Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства повторяющихся последовательностей хромосомной ДНК B. PERTUSSIS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Свойства повторяющихся последовательностей хромосомной ДНК B. PERTUSSIS"

РГ6 од

о 5 оит ^РОССИЙСКАЯ АКАДШ5Я ЕЗДИВШИХ НАУК

НАШО^ЮСЛЦОВАТВЛЬСКИЙ 15ГОЖУТ ВОИИИЯЮЛОШ К МИКРОБИОЛОГИИ ЕМ. Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ВОЛГИНА ТАШРА ЙЛШШКА

свойства повторяющей посщовательшстей хрошсошой днк п.?еет05313

(03.00.07 - изкробпологвл) (03.00.15 - Генетика)

Авгорефе т диссертации на соискание ученой степени кандидата бяологпчвсавх наук

Москва - 1993

Работа каогаэпа в Научно-вссгэдааатедгскога янотптуто апидэляодотоа а шкробволагап иаенп Н.Ф.Гсмааоя РА5Л1.

НаучныЗ рукоБодаувль: г^аядада? блологических наук Г.И.КАРАТАЕВ

01'лцеэяьпцо оппоненты: доктор 6еол)Глчсс1ШХ наук, профессор А.Ф.ШЮЗ, кгсщадот паук В.Ы.АНДРИАНС©

Вздздае учроддапсэ - Ш'Л шз. И. Ы. Сеченова

М-

Залога дпссершия. состоияся ^ 1998 г

ь " часов па заседаная СШяшшвдроасзвото Совета

К 001.07.01 в Научао-Еоояздовагэлъсшц сдститххо ваЕдеыЕолэдва а какробаояэш! ш&ня Н.О.Г&'ллав Р1Ш (122093» Иэсква» ул.Гвзалая, 18),

С днсоарггдЕаО шгао огнаноштъся в библиотеке НИИ эпндемаояогш а шкроблологва ш. Н.Я.Гаьшязп РАШ.

¿вгорейзраг разослан " 1993 г.

УЧвзнЗ секра^црх. СяеЦЕаялзЕрозшгого Совета

доктор мздщЕайШХ ваук ЕЛ1.КОТТШВА

obiîvih ХЛРЛКТ?А РАБОТЫ

/■ПТУП-Т-^СДТГ. ТГ;Т.ТЦ.

Изменчивость вовбудятехей ййфз&тпоаиих зяболзваввЗ ."{Э^гогся осповядо свойствен, сбйспечявсегхм адпятаитэ ьикрооркш скэз к условиям обптгдпгь

В ягсгояпоо зрел ис-г дсегатс-моЗ я^орчгдйп о посягал?* бордзтеллезяой пг^екпгя я восязккозснгя воя'ггзя эабо-

лзветпя. Последов аяяч посгзянпх лэу аозвоглт яредполояить, что возбудпталь воклкга споссбш порогетлровать в оргаяязмз пэловеяа, паходяпг», восмояго, в ав'рулоягаом состой!пл. Переход гакроорга-я?.?!:оэ пз Езнрул;н"гг.г/1 фзпз я зярулзятяой мо^т стз^уллроватъ развитие заболевания. Тг.лл ого а деЛ.зтвяхзлгяозтя, л каповы кеха-пягш, ззпуог такз эта? процесс, яеиззссгао.

Кэхяяагот; обоспочяэскгхо яг.!:зячхвосга шлрооргйЯла.'.этв, оха-рзктеразовгнн недостаточно. Одясхо, в ряде слуя~ез показано, что окона позорросстя: гятягепсв возбудителя, а хакно регудяш его ^аягорез пзтогенясстя происходит яря учеотап аз последовательнее то 3.

Регуляция фасовоЛ тгэатеетз патогенных мякрооргг.няа.:ов, о таядз ог.'с'ла поверхностных аятлгеясэ Еосбгяпге*л происходя? при утгоздя 15 ЭЯВКгЯгОЗ.

Сс^глптзльно недавно збдзза тез» кзхякуздях фактора пато-rsSîiOOTH S.partacaic, были сблзру::~тш вг,зтэрлк"!еея пезледеза-?опйсе»Я дляко" ЮСО л .п., вдеэдпшгв к:: элг.!зн?амя (re Fhout ?Гз11у ÏS57). лх лослздоза^аж-'ооть я

поквгпао, что структура R3 злгяеитоз х??зхтернз дгл' пззестних le зд^геятов прохаряот з'^лоп j.h. , idvey j.

at ftl., 1539). Оддако своЯстза ат.*х зле.'.хят-зз до аастояезго зрз-'*--гя яс- асутзпи. Око.-.:) -'О хешй д с г%-?дозстгл г ясо го fi, гомоязгяч-циз пгзэдкязд олеизнтдн, расягпдзлзна по длг.кэ хрс::с-сспг

возбудителя С Иг РЬэа* Я.Ь., Ка НаНу 5. ¿Г., 1987). Обнаружено, что 20 повторов вшяа вдаергаровашаде копяв, находящяесяна разных расстояниях друг о? друга (Коратаса Г.И. е др., 1988). Однако не ясно, гомологичнц жа ннвертзров вшще повторяющиеся последовательности охаракаераззвшным вз элемеагет в.рог-ьива1в.

Ксолэдованидаш поаяэдшвс лат к оказано, чач» экспрессия шогах факторов БЕрулзнтаосга в.рог1изз!а коитролвруотоя "т!*" опе-ролои. Роль "т1х" одероиа в рагуйздвя Еэкевчавоата бордвтеля вз; чеяа кедоотаточно. ¡ысказшазгся предпожжслва об учаотпи из по лзловатальностей в регудяцвз ^лрулеагаоста а заманчивое ?а бордэ-телл, обеспвЧЕЗшийе аномально высокую частоту антигенных фазозн ие|ш»доа кйкразргашааа (о? I к 1У фаза, о чсогогой 1СГ4 - 10"^ (tfoi.es Д.А. 1284; Ыс РЬаа* Ш.Ъ. ей 81., 1987, 1888).

Езз освядвгельоаэувг о нообходаносга изучэния сво2ота об-ЕсруЕенвнх нвга шзеюгаразаших швгорятеахоя последовательностей Б.рег6иез1с.

Пзлъ в задачи псоглгозрнт'я. Целью настоящей работа являлось ЕяонцровенЕз ВЕДоопецп^'СгоЕой повторяющая вослэдоватеявности ХРо«азо1щ з.рог*ава1а в Еэугаивз ее свойств.

Дй.1 достижения Еоа^азленЕой цела иэобходимо было решить сле^ дувева задача:

1. Кяонвровшш пов^рпзщахоя инвертированных последователь постай хрокзаот.ЕСй ДНК В.рег4иаа1в.

2. Изучолвз структуры кшшроэшнш: фрагментов с помовдэ мс 5годлз рсстрвэдшщого Е эхакуронно-маЕроокошпоского анализов, блэт-гибраизааяв и срзваенЕо клонврешшшах повторяющихся после доззуглькостоИ о Езвэсгазглз 18 элемшгамв.

3. Кау%"енво снособкоста кяонерозеднех последовательностей с1г.:лул5;роза?ь гас- кезйЗЕстаУа гены.'лыо перестройки: дэязции,

инверсия, дупликация.

4. Изучение способности повторяющихся последовательностей B.pertuoeio к мзжгенсшшм перемещениям.

5. Определение видоспецяфачлоск! клонированной повторяющейся последовательности.

Научная новизна.

Впервые клонировала шшертлрозснная повторяющаяся последовательность хромосомной ДНК в.pertussis и изучены ее своЗстза:

- показано,, что rsbp I элемент способен к леремещэнпа ная внутри, так и между геноуамз;

- rsep 1 глеыен? стимулирует внутри геногяшз перестройки гибридных плазшд типа делений п дупликаций;

- начато нзученпз способности KSHP I элг-лонта к точному п почти точному -исклотепга яз сайта интеграции.

Использование клонированной HSEP I последовательности в качестве молекулярного зонда поззоляст осуществлять вцяоспецифнчес-кую идентификация возбудителя кокяззз.

Апробаипя рпбогн. Наторкали диссертация долоззны я обсугщепн на научной конференции подраглэленш молекулярной биология п генетики бактерий НИИЭН ш. Н.Ф.Гзмадеп ТЫЛ.

Публикации, По темэ дяссэргацнп опубязкозапо 7 работ. Их список приводится в конце автореферата.

Структура д объем лиссортгдяк. Диссертация состоит ез введения, обзора литературы, материалов л катодов, результатов собственных наследований, обсуждения, ветодоз и списка литературу. Работа изложена на 132 страницах меаинопаслого текста и ялляят-рнро^эна 12 рисуакаип п 8 тебт:цяиз. Спг.аок лнгератури содерзлг 153 наименований.

- 6 -

ШТЕШЯЫ И штоды Бдктераалтдие отаммя. Шгашн, исяользозашше в рабою, представлены и габл. I.

Таблица I

Бактериальные , Еспользоввшше в работе

Ш т a n и ц i I а р а к 'г о р и с г и к а ! Источник

E.OOli

НВ 101

baiS 20 (rb~cb~)roo Л.13 cra-1'4 pro Л2 1эи lac YI ga?„ Г,2 rpa-20

(s/'^l-S atl-I вир Г.44

Коллэкцш лаборатория Г.Б.Смирнова, НИИЭМ 1Ш. Н.Ф. Гама лев

JM 109

гоз 21- огЛ Alt СУ* ¿Sa, tbi, bad R1?

&up IjIV9 AXp t (IGO

Я '„trs. D3G, pro AS, las Ja,

la® Z ITS5

TO so

2.L blue

rol ¿1» (las"), pro iiE, 1ьз aq 3 i.:15 10, (tot11)

* •£> 51 1 »f*^-»/& •

Zi> *i3i5 (pes 3fil) . pro hi-j rpaA

ICS 15£ • ■ tsp-78 pal A1

A£51 -11 (рДДаг: 2n10) ДВ 51 ~1 1 (2?®)

EE 101 73) ' ЕЗ ЮГ (.*,p*4V)

2X ЪХиэ UpR) JU..3,

го га

XL blue (?£on')

ив ют. (?n и)

ПВ 101 (pIS. I) 1x3 -L0X

•Ш ЮЗ (¡.i.li 1) ja 10Э ьт 2) . :i.t wui CtES г)

ИЗ IOI (¿rr лСк )

r> q .

13 ЮГ (.Av/ya*) E3 IOI Up®'1®!!) ¿'Л 1G С^Ес'Ъ га 103. UoV)

, R g ,

Ai« KLUis vAp Ус I

!ЛЯй1(гД.1ь-я:2а'.0) 13 IOI (So*4)

*IO ss

Полкан i; рзбого

•»о S3

- ? -

Окончание табл. I

M M II

XapaitîcpEQïHKa

исготш)!к

IIB ioi (BÍET il, p' lac: Tn ÎO) ™

HB IOI (pnx I, P' loo: Tn 10) Xb

H3 IOI UpRïoH)

H3 lot (ApnTc")

Нолучоп в работе

Bordetolla psrtunaisrïohaaa X; faca I.серовар 1.2

181,225,229,4325,5374,375,303; 1.2.

В.pertussin: 248,262,569,338,89; 1.0,

B.pcrtusola: 1Ö23; -и- 1.2,

B.parapcrtuaiaî 357, 17SCÖ; 1. Ii

B.bronchloeptiea: 8216, 8341, 8214

B.-fcronchiaeptiea: P220, 81 Ol, фзса I,

0. Колжзкцпя п Научпо-леояз и* довательског 0. института п апвдялполоп л шкробно-.тгогяв

Н.Ф.Гачахзн

Bruoölla isoHtenaiai s?ñ3; Cteoímp I 70 ГЛ

. 705 2

Y.pneudotuberculosis: SSâî серовар I Колгакция лабо рагоряи Г.Б. Скяр'юва ÏÏIÎE3L1 ям. Н.Ф.Гг}'е::.е

861; 3260

V.choloraoi h', «, . сорсззр läada ТО Z5

D/iS - l'ùp:rr/79;H1024 '• .Orassa -

5$22S'l$. S Ka-soTt-л полгацс!п;оЗ срел«^псяоя>зззгга аядкпй 2 агара:*,озаппй бульс-к.\; Лепкокоя (Ь) Хогг.пгер",.

Шпгшаяьиуя сроду 'гомоалз не сопсво углсзолю-солзгрй СРЗДЫ А. В срзд? дсйсалвгл r.^r.osy в гхнцеяярлцзв О, К/С,

V

. аминокислоты - 20 ms/v,л, , .

Анггбаояш в оеяэ&тггярэ' срзет дейалялл в г.сзцез'гргцх'гс (мкг/пя) : гзтранпклгл - 20-25, качасдпа -50 *-'£00, .акагцаялот -

Для знрадгааияя 1сз мутаатоз иозользсвагя ср-злу Шм-Коная,

- G -

содержащую 0,5% лактозы.

Для еырацпзенйя b.pertussis ïohssaû I еспользозпли полусин-тетпческув среду производства Центрального научно-исследовательского института вакшан и сшороток им. Мечникова (рН - 7,2).

Для Быраищваяпя В. pDrtugoio , В.par ар or tuesta и В. Ьгоп-ehlccptica использовали среду Борде-Еангу в КУА с 15$ дефябраниро-ва'шой бараньей крови ц без нее, а таетз гадкую пптатолгпуп сроду Коен-Уплер.

Конызгадионнш скрестивяная, выделение ауксотрофчых мутантов, las-мутантов, выдзлениз прототрофза в 1ас+ ревертанов проводили, как описано в руководстве Миллера (1976).

Виделение плавмкдной ДНК проводили по методу Birnboim, Doly (1979).

Вылелонпе хромооошой ЛЖ проводили йо методу Mormura, Doly (1952).

Раасаяденде ДНК рвотрикдтняшн эндон^клзааамп. электрофорез ДНК, азЕЛзчеякз фрагментов ДНК из агарозного геля, ник-трансля-цив, ДНК-ДНК гнбрЕдазадиэ оеуизстзлялп, как описано в руководство ШнватЕса с соавт. (1984).

Электронно-шзкррдкопическвй анализ ДНК. Гомо- и гетеродуклек-сныё Ш8Лbs ДНК ПРОВОДИЛИ ЕО КвГОДу R.Iarie (1971 ).

Вызедзядд тгоертяровгакш: повторяющихся последовательностей xpOKoeoîfliog ДНК B.pcrtuasia Eohana I

Хро:;ооокяая ДНК B.portu-sio ïoheaa (фага I) была подвергнуто езлэчной денатурация о пооледувк-ей Ю-минутпой ренатурацией пр2 65°С. Образование структур "стебель-петля" контролировали о покосыз методов электронной микроскоп яр. Обработку ренатуряроася-по2 ДНК Si яуклэазой проводили по методике Н.оьгетЛо и 2.0ht-сиЪс (1975). Посла контро/л полноты гадрояйэа одкояитевнх ДНК

31 иуклэазой л пооледугжэхо осаэдения 70° зтпнолом прог.одадп

достройку иоооезрпэпншс двунптавих концов до "tjt1ux" ДНК-яолякэ-

рпзой I. Получоннкэ ?акпп образом фрагмент лпгпрово-

ля с líind III лнтара*.*п "¿mroica" (CEL\) л использовала для клонировекяя. KíonncoTir.H5a проводили в пекторз рНС 79 (Манпатяо, 1976).

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЗШШЕ I. Кд^псстгшпо йнвпртеровпяннх повторяющихся поолэдоэатавьиоотей хрокосош B.pertuasio

Перзга о г ал см г.солэдованпя являлось клонирование повторяющихся последоватодхаостой (ПК) генома B.pertu33is.

Электропно-макроскоппческпй анализ хроносоьяой ДНК ü.pertua-oia показал, что сна содержит не менее 40 копий янзертяроввнннх ' ШТ (Каратаев ГЛ. я др., 1988). Структуры "стебель-петля", наблэ-яаемно на гс::одупле;ссрх, представлены на ряс. I. После обработки Гомодуплэщха S1 нуклзазой получены двунитевые фрагменты ДНК, ооотввтствупгяе инвертированным повторам хромосомы B.pertuasia. Распределение размеров фрагментов в преперэтэ представлено на гистогрзж-э (рис. 2). На гпстограгжэ вщщо, что преобладавшим является размер повторов - 1,1 т.п.н. Полученный препарат двуннгё-вых фрагментов использовали в качество ДНК-сснда при отборе рзком-бинаншюс клопов (ДНК - зонд I).

Клонирование инвертированных ПП проводила согласно процедуре, описанной в разделе "Шгериалы л te годы".. Схем клонирования представлена па рис. 3.

Рекокбяленотыз Лрн2о2 клони отбирали с помощью гибридизация iп sita с ДНК-зоддом I. Из 65 кленов были отобряш 6, дающих положительный сигнал гЕбретзгяни.

- IQ -

а, - рзгазо "nsTíEi"> образованной одцонатевай ДНК, раопоЪгсенкоЯ к-згду поздораш;

i - pssíap "eïcôai" (двувв*еаш JSK), сбразсава-сого Kssspxapoösajasrj' Ш ; •

a ig - oEsonarsstis ЛЯК- ярэйосока в.рохtúsala

! !

íi

• ?

Ä

Oi

tí

и

2Л

2 Лотогредкг ргоаредзлеяЕ« оааиедо Евунптевш: сТрэгмоитоз ДИК хрззюош! B.portatMl::, помчанных по слэ обработай реямур^рсзашюС ЖК si яу^зсяо:;

1 - ычж-кулярпая Î-uvjsô (î.n.ii,);

H - чкло «siîsDOHEft: молекул

pSCTFUXUK."! ВО

ibis- сзЯт>'

Mí,"- •'•с ü« t

Рис. 3 Cxei'.a хлоязрозаипя Ш хромоссиа В.pertussis в оостазо генома ллэгмяд» р'1С7Э. А,Б,с. сязичэслез карга рэксм<5нная1лкх пя&зиид. рШГх" - структура ргкомбякаятаой яяазиаяа, озядсемая пря ялокирсз^кия RSEPí слзи?Ита.рШ\ 1, рИК П,рЬ*К I - экспериментально п«б«Я!>емн0 ялазаош. Обозначен ля сайтов ззяаваьяя ая-дон^клгаа: с - CÏ&1; Е - Fcc'il; mi - nine XI; В - Ban Hl; S Said; rv - Prall; 3g ~ Egl XII

Плазмадк. выделенные из этих клоноз, были обозначены: рМК I; рМК I (X); рЫХ I (2); рЖ П; рМК Ш и рШС I .Их размерыопределенные по контурным длинам, составили: 7,0^0,5 т.п.н.; 6,9^0,5 т.п.н.; 7,2ip,5 т.п.н.; В,6д0,8 т.п.н.; 8,6^0,8 т.п.н.; 11,&±0,5 т.п.н., соответственно.

Размер клонированная фрагментов, определенный по разности контурных длин вектора рНС 79 в реко.мбкнаатных плазмкд, составил: в пяэзмпдах серии рШМ - 600 т.п.н., а рШ П и рМК Ш - 2200 п.н. Н s pus I - 5500 'л.н.

Следовало ожидать, что в результате клонирования должны быть отобраны реко-йбЕнантвыо плазмиды с" размером 7,5 т.п.в. (рНС 79 + вставка 1Д т.п.н.) (рис. 2).

Однако, срздп одобрачных клонов не было одного с плазмл-дой озидае»лого рагмзра, что позволяло нам сделать предположение о структурной нестабильности рекоыбинантных плазмад, содераащнх Ш B.pertuaals.

2. Анализ структуры рекомбинеитных плаамид На следующем этапе исследования был проведен подробный анализ структуры рексмбйнанглых плазиид р!.5С I, рМК П, рМК 13 а рНК I.

В результате рестракцг.онкого анализа JUIK рэкоыбцнантпих лжазнзд.гпбрадвзация фрагментов рестрикции с ДНК-зоадом I, а такие анализа гегеродуплзкоов рМК I я рШ П.а рМК I х рНО 79 было показало, что плазипды серая р*.!К I твззт по одному сайту узнава-Вий рестрактазц Bind, ill ; 2 сайта эндокуклеазы Pat I и 2 -C1& I и Sale I $ плагмзд рМК П и р?,!К И в по одному у плазмад рШ I. УстЕлезлано, что пдазмадн серн:: р«йС I содержат последова-теяькоа^ хроиосога Б.pertussis размеров - 600 т.п.н., являю-цувол часть s> Ш, х:лоаЕрозк:;;ой в рМК II, которая когда образоваться в результате еа распыления экдонуклеазой si в процессе кло-

пироваяня или делегирования частя Ш.

Сойоставлзгша результатов рестрякшзонного анализа плазшд рМЕСП а рНС 79 (эндонуклчазеш EcoR I, Pat I, SalO i, Cía i, Bgl и), а также их срашанйе с пойюиьо m то да гетеродуплексного анализа позволяло определять положение вставка и координаты сайтов рестрикции на Фйзпчеокой карге рШ П, которая представлена на рво.З. Из рис. ЗВ видно, что на правом фланге ПП хромосомы B.pertuasia расположены оайтн узнавания рестрвктаз cía i я SalO 3 . Располагай этих сайтов дает основание предположить, что фрагмент размером - Ï т.п.н., обозначенный нага ese? i, гомологичен последовательности R3I , рзкое охарактеризованной v?. Mo. Pheat et al. (1989). Оставшаяся'часть клонированной последовательности обозначена Ж (рис. ЗВ).

Для того, чгобУ изучать структуру клонированного фрагмента и

убЭДЙТЬСЯ 3 ТОМ, ЧТО КЛОаПрОВаНа ИШШО ПП ЗфОШСОМЫ B.partussio

üchaaa I, было провеяойа яабрвдвзапня частей этой последовательности с XpoitocoMKJH B.portuesis lohßaa I и E.coli.

' - - ' "

Для этого приготовил® ШК-асщш, содорзапие Pat i-Hind in я Pat i-SalQ I ' фраташта рестрвэдка клонированной последовательности, которкэ бияя ЕсПойЬ8ов£Ш в спитая по гпбрэдэзаашз с ola I фрагшитйм реегримш хроглс«» #>рдетелл я е.coli, фрагмент рзстрЕШйк Put 1-3aiö X ôo.tiapasî ПП п гпбрадппуется только с хромосомой B.pcrîraasia . . рзепредэлошя и чгсло ПОЛОО ГПбрЗДйЗШПП ССЕПа^Ю О ОВМаШШЗ ÏÏ.If-o Phaat et al. (1989) •ДЛЯ ЕЗ эл^зитов xpt?.tccc'.rj O.peïîitr.Cla.

Ляя устоновлоийя прпрдеп псс л-злсззгальностл, условно нарзанной пса ЕЕ, MüíCesst&fl й £ЗГ? 1, б:ш проведено гибридизация

(

ДНК-эояда, содергэсзго э?у аосяедсаетэжпооть с яромосомгтя dop-

дсэлл я в.воН. . Результата габбняязетшз показала, что ДШ-гокд

- к -

но гкбрцдязузтся о ДНК хрогосом в .pertussis, ко содержит послэ-до^атольпостг., хс^олохгтауд фрагменту хромосома Б.coli ..Таким образом, Hind. III - Pst I фрагмент плазмяда рМК П, обозначенной Е I, не принадлежи? хромосоме в.per tus sin ,, во содержгоя в одной копия 2 хро:.:эсог;е в.coli . Из представленного zóiü овгеэ-нйк процедур!; клошгюзальл ГШ хрошеома E.psrtuasic- следует, что сяучайаоэ совыейеназ фрагментов хроиосш B.coli и Espertaseis пзклшено. îlosïoï.-.y козою било предг.0ловить,, чта ка эддоа еэ этшоз {1орцяроаакая реаяккока рКК П проязошка- гаг А-незавяоя-кая рвгокЗяпяш «езду кязскадой, оодераз!зЁ Ш хроаосо&з ©.pertussis, и хро?лосо«э2 ДНК s.coli.

Результата рзстрпхцнонкого анализа плэзмядной ДНК рНК 1 и ее гибридизация с ДНК-зондом I, содержать взв? I последовательности и последовательность:) гена Ыа (Kind их фрагмент pBR-322), а такяе анализ гетерздуялексоз рКК 1 х рНС79, ргтк 1 д p'S П поззолзяз определять структуру плагиаш рКЕ 1 . IIa pas. 3G вядао, что ДНК pïîs I не содзрздг сгйгов уснавзния андонукгз-аз ы.пй m к Еаа m , a caïiïH Иг. I я Sala I удякальнк. Б состав алазвдш взадаг два урагмзятг вектора рЗС7Э. pasaapoa 5,5 т.п.в., рзздехздике поодздоватедьиосгй» кзп?1 ; часть вег~ тора гЛС?9, содер&адая Ilitiü. III , t'ai Gl , Ecu: Ж сайты s ген ici утрачена, Kl? 1 отсутствует ь сайта кдоанрезеная. Суллзруд результата посдедовгшя структурной органйзациз рэ-

клазжд, к-здгш едздать едздузгш-з внзока: а) все рзкоьзблязнхпьг' vzzxzsíri сод^рдат ПП, юлгологЕчнуз.

0хгфсхтерд20вад|;£гл Ы эдзментам Е.pertussis; tí) не било сбдадазпо клзпеа, содсрлддл: реге&гбяпаатнуэ кдаз^ад?, одгдазкзЕ структура- {Hi , рзз^эром - I..I T.íl Л1., £2sЦМРСЖ^Т? T¡ КМ;4 Тт1 cqüTo, йзктора гДО «то евд-

д.атт-ъатвуэт о нзстабзльпоста структур к рЖ"Х".

Пр?датазленпыз дека» могут свидетельствовать о том, что,по крайглй мэре рекогйпяапгпуа плззмпдц р1Я П л рКК X предотозягит собой продукт сегрегация родительской плсг:с?дц (ряс. 3).

Пламзда ?Г2Г i образовалась, по-задглсму, в еззг'з.тато дуплскаппп фрапгаагг рНС 79, включающего Ма rea, »дзцая гена tet а переЫ9Цонля HSSP I элемента в повнй сайт яя?егр2цзя. Внуг-ряггпомяпз перестройка в плгг?ладе pits I стгауляруютоя клонпро-векаой ПЛ.

Относительно Сгорпзровапгя пдаг.'ддц pi.SC II rsrsio одега» пред-хголоззш», что сна сфотмлрогалзеь г. р-ззул-гаго Rea л независимой рекокбявдяя, стякуларусггаЗ нзе? i , 'кззду рэдвтолт>о?.еЯ ллазкПчОй (c'T'I") и хрсмосожЗ ü.coli . Еоатсгаость ьзг.эго .-'2-яанвг-ма тор-проз шпл рекембянштаих алзеглад гэгко допустить, осла ЕЗЕ? I является is элэ;.:сн?ом.

Длг ироверкя денного нредпологенит б;гз пзучога слсеебзсчгг» клояяровешой ШЬк »«зкпомкоЗ транспоетпз, точкоку я петта юркому шишчгшяэ.

3. .Вшучленяз п глалчз ауксоур.е'тпе ?ту?г~г~"Ч п_^тгг" . в.coli, corsptsanax секо?;бггЬп?чг-з 'ллаг'здн

Гола P.S3? з способен к Morxencvito:! гггпкаозгат!, ус:?™ баю озпдзть, что с определенной i?.ctotoü сз -йудег з

генн :rp3"oco:rj 2.coli , огнзтотзйппз за гзс:"2эгдсм 6:иа ной клзтка. Чтобн прозорз-гь это UK.\w!OZt}::v~:ry« a .'«.часа?:», что частота rjytßuaä зндтцпруг'тг« Г3£? 2 :тз о? глру;;-:^:»,

сояер'л^З aro яласмяда з ззшшка'пяоге crjcrt?, г ;1z».tí струярсзаны ногзз2сг?Д!з птап«, иогоргэ о?.т;-:п.';по~ не только хромосомами, но вакторрги с г:;;-глгг I

ЕОБотальностьо.

Текпу обрагэы, нбин было получены тшв: НВ IOJ/рИС 79; КБ IOI/рИК П; 23, I blue/рЖ II; НВ IOl/рШ I; JU 109/рЖ Г в серая втамшв, содержьщых ES ЕР Г в составе вектора pBS+: ш ъ1ив/рВЗ+; Hil blua/pKS 2; ЕВ 101/рКК 2; «Ш 109/рКК 2.

Ё результате проз еденного еколершзонта было показано, что частота возпЕкновеппя аукоотрофов во всех стсюлах достигает уровня Ю-4- I0"3 не одну етзнейпособзув яязтку. В то время как в контра льних птаюшх,' неоувдх только ввкюрнЕЗ плагшиш, ауксэтрофике мутанты не обнаружена.

Предзтавлонаыз даншэ овЕдетельрЕаузат о тоы, что опособноогь образовывать аухоотрофп не гавпоат от хрошеогш клетка хозяина я вектора» в котором шшровш bsep 1 .

' Такса образов, еолз везншювенне ауксо?рс$яых иутантов связано с гранслозкцЕей езер i аз плазшиш в. хромоооиу е. с oil , то в еяалазвруейой сшгзыа aro? процеоо не завиовт os= структуры векторной ДНК а хрошеоиного генома.

4. Обнаружение последовательноста rsb? I в хРо?.:эсо?ле gyxcorpofeoro мутанта

дет того, чтобц подтвердить правильность вюода о sea, 4ío образовенве ауксотрофннх мутантов вызвано вмедраялем R3E? I в хрокосому к.с oil » была проведена габрядязащм ДШК-зонда 4 (Pot i-SaiG-pis: ii) о cíe. i, SaiG ^р&гкснта5да рестрикики хрота-sos.¡i¡ ауксотро$погс ь'утезта .НВ IOI^bk i . ,,

1Ьслодуеьга5 аукеэ*$ос£яы1 мутант получен из кзтаглма Е. coll НВ 101» НЕсузэго пдазшщу рЖ I , поэтому естественно било ояэдегь, что виделэкная наш пяазмада не будет, отличаться о? рЖ I. Однако, зто доауазнае кообходжэ было проверять. С этой

Ряс. 4 Радиоавтограф, полученной в результата Сауззрч-гкорщшзаздл.

а - / р32 / (Pst I - Sale I) - Зрагкек

pi,® П (зонда 6} о фрагмзнтаыл расвдпло.

ДНК хрошооми ауксотрофюго кутснта В.-

HB IOI/pKK X эядоиуклзазами Gin г (А.

SßlG I (Вг) ;

d - / р32 / - рКС 19 о фрягглентя?зд рас цзплэнзя ДНК хромосомы В.coli HB ÎOl/pï эвдсиуклзвзамя eis. I (), SaiG (Eg); па расунно цнфрама указаны ряоглеры ыар-îtepHur йрагмен-тоз (т.п.к.). Гвбридизаш зонда 2 п рЙС 19 с фрагментами ргсщзплс язя ДНК .тро.'.госсш стачка з.еоН из Ю1 se ос5япгулоно.

целью ДНК рзкомбгяаяотой влг^мадв вэ аунсогрсфюго мугел?а ИВ 10 pHic I пкдолена в градяекте Си Gl и охарактеризована с помошъа рв.стрйкцаоотого п гетародуалагссного «наказов. Боаыгвкагво ковзй плазмпдной ДНК Ь»лв разюр ~ 11,5 т.п.я. (по дезякл эл-тгроя-ной мякроскопад)'. равннЗ pas?«эру г>зг I „ по около Ijà ?я.-с::ул яма ля размер - 17 т.п.н. ГокзллеЯЕэ пгзглшдпой IHK эзг,е::ухлэа-ззкз реотрзвдяа ¿зле I л Cla ï позволял» зшвяга фрапжпи размером 11,5 Т.Я.И. а шюрауэ sohj » обяаотз, соотааюта-рнза Çpai тагу 5,5 г.п.н. Влот-гзврадзаацпя ЛШС с зоадом 2(aai-ß3ioi p'fK П) полагала, что оба gparaoi» солортпг участка si? i,хотя яптчяонвяоета оагаага Л'л зь^зааго ¡¡рспзапта зпачзтз.тгл:» Оба Срягманга гябрадяссзалгоь о JHEC рш 322, содотазгл.1? г-а

Таким образом, лсяулядвд влакждаоЯ Z51K, зщзлзшгоЗ га хаз-ток еуяеотр®$аого иутешсэ ИВ IOI/pSS X содоргз?, пст::."о .ШГл ряк I, около ^„молекул пяасиаянух IHK, neojnjn: в cbostî сэотгпв два копая азвр z раопояяеааах друг о? друга на раас«зяй.?ш-.5-,5

— J.O —

• *

т.п.ц. Б результате гсмодулхахсното пяалкза было показано, что копия Iffi находятся в прямой сриентааза.

С1

Иг, рис. 4 лрэдсп-авленн результаты блог-Гйбрддязаппя ДНК-зонда 6 е cla ï я Salo I фрагментом тотальной ДНК ее ауксотрсфяо-ío ¿лутакта НВ 101/рЖ I . Учятдаач ЕкгзизлоЕанное, ыозкно зак-елвзъ, что гвбрадвзашзя tpaiaeaios -12 т.н.н. я - 5,5 т.п.н. обусловлена влэзгдщдаой ДНК, тогда как гябрндязацяя (Храгкзнтов 8,5 т.п.н. а 4,8 т.п.н. (рестрикция s&lG I ) к 7,5 т.п.н. и 1,6 т.п.к. (рестрикция clu ï ) связана g яялпчес?.; в хрсьюсоые участке:.; , гсмологзчнш: I . Повторна!. гибридизецвя фильтра с меченной 32Р ДЕК рБГс 322 выявила только две полосы г-нбрвдязапий, срокзетствуэдс 11,5 т.п.н. в 5,5 т.п.н. Как следует

из предыдущего взлолення, эта полосы, вероятно, обусловлены габ-рядпзацией с плавадрой ДКК.

Таким образом, хромосома ауксотрофаого кутаита ííB 101,' в от-лкчяе от хрокосога b'.coli НВ 101, содержит, по крайней мере, одну колею RSE? i . Следовательно, нарушение питательной потреб-воети клеток связано» но-вщдаому, с интеграцией RSB? I элемента, ко не ялазмидн плд еа части.

Полученвыз в ssra разделе результаты доказывают яалвчиз элемента в хромосоме ауясотрофного мутанта 1Ш 101/рше 1 и сви-дйтелъспзуют о транапоэяпии RSKP 1.кааду геи о мамя.

5. Идентифахапяя вариантов в клетках E.coli,

содержащих кляшроввниую последовательность RSHP i

2 'loo (Tn 10)

Для расаяреняя сведенк£ о воз^тохкости nssB I элемента к мак-геномной. транспезщип папа была изучена его способность, транспо-апроваться «саду пяагаяшаня.. Для этого был осуществлен поиск

- 19 -

. Si.

lac" мутоптсз в cnoKUß, которая предстазляет собой клоткн 13. coli,- ПЗСуТСЙС рЗ"омЗппглтлкз ПЛЗЕИЭДП О RS BP Г ЭЛЙГЗЯТОМ я копь-юготгпнуз ?' фаэтор, содер'£агз)й las оаероя.

В случпа грзпспозяцлп RS3P I ялежктз в состав lie oncpo.'ía о озрэдэленкс2 чзототоЗ доязии зоанкать lea" кяспн.

Как показал зкепертаеят, частота Еозшжюзакзя 1ас~ ;слсиоз достагазт зрошя 10"'"- на одну плзкоспособную клетку s сравнима с частотой образования ауксотросгнах мутентов.

Б контрольной а?аш:э, яссущзм только.?' , выдзлзть 1га~ нло-псэ аз удаэтея. *

Получзннке дакппэ нозодтаг арэдпогозять, что обрагезелпо lac" вариантов так на обускозгзно аорзаекшасл hse? i гзиома яеяопьэгогзгпой аласяиш n Isa саорза a'gswoja. .

Та.хп.1 образе:.!, йЗГР I еяееойзя, ао-вдаюау, дор^:лсгд?1.ся . но только па nsaœqsnoro renoua а Х5сиоооку s.coii , но а по пдэзмпды в алаг:.зду.

G. ОпрздедаиЕз частота cdpagoasara рзвессай •

Ec¡) ОДЗК*1 C303052KJ !ÎS ЭЕйЗЯЗВЗ ЯЛХ'ТОССЯ ах CE0SC¿H0,2'?5 к

поотаатогрзяаошс-'ду пцрзегзпэ (srarcij aia зсяа топои? ;:г::гл-ченЕэ), зсязлствлз чэгэ ссгаэ „аолтео

фухшцзЗ ктззкрг-'зггпг: ¡S3 эггигзггзя гахоз.

Длч тэл», 42ÜÖU ошяшта зезрез, enesoefen яз нн I эл.-»:;:« к точному гоззяченаэ. бш apealen яояоз яро?згрс£п л вертянтов л птгктх ayitcorpcrnísc г^гглезз. iiczo:t poaspv''-'1*-- sto» водллс: з саосзвто-гззя со ссгндзр?::о2 ':3"io.tní»x1 (£г-:гр/1ЛЗЗ).

ух нг-зезэл в жгл/т-: i;-v::3is"i-po-¿tíп 1-у" с-,/™

тсятеп о частотой ТО"4' обрззгэгел ар-ку^с?-: a li?'1* '

ооотагтомзЕао'.

Полученные результата даст основание предположить, что rss? 1 способен к точпоцу асклэтенаа аз родительского генома с восста-iíовленкем структуры и функции днактлвироваипых генов.

7» Анализ аукоотрофнюс мутантов, лпиенннх коааа hsbp i

Для некоторых RS -злемзнтов показано, что на одной из стадий аск/диеншг происходи? утраха практически всей последовательности элемента за псклвченнеи нескольких десятков пуклеотпдов. Структура мутащного гена прп этой не восстанавливается (нозз et al., 1979). Этг> стадия получала название почта точного исключения.

Для проверки спозобности rsbp I к ПТИ, проведен поиск ауксо-тро^'шх мутантов, утратавшх копив rsbp I , но рзвергирующдх к прототро^ности.

Такой аукоотро^ный мутант (HBIOI-Ill) получен в результате вытеснения резидентной ДНК рЖ I с по?,:оцьэ суперанфицирующей плаз-

i

«иди pRK 2013, которая относится к одной с рНК I группе несов-ыесттаоста. В результате габридизвцхш не обнаружено копая rsbp 1 в хромосоме ауксотрофного мутанта. Таким образов, в процессе-культЕвароаааия клеток произошла потеря R3EP1 из хромосомы ауксо-тройного иутаята, но структура мутантяого гена не восстановилась.

Ауксотро$ннй мутант KB 101-Ш способен реверсировать к ПрОТО-

^е

трзфаоств с такой яе частотой (10 ) гаккэ, как и ауксотрофные ¡лутанта - НЗ IOI/рШС I . НБ 101/рШ П a JM 109/рКК 2. Этот факт указывает на го, что, по-ВЕДЕ?.5о;лу, реверсии к прототро^носта ауксотрофных мутантов могут происходить через две стадии - ПТИ ese? i с поолсдуоЕШ точекл исклшениеы его часта из хромосомы В.coli.

Определение вялоспепп^чностя клонированной Ш

ХРОМОСОМЫ B.pertuasia

В качестве вадоспеИй<£ячзской может бить выбрана любая последовательность, присутствующая в хромосома всех ита?лмов B.portua-а±а п отоутотвуйиал а хрс!'030!'э других видов Bordstaila. Для проверки аидовпецйфз'шоота кяшарезвмой Ш Хромосомы B.pertuaale

14

проведена гибридизация темной V Ш с хромосомаш 15 лабораторных П йШШЧеСКИХ иташов B.partUSJBin} 5-ТИ - В.bronchisoptica В 2-й B.porapertuosis, а такге 3-Х ПТЭМЙОВ П.coli, '/.cholara, У. pooudotubsroüleaia, Brucella (табл. I). ДНК-зонд, содеряашзй ПП, гпбрядизовался только с хрошсомамп штаммов в. portu3aio. Штаммовых различий в картине гдбрпдлзацпя не выявлено. Аналогичные результаты была получены прл гибридизация in aitu меченной 32р Ш с колониями анализируемых культур.

Таким образом, использование ПП хро?иосомы B.portucsia в качестве молекулярного ДНК-зонда позволяет осуществлять вкдоспецп-фическув идентификация возбудителя коклюша.

2Ю0ДУ

*

1. Йнвертирозанная повторявшаяся последовательность хромосомы B.pertuaaia клоннровайз в составе вектора рНС 79.

2. Клонированная bsbp i последовательность стшулкрует образованна внутрпгеаомннх переотроек типа да лоций я дуллшеазп'! рексглбшгаятных плаамяд.

3. ПэреметеНЕЗ RSBP I из рекомбняаатаой алазмадк а хсогсзЗ-

му хозяина и коньвгатлвную плазмиду l&c (Тп Ю) сопрсзог.-

—''

Дается етвдукцией .ауксотро|ннх я lao мутантов о частотой 10 ~ -способных я реверсии к прототрофяоетп с частотой Ю--0.*""

4. Чеотота транспозиция нзв? I элеюнга к© еэвисвт от структура, садсргсадоИ его плазияды я хроиосокново геноиз птагдла-хозян-па.

Б. Частота uozreiwmoií трансловЕЦяя кзер I схетнта а итам-шх и.coli, содергшщах плае:,:яды ршс I п piü£ Е, не зависит от последовательностей ДЕК донорокото сайта.

G. ШсердЕОНнан последовательвость ese? i способна к точному пеклэтанвв из сайта днтегрэака.

7. Кспояьзоззяяе повторяющаяся послсдовьтольксзти B.portuc-eis ESEP I в качестве кол^гуллркого зонда позволяет осуществлять ЕВДоспенвфнчесЕуа иденкфиссяЕв БОЕоудатзля коклзаа.

СШИОН РАБОТ, ШУБШОВШШ ПО IBS В'ССНРЩИИ

1. Каратаев Г Л)'., Нечаева В.В., Шунаков В.Л., Волгина Т.Н., Ланэеза 1I.Ä. Структуряш ссобеяноста участков ДНК. содерхацих tíт я Ъох гени E.psrtußsio. // Тез. 2-ой Воесоазн, кояф. по бахтеряасьяшг токоЕнеы, г. Юрмала, май, 1989.

2. Волгина Т.К., Нечаева Е.В., Ыоткн В.Л., Кириллов М.Ю., Каратаев Г.И., Л&яаева H.A. Магрщузизяе генетические элементы бор^ятелл. юг роль в изменчивости а р-згудяняи внрулзнтнсетя. // Тез. "Материалы региональной научи.-яракт. ксяф. оиаарянгологов я раодаренанЁ Елену:.! РНОЖЗ", Крхуток, 20-21 шш I9S0 г. -

С .176-177. .

3. Кириллов U.a., Кератезз T.IL, Нечаева Е.В., Болтина Т.Н., Лги&зва И.А. Струг.турнш особенности участков ДНК, сояеряащвх vir я toz гены B.pcrtuoeio // Тез. Всесоюзной школн-семянара ".олзкудчркая биология к i.&bkiiehs" . - П., 1990. - С.38.

4. Волгина Т.Н., Киряллзв .'¡.П., Шу;;к;оз О.Л., Нечаева Ч.В., Лакаеза К .А., Каратаев Г.И. Нсвчй юбкльнкй эламзкт В. pertussis.

// Таз. Всесоюзной Екояы-сеипнара "Иолекулярлвя биология п ?кдя-цшю". - М., 1990. - С.39.

5. Каратаев Г.И., Шунсаев В.Д.,. Кириллов МЛЭ., Полгппп ?.!Г., Лапаеза И.А. Сгруктуршя организация учоатка аригозегм в.раг1ия-э!а, содсрзгтазго -/1г гея 'В.рег$им1я // Молекулярная гснеигса, мпхсроб;:о;:огяя я вирусология. - 1930. 12. - С.¡¿у-32. .

6. Нечаева Б.В., Волгина Т.П., Кириллов гё.Э., Шумаков Ю.Л., Каратаев Г.И. Мобильный элвшгг в.рог*иап1з - КЗ И? I' // !.!оязку-ляряая гзетпха, ивкробяояоия п зпруоологгя.' - 1350. - й 12. -С.22-27. . -

7. Почасна Т?.В., Волгпяа Т.Н., Кгряллоз-М.Ю., Каратаев Г.II. Свойства • ш эязгэнта хромосома В.регйша1э // Тез. П Воесояз-яого сЕШозаума "Теорзпгсоакгэ и ярзяладииз аспекта козпуллрго!! бяологяа". - Самарканд, 1СЭ1, - С.146.

0тггеяа7гн з талоградза ШП.'БМ пи.Н.З.Гг^гаел

Зек« ПЗ, ткраи 100, швдшозя в нетагх, I5.0S.I933 г.