Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитолого-гистохимическое исследование фосфатаз и оксидаз в преимагинальном развитии мошек WILHELMIA SALOPIENSIS EDW

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Цитолого-гистохимическое исследование фосфатаз и оксидаз в преимагинальном развитии мошек WILHELMIA SALOPIENSIS EDW"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. ЛЕНИНА

Специализированный совет К 053.01.01

На правах рукописи

ДВОРНИК Владимир Яковлевич

|ИТОЛОГО-ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФОСФАТАЗ И ОКСИДАЗ В ПРЕИМАГИНАЛЬНОМ РАЗВИТИИ МОШЕК WILHELMIA SALOPIENSIS EDW. (DIPTERA: SIMULIIDAE)

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1992

/

Работа выполнена на кафедре зоологии Донецкого государственного университета.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Усова 3. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Егорова Т. А.; кандидат биологических наук Эчкалов А. П.

Ведущее учреждение — Институт биохимии имени А. Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится 22 июня 1992 г. в ............ часов

на заседании специализированного совета К 053.01.01 по присуждению ученой степени кандидата наук Московского педагогического государственного университета имени В. И. Ленина (адрес: 129243, Москва,' ул. Кибальчича, д. 6, корп. 6, кафедра органической и биологической химии, к. 506).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МП ГУ имени В. Н. Ленина (адрес: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, 1).

Автореферат разослан «..f^?.» .................... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

ОЖИГОВА А. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБУГЫ

Актуальнроть проблемы. В современной энтомологии проблемам био~ имической регуляции физиологических процессов, происходящих в оргя-изме насекомого, уделяется значительное внимание. Актуальность изу-ения биохимических основ жизнедеятельности вредных насекомых шзтз- " а,- прежде всего, необходимостью разработки эффективных методов бо-ьбы с ними. •

Одним из непременных условий разработки эффективных бредсти оологического контроля численности вредных насекомых является изучении заимоотношений "паразит-хозяин" на биохимическом-уровне. В ряде j;c-ледований, проведенных на насекомых, показано, что паразитические рганизмы оказывают влияние на деятельность многих ферментов хозяина, то в конечном итоге приводит к нарушению процессов жизнедеятельности гибели насекомого. ' •

Ферменты мошек, за исключением некоторых эстераз центральной ервной системы, таких как арил~, карбоксил- и ацетилхолинэстераза, Одинцов, Петренко, 1969; Одинцов и др., 1970, 1971; Харсун, 1975; ертышный, Петренко, 1976; Magnin et al., 1987/ и ряда пищеваритель-ых ферментов, в частности, амилазы и инве^тазн, /Yang, Daviea,l968a, 968b, 1968с; Martin'et al., 1985/ практически не изучались.

Пельп работы явилось изучение гистохимической локализации и ак-ивности, а также возможных физиологических функций ферментов комп-екоа фосфатаз, пероксидазы и каталазы в тканях мошек в течение пре-магинальных фаз развития.

Задачи работы:

1. Определить гистохимическую локализацию и активность фермен- 1 ов в тканях и органах мошек в течение- преимагинального развития.

2. Выяснить физиологическую роль изучавшихся ферментов в оргя-изме личинок и куколок мошек.

3. Уточнить классификацию и генезис клеток гемолимфы мошек на реимагинальных стадиях развития. •

4. Оценить перспективность использования цитофотометрическкх етодов в изучении ферментов Hacei.jwiux.

Научная новизна: а/ в работе впервые определена гистохимическая окалиэация отличающихся по субстратной специфичности форм фосфатаз т: ^нях и органах мошек в течение преимагяна ьного развития; t

'б/ впервые^, при помощи цитофотометрических методов установлена инамика активности отих ферментов в течение развития отдпышх ор~ анов и тканей личинок и куколок мошек; пока: jho," ч.о г.оличест'-ешшо истохишгчесхш методы оффсктивни при оценке активности ферментов в

органах и их отдельных частях у мелких насекомых;

в/ выяснена физиологическая роль форм кислой и щелочной фосфа-таз, их связь с процессами накопления и расходования запасных веществ и развитием и функциями органов;

г/ изучена локализация пероксидазы и каталазы в плетках гемолимфы мошек в зависимости от фазы развития; разработан новый метод цитохимического выявления каталазы с использованием в качестве субстрата 3,3'~диметил0ензидина;

д/ установлена зависимость между активностью пероксидазы и каталазы в клeткгiX'гемолимфы и процессами метаморфоза;

е/ на основании 'данных о локализации оксидаз уточнена классификация клеточных элементов гемолимфы и их роль в физиологии мошек на различных стадиях. .

Практическая значимость раоотн. Приведенные в диссертации данные и выводы существенны для понимания физиологических механизмов преима-гинального развития мошек, в частности, метаморфоза. Представленные в работе данные по локализации и активности пероксидазы и каталазы в клетках гемолимфы личинок и куколок имеют значение не только для клас-сифк ации этих клеток,'но и для.познания защитных механизмов организма гошек, что немаловажно дри разработке методов биологической борьбы с этими насекомыми.

Предложенный метод цитохимического определения пероксидазы в мазках мржет быть использован в клинической гематологической диагностике ■ Апробали^ работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рационально« использование приходных ресурсов" /Уфа, 1989 г./, X съезде Всесоюзноп энтомологического общества /Ленинград, 1989 г./, У Всесоюзном диптеро-логическом симпозиуме' /Новосиоирск, 1990' г./.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы. ' Структур и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и .состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитированной литературы /191 источник/. Работа иллюстрирована о) таблицами и 36 рисунками'.

содатме работы

Материалы и методы

. Ь качестве материала для проведения исследований использовались личинки и куколки кровососущего вида мошек \WiLhelWa АаЦзр^гк^

сосланные в природе. Гистохимическое выявление ферментов проводили у гиз.хлых личинок трех возрастов, иредкуколок, 1-, 2-, 3-днавннх и фа-

ратных куколок. В опытах использовали как самцов, так и самок. Возраст личинок определяли по методике Тартаряна /1957/.

Гистохимическое определение локализации фосфатаз проводили мето-хами с солями металлов по Гомори в модификации по Лойда /Лойда и др., [982/ и азосочетания в собственной модификации. Последняя заключалась з использовании в качестве субстрата вместо фосфатов наф'толов и 1-ка-^тилфосфата - 2-нафтилфосфата, что обеспечивало более точную локализацию продукта реакции.

При использовании методов с солями металлов выявлялись глииеро-Ёюсфатазы /расшепляюше алифатические моноэфиры ортофосфорной кислоты/, I применение методов азосочетания позволяло определить локализация) на-[>тилфосфатаз, действующих на ароматические моноэфиры.

Инкубацию проводили при 3?°С.или комнатной температуре /при вы-галении щелочной фосфатазы методом азосочетания/. Длительность инку-5ации для выявления фосфатаз по методу Гомори составляла I ч для кие-юй и 5 мин для щелочной, а по методу азосочетания - соответственно Ю и 10 мин. В методах азосочетания концентрация субстрата в инкуба-деонной смеси составляла 0,5 мг/мл, а диазониевой соли - 1,5 мг/мл. *

Для цитохимического определения пероксидазы использовали значительно модифицированный нами метод Грэма-Кнолла /Хейхоу, Кваглино, ^983/ с З.З'-диметилбензидином в качестве субстрата. В отличие от ори-■инальной прописи была значительно уменьшена концентрация субстрата и ¡место спиртовой инкубационной смеси, существенно ингибировавшей пер-тсидазу,. применен раствор на Ьснове трис-НС1-буфера. Инкубацию про-юдили при 37°С в течение часа. Контрольные препараты инкубировали в ;реде, содержавшей 1,2'Ю-^ М азида натрия. ••

Цитохимическую локализацию каталазы определяли при помопш разра— ютанного нами оригинального метода с З.З'-диметилбензидином в качест-ю субстрата.

Для приготовления' инкубационной среды 20 мг субстрата растворяли | нескольких каплях диметилформамида, к полученному раствору прилива-;и 20 мл 0,1 М трис-НС1-буфера, рН 9,3, нагретого до 60°С. Среду ох-:шдали до 37°С и непосредственно перед использованием добавляли в :ее 5 мл свежеприготовленного 0,1^-ного раствора Н2О2. Затем среду яльтровали. Мазки инкубировали при 37°С в течение часа с однократной меной среды. Контрольные препараты инкубировали в среде с 10"^ М- азид :атр'<тя.

Измерение оптической плотности препаратов осуществляли на минро-,итофотометре ЛйШ ПМ-П в полихроматическом ,све'*е при увеличении в ■50 раз и зонде диаметром I мкм. Активность ("-рмен!' , принятую равной

шютности отложения формазана в срезах, выретали в относительных единицах и вычисляли формуле: а2

\ Е<11

¿от» = ' 100

\

где 3 ЕШ - площадь соответствующего участка денситограммы, 1 - длина оканйруемого участка пб.ц соответствующим участком денситограммы, Е -.жетинкция, которая вычисляется по формуле Е=^Ф0/Ф, где $0 и Ф - соответственно падающий и прошедший через препарат световой поток. Измерения оптической плотности проводили в автоматическом режиме. Вычис ления активностей ферментов осуществляли на компьютере "Электроника ДЬК-3". Полученные значения активностей ферментов статистически обрабатывались по критерию Стьюдента при р<0,01.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ, АКТИВНОСТЬ И ФУНКЦИИ ФОСФАТАЗ • У ЛИЧИНиК И КУКОЛОК МОШЕК Методами с различными субстратами у преимагинальных фаз мошек обнаружены различные формы щелочной и кислой фосфатаз - глицерофосфа-аазы-и нафтилфосфатазы. Они имеют различную локализацию и отличаются по выполняемым ими физиологическим функциям.

Щелочная фосфатаза найдена в клетках средней кишки, слюнных железах и мальпигиевых сосудах личинок. В средней кишке фермент локализован почти исключительно в апикальных частях клеток. Наивысшего значения его активность достигает в клетках железистых выростов, более, низкого - в эпителии желудка и отсутствует в клетках средней.части средней кишки. Такое распределение активности щелочной фосфатазы указывает на функциональную'специализацию различных отделов средней кишки личлнок мошек.

Сравнение значений активности щелочной фосфатазы различных отдел' 1 средней кишки у личинок разных возрастов показывает, что наибольшей функциональной1 дифференциации эти отделы достигают на стадии зрелой л; чинки. - . • \ . Ь.слюнных железах личинки щелочные глицеро- и нафтилфосфатаза

проявляют совершенно различную локализацию, что, очевидно, связано с процессами органогенеза_и клеточной дифф ренциации, а также со специфическими ф)ункциями этих органов на этой фазе развития мошек. Щелоч-нач фосфатаза юн.он выводных протоков слюнных желез, вероятно, участ вуе<г в процессах, обеспечивающих некоторые физико-механические свойства слю^, в частности, ее высокую эластичность и прочность на разры На фазе куколки щелочная фосфатаза обнаружена в клетках дегене-гпрушого личиночного эпителия средней кишки и слюнных желез, а таете

в эпителии мальпигиевых сосудов фаратных куколок. Характер локализации и активности фермента, свидетельствует о его несомненном участии в процесса« личиночно-имагинальной трансформации этих органов, в первую очередь - в процессах клеточной дегенерации эпителия кишки .и слюнных желез. Причем в клетках кишечного эпителия щелочная нафтилфосфатаза локализуется, помимо цитоплазмы, в особых органеллах, которые не тождественны лизосомам, а, очевидно, подобны вторичным гранулам нейтро-филов млекопитающих, или нейтралогидролазосомам'/Роговин и др., 197?/. В то же время щелочная глицерофосфатаза обнаруживает в дегенерирующем эпителии кишечника исключительно цитоплазматическую локализацию.

По мере лизиса кишечника и слюнных желез личинки активность щелочной фосфатазы в этих органах на фазе куколки снижается и исчезает к концу 3-го дня развития.

Кислая фосфатаза распространена в тканях и органе« значительно шире, чем щелочная. Гистохимическая локализация кислвк глицеро- и нйф-тилфосфатазы существенно различается.

Нами показано, что глицерофосфатаза внутриклеточно локализуется, как правило, в аппарате Гольдки или цитоплазме, тогда как нафтилфосфатаза - преимущественно в лизосомах и, реже, в аппарате Гольдки.

В эпителии передней кишки обе формы кислой фосфатазы проявляют наибольшую активность в клетках крипт. В период развития между линь-*-ками максимальная активность фермента наблюдалась непосредственно перед линькой, а сразу после сбрасывания линочной шкурки была минимальной.

Характер локализации форм кислой фосфатазы в эпителии задней кишки личинок указывает на функциональную неоднородность последнего. Активность, кислой нафтилфосфатазы обнаружена в начальном отделе задней кишки и прямой кишке, а активность' глицерофосфатазы - только в прямой кишке. г

Учитывая полученные данные, следует предположить, что одной из' функций кислой фосфатазы передней и задней кишок личинок мошек является, вероятно, лизис внутриклеточных структур, а таюке базальннх мембран клеток, что облегчает процесс оттсрхения эпителия эти^. отделов пищеварительной сйстемы во вреля линьки. Помимо вышесказанного, роль нафтилфосфатазы в начальном отделе задней кишки состоит, возможно, в гидролизе некоторых метаболитов, всасываемых клетками этого' отдел;?., а в прямой кишке - -> регуляции осмотического давления. Глицерофосфатаза прям^ кишки участвует, видимо, в метаболизме глицерина, образующегося в результате процессов пищеварения, и всасыЕ \ние которого происходит в основном в этом отделе кише-шика.

Таблица 1

Активность .кислой нафтилфосфатазы в пищеварительной системе (.

преимагиналъных стадий мошки й. Ба1ор1епа1з ЕЗн.- (отн. ед.)

Vотделы у. !

\ китеч- передняя железистые 1-я треть | 2-я треть -. . задняя дегенерирующий

\ ника кишка выросты средней | средней' | желудок кишка эпителий сред-

стадии\ ср. кишки кишки. I • кишки | ней кишки

развитияХ

Личинка: '

111-1У 49,29*5,81 27,81*3,70 27,45±7,24| 31,46*4,25) 31,23*5,84 32,57*4,23 -

1У-У 48,64*5,(Ц. 29,94*3,52 42,10*6,02) 38,14*1,96) 52,92*5,58 30,92*4,13 -

У-У1 71,51*12,13 36,87*4,79 58,1В*3,7б| 47,44*5,31) 60,15*8,87 61.76*9,83 -

зрелая 50,11*9,23 50,18*5,88 57,02*7,47| 50,91*6,74| 56,14*5,68 46,29*7,37 -

Куколка:

0-:1-дневная - - | ) - - 51,42*6,38

1-2-днёвная - - | ) - - 62,01*8,90

2-3-дневная - - | | - - 34,45*5,68

фаратная - - -. | | - - -

В средней кишке кислые фосфатаэы локализуются по ее длине неравномерно, Различается .также их внутриклеточная локализация.

В клетках железистых /слепых/ выростов кислая нафтилфосфатаэа локализована исключительно в лизосомах. В отличие от нее глицерофоефатаза найдена в апикальной части клеток этих органов и аппарате Гольдки и, по-видимому, на определенных стадиях развития личинки морфологически и физиологически связана с наружными мембранами клеток. В других отделах средней кишки нафтилфосфатаэа также обнаруживает лизо-сомальную локализацию, тогда как активность глицерофосфатазы проявляется главным образом в цитоплазме и комплексе Гольдии кишечного эпителия.

Показатели активности кислой фосфатаэы в клетках средней киши и характер ее гистохимического распределения подтверждают вывод о функциональной специализации различных частей этого отдела пищеварительной системы, а такие степени их дифференциации в процессе органогенеза /с. 4/. Значения активности фермента свидетельствуют' о том, что интенсивность процессов гидролиза кишечного,содержимого, его абсорбции и внутриклеточного пищеварения возрастает по мере развития личинки, достигая максимума у личинок У1 возраста и предкуколок. .

На стадии куколки физиологическая роль кислой фосфатаэы средней кишки состоит, несомненно, в лизисе клеток эпителия. Об этом свиде^-.' тельствуют как локализация фермента исключительно в лизосомах, так и динамика его активности в течение куколочной фазы. Количественные значения активности кислой нафТилфосфатазы приведены в таблице I.

В клетках слюнных желез личинок формы кислой фосфатаэы также проявляют различную локализацию. Глицерофоефатаза обнаруживается исключительно в аппарате Гольджи, а нафтилфосфатаэа - преимущественно в лизосомах. Причем у ранних личинок глицерофоефатаза проявляет активность только в отдельных клетках слюнных келеэ, а у личинок У1 возраста -практически во всех. В слюнных железах предкуколок активность глицерофосфатазы снижается, а аппараты Гольджи секреторных клеток значительно уменьшаются в размерах. Очевидно, что наибольшей интенсивное 'И процессы секреции слюны достигают у личинок предпоследнего возр; ста; у предкуколок образования слюны нг происходит и в процессе плетения кокона используется слюна, запасенная в полости слюнных желез в течение личиночного развития.

На фазе куколки слюнные железы подвергаь ся гистолизу и дегенерации. На уровне физиологии клетки происходи разрушение аппарата Гольдаи и превращение оставшихся после прекращения энэоци-^за первичных лизосом во вторичные, главной функцией » горых .шляется артолиз

-ь-

клетки. На этом этапе развития в слюнных железах обнаруживается только нафтилфосфатаза, которой как раз присуща именно лиэосомальная локализация. Однако активность фермента, по сравнению со стадией предкуколки, значительно сникается /табл. 2/.

В мальпигиевых сосудах обе формы кислой фосфатазы локализуются в лизосомах эпителиальных клеток. .Очевидно, фермент участвует в выделительных процессах. Значения активности кислой нафтилфосфатазы в различных отделах мальпигиевых сосудов показывают, что выделительные процессы с ее участием и,дут более интенсивно в дистальном отделе, по сравнению с проксимальным /табл. 2/.

В клетках жирового тела кислая глицерофосфатаза локализуется, главным образом, в примембранном пространстве, а нафтилфосфатаза - в Цитоплазме. Но мере развития личинки активность кислой фосфатазы в ' клетках жирового тела возрастает, достигая максимума у личинок У-У1 возраста и несколько снижаясь у предкуколок /табл. 2/.

Сопоставляя полученные данные по локализации и активности кислой йосфатазы с данными по содержанию в жировом теле личинок и куколок мошек белков, жиров и углеводов /Усова, Савустьяненко, 1990/, следует предположить, что. нафтилфосфатаза, вероятнее всего, участвует в метаболизме белков и гликогена, тогда как глицерофосфатаза -в прогессах обмена фосфолипидов, входящих в состав клеточных мембран, а таете транспорте фосфат-ионов через мембраны трофоцитов.

В репродуктивных органах самцов кислая глицерофосфатаза у личиноь локализуется в виде четко очерченных областей, находящихся, главным образом, по периферии гонады. У поздней предкуколки, перед линькой на куколку, распределение этой формы кислой фосфатазы резко меняется, становится диффузным. В зачатках яичников продукт реакции на кислую глицерофосфатазу локализуется в центральной и периферической частях Гонады.

Кислая нафтилфосфатаза в зачатках гонад личинок всех возрастов локализуется ^иффузно. Ее активность у самок в течение личиночной фазы возрастает, дост. ,'ая максимума у предкуколок, а у самцов максимум наблюдается у личинок предпоследнего возраста, у зрелых же незначительно снижается /табл. 3/. По мере развития куколки локализация нафтилфосфатазы становится все менее диффучой, Однако у фаратных куколок структуры, содержащие фермент, становятся.очень мелкими и рассеянными .

На <?>азе куколки кислая Лосфатаза обнаруживается тааде в других частях 1..,ловой системы мошек, возникающих на этой стадии. Динамика акт/вности фермента приведена в таблице 3.

Таблица 2

Активность кислой нафтилфосфатазы в слюнных железах, малъпигиевых сосудах и жировом теле преимагинальных стадий мошки М. за1ор!епз15 Еаи. (отн. ед.)

\ органы | слюнные железы | мальпигиевы 1 сосуды | жировое тело

стадиич | проксимальный | дистальный 1 | проксимальный | дистальный |

развития | . отдел | отдел | отдел | отдел |

Личинка: 1 |" Г

Ш-1У | 33,88* 2,40 | 33,51*3,03 ( ' 42,32*5,27 I 49,13* 6,65 1 21.07* 4,70

1У-У | 48,71* 5,08 | 49,10*4,66 | 45,10*4,31 | 51,28* 4,13 | 43,73*13,41

7-У1 | 51,14*10,17 | 53,30*9,18 | 48,16*7,41 | 56,29* 8,05 ! 86,72*10,50

зрелая | 62,02* 6,43 | ■ 68,28*8,09 | 47,51^8,62 Г 56,70*10,50 | 70,64±14,85

Куколка:

0-1-дневнй.: 45¡45* 8,00 | 46,71*11,10 | 60,87^17,94

1-2-дневная | 40,90*11,57 | 69,39*10,93 | 86,97*18,70

2-3-дневная | ' ! 55,36* 7,29 | 63,88*11,37

фаратная [ | 49,19* 5,48 | 41,66*10,34

Таблица" 3

Активность кислой нафтилфосфатазы в репродуктивных органах преимагкнальных стадий мошки К. за1ор1епз1Б Ес!к. (отн. ед.)

^стадии развития! личинка куколка

! III-IV IV-V | v-vi ! зрелая i O-1-дн. 1-2-дн. 1 2-3-дн. фаратная

органы | возраст возраст | | возраст|

1 i 1 2 1 з 1 | 4 i | 5 1 ■ 6 7 1 в 9

33,34 1 49,48 | г 84,15 | 80,43 j 48,83 45,72 | 25,51 48,68

| семенники | * * * аЬ * j =t ±

ё ! 1 4,63 6,03 | 25,29 | 12,77 | 10,52 11,98 1 4,50 4,17

1 I | 33,21 32,43 Г 33,22 20,25

j семяпроводы| - | | - 1 ± ± tb *

1 1 1 | 1 7,05 6,03 1 3,71 2,13

16,07 1 18,72 | 1 20,16 j 38,35 | 35,17 30,64 j 55,52 33,0

| ЯИЧНИКИ I =t эЬ * ±

? 1 1 2,01 4,08 | 3,78 ! 3,07 . | 5,33 6,13 1 8,03 8,30

1 придаточные| 1 | 30,82 31,07 | 31,86 29,20

| половые |. - | j - I ± * эЬ

1 тлёзы | ! ! 1 3,67. 4,51 j 3,40 4,52

Выше уже отмечалось /с.?/, что наибольшая интенсивности процео-сы накопления запасных вешеств достигают у личинок У1 возраста. На этой же стадии наблюдается и максимум активности кислой фосфатазы в зачатках семенников. В зачатках гонад самок активность кислой фосфатазы остается сравнительно невысокой на протякение всего преимаги-нального развития, заметно повышаясь лишь перед созреванием куколки. Однако это повышение не связано с максимумом расходования запасных вешеств и, вероятно, является следствием завершения клеточной дифференциации яичников.

В головных ганглиях и узлах брюшной нервной цепочки центральной нервной системы личинок и куколок мошек кислая нафтилфосфатаза локализуется диффузно в глиальных клетках и их отростках, а глицерофос-фатаза - в нейропиле и телах нейронов. Функции нафтилфосфатазы могут быть довольно разнообразными и заключаться, в частности, в содействии переходу гликогена, липидов и. других метаболитов из глиальных клеток в нейроны, а также в промежуточном синтезе белка.

. Анализ гистохимической локализации кислой глицерофосфатазы в ганглиях личинок мошек показывает, что эта форма фермента находится в области основного нейропиля, основная функция которого - осуществлять координационную связь между всеми зонами данного ганглия и также с нервными элементами соседних ганглиев /Мандельштам, 1983/. Роль глицерофосфатазы здесь может состоять в участии в передаче импульсов в областях синаптических контактов.

Глицерофосфатаза головных ганглиев личинок мошек сопутствует, вероятно, нейросекреторным клеткам, поскольку локализуется далеко не во всех нейронах.

Данные гистохимических исследований указывают на активное участие кислой нафтилфосфатазы в процессах личиночно-имагинальной трансформации головного мозга мошек. Причем по мере созревания куколки активност? фермента возрастает /табл. 4/.

Сравнение полученных данных с данными по локализации фосфатаз в нервных ганглиях представителей отрядов таракановых /lewari, Dabhol-kar, 1968; Verheert et al., 1990/, прямокрылых /saleem et al., 1970/, полужесткокрылых /wigglesworth, 1959/ и чешуекрылых /виаег, 1972/ показывает, что для представителей филото этически более примитивных отрядов .насекомых /таракановых, прямокрылых и лолужесткокрылых/ характерно наличие в ганглиях как щелочной, так и кислой фосфатаз и локализация их в нейрилемме и периневриуме, а также телах нейронов. У на-cei.jmhx филогенетически более высокоорганизованных отрядов, например чешуекрылых и двукрылых, проявляется четкая тенденция к преобладанию

Таблица 4

Активность кислой нафтилфосфатазы в нервной системе преиыагинал'ьных стадий мошки аа1ор1егз!з Edw. (отн. ед.)

.отделы ЦНС стадии оазвития

Личинка: ' Ш-1У

• П-У У-П зрелая -Куколка:

0-1-дневная

1-2-дневная

2-3-дневная фаратная"

надглоточный ганглий

31,93*7,78 34,73*7,65 42,88*8,61 51,88*7,67

подглоточныЯ ганглий

.36,40*10,27 37,78* 9,61 65,34* 5,85 52,39*10,88

1-й грудной ганглий

43,46*11,62 47,92* 9,13 65,12* 7,53 53,18* 8,61

5-й брюшной ганглий

.43,95*10,12 48,20* 8,19 68,33* 8,89 55,82*11,57

грибовидные тела

РО I

23,25*5,06

26,42*8,61

34,73*8,25

34,81*6,40(самец)

22,36±2,99(самка)

в ганглиях кислой фосфатазы над щелочной и локализации ее в глиальньх клетках. С эволюционной точни зрения этот факт объясняется тем, что по мере усложнения системной организации нервные клетки становятся все более специализированными, теряют в целом несвойственные им метаболические функции, которые переходят к глиальным клеткам. "Сосредоточение" нейронов на выполнении исключительно ассоциативных и проводящих функций повышает эффективность деятельности нервной системы, что в конечном итоге является решающим фактором эволюционного прогресса.

ПЕРОКСВДАЗА И КАТМАЗА В КЛЕТКАХ ГЕМОЛИМФЫ МОШЕК

Проведенными исследованиями установлено, что из описанных Рубцовым /1959/ 10 типов клеточных элементов гемолимфы мошек пять на протяжение преимагинального развития проявляют положительную реакцию на пероксидазу и каталазу.

В течение личиночного развития наиболее интенсивно пероксидаза и каталаза проявляют свою активность в клетках гемолимфы зрелых личинок. Причем отчетливо выявляются различия в локализации этих ферментов. Так, пероксидаза обнаруживается в прогемоцитах, микронуклеоцитах, ве-ретеновидных гемоцитах, фагоцитах и зернистых гемоцитах, а каталаза -в микронуклеоцитах, прогемоцитах и адипоцитах.

Гемолимфа куколок характеризуется появлением большого числа крупных /до 25-30 мкм/ пигментированных клеток разнообразной формы, имеющих сильно вакуолизированную цитоплазму. Эти клетки присутствуют в гемолимфе куколки вплоть да фаратной стадии. Морфологически они несколько сходны с адипоцитамй,-однако четко отличаются от последних тем, что, во-первых, окрашиваются азур-эоэином по Романовскому-Гимза в интенсивный темно-зеленый цвет и, во-вторых, никогда не проявляют положительной реакции на каталазу. Для этого типа клеток предложено название "структуроциты", поскольку они характерны именно для стадии наиболее интенсивной дифференцировки имагинальных структур, в которой принимают непосредственное : участие.

Для гемолимфы куколок характерно также наличие eme трех типов клеток, отсутствующих на личиночной фазе. Два из них проявляют положительную реакцию на пероксидазу, а один - очень слабую реакцию на каталазу, Генезис и функции этих клеток не выяснены.

Оценивая результаты проведенных исследований по изучению цитохимической локализации пероксидазы и каталаэы в клетках гемолимфы пре-имргчшальных фаз мошек, можно с достаточной степенью уверенности' утверждать, что эти ферменты выполняют в организме мошек множественные физиологические функций, связанные с морфогенезом и ролью клеток

гемолимфы, содержащих оксидазы.

Достаточно четко проявляются различия в изменении активности пероксидазы и каталазы. Каталазная активность, в отличие от перокси-дазной, отсутствует в клетках гемолимфы вплоть до стадии предкуколки. По всей вероятности, у молодых личинок функции каталазы выполняет другой фермент .со сходным механизмом действия. С другой стороны, активность обоих ферментов проявляется преимущественно в достаточно зрелых и крупных клетках каждого из пяти упоминавшихся типов, а число этих клеток в гемолимфе молодых, незрелых личинок невелико и достигает достаточно большого значения лишь у дредкуколок. Этот факт указывает на то, что созревание и связанная с ним морфологическая и функциональная диф|} еренциация клеток гемолимфы идет на протяжение всего личиночного развития параллельно с подобными процессами в других органах и тканях и завершается у предкуколок.

Ряд фактов указывает на связь пероксидазы и каталазы, а также содержащих их гемоцитов с процессами метаморфоза и морфогенеза различных тканей. Так, первое значительное увеличение количества перок-сидазоположительных гемоцитов у личинок У-У1 возраста вызвано, по-видимому, началом дифференциации проторакальных дисков - дыхательных нитей будущей куколки. Максимальное же проявление активности пероксидазы и каталазы на фазе личинки наблюдается в гемолимфе предкуколок перед и в течение плетения кокона, а также перед линькой на куколку. Причем именно в это время значительная активность пероксидазы и каталазы обнаруживается и вне клеток гемолимфы, в ее плазме. Связана она, вероятно, с массовым разрушением гранулярных /зернистых/ гемоцитов и выходом гранул, содержащих ферменты, в плазму гемолимфы.

Как было показано в ряде работ /Мрке et аХ,, 1963; Нааэоп, Зи-gumaran,,1987/, пероксидаза насекомых принимает участие в процессах склеротизации их покровов. По-видимому, усиление пероксидагной реакции в клетках и плазме гемолимфы мошек соответствует, помимо прочего, периодам наибольшей интенсивности в склеротизации кутикулы. О эвидно, на стадии, куколки такими периодами являются 2-3-й и 4-5-й дни разви- . тия.

Анализ локализации пероксидазы и каталазы в клетках гемолимфы мошек на разных фазах развития позволил дополнить данные Рубцова /1959, 1960/ о функциональной роли этих клеток и уточнить их классификацию.

Различия в локализации пероксидазы в микронуклеоцитах указывают на то, что у мошек существуют два типа этих клеток. Один из них содержит пероксиДйзу в гигантской органелле диаметром до 1/2 диаметра клетки. Пероксидаэосодерхашие органеллы тако!. величины - явление б жиратам мире уникальное. Приставляете; доьольчо вероятны! 1 отнояешю мик-

ронуклеоцитов к защитным механизмам организма мошек, учитывая то, что пероксидаза в присутствии перекиси водорода и ионов хлора способна декарбоксилировать и дезаминировать ряд аминокислот до альдегидов, которые являются эффективными бактерицидными агентами АтасоЬо et а1., 1970/. Таким образом, гигантские пероксидаэосйдеркапше орга-неллы микронуклеоцитов мошек могут выполнять роль "окислительных станций" организма насекомого благодаря исключительно высокой активности содержащегося в них фермента.

Сопоставляя полученные данные по цитохимической локализации пероксидазы и каталазы в гемоцитах мошек с данными Рубцова по их морфологической классификации и генетическим взаимосвязям /Рубцов, 1969/ наиболее вероятным представляется следующий вариант клеточных трансформаций в морфофункциональном генезисе гемоцитов мошек на фазах личинки и куколки: прогемоциты - микронуклеоциты - веретеновидные гемо-циты - фагоциты. В пользу данного предположения свидетельствует как наличие в этих типах клеток обоих изучавшихся оксидаз, так и сходный характер их цитохимической локализации у разных типов клеток.

При помогай цитохимических методов показано, что гранулярные ге-моциты содержат и пероксидазу, и каталазу, Здесь возможна двоякая трактовка полученных данных: I/ гемоциты содержат оба фермента, локализованные каждый в специфических органеллах; 2/ существуют два типа гранулярных гемоцитов, каждый из которых содержит в качестве основного компонента гранул какой-либо из упомянутых ферментов.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что зернистые гемоциты являются полифункциональными клетками. Можно считать установленным факт, что наличие положительной пероксидазной или каталазной реакции в плазме гемолимфы личинок и куколон мошек непосредственно связано с генезисом зернистых гемоцитов, в частности, их разрушением на заключительной стадии развития. Второй функцией гра-.нулярных гемоцитов является защитная. Несмотря на функциональное подобие, зернистые гемоциты генетически отличаются от ряда клеток "прогемоциты - фагоциты" и связаны в своем происхождении с гиподермой /Рубцов, 1959/. Исходя из вышесказанного, логично предположить, что первичной функцией гранулярных гемоцитов мошек является "производство" каталазы и пероксидазы для процессов формирования покровов насекомого, а защитная функция - вторичная, обусловленная присутствием пероксидазы и каталазы в этом типе клеток.

Представляют интерес полученные данные о локализации каталазы в адк .оцитах. Проявление адипоцитами положительной реакции на каталазу совпадает с максимумом активности фермента в зернистых гемоцитах и

плазме гемолимфы, что свидетельствует о существовании общего механизма активации каталазы в клеточных и неклеточных элементах гемолимфы.

Отсутствие положительной реакции на пероксидазу и каталазу в эноцитах, эноцитоидах, макронуклеоцитах, клетках жирового тела в течение их. морфогенеза у преимагинальных фаз мошек свидетельствует о том, что эти типы клеток не содержат специфических органелл, маркерными ферментами которых являются пероксидаза и каталаза. Следовательно, генетически и функционально они отличаются от клеток, содержащих эти ферменты.

ВЫВОДЫ-

1.'. Гистохимическими методами с использованием различных модельных субстратов определена локализация различающихся по субстратной специфичности форм фосфатаз в тканях и органах личинок и куколок мошек. Установлено, что использование в качестве субстрата 2-нафтилфосфата более эффективно для выявления фосфатаэной активности, чем 1-нафтил-фосфата. Показано, что количественные цитофотометрические методы могут быть эффективно применены для изучения органов, тканей и клеток мелких насекомых, препарирование которых затруднено.

2. В организме личинок и куколок мошен кислая фосфатаза локализуется практически во всех органах и тканях и выполняет очень широкий спектр функций, связанных с накоплением белков, жиров и углеводов на личиночной фазе развития и их расщеплением на куколочной фазе. Щелочная фосфатаза локализуется почти исключительно в эпителии средней кишки," слюнных желез и мальпигиевых сосудов и связан* с осуществление;,! транспорта метаболитов через мембраны клеток.

3. Активность фосфатаз зависит от степени развития, морфологической и функциональной дифференцировки соответствующего органа насекомого и может служить ее показателем.

4. Для нервной системы мошек характерно преобладание в ганглиях кислой фосфатаэы над щелочной и локализация ее в глиальных клетках. В эволюционном плане это является следствием усложнения системной организации нейронов и утраты несвойственных им метаболических функций, которые переходят к глкальным клеткам.

о. Клеточные элементы гемолимфы мошек различаются по реакции на пероксидазу и каталазу, что может служить важным систематическим признаком гемоцитов. Активность этих ферментов в клетках и плазме эмолим-фы колеблется и зависит от степени зрелости клеток, а также процессов формирования наружных покровов насекомого.

б; Клеточный состав гемолимфы мошек на фазе куколки претерпевает, в сравнении с ^азой личинки, значительные изменения, связанные с про-

исссами лпчиночно-имагниалыгоЛ трансформации и характеризующиеся появлением специфических типов клеток, свойственных исключительно этой фазе развития.

7. В гемолимфе мошек существует несколько рядов клеток, один из которых (прогемоциты — микронуклеоциты — веретеновидные гемоциты — фагоциты) связан преимущественно с выполнением защитных функций, а другой, главным звеном которого являются гранулярные гемоциты.— с процессами формирования наружных покровов насекомого.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Дворник В. Я. Оксидазные системы насекомых. Краткий обзор. // Донец. ун-т — Донецк, 1990.— 20 с.— Библиогр. 67 назв. —Деп. в УкрНИИНТИ 2.11.90 № 1809-Ук90.

2. Дворник В. Я. Неспецифические фосфомоноэстеразы насекомых. Крат-<ий обзор Ц Донецк, ун-т.— Донецк. 1990.— 21 с.— Библиогр. 78 назв.— Деп, з УкрНИИНТИ 2.11.90 № 1810-Ук90.

3. Дворник В. Я-, Овчинников С. А., Самойленко Т. И. Приспособление цля микрофотографирования фотоаппаратом «Зенит» II Лаб. дело.— 1991.— V» 10,—С. 75.

1одп. в печать 15.05.92. Формат 60X847:6- Бумага типогр. Офсетная печать. гсл. печ. л. 0,93. Усл. кр.-отт. 1,16. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 9-7201. !есплатно.

Московский педагогический государственный университет, 129243, Москва, ул Кибальчича, 6

ДМАПП, 340050, Донецк, ул. Артема, 96