Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека

Орловский, Игорь Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека"

На правах рукописи

ОРЛОВСКИЙ Игорь Вячеславович

ТРАНСКРИПЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА

03.01.03 - молекулярная биология

005049772

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

і *■ фьв т

005049772

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии (до 2004г. - лаборатория гормонов и рецепторов) Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» Российской академии наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор

Рубцов Петр Михайлович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Лебедев Юрий Борисович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель лаборатории сравнительной и функциональной геномики

Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, руководитель группы гетерологичной экспрессии

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской Академии Наук.

Защита состоится «28» февраля 2013 года в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «28» января 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Значительные достижения геномики на рубеже XX-XXI веков, особенно результаты ;еквенирования геномов различных организмов, составляют основной потенциал для развития новых областей молекулярной биологии — «транскриптомики» и «протеомики». Результатом сравнения -еномов разных биологических видов стал вывод об усложнении регуляции экспрессии генома при тереходе от «низших» видов к «высшим», а не увеличение числа генов, как предполагали ранее. Экспрессия эукариотического генома — сложнейший многоуровневый процесс, одним из наиболее 5ажных этапов которого является транскрипция. В настоящее время на смену представлениям о 1роцессинге, транспорте, редактировании и запрограммированной деградации мРНК как тосттранскрипционных процессах выдвинута «гипотеза сопряжения» о тесной взаимосвязи всех этапов метаболизма РНК между собой и их котранскрипционном протекании. Предполагается, что гроцессинг, модификация, транспорт и деградация РНК происходят одновременно с процессом элонгации, то есть существует разветвлённая «сеть» «молекулярных машин», работающих югласованно. Стержнем этой системы, как полагают, является С-концевой домен (CTD) РНК-толимеразы И, однако до настоящего времени не идентифицирован «регуляторный каркас», управляющий столь сложной структурой. Исследования именно этого аспекта, по-видимому, могут )беспечить достаточные доказательства правоты «гипотезы сопряжения».

Изучение регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и сопряженных процессов метаболизма РНК может иметь и прикладное значение, например, для более глубокого понимания 1рироды РНК-доминантных заболеваний (RNA-dominant diseases), связанных с транскрипцией «токсических» некодирующих РНК. Попытки применения препаратов микроРНК (microRNA), киРНК (siRNA), PIWI-ассоциированных РНК (piRNA) и антисмысловых РНК для коррекции аберрантных продуктов транскрипции и метаболизма РНК, как в отдельных клетках, так и в живых организмах, позволяют говорить о развитии «антисмысловых» технологий для фундаментальных и прикладных исследований и закладке основ «антисмысловой» терапии и «микрогеномной» медицины.

Цель и задачи работы.

Цель работы состоит в изучении регуляции экспрессии сложной единицы транскрипции - гена рецептора гормона роста человека (hGHR). Основное следствие «гипотезы сопряжения» - вывод о существовании единой согласованной системы регуляции экспрессии генов, включающей транскрипционный и «посттранскрипционный» аппараты клеточного ядра, поэтому логично говорить о «котранскрипционной» регуляции экспрессии.

Для достижения поставленной цели необходимо решить общую задачу - исследоват «профиль» транскрипции гена hGHR в РНК из человеческих тканей, фактически, необходимо решит ряд конкретных задач:

1. построить физическую карту гена hGHR;

2. картировать функциональные элементы гена: потенциальные промоторы, 5' нетранслируемые экзоны, кодирующие экзоны;

3. исследовать функции потенциальных промоторов in vitro;

4. охарактеризовать 5'-нетранслируемую область (5'-НТО) гена: картировать сайты старто транскрипции, оценить представленность основных 5'-нетранслируемых экзонов (варианте первого некодирующего экзона гена hGHR) в РНК из человеческих тканей;

5. охарактеризовать З'-НТО гена;

6. изучить экспрессию кодирующей части гена hGHR в человеческих тканях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Построена карта кодирующей и проксимальной части 5'-НТО (район промотора Р1 специфического для взрослой печени) гена hGHR общей протяженностью около 200 т.п.н..

Впервые установлена нуклеотидная структура GC-богатого участка, содержащего дистальньи кластер 5'-нетранслируемых экзонов (V2(1B)-V9-V3(1C)).

Экспериментально in vitro и in silico показана потенциальная возможность ассоциации ядерным матриксом транскрипционно активных участков 5'- и З'-НТО гена hGHR.

Исследовано влияние короткой открытой рамки считывания (кОРС) в «общетканевом промоторе Р2 (дистальная 5'-НТО) на экспрессию репортерного гена люциферазы in vitre Установлено различное влияние элементов основного «общетканевого» экзона 1В на экспресс!» кОРС, расположенной ниже (в 3 '-направлении).

Идентифицированы четыре новые изоформы мРНК гена hGHR, образующиеся в результат альтернативного сплайсинга 5 '-НТО, экспрессирующиеся ткане- и стадиеспецифически.

Идентифицирована укороченная форма мРНК, не содержащая трансмембранного i внутриклеточного доменов рецептора гормона роста, предложен гипотетический механизм е образования за счет использования альтернативного сайта полиаденилирования в интроне 7/8 ген hGHR.

Установлено соответствие одного из потенциальных нетранслируемых вариантов 1 экзона (V6 хромосоме 11 человека, а не хромосоме 5, как полагали ранее. Экспериментально показан транскрипция некодирующей цепи ДНК в локусе гена моноацилглицерат-О-ацилтрансферазы

человека (hMOGAT2). Предложен гипотетический механизм образования химерной РНК в результате транс-сплайсинга двух дискретных транскриптов.

Исследована частота геномного полиморфизма области экзона 3 гена hGHR. Установлено достоверное различие частот генотипа делеция/делеция (d/d) в группе пациентов с идиопатической низкорослостью (ИН) по сравнению с контрольной группой.

У пациента с задержкой роста обнаружена мутация R43X в экзоне 4 гена hGHR, подтверждающая диагноз «синдром Ларона».

Апробация работы.

Основные результаты работы представлены на II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), III съезде Биохимического общества РАН (С-Петербург, 2002), ежегодных итоговых конференциях Федеральной целевой научно-технической подпрограммы «Геном человека» (Черноголовка, 1998, 1999), международном симпозиуме «Current problems of molecular genetics and cell biology» (Москва, 2000), III съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 2004), на международных семинарах "Coupling between transcription and RNA processing" (Baeza, Spain, 2004) и "RNA-protein interactions in development and cancer" (Baeza, Spain, 2009), лабораторных коллоквиумах лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 14 страницу* содержит if рисуншб, S таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, заключения, выводов, благодарностей и списка цитированной литературы ( <5-1 наименование ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

1.Структура гена hGHR. Функциональная карта кодирующей области и проксимальной 5'-НТО. Картирование основных элементов гена hGHR.

Для построения карты гена использовали рекомбинантные ВАС-клоны BAC25F11A, ВАС64А9М, ВАС170В4М (СЕРН, Франция), выбранные по наличию STS в области 2 экзона гена hGHR, клон из библиотеки в фаге X (Xghr41), содержащий нетранслируемый экзон 1В и фрагменты, полученные на геномной ДНК человека, связывающие известные последовательности гена. Рекомбинантные плазмиды ВАС-клонов гидролизовали эндонуклеазой рестрикции BamHI, смесь фрагментов лигировали с плазмидными векторами pUC19 и pGEM-3zf и трансформировали в клетки E.coli. Реконструированная последовательность ВатН1-фрагментов и результаты картирования кодирующих экзонов и проксимальной 5'-НТО гена hGHR представлены на Рис. 1. Alu- и LINE-элементы идентифицированы в процессе секвенирования рекомбинантных плазмид, содержащих ВатН1-фрагменты ВАС-клонов.

При картировании экзонов гена hGHR в ДНК ВАС-клонов установлено отсутствие экзона 3 в клоне ВАС64А9М. Ранее подобную делецию в некоторых человеческих РНК связывали с альтернативным сплайсингом, позднее - с геномным полиморфизмом неизвестной природы. Причиной данного геномного полиморфизма является ДНК-рекомбинация области, содержащей 3 экзон, расположенной между двумя гомологичными на 99% копиями повтора, состоящего из LTR семейства эндогенного ретровируса HERV-P (171 п.н.) и следующего за ним фрагмента транспозона MER4 (80 п.н.) (Pantel J., et al., 2000).

Рабочая версия нуклеотидной последовательности генома человека (UCSC Genome Bioinformatics http://genome.ucsc.edaO позволила уточнить полученные данные о структуре гена hGHR и провести анализ in silica структуры хроматина в данном локусе. Ген hGHR находится в участке с координатами 42423000 - 42723000, занимая примерно 300 т.п.н. Точное положение кодирующих и нетранслируемых экзонов гена относительно точки инициации трансляции (в экзоне 2) представлено в Табл. 1. Функциональная карта гена hGHR полностью подтверждается нуклеотидной последовательностью соответствующего локуса хромосомы 5 человека.

2. Характеристика нетранслируемых областей гена hGHR.

2.1. Характеристика 5 '-НТО. Картирование 5 '-нетранслируемых экзонов гена hGHR.

Результаты, полученные при картировании экзонов гена hGHR, показывают, что более чем 140 т.п.н. из 300 т.п.н., занимаемых геном, приходится на 5'-НТО, в которой картированы

Exons

MSR

¿Л

lß

V2 V9V'3c Hlndü

МАК

L L OO

V/V1V4V8

Alu □

Alu О

Htxя

L Alu L Alu П П ПП

L □

■ * n u'l1

МАЛ Alu Alu I О D#-

4 5 6 78 910

JLIL

FPCR9

Fv23 1

Xghi41

F170A5 ■

25-26 mm 25-12 —

25A6,12 ■ 25BH4 • 25BH23

25BH22

F25BC20

FPCR5 -

F170A8 —

170 Z10 —

17QA1.11 « 1705.1 -

25A8.15H3 FPCR170-3

64S1.9 i

БАС25

170-10 i

17QA2.8 шшшш F170H2 —

170-25 —

170610.5 ■

ВАС 170

I I II I I I..............l I I I I I I I I I I l I l 1 l l l I 1

-150 H 0 +50 +100 +150 +200

Рис.1. Схема кодирующей, проксимальной и дистальной части 5'-НТО гена hGHR. Отмечены кодирующие и некодирующие экзоны (черные прямоугольники), повторяющиеся элементы LINE-1 (L) и Alu (светлые прямоугольники), потенциальные участки связывания ДНК с ядерным матриксом (большие стрелки, MAR) и сайты узнавания эндоиуклеаз рестрикции ВашН! и Hindlll (маленькие стрелки).

Таблица 1. Схема организации гена GHR человека.

Экзоны Положение экзонов относительно Номер депонированной

участка инициации трансляции нуклеотидной

(п.н.)1 последовательности

Альтернативные 5'-

нетранслируемые

экзоны (экзон 1)

V2(1B) -142364--141920 Z11801, S97393

V9b -141423 --141277 AF230801

V9a -141398-- 141277/-51795--51511 AF230800

V3 -140883 - -140837/-82638 - -82546 Z11851

VIO -80168--80042 AY216680

V7 -17832--17724 Z11853

V1(1A) -17762--17346 Z11802

V4 -16319--16178 Z11849

V8 -15795 --15759 Z11848

V52 -414--12 Z11850

Кодирующие экзоны

экзон 2 -11 -+80 Х06562

экзон 3 +63163 -+63228 Х06562

экзон 4 +123015-+123144 Х06562

экзон 5 +129042-+129914 Х06562

экзон 6 +133949-+134127 Х06562

экзон 7 +145332 - +145497 Х06562

экзон 8 +147554 - +147644 Х06562

экзон 9 +152177-+152246 Х06562

экзон 10 +152578-+156002 Х06562

Примечания.

' 5'-границы альтернативных нетранслируемых экзонов соответствуют 5'-концам наиболее длинных продуктов 5'-RACE и, как правило, не совпадают с истинными точками инициации транскрипции (смещены в З'-направлении). 2 Экзон V5 расположен непосредственно перед экзоном 2, раньше рассматривался как часть неудаленного интрона (retained intron), в настоящее время - как альтернативный экзон, 5'-концевая часть которого до положения -11 удаляется при сплайсинге некоторых первичных транскриптов.

7 из 8 5'-нетранслируемых экзонов, идентифицированных ранее методом 5-RACE (V1,V2, V3, V4, V5, V7 и V8) (Pekhletsky R. et al., 1992), а также экзоны V9a, V9b и VIO, открытые позднее. Один из потенциальных нетранслируемых экзонов - V6, как выяснилось в процессе выполнения работы, соответствует участку хромосомы 11 человека. Большая часть 5'-нетранслируемых экзонов образует два основных кластера - дистальный, содержащий экзоны V2, V9, V3 и проксимальный, включающий экзоны V7, VI, V4 и V8 (Рис. 1, Рис. 11). Проксимальный кластер 5'-нетранслируемых экзонов, картированный в процессе работы с рекомбинантными ВАС-клонами, расположен на расстоянии от -17.8 до -15.8 т.п.н. перед экзоном 2. В этом участке находится экзон VI (1А) -основной 5'-нетранслируемый экзон изоформ мРНК, специфичный для взрослой печени. Особый интерес вызывает дистальный кластер (V2, V3 и V9), удаленный более, чем на 140 т.п.н. от 1-го кодирующего экзона мРНК. Как минимум два из 5'-нетранслируемых экзонов (V2 и V3) проявляют широкий спектр тканевой экспрессии, как в фетальных, так и во взрослых тканях, а также в

опухолях. Следует отметить высокую степень взаимной гомологии первичной структуры экзона 1В для всех изученных генов вНЯ. млекопитающих. Длительное время ни для одного биологического вида данную область не удавалось связать с проксимальным кластером негранслируемых экзонов, специфичным для взрослой печени. Область экзона 1В чрезвычайно вС-богата, что затрудняет ее исследование. Фрагмент, связывающий экзоны 1В (У2) и УЗ (1С), амплифицировали на геномной ДНК человека, клонировали и установили его первичную структуру. Оказалось, что экзон 1С (УЗ) отстоит от экзона 1В всего на 1100 п.н. в З'-направлении (Рис. 2).

Р2 1 рРЗ Hindlll +1 і . веіі г.5"" гг1 feiSmal S 1 II ;u?A <3€> Г г г г

1 1 1 1

Рис.2. Схема геномной области дистального кластера нетранслируемых экзонов: экзон IB (V2) и кОРС в нем (параграф 3.2.2.), экзон V9B и гомологичная ему часть экзона V9A (указано как V9B/AB), лежащие в области двух перекрывающихся СрО-островков (указаны ромбами над схемой) и экзон 1С (V3), границы экзонов указаны под схемой. Указаны сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции, сайты стартов транскрипции (Г), установленные in vitro методом достройки олигонуклеотида V3-3, красным цветом выделен сайт старта транскрипции в «предсказанном» экзоне V9B/V9AB (Г); сайт старта транскрипции внутри экзона 1В, установленный с помощью защиты РНК-РНК дуплекса от РНКаз (ГКРА); микросателлит (GT)n ». Отмечены области промоторов Р2 и предполагаемого РЗ (p-putative). Участки дистальной 5'-НТО гена hGHR, высоко гомологичные 5'-НТО генов GHR других млекопитающих, выделены на схеме серыми прямоугольниками.

Рассматриваемая область содержит два CpG-островка, единственные в локусе гена hGHR, микросателлит (GT)„ (п=23 в клонированном фрагменте) и новый нетранслируемый экзон V9, существование которого предсказано при картировании стартов транскрипции в экзоне 1С (V3) (Рис. 2). Структура дистального кластера гена hGHR сходна с организацией кластера гомологичного гена Bos taurus, но транскрипционный профиль данной области у Bos tanrus сложнее. Высоко гомологичны между собой лишь экзоны 1В, как уже указывалось выше, последовательности экзонов 1С (V3) и V9 человека - уникальны (Рис. 2).

2.2. Характеристика J '-НТО гена hGHR.

Секвенирование концевых последовательностей вставок позволило установить, что клон ВАС 170 содержит экзон 10 и З'-НТО гена hGHR, соответствующую ранее опубликованной последовательности кДНК GHR человека (Leung D.W., et al., 1987). Используя в качестве зонда 3'-концевой фрагмент ВАС 170, из библиотеки ВашН1-фрагментов выделен клон, содержащий вставку длиной около 30 т.п.н., включающую 5 экзонов (экзоны 6-10) и собственно З'-НТО гена hGHR. Установлена нуклеотидная последовательность 3'-фланкирующей области, показано, что данный район обогащен АТ-нуклеотидами, содержит множество потенциальных сайтов узнавания ДНК

топоизомеразы II и участки, гомологичные S/MAR-элементам, а также последовательности, гомологичные ARS-элементам дрожжей.

В З'-НТО гена hGHR in silico идентифицированы сайты связывания микроРНК: miR-129/129-5р, miR-142-Зр, miR-202/202-3p:I, miR-I5/16/195/424/497, miR-503, miR-202/202-3p:2, let-7/98, miR-135. Для гомологичных генов GHR показано влияние некоторых микроРНК на подавление экспрессии: miR-15a - в эпителиальных клетках молочной железы коровы (Li H.M., et al., 2012) и let-7b - в скелетных мышцах карликовой породы кур (Lin S, et al., 2012). Взаимодействие let-7/98 -GHR рассматривается как потенциальный маркер остеосаркомы человека (Di Fiore R., et al., 2012).

2.3. Изучение взаимодействия участков нетранслируемых областей с ядерным матриксом in vitro.

Экспериментально проверена способность клонированных фрагментов из 5'- и 3'-нетранслируемых областей гена связываться с ядерным матриксом in vitro. Результаты, представленные на Рис. 3 (для 5'-НТО) и Рис. 4 (для З'-НТО), свидетельствуют в пользу гипотезы доменной организации гена hGHR. На Рис. 1 области связывания с ядерным матриксом отмечены сверху стрелками (MAR).

а)

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

è» в i - г

Рис. 3. а) Авторадиограмма агарозного геля с фрагментами 5'-НТО после связывания с ядерным матриксом in vitro. №№ 1-5: фрагмент 170-4; Ms 6-10: фрагмент 25А6.12, №№ 11-15: фрагмент 25ВН4. №№ 1,6,11: контроли - продукты гидролиза плазмид с клонированными фрагментами (V-плазмидный вектор, F-соответствующий фрагмент); №№ 2,4,7,9,12,14 - супернатант и №№ 3,5,8.10.13,15 - осадок в экспериментах по связыванию с ядерным матриксом. №№ 2,3,7,8,12,13: 150 мкг и №№ 4,5,9,10,14,15: 200 мкг геномной ДНК Е. coli (компетитор). 6) Графическое представление результатов поиска in silico S/MAR-элементов в нуклеотидной последовательности 5'-НТО гена hGHR. Указано относительное положение фрагментов в геноме.

а)

12 345 67 89

» ä

™ ~ W

Г5

Рис. 4. а) Авторадиограмма агарозного геля с фрагментами З'-НТО после связывания с ядерным матриксом in vitro. №1: контроль - продукты гидролиза плазмиды с клонированным фрагментом З'-НТО (V-плазмидный вектор, A-D-соответствующие фрагменты); №№2,4,6,8-супернатант и №№3,5,7,9-осадок в экспериментах по связыванию с ядерным матриксом в присутствии геномной ДНК Е. coli (компетитор): №№2,3-50 мкг; №№4,5-100 мкг; №№6,7-150 мкг; №№8,9-200 мкг компетитора. б) Графическое представление результатов in silico поиска S/MAR-элементов в нуклеотидной последовательности З'-НТО гена hGHR. Указано относительное положение фрагментов в геноме.

3. Картирование и изучение активности in vitro основных промоторов гена hGHR.

3.1. Промотор Р1, специфический для взрослой печени. Из результатов анализа изоформ мРНК и картирования сайтов старта транскрипции в экзоне 1А следует, что промотор, специфический для взрослой печени, должен располагаться перед указанным экзоном. Для проверки этого предположения определили эффективность временной экспрессии репортерного гена люциферазы светлячка под контролем различных фрагментов

Рис. 5. Анализ активности промотора Р1 гена1#знк в клетках линии HepG2. а) Рестрикционная карта фрагмента промоторной области Р1 и схема конструкций, содержащих ген люциферазы (Luc) под контролем делеционных фрагментов промоторной области. Отмечено положение ТАТА-бокса (черный овал) и основного участка инициации транскрипции (+1); б) Относительная активность люциферазы в лизатах трансфицированных клеток (за единицу принята активность, обеспечиваемая контрольной плазмидой pGL3-Basic).

Последовательное удаление от 5'-конца исследуемого фрагмента поначалу мало влияет на промоторную активность (варианты -1930, -1200, -710), а затем приводит к ее усилению (варианты -370, -155). Таким образом, фрагмент размером 155 п.н. перед точкой инициации транскрипции (начало экзона VI) обеспечивает эффективную экспрессию репортерного гена люциферазы. Данная область содержат ТАТА-подобные элементы, которые, вероятно, вносят основной вклад в транскрипцию гена hGHR. Из полученных результатов можно также заключить, что нуклеотидные последовательности, находящиеся перед положением -155 по отношению к точке инициации транскрипции, содержат потенциальные негативные регуляторные элементы, так как их присутствие в репортерных конструкциях подавляет экспрессию гена люциферазы. Результаты исследования промоторной области PI согласуются с данными, независимо полученными в других лабораториях (Zou L., et al., 1997; Rivers C.A., Norman M.R., 2000).

3.2. Общетканевой промотор P2.

3.2.1. Характеристика промоторной области.

Методом анализа временной экспрессии репортерного гена в клетках HepG2 подтверждена активность промотора Р2, расположенного перед экзоном V2 (1В). Из Рис. 6 следует, что фрагменты -707 —1-70, -365 —1-70 и -165 - +70 по отношению к основной точке инициации транскрипции обеспечивают экспрессию репортерного гена люциферазы, причем так же, как и в случае с

предполагаемой промоторной области (Рис. 5). и

ВатШХМ

Kpnl

BglllEcoRl ftmiHI I TATA+II

-1930 С

Luc

-1690 L

-710 С

-370 dB -155 С*

2.16+/- 0.23 2.50+/-0.26 1.40+/-0.16 1.39+/-0.15 3.31 +/-0.29 Э 7.17+/-0.26

промотором PI, максимальную активность проявляет наиболее короткий фрагмент -165 —1-70. Удаление области -165 - -19 приводит к полному подавлению промоторной активности. Данная область, как уже отмечалась, весьма GC-богата. Она не содержит ТАТА-боксов, но включает несколько потенциальных сайтов связывания факторов транскрипции Spl/Sp3, что согласуется с отсутствием выраженной тканевой специфичности экспрессии транскриптов, содержащих 5'- ! нетранслируемый экзон V2. Таким образом, один из промоторов, расположенных перед экзоном V2 j (промотор Р2), по своей структуре подобен промоторам генов домашнего хозяйства. Участие факторов транскрипции Spl/3 в функционировании промоторов Р2 гомологичных генов других видов млекопитающих установлено в работах T.Adams (Ovis aries), M. Lucy (Bos taurus), R.Menon {Mus musculus).

Я |Эюон V2TTB11

Рис. 6. Анализ активности промоторов GC-богатой области гена GHR в клетках линии HepG2: а. Схема промоторной области и экзона V2 гена GHR человека и фрагментов, встроенных в репортерные плазмиды перед геном люциферазы. Стрелками показаны основные точки инициации транскрипции, овалами показано положение потенциальных сайтов связывания факторов Spl/Sp3; б. Относительная активность люциферазы в лизатах трансфицированных клеток (за единицу принята активность, обеспечиваемая контрольной плазмидой pGL3-Basic)

-707

-356 -165Р1+1 Р\+311

Sp Sp

20 40

-707 =

-707 с

-356 е

-165 =

=+70 =+70 =+70 -19=3+70

3 zu

-165 =

=+311 =+311

3.54+/-0.29 5.20 +/-0.50 13.50+/-2.00 1.00+/-0.08 20.94+/- 1.69 Зі 33.92 +/- 1.87

3.2.2. Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5'-нетранслируемом экзоне К2 (1В) гена ЄНИ, на экспрессию репортерного гена люциферазы.

Экзон У2 (1 В), транскрибируемый с промотора Р2, содержит короткую открытую рамку считывания (кОРС), которая в зрелой мРНК расположена перед АТО-кодоном основной рамки трансляции СТ®, представляет собой сильный вырожденный тринуклеотидный повтор ввС и кодирует короткий обогащенный глицином пептид. кОРС высоко консервативна и сохраняется в генах СИЯ разных видов млекопитающих (Яковенко А.Р. и др., 1997). Наличие кОРС в 5'-нетранслируемой области мРНК может существенным образом влиять на эффективность трансляции основной ОРС (Ко/ак М., 1999). Более детально изучено влияние различных элементов 5'- нетранслируемого экзона У2 на экспрессию репортерного гена люциферазы в трансфицированных клетках НерС2. В 5'-нетранслируемой области изоформ мРНК вНЯ человека, содержащих экзон У2, можно условно выделить три элемента: дистальную область (+1 —1-311), кОРС (+311 - +405) и следующий за ней спейсерный участок (+405 - +524), разделяющий кОРС и основную ОРС ИвНЯ. Получена серия конструкций, содержащая разные участки экзона У2 и

встроенный после них репортерный ген люциферазы (Рис. 6). Результаты определения активности люциферазы после трансфекции конструкциями клеток Нерв2 показали, что дистальная область экзона У2 благоприятно влияет на экспрессию следующей за ней ОРС, а кОРС (область +311 -+405), встроенная непосредственно перед основной ОРС, подавляет ее экспрессию (Рис. 7). Для того чтобы проверить, связано ли подавление экспрессии люциферазы с подавлением трансляции, сконструированы плазмиды, содержащие точечные мутации, нарушающие кОРС. В одном случае инициирующий АТО-кодон кОРС заменен на АТА-кодон, в другом случае кодон ОвА, следующий за АТв, превращен в стоп-кодон ТСА.

экзон 2

экзон V2 (1В)

-165 Р2 I

-165 = -165 = -165 С -165 с -165 с -165 с -165 = -165 с

РЗ k3U ^OS +524

J_I_I

§кОРС

= +70

SpT I Г

АТС TGA ATG

+311

atggga tga

atagga tga

+405 +405

+405

atggga tga atg atagga „ tga atg

atgtga ..tga

+524 +524

atgtga tga atg

дистальная кОРС спейсер часть 5-НТО

+524

13.516.23.4 -ч 21.6-9.3+; 26.6-

І-2Л .'- 0.49 -0.23 .<-3.2 -1.1 - 4.6

56.

6 */- і

I- 2.1

Рис. 7. Влияние элементов экзона У2 (1В) гена СИ1К человека на эффективность экспрессии люциферазы в клетках НерС2. а. Схема фрагмента промоторной области и экзона У2 гена вНЯ человека и фрагментов, встроенных в репортерные плазмиды перед геном люциферазы. Стрелками показаны основные точки инициации транскрипции, овалами показано положение потенциальных сайтов связывания факторов 8р1/5рЗ. Указано положение инициирующих кодонов кОРС и основной ОРС и терминирующего кодона кОРС. Нарушение кОРС в результате введения точечных мутаций отмечено перечеркиванием.

б. Относительная активность люциферазы в лизатах трансфицированных клеток (за единицу принята активность, обеспечиваемая контрольной плазмидой рОЬЗ-Ваз!с).

Введение таких мутаций сопровождалось увеличением эффективности экспрессии гена люциферазы примерно в 7 и 3 раза, соответственно. Действие введенных точечных замен на эффективность транскрипции представляется маловероятным. В то же время нарушение кОРС может снимать ингибирование трансляции ОРС люциферазы.

В следующей серии конструкций между кОРС и ОРС люциферазы встроен спейсерный участок (+405 - +524), полностью имитирующий нуклеотидную последовательность, присутствующую в мРНК hGHR, содержащих экзон V2. Как видно из Рис. 7, введение спейсера сильно ослабляет ингибирующее действие кОРС на экспрессию гена люциферазы, однако и в этом случае замена ATG в кОРС на ATA приводит к повышению люциферазной активности в трансфицированных клетках. Таким образом, можно заключить, что элементы 5'-нетранслируемого экзона V2 вносят разный вклад в эффективность экспрессии расположенной за ним ОРС репортерного гена. Полученные результаты не исключают возможного модулирующего действия кОРС экзона V2 на экспрессию гена GHR на уровне трансляции.

3.3. Другие промоторы генов GHR 3.3.1. Картирование предполагаемого промотора РЗ.

Анализ временной экспрессии люциферазы после трансфекции в клетки HepG2 репортерных конструкций, содержащих фрагменты предполагаемого промотора РЗ (Рис. 2), не выявил промоторной активности. В то же время при картировании сайтов старта транскрипции выявлены альтернативные точки инициации транскрипции в самом экзоне V2 (Рис. 2). Одна из них расположена в положении +290, и непосредственно перед ней находится еще один сильный сайт связывания Sp. В связи с этим проверено влияние встраивания в репортерные конструкции части экзона V2 (+1 - +311) на уровень экспрессии люциферазы. Как видно из Рис. 6, плазмиды, содержащие фрагменты -707 — +311 и -165 — +311, обеспечивают более высокий уровень люциферазной активности, чем сходные конструкции, ограниченные с З'-конца положением +70. Таким образом, введение в репортерные плазмиды фрагмента +70 —1-311 значительно усиливает экспрессию гена люциферазы, что может указывать на аддитивное действие сайтов связывания факторов транскрипции Sp, расположенных перед экзоном V2 и в самом экзоне. Из результатов, представленных на Рис. 6, можно заключить, что GC-богатая область, в которой находится экзон V2, содержит по меньшей мере два промотора - Р2 и РЗ, которые направляют транскрипцию гена hGHR в разных типах тканей (Рис. 2).

3.3.2. Изучение предполагаемых промоторных областей экзонов V5 и V9.

Методом достройки праймера в препаратах полиаденилированных и суммарных (контрольных) РНК из печени, плаценты и клеточной линии Huh7 картированы точки стартов транскрипции для экзона V5. Наличие стартов транскрипции в данной области позволяет предположить существование регуляторных элементов в районе экзона V5 гена GHR человека и сделать предварительный вывод об отсутствии тканеспецифичности для данного промотора, что согласуется с опубликованными данными о промоторной активности области экзона L5 мыши (Menon R., et al., 2001). Данные экспериментов по картированию сайтов старта транскрипции для экзонов V9 и V3 (параграф 2.1., Рис. 2) позволяют сделать заключение об отсутствии тканеспецифичности и для этих промоторов. Промоторную активность области экзона V9 можно объяснить наличием сайтов связывания факторов транскрипции Sp-семейства, так же как и для предполагаемого промотора РЗ (параграф 2.1.). Промотор, лишенный ТАТА-бокса, картирован перед экзоном V9, показано, что промотор работает в ткани сердечной мышцы m vivo и его активность определяется связыванием фактора транскрипции NF-Y (Goodyer C.G., et al., 2001).

4. Нетранслируемый «экзон» V6.

4.1. Картирование V6 в хромосоме 11 человека.

Предполагаемый вариант V6 первого нетранслируемого экзона гена hGHR обнаружен в продуктах 5'-RACE мРНК hGHR. Попытки картировать V6 в последовательностях ВАС-клонов и связать последовательность V6 с другими экзонами в геномной ДНК оказались безуспешными. Картирование V6 в 5'-НТО гена hGHR между дистальным и проксимальным кластерами нетранслируемых экзонов в геномной области длиной около 35 т.п.н. (Goodyer C.G., et al., 2001) оказалось ошибочным, что позднее признано авторами (Wei Y., et al., 2006; Goodyer C.G., et al., 2008).

С помощью ПЦР на ДНК из панели хромосомных гибридов «человек-грызун», любезно предоставленной Е.П. Копанцевым (ИБХ РАН), нами экспериментально доказана локализация нуклеотидной последовательности, соответствующей V6, в хромосоме 11 человека.

4.2. Клонирование хромосомного фрагмента гена hMOGAT2, содержащего V6.

Схематическое изображение структуры фрагмента, содержащего V6, представлено на Рис. 8. 5'- и З'-концевые последовательности хромосомного фрагмента длиной 4.9 т.п.н. установлены в системе однонаправленной ПЦР, любезно предоставленной Г.Ф. Юдиной (ИБХ РАН). Анализ последовательностей в геномном браузере UCSC позволил однозначно локализовать геномный фрагмент в хромосоме 11 человека.

4.3. Идентификация «антисмыслового» транскрипта в локусе гена hMOGAT2 .

В данном параграфе и далее «антисмысловыми», некодирующими, комплементарными (антипараллельными) названы транскрипты, кДНК, РНК, цепь ДНК - по отношению к направлению транскрипции гена hMOGAT2.

Исследована экспрессия гена hMOGAT2 в некоторых человеческих тканях и клеточных линиях. Впервые установлена экспрессия мРНК hMOGAT2 в ткани молочной железы, ОМЖ и клеточных линиях, происходящих из ОМЖ. Анализ «транскрипционного профиля» исследуемой области в РНК из человеческих тканей и клеточных линий позволил идентифицировать присутствие некоторых интронных последовательности гена hMOGAT2 в пуле зрелых мРНК. Помимо альтернативно сплайсирующегося интрона 3/4, в РНК из взрослой печени детектируется фрагмент интрона 1/2, прилежащий к экзону 2 (V6) (пара праймеров 395/241, Рис. 8, Рис. 9).

С другой стороны, амплификация с парой 398/402 на препаратах антисмысловых кДНК дает ожидаемый фрагмент, который включает сплайсированные экзоны 2 и 3 гена hMOGAT2. Из серии экспериментов ОТ-ПЦР, в которых селективно амплифицируются участки только смыслового или

39Ыу6-5) 195(уЬ?2) Т

&р1

N001

(Крп1) У^епР

Зас1

Во111

В.ипН! Хас!

В51Х1

«3

«О 4С2

В.^ЕП

Вз XI

ХЬа!

РмШ

Оги!

401

ехоп2

46 241

■*— 399 Ь>т}

242

243

244

ЩепК (ЕсоЮ)

Рис. 8. Схема геномной области нетранслируемого экзона У6 (в антипараллельной ориентации по отношению к гену ЬМСЮАТ2). Жирным шрифтом указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, использованных для клонирования фрагментов и создания конструкций, в скобках - сайты Крп1 и ЕсоШ, введенные в олигонуклеотиды для двунаправленной ПЦР на геномной ДНК и последующего клонирования полученного продукта; стрелками соответствующего направления показаны олигонуклеотиды для однонаправленной ПЦР и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции для наиболее протяженных фрагментов, полученных в однонаправленной ПЦР (названия набраны курсивом); праймеры для двунаправленных специфических ПЦР (названия набраны прямым шрифтом). Черными квадратами обозначены экзоны 3 и 4 гена 11МООАТ2 , белый квадрат -У6, комплементарный экзону 2 гена ЬМСЮАТ2 (между сайтами эндонуклеазы рестрикции Рк^Г). Серыми овалами обозначены участки, гомологичные А!и-повторам семейства Зд.

только антисмыслового транскрипта в локусе гена МОГАТ2, можно сделать предварительный вывод о транскрибировании некодирующей цепи ДНК в локусе гена ЬМСЮАТ2 и включении последовательности У6 в антисмысловой транскрипт. Результаты сравнительного анализа экспрессии мРНК гена 11МСЮАТ2 и предполагаемого антисмыслового транскрипта, транскрибирующегося с некодирующей цепи ДНК в локусе того же гена, представлены на Рис. 9. В некодирующей цепи ДНК локуса гена 11МСЮАТ2 т эШсо предсказано существование нескольких 5'- и 3'- сайтов сплайсинга. На расстоянии около 6,5 т.п.н. от У6 идентифицирован сигнал полиаденилирования. Из анализа промоторной активности (параграф 6.4.) и экспериментов по изучению экспрессии гена ЬМСЮАТ2 (Рис. 9) можно предполагать, что 5'-конец предполагаемого антисмыслового транскрипта лежит в альтернативно сплайсирующемся интроне 3/4 (параграф 6.4.) или в интроне 4/5 гена ЬМОСАТ2 (несколько сильных «предсказанных» т яШсо потенциальных «промоторов»).

1 2 3 П 6 7! ) 10111! 1314 1511171! 1! 20 К-

Рис. 9. Электрофореграмма продуктов амплификации специфических последовательностей гена ИМСЮАТ2 (400/398) и предполагаемого антисмыслового транскрипта (395/241) на кДНК : 1-взрослая печень, 2-фетальная печень, З-НеЬа, 4-Нерв2, 5-НиЬ7, 6-НЕК293, 7-ТЕ671, 8-МСР-7, 9-МСР-7 НТВ-22, ] 0-\ША-МВ436, 11-ВТ474, 12-молочная железа, 13-ОМЖ№1, 14-ОМЖ№2, 15-ОМЖ№3, 16-ОМЖ№4, 17-аденома простаты, 18-ободочная (толстая) кишка , 19-ободочная (толстая) кишка («нормальная» ткань), 20-опухоль ободочной (толстой) кишки, К-: отрицательный контроль амплификации (вода).

Возможно, 5'-область антисмыслового транскрипта имеет несколько альтернативных промоторов и/или сплайсируется альтернативно. Установить точную длину (предполагаемая длина 6-7 т.н.о.) и нуклеотидную последовательность антисмыслового транскрипта не удалось, опубликованных сведений в литературе и в геномном браузере иСЭС не найдено.

4.4. Картирование промотора У6.

Методом достройки праймера в РНК некоторых человеческих тканей и клеточных линий картированы сайты стартов транскрипции в области У6. Для изучения промоторной активности получен набор конструкций, содержащих фрагменты изучаемой области и встроенный под их контроль ген люциферазы. Результаты анализа люциферазной активности в клетках, несущих полученные конструкции, представлены на Рис. 10.

Методом временной экспрессии репортерного гена в клетках НеЬа установлены границы минимального промотора, непосредственно прилежащего к У6 (фрагмент длиной 143 п.н. между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции РбИ и N001) и нескольких «промоторных элементов» в

5'-области изучаемого фрагмента, как позитивных, так и негативных.

Рис. 10. Анализ люциферазной активности конструкций, содержащих ген люциферазы (Luc) под контролем фрагментов 5'-фланкирующей области экзона V6 в клетках HeLa. Сверху представлена схема относительного расположения сайтов эндонуклеаз рестрикции в исследуемой области, чёрные прямоугольники - экзон V6, слева указаны длины фрагментов, встроенные над геном люциферазы (серые прямоугольники). Показана относительная активность люциферазы в лнзатах трансфицированных клеток (за единицу принята активность, обеспечиваемая контрольной плазмидой pGL3-Basic).

4.5. Гипотетический механизм образования химерного транскрипта У6-экзон 2 hGHR.

В качестве одного из возможных механизмов образования химерной мРНК hGHR, содержащей V6, может рассматриваться транс-сплайсинг. Антисмысловой транскрипт, содержащий V6, несет 5'-донорный сайт сплайсинга. 7ранс-сплайсинг предполагает существование парного транскрипта, содержащего 3'-акцепторный сайт и сайт ветвления сплайсинга. В качестве кандидатов на роль «акцепторного партнера» могут быть рассмотрены изоформы мРНК hGHR, содержащие экзоны V3 или V5, поскольку показано, что указанные некодирующие экзоны происходят из интронов и содержат соответствующие сигнальные последовательности.

5. Изучение экспрессии гена hGHR в РНК из некоторых человеческих тканей, культивируемых клеточных линий и образцов опухолей.

Рецептор гормона роста относится к суперсемейству рецепторов цитокинов/гематопоэтина. Экспрессия GHR обнаружена практически во всех исследованных тканях (мышцы, почка, сердце, мозг, молочная железа, матка, простата, жировая ткань и других), но наиболее высокий уровень экспрессии GHR характерен для печени. Именно в печени GHR является медиатором сигнала гормона роста (GH), запускающим синтез и секрецию инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-1), необходимого для роста и протекания ряда метаболических процессов в организме. В остальных тканях GHR может быть медиатором локального действия GH на дифференцировку и пролиферацию клеток. Экспрессия GHR возрастает в постнатальный период, но обнаружена также в раннем эмбриогенезе и в процессе развития зародыша. Следует отметить, что hGHR детектируется в большом числе опухолей различной этиологии, однако его роль в канцерогенезе остается неясной.

Полноразмерная форма мембранного рецептора гормона роста человека содержит 620 аминокислотных остатков. Экзон 2 (первый транслируемый экзон) кодирует сигнальный пептид длиной 18 аминокислот, экзоны 3-7 - внеклеточный домен рецептора из 246 аминокислот, экзон 8 -трансмембранный домен из 24 аминокислот, экзоны 9 и 10 — цитоплазматический домен рецептора длиной 350 аминокислот, отвечающий за внутриклеточное проведение сигнала.

йпШ Sid РЯ1 ма

8?9пл. Г~

н.н

Ил 1.7Ш-Ш 1S7-ÛJ7 0.72 i ;-0.4 H г.«* 0.16

I—I 3.4.1+ЧШ

Наряду с мембранной формой hGHR выявлены укороченные с С-конца формы, образующиеся как в результате ограниченного иротеолиза полноразмерного рецептора (растворимый белок, связывающий гормон роста, growth hormone binding protein — GHBP), так и в результате альтернативного сплайсинга экзона 9. Такие изоформы рецептора, как полагают, расщепляются до GHBP лучше, нежели полноразмерный рецептор (Hochberg Z., et al.).

5.1. 5 '-нетранлсируемая область гена hGHR.

5.1.1. Идентификация новых 5нетранслируемых экзонов гена hGHR.

Методом ОТ-ПЦР на РНК из взрослой печени идентифицированы 4 новые изоформы мРНК hGHR, содержащие на 5'-конце как уже известные последовательности (V3, V7, VI, V9A и VIO) в новых комбинациях (V7a, V7b, VlOa), так и одну новую последовательность (координаты в геномном браузере UCSC: 42468879 - 42469098, по отношению к инициирующему AUG-кодону экзона 2:-97098 --96879, длина - 219 п.н.) (Рис. 11). Установлено, что экзон V7a состоит из непрерывной последовательности экзонов V7-V1 и интрона между ними. В экзоне VI идентифицирован проксимальный 3'-акцепторный сайт сплайсинга (Рис. 11), за счет использования которого образуется новый экзон V7b, экспрессирующийся во взрослой печени в незначительном, по сравнению с V7a, количестве.

5.1.2. Экспрессия 5 '-нетранслируемых экзонов гена hGHR в клеточных линиях.

Исследован профиль экспрессии нетранслируемых экзонов гена hGHR в РНК взрослой печени (контроль) и клеточных линий HeLa, HepG2, Huh7, НЕК293, ТЕ671, MCF-7. Полученные результаты о ткане- и стадиеспецифической экспрессии большинства нетранслируемых экзонов согласуются с опубликованными данными независимых исследований (рис. 11).

Рис. 11. Схема альтернативного сплайсинга 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR. Линиями показаны комбинации последовательностей (прямоугольники), образующих собственно экзоны. Красные линии - новые комбинации, установленные в работе; красный прямоугольник - новая последовательность, входящая в состав экзона V3d. Указаны промоторы гена, предполагаемые промоторы отмечены строчной буквой «р» (putative).

Следует отметить, что экспрессии экзонов, специфичных для взрослой печени (V7, VI, V4, V8), в HeLa, HepG2, Huh7, НЕК293 и ТЕ671 не наблюдается, но в трех последних из указанных экспрессируется новый экзон V7a (возможно и V7b), а в линии MCF-7 детектируется экзон VI (1А).

5.2. Транслируемая область гена hGHR.

5.2.1. Экспрессия мРНК hGHR в некоторых тканях и клеточных линиях.

Методом ОТ-ПЦР (амплификация фрагмента внеклеточного домена hGHR - экзоны 4-6, на суммарных РНК из некоторых человеческих тканей: взрослой и фетальной печени, плаценты, коры надпочечника, ободочной (толстой) кишки, молочной железы, яичника, почки, поджелудочной железы, тимуса, скелетных мышц, сердца, тестикул, легкого, спинного мозга, из периферических клеток крови, из первичной культуры хондроцитов, из культивируемых клеточных линий HepG2, Huh7, HeLa, MCF-7, MDA-MB436, BT474, HEK293, TE671) установлен относительный уровень мРНК hGHR. Наиболее высокий уровень экспрессии hGHR наблюдается во взрослой печени и в молочной железе.

5.2.2. Исследование экспрессии мРНК гена hGHR в некоторых клеточных линиях.

Для более детальной качественной оценки экспрессии гена hGHR на транскрипционном уровне в клеточных линиях методом ОТ-ПЦР амплифицировали фрагменты «экзоны 4-6» (внеклеточный домен) и «экзоны 8-10» (трансмембранный/внутриклеточный домены). В линии Huh7 детектируется только внеклеточный домен, а в клеточных линиях НЕК293 и ТЕ671 детектируются участки как внеклеточного, так и трансмембранного/внутриклеточного доменов, но результаты не соответствуют ожидаемому соотношению 1:1.

Полученные данные позволяют предположить, что в клеточных линиях Huh7, НЕК293 и ТЕ671 экспрессируется укороченная форма мРНК hGHR, не содержащая участков, соответствующих трансмембранному (экзон 8) и внеклеточному доменам (экзоны 9-10).

5.2.3. Анализ экспрессии форм мРНК hGHR в образцах опухолей и в клеточных линиях опухолевого

происхождения.

Сравнительный анализ экспрессии мРНК гена hGHR методом ОТ-ПЦР в образцах тканей молочной железы, опухолей молочной железы (ОМЖ) и культивируемых клеточных линий ОМЖ (MCF7, MDA-MB436, ВТ474) позволил установить корреляцию между экспрессией укороченной формы мРНК hGHR и альфа-эстрогенового рецептора (ERa): в гормонозависимых (по наличию экспрессии ERa) образцах детектируются участки всех доменов hGHR, в гормононезависимых -только участок внеклеточного домена. Установленная корреляция может свидетельствовать о прямом (на уровне инициации транскрипции/выбора промотора) и/или опосредованном (через

молекулы сигнального каскада) влиянии ERa на экспрессию укороченной мРНК hGHR.

Изучена экспрессия предполагаемой укороченной мРНК в 5 попарных (опухоль/ «нормальная» ткань, прилежащая к опухоли) образцах опухолей печени, 15 попарных образцах опухолей ободочной (толстой) кишки, 4 опухолях молочной железы, образцах аденомы простаты, ткани молочной железы при гигантомастии, клеточных линиях, происходящих из опухолей печени (2), ободочной (толстой) кишки (4), молочной железы (4), простаты (3), нейробластомы (14) и в соответствующих нормальных тканях человека. В ряде опухолей и клеточных линий экспрессируется только укороченная форма (гормононезависимые ОМЖ и соответствующие клеточные линии ОМЖ, 7 опухолей толстой кишки, линия нейробластомы СНР212), в некоторых образцах hGHR не экспрессируется (13 клеточных линий нейробластомы, 2 опухоли печени и линия HepG2, 2 опухоли и 3 клеточные линии из опухолей толстой кишки). В остальных образцах детектируется полная форма мРНК hGHR. Следует отметить, что в нормальной ткани простаты экспрессии hGHR не наблюдается, в то время как в аденоме простаты детектируется мРНК полной формы hGHR, при гигантомастии наблюдается экспрессия укороченной мРНК. Гетерогенность экспрессии мРНК hGHR можно объяснить невозможностью в стандартных ОТ-ПЦР дифференцировать укороченную форму мРНК от полной, при их одновременном присутствии в образце.

Несмотря на то, что регуляция экспрессии укороченной мРНК в разных опухолях, судя по полученным результатам, не является «универсальной», можно предполагать, что данная форма мРНК hGHR, возможно соответствующая GHBP, является потенциальным онкомаркером.

5.2.4. Гипотетический механизм образования укороченной формы мРНК гена hGHR.

Механизмы образования GHBP у разных видов существенно различаются. У грызунов GHBP образуется в результате альтернативного сплайсинга мРНК. В интроне 7/8 гена GHR мыши и крысы присутствует альтернативный экзон 8А, сплайсинг которого с экзонами 2 -7 внеклеточного домена GHR приводит к образованию мРНК GHBP длиной около 1.2-1.4 т.н.о.. У человека и кролика GHBP образуется в результате ограниченного протеолиза полноразмерного рецептора гормона роста. У макаки - резус в образовании GHBP участвуют оба механизма (Martini J., et al., 1997). В результате использования альтернативного сайта полиаденилирования в интроне 7/8, образуется мРНК длиной 1.7 т.н.о., кодирующая белок, в котором трансмембранный и цитоплазматический домены замещены октапептидным «хвостом» GKRNKRLK.

Можно предполагать, что обсуждаемая укороченная мРНК hGHR образуется по механизму, сходному с механизмом образования мРНК GHBP у макаки-резус. Интрон 7/8 гена hGHR человека примерно на 95% гомологичен интрону макаки - резус и содержит консенсусный сигнал полиаденилирования, что свидетельствует в пользу гипотезы.

6. Полиморфизм и мутации в гене ІіСНІІ

6.1. Полиморфизм области 3 экзона гена ЛС//Л. Анализ делеционного полиморфизма экзона 3 гена ЬСНЯ проведен в выборке, включающей 111 здоровых неродственных индивидуумов (контрольная группа), принадлежащих к условно русской популяции. Результаты представлены в Табл. 2 и Табл. 3.

Таблица 2.

Распределение аллелей с1 и Я экзона 3 гена вНЛ в группе исследования

Аллель Число аллелей в группе Частота встречаемости,

исследования, 111 образцов 222 хромосомы

й 54 0.243

Я 168 0.757

Таблица 3.

Распределение генотипов А/А, (1/А, сШ экзона 3 гена ОПЯ в группе исследования

Генотип Число генотипов в группе Частота встречаемости,

исследования,111 образцов 111 образцов

Я/А 64 0.577

а/я 40 0.36 (гетерозиготность)

(1/(1 7 0.063

Распределение аллелей и генотипов соответствуют данным для других европейских популяций (РагИе1 }. , е1 а1., 2000). Функциональное значение этого полиморфизма до сих пор окончательно не выяснено.

Проведен анализ полиморфизма области экзона 3 гена ЬвНЫ в выборке лиц с идиопатической низкорослостью: всего - 77 образцов, из них с семейной низкорослостью (СН) -53, с конституциональной задержкой роста (КЗР) - 24. В группе с СН частота генотипа (1/(1 экзона

3 гена ЬСНЯ составила 0.1 , что достоверно выше, чем в контрольной группе (111 образцов ДНК от неродственных индивидуумов) - 0.043 (^2-33,18937; /><0.001).

6.2. Синдром Ларона

Дефекты в гене рецептора гормона роста и, как следствие - нечувствительность к гормону роста, являются основной причиной редкой формы карликовости - синдрома Ларона. Проведен анализ нуклеотидной последовательности кодирующих экзонов гена ЬСНЯ у девочки с классической формой синдрома Ларона и идентифицирована нонсенс-мутация в 4 экзоне: гомозиготная замена С—>Т в 43 кодоне аргинина (Я43Х). Замена С —» Т происходит в динуклеотиде

СрС, потенциальном сайте метилирования, последующее дезаминирование 5-метилцитозина приводит к транзиции. Указанный сайт является «горячей точкой» мутаций, замена Я43Х выявлена, по меньшей мере, еще в 7 неродственных семьях из разных популяций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты изучения транскрипционного профиля гена ЬОПЯ, полученные в работе, предварительные данные о влиянии суперэкспрессии Лгт-субъединицы ремоделирующего комплекса 8\¥1/5№ на транскрипцию и сплайсинг некоторых нетранслируемых экзонов гена ЬвНЯ и анализ структуры хроматина в локусе гена ЬОПЯ позволяют предположить существование функциональной связи между сопряженными механизмами транскрипционной/ котранскрипционной регуляции тканеспецифической экспрессии гена и структурой хроматина. Результаты исследований транскрипции ДНК в хроматине, как на моделях (мононуклеосомы, полинуклеосомы), так и, собственно, на хроматине разной степени компактизации (конденсированный хроматин, активированный хроматин - 30 нм-фибриллы, транскрибируемый хроматин), результаты изучения ремоделирования хроматина разными видами РНК-полимераз и хроматин-ремоделирующими комплексами, данные о регуляторных функциях «гистонового кода», все вышесказанное в совокупности позволяет рассматривать хроматин не просто как форму «упаковки ДНК», а как функциональную часть «экспрессионного аппарата». Хроматин может быть коннектором или «регуляторным каркасом», который координирует механизмы регуляции экспрессии генома и благодаря которому «посттранскрипционные» процессы метаболизма РНК протекают контранскрипционно. Можно полагать, что детальное изучение влияния структуры хроматина на сопряженные процессы транскрипции и котранскрипционного процессинга РНК в локусе сложной единицы транскрипции — гена рецептора гормона роста человека, будет представлять интерес не только для области фундаментальных знаний, но и для прикладных исследований.

выводы.

1. Построена функциональная карта гена рецептора гормона роста человека (hGHR), занимающего около 300 т.п.н. в коротком плече хромосомы 5 (5р13.1-р12) и имеющего протяженную 5'-регуляторную область размером более 140 т.п.н..

2. Картированы и охарактеризованы основные промоторы гена hGHR: проксимальный промотор Р1, специфический для взрослой печени - основной «мишени» гормона роста, расположенный в области -17 т.п.н. от старта инициации трансляции, идистальный промотор Р2, имеющий широкую тканевую специфичность и расположенный в области -140 т.п.н. от старта инициации трансляции.

3. Экспериментально показано влияние консервативной короткой открытой рамки считывания одного из альтернативных 5'-нетранслируемых экзонов дистальной области гена hGHR на экспрессию встроенного за ней репортерного гена в системе временной экспрессии, что указывает на возможность регуляции экспрессии гена hGHR на уровне трансляции.

4. Установлено, что один из предполагаемых 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR (V6), выявленный ранее методом 5'-RACE, является артефактным продуктом и соответствует антисмысловой цепи ДНК в локусе гена моноацилглицерат-О-ацилтрансферазы 2 человека (hMOGAT2), расположенного в длинном плече хромосомы 11 (llql3.5). Экспериментально доказана транскрипция антисмысловой цепи гена hMOGAT2.

5. Экспериментально установлена и подтверждена in silico локализация всех известных 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR. Идентифицированы 4 изоформы, содержащие как новые комбинации известных 5'-нетранслируемых последовательностей (3 изоформы), так и один новый 5'-нетранслируемый экзон (1 изоформа).

6. В некоторых опухолях и клеточных линиях опухолевого и эмбрионального происхождения выявлена экспрессия укороченной формы мРНК hGHR, не содержащей участков, кодирующих трансмембранный и внутриклеточный домены рецептора.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи

1. Tiulpakov A.N., Orlovsky I.V., Kalintchenko N.U., Lonina D.A., Kalesnikova G.S., Peterkova VA., Bjarnason R., Baumbach L., Rubtsov P.M. A case of growth hormone insensitivity (Laron syndrome) in a Russian girl caused by a common mutation of the growth hormone receptor gene. // The Journal of Endocrine Genetics. 1999. V. 1. N 2. P. 95-100.

2. Орловский И.В., Свердлова П.С., Рубцов П.М. Тонкая структура, экспрессия и полиморфизм гена рецептора гормона роста человека. // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. № 1. С. 29-39.

3. Студитский В.М., Орловский И.В., Чертков О.В., Ефимова Н.С., Логинова М.А., Кулаева О.И. Молекулярные механизмы транскрипции хроматина РНК-полимеразой 3. Часть 1. // Вестник Московского Университета, Серия 16: Биология. 2012. № 3. С. 6-11.

4. Студитский В.М., Орловский И.В., Чертков О.В., Ефимова Н.С., Логинова М.А., Кулаева О.И. Молекулярные механизмы транскрипции хроматина РНК-полимеразой 3. Часть 2. // Вестник Московского Университета, Серия 16: Биология. 2012. № 4. С. 10-16.

Тезисы устных и стендовых докладов, материалы конференций

1. Рубцов П.М., Яковенко А.Р., Лонина Д.А., Астапова И.И., Орловский И.В., Свердлова П.С. Гены рецепторов гормона роста и пролактина как примеры сложных единиц транскрипции эукариотического генома. // II съезд Биохимического общества РАН. 1997. Пущино. С. 36-37.

2. Астапова И.И., Орловский И.В., Яковенко А.Р., Свердлова П.С., Чернов Б.К., Рубцов П.М. Клонирование и характеристика промоторных участков гена рецептора гормона роста человека. // Восьмая итоговая конференция «Геном человека-98». 1998. Москва. С. 51-52.

3. Орловский И.В., Свердлова П.С., Астапова И.И., Морозов И.А., Бабасян С.А., Лонина Д.А., Голова Ю.Б., Чернов Б.К., Рубцов П.М. Структурно-функциональный анализ гена рецептора гормона роста человека. // Девятая итоговая конференция «Геном человека-99». 1999. Москва. С. 71.

4. Тюльпаков А.Н., Орловский И.В., Калинченко Н.Ю., Лонина Д.А., Колесникова Г.С., Петеркова В.А., Бьярнасон Р., Баумбах Л., Рубцов П.М. Характеристика мутации в гене рецептора гормона роста человека при синдроме Ларона. // Девятая итоговая конференция «Геном человека-99». 1999. Москва. С. 93.

5. Орловский И.В. Клонирование и характеристика предполагаемого промотора РЗ гена рецептора гормона роста человека. // Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии». Пущино. 2000. Т. 2. С. 131.

6. Orlovski I.V., Sverdlova P.S., Ivanov D.S., Prassolov V.S., Rubtsov P.M. Characterisation of the multiple promoters of the human growth hormone receptor gene. // Proceedings of The Symposium "Current problems of Molecular Genetics and Cell Biology" (Eds. G.P. Georgiev, S. Olsnes, Yu.V. Kozlov). 2001. MaxPress. Moscow. P. 227-232.

7. Орловский И.В., Свердлова П.С., Рубцов П.М. Изучение полиморфизма гена рецептора гормона роста человека. // III съезд Биохимического общества РАН. 2002. С.-Петербург. С. 306.

8. Орловский И.В., Витебская А.В., Петеркова В.А., Рубцов П.М. Анализ полиморфизма гена рецептора гормона роста человека у пациентов с идиопатической низкорослостью. // III съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. 2004. Москва. Т. II. С. 15.

9. Orlovski I. Trans-splicing as a possible mechanism of the human growth hormone receptor mRNA isoform formation. // Workshop "Coupling between transcription and RNA processing". 2004. Baeza (Spain).

10. Orlovski I., Rubtsov P. Identification and analysis of the noncoding antisense transcript in the human acyl-CoA:monoacylglycerol O-acyltransferase (hMOGAT2) gene locus. // Workshop "RNA-protein interactions in development and cancer ". 2009. Baeza (Spain).

Заказ № 49-П/01/2013 Подписано в печать 25.01.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25

(Г?

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орловский, Игорь Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Механизмы котранскрипционного сопряжения процессинга РНК.

1. Введение. «Гипотеза сопряжения».

2. С-концевой домен большой субъединицы РНК-полимеразы И.

3. Код CTD.

3.1. Гипотеза CTD-кода.

3.2. Фосфорилирование остатков серина в CTD.

3.3. Фосфорилирование тирозина-1 и треонина-4.

3.4. Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков

CTD в транскрипционном цикле

3.5. Изомеризация пролинов в CTD.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека"

Значительные достижения геномики на рубеже XX-XXI веков, особенно результаты секвенирования геномов различных организмов, составляют основной потенциал для развития новых областей молекулярной биологии — «транскриптомики» и «протеомики». Результатом сравнения геномов разных биологических видов стал вывод об усложнении регуляции экспрессии генома при переходе от «низших» видов к «высшим», а не увеличение числа генов, как предполагали ранее. Экспрессия эукариотического генома - сложнейший многоуровневый процесс, одним из наиболее важных этапов которого является транскрипция. В настоящее время на смену представлениям о процессинге, транспорте, редактировании и запрограммированной деградации мРНК как посттранскрипционных процессах выдвинута «гипотеза сопряжения» о тесной взаимосвязи всех этапов метаболизма РНК между собой и их котранскрипционном протекании. Предполагается, что процессинг, модификация, транспорт и деградация РНК происходят одновременно с процессом элонгации, то есть существует разветвлённая «сеть» согласованно работающих «молекулярных машин» (Maniatis Т., Reed R., 2002). Стержнем этой системы, как полагают, является С-концевой домен (C-terminal domain, CTD) РНК-полимеразы II, однако до настоящего времени не идентифицирован «регуляторный каркас», управляющий столь сложной структурой. Исследования именно этого аспекта, по-видимому, могут обеспечить достаточные доказательства правоты «гипотезы сопряжения».

Основное следствие «гипотезы сопряжения» - вывод о существовании единой согласованной системы регуляции экспрессии генов, включающей транскрипционный и «посттранскрипционный» аппараты клеточного ядра, поэтому логично говорить о «котранскрипционной» регуляции экспрессии генов. Предложенная гипотеза позволяет ответить на ряд фундаментальных вопросов молекулярной биологии, но можно надеяться, что полученные ответы со временем найдут применение в практической деятельности человека. Так изучение регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и сопряженных процессов метаболизма РНК в настоящее время находит применение, например, для более глубокого понимания природы РНК-доминантных заболеваний (RNA-dominant diseases), связанных с транскрипцией «токсических» некодирующих РНК. Попытки применения препаратов микроРНК (microRNA), киРНК (siRNA), PIWI-ассоциированных РНК (piRNA) и антисмысловых РНК для коррекции аберрантных продуктов транскрипции и метаболизма РНК, как в отдельных клетках, так и в живых организмах, позволяют говорить о развитии «антисмысловых» технологий для фундаментальных и прикладных исследований и закладке основ «антисмысловой» терапии и «микрогеномной» медицины.

Цель работы состоит в изучении регуляции экспрессии сложной единицы транскрипции - гена рецептора гормона роста человека (hGHR). Для достижения поставленной цели необходимо решить общую задачу -исследовать «профиль» транскрипции гена hGHR в РНК из человеческих тканей, фактически, необходимо решить ряд конкретных задач:

1. построить физическую карту гена hGHR;

2. картировать функциональные элементы гена: потенциальные промоторы, 5'-нетранслируемые экзоны, кодирующие экзоны;

3. исследовать функции потенциальных промоторов in vitro;

4. охарактеризовать 5'-нетранслируемую область (5'-НТО) гена: картировать сайты старта транскрипции, оценить представленность основных 5'-нетранслируемых экзонов (вариантов первого некодирующего экзона гена hGHR) в РНК из человеческих тканей;

5. охарактеризовать 3'-НТО гена;

6. изучить экспрессию кодирующей части гена hGHR в человеческих тканях.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Механизмы котранскрипционного сопряжения процессинга РНК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Орловский, Игорь Вячеславович

выводы.

2. Картированы и охарактеризованы основные промоторы гена hGHR: проксимальный промотор Р1, специфический для взрослой печени - основной «мишени» гормона роста, расположенный в области -17 т.п.н. от старта инициации трансляции, и дистальный промотор Р2, имеющий широкую тканевую специфичность и расположенный в области -140 т.п.н. от старта инициации трансляции.

4. Установлено, что один из предполагаемых 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR (V6), выявленный ранее методом 5'-RACE, является артефактным продуктом и соответствует антисмысловой цепи ДНК в локусе гена моноацилглицерат О-ацилтрансферазы 2 человека (hMOGAT2), расположенного в длинном плече хромосомы 11 (llql3.5). Экспериментально доказана транскрипция антисмысловой цепи гена hMOGAT2.

6. В некоторых опухолях и клеточных линиях опухолевого и эмбрионального происхождения выявлена экспрессия укороченной формы мРНК ИвНЯ, не содержащей участков, кодирующих трансмембранный и внутриклеточный домены рецептора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты изучения транскрипционного профиля гена ЬОНЯ, полученные в работе, предварительные данные о влиянии суперэкспрессии Вгакта-субъединицы ремоделирующего комплекса БАУХ/БМ7 на транскрипцию и сплайсинг некоторых нетранслируемых экзонов гена ЬвНИ и анализ структуры хроматина в локусе гена 1ЮН11 позволяют предположить существование функциональной связи между сопряженными механизмами транскрипционной/ котранскрипционной регуляции тканеспецифической экспрессии гена и структурой хроматина. Результаты исследований транскрипции ДНК в хроматине, как на моделях (мононуклеосомы, полинуклеосомы), так и, собственно, на хроматине разной степени компактизации (конденсированный хроматин, активированный хроматин - 30 нм-фибриллы, транскрибируемый хроматин), результаты изучения ремоделирования хроматина разными видами РНК-полимераз и хроматин-ремоделирующими комплексами, данные о регуляторных функциях «гистонового кода», все вышесказанное в совокупности позволяет рассматривать хроматин не просто как форму «упаковки ДНК», а как функциональную часть «экспрессионного аппарата». Хроматин может быть коннектором или «регуляторным каркасом», который координирует механизмы регуляции экспрессии генома и благодаря которому «посттранскрипционные» процессы метаболизма РНК протекают контранскрипционно. Можно полагать, что детальное изучение влияния структуры хроматина на сопряженные процессы транскрипции и котранскрипционного процессинга РНК в локусе сложной единицы транскрипции - гена рецептора гормона роста человека, будет представлять интерес не только для области фундаментальных знаний, но и для прикладных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орловский, Игорь Вячеславович, Москва

1. Adams T.E. Differential expression of growth hormone receptor messenger RNA from a second promoter. // Mol. Cell. Endocrinol. 1995. V. 108. N 1-2. P. 23.

2. Akhtar M.S., Heidemann M., Tietjen J.R., Zhang D.W., Chapman R.D., Eick D., Ansari A.Z. TFIIH kinase places bivalent marks on the carboxy-terminal domain of RNA polymerase II. // Mol. Cell. 2009. V. 34. N 3. P. 387-93.

3. Akman B.H., Can T., Erson-Bensan A.E. Estrogen-induced upregulation and 3'-UTR shortening of CDC6.//Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. N21. P. 10679-88.

4. Allemand E, Batsché E, Muchardt C. Splicing, transcription, and chromatin: a ménage à trois. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2008. V. 18. N 2. P. 145-51.

5. Allison L. A., Moyle M., Shale M., Ingles, C. J. Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases. // Cell. 1985. V. 42. N2. P. 599-610.

6. Amit T., Bergman T., Dastot F., Youdim M.B., Amselem S., Hochberg Z. A membrane-fixed, truncated isoform of the human growth hormone receptor. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. V. 82. N 11. P. 3813-7.

7. Amit T., Hacham H., Daily O., Hertz P., Barkey R.J., Hochberg Z., The Hep G2 cell line in the study of growth hormone receptor/ binding protein. // Mol. Cell. Endocrinol. 1994. V. 101. N 1-2. P. 29-36.

8. Bartke A., Chandrashekar V., Dominici F., Turyn D., Kinney B., Steger R., Kopchick J.J. Insulin-like growth factor 1 (IGF-I) and aging: controversies and new insights. // Biogerontology. 2003. V. 4. N 1. P. 1-8.

9. Batsché E., Yaniv M., Muchardt C. The human SWI/SNF subunit Brm is a regulator of alternative splicing. //Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. V.13. N 1. P. 22-29.

10. Berger S.L. The complex language of chromatin regulation during transcription. // Nature. 2007. V. 447. N 7143. P. 407-12.

11. Beyer A.L., Osheim Y.N. Visualization of RNA transcription and processing. // Semin Cell Biol. 1991. V. 2. N 2. P. 131-40.

12. Boeing S., Rigault C., Heidemann M., Eick D., Meisterernst M. RNA polymerase II C-terminal heptarepeat domain Ser-7 phosphorylation is established in a104mediator-dependent fashion.// J. Biol. Chem. 2010. V. 285. N 1. P. 188-96.

13. Bracht J., Hunter S., Eachus R., Weeks P., Pasquinelli A.E. Trans-splicing and polyadenylation of let-7 microRNA primary transcripts. // RNA. 2004. V. 10. N 10. P. 1586-94.

14. Bruce C., Whitelaw A., Grolli S., Accornero P., Donofrio G., Farini E., Webster J. Matrix attachment region regulates basal beta-lactoglobulin transgene expression. // Gene. 2000. V. 244. N 1-2. P. 73-80.

15. Buratowski S. The CTD code. // Nat. Struct. Biol. 2003. V. 10. N 9. P. 679-80.

16. Cai X., Hagedorn C. H., Cullen B.R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. // RNA. 2004. V. 10, N 12. P. 1957-66.

17. Cassart C., Drogat J., Migeot V., Hermand D. Distinct requirement of RNA polymerase II CTD phosphorylations in budding and fission yeast. // Transcription. 2012. V. 3. N 5. P. 231-234.

18. Chapman R.D., Heidemann M., Albert T.K., Mailhammer R., Flatley A., Meisterernst M., Kremmer E., Eick D. Transcribing RNA polymerase II is phosphorylated at CTD residue serine-7. // Science. 2007. V. 318. N 5857. P. 1780-2.

19. Chapman R.D., Heidemann M., Hintermair C., Eick D. Molecular evolution of the RNA polymerase II CTD. // Trends Genet. 2008. V. 24. N 6. P. 289-96.

20. Chiara M.D., Reed R. A two-step mechanism for 5' and 3' splice-site pairing. // Nature. 1995. V. 375. N 6531. P. 510-3.

21. Cho E.J., Takagi T., Moore C.R., Buratowski S. mRNA capping enzyme is recruited to the transcription complex by phosphorylation of the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. // Genes Dev. 1997. V. 11. N 24. P. 3319-26.

22. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. V. 162. N l.P. 156-9.

23. Cockerill P.N., Garrard W.T. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites. // Cell. 1986.V. 44. N 2. P. 273-282.

24. Conway-Campbell B.L., Brooks A.J., Robinson P.J., Perani M., Waters M. J.105

25. The extracellular domain of the growth hormone receptor interacts with coactivator activator to promote cell proliferation. // Mol. Endocrinol. 2008. V. 22. N 9. P. 2190202.

26. Corden J.L. Tails of RNA polymerase II. // Trends Biochem. Sci. 1990. V. 15. N 10. P. 383-7.

27. Corden J.L., Patturajan M. A CTD function linking transcription to splicing. // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. N 11. P. 413-6.

28. Delehaye-Zervas M.C., Mertani H., Martini J.F., Nihoul-Feketé C., Morel G., Postel-Vinay M.C. Expression of the growth hormone receptor gene in human digestive tissues. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994. V. 78. N 6. P. 1483-90.

29. Du L., Warren S.L. A functional interaction between the carboxy-terminal domain of RNA polymerase II and pre-mRNA splicing. // J. Cell. Biol. 1997. V. 136. N 1. P. 518.

30. Edens A., Talamantes F. Alternative processing of growth hormone receptor transcripts. // Endocr. Rev. 1998. V. 19. N 5. P. 559-82.

31. Egloff S., O'Reilly D., Chapman R.D., Taylor A., Tanzhaus K., Pitts L.,Eick

32. D., Murphy S. Serine-7 of the RNA polymerase II CTD is specifically required for snRNA gene expression.//Science. 2007. V. 318. N 5857. P. 1777-9.

33. Egloff S., Szczepaniak S.A., Dienstbier M., Taylor A., Knight S., Murphy S. The integrator complex recognizes a new double mark on the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. N 27. P. 20564-9.

34. Fabbri M., Bottoni A., Shimizu M., Spizzo R., Nicoloso M.S., Rossi S., Barbarotto

35. E., Cimmino A., Adair B., Wojcik S.E., Valeri N., Calore F., Sampath D., Fanini

36. Flouriot G., Brand H., Seraphin B., Gannon F. Natural trans-spliced mRNAs are generated from the human estrogen receptor-alpha (hER alpha) gene. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. N 29. P. 26244-51.

37. Gebre-Medhin M.,Kindblom L.G., Wennbo H.,Tornell J., Meis-Kindblom J.M. Growth hormone receptor is expressed in human breast cancer. // Am. J. Pathol. 2001. V. 158. N 4. P. 1217-22.

38. Ghosh A., Shuman S., Lima C.D. Structural insights to how mammalian capping enzyme reads the CTD code. // Mol. Cell. 2011. V. 43. N 2. P. 299-310.

39. Goodyer C.G., Zogopoulos G., Schwartzbauer G., Zheng H., Hendy G. N., Menon R.K. Organization and evolution of the human growth hormone receptor gene 5'-flanking region. // Endocrinology. 2001. V. 142. N 5. P. 1923 -1934.

40. Graichen R., Sandstedt J., Goh E.L., Isaksson O.G., Tornell J., Lobie P.E. The growth hormone-binding protein is a location-dependent cytokine receptor transcriptional enhancer. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N 8. P. 6346-54.

41. Greenleaf A. L. Positive patches and negative noodles: linking RNA processing to transcription? // Trends Biochem. Sci. 1993. V. 18. N 4. P. 117-119.

42. Gu B., Eick D., Bensaude O. CTD serine-2 plays a critical role in splicing and termination factor recruitment to RNA polymerase II in vivo. // Nucleic Acids Res. 2013. V.41.N3.P. 1591-603.

43. Hampsey M., Reinberg D. Tails of intrigue: phosphorylation of RNA polymerase II mediates histone methylation. // Cell. 2003. V. 113. N 4. P. 429-32.

44. Heidemann M., Eick D. Tyrosine-1 and threonine-4 phosphorylation marks complete the RNA polymerase II CTD phospho-code. // RNA Biol. 2012. V. 9. N 9. P. 1144-6.

45. Hicks MJ., Yang C.-R., Kotlajich M.V., Hertel K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. // PLoS Biol. 2006. V. 4. N 6. P. el47.

46. Hsin J.P., Sheth A., Manley J.L. RNAP II CTD phosphorylated on threonine-4 is required for histone mRNA 3' end processing. // Science. 2011. V. 334. N 6056. P. 683-6.

47. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. // Gene, 1990. V. 26. N 1. P. 23-28.

48. Jiang H., Okamura C.S., Lucy M.C., Isolation and characterization of a novel promoter for the bovine growth hormone receptor gene. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N 12. P. 7893-7900.

49. Jiang H., Okamura C.S., Boyd C.K,. Lucy M.C. Identification of Spl as the transcription factor for the alternative promoter P2 of the bovine growth hormone receptor gene. // J. Mol. Endocrinol. 2000. V. 24. N 2. P. 203-14.

50. Jorge A.A., Arnhold I.J. Growth hormone receptor exon 3 isoforms and their implication in growth disorders and treatment. // Horm. Res. 2009. V. 71 Suppl. 2. P. 55-63.

51. Kahlert S., Nuedling S., van Eickels M., Vetter H., Meyer R., Grohe C. Estrogen receptor alpha rapidly activates the IGF-I receptor pathway. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N24. P. 18447-53.

52. Kami R., de Stanchina E., Lowe S.W., Sinha R., Mu D., Krainer A.R. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. N 3. P. 185-93.

53. Kim E., Du L., Bregman D.B., Warren S.L. Splicing factors associate with hyperphosphorylated RNA polymerase II in the absence of pre-mRNA. // J. Cell. Biol. 1997. V. 136. N 1. P. 19-28.

54. Konarska M.M., Padgett R.A., Sharp P.A. Trans splicing of mRNA precursors in vitro. // Cell. 1985. V. 42. N 1. P. 165-71.

55. Konarska M.M., Sharp P.A. Response to Solnick. // Cell. 1986. V. 44. N 2. P. 211.

56. Kops O., Zhou X.Z., Lu K.P. Pinl modulates the dephosphorylation of the RNA polymerase II C-terminal domain by yeast Fcpl. // FEBS Lett. 2002. V. 513. N 2-3. P. 305-11.

57. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. // Gene. 1999. V. 234. N2. P. 187-208.

58. Laron Z. The GH-IGF-I axis and longevity. The paradigm of IGF-I deficiency. // Hormones (Athens). 2008. V. 7. N 1. P. 24-7.

59. Leung D.W., Spencer S.A., Cachaines G., Hammonds R.G., Collins C., Henzel W.J., Barnard R., Waters M. J., Wood W.I. Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression. // Nature. 1987. V. 330. N 6148. P. 537-543.

60. Lev-Maor G., Sorek R., Shomron N., Ast G. The birth of an alternatively spliced exon: 3' splice-site selection in Alu exons. // Science. 2003. V. 300. N 5623. P. 128891.

61. Liu P., Kenney J.M., Stiller J.W., Greenleaf A.L. Genetic organization, length conservation, and evolution of RNA polymerase Ilcarboxyl-terminal domain. // Mol. Biol. Evol. 2010. V. 27. N 11. P. 2628-41.

62. Lobie P.E., Barnard R., Waters M.J. The nuclear growth hormone receptor binding protein. Antigenic and physicochemical characterization. // J. Biol. Chem. 1991.V. 266. N 33. P. 22645-52.

63. Lockwood J.F., Cao J., Burn P., Shi Y., Human intestinal monoacylglycerol acyltransferase: differential features in tissue expression and activity. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. V. 285. N 5. P. E927-E937.

64. Lomberk G., Bensi D., Fernandez-Zapico M.E., Urrutia R. Evidence for the existence of an HPl-mediated subcode within the histone code. // Nat. Cell. Biol. 2006. V. 8. N4. P. 407-15.

65. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor, New York. 1989.

66. Maniatis T., Reed R. An extensive network of coupling among gene expression machines. // Nature. 2002. V. 416. N 6880. P. 499-506.

67. Maniatis T., Tasic B. Alternative pre-mRNA splicing and proteome expansion in metazoans. // Nature. 2002. V. 418. N 6894. P. 236-43.

68. Mansfield S.G., Clark R.H., Puttaraju M., Kole J., Cohn J.A., Mitchell L;G., Garcia-Blanco M.A. 5' exon replacement and repair by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. // RNA. 2003. V. 9. N 10. P. 1290-7.

69. Mayer A., Heidemann M., Lidschreiber M., Schreieck A, Sun M., Hintermair

70. C., Kremmer E., Eick D., Cramer P. CTD tyrosine phosphorylation impairs termination factor recruitment to RNA polymerase II. // Science. 2012. V. 336. N 6089. P. 1723-5.

71. Mayr C., Bartel D.P. Widespread shortening of 3'UTRs by alternative cleavage and polyadenylation activates oncogenes in cancer cells. // Cell. 2009. V. 138. N 4. P. 673-84.

72. McCracken S., Fong N., Rosonina E., Yankulov K., Brothers G., Siderovski

73. D., Hessel A., Foster S., Shuman S., Bentley D.L. 5'-Capping enzymes are targeted to pre-mRNA by binding to the phosphoiylated carboxy-terminal domain of RNA polymerase II. // Genes Dev. 1997a. V. 11. N 24. P. 3306-18.

74. McCracken S., Fong N., Yankulov K., Ballantyne S., Pan G., Greenblatt J., Patterson S.D., Wickens M., Bentley D.L. The C-terminal domain of RNA polymerase II couples mRNA processing to transcription. // Nature. 1997. V. 385. N 6614. P. 35761.

75. Mertani H.C., Raccurt M., Abbate A., Kindblom J., Tornell J., Billestrup N., Usson

76. Y., Morel G., Lobie P.E. Nuclear translocation and retention of growth hormone. //

77. Endocrinology. 2003. V. 144. N 7. P. 3182-95.110

78. Morlando M., Ballarino M., Gromak N., Pagano F., Bozzoni I., Proudfoot N.J. Primary microRNA transcripts are processed co-transcriptionally. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V. 15. N 9. P. 902-9.

79. Morris D.P., Phatnani H.P., Greenleaf A.L. Phospho-carboxyl-terminal domain binding and the role of a prolyl isomerase in pre-mRNA 3'-End formation. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N 44. P. 31583-7.

80. Mullis P.E., Holl R.W., Lund T.M , Eble A., Brickell P.M. Regulation of human growth hormone-binding protein production by human growth hormone in a hepatoma cell line. // Mol. Cell. Endocrinol. 1995. V. 111. N 2. P. 181-190.

81. Mullis P.E., Lund T.M., Patel M.S., Brook C.G.D., Brickell P.M. Regulation of human growth hormone receptor gene expression by human growth hormone in a human hepatoma cell line. // Mol. Cell. Endocrinol. 1991. V. 76. N 1-3. P.125-133.

82. Mullis P.E., Wagner J.K., Eble A., Nuoffer J.M., Postel-Vinay M.-C. Regulation of human growth hormone receptor gene transcription by human growth hormone binding protein. // Mol. Cell. Endocrinol. 1997. V. 131. N 1. P. 89-96.

83. Neugebauer K.M., Roth M.B. Transcription units as RNA processing units. // Genes Dev. 1997. V. 11. N 24. P. 3279-85.

84. Noble C.G., Hollingworth D., Martin S.R., Ennis-Adeniran V., Smerdon S.J., Kelly G., Taylor I.A., Ramos A. Key features of the interaction between Pcfl 1 CID and RNA polymerase II CTD. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V. 12. N 2. P. 144-51.

85. Pekhletsky R.I., Chernov B.K.,Rubtsov P.M. Variants of the 5'-untranslated sequence of human growth hormone receptor mRNA. // Mol. Cell. Endocrinol. 1992. V. 90. N l.P. 103-109.

86. Perry J.K., Emerald B.S., Mertani H.C., Lobie P.E. The oncogenic potential of growth hormone. // Growth Horm. IGF Res. 2006. V. 16. N 5-6. P. 277-89.

87. Reis E.M., Louro R., Nakaya H.I., Verjovski-Almeida S. As antisense RNA gets intronic. // OMICS. 2005. V. 9. N 1. P. 2-12.

88. Reiter E., Kecha O., Hennuy B., Lardinois S., Klug M., Bruyninx M., Closset J., Hennen G. Growth hormone directly affects the function of the different lobes of the rat prostate. // Endocrinology. 1995. V. 136. N 4. P. 3338-3345.

89. Rivers C.A., Norman M.R. The human growth hormone receptor gene — characterisation of the liver-specific promoter. // Mol. Cell. Endocrinol. 2000. V. 160. N1-2. P. 51-59.

90. Schickel R., Boyerinas B., Park S.-M., Peter M.E. MicroRNAs: key players in the immune system, differentiation, tumorigenesis and cell death. // Oncogene. 2008. V. 27. N 45. P. 5959-5974.

91. Schwer B., Sanchez A.M., Shuman S. Punctuation and syntax of the RNA polymerase II CTD code in fission yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 V. 109. N44. P. 18024-9.

92. Shevah O., Laron Z. Patients with congenital deficiency of IGF-I seem protected from the development of malignancies: a preliminary report. // Growth Horm. IGF Res. 2007. V. 17. N l.P. 54-7.

93. Sobrier M.L., Duquesnoy P., Duriez B., Amselem S., Goossens M. Expression and binding properties of two isoforms of the human growth hormone receptor. // FEBS Lett. 1993. V. 319. N 1-2. P. 16-20.

94. Solnick D. Trans splicing of mRNA precursors.//Cell. 1985. V. 42. N 1. P. 157-64.

95. Solnick D. Does trans splicing in vitro require base pairing between RNAs? // Cell. 1986. V. 44. N2. P. 211.

96. Souza S.C., Frick G.P., Wang X., Kopchick J.J., Lobo R.B., Goodman H.M. A single arginine residue determines species specificity of the human growth hormone receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. N 4. P. 959-63.

97. Stallings-Mann M.L., Ludwiczak R.L., Klinger K.W., Rottman F. Alternative splicing of exon 3 of the human growth hormone receptor is the result of an unusual genetic polymorphism. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. N 22. P. 1239412399.

98. Strawbridge R.J., Karvestedt L., Li C., Efendic S., Ostenson C.G., Gu H.F., Brismar K. GHR exon 3 polymorphism: association with type 2 diabetes mellitus and metabolic disorder. // Growth Horm. IGF Res. 2007. V. 17. N 5. P. 392-8.

99. Sullenger B. A., Gilboa E. Emerging clinical applications of RNA. // Nature. 2002. V. 418. N6894. P. 252-8.

100. Takahara T., Kanazu S.I., Yanagisawa S., Akanuma H. Heterogeneous Spl mRNAs in human HepG2 cells include a product of homotypic trans-splicing. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N 48. P. 38067-72.

101. Takahara T., Kasahara D., Mori D., Yanagisawa S., Akanuma H. Thetrans113spliced variants of Spl mRNA in rat. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 298. N l.P. 156-62.

102. Takahara T., Tasic B., Maniatis T., Akanuma H., Yanagisawa S. Delay in synthesis of the 3' splice site promotes trans-splicing of the preceding 5' splice site. // Mol. Cell. 2005. V. 18. N2. P. 245-51.

103. Tennyson C.N., Klamut H.J., Worton R.G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. // Nat. Genet. 1995. V. 9. N2. P. 184-190.

104. Tietjen J.R., Zhang D.W., Rodriguez-Molina J.B., White B.E.,AkhtarI

105. M.S., Heidemann M., Li X., Chapman R.D., Shokat K., Keles S., Eick D., Ansari A.Z. Chemical-genomic dissection of the CTD code. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V. 17. N9. P. 1154-61.

106. Tiong T.S., Freed K.A., Herington A.C. Identification and tissue distribution of messenger RNA for the growth hormone receptor in the rabbit. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 158. N 1. P. 141-8.

107. Tiong T.S., Herington A.C. Identification of a novel growth hormone binding protein mRNA in rat liver. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 180. N 2. P. 48995.

108. Urbanek M., Russell J.E., Cooke N.E., Liebhaber S.A. Functional characterization of the alternatively spliced, placental human growth hormone receptor. // J. Biol. Chem. 1993.V. 268. N 25. P. 19025-32.

109. Wei Y., Puzhko S., Wabitsch M., Goodyer C.G. Structure and activity of the human growth hormone receptor (hGHR) gene V2 promoter. // Mol. Endocrinol. 2009. V. 23. N3. P. 360-72.

110. Wei Y., Rhani Z., Goodyer C.G. Characterization of growth hormone receptor messenger ribonucleic acid variants in human adipocytes. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006. V. 91. N 5. P. 1901-1908.

111. Werner-Allen J.W., Lee C.J., Liu P., Nicely N.I., Wang S., Greenleaf A.L., Zhou P. cis-Proline-mediated Ser(P)5 dephosphorylation by the RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase Ssu72. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. N 7. P. 5717-26.

112. Wu X., Liu F., Yao X., Li W., Chen C. Growth hormone receptor expression is up-regulated during tumorigenesis of human colorectal cancer. // J. Surg. Res. 2007. V. 143. N 2. P. 294-9.

113. Xu Y.X., Hirose Y., Zhou X.Z., Lu K.P., Manley J.L. Pinl modulates the structure and function of human RNA polymerase II.// Genes Dev. 2003. V. 17. N22.1151. P. 2765-76.

114. Yen C.L., Farese R.V. Jr. MGAT2, a monoacylglycerol acyltransferase expressed in the small intestine. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N 20. P. 18532-18537.

115. Yu J.H., Schwartzbauer G., Kazlman A., Menon R.K. Role of the Sp family of transcription factors in the ontogeny of growth hormone receptor gene expression. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N 48. P. 34327-36.

116. Zhang M., Wang X.J., Chen X., Bowman M.E., Luo Y.,Noel J.P., Ellington A.D., Etzkorn F.A., Zhang Y. Structural and kinetic analysis of prolyl-isomerization/phosphorylation cross-talk in the CTD code. // ACS Chem. Biol. 2012. V. 7. N 8. P. 1462-70.

117. Zhu Т., Starling-Emerald В., Zhang X.,Lee K.O., Gluckman P.D.,Mertani H.C., Lobie P.E. Oncogenic transformation of human mammary epithelial cells by autocrine human growth hormone. // Cancer Res. 2005. V. 65. N 1. P. 317-24.

118. Zippo A., Serafini R., Rocchigiani M., Pennacchini S., Krepelova A., Oliviero S. Histone crosstalk between H3S10ph and H4K16ac generates ahistonecode that mediates transcription elongation. // Cell. 2009. V. 138. N 6. P. 1122-36.

119. Zogopoulos G., Albrecht S., Pietsch Т., Alpert L., von Schweinitz D., Lefebvre Y., Goodyer C.G. Fetal- and tumor-specific regulation of growth hormone receptor messenger RNA expression in human liver. // Cancer Res. 1996. V. 56. N 13. P. 2949-53.

120. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике, пер. с англ. Ю. Н. Зографа, Т.С. Ильиной и В.Г. Никифорова, под ред. и с предисл. С. И. Алиханяна. 1976. Москва : Мир. С. 324-327.

121. Яковенко А.Р., Свердлова П.С., Антонов А.В., Адаме Т.Е., Рубцов П.М. Клонирование GC-богатого 5-некодирующего экзона и предполагаемого промотора гена рецептора гормона роста человека. // Доклады АН. 1997. Т. 356. №5. С. 704-707.

122. Автор глубоко благодарен научному руководителю проф. П.М. Рубцову за мудрое и чуткое руководство, без которого выполнение данной работы было бы невозможно.

123. Автор признателен Д.С. Иванову и проф. B.C. Прасолову, за выполнение трансфекции эукариотических клеток и методическую помощь в работе с культивируемыми клеточными линиями.

124. Автор весьма признателен коллегам, поименованным в главе III диссертационной работы, предоставившим материалы и оказавшим методическую помощь при выполнении отдельных экспериментов.

125. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории белковых ингибиторов клеточных процессов ИМБ РАН и лично зав. лабораторией проф. Ю.В. Козлову, за помощь при выполнении некоторых экспериментов и ценные советы.

Информация о работе

Орловский, Игорь Вячеславович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии гена рецептора гормона роста человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы