Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама-отхода нефтехимического производства

Никитина, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама-отхода нефтехимического производства
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама-отхода нефтехимического производства"

УДК579.26:57922:577.121

На правах рукописи

НИКИТИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ТОКСИКОЛОГО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕШЛАМА - ОТХОДА НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.07-Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

Казань -2003

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Р.П. Наумова

Член корр. РАН, Доктор

биологических наук И.Б. Ившина

Доктор биологических наук, профессор Л. П. Хохлова

Казанский Институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится « 2 » октября 2003г. в_на заседании

диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина, 420008, г.Казань, ул. Кремлёвская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан _августа 2003г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

2-ооЗ'А

«7 °7?

Актуальность проблемы. Мировое сообщество движется в направлении повышения уровня урбанизации и роста промышленного производства, в связи с чем, одна из главных международных экологических проблем связана с наличием в объектах биосферы сложных комплексов экологически опасных ксенобиотиков, которые представляют угрозу для почвы, воздуха, водоемов, источников питьевой воды, здоровья л кадей.

В нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленных отраслях остро стоит проблема обезвреживания и утилизации больших объемов нефтесодержащих отходов (Shailubhai, 1984; Castaldi, Ford, 1991; Giles et al., 2001; Mishra etal., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001; Saikia etal., 2001). Это в полной мере относится к производственному объединению "Нижнекамскнефтехим" (НКНХ) (г.Нижнекамск, Россия), функционирование которого сопряжено с постоянным образованием твердых нефтесодержащих отходов. До недавнего времени в мировом масштабе наиболее распространенной была практика захоронения твердых опасных отходов на специализированных полигонах (Mueller etal., 1984; Holmboe, 1993; Saxena, Jotshi, 1997). Аналогично решалась эта проблема в НКНХ, где, начиная с 1965г, происходило накопление этих шламов в шламонакопителях. В настоящее время объемы скопившихся в этих специальных депо отходов достигают 1123 тыс м3. Существующие депо практически заполнены, а строительство новых противоречит экологическим критериям. В этих условиях возникла необходимость освобождения шламонакопителей и поиска путей обезвреживания и утилизации твердых нефтехимических отходов.

Нефтешламы содержат устойчивые и токсичные компоненты, в частности, полициклические ароматические углеводороды(ПАУ),алканы(Aprilletal., 1990; Rocha etal., 1997; Giles etal., 2001; Mishra etal., 2001), а также могут включать специфические продукты нефтехимии (Якушева с соавт., 2002). Часть нефтехимических составляющих - это токсиканты и канцерогены (Styrene, 1983; McMichael, 1988). Химический состав шламов варьирует в зависимости от их происхождения, специфики применяемых на предприятиях технологий добычи, переработки и химического синтеза. Исходя из этого, в каждом конкретном случае необходимо создавать стратегию ремедиации с учетом биологических и абиотических особенностей, которые характеризуют исследуемые твердые отходы.

Научное обоснование стратегии ремедиации предполагает создание концепции

химического, токсикологического и биологического статуса данной антропогенной

^ЭДф^йгочн ека 1 :

rsrjw

экосистемы. К изучению первых двух аспектов привл< !чею.тй№Н№4ад8№мчно-

БИБЛИОТЕКА 1 3

С-Петер J ОЭ

исследовательских центров (Aprill et al., 1990; Juvonen et al., 2000; Giles et al., 2001), no поводу последнего практически нет данных литературы.

Наличие и степень микробной контаминации нефтешламов важны с позиций эволюции биоценозов в процессе многолетней аккумуляции специфического комплекса ксенобиотиков. Литература по нефтешламам затрагивает, как правило, микробиологические аспекты биоремедиации (Lazar et al., 1999; Giles et al., 2001; Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), но не собственно нефтешламов как концентрированного комплекса специфических загрязнителей. Вместе с тем, создание биотехнологии, направленной на детоксикацию и утилизацию нефтешлама, предполагает исследование микробиологического статуса этой антропогенной экосистемы, что и определило изучение закономерностей распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, особенностей их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания.

Выживание и функционирование живых организмов в условиях сложной комбинации экстремальных факторов - проблема общебиологического масштаба. Дискуссии по вопросам, связанным с гипометаболическим, анабиотическим, жизнеспособным-но-некультивируемым, "другим состоянием" микробных популяций и сообществ (Kaprelyants et al., 1993; Atlas, Bartha, 1997; Trevors, 1998; Головлев, 1998; Mascheretal., 2000) свидетельствуют о сложности данной проблемы. Её исследование включает закономерности адаптации микроорганизмов в условиях сложного комплекса экстремальных факторов нефтешлама: токсичности, гидрофобности и низкой биодоступности ксенобиотиков, высокого осмотического давления, сезонных колебаний температур.

Мировой опыт по переработке твердых отходов демонстрирует наибольшую

экономическую эффективность и экологическую безопасность применения

биотехнологий, однако известны лишь немногочисленные примеры экспериментального

и промышленного обезвреживания шламов с высоким содержанием нефтяных

углеводородов с помощью такого распространенного приема биоремедиации как

компостирование (O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu, 1998; Lazar et al., 1999;

Juvonen et al., 2000; Admonetal., 2001). При этом большинство работ сконцентрировано

на исследованиях химических аспектов ремедиации нефтесодержащих отходов (EI-

Nawawy et al., 1992; Prado-Jatar et al., 1993; O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu,

1998). В связи с ужесточением норм сброса в окружающую среду различных

экологически опасных химических отходов возникла

необходимость в процессе обезвреживания нефтесодержащих осадков, наряду с химическим мониторингом, осуществлять, токсикологические исследования (АргШ а1., 1990; .Зиуопеп е1а1., 2000) в сочетании с выявлением закономерностей формирования и функционирования микробных сообществ в условиях компостирования нефтзагрязненных шпамов (Уазис1е\/ап, [фагат, 2001; РеЬтаэг е1 а1., 2001).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - создать научную основу эффективной биотехнологии дегоксикации и утилизации сложного комплекса экологически опасных отходов нефтехимического предприятия. Были поставлены следующие задачи:

Охарактеризовать исходный нефтешлам по химическим, токсикологическим и микробиологическим показателям;

Выявить закономерности распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, а также оценить особенности их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания;

Оценить особенности метаболического потенциала микроорганизмов нефтешпама с позиции создаваемой биотехнологии;

Осуществить пплотно-полевое компостирование на базе производственного объединения "Нижнекамскнефтехим" и оценить эффективность компостирования путем мониторинга с использованием основных химических, токсикологических и микробиологических параметров;

Разработать рекомендации по практической реализации полномасштабной ремедиации нефтехимических отходов.

Научная новизна. Впервые дана характеристика химического состава, микробиологического статуса и токсикологических свойств твердых нефтехимических отходов. Выявлены закономерности пространственно-временного распределения основных физиолого-таксономических групп микроорганизмов в многотонной массе нефтехимических отходов с учетом принципиально важной доли их жизнеспособных форм. Новым является также аспект дифференцированной оценки стратегии адаптации различных физиологических групп микроорганизмов в условиях длительного воздействия комбинации экстремальных факторов. Предложена гипотеза эволюции микробного сообщества исследуемой антропогенной экосистемы.

Дана сравнительная характеристика контаминации нефтешламов с позиций численности и метаболической активности деструкторов основных устойчивых,

токсичных и мутагенных органических ксенобиотиков из би- и трициклоаренов, тиофенов, алканов.

Проведено разностороннее исследование токсических и генотоксических эффектов: острая и отдаленная токсичность в тестах на беспозвоночных, токсичность по отношению к бактериям, фитотоксичность, мутагенность в тесте Эймса. •

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы позволили практически реализовать в пилотно-полевых условиях (совместно с "Нижнекамскнефгехим") компостирование для обезвреживания и утилизации твердого отхода нефтехимических отходов производственного объединения "Нижнекамскнефтехим" на территории Биологических очистных сооружений и с привлечением материальной базы этого предприятия. Выявление высокой потенциальной метаболической активности микрофлоры нефтешлама позволило осуществить ремедиацию без интродукции бактериальных штаммов, что значительно удешевляет процесс. Применение испытанной технологии позволило уменьшить в среднем на 90% содержание нефтяных углеводородов, в том числе и полициклических ароматических углеводородов, с одновременной детоксикацией в отношении бактерий, одноклеточных организмов и растений. Создана система токсиколого-микробиологического и химического мониторинга, включающая тестирование различных физиолого-биохимических групп микроорганизмов и биологических активностей и изменение химического состава в процессе детоксикации и минерализации сложного комплекса промышленных отходов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на: V и VI международных конференциях "Environmental contaminaüon on central and eastem Europe" (Prague, 1999,2003); VII Международном симпозиуме In-Situ and On-Site Bioremediation (Орландо, США); V международной конференции "Environmental pollution - ICEP-2001", (Volgograd-Perm, 2001); V, VI и VII Пущинских конференциях молодых ученых "Биология - наука 21 века"(Пущино, 2001,2002,2003); II научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского гос. университета (Казань, 2001). Основные результаты диссертации обсуждены на ежегодных дискуссиях партнеров в рамках проекта Европейского сообщества "Copernicus-2" (Вагенинген, Голандия), 2002 (Флоренция, Италия), 2002 (Казань, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 11 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, изложение результатов исследований и их обсуждение, выводы и перечень цитируемой литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц и 33 рисунка. Цитируемая литература включает 211 источников, из них 182 иностранных.

уровне его влажности 60%*. Учет числа микроорганизмов-деструкторов индивидуальных ксенобиотиков в нефтешламе проводили с использованием метода серийных разведений шлама и плотных питательных сред на основе среды следующего состава (г/л дистиллированной воды): (NH4)2S04-1.0, MgS04*7H20 - 0.25, KH2P04 - 3.0, Na2HP04* 12Н20 - 4.5, дрожжевой экстракт - 0.05, агар 20.0, pH 7.0. В качестве источника углерода вносили один из ксенобиотиков: фенантрен, антрацен, флуорен, гексадекан (по 400 мг/л), дибензотиофен, бифенил (по 200 мг/л), октан и нафталин (в парах).

Методы химического анализа. Содержание аммонийного, нитратного, нитритного азота, фосфат-ионов определяли по (Лурье, 1984). Определение суммы органических веществ проводили по ГОСТ 26213-91. Летучие компоненты нефгешлама определяли по методу, описанному (Лурье, 1984). Хлороформ-экстрагируемые вещества (нефтяных углеводородов) оценивали гравиметрически и И K-спектроскопией после экстракции в аппарате Сокслета. Для определения мальтенов (гексан-расгворимые компоненты) и асфальтенов (гексан-нерасгворимые компоненты) хлороформный экстракт переэкстрагировали гексаном. Осадок асфальтено-смолистых соединений (гексан-нерастворимых) отделяли от мальтенов центрифугированием, промывали гексаном, и повторно центрифугировали, сушили и взвешивали. Определение ПАУ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографией на приборе серии LP с UV-VIS детектором, на колонке с обращенной фазой (5тм, 4.6 СС 250 мм, Ultracarb 50DS, Phenomenex, USA).

Токсикологические методы. Токсичность водного эксракга нефтешлама и компостов по отношению к микроорганизмам определяли в тесте со штаммом Pseudomonas putida по ISO 10712 (ISO, 1995), острой токсичности - в тесте с Paramecium caudatum (Selivanovskaya et al., 1997). Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса) осуществляли по методике Ильинской с соавторами (1995). Фитотоксичность нефтешлама (компостов) определяли на растениях из класса двудольных (редис Raphanus sativus radiculata) и однодольных (пшеница Triticum aestivum). Навеску нефтешлама или компоста шлама (5г) распределяли на чашке Петри, накрывали фильтровальной бумагой соответствующего диаметра, добавляли 5 мл стерильной водопроводной воды, раскладывали 10 семян одного из растений, заранее

♦культивирование на обводненном агаризованном нефтешламе разработано Галиевым P.A.

пророщенных, измеряли начальную длину корней, рассчитывали среднюю длину (L^). Через сутки измеряли длину корней, рассчитывали среднюю (LK0He4). Токсичность рассчитывали по формуле:

(Цсонеч ЦвчХзпыт

Т- - X 100%

Цсонеч^ контр

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика отхода нефтехимического производства 1.1. Химико-токсикологические свойства нефтешлама

В изучаемом нефтехимическом шламе 20-25% от органического вещества составляют компоненты нефти (табл. 1), что характерно для данной категории нефтесодержащих отходов (Bartha, Bossert, 1984; Castaldi, Ford, 1992). В составе нефтяных углеводородов преобладает фракция мальтенов, более чем в 10 раз меньше асфальтенов, кроме того, присутствуют продукты и полупродукты нефтехимического производства: бензолы, толуолы, ксилолы, сгиролы, часть из которых являются токсикантами и канцерогенами (McMichael, 1987; Styrene, 1983). Наличие таких продуктов является характерным именно для отходов нефтехимического синтеза (Castaldi, Ford, 1992; Якушева, Наумова, 1998).

К экологически опасным загрязнениям принадлежат многие характерные нефтяные компоненты шламов,в том числе nAy(Menzieetal., 1992). Концентрация 13 ПАУ (нафталина, ацетонафтилена, бифенила, флуорена, фенантре-на, антрацена, флуорантена, пирена, 1,2-бензофлуорантена, хризена, бензо(а)пирена, дибен-зо(х)антрацена) в нефтешламе НКНХ сравнима с таковой в отходах нефтепереработки (April! et al., 1990), которые характеризуются как токсичные и экологически опасные. Кроме того, в нефтешламе НКНХ содержится особо контролируемый бензо(а)пирен, который в России не нормируется для отходов, а для почвы его ПДК составляет 0.02 мг/кг(Санит. нормы..., 1988). Оценивая перспективы переработки и утилизации изучаемого шлама, с учетом приведенных норм и фактического содержания бензо(а)пирена (12-47 мг/кг), этот компонент следует контролировать особо в процессе предстоящей обработки.

С точки зрения последующей ремедиации отходов нефтехимической промышленности, его важной составляющей являются минеральные компоненты и их сбалансированность для развития и активной жизнедеятельности

микроорганизмов.

Таблица 1

Химико-токсикологическая характеристика нефтешлама НКНХ

Химические параметры Кон-ция

Органические вещества, г/кг 432-532

Углеводороды нефти, г/кг (гравиметрически) 102-149

Летучие углеводороды, г/кг 14-32

Мальтены, г/кг 95-139

Асфальтены, г/кг 6-10

Сумма 13 определенных ПАУ, г/кг 5-8

Азот

Аммонийный, МГ1Ч/КГ 49-245

Нитратный, мг1\1/кг 6-11

Нитритный, мгМ/кг 1-8

Общий фосфор, мгР/кг 1-2

Сульфиды, мгБ/кг 3-13

РН 7.8-8

Токсикологическая оценка

Токсичность по отношению к Ps. putida, % ингибирования роста -18-28

Острая токсичность на Р. caudatum, % смертности 58-74

Фитотоксичность нефтешлама, % ингибирования роста

корней:

Пшеница 95-100

Редис 96-100

Мутагенность на Salmonella typhimurium, кратность превышения

над контролем:

Вод. экстракт (с фракцией S9)

ТА98 9-10

ТА100 9-15

Органич. экстракт (с фракцией S9)

ТА98 6-7

ТА100 5-6

Согласно проведенным ранее исследованиям, оптимальные соотношения C:N и С:Р для биоремедиации нефтешлама составляли 60:1 и 800:1, соответственно (Dibble, Bartha, 1979). В исследуемом нами отходе эти отношения были 1800:1 и 31000:1 (табл. 1), соответственно, что свидетельствует о дефиците азота и особенно фосфора для жизнедеятельности микроорганизмов, что было учтено при переработке нефтешлама с применением биологической технологии.

Экологическая опасность нефтешламов подтверждена при анализе токсичности. Выявлено высокое негативное воздействие на простейшие и растения, а также

показана мутагенность водных и органических экстрактов шлама (тест Эймса), возрастающая в 2-3 раза в присутствии метаболической активации (фракции Б9) (табл. 1). Данные литературы по поводу токсического потенциала исходного нефтешлама отсутствуют, однако, ранее была обнаружена высокая токсичность и генотоксичность нефтешламо-загрязненных почв (АргШ й а1., 1990) и компостов Оиуопеп е1 а1.; 2000). Выявленный химический состав в сочетании с экотоксикологической оценкой шламов производственного объединения "Нижнекамскнефтехим" позволяет отнести их к экологически опасным отходам, которые требуют предварительного обезвреживания.

1.2. Микробиологический статус нефтешлама

Большинство известных работ посвящены ремедиации шламов нефтедобычи (Giles etal., 2001; Габбасова ссоавт., 2001) и нефтепереработки (Aprill etal., 1990; Rocha et al., 1997). В этих работах основной акцент делается на химико-токсикологических аспектах проблемы. Исключение составляют работы румынских (Petrisor et al., 2001) и индийских исследователей (Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), однако, и в них анализ микробного сообщества ограничивается аэробными гетеротрофами и нефте-деструкторами.

10 -

с 3

Й о

0) 5

7 -

0.2м 1м Зм 0.2м

А Б

Рис. 1. Общая количественная характеристика микрофлоры нефтешлама. 1 - общее содержание микробных клеток, 2 - количество жизнеспособных клеток, 3 -количество аэробных гетеротрофов. А, Б и В - участки шламонакопителя.

Стратегия же ремедиации нефтешлама зависит от совокупности представлений о количестве, физиологическом статусе и метаболической активности населяющих его микроорганизмов. Принимая во внимание многолетнюю историю депонирования побочных продуктов нефтехимии, мы предприняли экспериментальное бурение в трех репрезентативных участках изучаемого шламонакопителя (А, Б и В). Это позволило оценить толщину создавшегося депо шлама (в среднем около 3 м) и асептически отобрать пробы из его отдельных горизонтов.

Неожиданным и наиболее значимым оказался факт высокой микробной обсемененности толщи нефтешлама, хотя во всех случаях проявлялась тенденция к снижению показателей численности с глубиной залегания соответствующих горизонтов (рис. 1). Сточки зрения впервые проведенного нами исследования пространственного распределения и физиологического состояния микроорганизмов в многотонной массе нефтехимических отходов большой интерес представляет высокая доля жизнеспособных форм этих организмов (до 90%).

100 - ........

1 80-

§. 80-

о 70-

о 605

| 402 30л

2 20-Б 1001 2 3 5 7 11

Время, сут

Рис. 2. Последовательность появления колоний аэробных гетеротрофов (в процентах от максимального уровня) в зависимости от глубины горизонта

Наблюдение за динамикой роста гетеротрофов после посева проб нефтешлама (сразу же после их асептического извлечения из накопителя) выявило важную особенность большинства микроорганизмов, населяющих толщу нефтешлама, а именно, запаздывающее (на 5-7 суток) появление и медленный последующий рост их колоний на агаризованных средах (рис.2), что позволяет оценить состояние этих микроорганизмов как гипометаболическое. Об обратимости этого состояния, по крайней мере, у значительной части изоляюв, свидегельствуегто, что, будучи выделены из медленно растущих колоний, они ускоряли темпы роста после 2-3 пассажей на средах, способных поддерживать их рост.

О 0.2т ■ 1.0т 03.0т

С учетом изложенного, наиболее вероятным представляется следующий ход эволюции микробных сообществ нефтешлама. Микроорганизмы могли активно размножаться в верхнем горизонте после очередного сброса отходов, то есть в условиях высокой концентрации доступных компонентов нефтешлама, достаточной аэрации на границе раздела шлам-воздух и увлажнения за счет атмосферных осадков. В результате последующего наслоения очередных порций шламовых масс экологическая ситуация в погребенном под ними слое резко ухудшалась, прежде воего в отношении кислородного, водного, осмотического и температурного режимов. Поэтому микробный статус "зрелого" шлама определяется способностью микроорганизмов к длительному (в течение десятилетий) выживанию в его толще, в условиях сложного комплекса экстремальных факторов. Рассмотренные выше данные свидетельствуют о наличии такой способности у большого количества микроорганизмов, включая обитателей самого нижнего горизонта шлама, возраст которого оценивается в 35-40 лет. Помимо аэробных гетеротрофов, анализ нефтешлама выявил в его толще высокий уровень различных групп микроорганизмов, в том числе спорообразующих бактерий, актиномицетов и микромицетов (рис. 3).

я X я

Рис. 3. Распределение основных физиолого-таксономических групп бактерий по горизонтам.

Минеральный азот нефтешлама находится в основном в аммонийной форме, что свидетельствует о блокировании нитрификации на первом, аэробном этапе трансформации шламовых масс после их поступления в накопитель. Это, в свою очередь, означает невозможность реализации потенциала денитрификаторов, несмотря на сравнительно высокий уровень их адаптации в условиях нефтешлама (рисЗ).

Хотя бескислородные условия подповерхностных слоев благоприятны для сульфатредукции и данная группа бактерий представлена в нефтешламе (рис. 3), сульфидогенез невозможен и из-за низкого содержания сульфатов (на уровне 3-12 мг/кг), и из-за отсутствия условий для функционирования пищевой цепи (включающей

и аэробов, и анаэробных ацидо/ацетогенных бактерий), ответственной за регенерацию доступных органических субстратов. Последнее подтверждается характером жирных кислот (С5 - С16), обнаруженных в нефтешламе, а именно отсутствием низших гомологов этого ряда (Якушева с соавт., 2002). Таким образом, гипометаболическое состояние большей части микроорганизмов нефтешлама обусловлено неблагоприятными физическими факторами (гидрофобное окружение, аноксия), и/или отсутствием доступных питательных субстратов и альтернативных акцепторов электронов.

Сопоставимость величин КОЕ при посеве разведений проб нативного нефтешлама как на МПА, так и на агаризованный нефтешлам (рис. 4), свидетельствует о том, что многолетнее пребывание микроорганизмов в толще нефтехимических отходов не исключает возможности не только их выживания, но и сохранения разносторонней метаболической активности. Речь идет об утилизации как легкодоступных субстратов, так и специфических компонентов изучаемых отходов. ПАУ, входящие в состав тяжелой нефтяной фракции, в отличие от водорастворимых компонентов нефтехимических отходов, не подвергаются окислению в условиях биологической очистки сточных вод (Якушева, Наумова, 1998), и поэтому являются предметом особой озабоченности из-за устойчивости, мутагенности и канцерогенное™ многих из них (Мепг1е е1 а1., 1992). Проведенный в этой связи скриниг микроорганизмов-деструкторов выявил их высокую активность в отношении компонентов нефтешлама, как алканов, так и некоторых соединений из класса ПАУ.

п с 3

10 9 8 7 6 5 4 2 2 1 0

<0 с; Э

-е-

о X

5 С Л н

•е-

се I

о.

о >.

с; в

X X X

а> а) а>

е- ■з <В ■е- о

X <0 X 1 Р о

< €0 X Л) ю

о ■в-

Рис. 4. Распределение деструкторов нефтешлама и индивидуальных ксенобиотиков в различных слоях нефтешлама.

Наличие адекватного метаболического потенциала в сочетании с широкими адаптивными возможностями микроорганизмов, населяющих нефтешлам, означает отсутствие необходимости в дополнительной биоаугментации в условиях создаваемой нами технологии ремедиации отходов нефтехимии.

1.Биоремедиация нефтехимического шлама 2.1. Химический мониторинг компостирования

После завершения цикла исследований по установлению химико-токсикологического и микробиологического статуса нефтешлама объединения НКНХ был изучен и решен вопрос о моделировании биоремедиации этого отхода в опытно-полевых условиях.

Мониторинг химических показателей в процессе опытно полевого компостирования шлама НКНХ выявил период продолжительностью 4 месяца, в течение которого наблюдалась высокая скорость элиминации нефтяного загрязнения из компоста, в среднем на 70-80%. Наибольшая скорость деструкции нефтяных углеводородов, в том числе ПАУ, зафиксирована в контрольном варианте. Высокая скорость деградации загрязнений, по-видимому, является следствием исходно высокой обсемененности шлама, наличия в составе микробного сообщества высоко активной специализированной микрофлоры, а также внесения N и Р. Максимальная концентрация нефтесодержащих отходов в смесях, в отношении которой рядом авторов показана высокая эффективность применения компостирования, выявлена на уровне 10-15 % от общей массы компостируемой смеси (O'Reilly, Simpkin, 1997; Juvonen et al., 2000; Petrisor et al., 2001). В отличие от вышеприведенных примеров, изучаемый процесс эффективнее при исходном содержании шлама на уровне 30 %.

Таблица 2

Динамика токсико-химических показателей в процессе компостирования нефтехимического шлама

Варианты компостирования Контроль (К) Добавлено дизельное топливо (ДТ) Добавлен отход производства лапрола (ОПЛ)

Параметры Месяц

0 3 16 0 3 16 0 3 16

Углеводороды нефти, г/кг (гравиметрически) 54.7 34.0 22.3 54.7 36.5 24.5 54.7 27.0 12.3

Углеводороды нефти, г/кг (ИК-спектроскопически) 79.2 40.2 10.1 79.2 37.5 11.0 79.2 33.6 10.2

210 испыт. ПАУ, мг/кг 377.7 50.8 5.6 377.7 48.3 4.6 377.7 42,6 3.5

МН/, мгГ1/кг 200 35 17 200 125 22 200 32 8

М03-, мгГЧ/кг 11.0 7.3 20.1 11.0 6.8 18.5 11.0 46.8 8.0

N0/, мгН/кг 6 1.5 0.3 6 2.4 0.9 6 2.1 0.3

Биоремедиационный процесс можно разделить на две фазы: 1 -активную (интенсивную), для которой характерна высокая скорость разложения контаминирующих агентов, и 2 - пассивную (экстенсивную), для которой отмечена низкая скорость деградации остаточных, в основном труднодоступных, компонентов нефтяного загрязнения (Harmsen et al., 1997; Smith et al., 1997). При компостировании нефтехимического шлама НКНХ интенсивной фазе процесса соответствует период первых 4 мес, а экстенсивной - с 5 по 16 мес. Ряд авторов указывают на трудности деструкции остаточного нефтяного загрязнения, связанные с уменьшением подвижности органических соединений (Harmsen et al., 1994, Loehr, Webster, 1997).

2.2. Динамики микробиологических показателей в процессе компостирования

Комплексный анализ микробиологических параметров выявил повышение числа органотрофной части микробного сообщества (аэробные гетеротрофы и ПАУ-деструкторы (нафталин, фенантрен, антрацен)) в период интенсивной фазы ремедиации, что можно рассматривать как ответ микроорганизмов нефтешлама на улучшения условий обитания (рис. 5). В первую очередь это касается уменьшения концентрации нефтяных углеводородов за счет повышения степени аэрации и уменьшения влажности вследствие смешивания шлама с отработанным наполнителем биофильтра, дозировки азота и фосфора в компостируемые смеси. В пользу активизации микробного сообщества нефтешламовых компостов может говорить тот факт, что в первый месяц обработки резко снижается содержание аммонийного азота - наиболее доступной минеральной формы этого биогенного элемента. То обстоятельство, что в компосте происходит повышение содержания нитратов, в сочетании с отсутствием увеличения содержание нитритов, дает основание предполагать, что в условиях компостирования функционируют бактерии, ответственные за нитрификацию как первой, так и второй фазы.

и*

16 18 Бремя, мес

- ♦ - Аэробные гегеротрафы —■—Антрацен

—*—Фенантрен —К—Нафталин

—щ- Споробразующие бактерии - «•» - Актиномицеты —I—Микромицепы

Рис.5. Динамика численности различных групп микроорганизмов (усредненная для трех вариантов) в процессе компостирования нефтешлама НКНХ.

Изучение микробной сукцессии в процесое компостирования нефтеоодержащего отхода позволило выявить следующие закономерности.

В течение первого вегетационного сезона в первую очередь увеличивается численность микроорганизмов гетеротрофного блока бактерий, к которым принадлежат и деструкторы нефтяного загрязнения и его компонентов: нафталина, фенантрена, антрацена. Затем следует

Таблица 3

Динамика токсичности в процессе компостирования нефтешлама

Варианты Добавлено дизельное Добавлен отход производства

компостирования Контроль (К) топливо (ДТ) лапрола (ОПЛ)

Месяц

Паоаметоы 0 3 16 0 3 16 0 3 16

Токсичность по отношению к Р. риИба, % ингибиоования -20 -116 -5 -20 121 -8 -20 -60 -4

Острая токсичность на Р. саибаЫт, % смертности 15 33 0 15 19 0 15 20 0

Фитотоксичность, % ингибирования Пшеница 20 29 9 20 26 1 1 20 ?? 7

Редис 34 37 10 34 33 8 34 27 8

В период интенсивного разложения органических загрязнений (3 мес от начала испытаний) токсическое действие водного экстракта на одноклеточные и растения увеличивалось (табл. 3). Аналогичное повышение токсического потенциала обнаружено при ремедиации шламов нефтедобывающей (Aprill et al., 1990) и нефтеперерабатывающей промышленности (Juvonen et al., 2000). Повышение токсичности во время биоремедиации ПАУ-загрязненных почв может быть результатом неполной деградации загрязнений и формирования токсичных промежуточных метаболитов (Wang, Bartha, 1990; Phillips et al., 2000). Согласуется с данными литературы и временный характер повышения проявления токсичности (Juvonen et al., 2000).

Итоги компостирования нефтешлама подтверждают опыт других исследователей по детоксикации отходов с высокой исходной загрязненностью нефтяными компонентами, показывающий эффективность применения этого способа обработки сточки зрения токсикологических показателей (Juvonen et al., 2000). Однако, несмотря на отсутствие или резкое снижение негативного воздействия нефтешлама на различные группы живых организмов в конце испытаний (16 мес), в составе компостов сохраняются остаточные компоненты нефтяных углеводородов, в том числе принадлежащие к ПАУ, обладающие генотоксичносгью. В этой связи наиболее верным является подход комплексного мониторинга объектов, подвергающихся обезвреживанию, как было предложено при выявлении токсикологических аспектов биоремедиации нефтезагрязненных почв (Murphy et al., 2001). К аналогичным выводам

пришли исследователи, изучающие процесс ремедиации почв с высокой контаминацией ПАУ (Phillips et al., 2000).

Снижение токсичности и стабилизация микробного сообщества коррелируют с уменьшением содержания углеводородов нефти. Наличие в компосте загрязняющих веществ на фоне отсутствия токсичности свидетельствует о стабилизации остаточного загрязнения. В результате ремедиации произошло сокращение содержание нефтяных углеводородов, в том числе ПАУ, при этом выявлено снижение токсического действия на простейшие и растения. Комплексный анализ компостируемых смесей показал эффективность применения данного метода биоремедиации для обезвреживания нефтехимического шлама "Нижнекамскнефтехим", что позволило нам рекомендовать использование компостирования для полномасштабной биоремедиации твердого отхода нефтехимического промышленного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Высокое содержанием нефтяных (около 150 г/кг) и собственно нефтехимических (около 2 г/кг) компонентов в составе твердых отходов объединения "Нижнекамскнефтехим"обуславливает оструютоксичность по отношению к простейшим (летальный эффект до 78%), фитотоксичносгъ (ингибирование нефтешламом роста корней растений до 100%, водной вытяжкой до 59%) и мутагенность (кратность превышения числа ревертантов: водная вытяжка -до 15, органическая вытяжка-до

ъ-

2. Впервые выявлен факт высокой микробной обсемененности толщи нефтешлама (до 1010 клеток/г), на фоне тенденции к снижению показателей численности с глубиной залегания горизонтов шламонакопителя. Наиболее характерной особенностью физиологического статуса микроорганизмов в многолетней массе нефтехимических отходов является высокая доля жизнеспособных форм (до 90% от общего количества микробных клеток). Важной особенностью большинства микроорганизмов, населяющих толщу нефтешлама, является их гипометаболическое состояние.

3. Микробиологический скрининг культивируемой части микробного сообщества показал, что нефтешлам является источником метаболически активной и экстремотолернатной микрофлоры, в том числе деструкторов труднодоступных ксенобиотиков, осморезистентных, психро- и термотолерантных микроорганизмов. Наличие адекватного метаболического потенциала и разносторонней устойчивости у нефтешламовой микрофлоры исключает необходимость интродукции специальных микробных препаратов в процессе ремедиации нефтехимических отходов.

4. Создана коллекция из 20 метаболически активных бактериальных штаммов, способных метаболизировать нефтяные компоненты, в том числе полициклические ароматические углеводороды. Эти штаммы могут быть использованы и уже используются для интенсификации ремедиации объектов.

5. Сукцессия микробного сообщества в процессе компостирования нефтешлама характеризовалась увеличением органотрофной части микробиоценоза в первые месяцы компостирования, свидетельствующим о биодоступности, отражающем биоразлагаемосгь нефтяного загрязнения. Повышение числа актиномицетов (на 2 порядка) и стабилизация уровня органики на завершающем этапе созревания компосгов свидетельствует об исчерпании в компостируемых смесях субстратов, способных удовлетворять потребности копиотрофов в источниках органического питания. В результате ремедиации микробиоценоз компосгов нефтешлама приобрел свойства устойчивого сообщества на поздней стадии сукцессии.

6. Компостирование в пилотно-полевых условиях выявило его высокую эффективность для обезвреживания экологически опасных нефтехимических отходов. Об этом свидетельствует снижение суммарного уровня нефтяных углеводородов (на 70-80%, по данным гравиметрического метода, на 90% - с использованием ИК-спектроскопии), суммы 10 исследованных полициклических ароматических углеводородов - на 97%. Выявлено достоверное снижение негативного влияния компосгов нефтешлама на тест-объекты из числа простейших (с 15 до 0%) и растений (с 34 до 7%).

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность зав. лабораторией очистки сточных вод ОАО"Нижнекамскнефгехим"к.б.н. Якушевой О.И. и всему коллективу лаборатории за постоянное внимание, консультации, участие в проведении химических анализов, предоставление материально-технической базы для выполнения совместных опытно-полевых испытаний.

Автор искренне благодарит к.б.н. Наумова A.B. за участие в экспериментах по компостированию нефтешлама и к.х.н. Гарусова A.B. (НИЛ ЭББ КазГУ) за помощь в проведении качественного и количественного анализа нефтяных углеводородов.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Никитина Е.В.Г Якушева О.И., Зарипов С.А., Галиев Р.А., Гарусов А.В., Наумова Р.П. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтехимического производства // Микробиология. - 2003. -Т.73, N.5. (в печати).

2. Якушева О.И., Никитина Е.В.. Частухина И.Б., Зарипов С.А., Суворова Е.С., Наумова Р.П. Микрофлора нефтешлама отхода нефтехимического производства // Вестник татарстанского отделения Российской экологической академии. - 2001. - № 1-2. - Р.45-50.

3. Якушева О.И., Никонорова В.Н., Кияненко Г.В., Качалина О.В., Алиулова Р.А., Никитина Е.В.. Наумова Р.П. Особенности химического состава нефтешлама - отхода нефтехимического производства //VI Международная конференция по интенсификации нефтехимических процессов "Нефтехимия-2002". Нижнекамск, Россия. - 2002. - С. 271276.

4. Yakusheva O.I., Nikitina E.V.. Naumova R.P. Bioremediation and reuse of petrochemical sludge in JSC"Nizhnekamskneftekhim"// Papers from 7th International In-Situ and On-Site Bioremediation Symposium. - Florida, U.S.A. June 2-5, -2003, (presentation).

5. Зарипов C.A., Наумов А. В., Никитина E. В.. Наумова Р. П. Альтернативные пути начальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами. // Микробиология. -2002. -Т.71, №5. -С506-511.

6. Yakusheva O.I., Nikitina E.V.. Zaripov S. A., Naumov A.V., Suvorova E.S., Naumova R.P. Petrochemical waste sludge as a source of metabolically active and extremotolerant microorganisms. // 5th International symposium "Environmental contamination in Central and Eastern Europe "Czech Republic, Prague. -1999. - P. 147.

7. Yakusheva O.I., Nikitina E.V.. Naumova R.P. Microflora of petrochemical oily sludge as the future potential for bioremediation // в11 International symposium "Environmental contamination in Central and Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States" Czech Republic, Prague.-2003. (in press).

8. Никитина E.B.f Матвеева E.A., Халиуллина M.A., Якушева О.И., Наумова Р.П. Микробиология твердых отходов нефтехимической промышленности // Сборник тезисов конференции "Биология - наука XXI века", 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. -14-18 апреля 2003г. - С.286.

9. Никитина Е.В.. Якушева С., 1, Гарусов А.В., Наумова Р.П. Компостирование как способ обезвреживания отходов нефтехимического производства. //XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективныенаправления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов. Москва. -10-14 февраля, 2003.-С.57.

10. Никитина Е.В.. Матвеева Е.А., Галиев Р.А., Частухина И.Б., Якушева О.И., Наумова Р.П. Метаболическое разнообразие микроорганизмов-деструкторов нефтешлама//Сборник тезисов конференции "Биология - наука XXI века", 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых - 20-24 мая 2002г.- Т.З. - С.43.

11. YakushevaO.I. Kharisova EZ, ShurWino R A Gareev R.G., NikitinaEV.. Norina E. S., Naumova R.P. Bioremedalion of petrochemical waste sludge by using of vermicomposling //5thinten^1ionalccrTfererce"ErMrorireria Russia. -1 &-25 September, 2001.-P. 51.

12. Nikitina EV.. YakushevaO.I., Chastukhina I.B., Naumova R.P. Microorganisms of oil-contaminated waste as poterrtial xenobiolics deslructors // 5* conference of young scientist "Biology Isscience of 21th Centry, Puschino, Russia. -16-20 April2001, - P.266.

13. ГалухинВА.ЯкушеваО.И., Никонорова B.H., Гарифутдинова M.K.. Никитина ЕВ.. Наумова Р.П. Исследования покомпостированию депонированныхшламов ОАО "Нижнекамскнефтехим'7/VI Международная конференция по интенсификации нефтехимическихпроцессов "Нефтехимия-2002". Нижнекамск, Россия.- 2002. - С.276-277.

14. ЯкушеваО.И., ЗариповСА.. Никитина Е.В.. Частухина И.Б., Суворова Е.С., Наумова Р. П. Нефтешпам как источник микрооргашзмов-деструстаров ксеюбиогиков //Тезисы докладов международной конференции "Экология и жизнь -2000". - Великий Новгород, 2000.-С2.

'¿оо?-А

1?°77

»130 73

Отпечатано в ООО «СИРДХИ-СЕКЬЮРИТИ» Казань, ул. Журналистов, 1/16. Лицензия N¡0130 от 1.07.98 е. Подписано в печать 20.07.03. Усл.пл.1. Заказ Ыв 583. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 зкз. Бумага офсетная. Печать ризоарафия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитина, Елена Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Химико-токсикологический и микробиологический мониторинг

1.1 Особенности химического состава нефтешламов

1.1.1. Фракционный состав нефтяных углеводородов шламов

1.1.2. Компоненты, составляющие неорганическую часть шлама

1.2. Токсические эффекты нефтешламов и их компонентов

1.3. Стратегии выживания бактерий 18 1.3.1. Приспособленность микроорганизмов к стрессовым условиям

1.3.2. Ответ микробного консорциума на загрязнение

2. Методы биоремедиации нефтезагрязненных объектов

2.1. Компостирование как метод ремедиации загрязненных объектов

2.2. Ландфарминговая технология биоремедиации

3. Метаболизм полициклических ароматических углеводородов - труднодоступных компонентов нефтешлама

3.1. Особенности метаболизма ПАУ у бактерий и грибов 33 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4. Материалы и методы исследования

1. Отбор проб нефтешлама и компостов

2. Экспериментальное компостирование в полевых условиях 42 ® 3. Микробиологические методы анализа

4. Определение ферментативных активностей. 49 4.1 Активность внутриклеточных ферментов

5. Методы химического анализа

5.1 Анализ водной вытяжки

5.2 Анализ органорастворимых компонентов нефтешлама.

6. Токсикологические методы

7. Статистическая обработка результатов 52 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. Характеристика отхода нефтехимического производства

5.1. Химическая характеристика нефтешлама

5.1.1. Фракционный состав нефтяных компонентов нефтешлама

5.1.2. Анализ полициклических ароматических углеводородов

5.1.3. Водорастворимые компоненты нефтешлама

5.2. Токсикология нефтешлама

5.2.1. Изучение влияния водорастворимых компонентов 60 нефтешлама на бактерии и одноклеточные

5.2.2. Влияние компонентов нефтешлама на растения

5.2.3. Мутагенность компонентов нефтешлама

5.3. Микробиологический статус нефтешлама

5.3.1. Количественная характеристика основных групп микроорганизмов

5.3.2. Физиологическое состояние бактериального консорциума шлама

5.3.3. Стресс-устойчивые группы бактерий нефтешлама

5.3.4. Деструкторы ксенобиотиков в нефтешламе

5.3.5. Характеристика бактериальных изолятов -деструкторов индивидуальных ПАУ

5.3.6. Оценка возможности изолятов использовать нефтешлам и ПАУ как источник питания

5.3.7. Активность оксигеназ расщепления ароматического кольца

6. Биоремедиация нефтехимического шлама с использованием компостирования

6.1 Химический мониторинг компостирования

6.1.1 Эффективность обработки шлама в отношении органических загрязнителей

6.1.2 Изменение содержания водорастворимых компонентов в компостах

6.2 Динамики микробиологических показателей в процессе 92 компостирования

6.2.1. Закономерности изменений общего количества бактерий и специализированной микрофлоры

6.2.2. Изменение температуры в компостах

6.2.3. Динамические изменения различных физиолого-биохимических групп микроорганизмов и показателей биохимической активности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама-отхода нефтехимического производства"

Актуальность проблемы. Мировое сообщество движется в направлении повышения уровня урбанизации и роста промышленного производства, в связи с этим, одна из главных международных экологических проблем связана с наличием в объектах биосферы сложных комплексов экологически опасных ксенобиотиков, которые представляют угрозу для почвы, воздуха, водоемов, источников питьевой воды, здоровья людей.

Очистка окружающей среды от нефтяного загрязнения является одной из актуальных проблем в свете того, что углеводороды нефти являются преобладающими загрязнителями биосферы (70%) (Lazar et al., 1999). В нефтедобывающей, перерабатывающей и нефтехимической промышленных отраслях остро стоит проблема утилизации больших объемов нефтесодержащих отходов (Shailubhai, 1 984; Castaldi, Ford, 1991; Giles etal., 2001; Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001; Saikia et al., 2001). Это в полной мере относится к производственному объединению «Нижнекамскнефтехим» (НКНХ) (г.Нижнекамск, Россия), функционирование которого сопряжено с постоянным образованием твердых нефтесодержащих отходов. До недавнего времени в мировом масштабе наиболее распространенной была практика захоронения твердых опасных отходов на специализированных полигонах (Mueller et al., 1984; Holmboe, 1993; Saxena, Jotshi, 1997). Аналогично решалась эта проблема в НКНХ, где, начиная с 1965г, происходило накопление этих шламов в шламонакопителях. В настоящее время объемы скопившихся в этих специальных депо отходов достигают 1123 тыс м3. Существующие депо практически заполнены, а строительство новых противоречит экологическим критериям. В этих условиях возникла необходимость освобождения шламонакопителей и поиска путей обезвреживания и утилизации твердых нефтехимических отходов.

Нефтешламы содержат устойчивые и токсичные компоненты, в частности, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), алканы (Aprill et al., 1990; Rocha et al., 1997; Giles et al., 2001; Mishra et al., 2001), a также могут включать специфические продукты нефтехимического синтеза (Якушева с соавт., 2002). Часть нефтехимических составляющих являются токсикантами и канцерогенами (Styrene, 1983; McMichael, 1988). Химический состав шламов варьирует в зависимости от их происхождения, специфики применяемых на предприятиях технологий добычи, переработки и химического синтеза. Исходя из этого, в каждом конкретном случае необходимо создавать стратегию ремедиации с учетом биологических и абиотических особенностей, которые характеризуют исследуемую эконишу.

Научное обоснование стратегии ремедиации предполагает создание концепции химического, токсикологического и биологического статуса данной антропогенной экосистемы. К изучению первых двух аспектов привлечено внимание ряда научно-исследовательских центров (Aprill et al., 1990; Juvonen et al., 2000; Giles et al., 2001), по поводу последнего практически нет литературных данных.

Наличие и степень микробной контаминации нефтешламов важны с позиции эволюции биоценозов в процессе многолетней аккумуляции специфического комплекса ксенобиотиков. Литература по нефтешламам затрагивает, как правило, микробиологические аспекты биоремедиации (Lazar et al., 1999; Giles et al., 2001; Mishra et al., 2001; Vasudevan, Rajaram, 2001), но не собственно нефтешламов как концентрированного комплекса специфических загрязнителей. Вместе с тем, создание биотехнологии, направленной на детоксикацию и утилизацию нефтешлама, предполагает исследование микробиологического статуса этой антропогенной экосистемы, что и определило изучение закономерностей распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, особенностей их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания. Выживание и функционирование живых организмов в условиях сложной комбинации экстремальных факторов -проблема общебиологического масштаба. Непрекращающиеся дискуссии по вопросам, связанным с гипометаболическим, анабиотическим, жизнеспособным-но-некультивируемым, "другим состоянием" микробных популяций и сообществ (Atlas, Bartha, 1997; Trevors, 1998; Mascher et al., 2000) свидетельствуют о сложности данной проблемы. В круг этих проблем входят исследования закономерностей адаптации микроорганизмов в условиях сложного комплекса экстремальных факторов нефтешлама: токсичности, гидрофобности и низкой биодоступности ксенобиотиков, высокого осмотического давления, сезонных колебаний температуры.

Мировой опыт по переработке твердых отходов демонстрирует наибольшую экономическую эффективность и экологическую безопасность применения биотехнологий, однако известны лишь немногочисленные примеры обезвреживания шламов с высоким содержанием нефтяных углеводородов с помощью компостирования (O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu, 1998; Lazar et al., 1999; Juvonen et al., 2000; Admon et al., 2001). При этом, основная масса работ сконцентрирована на исследованиях химических аспектов ремедиации нефтесодержащих отходов (El-Nawawy et al., 1992; Prado-Jatar et al., 1993; O'Reilly, Simpkin, 1997; Kirchmann, Ewnetu, 1998). В связи с ужесточением норм сброса в окружающую среду различных экологически опасных химических отходов, возникла необходимость в процессе обезвреживания нефтесодержащих осадков, наряду с химическим мониторингом^ осуществлять^ токсикологические исследования (Aprill et al., 1990; Juvonen et al., 2000). В настоящее время практически не существует работ, направленных на изучение формирования и функционирования микробных сообществ в условиях компостирования нефтзагрязненных шламов (Vasudevan, Rajaram, 2001; Petrisor et al., 2001).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - создать научную основу эффективной биотехнологии детоксикации и утилизации сложного комплекса экологически опасных отходов нефтехимического предприятия. Были поставлены следующие задачи:

• Охарактеризовать исходный нефтешлам по химическим, токсикологическим и микробиологическим показателям;

• Выявить закономерности распределения ряда физиолого-таксономических групп микроорганизмов в промышленном накопителе нефтехимических отходов, а также оценить особенности их физиологического состояния с учетом специфики среды обитания;

• Оценить особенности метаболического потенциала микроорганизмов нефтешлама для создаваемой биотехнологии;

• Осуществить пилотно-полевое компостирование на базе производственного объединения «Нижнекамскнефтехим» и оценить эффективность компостирования путем мониторинга с использованием основных химических, токсикологических и микробиологических параметров;

• Разработать рекомендации по практической реализации полномасштабной ремедиации нефтехимических отходов.

Научная новизна. Впервые дана характеристика химического состава, токсикологических свойств и микробиологического статуса твердых нефтехимических отходов, с учетом вертикального распределения слоев в многолетней толще шламонакопителя. Новым является также аспект дифференцированной оценки стратегии адаптации различных физиологических групп микроорганизмов в условиях длительного воздействия комбинации экстремальных факторов. Выявлены закономерности пространственно-временного распространения основных физиолого-таксономических групп микроорганизмов в многотонной массе нефтехимических отходов, при этом принципиально важна высокая доля их жизнеспособных форм. Выдвинута гипотеза эволюции микробного сообщества исследуемой антропогенной экосистемы.

Показаны особенности адаптации микроорганизмов в условиях многолетнего воздействия сложного комплекса экстремальных физико-химических специфических факторов в процессе аккумуляции специфических комплексов ксенобиотиков. Проведена сравнительная характеристика контаминации нефтешламов с позиций численности и метаболической активности деструкторов основных устойчивых, токсичных и мутагенных органических ксенобиотиков из би- и трициклоаренов, тиофенов, алканов. Изучены степень биодоступности как индивидуальных поллютантов, входящих в состав шлама, так и сложного комплекса загрязнения собственно нефтехимических отходов для детоксикации и минерализации.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы позволили практически реализовать (совместно с «Нижнекамскнефтехим») компостирование для обезвреживания и утилизации твердого отхода нефтехимических отходов «Нижнекамскнефтехим» в пилотно-полевых условиях на территории Биологических очистных сооружений и с привлечением материальной базы Лаборатории ^очистки сточных вод этого предприятия. Оценка микробиологических параметров исходного нефтешлама выявила высокую потенциальную метаболическую активность микрофлоры нефтешлама. Это позволило осуществить ремедиацию без интродукции бактериальных штаммов. Применение испытанной технологии позволило уменьшить в среднем на 90% содержания нефтяных углеводородов, полициклических ароматических углеводородов, с одновременной элиминацией токсического действия компонентов компостов на одноклеточные и растения. Создана система токсико-микробиологического мониторинга, включающая тестирование различных физиолого-биохимических групп микроорганизмов и биологических активностей, и химического мониторинга в процессе детоксикации и минерализации изучаемых комплексов. Дано обобщение результатов исследования в виде концепции биодеградации комплекса экологически опасных ксенобиотиков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Никитина, Елена Владимировна

выводы

1. Высокое содержанием нефтяных (около 150 г/кг) и собственно нефтехимических (около 2 г/кг) компонентов в составе твердых отходов объединения «Нижнекамскнефтехим» обуславливает острую токсичность по отношению к простейшим (летальный эффект до 78%), фитотоксичность (ингибирование нефтешламом роста корней растений до 100%, водной вытяжкой до 59%) и мутагенность (кратность превышения числа ревертантов: водная вытяжка - до 15, органическая вытяжка - до 7).

2. Впервые выявлен факт высокой микробной обсемененности толщи нефтешлама (до Ю10 клеток/г), на фоне тенденции к снижению показателей численности с глубиной залегания горизонтов шламонакопителя. Наиболее характерной особенностью физиологического статуса микроорганизмов в многолетней массе нефтехимических отходов является высокая доля жизнеспособных форм (до 90% от общего количества микробных клеток). Важной особенностью большинства микроорганизмов, населяющих толщу нефтешлама, является их гипометаболическое состояние.

3. Микробиологический скрининг культивируемой части микробного сообщества показал, что нефтешлам является источником метаболически активной и экстремотолерантной микрофлоры, в том числе деструкторов труднодоступных ксенобиотиков, осморезистентных, психро- и термотолерантных микроорганизмов. Наличие адекватного метаболического потенциала и разносторонней устойчивости у нефтешламовой микрофлоры исключает необходимость интродукции специальных микробных препаратов в процессе ремедиации нефтехимических отходов.

5. Сукцессия микробного сообщества в процессе компостирования нефтешлама характеризовалась увеличением органотрофной части микробиоценоза в первые месяцы компостирования, свидетельствующим о биодоступности, отражающем биоразлагаемость нефтяного загрязнения. Повышение числа актиномицетов (на 2 порядка) и стабилизация уровня органики на завершающем этапе созревания компостов свидетельствует об исчерпании в компостируемых смесях субстратов, способных удовлетворять потребности копиотрофов в источниках органического питания. В результате ремедиации микробиоценоз компостов нефтешлама приобрел свойства устойчивого сообщества на поздней стадии сукцессии.

6. Компостирование в пилотно-полевых условиях выявило его высокую эффективность для обезвреживания экологически опасных нефтехимических отходов. Об этом свидетельствует снижение суммарного уровня нефтяных углеводородов (на 70-80%, по данным гравиметрического метода, на 90% - с использованием ИК-спектроскопии), суммы 10 исследованных полициклических ароматических углеводородов - на 97%. Выявлено достоверное снижение негативного влияния компостов нефтешлама на тест-объекты из числа простейших (с 15 до 0%) и растений (с 34 до 7%).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Елена Владимировна, Казань

1. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. Изд-во: МГУ. 1961.

2. Балашова Н.В. Деградация фенантрена и нафталина бактериями родов Pseudomonas и Burkholderia. (Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук, специальность-03.00.04). Пущино, - 2000. - 112с.

3. Габбасов И.М., Сулейманов P.P., Хазиев Ф.Х., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Фердман В.М., Ханисламова Г.М. Рекультивация серой лесной почвы, загрязненной нефтяным шламом // Экологическая и промышленная безопасность. 2001. - № 7. - С.81-84.

4. Гайсин И.А., Гилязов М.Ю. Загрязнение почв предприятиями нефтяной промышленности //В кн. Зеленая книга республики Татарстан. Казань: Изд-во КГУ, 1993. - С.278-281.

5. Головлёв Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы // Микробиология.-1999.-Т.68.-С.623-631.

6. Головлёв Е.Л. Другое состояние неспорообразующих бактерий // Микробиология. 1998. - Т.67. - С.601-609.

7. Головлёв Е.Л. Экологическая стратегия бактерий: специфика проблемы // Микробиология. 2001. - Т.70, N.4. С.437-443.

8. ГОСТ 26213-91. Почвы. Методы определения органического вещества. // М. Изд-во стандартов. 1992.

9. ГОСТ Р 17.4.3.07-2001. Требования к свойствам осадков сточных вод при использовании их в качестве удобрений /'/' М. Изд-во стандартов. 2001.

10. Ю.Зарипов С. А. Начальные этапы микробного метаболизма 2,4,6-тринитротолуола. (Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук 03.00.07-микробиология). - Казань, - 2002. - 109с.

11. И.Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. // Изд-во: МГУ. 1991.

12. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М.:ГЕОС, 2001. -256с.

13. П.Звягинцева И. С., Поглазова М. Н., Готоева М. Т., Беляев С.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями // Микробиология. 2001. - Т.70. № 6. - С.759-764.

14. М.Зенова Г.М., Грачева Т.А., Манучарова Н.А., Звягинцев Д.Г. Атиномицетные сообществ алесных экосистем // Почвоведение. 1996. -№11.- С. 1347-1351.

15. Ильинская О.Н., Иванченко О.Б., Карамова Н.С. Определение генотоксичности веществ в краткосрочных тест-системах. Методическое руководство // Изд-во: КГУ, Казань. 1995. - 22с.

16. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. -БашкГУ.,1994. -С. 172.

17. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе // Изд-во: МГУ. Москва. 1989.

18. Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы // Изд-во: Выш. школа. Минск. 1981.- 176с.

19. Критерии определения класса опасности отходов и порядок их отнесения к классу опасности для окружающей среды. Госкомитет РФ по охране окружающей среды. // Проект документа, Изд-во: М., 2000.

20. Куличевская И.С., Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Беляев С.С. Окисление углеводородов нефти экстремально галофильными архебактериями //Микробиология. 1991. Т.60. № 5. С. 860 866.

21. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, - 1990. - 352с.

22. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. Изд-во: Химия. Москва. 1984. - 447с.

23. Методы таксономического анализа // Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Звягинцева Д. Г. М.: Изд-во МГУ. 1991. С. 131-133.

24. Мишустин Е.Н. Развитие учения о ценозах почвенных микроорганизмов // Успехи Микробиологии. 1982. Т.17. С. 117-134.

25. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дуда М.В., Митюшина Л.А., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образованиепокоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997. - Т.66, №1. - С.42-49.

26. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, - 1970. - 366с.

27. Санитарные нормы допустимых концентраций химических веществ в почве САН П и II 42-128-4433-87 // Минздрав. СССР, Изд-во: М., 1988.

28. Филонов А.Е., Карпов А.В., Пунтус И.Ф., Акименко В.К., Воронин A.M. Микробная деградация фенантрена и нафталина в почвенных модельных системах. // INTAS « Microb. Ecol. Biotechnol. Reflect. Extremophil.» Москва, 26-30 сент., 1997. - С.30.

29. Якушева О.И., Наумова Р.П. Биотехнология очистки сточных вод нефтехимического комплекса // В сб. Био- и медицинские проблемы окружающей среды Республики Татарстан. Под ред. Гордона JT.X., Бойко В.А., Казань: Экоцентр. 1998. - Т.1. - С.168-188.

30. Admon S., Green М., Avnimelech Y. Biodegradation kinetics of hydrocarbons in soil during land treatment of oily sludge // Bioremediation J. 2001. - V.5, N.3. -P.193-209.

31. Ahn Y., Sanseverino J., Sayler G.S. Analyses of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from contaminated soils // Biodegradation. 1999. -V.10. - P.149-157.

32. Alexander M. How toxic are toxic chemicals in soil? // Environ. Sci. Technol. -1995. V.29. - P.2713-2717.

33. Almeida J.S., Leung K.T., MacNaughton S.J., Flemminf C.A., Wimpec M.H., Pavis G.A., White D.C. Mapping change in soil microbial community composition signaling bioremediation // Bioremediation J. 1998. - V.l, N.3. - P.255-264.

34. Amellal N., Portal J.-M., Vogel T. Berthelin J. Distribution and location of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and РАН-degrading bacteria within polluted soil aggregates // Biodegradation. 2001. - V.12. - P.49-57.

35. American Petroleum Institute. Manual on disposal of refinery wastes. // Am. Petr. Inst., Washington, D.C.

36. Andersson E., Henrysson T. Bioremediation of РАН-contaminated soils using white-rot fungi // In-Situ and On-Site Bioremed. 1997. - V.2. - P.535.

37. Aprill W., Sims R.C., Sims J.L., Matthews J.E. Assessing detoxification and degradation of wood preserving and petroleum wastes in contaminated soil // Waste Manag. Research. 1990. - V.8. - P.45-65.

38. Arana I., Muela A., Iriberry J., Egea L., Barcina I. Role of hydrogene peroxide in loss of culturability mediated by visible light in Escherichia coli in a Freshwater system//Appl. Environ. Microbiol.-1992.-V.58.-P.3903-3907.

39. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective // Microbiol. Review. 1984 V.45. N.l. - P. 198-209.

40. Atlas R.M., Horowitz A., Krichevsky A., Bej A.K. Response of microbial population to environmental disturbance // Microbiol. Ecol. 1991. - V.22. -P.249-256.

41. Atlas, R.M., Bartha, R. Microbial ecology: fundamentals and applications. Cummings. Sei. Publ. California. 1997. - 343p.

42. Barron M.G., Podrabsky Т., Ogle S., Ricker R.W. Are aromatic hydrocarbons the primary determinant of petroleum toxicity to aquatic organisms? // Aquatic Toxicol. 1999. - V.46. - P.253-268.

43. Bartha R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation // Microb. Ecology. 1986. - V.12. - P.155-172.

44. Bartha R., Bossert I. The treatment and disposal of petroleum waste // In: Atlas R.M. (ed.), Petroleum microbiology. Macmillian, New York. 1984. - P.553-577.

45. Bastiaens L., Springae L.D., Wattiau P., Harms H., DeWachter R., Verachtert H., Diels L. Isolation of adherent polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)- degrading bacteria using PAH-sorbing carriers // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66. -P.1834-1843.

46. Benka-Coker M.O., Ekundayo J.A. Applicability of evaluating the ability of microbes isolated from an oil spill site to degrade oil // Environ. Monitor. Assessment. 1996. - V.45. - P.259-272.

47. Bispo A., Jourdain M.J., Jauzein M. Toxicity and genotoxicity of industrial soils polluted by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) // Organic Geochemistry. -1999. V.20. -P.947-952.

48. Bogardt A.H., Hemmingsen B.B. Enumeration of phenanthrene-degrading bacteria by an overlayer technique and its use in evaluation of petroleum-contaminated sites // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V.58, N.8. - P.2579-2582.

49. Boldrin, В., Tiehm A., Fritzsche C. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene, andpyreneby a Mycobacterium sp. Appl. // Environ. Microbiol. -1993. -V.59. P.1927-1930.

50. Boonchan S ., Вritz M .L., S tanley G .A. Degradation and mineralization о f high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66, N.3. - P.1007-1019.

51. Bossert I., Bartha R. The fate of petroleum in soil ecosystems // In: Petroleum Microbiology. Ed. R. Atlas. New York, U.S.A.: Macmillan Pub. Co. 1986a. - P. 435-474.

52. Bossert I.D., Bartha R. Structure-biodegradability relationships of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1986b. - V.37. -P.490-495.

53. Burback, B.L., Perry J.J. Biodegradation and biotransformation of groundwater pollutant mixtures by Mycobacterium vaccae //Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V.59. - P.1025-1029.

54. Caldini G., Cenci G., Manenti R., Morozzi G. The ability of an environmental isolate of pseudomonas fluorescence to utilize chrysene and other fourOringpolynuclear aromatic hydrocarbons // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V.44, N.l-2. - P.225-229.

55. Castaldi F.J., Ford D.L. Slurry bioremediation of petrochemical waste sludge // Wat. Sci. Tech. 1991. V.25. P.207-212.

56. Cavalca L., Colombo M., Larcher S., Gigliotti C., Collina E., Andreoni V. Survival • and naphthalene-degrading activity of Rhodococcus sp. strain 1BN in soilmicrocosms // J. Appl. Microbiol. 2002. - V.92. - P. 1058-1065.

57. Cegniglia С. E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Biodegradation. 1992. - V.3. - P.351-368.

58. Churchill S.A., Harper J.P., Churchill P.F. Isolation and characterization of a Mycobacterium species capable of degrading three- and four-ring aromatic and aliphatic hydrocarbons // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V.65, N.2. - P.549-552.

59. Cioffi R., Costanzo S., Maffucci L., Santoro T. Adsorption of the organic fraction of a tannery sludge by means of organophilic bentonite. // Environ. Technol. 2001. V.22. N.l. P.83-89.

60. Concawe // Sludge farming: a technique for disposal of oil refinery waste. Report 3/80. Den Haag, the Netherlands. 1980.

61. Delille D., Delille В., Pelletier E. Effectiveness of bioremediation of crude oil contaminated subantarctic intertidal sediment: the microbial response // Microb. Ecol. 2002. - V.44, N.2. P.l 18-126.

62. Denome SA, Stanley DC, Olson ES, Young KD. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene in Pseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolic pathway // J Bacterid. 1993. - V.175, N.21. - P.6890-6901.

63. Dibble J.T., Bartha R. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil sludge. // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - V.37, N.4. - P.729-739.

64. Dries J., Smets B.F. Transformation and mineralization of benzoa.pyrene by microbial cultures enriched on mixtures of three- and four-ring polycyclic aromatic hydrocarbons // J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.28. P.70 -73

65. Dukan S., Levi Y., Tonati D. Recovery of culturability of an HOCI-stressed population of Escherichia coli after incubation in phosphate buffer: resuscitation or regrowth? // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V.63. - P. 4204-4209.

66. Ehrlichmann H. Entwicklung eines Konzepts zur Bewertung des wassrig extrahierbaren genotoxischen Potetials kontaminierter Boden m it optimierten und miniturierten prokariontischen Testverfahren // Copyright Shaker Vergal. Aahen. Germany. 1999. 234p.

67. E1-Nawawy A.S., El-Bagouri I.H., Abdal M., Khalafai M.S. Biodegradation of oily sludge in Kuwait soil // W. J. Microbiol. Biotechnol. 1992. - V.8, N.6. - P.618-620.

68. Faulkner B.C., Lochmiller R.L. Ecotoxicity revealed i n p arasite communities о f Sigmodon hispidus in terrestrial environments comtaminated with petrochemicals // Environ. Polutt. 2000. V.110. P.135-145.

69. Federal register. Hazardous waste management system; standards applicable to owners and operators of hazardous waste treatment, storage, and disposal facilities; and EPA administered permit programs // 1982. V.47, N.143. - P.32324.

70. Ferris J. P., MacDonald L.H., Patrie M.A., Martin M.A. Aryl hydrocarbon hydroxylase activity in the fungus Cunninghamella bainieri: evidence for the presence of cytochrome P-450 // Arch. Biochem. Biophys. 1976. - V.175, N.2. - P. 443-552.

71. Foght J.M., Fedorak P.M., Westlake D.W.S. Mineralization of l4C-hexadecane and l4C-phenanthrene in crude oil: specificity among bacterial isolates // Can. J. Microbiol. 1989. - V.36. - P.169-175.

72. Foote C.S. Definition of type 1 and type 2 photosensitized oxidation. // Photochem. Photobiol. 1991. - V.54. - P.659-664.

73. Ford Т.Е. Response of marine microbial сommunities tо anthropogenic stress // Aqua. Ecosystem Stress Recov. 2000. - V.7. - P.75-89.

74. Fredrickson J.K., Brockman F.J., Workman D.J., Li S.W. Stevens Т.О. Isolation and characterization of a subsurface bacterium capable of growth on toluene, naphthalene, and other aromatic compounds // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V.57. P.796-803.

75. Fuller M.E., Manning J.F. Evidence for differential effects of 2,4,6-trinitrotoluene and other munitions compounds on specific subpopulation of soil microbial communities // Environ. Tox. Chem. 1998. - V 17. P.2185-2195.

76. Garcia C., Hermandez T. Effects of bromacil and sewage sludge addition on soil enzymatic activity// Soil Sci. Plant Nutr. 1995. - V.42, N.l. - P. 191-195.

77. Garcia-Valdes E., Cozar E., Rotger R., Lalucat J., Ursing J. New naphthalene-degrading marine Pseudomonas strains // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V.54. - P.2478-2485.

78. Geiselbrecht A.D., Hedlund B.P., Tichi M.A., Staley J.T. Isolation of marine polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading Cycloclasticus strains from the Gulf of Mexico and comparison of their PAH degradation ability with that of Puget

79. Sound Cycloclasticus strains // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64, N.12. - P. 4703-4710.

80. Geiselbrecht A.D., Herwig R.P., Deming J.W., Staley J.T. Enumeration and phylogenetic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading marine bacteria from Puget Sound sediment // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62.• P.3344-3349.

81. Gibson, D. I., and V. Subrahamanian. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons // In D. T. Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Mercel Dekker, Inc., New York, N.Y. 1984. P. 181-252.

82. Giles W.R., Kriel K.D., Stewart J.R. Characterization and bioremediation of a weathered oil sludge // Environ. Geosciences. 2001. - V.8, N.2. - P.l 10-122.

83. Goettems E.M., Simon Z., Baldasso M.L., Ferreira E.S. Sitel: a successful petrochemical wastewarter treatment system // Wat. Sci. Tech. V.20. - P. 141-162.

84. Goldberg D.R., Yuill T.M., Burgess E.C. Mortality from duck plaque virus in

85. Ш immunosuppressed adultmallard ducks // J. Wildl. Dis. 1990. - V.26. - P.299-306.

86. Govindaswami M., Feldhake D. J., Kinkle B.K., Mindell D.P., Loper J.C. Phylogenetic comparison of two polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading Mycobacteria//Appl. Environ. Micobiol. 1995. - V.61, N.9 - P.3221-3226.

87. Goyal A.K., Zylstra G.J. Molecular cloning of novel genes for polycyclic aromatic hydrocarbon degradation from Comamonas testosteroni GZ39 // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62. - P.230-236.

88. Grifoll M., Casellas M., Bayona J.M., Solanas A.M. Isolation and characterization of a fluorene-degrading bacterium identification of ring oxidation and ring fission products // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - V.58. - P.2910-2917.

89. Gu Y., Mazolla M., Impact of carbon starvation on stress resistance, suvival in soil habitats and biocontrol ability of Pseudomonas putida strain 2C8. // Soil Biology and Biochemistry. -2001. -V.33. P. 1155-1162.

90. Guzev I.S., Levin S.V., Seletski G.I., Babieva E.N., Zviagintsev D.G. // In Microorganisms and protection of soils. Ed. Zviagintsev D.G. Moscow State University Press, Moscow, Russia. 1989. - P. 129-150.

91. Harmsen J., Ferdinandy M. Measured bioavailability as a tool managing clean-up and risks on landfarming // In: 5th International In Situ and On Site Bioremediation Symposium. San Diego, California, April 19-22. 1999. - V.2 - P.57-62.

92. Haworth S., Lawlor Т., Mortelmans K., Speck W., Zeiger E. Salmonella mutagenicity test results for 250 chemicals /7 Environ. Mutagen. 1983. - V.5, N.l.- P.141-142.

93. Hedlund B.P., Geiselbrecht A.D., Bair T.J., Staley J.T. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a new marine bacterium, Neptunomonas naphthavorans gen. nov., sp. nov. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V.65, N.l.- P.251-259.

94. Holmboe B. SWIS the Danish solid waste information system - a statistical tool to collection and progress data on solid waste and recyclable materials. // Adv.

95. Recov. Recycl.: Concepts and Technol.: Collec. Pap. ReC'93 Int. Recycl. Congr., Geneva. 1993. - V.l. - С 234-235.

96. Huddlestone R.L., Creswell L.W. The disposal of oily wastes by landfarming. // In Proc. of the Management of Petroleum Refinery Wastewaters Forum, Tulsa, OK. Am. Petroleum Inst. 1976.

97. Hughes T.J., Claxton L.D., Brooks L., Warren S., Brenner R., Kremer F. Genotoxicity of bioremediated soils from the Reilly Tar site, St. Louise Park, Minnesota // Environ. Health Perspect. 1998. - V.106, N.6. - P. 1427-1433.

98. Hund K., Traunspueger W. Ecotox-evaluation strategy for soil bioremediation exemplified for a РАН-contaminated site // Chemosphere. 1994. - V.29, N.2. -P.371-390.

99. IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans: Polynuclear Aromatic Hydrocarbons. WHO, Lyon, France. 1983. - V.32.

100. ISO 10712. Water quality Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test). - 1995.

101. Jonsen A.R., Winding A., Karlson U., Roslev P. Linking of microorganisms to phenanthrene metabolism in soil by analysis of 13C-labeled cell lipids // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V.68, N.12. - P.6106-6113.

102. Jorgensen F., Nybroe O., Knechel S. Effects of starvation and osmotic stress on viability and heat resistance of Pseudomonas fluorescens Al 19 // J. Appl. Bacterid. 1994.-V.77.-P.340-347.

103. Juhasz A., Britz M., Stanley G. Degradation of benzo(a)pyrene, dibenz(a,h)anthracene and coronene by Burkholderia cepacia II Water Sci. and Tech. 1998,-V.10,-P.45-51.

104. Juhasz A., Stanley G., Britz M. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbon by Stenotrophomonas maltophilia strain VUN 10,003 // Lett. Appl. Microbiol. 2000. - V.30. - P.396-401.

105. Juvonen R., Martikainen E., Schultz E., Joutti A., Ahtianen J., Lehtokari M. A battery of toxicity tests as indicators of decontamination in composting oily waste // Ecotoxicol. Environ. Safety. 2000. - V.47. - P. 156-166.

106. Kanaly R., Bartha R., Fogel S., Findlay M. Biodegradation of 14C.benzo[a]pyrene added in crude oil to uncontaminated soil // Appl. Environ. Microbiol. 1997.-V.63,N.11.-P.4511-4515.

107. Kaprelyants A.S., Gottscal J.C., Kell D.B. Dormancy in non-sporulating bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V.140. - P.271-286.

108. Kastner M., Breuer-Jammali M., Mahro B. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize aromatic polycyclic hydrocarbons // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V.41. -P.267-273.

109. Kell D.B., Kaprelyants A.S., Weichart D.H., Harwood C.R., Barer M.R. Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues // Ant. van Leeuwennquec. 1998. - V.73. - P. 169-187.

110. Kiehlmann E., Pinto L., Moore M. The transformation of chrysene to trans-\,2-dihydroxy-l,2-dihydrochrysene by filamentous fungi // Can. J. Microbiol. 1996. -V.42. - P.604-608.

111. Kincannon D.F., Lin Y.S. Microbial degradation of hazardous wastes by land treatment // Proc. Ind. Waste Conf. 1985. V.40. - P. 607-619.

112. Krishnamurthi K., Devi F., Chakrabarti T. Genotoxic effects of PAH containing sludge extracts in Chinese hamster ovary cell cultures // Biomed. Environ. Sci. -2003. V.16, N.l. - P.68-82.

113. Kirchmann H., Ewnetu W. Biodegradation of perroleum-based oil wastes through composting//Biodegradation. 1998. - V.9, N2. - P. 151-156.

114. Kiyohara H., Nagao K., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbon о n agar plates //Appl Environ Microbiol. 1982. -V.43.N.2. -454-457.

115. Kogure, K., U. Simidu, N. Taga. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria // Can. J. Microbiol. 1979. - V.25. - P.415^420.

116. Korda A., Santas P., Tenente A., Santas R. Petroleum hydrocarbon bioremediation: sampling and analytical techniques, in situ treatments and commercial microorganisms currently used // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.48. - P.677-686.

117. Kragelund L., Nibroe O. Culturability and expression of outer membrane proteins during carbon, nitrogen, or phosphorus starvation of Pseudomonas putida DF14 // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60. - P.2944-2948.

118. Langworthy D.E., Stapleton R.D., Sayler G.S., Findlay R.H. Genotypic and phenotypic responses of a riverine microbial community to polycyclic aromatic hydrocarbon contamination // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - P.3422-3428.

119. Launen L., Pinto L., Wiebe C., Kiehlmann E., Moore M. The oxidation of pyrene and benzoa.pyrene by nonbasidiomycete soil fungi // Can. J. Microbiol. 1995. -V.41. - P.477-488.

120. Laurie A.D., Lloyd-Jones J. The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism //J. Bacterid. 1999. V.181, N.2. P.531-40.

121. Lawlor K., Sublette K., Duncan K., Levetin E., Buck P. et al. Long-term effects of crude oil contamination and bioremediation in a soil ecosystem // Bioremediation J.- 1997. V.l, N.l. - P.41-51.

122. Lazar I., Dobrota S., Voicu A., Stefanescu m., Sandulescu L., Petrisor I.G. Microbial degradation of waste hydrocarbons of oily sludge from some Romanian Oil Fields//J. Petrol. Sci. Engineering. 1999. - V.22. -P.151-160.

123. Lenhard G. Bestimmung der vertugbaren Pflanzennahrstoffe durch Ermittlung der Degidrogenoseaaktivitat des Bodens // Ztschr. Pflanz. Dung. Bodenk. 1962. -V.99, N.2-3. - P.182-190.

124. Li С.-Т., W.-J. Lee, H.-H. Mi., С.-С. Su. РАН emission from the incineration of waste oily sludge and PE plastic mixtures // Sci. Total Environ. 1995. - V.170. -P.171-183.

125. Loehr R.C., Webster M.T. Behavior of fresh vs. Aged chemicals in soil // J. Soil Contamination. 1996. - V.5. - P.361-383.

126. Loehr R.C., Webster M.T. Change in toxicity and mobility resulting frombioremediation processes // Bioremediation J. 1997. - V.l, N.2. - P. 149-163.

127. Londry K., Suflita J. Use of nitrate to control sulfide generation by sulfate -reducing bacteria associated with oily waste // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.22. № 6. P.582-589.

128. MacNaughton S.J., Stephen J.R., Venosa A.D., Davis G.A., Chang Y.J., White D.C. M icrobial p opulation сhanges during bioremediation о f an experimental oil spill // Appl Environ Microbiol. 1999. - V.65, N.8. - P.3566-3574.

129. Maliszewska-Kordybach В., Smreczak B. Deshydrogenases activity in soils andt thheavy metals. // In: Proceeding of 17 International Symposium on Polycyclic

130. Aromatic Compounds, 25-29 October, 1999. Bordeaux, France. P.212.

131. Manual of methods for general bacteriology // Ed. P. Gerhardt et al. American Society for Microbiology. Washington, DC. 1984.

132. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Monitoring of bioremediation by soil biological activities // Chemosphere. 2000. - V.40. - P.339-346.

133. Marks R.E., Field S.D., Wojtanowicz A.K., Britenbeckn G.A. Biological treatment of petrochemical wastes for removal of hazardous polynuclear aromatic hydrocarbon constituents // Wat. Sci. Tech. 1992. - V. 25, N. 3. - P.213-220.

134. Menn F.-M., Applegate B.M., Sayler G.S. NAH plasmid-mediated catabolism of anthracene and phenanthrene to naphtoic acids // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59. - P.1938-1942.

135. Menzie C.A., Potocki B.B., Santodonato J. Exposure to carcinogenic PAHs in the environment. // Environ. Sci. Technol. 1992. V. 26. P. 1278-1284.

136. Meulenberg R., Draaisma R.B., de Ridder E.M.E.J., Rijnaarts H.H.M. Sequentialanthracene degradation by Bjerkandera BOS55 and bacteria // In-Sity and On-Site Bioremed. 1997. - V.2. - P.487.

137. Mishra S., Jyot J., Kuhad R. C., Lai B. In Situ Bioremediation Potential of an Oily Sludge-Degrading Bacterial Consortium // Curr. Microbiol. 2001. - V. 43. -P.328-335.

138. Molina M., Aranjo R., Hodson R.E. Cross-induction of pyrene and phenanthrene in a Mycobacterium sp. isolated from polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated river sediments // Can. J. of Microbiol. 1999. - V.45, N.6. - P.520-529.

139. Mueller U., Kassner W., Kuhlhoff D., Loll U., Otte-Witte R. Neudefmition der Ф Deponierfahigkeit von Klarschlammen. // Korrespond. Adwasser. 1984. - V.31,11. -P.928-933.

140. Mueller, J.G., Chapman P.J., Blattmann B.O., Pritchard P.H. Isolation and characterization of a fluoranthrene-utilizing strain of Pseudomonas paucimobilis П Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V.56. - P. 1079-1086.

141. Murphy S., Charrois J., McGill W. Toxicity testing of weathered biotreatment petroleum hydrocarbon-contaminated soils // In: The 6 International In Situ and On-Site Bioremediation Symposium. San Diego, California, USA. June 4-7. 2001.- V.4. P.7-16.

142. Murray K., Williams P.A. Role catechol and methyl catechol as inducers of aromatic metabolism in Pseudomonas putida II J. Bacterid. 1974. - V.l 17. -P. 1153-1 157.

143. Nyman J.A. Effect of crude oil and chemical additives ob metabolic activity of mixed microbial populations in fresh marsh soils // Microb. Ecol. 1999. - V.37. -P.157-162.

144. Parales R.E., Lee K., Resnick S.M., Jiang H., Lessner D.J., Gibson D.T. Substrate specificity of naphthalene dioxygenase: effect of specific amino acids at the active site of the enzyme // J. Bacteriol. 2000. - V.l 82, N.6. - P. 1641-1649.

145. Pfortner P., Weller MG., Niessner R. Immunological method for the detection of nitroaromatic residues covalently bound to humic acids // Prescnius J Anal Chem. -1998. V.360. - P.192-198.

146. Phillips T.M., Liu D., Seech A.G., Lee H., Trevors J.T. Monitoring bioremediation in creosote-contaminated soils using chemical analysis and toxicity tests //J. Indust. Microbiol. Bioteclmol. 2000. - V.24. - P. 132-139.

147. Picado A., Nogueira A., Baeta-Hall L., Mendonca E., Rodrigues F.M., Saagua M.C., Martins A., Anselmo A.M. Landfarming i n a РАН-contaminated soil//J.

148. Environ. Sci. Health. -2001,- V.36,N.9. P. 1579-1588.

149. Poche L.R., Derby R.E., Wagner D.R. Solvent extraction of refinery wastes rates EPA BDAT // Oil Gas J. 1991. - V.7, N.l. - P.73-77.

150. Pope D.F., Matthews J.E. Bioremediation using the land treatment concept. // USEPA/600/R-93/164. Robert S. Kerr Environ. Res. Lab., U.S. Environ. Protection Agency. 1993.

151. Prado-Jatar M., Correa M., Rodriguez-Grau J., Carneiro M. Oil sludge landfarming biodegradation experiment conducted at a tropical site in eastern Venezuela//Was. Manag. Resech. 1993. - V.ll. - P.97-106.

152. Propst T.L., Lochmiller R.L., Quails C.W., McBee K. In situ (mesocosm) assessment of immunotoxicity risks to small mammals inhabiting petrochemical waste sites // Chemosphere. 1999. - V.38, N5. - P.1049-1067.

153. RCRA Information on Hazardous waste for Public owned treatment works, United States Environmental Protection Agency. September 1985.

154. Rocke Т.Е., Yuill T.M., Hinsdill R.D. Oil and related toxicant effects on mallard immune defenses // Environ. Res. 1984. - V.33. - P.343-352.

155. Rosazza J. P., Smith R. V. Microbial models for drug metabolism // Adv. Appl. Microbiol. 1979. - V.25. - P. 169-208.

156. Roszak D.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol. Rev. 1987. - V.51. - P. 367-379.

157. Saagua M.C., Baeta-Hall L., Anselmo A.M. Microbiologiucal characterization of • a coke oven contaminated site and evaluation of its potential for bioremediation //

158. W. J. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.18. - P.841-845.

159. Saikia N.J., Segupta P., Gogoi P.K., Borthakur P.C. Physico-chemical and cementitious properties of sludge from oil field effluent treatment plant // Cement Concrete Research. 2001. - V.31. - P. 1221 -1225.

160. Sakai M., Yoshida P., Mizusaki S. Mutagenicity of polycyclic aromatic hydrocarbons and quinines on Salmonella typhimurium TA97 // Mutation Research. 1985. - T.156. - P.61-67.

161. Sandvik S, Lode A, Pedersen ТА. Biodegradation of oily sludge in Norwegian Щ soils // Appl. Microbiol. 1986. - V.23. - P.297-301.

162. Saxena S.C., Jotshi C.K. Management and combustion of hazardous wastes. // Prog. Energy Combust. Sci. 1996. - V.22. - P.401-425.

163. Symons B.D., Sims R.C. Assessing detoxification of a complex hazardous waste, using the Microtox™ bioassay // Arch. Environ. Contam. Toxocol. 1988. - V.l7. -P.497-505.

164. Tedesco M., Ligo M., Gianello C., Simon Z. Effect of petrochemical activated sludge on soil properties // Wat. Sci. Tech. 1989. - V.20. - P.63-74.

165. Thompson R.A., Shcroder G.D., Connor Т.Н. Chromosomal aberrations in the cotton rat, Sigmodon hispidus, exposed to hazardous waste // Environ. Molec. Mutagen. 1988. - V. 11. - P.359-367.

166. Trevors J.T. Bacterial biodiversity in soil with an emphasis on chemically-contaminated soils // Water Air Soil Pollution. 1998. - V.101. P.45-67.

167. Vasudevan N, Rajaram P. Bioremediation of oil sludge-contamination soil // Environ. Internat. 2001. - V.26. 409-411.

168. Verrhiest G.J., Clement В., Volat В., Montuelle В., Perrodin Y. Interactions between a polycyclic hydrocarbon mixture and the microbial communities in a natural freshwater sediment // Chemosphere. 2002. - V. 46. - P. 187-196.

169. Walter U., Beyer M., Klein J., Rehm H.J. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1II Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V.34. - P.671-676.

170. Wang X., Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicity in soil contaminated by fuel spills // Soil Biol. Biochem. 1990. - V.22. - P.501-505.

171. Weissenfels W.D., Beyer M., Klein J. Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by pure bacterial cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. -V.32. - P.479-484.

172. Weldon R.A. Oil waste biooxidation in soil. // In 86th Nat. Meeting, Am. Inst, of chem. Eng., Houston-1979.

173. Wernersson A.-S., Dave G. Phototoxicity identification by solid phase extraction and photoindused toxicity to Daphnia magna. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. -1997. V.32. - P.268-273.

174. West P.A., Okpokwasih G.C., Brayton P.R., Grimes D.J., Colwell R.R. Numerical taxonomy of phenanthrene-degrading bacteria isolated from the Chesapeake Bay// Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V.48. - P.988-993.

175. Whitesides M.D., Oliver J.D. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V.63.- P.1002-1005.

176. Williams R.T., Ziegenfuss P.S., Sisk W.E. Composting of explosives and propellant contaminated soils under thermophilic and mesophilic conditions // J. Industr. Microbiol. 1992. - V.9. - 137-144.

177. Wilstrom P., Wiklund, A. Andersson A.C., Forsman M. DNA recovery and PCR quantification of catechol 2,3-dioxygenase genes from different soil types // Biotechnol. 1996. - V.52. - P. 107-120.

178. Wunder Т., Marr J., Kremer S., Sterner О., Anke H. 1-Methyoxy-pyrene and 1,6-dimethoxypyrene: two novel metabolites in fungal metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons // Arch. Microbiol. 1997. - V.167. - P.310-316.

179. Yamamoto H., Hashimoto Y., Ezaki T. Study of nonculturable Legionella pneumophila cells during multiplenutrient starvation // FEMS Microbiol. Ecol. -1996. V.20. - P.155-162.

180. Zitrides T. G. Bioremediation comes of age // Pollution Engineering. 1990.-V.22. - P.57-62.

Информация о работе

Никитина, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Казань, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Токсиколого-микробиологические аспекты биоремедиации нефтешлама-отхода нефтехимического производства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы