Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт одновалентных катионов в вэритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транспорт одновалентных катионов в вэритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт физиологии им. И.П. Павлова

>п Г о 071-

- 1 ДПР Ш)

На правах рукописи

Макаров Владимир Львович

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ В ЭРИТРОЦИТАХ КРОЛИКОВ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ

Специальности: 03.00.04 - Биохимия

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научный руководитель: доктор медицинских наук С.К. Чурина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук H.H. Иезуитов

доктор биологических наук A.M. Казеннов

Ведущее учреждение: С.-Петербургский Государственный Университет, биологический факультет.

Защита диссертации состоится »22« 61/1/1 <? Л A 1QQQ г_ в/^^часов на заседании Диссертационного совета К 002.36.01 присуждению ученой степени кандидата наук при Институте физиси гии им. И.П. Павлова РАН по адресу: 199034, С.-Петербург, наб. Макарова, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан '- н 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Э.А. Кон

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных функций биологических мембран является поддержание неравновесного распределения ионов между цитоплазмой клетки и внеклеточной средой. В этом процессе принимают участие различные ион-транспортирующие системы, осуществляющие пассивный, активный, а также вторично-активный трансмембранный транспорт катионов и анионов. Важнейшее место среди этих систем занимает Na+,K+-насос, ответственный за поддержание низкой внутриклеточной концентрации натрия и высокой внутриклеточной концентрации калия за счет активного (против электрохимических градиентов) транспорта этих катионов (Skou, 1990). Поэтому исследование возможности воздействия различных внешних факторов на функционирование этой ион-транспортирующей системы в эритроцитах представляется достаточно важным и актуальным.

Системы Ыа^Н^-обмена и Na+/Na+ (NaVLl4")-обмена также участвуют в трансмембранном обмене ионов натрия. Ыа+/Н+-обмен, обнаруженный в плазматических мембранах клеток многих типов, принимает участие в регуляции внутриклеточного рН и объема клетки, а также в процессах клеточного роста и пролиферации (Mahnensmith, Aronson, 1985). Физиологическое значение эквивалентного Яа+/!1а+-обмена, оцениваемого обычно по скорости Na+/Li+-npoTHBOTpaHcnopra, остается невыясненным (Rutherford et al, 1992). Некоторыми авторами была выдвинута гипотеза о молекулярной идентичности переносчиков, осуществляющих Na+/H+-и Na+/Na+(Na+/Li+)-обмен (Aronson et al., 1982; Grinstein et al.,

1984). Результаты различных экспериментальных работ свидетельствуют как в пользу упомянутой выше гипотезы, так и против нее. Данные о возможной модуляции активности Na+/H+- и Na+/Li+-противотранслорта различными экзогенными факторами также могут пролить некоторый свет на эту проблему.

Одним из внешних факторов, способных оказывать влияние на различные процессы, протекающие в организме животных и человека, является холестерин, поступающий в организм с пищей. С одной стороны, являясь структурным компонентом клеточных мембран, холестерин необходим для нормального функционирования многих мембранных ферментов и модулирует активность некоторых трансмембранных процессов (Yeagle,

1985). С другой стороны, холестерин, циркулирующий в крови в составе липопротеинов, играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза (Климов, Никульчева, 1995). Довольно обширный материал накоплен о регу-

ляции экзогенным холестерином in vitro и in vivo активности Na+,K+-насоса эритроцитов. В то же время эти данные достаточно противоречивы. В литературе отсутствуют сведения о модуляции холестерином, содержащимся в пище, активности Na+/H+- и №а+/1Л+-обмена, а также систем котранспорта ионов в эритроцитах лабораторных животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование активности некоторых ион-транспортирующих систем в эритроцитах кроликов с нормальным содержанием холестерина в плазме крови, а также в эритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхо-лестеринемией. Кроме того, предполагалось получить данные о возможных механизмах модуляции экзогенным холестерином активности некоторых систем транспорта одновалентных катионов в эритроцитах кроликов. В работе были поставлены следующие задачи:

Исследование активности Na+,K+-насоса, Na+,K+,2C1~- котранспорта, К+,С1~-котранспорта (в изоосмотических и гипоосмотических условиях), Na+/Li+-o6MeHa, Na+/H+-o6MeHa, индуцированного зачислением цитоплазмы, в эритроцитах контрольных кроликов и кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией.

2. Исследование активности Na+,K+- насоса и Na+/Li+-cx5MeHa в эритроцитах кроликов на различных сроках кормления холестерином, а также через разное время после отмены кормления.

3. Исследование влияния экспериментальной гиперхолестеринемии у кроликов на содержание холестерина в плазматических мембранах эритроцитов.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что экперимен-тальная гиперхолестеринемия у кроликов, вызванная скармливанием животным раствора холестерина в растительном масле, не сопровождается ивменением содержания холестерина в мембранах эритроцитов. При этом наблюдается значительная активация Na+,K+-насоса, а также существенное снижение активности Na+/Li+-o6MeHa и индуцированного гипоосмоти-ческим набуханием К+,С1"-котранспорта в эритроцитах экспериментальных животных по сравнению с контрольными. Модуляция активности Na+,К+-насоса и Ha+/Lí^-обмена имеет место лишь по истечении достаточно длительных сроков кормления животных холестерином; нормализация активности этих ион-транспортирующих систем после отмены кормления холестерином также наблюдается со значительной задержкой во времени. Отсутствие изменений в активности амилорид-ингибируемого На+/Н+-обмена в эритроцитах кроликов с повышенным холестерином плаз-ми по сравнению с контролем свидетельствует о том, что амило-

рид-чувствительная изоформа NaVH+-обменника не осуществляет Na+/L1противотранспорт.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах модуляции экзогенным холестерином активности некоторых ион-транспортирующих систем эритроцитов и могут внести вклад в изучение патологических процессов, связанных с нарушениями лштидного обмена.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз" (С.-Петербург, 1995), на семинаре в Институте диабета (Карлсбург, Германия, 1995), на заседании отдела физиологии висцеральных систем Института физиологии им. И.П.Павлова РАН, на расширенных лабораторных заседаниях лаборатории кардиологии Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результа-тоь исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 236 наименований. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы и 25 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И ЬЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовались кролики-самцы породы шиншилла. Масса животных к началу серий экспериментов составляла 2,3-2,5 кг.

Использовался классический метод получения алиментарного атеросклероза у кроликов, разработанный Аничковым (Аничков, 1956). Экспериментальные животные ежедневно (или практически ежедневно) в течение 2-3,5 мес. принудительно получали различные количества холестерина (ХС), растворенного в растительном масле. Контрольные животные получали эквивалентные количества растительного масла.

Пробы крови забирали из ушной вены кроликов. Эритроциты выделяли центрифугированием; осадок эритроцитов промывали 2-5 раз различными средами (в зависимости от проводимого эксперимента). Все операции с эритроцитами проводили при температуре 0-2°С. Упакованные клетки хранили на льду не более б часов.

Тени эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза (Dodge et.al., 1963).

Экстракцию липидов из теней эритроцитов проводили с использова--шем смеси я-гексана и изопропанола (3:2 по объему) (Нага, Radln, 1978). Для определения суммарного содержания ХС в тенях эритроцитов

- б -

использовалась реакция окисления ХС хлорным железом в присутствии уксусной, фосфорной и серной кислот (Courchaine et al., 1959). Концентрацию холестерина представляли в мг на 1 мг мембранного белка.

Содержание белка в мембранном препарате определяли по реакции с красителем Кумасси G-250 по методу, описанному ранее (Gogstad, Krut-nes, 1982).

Концентрацию катионов в эритроцитах определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS-3 ("Carl Zeiss", Германия) после лизиса клеток в 30-кратном объеме 0,1 М HCl.

Содержание внутриклеточной воды в эритроцитах определяли гравиметрически по методу, описанному ранее (Walter, Distler, 1982).

Активность Na+,K+-Hacoca в эритроцитах оценивали по уаба-ин(1мМ)-ингибируемым компонентам входного потока ионов 86Rb+ или 85Rb+. В случае использования в качестве метки радиоактивного изотопа рубидия (86Rb+) в среду инкубации вносили небольшое количество 86RbCl (1 мкКи/мл); для измерения входа метки в эритроциты использовали жидкостной сцинтилляционный счетчик радиоактивности. В случае использования стабильного изотопа рубидия среда инкубации, не содержащая ионов К+, включала 10 мМ RbCl; вход рубидия в этом случае определяли атомно-абсорбционным методом. Скорость Na+,K+,Cl~-KOTpaHC-порта в эритроцитах оценивали по уабаин(1мМ)-резистентным, бумета-нид(0,01мМ)-ингибируемьм компонентам входного потока 86Rb+; скорость К+,С1_-котранспорта - по уабаин + буметанид-резистентным, фуросе-мид-ингибируемым компонентам входа рубидия. Активность К+,С1~-кот-ракспорта, индуцированного гипоосмотическим набуханием клеток, регистрировали как уабаин-резистентную компоненту входа рубидия в ги-поосмотической среде. Об активности амилорид-чувствительного Na+/H+-o6MeHa в эритроцитах судили по амилорид(1мМ)-ингибируемой компоненте входного потока 22Na+, индуцированного закислением цитоплазмы клеток (Ддн+~индуцированного) (pHi ~ 6,2). Внутриклеточную pH определяли по методике, описанной ранее (Orlov et al., 1989).

Активность системы Na+/Li+-o6MeHa исследовали, регистрируя выход ионов лития из нагруженных литием эритроцитов в среду, содержащую ионы Na+, и в безнатриевую (МйС^-содержащую) среду, в условиях заингибированной уабаином №+,К+-АТРазы (Canessa et al., 1980).

Содержание холестерина в плазме крови измеряли с использованием реактива Либермана-Бурхарда (Прохорова, Гупикова, 1965).

Содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в плазме определяли турбидиметрическим методом с использованием осаждения липоп-

ротеинов гепарином в присутствии хлорида кальция (Burstein, Samall-le, 1958).

В таблицах представлены средние арифметические исследованных параметров по группам животных (АО и их стандартные ошибки (SE). За достоверные принимались различия между средними величинами по группам с достоверностью по t-критерию Стьюдента больше 0,95 (р<0,05). Расчет коэффициента корреляции (г) и уровня значимости коэффициента корреляции (р) проводили по программе пакета Statgraphlcs для линейной регрессии. При малых выборках для расчета уровня значимости коэффициента корреляции использовался метод "Z" Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И »X 0БСУЖДЕШ5Е

1. Первая эясперииепишьвая серия.

В первой серии экспериментов исследовалось влияние экспериментальной гиперхолестеринемии на транспорт одновалентных катионов (Дин+-индуцированный Na+/H+-o6MeH, Na+/Ll+-обмен, Na+,K+-Hacoc, Na+, К"\ 2С1котранспорт, К+,С1~-котранспорт), внутриклеточные концентрации катионов Na+, К+, Mg2+ и содержание мембранного холестерина в эритроцитах кроликов. Для этой цели 8 животных ежедневно в течение 2-х месяцев получали по 0,5 г холестерина; 3 кролика служили контролем.

1.1. Na+/H* и Nä*/Li+-обмен

Как видно из табл. 1, по истечении срока кормления экспериментальных животных холестерином уровень ХС и ЛПНП в плазме возрос по отношению к контролю в 12 и 18 раз соответственно. При этом суммарный индуцированный закислением цитоплазмы вход Na* в эритроциты кроликов экспериментальной группы был в среднем в 3,5 раза ниже контроля. В то же время скорость №+/Н+-обмена, регистрируемая как амило-рид-ингибируемая компонента входа натрия в эритроциты, статистически не различалась у животных обеих групп.

Скорость Na+/Li+-обмена в эритроцитах кроликов с высоким ХС плазмы была в среднем в 3,5 раза ниже контроля. Активность обменника хорошо коррелировала с уровнем ХС (г=-0,970, р<0,002) и ЛПНП (г=-0,950, р<0,01) в плазме. Корреляция между скоростью Na+/Li+-o6-мена и Лр.н+-индуцированного Иа+/Н+-обмена отсутствовала; активность Ма+/Ы+-противотранспорта достоверно коррелировала с амилорид-не-чувствительной компонентой Дин+-индуцированного входа Na+ в эритроциты (г=0,936, р<0,05).

Таблица 1. Влияние экспериментальной гиперхолестеринемии на активность ион-транспортирующих систем и некоторые другие параметры эритроцитов кроликов

1 I Исследованные 1 параметры Контрольная группа (//=3) I 1 |Экспериментальная| | группа | | 1

1 1 |Концентрация в | холестерин 55±13 1 |643±62* 1 слг=в) I

|веса на 100 мл | ЛПНП 104±32 1 |1864+130* 1 (N=8)|

I индуцирован-1 суммарный 174,1±21,2 1 150,0+9,0* 1 (N=6) |

|ммоль Иа+/ч на | |1 л клеток 1 р | амилорид-ингибируемый 2б,1±7,3 1 |30,7±7,9 I 1 № 6) I

| На+/Ы+-обмен, | ммоль Ы+/ч на 1 л клеток 6,68±0,53 1 |1,91±0,47* 1 1 (N=6)|

|Ма+,К+-насос 1 | ммоль 0,81±0,04 1 11,б2±0,13* 1 (ЛГ=8) |

|Na+,K+,2Cl -котранспорт| на 1 1 ^ _ 0,02+0,05 1 |0,004±0,016 1 (.N=8) |

1 1К+,С1"-котранспорт | клеток I 0,06±0,03 1 |0,06±0,01 1 (N=8)1

I 1 (концентрация катионов | Ма+]1 1 „ --------------- 1 21,2±0,6 1 |16,8±1,2 1 (N=8)1

Iммоль на 1 л |внутриклеточной |воды 1 ГК+]1 1 170,3±3,4 1 (164,6±4,2 I (N=8) |

1 1 шт^ь 1 4,81±0,18 1 |4,52±0,20 1 (N=8)(

(содержание воды в |л на 1 л клеток эритроцитах, 0,62±0,03 1 |0,60±0,01 1 1 (N=8)|

(концентрация холестерина в тенях |эритроцитов, мг на 1 мг белка | 0,078±0,011 1 (0,075±0,00б 1 1 (А/=8) | 1

Примечание: * - р<0,01

Полученные данные об активности Ua+/Ll*-противотранспорта и амилорид-чувствительного Ма+/Н+-обмена в эритроцитах экспериментальных животных позволяют сделать определенные выводы относительно природы переносчика, ответственного за Na+/Li'l"-o6MeH, а именно относительно гипотезы о том, что Ma+/Na+-прогивотранспорт можно рассматривать как одну из мод функционирования Ма+/Н+-обменника (Aronson et al., 1982; Grlnstein et al., 1984). В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о снижении скорости Na+/Na+-обмена в эритроцитах человека и кролика при закислении цитоплазмы (Canessa, Spalvins, 1987; Escóbales, Rivera, 1987). Кроме того, известно, что активность Ма+/Ма^"-обмена, оцениваемая по скорости Ма+/1л+-противотрансггорта, повышена в эритроцитах больных первичной гипертензией (Canessa et al., 1980; Aronson, 1982), а также при некоторых других клинических состояниях, включая диабет (Rutherford et al., 1992). В то же время аналогичные данные были получены при исследовании активности индуцированного закислением цитоплазмы Na+/H+-обмена в эритроцитах больных гипертонической болезнью (Орлов и др., 1988; Sempliclnl et al., 1989) и инсулин-зависимым диабетом (Huot, Aronson, 1991), что косвенным образом подтверждает гипотезу о том, что системы Na+/Na+- и Ма+/Н+-противотранспорта представляют собой две функциональные моды одного ионного переносчика. Результаты многих экспериментальных исследований, однако, свидетельствуют против молекулярной идентичности этих ион-транспортирующих систем (Орлов и др., 1992; Escóbales, F1-gueroa, 1991; Busch, Slffert, 1992). Гот факт, что в нашем исследовании экспериментальная гиперхолестеринемия у кроликов приводила к существенному ингибированию Na+/Li+-o6MeHa в эритроцитах, не сказываясь на активности амилорид-чувствительного Na+/H+-обмена, позволяет сделать вывод о том, что амилорид-чувствительная изоформа Na+/H+-обменника (NHE-1) не участвует в процессе Na+/Li+-np0THB0T-ранспорта в эритроцитах. Амилорид-резистентная компонента входа Na+, предположительно состоящая из вклада Na+/Na+-o6MeHa и амилорид-резистентного Ка+/Н+-обмена, была значительно снижена в эритроцитах экспериментальных животных. Поскольку неизвестно, экспрессирована ли в эритроцитах кролика одна из известных амилорид-резистентных изо-форм Na+/H+-обменника (NHE-2, NHE-3, NHE-4), остается возможность того, что этот гипотетический переносчик осуществляет Na+/Li+ (Na+/Na+)-противотранспорт.

1.2. Na+, К*-насос

Как видно из табл. 1, активность Na+,K+-насоса, определяемая по уабаин-ингибируемой компоненте входа 86Rb+, в среднем на 100% увеличена в эритроцитах кроликов с гиперхолестеринемией по отношению к контролю. Корреляционный анализ обнаруживает наличие достоверной положительной корреляции между активностью этой ион-гранс-портирующей системы и уровнем ХС (г=0,885, р<0,01) и ЛПНП (г=0,757, р<0,05) в плазме.

1.3. Na*,2СГ-котранспорш и К¥, С1~-котранспорт

Мы не обнаружили достоверной активности систем Na+,K+,2C1~- и К+,Скотранспорта в эритроцитах всех исследованных животных независимо от уровня ХС (ЛПНП) в плазме (табл.1), что согласуется с данными работы Орлова и др., в которой также отмечалась неактивность систем котранспорта в формировании входящих потоков рубидия в эритроциты кролика в изоосмотических условиях (Орлов и др., 1992).

1.4. Внутриклеточные концентрации катионов и содержание воды в эритроцитах

Концентрация натрия в эритроцитах кроликов с гиперхолестеринемией была в среднем на 21% ниже контроля (табл. 1). Имела место достоверная обратная корреляция между содержанием внутриклеточного натрия и уровнем ХС (г=-0,752, р<0,05) и ЛПНП (г=-0,704, р<0,05) в плазме. Концентрация натрия в эритроцитах достоверно коррелировала с активностью Na+,K+-Hacoca (г=-0,779, р<0,02). Содержание ионов кания и магния, а также содержание внутриклеточной воды в эритроцитах контрольных и экспериментальных животных было статистически неизменным независимо от уровня плазменного ХС (табл.1).

1.5. Содержание холестерина в тенях эритроцитов

Содержание ХС в тенях эритроцитов, полученных методом гипоос-мотического гемолиза, не различалось у кроликов, получавших низко-и высокохолестериновую диету (табл.1).

Данные настоящего исследования о стимулирующем влиянии диетического холестерина на активность Na+,K+-насоса расходятся с результатами некоторых экспериментальных работ, в которых высокохолестериновая диета приводила к ингиСированию этой ион-транспортирующей системы в эритроцитах кроликов (Торховская и др., 1980; Uysal, 1986). Это расхождение, однако, становится более понятным, если учесть, что во всех исследованиях, в которых наблюдалось снижение активности №+,К+-АТРазы в клетках экспериментальных животных, вызванное потреблением избыточного экзогенного ХС, было зафиксировано

повышение концентрации ХС в клеточных мембранах. Многочисленными опытами In vitro было показано, что мембранный ХС в высоких концентрациях подавляет активность натриевого насоса, что объясняется, вероятно, снижением конформационной подвижности фермента в более упорядоченной структуре мембраны, обогащенной холестерином (Yeagle, 1989). В то же время многими авторами показано, что повышение содержания ХС в эритроцитах экспериментальных животных различных видов сопряжено с развитием гемолитической анемии, в то время как повышение уровня плазменного холестерина у кроликов до очень высоких ' величин при отсутствии признаков гемолитической анемии не приводит к изменению содержания мембранного ХС (Westerman et al., 1970). Повышенный уровень мембранного холестерина обнаружен в деформированных эритроцитах ("spur cells") больных анемией (Cooper, 1969). Известно, что на перенос холестерина между липопротеинами низкой плотности и мембранами эритроцитов In vitro оказывают влияние процессы перекисного окисления липидов (Панасенко и др., 1987). Продукты этих процессов, возможно, играют определенную роль в патогенезе различных форм гемолитической анемии (Chiu et al., 1982). Уровень перекисных соединений липидов в плазме и в эритроцитах кроликов коррелирует с пониженной активностью Na+,К+-АТРазы и повышенной концентрацией мембранного холестерина (Uysal, 1986). Таким образом, можно предположить, что подавление по какой-либо причине процессов перекисного окисления липидов является фактором (или одним из факторов) , препятствующим обогащению мембран эритроцитов холестерином при экспериментальной гиперхолестеринемии.

В литературе описаны различные механизмы модуляции активности Na+,K+-ATPasu в различном временном масштабе (Ewart, Klip, 1995). Отрицательная корреляция активности Na+,K+-Hacoca с внутриклеточной концентрацией натрия позволяет исключить возможность его активации посредством повышения концентрации внутриклеточного субстрата (Na+). Концентрация Mg2+ в эритроцитах кроликов с различным уровнем ХС плазмы достоверно не различалась и, таким образом, не могла влиять на активность Na+,K+-ATPa3H. Известно также, что в отличие от эритроцитов рыб и птиц эритроциты млекопитающих не имеют гормон-активируемых форм ионных переносчиков, поскольку в безъядерных эритроцитах, как правило, отсутствуют те или иные компоненты передачи сигнала от рецептора на эффекторные системы (Орлов и др., 1989). Поэтому изменение гормонального статуса, вызванное скармливанием животным холестерина, вряд ли могло привести к столь значительным изменениям

активности Na+,K+-Hacoca и Ка+/Ы+-противотранспорта.

Модуляция активности На+,К+-АТРазы различных клеток может быть опосредована изменением количества молекул фермента в клеточных мембранах (Sweadner, 1989; Ewart, Klip, 1995). Если подобный механизм модуляции возможен в случае безъядерных эритроцитов, то он должен подразумевать изменение числа молекул переносчика в клетках-предшественниках эритроцитов - клетках костного мозга. Ранее было показано, что ион-транспортирующие системы эритроцитов являются своеобразными молекулярными маркерами, отражающими функционирование генома первичных стволовых клеток костного мозга (Bianchi et al., 1985). Поэтому нам представлялось достаточно обоснованным предположить, что изменения активности Na+,K+-насоса и Ма+/Ь1+-противотранс-порта в эритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринеми-ей обусловлены индукцией или репрессией генов, ответственных за эти ион-транспортирующие системы. Если подобная гипотеза верна, то изменения активности Na^K"1"-насоса и Иа+/1Л+-обмена эритроцитов кроликов не должны наблюдаться на начальной стадии кормления животных холестерином, независимо от прироста плазменного ХС. Чтобы таким косвенным путем проверить упомянутую выше гипотезу, мы провели серию экспериментов, в которой исследовали состояние этих ион-транспортирующих систем в эритроцитах через различные промежутки времени после изменения содержания холестерина в диете.

2. Вторая экспериментальная серия

Во второй серии экспериментов 24 кролика были разделены на 3 группы, по 8 животных в каждой: 1) контрольная группа; 2) первая экспериментальная группа (кролики практически ежедневно получади по 0,4 г ХС); 3) вторая экспериментальная группа (по 0,8 г ХС). Через различные промежутки времени после начала кормления животных соответствующими диетами (20 дней; 1,5 мес.; 2 мес.; 3,5 мес.) у животных забирали пробы крови и проводили исследования активности Na+,K+-насоса и Na+/Ll+-o6MeHa (табл.2). По истечении 3,5 мес. после начала опыта кормление холестерином было прекращено; исследования на эритроцитах проводились также через 2 недели, 2 мес. и 3 мес. после отмены высокохолестериновых диет (табл.3). Кроме того, исследовалось влияние экспериментальной гиперхолестеринемии на вход рубидия в эритроциты в гипоосмотических условиях (Na+,K+-насос, К+,С1~- кот-ранспорт).

Таблица 2. Ма+,К+-насос, Ыа+/1л+-обмен и внутриклеточный Иа* в эритроцитах кроликов на разных стадиях кормления холестерином

I I I I 1 I 1

|Время, Группа ХС в Активность Активность Ма+ в зрит- |

|сутки плазме, Ма'Чк*- насоса Na+/Li+-o6MeHa, роцитах, ммоль)

мг на ммоль №+/ч ммоль Ll+/4 на 1 л внутри-|

i 100 мл на 1 л клеток на 1 л клеток клеточной воды|

г К 40±6 1,64±0,05 9,9±1,2 22,3±2,0 |

1 о 1 41 ±4 1,59+0,06 9,9±1,3 21,8+1,7 |

i 2 41 ±4 1,66±0,08 10,5+1,0 22,9±1,4 |

1 К 37 ±4 1,71±0,08 11,1+1,1 22,5±1,3 |

| 20 1 175±51* 1,64±0,07 9,9±1,3 20,6±1,8 |

2 426163" 1,74+0,10 10,0+0,7 21,3±1,6 |

К 44+3 1,65±0,06 8,8±0,5 23,1±0,4 |

| 45 1 267±81* 1, 95±0,07>' 5,9±0,4* 20,7±1,1 |

i 2 834±145* 1,99±0,20* 4,7±0,7* 19,4±1,4* |

г К 41 ±4 1,65+0,04 9,5±0,7 22,9+0,5 |

| 60 1 297+84* 2,14±0,09* 2,7±0,6* 17,7±0,9* |

2 876±159* 2,40+0,16* 2,0+0,6* 13,9±0,5* |

К 41+2 1,74±0,04 9, 4±0,8 23,1±0,6 |

| 105 1 356±84* 2,21±0,09* 2,5±0,7* 14,7+1,3* |

2 999+168* 2,60+0,29* 1,2±0,4* 13,3±0,7* |

i___i_i_i_i_i_i

Примечания: К - контроль (N=8), 1,2 - первая и вторая экспериментальные группы (N=8); * - р<0,05.

Таблица 3. Иа+, К+- насос, Ыа+/1Л+-обмен и внутриклеточный Иа+ в эритроцитах кроликов после отмены кормления холестерином

Вре- (Группа мя, | сутки(

ХС в плазме, мг на 100 мл

Активность Ма+,К+-насоса ммоль Иэ^/ч на 1 л клеток

Активность Ма+/1Л+-обмена, ммоль 1Л+/ч на 1 л клеток

На в эритроцитах, ммоль на 1 л внутриклеточной воды

|К (Л-8) 11 (№=8) 12 (N=8)

41±2 356±84* 999±168*

1,74±0,04

2,21±0,09*

2,60±0,29*

9,4±0,8

2,5±0,7"

1,2±0,4"

23,1±0,б 14,7±1,3* 13,3±0,7*

14

(К (N=8) И (№• 8) 12 (N=7)

40± 3 190±73" 409±32*

1,73±0,03

2,17±0,08*

2,38±0,24*

10,3±1,1 2,1±0,7* 1,б±0,4*

22,7±0,6

12,9±0,8*

11,9±1,0*

|К (N=8) 60 (1 (N=8) 12 (//=7)

41±5

72±15

90±23

1,64±0,03 1,79±0,04* 2,00±0,17*

10,7±0,8 4,8+0,7* 5,0±0,6*

21,7±1,0

15,1±1,1*

13,8±0,7*

90

|К (N=8)

11 (N=8)

12 (//=7)

39 ±3 45±4 63±22

1,57±0,0б 1,70±0,03 1,93±0,18*

11,2±0,8 7,1*0,8" 6,8±1,0"

20,9±0,9 18,8±1,5 14,4±1,5*

Примечания: К - контроль, 1,2 - первая и вторая экспериментальные группы; * - р<0,05.

2.1. Активность Ма+, ¡С-насоса, На+/И+-обмена и внутриклеточная концентрация Ма+ на разных стадиях эксперимента

На раннем этапе кормления животных специфическими диетами (20 дней) различий в активности Ка+,К+-насоса и Ма+/1л+-обмена, а также в концентрации в эритроцитах контрольных и экспериментальных

кроликов не наблюдалось (табл.2), несмотря на значительное повышение содержания ХС в плазме. Таким образом, на ранних сроках кормления холестерином повышение уровня плазменного ХС (даже весьма значительное) не предопределяет изменений активности этих ион-транспортирующих систем. Эффект повышенного ХС плазмы (активация Ма+,К+-насоса, ингибирование Ма+/1л+-обмена и снижение внутриклеточной концентрации натрия) проявлялся лишь через 1,5-2 мес. после начала кормления холестерином. Эффект усиливался по истечении более длительных сроков кормления и был сильнее выражен у животных второй экспериментальной группы, получавших большее количество ХС.

Из табл.3 видно, что достигнутое через 2 недели после прекращения кормления экспериментальных животных холестерином значительное снижение ХС плазмы не приводило к изменению активности ион-транспортирующих систем и концентрации Иа+ в эритроцитах экспериментальных животных (видимое снижение средней активности натриевого насоса в эритроцитах животных второй экспериментальной группы связано со смертью кролика, характеризовавшегося аномально высокой активностью переносчика). По истечении более длительного времени после отмены высокохолестериновых диет имела место частичная нормализация исследованных параметров эритроцитов экспериментальных животных.

Таким образом, модуляция активности Ма+,К+-насоса и Иа+/и+-обмена в эритроцитах кроликов при изменении содержания холестерина в диете наблюдалась в настоящей работе лишь по истечении достаточно длительного времени после изменения диеты, что косвенно подтверждает высказанное выше предположение о том, что в данном случае модуляция процессов ионного транспорта проявляется по мере обновления клеток, т.е. связана с появлением в крови эритроцитов, мембраны которых содержат отличное от контроля число молекул ионных переносчиков. Среднее время жизни эритроцитов кролика составляет 45-50 дней (Кудрявцев, Кудрявцева, 1972), что неплохо согласуется с данным предположенном. Следовательно, экспериментальная гиперхолестеринемия, возможно, способна воздействовать на экспрессию генома первичных стволовых клеток костного мозга, вызывая индукцию или репрессию генов, ответственных за эти ион-транспортирующие системы. К сожалению, мы не мо-

жем предложить конкретную схему, по которой изменения метаболизма, вызванные потреблением животными избыточного экзогенного холестерина, могли бы влиять на экспрессию генов, кодирующих ионные переносчики. В литературе практически отсутствуют сведения относительно способности различных веществ воздействовать на экспрессию различных изоформ Ма+,К+-АТРазы эритроцитов. Что касается переносчика, выполняющего функцию На+/1Л+(Ма+/№+)-обмена, то он к настоящему времени не идентифицирован.

2.2. Влияние гиперхолестеринемии на транспорт рубидия в эритроцитах в гипоосмотических условиях

Входной поток 1?Ь+ в эритроциты кроликов (суммарный и уабаин-ин-гибируемый) измерялся в начале эксперимента и по истечении 3,5 мес. после начала кормления животных холестерином. Наряду с увеличением уабаин-ингибируемого входа рубидия (Ма+,К+-насос) в клетках кроликов с повышенным ХС плазмы, наблюдалось значительное снижение активности индуцированного гипоосмотическим набуханием клеток К+,С1~-котранс-порта (контроль - 1,2б±0,08; первая экспериментальная группа -0,82±0,10; вторая экспериментальная группа - 0,65±0,13 ммоль №+/ч на 1 л клеток). Следует отметить, что абсолютные величины активности натриевого насоса эритроцитов кролика заметно ниже в условиях гипо-осмоса по сравнению с изоосмотическими условиями. Активность индуцированного гипоосмотическим расширением клеток К+,С1~-котранспорта обратно коррелировала с активностью натриевого насоса, так что суммарный входной поток рубидия в эритроциты был в значительной мере стабилен для клеток животных с различным уровнем ХС плазмы. Поскольку активность системы К+,С1~-котранспорта в настоящем исследовании не измерялась на различных стадиях кормления кроликов холестерином, неизвестно, имеет ли место, как в случае №+,К+-насоса и Ыа+/Ь1+-об-мена, задержка во времени в проявлении модулирующего влияния диетического холестерина.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная гиперхолестеринемия у кроликов, вызванная длительным скармливанием животным раствора холестерина в растительном масле, не приводит к изменению содержания холестерина в плазматических мембранах эритроцитов.

2. Экспериментальная гиперхолестеринемия у кроликов сопровождается значительным (1,5-2-кратным) повышением активности На+,К+-насоса и снижением внутриклеточной концентрации №а+ в эритроцитах.

3. Активность ^-обмена в эритроцитах кроликов с гиперхолес-теринемией снижена в 4 - 8 раз по сравнению с контрольными животными. В то же время активность индуцированного закислением цитоплазмы амилорид-ингибируемого Ма+/Н+-обмена не различается в эритроцитах кроликов с различным уровнем холестерина в плазме, что свидетельствует о том, что амилорид-ингибируемый №+/Н+-обмен и Ма+/Ь1+-обмен осуществляются различными ионными переносчиками.

4. Модулирующее воздействие экзогенного холестерина на активность Ма^К"1"-насоса и На+/1л+-обмена в эритроцитах кроликов наблюдается лишь по истечении достаточно длительного времени (1,5 - 2 месяца) после начала кормления холестерином. Частичная нормализация этих параметров после прекращения кормления холестерином происходит с аналогичной задержкой во времени.

5. Активность К+С1 "-котранспорта, индуцированного гипоосмотическим набуханием клеток, существенно (на 35-50%) снижена в эритроцитах кроликов с гиперхолестеринемией.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TQE ДИССЕРТАЦИИ

1. Орлов С.Н., Кузнецов С.Р., Колосова И.А., Макаров В.Л. Na+/H+- и Na+/Na+-np0THB0TpaHcn0pT в эритроцитах человека, кролика и крысы: доказательства существования двух независимых ион-транспор-тирующих систем. Биохимия. 1994. Т. 59. N 5. С. 639-647.

2. Макаров В.Л., Кузнецов С.Р., Чурина С.К., Соколова А.И. Транспорт одновалентных катионов в эритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией: корреляции с холестерином плазмы. Биохимия. 1994. Т. 59. N 7. С. 1011-1019.

3. Makarov V.L., Kuznetsov S.R. Increased Na+,K+'-pump activity in erythrocytes of rabbits fed cholesterol. Int. J. Exp. Pathol. 1995. V. 76. P. 93-96.

4. Макаров В.Л. Модуляция активности Na+,K+-насоса и Na+/Li+-o6Me-на в эритроцитах кроликов на разных стадиях кормления холестерином. Биохимия. 1995. Т. 60. N 9. С. 1468-1476.

5. Макаров В.Л., Кузнецов С.Р., Чурина С.К. Модуляция активности ион-транспортирующих систем в эритроцитах кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией. Симпозиум 'Липопротеиды и атеросклероз', С.-Петербург, 1995, С. 56.