Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспортная функция мембраны щеточной каймы эпителиальных клеток тонкого кишечника после воздействия ионизирующей радиации

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Транспортная функция мембраны щеточной каймы эпителиальных клеток тонкого кишечника после воздействия ионизирующей радиации"

Л '

з

• Нац1ональна академ1я наук Укра1'ни 1нститут експериментально! патологи, онкологи 1 рад1об1ологП 1м. Р. 6. Кавецького

На правах рукопису

КОВАЛЕНКО 1РИНА БВГЕННВНА

ТРАНСПОРШ ФУНКЦ1Я МЕМБРАНИ Щ1ТК0В01 КАЙМИ ЕШТЕЛШЬНИХ КЛ1ТИН ТОНКОГО КИШЕЧНИКА П1СЛЯ ДП ЮН13УЮЧ01 РАД1АЦП

03.00.08 - рад1обшлог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття наукового ступеня кандидата 61олог1чних наук

КИ1В - 1995

Дисертащею е рукопис. Роботу виконано на кафедр1 61ох1м11 Ки1вського ун!верситету ¿м. Тараса Шевченка

Науковий кбр1вник

0ф1ц1йн1 опоненти :

доктор б1олог1чних наук, професор В. М. Вошццький

доктор б!олог1чних наук О.М.Федоров

доктор б!олог!чних наук Ю.В.Бездробний

Пров!дна установа - Ктвський державний медичний

ун1верситет.iM.0.0.Богомольця

Захист в1дбудеться "_" _ 1995 р. о _ годин1

на зас!данн1 спец1ал1зовано! вчено! ради Д 01.83.01 в 1нститут1 експериментально! патолог!i, онкологП i рад1об!ологП 1м. Р.6.Кавецького HAH Укра!ни (252022, Ки!в-22, вул. Василь-к!вська,45).

3 дисертац1ею можна ознайомитися в б1бл!отец1 1ЕП0Р HAH УкраГни.

Автореферат роз1сланий "_" _ 1995 р.

Вчений секретар спец1ал!зовано1 вчено! ради канд. б!ол. наук

Г.Й.Лавренчук

- э -

ЗАГАЛЪНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть роботи. Широке використання джерел 1он1эуючого випром!нення в промисловост1, медицин1, наукових досл1дженнях, потенц1альна небезпека виникнення ядерних авар1й, як1, як св1д-чать подП на ЧАЕС, можуть набувати катастроф 1чних розм1р1в - все це виыагае рознирення досл1джень дП 1он1зуючо1 рад1ац11 як на орган!зм в ц1лому, так i на окрем1 тканини, органи 1 кл1тинй.

Структурн1 та функц1ональн1 зм1ни в тонкому кишечнику, одному з найб!льш рад!очутливих орган1в, п1сля д11 високих доз опром1ноння (б1льяе 10 Гр) вивчен! в1днссно добре (Монастырская. 1978; Ларшков, 1980; Костеиа, 1990; Quastler, 1965]. Разом з тим, потребупть значно детальн!шого досл1двення нехан1зми впливу б1льи низьких доз рад!ац11.

Пров1дна роль у зд1йсненн! основних функц!й тонкого кишечника - травно! 1 всмоктувально! - налеяить плазматичн!й мембран1 еп1тел1альних кл1тин (ентероцит1в), яка м1стить р1зноман1тн1 транспортн1 системи 1 контролюе надходження поживних речовин з пороянини кипечника в кров 1 л1мфу. Початковою та ивидк1сть-л1м1-туючою стад1ео трансмембранного перенесения речовин е Ix транспорт через ал!кальну плазиатичну мембрану, так звану щ1ткову кай).<у (ЩК) [Уголев, 1986; Морозов, 1988]. Завдяки багатосторонн1м регуляторним взаемозв'язкам з кп1тинним метабол1зном 1 виклпчною функц1ональною вахлив!стю порушення властивостей мембрани ЩК п!сля, опрсм!нения ноже набувати периочергового значения в рад1ац1йному пошодженн1 ентероцит1в 1 тонкого кишечника взагал! [Рыскулова, 1986; Дворецкий, 1990; Königs, 1982; Lang, 1991].

0ск1льки через мембрану переносяться р1зноман1тн] iohh 1 нутр1енти, вивчення транспорту 1он1в калыДп (ун1эерсальний рс-

гулятор кл!тинного метабол!зму [Болдырев, 1985; Назгаиззеп, 1983]) та таких. життевонеобх!дних метабол!т1в як ам1нокислоти надасть р1зноб1чну характеристику променевого ураження транспортних влас-тивостей ц1е! иембрани. Ир1м того, з'ясування механ1зм!в порушення транспортно! функцП мембрани ЩК при д11 доз, эначно ниячих в!д тих, як1 викликають киакову форму променево! хвороби, дозволяе встановити насл1дки даного впливу на процеси всмоктуван-ня у тонкому кишечнику, а такой сприяе поглибленню знань у вияв-ленн1 рад1ац1йно! ст!йкост1 даного органу 1 орган!зму в ц1лому.

Мета 1 задач! досл!дчення. Метою дано! роботи було вивчення функц1онально! активное^ (особлива увага прид1лялася транспорт-ним властивостям) иембрани щ1тково! кайми (ЦК) еп!тел1альних кп1тин тонкого кишечника щур1в п1сля д11 одноразового тотального р1дко1он1зуючого (рентген1вського) випро,ч1н11вання в дозах 0,5;

; 1,0; 2,0 та 3.0 Гр через 1 добу п1сля опром1нення.

' Досягнення зазначено! мети передбачапо вир1шекня. наступних задач : 1. Визначити активнЮть фсрмент1в, характерних мембран1 ЩК ентероцит!в (Са^.М^-АТСази, лужно! фосфатази, *-глутам!л-трансферази) через 1 добу п1сля опром1нення. 2. Бивчити процес транспорту 1он1в калы|1ю мембранними препаратами ЩК п!сля д!1 1он1зуючого випром1нення. 3. Досл1дити ыехан!зми транспорту нейтральних ам1кокислот - фен!лалан1ну та лейцину через дану мембрану при променевому вплив1. 4. 0ц1нити основн1 параметри транспорту Саг+ та даних ам1нокислот через мембрану ЩК тонкого кишечника через 14 д1б п!сля опром1нення в доз1 1,0 Гр (час, за який в1дбуваеться поене оновлення кл1тин кишкового еп!тел1ю).

Наукова новизна та практична значим!сть роботи. Проведено пор1вняльний анал1з 1 з'ясовано ■ основн1 механ1зми рад1ац1йно-Ьщукованих поруиень транспорту кальц1ю та нейтральних ам1нокис-

лот через мембрану ЩК тонкого книечншса щур1в п!сля рентген!всь-кого опром1нення в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Гр.

Встановлено. що через 1 добу в!дбувасться р1зке пригн!чення Са2 *-АТФазно! активност!, же посилюсться з1 зб1льпеннпм дози опром1нення. Актиен1сть лужно!" фосфатази, У-глутаМлтрансферази, а також Ь^-АТФази мембрани ЩК практично не зм1нветься при вс1х дозах опром!нення.

Показано, 40 рад1ац1йно-1ндуковане зб1льиення Са2*-зв'язую-401 здатносгп мембранн 11;К за рахунок п1двищення к!лькост1 Са2*-зв'язуючих д1лянок на зовн1ш!й та внутр1Ен1й поверхн! ц1ег мембранн мояе обумовлювати зростання Са2*-транспортусчо! функцП. Виявлено п1двищення свидкост! трансмембраннсго перенесения Сай* через мембрану 1ЦК п1сля спром!нення.

Еивчення р!зних елях1в транспорту ам1нокислот св1дчить, що опром!нення досл!д»уваними дозами викликае прискорення пасивно! дифуз11 фен1лалан!ну та лейцину, а також пригн!чення (особливо для лейцину) 1х вторинно активного На*-залежного транспорту. Встановлено 1снування альтернативно! специф1чно! для фен!лалан1ну На*-залежно! -смстеми транспорту, яка може в1др1змятися за чутлив1стю до д11 1он1зуючс1 рад1ац1х.

Анал1з одержаних результат^ дозволяе твердити, цо основною причиною порушення транспортних властивостей е рад1ац1йно-1ндуко-ване зростання проникливост1 мембранн [ЦК.

Функц1онування кальц1й-транспортуючих систем, а такок систем транспорту фен!лалан!ну та лейцину мае здатн!сть в1дновл»ватися до контрольного р1вня через 14 д!б п1сля опром1нення.

Встановлен! фактн дають змогу з'ясувати особливост! механ!зм!в транспотру 1он1в кальц1в та атнокислот через мембрану ЩК тонкого киаечника та 1х иожлив! пострад!ац!йн1 порушення. Кр1м

того, вони можуть бути основою для розробки проф1лактичних llip i иауково обгрунтованого добору л1кувапьних аасоб1в при променевому ураженн! тонкого кишечника.

Положения, що виносяться на захист. 1. Рентген1вське опром1-иення в дозах 0,5; 1.0; 2,0 та 3.0 Гр через 1 добу викликае п!д-вищення Са2*-транспортуюч01 функц11 мембрани ЩК тонкого кишечника за рахунок зб!льшення проникливост1 мембрани ЦК для даного 1ону, а такой зростання Са2+-зв'язуючо1 здатност! мембрани. 2. Промене-ве ураження в досл1джуваних уыовах викликае зростання пасивно! диФузИ ам!нокислот - фен!лалан1ну та лейцину через мембрану ЩК та пригн1чення Ix Na"-залежного шляху транспорту. Причому вплив ioHÍ3yio4oI рад!ацП на перший процес е б1льш вираженим. 3. Вияв-лен1 аы1ни транспорту Са2+, фен!лалан1ну та лейцину посилвються ai зб!льшенням дози опром!нення, а через 14 д!б П1сля опром!нення спостер!гаеться майже повне в1дновлення цих транспортних npoqecio.

Апробац1я роботи. Основыi положения дисертац1йноГ роботи допоо1далися на Рад1об1олог1чному з'1зд1 (Ки1в, 1993). на 1 з'!зд1 Украшського б!оф1зичного товариства (Ки1в, 1994), на Шжнародному симпоз!уьЦ "Биологическая подвижность" (Москва, 1994), на наукових конференц!ях професорсько-викладацького складу Ки1вського ун!верситету 1м. Тараса Шевченка (Ки1в, 1994, 1995).

Впровадження. Натер1али дисертац!йно1 роботи використоэують-ся в курсах лекц!й "Рад1об1олог1я" та "Рад1ац1йна еколог!я" КиГвського ун1оерситету ii.i. Тараса Шевченка.

Об'ем роботи. Дисертац1я складаеться • з вступу, огляду л1тератури (3 розд1ли), матер!ал1в та метод1в досл1д»ення, результат!в та íx обговорення (4 розд1л1в), заключения, . виснов-к1ь. персл1ку л!тератури (203 джерела). Робота викладена на 120 стор1ннах »ш'инопису. míстить 14 рисунк^о 1 6 таблиць.

- 7 -

НАТЕРШИ ТА 1'ЕТОДИ Д0СЛ1Д5ЕШШ.

Досл1дкення проведен1 на цурах-самцях, вагою 180-200 г, яких одноразово тотально опром1нювапи в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 3.0 Гр на апарат! РУМ-17 з тубусом при таких умовах : потуги1сть дози в noBiTpl 2x10"1 А/кг. ф1льтри 0,5 мы Си та 1 мм AI, сила струму 10 мА. налруга 200 кВ, пк1рно-фокусна в!дстань 50 см.

Щур1в декал1тували через 1 добу п1сля опром!нения, оск1льки в наших попередн1х досл1дженнях було встановлено односпрямований характер зм1н тргнспортно! функцП через 12 та 24 години теля опром1нення, 1 вони були б1льп вирааеними через 24 години; кр1м того, функ1)1онування дозр1лих ентероцит1в в1дбуваеться протягом короткого в1др1зку часу (20-24 години [Уголев, 1986]), а вхэ з З-Tboï доби п1сля опром1неннл спостер1гаеться в1дн'овлення транспортних властивосгей мембрани ЦК [Ваег, 1987].

Везикульован! мембранн1 препарат» ЩС тонкого кивечника одержували зг1дно з методиками [Kopier, 1973; Miller. 1981]. BhIct б1лку в об'ектах досл!дження визначали за методом Лоур1 1 cniBaB. CLowry et al., 1951]. Чистоту препарат1в CJK, отриманих з контрольних 1 опром!нених тварнк оц1нювали електронном!кроскоп1ч-ним методом [Lewis, 1977] та за активн1стю маркерних фермент!о мембрани CJK - лужно! фосфатази [Ghljsen, 1980] 1 *-глутан!лтранс-ферази [Lin, 1981]. АТФазну активн1сть визначали так, як вказу-еться в робот! [Ghijsen, 1980].

Вивчення поглинання. виходу та зв'язування Саг+ мембранними везикулами ЦК проводили рад!о1зотопним методом зг1дно [Miller, 1981; Miller, Tung, 1982Î в розчин! (об'ем 0,3 мл), який м1стив 10 мМ HEPES-Tpic (pH 7.5 при 25°С). 100 мМ Д-сорб1тол, 1 Ш СаС12 (при досл!д*енн1 зв'язування 1она з мембраною концентрац!я Са?'

- в -

становила 0.1-4 мМ) та 45СаС1г з молярною рад1оактивн1стю 0,3 мК!/ммоль. Реакц1и !н1ц!ювали внесениям 0,05 мг 61лку в пробу.

Накопичення фен!лалан1ну та лейцину вивчалося з використан-ням й-(14С)-фен!лалан1ну 1 а-(14С)-лейцину (молярна ра1оактив-н1сть 2,8 мК1/ммоль 1 2,6 мК!/ммоль, в1дпов1дно) зг!дно [Ба1о1п, 1989] в розчин1 (об'ем 0,5 мл), який м1стив 10 мМ НЕРЕ5-тр1с (рН 7.5 при 25° С), 100 мМ Д-сорб1тол, 0,1 мМ MgCl2, 100 мМ НаС1 або 100 мМ КС1, 0,1 мМ фен1лалан1н або 0,1 мМ лейцин. Реакц1ю 1н1ц1ювали внесениям 0,05 мг б!лку в пробу. Дифуз1ю ам!нокислот оц1нювали за к1льк1стю накопиченого м1ченого субстрату препаратами ЩК, як! попередньо були навантажен1 нем1ченим фен!лалан!ном або лейцином.

Реакц!ю зупиняли шляхом швидкого ф1льтрування через мембран-н1 ф!льтри. Рад1оактивн1сть препарат1в визначапи за допомогою р!-динно-сцинтиляц1йного л!чильника БЬ-4000 ф1рми "1п1ег1ес1т1яие". Статистична обробка даних проводилась загапьноприйнятими методами вар1ац1йно! статистики [Плохинский, 1980].

РЕЗУЛЬТАТ!) ТА ¡X ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення функц1онального стану мембрани ЩК тонкого кишечника щур!в через 1 добу п1сля рентген1вського опром1нення в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Гр показало, що активн!сть маркерних фермент1в ц1е1 мембрани - лужно! фосфатази та *-глутам1лтрансферази, а також Мя"4-АТФази практично не зм1нюбться при вс1х дозах опром1нення. Найб1льш рад1очутливою е Саг *-АТФаза. активн1сть яко! знияуеться в 1,7 раз!в при опром1ненн1 дозою 0,5 Гр з подальвим р1зким I! зменшенням при зб!льшенн1 дози опром1нення. Але, грунтуючись на л!тературних даних, участь И в транспорт! Са2* мембранами ЩК

- 9 -

остаточно не доведена [Ohta, 1989].

Кальц1й-транспортуюча здатн!сть мембрани ЩК ентероцит1в п!сля д11 рентген1вського опром!нення. Одним э основних мехаи1зм1в транспорту капьщю через мембрану CJK е пасивне перенесения 1ону за електрох!м1чним град1ентом (Van Os, 1987]. Досл!дження накопичення Са2+ везикульованими - мембранними препарата}/.» ЦК св!дчить. цо в присутност! 1 иМ ЕДТА в

9 +

промиваючому розчин1 знижуеться к1льк1сть накопиченого Са~ як в

контрольних. так 1 в препаратах, одержаних з опром1нених тварин,

х1д к1нетичних кривих при цьому не зм1нюеться (рис.1 А, Б). Кр1м

того, встансзлено, що за даних умов (тобто в присутност! ЕДТА)

частково зменауеться 1 р!зниця м!ж р!внями накопичення Са'* в

контрольних та опром!нених препаратах. Отже, одн1ею з можливих

причин зб!льшення р!вня накопичення Са2+ теля опром1нення е до-

даткова сорбц1я 1она на зовн!шн!й поверхн! мембрани ЩК.

При визначенн! початково! швидкост! накопичення Са'1' виявле-

но зростання даного параметра з п1двищенням дози опроьДнення в

1.2; 2.0; 2,8 i 2.9 раз!в при д11 доз 0,5; 1.0; 2,0 1 3.0 Гр,

в!дпов!дно. прр!вняно з контролем. Початкова швидкЛсть накопичен-2 ♦

ня Са в препаратах з опром1нених тварин е вицою в!д контрольного р1вня, незалехно в1д вм!сту ЕДТА в промиваючому розчик!. Це доэволяе ствердхувати про зростання ивидкост1 транспорту Са всередину везикул ЦК, а не т1льки про його сорбц!о назови!.

Доказом !снування трансмембраннного перенесения Са2' е стимуляц1я його накопичення та виходу в присутност! кальц1евого !онофору А23187 (25 ыкМ), ио виявлено як в контрольних, так 1 одержаних з опрон!нених тварин препаратах.

К1нетичний анал1з процесу транспорту ionlB капьц1ю св1лчить про зростання максимально! швидкост! (Vnax). накопичення Са?' в

- IÜ

1,6; 1,7; 2,0 1 2,2 рази при опром1ненн1 в дозах 0.5; 1,0; 2,0 1 3,0 Гр, в1дпов!дно, пср1онлно з контролем (табл.1). При цьому спор1днен!сть (Кга) ц1е! транспорт?! системи до субстрату практично не зм!нюеться.

Таблиця 1.

К111ЕТНЧ111 ПАРАМЕТР!! ПАСНШЮГО ТРАНСПОРТУ Са2*

МЕМБРАНАМИ <М ± Щ1ТК0В01 КАЙМИ ш, п-4-6) ТОНКОГО КИШЕЧНИКА

■ 1 Уиови 1 1 досл1ду 1 Параметр» 1

Ка. мМ 1 Увах. I' 1 нмоль/мгб1лку-хв 1 1 1

1 Контроль I 1.12 ± 0.06 1 1 1 24.8 ±1,8 1 1 |

1 0.5 Гр 1 1.10 ± 0,05 1 1 1 40,2 ± 2.5* 1 1 |

1 1.0 Гр 1 1.02 ± 0.01 1 1 1 43,3 ±2,3* 1 1 |

1 2.0 Гр 1 1.22 ± 0,05 1 53.5 »3,5' 1

1 3.0 Гр 1 1.24 ± 0,06 1 1 I- 55.5 ± 3,8* 1 1 1

1 1.0 Гр 1 1 через 14 д1б 1 1 1.14 ± 0,05 1 1 1 33.5 ± 2.6* 1 ............... 1

* - Р < 0,05 по в1дношенню до контролю

- is -

Пасивне накопичення Саг+ везикульованими мембранами ЩК знач-

ною Mipon визначаеться прониклив1стю мембрани для даного 1она. В

? ♦

зв'язку з цш вивчали вих!д Са з попередньо пасивно навантаже-них везикул ЦК в середовшце, яке м1стить ЕГТА. За даних умов фаза вив1льнення Са2*. вЦобраяуе прониклив1сть везикул ЩК для капьц1ю. Встановлено, що з1 зб1льионням дози опром1нення прониклив1сть мембрани ЩК зростае. 0держан1 результат узгодауються з в ¡допою для плазматичних мембран 1нанх кл!тин реакц1ею на д1ю 1он1зуючого випром1нйваиня [Рыскулова, 1986; Дворецкий, 1990].

2 ♦

Отяе, рад1ац1йно-1ндуковане порушення транспорту Са прояв-ляеться в зб1льшенн1 швид1сост1 трансмембранного перенесения ioHa внасл1док п1двицення проникливост! мембрани ЩК 1, можливо, також виникнення як специф1чних, так 1 неспециф1чних шлях!в транспорту кальц1ю [Braun, 1984; Van Os, 1987].

В1домо, цо зв'язуЕання Са2* е необх!дною стад!ею трансмембранного 1 транскл1тинного перенесения даного 1она 1, кр1м того, мембран1 ЩН. властива досить висока Са2> -зв'язуюча здатн1сть [Miller, Tung. 1982]. Тому з mctod б!льи детального визначення механ1зм!в впливу 1он1зуючого випром1нення на процес транспорту loniB кальц!п через мембрану ЩК тонкого кишечника вивчалося пост-рад!ац1йне зв'язування Са2* з ц!ею мембраною.

Лосл1дг.ення зв'язування Са24 з мембранной, поверхнев ЩК i анал!з одержаних результатов за методом Скетчарда св1дчать, цо в д!апазон1 концентрац1й Са? * 1x10"4 - 4x10"? Mi.! отрнман! з конт-рольних 1 опром!нених тварин препарати ЩК характеризуються двома типами цэнтр!в зп'язування ; Саг*-эв'язуюч1 д1лянки 1 типу, уявна константа дисоц!ацП (Kj) яких становить 2,ЗхЮ"4 М 1 вони воло-гНють б!льы високою спор!днен1стю до Сас\ та д1лянки 2 типу з К.,-1,2x10"' И (табл.2). Зг1дно з даними л!тературн [Miller, 19813

уявна константа днсоц!ац1! для д1лянок 2 типу в1дпов1дае величин! Kj для центр1в низько! спор1дненост1. Встановлено, qo значения уявно! константи дисоц1ацП комплексу "Са'* - мембрана ЩК" практично не зм1нюеться при вс1х дозах опром1нення, пор!вняно з контролем (табл.2). В той же час вопив 1он1зуючо! рад!гц1! викликае зб1льшення к!лькост1 центр!в зв'язування Саг* (п) р1гних тип!в, qo й спричиняе п1до:щення Саг*-зв'язуючо! здатност1 мембран» ЦК. Як св1дчать наведен1 в таблиц! 2 результати. к1льк1сть д1лянок 1 типу эростае приблизно в 2.0 рази незалежно в1д доэи опром!нення, а к!льк1сть д!лянок 2 типу (низько! спор!дненост!) р!зко п!двищуеться з! зб1льсенням дози опром1кення : в!д 1,3 ра-з1в при доз1 0,5 Гр до 2.4 раз!в при дозах 2,0 i 3,0 Гр.

Досл!дження Са2 *-транспортувчо! 1 Са2*-зв'язуючо! эдатност1 ыенбрани BJK через 14 д!б пЮля опром1нення в дсз1 1.0 Гр св1дчмть про часткове в1дновлення к!нетичних параметр1в транспорту iona (табл. 1). qo взаемозв'яэане з! зменшенням к1лькост1 Са2*-зв'язую-чих д!лянок низько! спор!дненост1 (табл.2) до р!вня контроля в цей пер1од. К1льк1сть д1лянок 1 типу (61льшо! спор1дненост1) зализаегься на тому ж р1вн1, як i через 1 добу п1сля олром1неннл.

Вважаеться [Miller, Tung 19G21, цо центри зв'язування Са2* низько! спор1дненост1 (головним чином фосфол1п!ди) розм1цен1 на 30BHlCHift поверхн1 мембрани EJK, а сисско!, як1 м!стять б1лки та фосфопроте1ни, - на внутр1шн1й I! поверхн1. Мокна припустити, ио одна з причин зростання транспорту кальц!п через • мембрану ЩК п!сля опром1нення пов'язана з в!дпов1дним зростанням Са2'-зв'язу-ючих д!лянок на зовн!шн1й поверхн1 мембрани. В той ке час зб1льпення к!лькост1 внутр!шньовез1'.кулярних Са2'-зв'язуючих центр!в, головним чином це д!лянки 1 типу, пора за все обумовлпе п!двищення Са"*-зв'язуючо! емност! мембрани ЩК.

Таблиця Z.

ХАРАКТЕРИСТИКИ Са2+-ЗВ'ЯЗУЯЧИХ Д1Л5Ш0К МЕМБРАННИХ ПРЕПАРАТ1В Щ1ТК0В01 КАЙМИ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА (Н±Ш, п-4-6)

г 1 I Плраыетрк .......1 .1 1

| досаду I .1 тал 2 чкл |

1 1 1 1 1 1 1 1 1 п, { Ра (хЮ"4«) | ЕШЗьСа^/щЧИ.Еяу 1 КЛ (х10~3М) 1 п. 1 | 1шольСз2г/игб1дзчу 1 )' 1

1 1 | Контроль I 1 2.3 ± 0,07 | 1 » 1Б,0 4 1,4 | » 1,2 ± 0,05 1 1 | 41),0 ^ 3,5 | 1 |

1 0,5 Гр 1 1 2,2 ± 0,06 | 1 23,1 4 1,8" | 1 1,1 0,03 1 1 | 57,1 ± 4,3* | 1 !

1 1 1 1,0 Гр | 1 1 1 1,6 ± 0,05 | 1 38,2 ± 2,5* | 1 1,4 ± 0,05 1 1 | 103,0 ± 7,5" 1

1 2,0 Гр 1 2,0 ± 0,06 | I I 20,0 + 2,6* 1 1 1,4 ± 0,05 ! 1 | 110,4 ± 7,8* I

1 ( 1 3,0 Гр | 1 2,1 ± 0,05 ' | 1 I 29,6 ± 2,4* | 1,4 ± 0,05 | 103,5 ± 7,3" |

1 I 1 1.0ГР 1 I через 14 д1б! » 1 2,4 ± 0,06 | I 1 27,0 * 2,0* I 1 1,0 ± 0,04 1 1 | 70,2 ± 6,5* | I 1 »

я - Р < 0,05 по Е1дпсгопст до которого

Досл1дхення накопичекня Са2* в присутност! 1нг1б1тор1в -кадм!ю (1 мМ) 1 лантану (0.5 мМ) - контрольншли препарата».«« ЩК 1 п!сля опром!нення також дозволяе охарактеризувати зм!ни Са"'-зо'язуючо! здаткост1 мембраии ЩК. Як п!до".о, La3* вигЮняе мембранозв'язаний Са'+. не транспортуючись через мембрану tSquler. 1990], a Cd2* конкурус за Са2*-зв'язуюч! д1ллнки як на зовн!ен1й, так 1 на внутр1кн1н мембранн1й поверхн1 (Verbost, 19873. Шдсилення 1нг1буючого ефекту лантану в!д 15 % до ЗОЛ. а такоя зниження р!вню калыДевого накопичення при 1нг1буванн1 кадм!ем в 1,5-2,0 рази з п1двиа;енням дозн опром!нення св!дчить, що променево ураження викликае зб1льиення • доступност! Са '-зв'язуючих д1лянок як на внутр1шн1й, так I на зоен!шн!й поверхн! мембрани ЩК.

Таким чином, р1зноб1чн1 досл1дження механ!зм!в пострад1ац1й-ного порушення процесу транспорту Са" * через мембрану 1!|К дозволяють стверджувати, що при дП 1он1зуючого випрсмшення в дозах 0,5-3.0 Гр зб1льыуеться р!вень i итидк1сть накопичення Са' * везикульованими мембранами ЦК. Причиною* даних зм1н е, з одного боку, зб1льшення проникливост1 net,¡брани, а з другого - зросталня к!лькост1 Саг*-зв'язуючих д1лянок, пери за все, вкасл1док п1двищення IX доступност! на зосн1тий та внутр1сн1й мембранн1й ловерхн1.

Виявлен! рад1ац!йно-1ндукован1 поикодження можуть п^изводити до зм1ни внутр1шньокл1тинно1 концентрацП 1ону, а отке 1 до порушення Са'*-гомеостазу.

Вплив 1он1зусчого опром!нення на механ!зми транспорту а>.|1нокислот через мембрану lilK ентероцит!в.

Зг1дно з даними л1тератури [Stevens, 1982; Satoh, 1989] в мембран! ЩК тонкого мгаечника 1снуе дек1лька шлях 1 в транспорту

нейтральних ам1нокислот - Иа*-залежний, На"-незалежний та пасивна дифуз1я. як! й було досл!джено.

Встановлено, що опром!нення в дозах 0,5; 1,0; 2,0 1 3,0 Гр викликае п1двищення пасивно! дифуз11 фен1лалан!ну та лейцину в середньому в 4,5-5,0 раз1в, пор!вняно з контролеы (рис.2). При-чок|у, на в!дм!ну в1д лейцину, для якого з1 аб!лыаенням дози опром1нення характерно подальше п1двищення дифуз!йного процесу, для фен!лалан1ну зростання дози опром!нення веде до незначного зниження цього процесу (рис.2). Необх1дно п1дкреслити, що зб1льшення пасивно! дифузП даних ам1нокислот п!сля опром1нення е б1льш вираженим в початковий момент часу (30 сек 1нкубац11), н1в в стан! р!вноваги, цо вказуе на зростання саме швидкост1 1х пасивного накопичення.

Досл1дження На* -незалежного шляху транспорту ам!нокислот ( в присутност! К*-град!ента, зверненого ззовн! всередину везикул ЩК) св!дчить, цо його внесок у процес трансмембранного перенесения фен!лалан1ну та лейцину е незначним 1 в!н майке не зм!нюеться при дП 1он1зуючо1 рад!ацП в дозах 0,5-3,0 Гр.

На*-залежний шлях транспорту аы1нокислот через мембрану ЩК визначали як р!зницю накопичення в середовиц! з НаС1 1 КС1. Присутн1сть На*-град1ента. зверненого ззовн1 всередину везикул ЩК. стимулюе накопичення як фен1лалан!ну, так 1 лейцину. Спостер1гаеться так званий ефект "овериуту", тобто значне п1двищення швидкост1 накопичення в початковий момент часу, що тако* вказуе на трансмембранне перенесения даних ам1нокислот (рис.3). Виявлено, що 1он1зуюче випром1нення в досл1д*уваних дозах викликае пригн1чення вторинно активного -залежного транспорту обох ai.il нокислот.

Анал1з к!нетичних параметр1в дозволяе твердити, що дане по-

- il-

a

5'

a>

if g

о

а

6

et о

• I—

Ю

■3

ci

ч

g

<u tr

В

с

y-t-

i

WW

Wi;

''Л-V" .-I

Pite.2. Накотчешя хЧС-йегИлалэнтну /V та С-ле<Ьсшу /Б/ •п-тгогоч пасивно"! ллфузП препарата^! CJ{ оа 30 секунд т j в

коигролт /I/, через I добу птсля спромтнення п лепах 0,5 Гр /2/, 1,0 Гр /3/, 2,0 Гр /4/,'3,0 Гр /5/, ». т---через 14 д{б теля crrpnMÎtre;nirr лозсп Г ,0 Гр /в/, н - Р< 0,05

W-"! р'Г"."

ь

1 '

Ы

Ц'., 'I

1ËS4

60 сек

60 х»

Рис

/-© АЛ

бОхв

а

I

,3. Накопичення ^-фентлалантну /А/ та Т4С -лейцину /Б/ ,\"а*-залеж!(им шляхом хонтролънимп /»/ та препаратами 1ДК, опержяними э опромгнения в позах 0,5 /а/, т,0 Гр /4/, 2,0 Гр /Г/, 3,0 Гр /X/ тварин.

порушення в1дбуваеться внасл1док зниження швидкост1 проходження ам!нокислот через мембрану 1Щ без зм!ни спор1дненост! субстрату до переносника. Показано. с;о б1льи суттеве пригн1чення Иа*-залеяного транспорту характерно для лейцину (Ушах змениуеться в 1,7; 1,8; 2,0 1 2.1 рази при опром1ненн1 в дозах 0,5; 1,0; 2,0 1 3,0 Гр. в1дпов1дно, пор1вняно з контролем), н1в для фен1лапан1-ну (Ушах зменпуеться в 1,25; 1,20; 1,35 1 1,36 раз при дп доз 0,5; 1,0; 2.0 1 3,0 Гр. в1дпов1дно).

0ск1льки руш1йною силою Иа*-залеасного транспорту ам1нокнслот е сформований з зовн1еньо1 сторони оеэшульовашХ мембрани ЩК На*-град1ент, то пострад1ац1йне зб1льшення проникливост1 мембрани ЩК для 1он1в, в тому числ1 1 для На*' (на що вказусться в роботах (Рыскулова. 1986; Дворецкий, 1990]), а отзе 1 б1льи швидке розс1-ювання На*-град1ента, виступае причиною знихення транспорту даних ам1нокислот На*-залехниы пляхом.

Таким чином, при опром1ненн1 в дозах 0.5-3.0 Гр пров1дного значения в порувеннях нехан1зм1в транспорту фен1лалан1ну та лейцину набував зростгння пасивно! . проникливост1 мембрани ЩК тонкого киаечника як для ам1нокислот. так 1 для 1сн1в натр1ю.

Досл1дяення пасивно! дифуз11 фен1лалан1ну та лейцину (рис.2), а такое На*-залежно! системи транспорту лейцину. оск1ль-ки вона е б1льш рад1очутливоп, через 14 д1б п!сля опром1нення в доз1 1.0 Гр св1дчить про практично повне в1дновлення даних процесс транспорту до р1вня контролю за цей час.

Заслуговуе уваги факт неоднакового пригн1чення На*-залежного транспорту фен1лалан1ну та лейцину п1сля опром1нення. Пояснения цьому полягае в тому, цо. на в1ды1ну в1д лейцину. який транспортуеться лише пляхом сп!льним для вс!х нейтралышх ш,(1нокислот. для фен1лапан1ну в 1 дома ще одна На*-эалс-яна систека

транспорту IStevens. 1982; Kudo, 1987; Satoh, 1989]. Отже, менш значне пострад1ац1йне пригн1чення Na+-залежного транспорту фен1лалан1ну св1дчить, цо альтернативна спэциф!чна для фен!лала-HiHy Na4-залежна система транспорту може в1др1знятися за чутли-в1стю до дП 1он1зусчо1 рад1ац11.

Таким чином, рад1ац1йне уразення в дозах 0,5-3,0 Гр через 1 добу п1сля опром1нення викликае поруиення процес!в транспорту Са2*, фен1лалан!ну ха лейцину через мембрану ЩК тонкого кишечника, як! посилюються з1 аб1льоенням дози. Основною причиною пошкодження транспортних властивостей мембрани ЩК лЮля променевого впливу в досл1джуваних дозах с зростання проникливост! ц!е! мембрани як для 1он1в так 1 для ам1нокислот. Виявлене п!двищення Са2,-зв'язуючо1 здатност1 мембрани ЦК в1дбуваеться лиае за рахунок зб!льшення к1лькост1 Са2*-зв'язуючих д1лянок на мембран!. В той «е час спор1днен1сть Са" та ам!нокислот до !х переносник!в залишаеться незм1нною п!сля опроы1нення.

Кр1м того, встановлено, що через 14 д!б (п1сля опром!нення дозою 1,0 Гр) в1дбуваеться майже повне в!дновлення транспортно! Функц11 мембран ЦК.

Отже, виявлен1 поруиення, мабуть, в перау чергу обумовлен! конформац1йниыи ам!наыи 61лкових та л1п!дних компонент!в мембрани ЩК, порушеннями б1лок-л1п!дних та л1п!д-л1п1дних взаемод!й, а також зм1нами в л!п1дному склад1 мембрани. Суттеве поикодження меибранозв'язаних переносник1в за дашх умов опром1нення навряд чи в1дбуваеться.

- ¿21 -висновки

1. Тотапьне рентген1вське опром1нення безпор!дних щур1в-самц1в в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр через 1 добу викликае зростання швидкост! транспорту 1он1в капьц1ю через мембрану щ1тково! ¡<айми тонкого кишечника внасл1док зб!льиення проникливост1 мембрани для даного 1ону та п1двицення к1лькост! Са2*-зв'язувчих д1лянок на мембран1. Результатом цього може бути поруиення внутр1шньокл1тинного Са2|-гочсостазу.

2. За даних умов опром!нення зб!льшуеться пасивна дифуз1я фен!лалан1ну та лейцину через мембрану щ1тково1 кайми, а такоя пригн1чуеться 1х транспорт -залеаним шляхом. Вплив 1он1зуючо1 рад1ацП на перший процес е б1льш вираиеним.

3. Ма'-залеяна система транспорту фен1лалан!ну, пор1вняно з лейцином, е мени рад1очутливою, цо вказуе на 1снування в мембран1 щ1тково1 • каймн тонкого кишечника щур1в специф1чних до д11 рентген! вського onpoi.il нення систем трансмембранного перенесения нейтральних ам1нокислот.

4. 1он1зупче випром1нзовання в дозах 0,5-3,0 Гр через 1 добу викпикае зменаення активност1 Са2* -АТФаэн мембрани ц1тково! кайми, в той час як активност1 Щ2'-АТФази, лунно! фосфатази та *-глутам1л'трансферази практично не зм1ншться.

5. Функц1онування кальц1й-транспортуючих систем, а також систем транспорту фен1лалан!ну та лейцину мае здатн1сть в1дновлюватися до контрольного р1вня через 14 л1б п!сля опром!нення.

- 22 -

ПЕРЕЛ1К POSIT. ЩО ОПУБЛ1КОВАН1 ЗА ТЕМОЙ ДИСЕРТАЦ1!

1. Степанов D.B., Векслярский Р.З;, Степанова Л.И.. Коваленко И.Е.. Кучеренко Н.Е. Функциональное состояние ферментов тонкого кишечника при длительном воздействии малых доз ионизирующей радиации // Тез. докл. Радиобиол. съезда. Киев, 20-25 сент., Пущино. 1993. - Т. 3.-С. 957.

2. ХижнякС. В., Коваленко 1.6., Войц1цький В.М., Кучеренко М.е. Прониклив1сть мембран щ1тково! кайми тонкого кишечника цур1в для 1он1в кальц1с п1сля впливу рентген1вського випром1нення II Доп. ПАН Укра!ни. - 1994,- N 7.- С. 146-148.

3. Коваленко I.E., ХижнякС. В., Степанов Ю. В., Войц1цький В.М., Кучеренко M.G. Вплив рентген!вського опром!нення на транспорт 1он1в кальц1ю мембранами еп!тел!альних кл1тин тонкого кишечника // Тези доп. 1 з'1зду Укра1нського б1оф1зичного товариства, Ки!в 20-24 черв. 1994, Ки1в, 1994.- С.48.

4. Коваленко I.E. Вивчення транспортно! функц11 мембран щ!тково1 кайми тонкого кишечника п1сля впливу малих доз рентген1вського випром1нення // Зб1рник праць студент1в та асп1рант1в Ки1в. ун-ту, Ки1в 1994. С.87-96.

5. ХижнякС.В., Коваленко 1.Б., Ващенкр I.B., Войц1цький В.М. Вплив 1он1зуючо1 рад1ац11 на транспорт! властивост1 мембрани щ!тково! кайми тонкого кишечника // Укр. б1ох1м. курн.-1995.- Т. 67. N 4.- С. 53-56.

6. Hizhnyak S.V., Kovalenko I.E.. Stepanov Y.V.. Vashenko I.V., Voltsitsky V.M. Changes of calcium fluxes in small intestine Induced by ionizing radiation // Abstr. Inter, Symp. "Biological nobility", Moscow. 1994. P.135.

Kovalenko I.E. Transport function of brush-border renbrar.e of snail Intestinal epithelial cells after Irradiation exposure (manuscript).

The dissertation work for the degree of candidate of biological sciences (speciality 03.00.08 - radlobiology). Institute of experimental pathology, oncology and radicbiology cf Ukrainian NAS. Kiev, 1S95.

6 scientific works are defending, - they have include data about effect of ionizing Irradiation in doses 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Gr on transport of calcium ions and neutral aalno acid -phenylalanine and leucine by rats snail intestinal brush-border meir.brane, and also on the enzymes activity of alkaline phosphatase, tf-glutarayltranspherase and Ca2 +,J'g2 + -ATPase in these membrane.

Коваленко И.Б. Транспортная функция мембраны веточной кайчы

эпителиальных клеток тонкого_кишечника после_воздействия

ионизирующей радиации (рукопись).

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.08 - радиобиология. Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Укрглкы, Киев, 1SS5.

Защищается 6 научных работ, в которых содержатся данные о воздействии ионизирующей радиации в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Гр на транспорт ионов кальция и нейтральных аминокислот - фенилала-нина и лейцина, а такие на активности щелочной фосфатазм, *-глу -тамнлтрансферазы и Са2*',Hg2'-АТФазы мембраны щеточной наймы тонкого кишечника крыс.

Ключов! слова: менбрана ц1ткогзох кайьи, ентероцити, тонкий киаечник, капьц1й, фен!лалан1н, лейцин, 1он1зуючя спром1иеиня, дози.