Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретические и практические аспекты процесса конденсации формальдегида в углеводы и использования конденсата в процессах микробного синтеза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Теоретические и практические аспекты процесса конденсации формальдегида в углеводы и использования конденсата в процессах микробного синтеза"

I (а правах рукописи

РГ6 од

3 и Ш 1958

МЕДВЕДЕВА Надежда Григорьевна

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОЦЕССА КОНДЕНСАЦИИ ФОРМАЛЬДЕГИДА В УГЛЕВОДЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОНДЕНСАТА В ПРОЦЕССАХ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Санкт-Петербург 199В

Работа выполнена б Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (Техническом университете) и Санкг-Пегербургском Научно-исследовательском центре экологической безопасности РАК.

Научный консультант:

доктор технических паук, профессор

Сухаревич Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор технических наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР

доктор технических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Джиндояк Лев Семенович Кривова Анна Юрьевна

Ведущая организация:

АООТ Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (Санкт-Петербург)

Защита состоится

¥

апреля 1998 года в

а

часов на

заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047 Москва, Миусская пл, д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в НИЦ РХТУ им. Д.И.Менделеева Автореферат разослан " " марта 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.И.Гусева

л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное», темы.

Управление ростом и физиологической активностью микроорганизмов язляется важной проблемой в биотехнологии. Одним из направлений решения этом проблемы иалиется использование для этой цели различного рода стимуляторов. Применение таких веществ позволяет без дополнительных затрат сырья, практически без изменения технологии значительно увеличивать выход целевых продуктов, степень потребления компонентов среды, что улучшает экономические показатели процесса, и, что не менее важно, снижает степень загрязнения стоков микробиологических производств.

В качестве стимуляторов используют самые различные индивидуальные вещества (аминокислоты, витамины, нуклеотиды, антибиотики, поверхностно-активные вещества и др.) и сложные смеси веществ (различные экстракты и гидролизаты растительного и животного происхождения, отходы промышленности, сельского хозяйства и др.).

Стимуляторы, используемые в биотехнологии, должны отвечать определенным требованиям, основными из которых являются: отсутствие токсичности, высокая эффективность действия, известный и стандартный состав, доступность, сравнительно низкая стоимость, стабильность при хранении. Высокие требования существенно ограничивают число используемых стимуляторов и обусловливают необходимость поиска и создания новых.

Важным вопросом в проблеме поиска и применения стимуляторов является выяснение механизмов их действия, что позволяет определить уровень специфичности действия, расширяет представления о защитных клеточных реакциях в ответ на воздействие этого фактора, позволяет прогнозировать развитие и скорость адаптации к нему, во многом определяет перспективу их использования.

В наших более ранних исследованиях было показано, что эффективным стимулятором ряда микробиологических процессов являются продукты конденсации формальдегида. Учитывая простоту способа получения конденсата, доступность сырья, невысокую стоимость, стабильность состава и биологической активности он может быть отнесен к числу перспективных биостимуляторов. Однако многие

вопросы этой проблемы, интересно» н научном и практическом аспектах оставались нерешенными, а по некоторым из них высказаны лиш предположения той или иной степени достоверности. Прежде всего эт< касается вопросов: какое вещество (или группа веществ), входящие I состав конденсата, определяют его биологическую активность; каковь пути направленной регуляции синтеза этих биологически-активны: веществ, каковы спектр и механизмы их действия на биологически, объекты различного уровня организации и др.

Целью настоящей работы является разработка теоретических осно! направленного синтеза биологически активных веществ в процесс! конденсации формальдегида и разработка технологического процесс; получения стимулятора с заданными свойствами; определение характер; и механизма действия конденсата на морфолого-культуральные 1 физиолого-биохимичекие признаки микроорганизмов, перспективны: направлений использования его в биотехнологии.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

• изучить основной качественно-количественный состщ конденсатов, получаемых в различных условиях;

• определить природу активного начала, ответственного з; биологическую активность конденсатов формальдегида;

• разработать лабораторный регламент для получения конденсато! формальдегида с повышенным содержанием веществ, обусловливающие их биологическую активность;

• определить спектр действия конденсата на биологичеки< объекты, различающиеся по уровню организации: бактерш (грамположительные и грамотрицательные), микромицеты, высши( базидиальные грибы, растения;

• выявить возможные механизмы стимулирующего ит ингибирующего действия конденсата в зависимости от доз действия I чувствительности объектов-реципиентов;

• изучить эффективность стимулирующего действия конденсата I процессах биосинтеза ценных метаболитов: антибиотиков, аминокислот ферментов, а также биомассы высших базидиальиых грибов < использованием промышленных продуцентов;

• определить другие возможные области применения продукте; конденсации формальдегида.

Научная новизна.

• Впервые показано, что разветзленные углеводы, в том числе 2-С-гидроксимст1ипрно1а, 2-С-гидроксиметилтетроза. 2-С-гидроксн-метнлпентоза и 2-С-гидроксиметилгексоза являются биологически активными соединениями. Биологическая активность конденсатов формальдегида обусловлена наличием в их составе разветвленных углеводов Са-Ст.

• Исследовано влияние на синтез биологически активных разветвленных углеводов основных физико-химических параметров процесса - температуры, концентраций формальдегида и катализатора, природы и концентрации сокатализатора и растворителя. Установлено, что природа органического сокатализатора и растворителя оказывают существенное влияние на состав продуктов конденсации. Определены условия конденсации формальдегида, позволяющие получать смеси с преимущественным содержанием разветвленных углеводов. Впервые в составе конденсатов формальдегида идентифицированы 5 разветвленных углеводов и 2 дезоксисоединения. При исследовании механизма начальной стадии конденсации формальдегида показано, что реакция самоконденсации формальдегида не является инициирующей стадией автокатализа. Для начала конденсации необходимо присутствие в реакционной смеси небольших количеств ацетальдегида или других органических сокатализаторов.

• Впервые проведено комплексное исследование характера и эффективности действия конденсата формальдегида на рост, некоторые физиологические процессы и морфолого-культуральные признаки микроорганизмов - как прокариот, так и эукариот. Показано, что в соответствии с правилом Арнт-Шульца конденсат может быть отнесен к биорегуляторам, характер действия которого - стимуляция или ингибирование - определяется его концентрацией.

• Впервые установлено, что основным механизмом как стимулирующего, так и ингибирующего действия регулятора (независимо от уровня организации тест-объекта) является изменение под его влиянием структурной организации цитоплазматической мембраны, а именно: повышение ее текучести' вследствие увеличения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах.

• Впервые выявлено свойство конденсата формальдегида регулировать процесс пеллетообразования у мицелиальных организмов -

стрсптомицетоа и грибов при глубинном способе их культивирования, присутствии конденсата уменьшается размер пеллет, увеличиваете степень дисперсности мицелия. Показано, что одним из возможны механизмов такого воздействия являются изменения в структуре составе клеточной поверхности культур, возникающие под действие конденсата.

• Обнаружено свойство конденсата формальдегида воздействоват на морфолого-культуральные признаки микроорганизмов. Впервы показано, что одной из неспецифических реакций микромицетов н воздействие конденсата является усиленный синтез им полисахаридов.

Практическая значимость.

Разработан способ и научно-техническая документация дл получения стандартных смесей продуктов конденсации формальдегида преимущественным содержанием биологически активных компонентов разветвленных углеводов. Наработана опытная партия препарата проведены его испытания.

С использованием в качестве стимулятора конденсат; формальдегида разработаны способы интенсификации процессо! биосинтеза аминокислот лизина (а.с. 1112780), валина (а.с. 1549071) пролина, триптофана, гистидина; антибиотиков тилозина (а.с. 1554390) имбрицина; протеи нал фибринолитического действия; протосубтилина биомассы высших базидиальных грибов, дрожжей (а.с. 1194874 промышленными продуцентами. Включение конденсата в со ста] ферментационных сред позволяет на 15-37%, в зависимости от процесса повысить выход целевого продукта, сократить удельный расход сырья I продолжительность процессов.

Показано, что в присутствии конденсата формальдегид; повышается эффективность выделения антибиотика имбрицина и: биомассы, что может быть использовано для интенсификации выделени? его в промышленных условиях.

Показана возможность использования конденсата формальдегида для регуляции сукцессионных изменений в микробных популяциях компостов при получении органических удобрений. Конденсат вносимый в соломистые компосты в концентрации 0,1% (по РВ)

позволяет сократить продолжительность созревания компосто». направленно влиять на их микробные сообщества.

Исследуемый в работе биорегулятор может быть использован и в другой области - в сельском хозяйстве, например, для повышения морозоустойчивости пшеницы (а.с. 12692980). а также для разработки способов очистки от формальдегида сточных вод некоторых химических производств.

Место проведения работы.

Работа выполнялась на кафедре технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского технологического института (зав. кафедрой д.т.н., проф. Яковлев В.И.), в лаборатории моносахаридов Пражского химико-технологического института (зав. лабораторией д.х.н., проф. И.Яры) и в Санкт-Петербургском научно-исследовательском центре экологической безопасности РАН (директор д.эк.н. Донченко В.К.). Инициатором исследований в этой области является д.х.н.. проф. кафедры органической химии СПбТИ Глибин E.H. Отдельные фрагменты исследований выполнены совместно с сотрудниками ВНИТИАФ (Санкт-Петербург), НИГИА (Ереван), НИИ пищевой промышленности (Санкт-Петербург), Технологического института пищевой промышленности (Москва), ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург).

Апробация работы н публикации.

Результаты исследований были представлены на Научно-практической конференции "Научно-техническое сотрудничество отраслевых НИИ и Вузов" (Ленинград, 1980), VII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Пущино, 1982), Всесоюзной конференции "Контроль и управление биотехнологическими процессами" (Горький, 1985), VII съезде микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), Всесоюзной конференции "Перспективы получения новых лекарственных препаратов с помощью биотехнологии" (Москва, 1985), VIII Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Москва, 1987), VII съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989), V и VII European symposium on carbohydrates (Praqua. 1989; Cracow, 1993), VI Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, ¡996).

л

По теме диссертации опубликована 3! работа, в том числе I монография, получено 6 авторских свидетельств на изобретения.

Объем н структура работы.

Диссертация состоит из введения, семи глав (обзора литературы, методов исследований, пяти глав по результатам экспериментальной работы), выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 229 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и фотографиями, 26 таблицами. Список литературы включает 323 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Химический синтез углеводов из формальдегида и их использование живыми организмами (обзор литературы)

В обзоре обобщены известные данные, касающиеся условий, механизма и кинетики процесса конденсации формальдегида, качественно-количественного состава продуктов реакции, проведен их критический анализ. Обобщены и проанализированы известные данные по воздействию конденсатов на живые организмы. Обоснована необходимость углубленных исследований по направленному синтезу биологически активных веществ в процессе конденсации формальдегида, уточнению его качественно-количественного состава с целью разработки технологического процесса получения высокоактивного регулятора, определения степени и механизмов его воздействия на живые организмы, определения возможных областей использования в биотехнологии.

2. Объекты и методы исследования

Конденсацию формальдегида проводили в водной среде при перемешивании и термостатировании. В качестве катализатора использовали гидроокись кальция, сокатализатора - гликолевый альдегид или продукты конденсации формальдегида. Окончание реакции устанавливали потенциометрически по редокс-потенциалу системы. В

процессе iî по окончании реакции в реакционно)) смеси определяли содержание формальдегида сульфитным методом (ГОСТ 1625-89Е) и методом жидкостной хроматографии (хроматограф Перкин-Элмер-601). органических кислот - алкалиметрически, редуцирующих веществ -эбулиостатнческим методом. По окончании реакции катализатор осаждали насыщенным раствором щавелевой кислоты или углекислым газом. Содержание ионов кальция определяли комплексонометрнческим методом. Оптимизацию условии конденсации формальдегида проводили с использованием симплексного метода планирования. Анализ продуктов конденсации проводили методами бумажной, тонкослойной, газожидкостной хроматографии (хроматографы Хром-4! и Variai) areograph series 2100) и методом хромато-масс-сиектрометрии (LKB-9000). Фракционирование продуктов конденсации формальдегида проводили на катионите Ostión LG-KC 0804.

В микробиологических исследованиях применяли общепринятые среды, методики и оборудование. Культивирование микроорганизмов -продуцентов биологичеки активных веществ (БАВ) проводили в условиях, разработанных для каждого конкретного процесса. Общепринятые методы использовали для анализа аминокислот (тонкослойная хроматография), лимонной кислоты (спектрофото-метрический метод), Сахаров (метод Сомоджи-Нельсона), белка (метод Лоури), тилозина (метод биологического титрования), имбрицина (спектрофотометрический метод и биологический - метод диффузии в агар), фибринолнтической активности (метод Аструпа-Мюллертца). общей дегидрогеназной активности (с 2,3,5-ТТХ) и активности ключевых ферментов биосинтеза лизина.

Выделение липидов из биомассы проводили экстракцией диэтиловым эфиром после предварительного гидролиза клеток. Общее количество липидов определяли весовым методом, жирнокислотный состав - методом газо жидкостной хроматографии (хроматограф Хром-41).

Об изменении уровня проницаемости микробных клеток судили по появлению в среде клеточных метаболитов, поглощающих в УФ-свете (200-300 нм), и ионов калия. Определение интенсивности автолиза микробных клеток проводили турбидометрическим методом и определением количества КОЕ при рассеве клеточных суспензий на плотные среды. Морфологию продуцентов изучали с использованием

!ü

просвечивающей и сканирующей электронной микроекопш (микроскопы JEM-1000 и JSM-35C). Экспериментальные даиньч обрабатывали статистическими методами.

3. Разработка технологии получения конденсата формальдегида - высокоактивного регулятора микробиологических процессов

Как было показано нами ранее, конденсат формальдегида являете» стимулятором ряда микробиологических процессов. При изучении этогс свойства конденсата формальдегида, представляющего собой сложнук многокомпонентную смесь, возникают вопросы, касающиеся егс качественно-количественного состава, природы веществ, определяющи? его биологическую активность, наличия соединений, обладающие ингибкрующнм действием и тем самым снижающих уровеш положительного эффекта, а также возможности путем регуляции условш конденсации получать смеси продуктов с преимущественные содержанием того или иного компонента и др. В настоящей работе былг предприняты углубленные исследования в этом направлении.

3.!. Качественно-количественный состав конденсатов формальдегида

Ранее с использованием различных хроматографических методов, а также хромато-масс-спектромеггрического анализа нами было показано, что смеси синтетических углеводов, получаемые из формальдегида е присутствии окиси кальция, состоят из большого числа моносахаридов л полиолов: дезокси-, линейных и разветвленных (табл. 1), структура некоторых из них была определена предположительно (пики 8, 11, 12, 15, 19, 23, 28, 29, 32, 33, 38). Новые данные, полученные на основании сравнения масс-спектров и времен удерживания (проверено по индивидуальным веществам) позволили уточнить их структуру. В конденсатах нами впервые идентифицированы 2 дезоксисоединения (пики 11, 12) и 5 разветвленных углеводов (пики 8, 19, 28, 29, 32). При этом разветвленные углеводы составляют от 48,2% до 83,4% всех углеводов в зависимости от условий конденсации (раздел 3.4., табл. 3).

Таблица 1

Качественный состав восстановленной смеси синтетических углеводов

№ пика Полиол

1 Этилснгликоль

3 Эритро-бутантриол - 1,2,3

4 Трео-бутантриол - 1,2,3

5 Глицерол

7 Бутантриол - 1,2,4

8 2 - С - Гидроксиметилглицерол

9 Эритритол

10 Треитол

11 2 - Дезоксирибитол

12 3 - Дезоксииентитол

14 Рамнитол

15 2 - С - Гидроксиметилтетритол *

17 Рибитол

18 Арабинитол

19 2 - С - Гидроксиметил тетритол

20 Ксилитол

23 Разветвленный пентитол *

24 Аллитол

25 Маннитол + таллитол

26 Идитол

27 Глюцитол

28 2 - С - Гидроксиметилпентитол

29 3 - С - Гидроксиметилпентитол

30 Галактитол

32 2 - С - Гидроксиметилгекситол

33 2,3 - С - Дигидроксиметилпентитол *

34 Линейный гептитол

35 Волемитол

36 Линейный гептитол

38 Гидроксиметилгекситол *

* предполагаемая структура

3.2. Определение биологической активности компонентов конденсата формальдегида

Для предварительного решения вопроса о том, какие вещества, входящие в состав конденсата формальдегида, определяют уровень его биологической активности, изучено влияние на рост и биосинтез лизина культурой Brevibaclerium Jlcnum E-S31 четырех фракций конденсата, полученных разделением на катионите Ostión LG-K.S 0804.

Нами показано, что стимулирующей активностью обладают только 2 фракции, содержащие линейные и разветвленные углеводы от тетроз до гептоз и составляющие большую часть конденсата - около 80%. Результаты по влиянию на процесс биосинтеза лизина отдельных компонентов биологически-активных фракций (в том числе разветвленных углеводов 2-С-гидроксимегилтриозы, 2-С-гидрокси-метилтетрозы, 2-С-гидроксиметилпентозы и 2-С-гидроксиметилгексозы, полученных методами химического синтеза) и конденсата в целом представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние конденсата формальдегида и отдельных его компонентов на биосинтез лизина и биомассы культурой В./1а\ит Е-531

Добавляемый компонент Биомасса, % к контролю Лизин, % к контролю

Контроль 100 100

Конденсат формальдегида 95 11Х

Эритроза 100 100

2-С-гидроксиметилтриоза 96 119

Ксилоза 100 100

Арабиноза 100 97

2-С-пщроксиметилтетроза 93 120

Глюкоза 100 100

Сорбоза 98 106

Манноза 98 105

2-С-гидроксиметилпентоза 92 120

Галактогептулоза 100 103

2-С-гидрокси метилгексоза 91 121

Рамноза 100 100

!)

Конденсат формальдегида вносили в питательную среду в количестве 0,05% (по Г'В), концентрации отдельных его компонентов рассчитывали с учетом их количественного содержания в конденсате.

Из представленных результатов видно, что именно разветвленные углеводы определяют биологическую активность конденсат;! формальдегида. Следует отметить, что во всех случаях увеличение выхода лизина на 18-21% сопровождается некоторым снижением прироста биомассы продуцента. Следовательно, стимулирующий эффект, наблюдаемый при использовании как конденсата формальдегида в целом, так и входящих в его состав разветвленных углеводов, выражается в повышении продуктивности единицы биомассы продуцента.

Следующей задачей работы было определение условии конденсации, позволяющих получать конденсаты формальдегида с преобладающим содержанием в них биологически активных компонентов - разветвленных углеводов.

3.3. Оптимизация условий конденсации формальдегида

Стадией автокаталитической реакции конденсации формальдегида в углеводы, определяющей продолжительность процесса, является начальная стадия, механизм которой в настоящее время остается дискуссионным.

При исследовании механизма начальной стадии конденсации формальдегида использовали формальдегид, полученный растворением твердого или сублимированного параформальдегида в воде.

Результаты показали, что конденсация формальдегида в углеводы происходит только при его получении растворением параформальдегида в воде. Индукционный период (стадия 1) при этом составляет 17-20 мин (рис. 1. а). В течение указанного периода, по мнению ряда авторов, происходит димеризация формальдегида в гликолевый альдегид, после чего реакция приобретает автокаталитических характер. По окончании реакции содержание редуцирующих веществ в смеси составляет 45-51% при полной конверсии формальдегида.

I 4

а 6

Ей, ш\? ЕЬ. шУ

т

Рис. 1. Кинетика реакции конденсации формальдегида.

А - расход СН>0 и выход продуктов (%), т - время (мин). I, 13 - стадии. СН>0 - 1 моль/л, СаО - 0,1 моль/л, г - 60°С. 1 - ЕЙ (мВ), 2 - общая конверсия СНгО, 3 - редуцирующие сахара, 4 - конверсия СН2О по реакции Канниццаро. Раствор формальдегида, полученный растворением: а -

параформальдегида в кипящей воде; б - сублимированного параформальдегида.

При проведении реакции с формальдегидом, полученным растворением сублимированного параформальдегида в дистиллированной воде, образования углеводов не происходит даже но истечении 10 ч. Степень конверсии формальдегида при этом равняется степени конверсии по реакции Канниццаро (рис. 1, б). Однако в некоторых опытах, проведенных нами с формальдегидом, полученным сублимацией параформальдегида, происходит его конверсия с образованием смеси углеводов. Кривые конверсии формальдегида при этом полностью совпадают с представленными на рис. 1, а.

С использованием метода жидкостной хроматографии показано, что в растворах, дающих положительную реакцию на образование углеводов независимо от способа их получения, содержится незначительное количество (0,001-0,005%) ацетальдегида, в то время как в растворах формальдегида, полученных растворением сублимированного параформальдегида и не образующих при нагревании с окисью кальция Сахаров, ацетальдегид не обнаружен. То, что именно наличие

ацетальдегида, имеющего 3 а-водородных атома, необходимо дпя инициирования реакции образования углеводов, подтверждено модельными опытами с добавлением в реакционную среду ацетальдегида в количестве 0,001-0,01%.

Таким образом, реакция самоконденсации формальдегида в гликолевый альдегид не является инициирующей стадией автокатализа. Для того, чтобы реакция началась, необходимо присутствие и реакционной смеси небольших количеств ацетальдегида или других органических сокатализаторов.

Ранее нами было показано, что эффективным сокатализатором процесса является конденсат формальдегида. Он оказывает существенное влияние на продолжительность индукционного периода, который сокращается в 5-6 раз, при этом общее время реакции уменьшается почти вдвое, повышается выход редуцирующих Сахаров (с 42 до 60%), уменьшается почти вдвое расход формальдегида на побочную реакцию Канниццаро (с 15% до 8%). По сокагалитической активности он сравним с самым эффективным из известных ранее для этого процесса -гликолевым альдегидом. Однако одинаковый сокаталитический эффект наблюдается при использовании гликолевого альдег ида в количестве на порядок выше, чем конденсата.

Наличие и природа сокаталнзатора оказывает существенное влияние и на соотношение в конденсате линейных и разветвленных углеводов (табл. 3).

При проведении реакции без сокаталнзатора или с использованием в качестве сокаталнзатора гликолевого альдегида в продуктах реакции содержится соответственно 48,2% и 52,6% биологически активных компонентов - разветвленных углеводов. Замена гликолевого альдегида на конденсат формальдегида приводит к заметному увеличению содержания целевого продукта - до 71,7%.

С целью повышения выхода углеводов нами была изучена возможность замены растворителя - воды на водные растворы метанола и этанола, так как известно, что добавление в реакционную смесь спиртов приводит к увеличению выхода Сахаров при конденсации формальдегида за счет торможения реакции Канниццаро. Определены условия, позволяющие получать смесь углеводов с высоким выходом -77,5%. Отмечено, что в случае использования водно-спиртовых сред достигается также более высокое удельное содержание в продуктах

реакции биологически активных компонентов - разветвленных углеводов - 83,4%.

Таблица 3

Влияние условий конденсации на фракционный состав углеводов (катализатор - гидроокись кальция)

Условия конденсации

Растворитель - вода Растворитель -

Углеводы без органического соката-лизатора сокатализатор конденсат форм;шь-дегида сокатализатор -гликолевы й альдегид 25% этанол, орг. сокатализатор - конденсат формальдегида

Сл 9,0 1,0 6,9 0,7

С4(линейн.) 7,1 2,0 3,2 0,4

С4(разветв.) 5,0 4,0 4,9 2,5

С4 12,0 6,0 8,0 2,9

С 5 (линейн.) 10,2 7,0 8,7 2,7

С> (разветв.) 14,7 26,0 11,3 17,7

с5 24,9 33,0 20,0 20,4

Сб (линейн.) 20,3 14,3 21,3 7,0

Се (разветв.) 22,7 35,7 28,7 47,3

С6 43,0 50,0 50,0 54,3

Ст (линейн.) 5,2 4,0 7,3 5,8

С? (разветв.) 5,8 6,0 7,7 15,9

С7 11,0 10,0 15,0 21,7

Линейные 51,8 28,3 47,4 16,6

Разветвлен. 48,2 71,7 52,6 83,4

На основании разработанных технологических приемов и результатов изучения состава конденсата в оптимизированных условиях создан лабораторный регламент для получения высокоактивного биорегулятора методом конденсации формальдегида в углеводы, сформулированы основные технические требования к целевому продукту.

3.4. Принципиальная технологическая схема получения конденсатов формальдегида

Процесс конденсации формальдегида в углеводы с целью получения биостимулятора достаточно прост, гак как является одностадийным, протекает в йодной среде при невысоких температурах и атмосферном давлении. Принципиальная схема процесса представлена на рис. 2.

СаО Н:0 С:Н5ОН СГЬО СОз (или Н^О-О ^

приготовление конденсация осажде- филь-

известкового —» формальде- —> ние ионов трация

молока гида CaJ+ осадка

осадок

готовый

фильтрат

_обработка

УЗ или М П продукт

Рис. 2. Принципиальная технологическая схема получения регулятора микробиологических процессов конденсацией формальдегида.

Согласно рис. 2, в реактор, где происходит конденсация формальдегида, по отдельным линиям подают известковое молоко, раствор формалина этиловый спирт и конденсат формальдегида в качестве сокатализатора. Реакцию проводят при перемешивании при следующих условиях: концентрация формальдегида - 0,55-0,6 моль/л, гидроокиси кальция - 0,15-0,2 моль/л, этанола - 5,7 моль/л, конденсата формальдегида - 0,013-0,015% по РВ, температура 55-60°С. По окончании реакции ионы кальция осаждаются в виде карбонатов или оксалатов, осадок отфильтровывают. Биологическая активность конденсатов формальдегида может быть повышена на 10-27% обработкой его ультразвуком или магнитными полями. Однако положительный эффект в обоих случаях обработки проявляется избирательно, в зависимости от процесса и продуцента.

Полученные по указанной схеме конденсаты формальдегида относятся к малотоксичным веществам (IV класс токсичности, III класс

t

опасности). По орпшолептическим и физико-химическим показателя готовый продукт должен отвечать требованиям и нормам, указанным табл. 4.

Таблица

Технические требования к конденсату формальдегида -регулятору микробиологических процессов

Показатель Характеристика, нормь:

Внешний вид Прозрачная жидкость

Цвет От светло-желтого до светло-коричневого

Запах Карамели

Массовое содержание, %:

редуцирующих веществ не менее 1,0

формгшьдегида не более 0,001

рн 2,5-5,5

При необходимости конденсаты формальдегида концентрируют д< концентраций 15,0-86,7% (по РВ) в мягких условиях (под вакуумом лиофильная сушка) без потери их активности. Полученный продук" стабилен. Биологическая активность концентрированных кондеисато! формальдегида сохраняется при хранении их при комнаткой температур« в течение длительного времени (проверено до 7 лет).

4. Спектр действия конденсата формальдегида -регулятора микробиологических процессов

Изучение конденсата формальдегида как регулятора процессо! микробиологического синтеза проводили с использованием различны? по уровню клеточной организации тест-объектов: бактерий (грамположительных и грамотрицательных), микромицетов, высшю базидиальных грибов, которые являлись промышленными продуцентами биомассы или БАВ. Такой подход к выбору тест-объектов облегчат выбор критериев для оценки действия регулятора, определения характера и спектра его действия и одновременно позволял определит) целесообразность его практического использования и разработать рекомендации применения в конкретных процессах.

Действие конденсата формапы)егш)а па грамполажительиые бактерии

Действие конденсатов на грлмположительные бактерии изучали с использованием продуцентов различных аминокислот: лизина (Corynebaclerium gluiamicum Г-3. Brevibacierium flavum 22 ЛД и Brevibacierium flavum E-53I), валика (Corynebaclerium gluiamicum С//-/), пролина (Brevibacierium flavum P-H2), гистидипа (Corynebaclerium gluiamicum H-46A), триптофана (Bacillus suhtilis 15) и орнитина (Micrococcus gluiamicum). Во всех случаях наблюдается однотипный характер действия конденсата - стимуляция продуктивности бактерии при содержании его в регламентных средах в количестве 0,0!-0,1% (по РВ) и ингибирование синтетической активности при более высоких концентрациях (0,5-1% и выше). Стимулирующий эффект в зависимости от концентраций и от типа конкретного синтеза составляет для разных продуцентов 16-24%, а ингнбирующий - 10-17%. Полученные результаты проверены и подтверждены в специализированном институте аминокислот - НИТИА (Ереван).

На примере процесса биосинтеза лизина показано (рис. 3), что п присутствии конденсата несколько снижается прирост биомассы продуцента (на 7-10%), возрастают экономический коэффициент по лизину (на 18%) и удельная продуктивность (на 30%).

Время, ч

Рис. 3. Динамика накопления биомассы (I), лизина (2), потребления РВ (3) культурой В. /1а\ит Е-531: I, 2, 3, - контроль, 1', 2', 3' - опыт с конденсатом формальдегида.

Использование конденсата в качестве регулятора процессов синтеза аминокислот, например, лизина, валина, не сказывается на синтезе сопутствующих аминокислот (табл. 5), что является косвенным подтверждением того, что конденсат не изменяет характер метаболизма продуцентов.

Г'.шлица 5

Влияние конденсата формальдегида (0,05% по РВ) на биосинтез аминокислот

Продуцент Стимулятор Целевая аминокислота Сопутствующая аминокислота Удельное содержание целевой аминокислоты, %

Найме нова-кие Выход, г/л Наименование Выход, г/л

Согупг-bacterium glulami-cum СН-1 контроль валин 18,5+0,3 гистидин лизин лейцин 4,0±0,3 2,9±0,2 1,0±0,1 73

конденсат формальдегида 0,05% 20,4±0,4 гистидин лизин лейцин 4,3+0,3 2,2±0,2 1,0+0,1 76

Brevi-hacierium flamm E-531 контроль лизин 20,4±0,4 валин аланин 2,0±0,2 0,910,1 88

конденсат формальдегида 0,05% 23,5±0,4 валин аланин 2,1 ±0,2 0,8+0,1 89

Действие конОенсата формальдегида па метабилшпическую активность граиотрицательиых бактерий

Действие конденсата на грамотрицательные бактерии, строение и состав клеточных оболочек которых существенно отличается от таковых у грамположительных, изучали с использованием культуры уксуснокислых бактерий аисопоЬааег охуёат в процессе окисления

ими П-сорбша в Ь-сорбозу. Как показал» результаты, влияние конденсата в концентрации 0,02-0,07% (по РВ) проявляется в сокращения лаг-фазы, времени развития культуры при сохранении на уровне контроля выхода как биомассы, так и сорбозы в условиях глубинного культивирования бактерии (рис. 4). При более высоких дозах (превышающих 0,5%) наблюдается иш ибированпе росга микроорганизмов.

Время культивирования, ч

Рис. 4. Рост С. охуАапя и окисление им сорбита в сорбозу на контрольной среде (1,2) и среде с 0,03% конденсата формальдегида (по РВ) {Г, 2'): 1 - биомасса; 2 - сорбоза.

Влияние конденсата на синтез антибиотиков стрептомицетами

В данном разделе представлены результаты исследований действия конденсата формальдегида на стрептомицеты с использованием двух культур промышленных продуцентов антибиотиков: тилозина -81гер1отусе$/гасНае и имбрицина - ипЬпсаш.

Культивирование продуцентов проводили в колбах на качалке и на опытно-промышленной установке на средах и при условиях, предусмотренных в соответствующих промышленных регламентах.

Конденсат вносили в ферментационную среду, так как-предварительными исследованиями было установлено, что внесение его на стадиях выращивания поверхностного или глубинного посевного материала не оказывает заметного влияния на биосинтез антибиотиков.

Как показали результаты, конденсат в концентрациях 0,02-0,1% интенсифицирует процесс биосинтеза тилозина, при этом количество антибиотика повышается в среднем на 24%>, на сутки сокращается продолжительность процесса. Предложенный способ биосинтеза тилозина был испытан на Бердском биохимическом заводе и защищен авторским свидетельством.

Аналогичные и близкие по величине эффектов результаты получены в процессе стимуляции биосинтеза имбрицина. Показано, что увеличение выхода антибиотика под действием конденсата происходит в результате значительного - на 56% - повышения продуктивности биомассы. При повышенных концентрациях конденсат оказывает ингибирующее действие на развитие стрептомицетов.

Культивирование грибов на средах с конденсатом формальдегида

Значительную по численности и более высокоорганизованную группу микроорганизмов составляют грибы, относящиеся к высшим протестам - эукариотам, клетки которых сходны с растительными и животными. В составе клеточной стенки грибов, в отличие от бактериальных, преобладают полисахариды, основными из которых являются глюканы, маннаны, хитин, целлюлоза.

Учитывая существенные различия в морфолого-биохимических признаках бактерий и грибов был закономерен теоретический и практический интерес к реакции грибов на действие конденсата.

Изучение влияния конденсата на их рост и синтез метаболитов проводили с использованием культур несовершенных грибов: Aspergillus niger, A.terreus, A.flaviis. Pénicillium ochrochloron и с культурой высших базидиальных грибов Coprinus cinereus - продуцентом протеиназ фибринолитического действия.

Гриб С. cinereus культивировали в глубинных условиях в колбах на качалке или в ферментаторе емкостью 25 л на среде и в условиях, оптимизированных для биосинтеза протеиназ. Конденсат вносили в среду до стерилизации в концентрациях от 0,001 до 0,1% по PB.

Как покапали результаты, и в этом процессе конденсат формальдегида оказывает регуляториое действие - н низких концентрациях стимулирует прирост биомассы гриба (на 16%), а синтез фибринолитической протеазы активность на 23 % (рис. 5); при концентрациях 0,1% и выше наблюдается ингибирование процесса в целом.

Время кулынвирования, ч

Рис. 5. Динамика изменения фибринолитической активности и прироста биомассы Соргти.ч стеки.? на среде с конденсатом формальдегида и в контрольных условиях. Контроль - 1, Г; опыт (с конденсатом формальдегида) - 2,2'; 1,2 - ФА; Г, 2' - биомасса.

Регулирующий эффект действия конденсата выявлен и в экспериментах с микромицетами. На средах с конденсатом прирост биомассы всех используемых грибов снижается, и тем больше, чем выше его концентрация, при этом наиболее чувствительной культурой к действию регулятора является Р. осИгосШогоп.

В качестве физиологического признака, контролируемого у этих грибов, была использована интенсивность образования кислот, стимулируемая низкими концентрациями конденсата, в то время как при более высоких кислотообразование ингибировалось. Эта зависимость отражена на рис. 6 на примере двух культур рода Ахрег^Щт.

Следует отметить, что свойство конденсата регулировать кислотообразование было выявлено ранее совместно с сотрудниками НИИ пищевой промышленности (Санкт-Петербург) в процессе биосинтеза лимонной кислоты промышленным продуцентом А. пщегЛ-]. Положительный эффект наблюдался при низких концентрациях регулятора - 0,002-0,0045%, а ингибирующий - при 0,1-0,2%. Стимулирующий эффект проявлялся не только в увеличении выхода лимонной кислоты, ко и в снижении количества синтезируемых сопутствующих кислот - глюконовой и щавелевой.

Кнслотс-продукция.

123456 1 2 3 4 5 Б

д Б Время, ч

Рис. 6. Удельная скорость снижения рН микромицетами А. 1етгеш (А), А. /1ауил- (Б): 1 - контроль; 2, 3 - среда с конденсатом формальдегида 0,01% и 0,2% (по РВ) соответственно.

Перечень ряда процессов, в которых конденсат был испытан как биорегулятор, достаточно широк (табл. 6). Как следует из табл. 6, во всех процессах независимо от используемого продуцента наблюдалась регуляторная активность конденсата и, по-видимому, список микробных синтезов, где проявлялись бы аналогичные эффекты, может быть значительно расширен.

Таблица 6

Конденсат формальдегида как регулятор микробиологических процессов

№ п/п Культура продуцента и целевой продукт- биосинтеза Доза конденсата, % по РВ Характер действия Стиму-Ингиби-

ляция рование

1. Brevibacierium flavum 0,01-0,1 + -

Е-531 (лизин,! 0,5 и выше - +

2. Corynebaclerium gluiamicum 0,01-0,1 + -

СН-1 (валин) выше 0,2 - +

•> Bacillus sub til is -15 0,01-0,1 + -

('триптофан) выше 0,5 - +

4. Micrococcus gluiamicum 0,01-0,1 -

(орнитин) 0,5 и выше - +

5. Brevibacierium flavum P-H2 0,01-0,3 +

(пролин) выше 1,0 - +

6. Corynebaclerium gluiamicum H-46A 0,001-0,05 + -

(гистидин) выше 0,5 - +

7. Gluconobacler oxydans 0,01-0,1 + -

(сорбоза) выше 1,0 - +

8. Streplomyces fraa'iae 165 0,02-0,1 + -

(тилозин) выше 0,5 - +

9. Streplomyces imbricaius 0,001-0,05 + -

0112/90 ЛИЛ (имбрицин) выше 0,1 - +

10. Aspergillus niger Л-1 0,001-0,01 + -

(лимонная кислота) выше 0,1 - +

11. Coprinus cinereus 0,005-0,01 + -

(протеазы, биомасса) выше 0,1 - +

12. Coriolus hersutus 0,05-0,1 + -

(биомасса) выше 0,5 - +

13. Eremothecium ashbyii (витамин £Ь) 0,06 +

14. Erwinia awidea (аспартаза) 0,05-0,07 +

15. Alcaligenes faecal is (аспартат ß-декарбоксилазы 1 0,05 +

16. Bacillus subtilis (протосубтилин) 0,01 +

В соответствии с правилом Арнт-Шульца конденсат может быть отнесен к биорегуляторам, характер действия которого - стимуляция или ингнбирование - определяется его концентрацией.

Сопосгавительный анализ данных литературы по проблеме биостимуляторов показал, что конденсат формальдегида по основным критериям - биологической активности, действию на широкий спектр микроорганизмов, отсутствию токсичности, простоте способа получения и применения, стабильности при хранении и отсутствию дефицитности сырья отвечает требованиям, предъявляемым к регуляторам микробиологических процессов и по многим из них превосходит известные и используемые в практике.

Экономическая целесообразность применения конденсата в таких биотехнологических процессах как окисление сорбита в сорбозу культурой Gluconobacter oxydans, синтез антибиотика имбрицина продуцентом Slreptomyces imbricalm, протеиназ - базидиомицетом Coprimts änereus, лимонной кислоты - культурой Aspergillus niger подтверждены результатами экспериментов, проведенных в укрупненных масштабах - в ферментаторах объемом 25 л и аппаратах емкостью 600 л на опытно-промышленных установках отраслевых НИИ (акты испытаний в приложении диссертации).

Применение конденсата в процессах микробного синтеза позволит практически без изменения существующих технологий значительно увеличить выход целевых продуктов, снизить удельный расход сырья, сократить продолжительность процесса и время занятости оборудования, то есть увеличить эффективность производства в целом.

5. Механизм биологического действия конденсата формальдегида

Проблема направленной регуляции микробиологических процессов с помощью стимуляторов является чрезвычайно важной как в теоретической, так и в практической микробиологии (биотехнологии). Изучение механизмов действия стимуляторов из самостоятельной цели становится средством выяснения механизмов самих процессов биосинтеза. Знания механизмов действия стимуляторов на клетку позволяют определить уровень специфичности их действия, расширяют представления о защитных клеточных реакциях, проявляющихся в ответ

нл воздействие этого фактора, во многом определяют перспективу их использования.

Определение механизмов действия конденсата представляет собой трудную задачу, особенно, если учесть сложность и необычность его состава, а. следовательно, и возможное число клеточных функций, которые могут изменяться под его влиянием. Однако, учитывая однотипный характер ответов микроорганизмов с различным уровнем клеточной организации - от бактерий до высших базидиальных грибов на наличие в среде роста этого биорегулятора, можно предположить, что основной механизм его действия будет одинаковым для продуцентов различных таксонов.

На первом этапе исследования этой проблемы в качестве тест-объекта использовали продуцент лизина Вггх\Ьас1ег'щт /1и\ит Е-5Л (фирмакугные бактерии). Основное внимание было уделено влиянию конденсата на активность ключевых ферментов метаболизма углеводов и биосинтеза лизина (фосфофруктокиназы, глюкозо-б-фосфатдегидро-геназы, изоцитрнтдегидрогеназы. фосфоенолпируват-карбоксилазы, Р-аспартокиназы), а также на клеточную проницаемость.

Как показали результаты, конденсат не оказывает заметного влияния на активность указанных ферментов, и, следовательно, стимулирующее действие его осуществляется по иному механизму. Результаты ранее проводимых нами исследований позволили предположить, что одним из возможных путей стимуляции конденсатом биосинтеза лизина мог быть процесс активация автолиза клеток продуцента.

Углубленное изучение этой возможности с использованием 12 линейных и 2 разветвленных углеводов в О- и Ь-формах, входящих в состав конденсата, показало, что действие отдельных углеводов на индукцию автолиза не равнозначно: одни (линейные гексозы - галактоза, сорбоза, фруктоза, манноза) в низких концентрациях (0,0025 - 0,1 мг РВ I мл) стимулируют, другие (линейные пентозы и дезоксисахар - рамноза) либо не влияют, либо ингибируют (О- и Ь-арабиноза) процесс независимо от их оптической изомерии. Важно отметить, что наибольшая интенсификация автолиза клеток продуцента - 17,5-19,2% -наблюдается в присутствии разветвленных углеводов - 2-С-гидроксиметилпеитозы и 2-С-гидроксиметилгексозы в концентрациях 0,05 и 0,5 мг РВ / мл. Наличием компонентов, ингибирующих автолиз

вероятно, можно объяснить более низкую интенсивность автолиза в присутствии конденсата формальдегида, чем в присутствии отдельных моносахаридов, содержащихся в его составе, хотя не исключаются и другие механизмы.

Однако не во всех случаях (сорбоза, манноза) увеличение интенсивности автолиза сопровождается повышением выхода лизина (табл. 7). Показано, что и при одинаковой с контрольной интенсивностью автолиза продуцента в присутствии конденсата формальдегида или его биологически-активных компонентов разветвленных углеводов - выход лизина превышает контрольный на 1822%. Следовательно, увеличение выхода лизина не является обязательным следствием повышения активности автолиза, и активацией автолиза нельзя объяснить стимулирующий эффект, оказываемый па микроорганизмы конденсатом в целом и его биологически-активными компонентами - разветвленными углеводами.

Таблица 7

Влияние конденсата и отдельных его компонентов на автолиз и клеточную проницаемость продуцента В.}1а\'ит Е-531

Содержание конденсата и его компонентов в среде, % Интенсивность автолиза, % Проницаемость, Езбо/100 мга.с.б. Лизин, % к контролю

Контроль 3,1 0,06 100

Конденсат (0,05% по РВ) 8,0 0,095 118

Арабиноза (0,01%) 0,8 0,061 95

Сорбоза 11,9 0,061 106

Манноза 9,0 0,059 105

Конденсат (0,05% по РВ) Арабиноза (0,01%) 3,0 0,09 115

2-С-гидроксиметил-гексоза (0,01%) 17,5 0,1 121

2-С-гидроксиметил- гексоза (0,1%) Арабиноза (0,01%) 0,097 122

Конденсат (0,1% по РВ) 4,9 0,145 90

Конденсат (0,5% по РВ) 4,0 0,173 83

В последние годы при изучении механизмов действия различных веществ, оказывающих регуляторное действие на клетку, повышенное внимание обращается на изменение клеточной проницаемости. Анализ спектров поглощения фильтратов, полученных после инкубации биомассы продуцента лизина в воде в присутствии конденсата и без него (контроль), показал, что интенсивность "утечки" клеточных метаболитов, поглощающих в УФ-области (200-300 нм), в опытных вариантах выше, чем в контрольном (рис. 7). Эти результаты подтверждаются также и данными, полученными при анализе фильтратов на содержание в них ионов калия, белков, аминокислот.

о

Рис. 7. Спектры поглощения фильтратов, полученных после инкубации биомассы В./1апип Е-531 в водной среде: контрольная биомасса - 1; биомасса, выращенная на среде с конденсатом формальдегида: 0,05% по РВ - 2; 0,5% по РВ - 3.

В фильтратах, полученных после инкубации биомассы, выращенной на средах с 0,05% и 0,5% содержанием конденсата, количество ионов калия увеличивается на 96% и 137%, белка - на 46% и 145%, суммарное содержание аминокислот - на 35% и 86% соответственно. Сопоставление этих результатов с данными о стимуляции и ингибировании биосинтеза лизина конденсатом в зависимости от концентрации позволяет предположить, что основным

механизмом его действия па продуцент является увеличение клеточной проницаемости (табл. 7). Ингибирующее действие повышенных концентраций конденсата (0,1-0,5%), по-видимому, обусловлено тем, что при этом потери жизненно важных метаболитов достигают критического уровня.

Основной клеточной структурой, регулирующей поступление в клетку молекул и ионов и выход их наружу, является цитоплазмагическая мембрана. Для нормального функционирования мембраны липиды, входящие в ее состав, должны находиться в состоянии "жидкой пленки" определенной вязкости. Только в этом случае может быть обеспечено правильное функционирование мембранных белков и нормальное прохождение различных веществ через мембрану. Степень текучести мембраны во многом определяется жирнокислотным составом входящих в нее липидов, который может меняться в зависимости от условий культивирования.

Исследование жирнокислотного состава липидов продуцента лизина В. /1а\шт Е-531 показало, что они представлены в основном насыщенными и мононенасыщенными жирными кислотами с 16-18 углеродными атомами - пальтиминовой Обо, стеариновой Ст.», пальмиголеиновой Ск,:| и олеиновой Сш (табл. 8).

Сопоставительный анализ жирнокислотного состава липидов продуцента показал, что в присутствии конденсата формальдегида количество ненасыщенных жирных кислот клеточных липидов увеличивается с 56,3% в контроле до 76,5% в опыте.

Таблица 8

Содержание доминирующих жирных кислот в липидах бактерий В. flamm Е-531

Вариант Жирные кислоты

С|6:<1 С 16:1 С 18:0 С 18:1

Контроль 37,7 14,0 3,9 42,3

Конденсат формальдегида (0,05%) 20,1 23,2 1,3 53,3

Увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах продуцента лизина, по-видимому, приводит к

изменению структурной организации мембраны а сторону повышения ее жидкостпости п, как следствие, возможному увеличению проницаемости. Полученные данные могут служить также и косвенным доказательством того, что иод влиянием конденсата формальдегида или его биологически активных компонентов увеличивается жидкостность мембраны, вследствие чего активируется система транспорта веществ через нее.

Аналогичные исследования влияния конденсата на клеточную проницаемость и жириокислотный состав липидов были проведены и с другими микроорганизмами - грациликутными бактериями, стрептомицетами и микромицегами (табл. 9). Результаты, представленные в табл. 9, подтверждают сделанное выше заключение и позволяют объяснить однотипный характер действия конденсата на микроорганизмы с различным уровнем организации.

В исследованиях, проведенных с продуцентом противогрибкового антибиотика имбрицина ¿Г. ипЬгкаШя, показано, что свойство конденсата повышать клеточную проницаемость может быть использовано не только для интенсификации процесса биосинтеза антибиотика, но и для более полного выделения его из биомассы продуцента. Предварительное добавление конденсата к биомассе позволяет не только повысить полноту извлечения антибиотика, но и упростить процесс выделения за счет сокращения числа циклов экстракции.

Таблица 9

Влияние конденсата формальдегида на клеточную проницаемость и жирнокислотный состав липидов микроорганизмов

Культура Проницаемость Содержание ненасыщенных жирных кислот в липидах, %

Егва 1 100 мг а.с.б. Е280/100 мг а.с.б.

контроль опыт контроль опыт контрол ь опыт

С1исопоЬас1ег охуЛапя 0,08 0,13 0,03 0,065 57,0 72,7

Streplamyc.es йпЬпсаШ 0,12 0,15 0,11 0,15 56,7 75,9

Аэре^Шш пк',гг 0,20 0,24 0,14 0,18 58.2 77.5

6. Влияние конденсата формальдегида на морфолого-культурадьные признаки микроорганизмов

Параллельно с действием конденсата на определенные физиологические процессы и интегральную характеристику микроорганизмов - рост, было изучено влияние этого биорегулятора на морфолого-культуральные признаки мицелийобразующих организмов -стрептомицетов, микро- и макромицетов. В наших исследованиях впервые выявлено свойство конденсата влиять на процесс пеллетообразования при глубинном способе культивирования. Процесс образования пеллет издавна привлекает внимание исследователей, так как агрегация мицелия в шаровидные структуры различного диаметра и различной степени плотности оказывает существенное влияние на скорость роста, качество образуемой биомассы, ее физиологическую активность, а часто и на качественный состав образуемых экзометаболитов. Этим дополнительно обусловливается практическая значимость конденсата как биорегулятора. На средах с конденсатом мицелиальные микроорганизмы растут в виде обрывков мицелия, различных по размеру "хлопьев", а образующиеся пеллеты отличаются чрезвычайно мелкими размерами.

Сканирующая и просвечивающая микроскопии позволили выявить особенности в характере агрегации гиф микромицетов, изменения в клеточной поверхности. Гифы соединяются в длинные утолщенные тяжи, образующие сетку с определенной конфигурацией. Клетки покрыты плотным слоем полисахарида, толщина которого во много раз превышает толщину аналогичного слоя у контрольных клеток и равномерно окружает клетку, плотно прилегая к ней. Установлено, что биосинтез полисахаридов усиливается в присутствии конденсата (табл. 10). Эти результаты согласуются с данными литературы о защитной функции полисахаридов, образуемыми микроорганизмами в ответ на негативные воздействия. Влияние конденсата на состав, а, следовательно, и свойства поверхностных слоев клеток можно рассматривать как один из вероятных механизмов регуляции процесса образования пеллет у стрептомицетов и грибов.

Таблица 10

Влияние конденсата формальдегида па образование полисахаридов культурой А. пщег

Вариант А.с.б. Внеклеточный полисахарид Полисахарид, связанный с клеткой

г/л % к контролю мг/л мг/г а.с.б. % к контролю мг глюкозы / г а.с.б. о/ ,, контролю

контроль 7,5 100 282 37,6 100 174 100

конденсат формальдегида 0,1% (по РВ) 7,1 95 620 88,8 236 361 207

7. Возможные области использования процесса конденсации формальдегида в углеводы

Учитывая свойство конденсата оказывать регуляторное воздействие на микроорганизмы независимо от их систематического положения, особенностей клеточной организации, а также единый для всех механизм действия, а именно: на клеточную мембрану, можно предположить, что области его использования могут быть значительно расширены за пределы биотехнологии.

"Гак, совместно с ВНИИ растениеводства (Санкт-Петербург) и Московской сельско-хозяйственной академией им. К.А.Тимирязева начаты исследования по использованию конденсата в другой области - в сельском хозяйстве. Показана перспективность его применения для повышения морозоустойчивости пшеницы, для регуляции сукцессионных изменений в микробных популяциях компостов при получении органических удобрений.

Реакция конденсации формальдегида в углеводы представляет значительный интерес и как способ обезвреживания стоков многих химических производств, содержащих формальдегид - токсикант.

затрудняющий или делающий невозможной биоочистку таких стоков. Помимо экологического эффекта конденсат, получаемый из формальдегида сточных вод, может быть использован в качестве регулятора микробиологических процессов (например, биосинтеза тилозина, имбрицина, протеииаз фибринолитического действия) с таким же эффектом, какой достигается при использовании технического формальдегида. Вполне вероятно предположить, что он может оказывать стимулирующее действие и на микробиологическме процессы, протекающие в аэротенках очистных сооружений.

Эти исследования носят предварительный характер и в настоящее время свидетельствуют лишь о широте и многообразии сфер возможного использования как самого процесса конденсации, так и его продуктов, о целесообразности продолжения углубленных исследований в этом направлении как с научной, так и с практической точек зрения.

выводы

1. Впервые показано, что биологическую активность конденсата формальдегида как регулятора микробиологических процессов определяют разветвленные углеводы с числом углеродных атом он от 4 до 7, в том числе 2-С-гидроксиметилгриоза, 2-С-гидроксимегнлтетроза, 2-С-гидроксиметилнентоза и 2-С-глдроксиметилгексоза. Впервые в составе конденсатов формальдегида идентифицированы 5 разветвленных углеводов и 2 дезоксисоединения.

2. Результатами изучения механизма начальной стадии конденсации формальдегида показано, что реакция симоконденсации формальдегида не является инициирующей стадией автокатализа, и для начала конденсации необходимо присутствие в реакционной смеси небольших количеств ицетальдегида или других органических сокатализаторов.

Установлено, что природа органического сокатализатора оказывает существенное влияние на состав продуктов конденсации. Наибольшая селективность в образовании биологически-активных компонентов - разветвленных углеводов - наблюдается при использовании в качестве сокатализатора процесса конденсата формальдегида.

3. Исследовано влияние на синтез разветвленных углеводов основных факторов процесса - температуры, концентрации формальдегида и катализатора, природы и концентраций сокатализатора и растворителя. Определены условия конденсации, позволяющие получать смеси с преимущественным - до 83,4% -содержанием разветвленных углеводов.

Разработан лабораторный регламент получения регулятора микробиологических процессов конденсацией формальдегида, сформулированы технические требования к целевому продукту.

4. Установлено, что конденсат формальдегида проявляет высокую биологическую активность в отношении микроорганизмов с прокариотическим (бактерии, стрептомицеты) и эукариотнческим (дрожжи, микромицеты и высшие базидиальные грибы) типами организации клеток и может быть отнесен к регуляторам широкого спектра действия.

Изучено действие конденсата на сиерхсннтсз таких метаболитов как антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты высокоактивными промышленными продуцентами. Определены концентрации конденсата, в которых он увеличивает выход целевых продуктов на 15-37%. сокращает продолжительность процесса, снижает удельный расход сырья.

5. Определен один из возможных механизмов регуляз орного действия конденсата формальдегида на микроорганизмы. Показано, что механизмом, общим для микроорганизмов различных систематических групп и уровней организации, является изменение структурной организации цитоплазматической мембраны в сторону увеличения се жидкостности и, как следствие, активизация транспорта веществ через нее. Ингибирующее действие конденсата в повышенных концентрациях обусловлено тем, что в этом случае потери клеточных метаболитов, в том числе и жизненно-важных (аминокислот, белков, веществ нуклеотидной природы) достигают критического уровня. Впервые выявлено, что в присутствии конденсата увеличивается степень ненасыщенности жирных кислот липидов у микроорганизмов различных таксономических групп.

6. Конденсат формальдегида оказывает воздействие на некоторые морфолого-культуральные признаки микроорганизмов при поверхностном и глубинном способах их культивирования.

Показано, что одной из неспецифических реакций грибов на воздействие конденсата является образование на поверхности клеток толстого полисахаридного слоя. Усиленный синтез полисахаридов, очевидно, лежит в основе механизма влияния конденсата на характер роста мицелиальных культур в глубинных условиях, а именно - на процессе пеллетообразования. В присутствии конденсата наблюдается "гомогенный" рост, образуются мелкие плотные пеллеты, размер которых в 2-3 раза меньше, чем в контрольных условиях.

7. Показана возможность использования конденсата формальдегида как средства, повышающего морозоустойчивость озимой пшеницы. Обработка проростков пшеницы растворами конденсата (0,05% по РВ) значительно (115-350% к контролю) повышают их выживаемость после промораживания, сокращает число поврежденных растений. По эффективности действия конденсат существенно превышает такой криопротектор как сахароза.

с п и с о к

публикаций по теме

1. Медведева Н.Г., Яковлев В.И, Сухаревич В.И., Егорькоз А.П.. Яковлева Е.П., Дивова Н.П., Волик Т.В. Получение углеводов из формальдегида для микробиологического синтеза // Результаты научно-технического сотрудничества отраслевого НИИ (8НИТИАФ) и ВУЗа (ЛТИ им.Ленсовета): Тез. докл. - Л., 1980. - С. 16-17.

2. Медведева Н.Г., Яког.лев В.И., Сухаревич В.И., Кутуев Р.Х. Об автокаталитическом синтезе углеводов из формальдегида /7 Ж. прикл. химии. - 1981. - Г.54, №6. - С. 1399-1402.

3. Медведева Н.Г., Геллис Ю.К., Яковлев В.И., Сухаревич В.И., Кутуев Р.Х., Егорьков А.Н. Оптимизация процесса получения углеводов из формальдегида //Ж. прикл. химии. - 1981. - Т.54, № 8. -С. ¡789-1793.

4. A.c. № 837065 (СССР). Способ получения биомассы. Сухаревич В.И., Глибин E.H., Дивова Н.П., Кутуев Р.Х., Медведева Н.Г., Яковлев

B.И., Львова Е.Б., Никифорова Т.А., Василннец И.М., Вилявдо Г.А., Аглиш И.В., Лыкова Л.А. Опубл. Б.И., 1982, № 30.

5. Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Стигайло И.Н., Беликова Т.Д. Использование синтетических углеводов для получения микробной биомассы и некоторых метаболитов // Химия и биохимия углеводов: Тез. докл. VII Всесоюзн. конф. - Пущино, 1982. - С. 25.

6. Никифорова Т.А., Хрущева Н.М., Медведева Н.Г., Львова Е.Б. Действие препарата формозы на активность прорастания Aspergillus niger ■ продуцента лимонной кислоты и кислотоооразование при культивировании на твердых средах // В сб.: Получение и применение регуляторов роста. - Вып.2. - Л., 1982. - С. 11-17.

7. Сухаревич В.И., Яковлева Е.П., Медведева Н.Г., Стигайло И.Н., Умбетова А.Ж. Влияние синтетических Сахаров на биосинтез ингибитора протеолитических ферментов // Там же. - С. 31 -34.

8. Никифорова Т.А., Львова Е.Б., Сухаревич В.И., Аглиш И.В., Лыкова И.Н., Мовган Ю.Р., Медведева Н.Г. Влияние формозы на биосинтез лимонной кислоты глубинной культурой Aspergillus niger I/ Там же. -

C. 35-37.

9. Сухаревич В.И., Стигайло И.Н., Медведева Н.Г., Тутурина В.А. Выращивание дрожжей рода Candida на синтетических углеводах. Деп. в ОНИИТЭХИМ, 1982, № П43ХП-Д82.

10. Никифорова Т.А., Львова Е.Б., Сухаревич В.И., Аглиш И.В., Лыкова И.Н., Мовчан Ю.Р., Хрущева Н.М., Медведева Н.Г. Изучение действия формозы на продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger 11 Микробиологическая промышленность. - 1983. - jNb 3. - С. 18-19.

П.Медведева Н.Г., Стигайло И.Н. Получение и использование синтетических углеводов для микробиологического синтеза лизина // Бюл. ВНИИ с.-х. микробиол. - 1983. - № 37. - С. 51-53.

12. Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Собетов А.И. Использование синтетических Сахаров для биосинтеза лизина II Микробиологическая промышленность. - 1983. - Вып.4. - С. 4-5.

13. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Станек 51.Я., Яковлев В.И. Исследование продуктов конденсации формальдегида // Ж. прикл. химии. - 1983. - Т. 56. № 12. - С. 2708-2710.

14. Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Беликова Т.Д., Стигайло И.К., Станек Я.Я. Использование синтетических углеводов для выращивания дрожжей// Прикл. биохимия и микробиология. - 1984. -Т.20, № 2. - С. 245-249.

!5. А.с. 1112780 (СССР). Способ получения аминокислот. Сухаревич

B.И., Медведева Н.Г., Собсггов А.И., Яковлев В.И., Тутурина В.А. 1984. ДСП.

16. А.с. I ¡94874 (СССР). Способ получения биомассы дрожжей. Сухаревич В.И., Семушина Т.Н., Стигайло И.Н., Балашевич И.И., Яковлев В.И., Медведева Н.Г., Гаврилов Л.И., Лисицкая Т.Б. 1985. Б.И. №44.

17. Медведева Н.Г., Тутурина В.А., Серебрякова Е.В. Интенсификация процесса биосинтеза лизина // Контроль и управление биотехнологическнми процессами: Тез. Всес. котЬ. - Горький, 1985. -

C. 78.

18. Сухаревич В.И., Яковлев В.И., Медведева Н.Г. Перспективы использования синтетических углеводов в микробиологических процессах // Тез. VII съезда ВМО, т.4. - 1985. - С. 110.

19. Костенко Т.Ф., Сухаревич В.И., Ширшов В.А., Васильева Е.В., Ларионова В.А., Рафаэльская Б.В., Медведева Н.Г. Использование смеси синтетических Сахаров для биосинтеза витамина В2 кормового // В сб.: Получение и применение регуляторов роста. - Л., 1986. - С. 109-111.

20. А.с. 1269298 (СССР). Средсгво защиты озимой пшеницы от мороза. Шевенко Е.В., Виноградова В.В., Александрова Л,С., Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Яковлев В.И. 1986.

21. Сухаревич В.И., Яковлев В.И., Медведева Н.Г. Получение и использование синтетических углеводов в микробиологических процессах II В кн.: Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. - Л.: Наука, 1986. - С. 241-252.

22. Медведева Н.Г., Станек Я.Я., Яры И., Сухаревич В.И. К вопросу об автокаталитическом синтезе углеводов из формальдегида П Ж. прикл. химии. - 1989. - Т.62, № 11. - С. 2557-2560.

23. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Яковлев В.И. Синтез углеводов из формальдегида для процессов микробного синтеза // Химия и биохимия углеводов: Тез. VIII Всесоюзн. конф. - 1987. - С. 17.

24. А.с. 1549071 (СССР). Способ получения L-валина. Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Жерновой А.И., Иванов В.А., Иванов Ю.А., Мусиенко Л.И., Г'атих Е.В., Карабеков Б.П., Лисицкая Т.Б. 1989.

25. Medvedeva N.G., Sucharevich V.I., Stanek J., Jary I. Synthesis and utilisation of synthetic carbohydrates in biotechnology П V European Symposium on carbohydrates, Prague, Czechoslovakia, 1989, p. 44.

26. Лисицкая Т.Б., Сухаревич В.И., Видякина Е.Ю., Медведева Н.Г., Трофимов В.А., Бабкин Д.Н. Стимуляция биосинтеза лизина

синтетическими углеводами. Деп. в НПО "Медбиоэкономика", 1989. № 458-мб 89.

27. А.с. 1554390 (СССР). Способ получения тилозипа. Сухаревич В.И., Томашепская Н.А., Медведева Н.Г., Ломовская Т.Ф., Яковлев В.И.. Пахтуев А.И., Чегодаев Ф.Н., Трухнина В.Н., Зайцева Т.Ь. 1989.

28. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Гатих Е.В. Влияние фракций смеси синтетических углеводов на биосинтез лизина бактериями // В кн.: Современные методы и оборудование для производства генно-инженерных продуктов. - Л.: Знание, 1990. - С. 49-55.

29. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Яры И., Станск Я.Я. Влияние ультразвука на биологическую активность синтетических углеводов // В сб. Пражского Химико-технологического института. ЧССР, Прага. 1991, ХЗ. -С.75-82.

30. Сухаревич В.И., Кислухина О.В., Тутурина В.А., Лисицкая Т.Б.. Медведева Н.Г. Влияние синтетических углеводов на биосинтез лизина // Биотехнология. - 1992. - № 2. - С. 30-32.

31. Семенова И.Р., Медведева Н.Г., Денисова Н.П., Емельянова с.В. Влияние синтетических углеводов на физиологическую активность некоторых высших базидиальных грибов // Биотехнология. - 1994. - № 11-12.-С. 20-22.

32. Сухаревич М.Э., Медведева Н.Г., Борисова О.Г., Рыбальченко О.В. Влияние аэрации и редокс-потенциала на биосинтез антибиотика имбрицина // СПИД, рак и родственные проблемы: Тез. докл. IV Межд. конф. - СПб, 1996. - С. 103.

33. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И. Конденсация формальдегида в углеводы. - НИЦЭБ РАН. - СПб, 1996. - 47 с. - Деп. в НИЦЭБ РАН 08.04.96, № 03125080496.

34. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И. Действие продуктов конденсации формальдегида на микроорганизмы. - НИЦЭБ РАН. - СПб, 1996. -101 с. - Деп. в НИЦЭБ РАН 12.06.96, №03225120696.

35. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И. Детоксикация сточных вод. содержащих формальдегид // Инженерная экология. - 1996. - № 4. - С. 17-21.

36. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И. Химический синтез углеводов из формальдегида и их использование в микробиологических процессах. - СПб, 1997. - 142 с. (Российская Академия наук, СПб Научно-исследовательский центр экологической безопасности).

37. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Рыбальченко О.В. Влияние конденсата формальдегида на продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger // Биотехнология. - 1997. - № 5. - С. 28-32.

Подписано к печати 24.02.9S. Формат 60x84/16

Тираж 100 экз. Заказ N 33. Ротапринт РИМ Библиотеки АН России (199034, Санкт-Петербург, Биржевая,!)