Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сворачивание тРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Серебров, Виктор Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Роль Mg2+ и других катионов в формировании нативной структуры тРНК.

1.1. Связывание катионов с тРНК.

1.2. Координация Mg в трехмерной структуре тРНК.

1.3. Структурные эффекты при связывании Mg2+ с тРНК.

Глава 2. Влияние минорных нуклеотидов на конформацию и функции тРНК

2.1. Акцепторная функция тРНК.

2.2. Адапторная функция тРНК.

2.3. Конформация тРНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Материалы и методы, использованные для получения препаратов тРНК.

3.1.1. Выделение и очистка тРНК.

3.1.2. Получение тРНК транскрипцией in vitro.

3.1.3. Введение флуоресцентных меток в тРНК.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Метод остановленного потока.

3.2.2. Измерение радиусов Стокса тРНК методом гель-фильтрации.

3.2.3. Спектроскопия УФ и КД.

3.2.4. Температурное плавление тРНК.

3.2.5. Флуоресцентная спектроскопия.-.

3.2.6. Измерения связывания Mg2+ с тРНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сворачивание тРНК"

Актуальность проблемы. Одним из фундаментальных свойств линейных молекул биополимеров является их способность сворачиваться в трехмерные структуры, эффективные в процессах молекулярного узнавания и катализа. При этом пространственная структура, которая образуется в результате сворачивания, полностью определяется первичной структурой биополимера. Изучение принципов, по которым происходит реализация записанной в первичной структуре информации о пространственном строении биополимера необходимо для понимания процессов, протекающих в клетке, и возможное^ в дальнейшем влиять на эти процессы l желаемом направлении.

В настоящее время термин «сворачивание» (folding) в отношении РНК и белков принято относить как к описанию пространственной структуры равновесной нативной формы макромолекулы, так и к последовательности событий при ее образовании из развернутой цепи, образующейся в результате биосинтеза в клетке. Соответственно, изучение сворачивания макромолекул, в частности тРНК, идет в двух направлениях: установление трехмерной структуры и ее равновесных переходов (термодинамический подход) и выявление промежуточных неравновесных этапов сворачивания (кинетический подход). Для понимания механизма и закономерностей сворачивания важны оба аспекта, поскольку они совместно определяют результат сворачивания.

Несмотря на то, что основной интерес исследователей уже долгое время сосредоточен на сворачивании белков, как эффективных катализаторов и регуляторов клеточных процессов, а также важнейших структурных элементов клетки, сворачивание РНК в последнее время приобретает все больший интерес. Прежде всего, это связано с открытием каталитической функции РНК, которая в сочетании с широкими t возможностями отбора in vitro и амплификации представляет большое научное и практическое значение. Кроме того, учитывая ключевую роль РНК в биосинтезе белков и в других процессах, изучение сворачивания РНК тесно связано с проблемой РНК-белкового узнавания и обеспечения высокой точности перевода генетической информации в структуры белков.

В отличие от белков, абсолютным условием существования нативной структуры РНК является присутствие катионов металлов, преимущественно ионов Mg2+, и таким образом исследования сворачивание РНК тесно связаны с изучен;*?!.; связывания Mg2+ и его роли ъ формировании пространственной структуры РНК. Наиболее изученными, с точки зрения структуры и функции, адпяются транспортные РНК, исследоьарпз которых продолжается уже несколько десятилетий. В последние годы, с увеличением числа расшифрованных структур РНК и в результате исследования механизма функционирования рибозимов достигнут большой прогресс в понимании вклада ионов металлов в формирование активной конформации РНК. Все же, несмотря на все увеличивающийся обьем данных о структуре разнообразных РНК и их фрагментов, на сегодняшний день тРНК остаются наиболее изученным семейством РНК, для которых доступны как рентгеновские структуры в кристаллах, так и данные о структуре и конформации в растворе. Поэтому использование тРНК для изучения сворачивания РНК позволяет сочетать результаты более ранних работ с новыми данными. Несмотря на свой малый размер, молекулы тРНК содержат все известные сегодня типы третичных взаимодействий РНК, за исключением псевдоузла. Дополнительный интерес представляет то обстоятельство, что тРНК, в отличие от всех других известных тРНК, содержат множество разных минорных оснований, составляющих в некоторых тРНК до 1Л от всех нуклеотидов, что вносит новые элементы в их трехмерную структуру и стабильность.

Цели работы. В ходе работы ставились следующие задачи:

1. Сравнительное изучение структуры и стабильности зрелой тРНК и транскрипта ее гена, не содержащего минорных оснований, с целью выявления роли минорных оснований в формировании структуры.

2. Исследование сворачивания тРНК, индуцированного ионами М§. Установление механизма сворачивания в терминах элементарных кинетических этапов и поиск интермедиатов сворачивания.

Научная новизна и практическая значимость. Используя ковалентао присоединенные флуоресцентные метки было впервые продемонстрировано, что при связывании тРНК последовательно претерпевает 4 конформационных перехода. Показано, что два из них не сопровождаются изменением числа пар оснований и относятся к чисто конформационным. На основе кинетических экспериментов определены временные параметры для отдельных этапов формирования нативной структуры. Выявлено присутствие альтернативной конформации тРНК, которая по-видимому имеет вторичную структуру, отличную от «клеверного листа». Эта конформация обуславливает существование параллельного пути сворачивания в нативную конформацию при добавлении Показана значительная стабилизация альтернативной конформация при связывании ионов М§ , что приводит к повышению энергии активации ее перехода в нативную форму и кинетическому затормаживанию этого процесса.

Для тРНК№е из Е. соН и транскрипта ее гена показано влияние минорных

2+ оснований на стабильность структуры и связывание М^ . Продемонстрировано, что присутствие миноров значительно повышает стабильность третичной структуры тРНК и сродство М^2+-связывающих центров. На основе ряда подходов были сделаны выводы о степени влияния минорных нуклеотидов на компактность и конформацию тРНК, а также на механизм Мд2+-индуцированного сворачивания. Показано, что высокая концентрация мё2+ способна компенсировать отсутствие минорных нуклеотидов в молекуле транскрипта.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Изучение пространственной структуры молекул тРНК в растворе началось задолго до того, как в 1965 г. была расшифрована первая нуклеотидная последовательность тРНК Holley et al, 1965). Наряду с чисто физическими подходами (спектроскопия УФ, КД и ЯМР, калориметрия, флуоресценция минорных оснований тРНК и искуственно введенных меток., гидродинамические методы и т. д.) широко использовали также химические и биохимические методы, такие как метод химических модификаций, изучение чувствительности тРНК к гидролизу различными нуклеазами, фото- и химические сшивки (Киселев и др., 1984). Позднее к этим методам дебязили эффективные средства генной инженерии, позволяющей осуществлять сайт-направленный мутагенез молекулы тРНК, что сделало возможным проводить систематические исследования связи первичной структуры макромолекулы с ее функцией и трехмерной структурой. Однако, достаточно полные данные по структуре тРНК были получены только в середине 70-х годов после расшифровки рентгенограмм кристаллов дрожжевой тРНКРЬе (Kim et al., 1973; Klug et al., 1974). Кроме последней, с достаточно высоким разрешением (3 ?) на сегодняшний день расшифровано строение дрожжевых тРНКД5р (Westhof et al., 1985) и тРНК™61 (Bassavappa & Sigler, 1991). Были получены кристаллы и других индивидуальных тРНК (тРНКШе1 из Е. coli (Woo et al., 1980) и тРНК01у из дрожжей (Wright et al., 1979)), однако достигнутое разрешение в этих случаях не превысило 3,5-4,0 А, что недостаточно для анализа особенностей пространственной структуры этих тРНК. Рентгеноструктурные модели в целом подтвердили правильность представлений о вторичной и третичной структурах тРНК, вынесенных из результатов работ по исследованию тРНК в растворе. Многие данные указывают на то, что по-видимому возможные изменения конформации тРНК в кристалле по сравнению с ее конформацией в растворе незначительны, и полученные рентгеноструктурные модели адекватно описывают нативную структуру тРНК (Kim, 1978). Сравнение имеющихся рентгеноструктурных данных показало большое сходство между тРНК разной аминокислотной специфичности. Это дает возможность переносить многие из выводов, полученных для индивидуальной тРНК, на все семейство транспортных РНК.

Как уже было отмечено, исследование сворачивания макромолекул, в частности тРНК, состоит из двух подходов: изучение равновесных структурных переходов и исследование кинетики образования нативной структуры. Несмотря на то, что из всех существующих методов исследования структуры рентгеноструктурный анализ наиболее информативен, его применение ограничивается анализом структуры 1\А?лромодекуяы в ограниченном и далеком от физиологического диапазоне условий. Поэтому для исследования динамики и сворачивания РНК в растворе перечисленные выше подходы сохраняют свое значение. Кроме того, при исследовании кинетики конформационных переходов структуры набор средств, находящийся в распоряжении исследователей сильно сужается, поскольку для многих методов имеется ограничение по времени измерения. Таким образом, проблема сворачивания РНК является более сложной, чем установление равновесной структуры молекулы. В следующей главе будут рассмотрены как равновесные, так и кинетические подходы к проблеме сворачивания тРНК и результаты этих исследований. Особое внимание будет уделено роли катионов металлов в формировании нативной структуры РНК.

Во второй части обзора литературы будут рассмотрены результаты изучения влияния минорных нуклеотидов конформацию и функциональную активность тРНК. Давно известно, что тРНК содержит многочисленные минорные основания, около половины которых находится в положениях, занятых в третичных взаимодействиях. Таким образом, они могут напрямую влиять на структурную стабильность и конформацию тРНК. Для структурно-функциональных исследований тРНК широко применяют метод транскрипции in vitro, недостатком которого является полное отсутствие минорных оснований в молекуле транскрипта. Учитывая, что удаление миноров может приводить к серьезным искажениям структуры и мешать узнаванию тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами и другими клеточными компонентами, исследование структурной роли модифицированных нуклеогидов вызывает значительный интерес.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Серебров, Виктор Юрьевич

выводы

1. При низкой ионной силе и в отсутствие ионов тРНК существует в двух конформациях. Основная конформация, имеющая каноническую вторичную структуру «клеверный лист», находится в равновесии с альтернативной конформацией, вторичная структура которой не соответствует «клеверному листу».

2. Ионы индуцируют параллельное превращение обеих форм тРНК в нативную форму. Основная конформация переходит в нативную форму по быстрому пути, тогда как альтернативная - по медленному.

3. Низкая скорость превращения альтернативной формы тРНК в нативную форму обусловлена стабилизацией ее специфической структуры при связывании ионов М§24, что приводит ¥ значительному повышению энергии активации процесса сворачивания.

4. При увеличении концентрации дрожжевая тРНКРЬе претерпевает четыре последовательных конформационных перехода, регистрируемых по изменению флуоресценции ковалентно пришитых меток. Два перехода при миллимолярных . концентрациях М§ (2 и 20 мМ) не сопровождаются изменением числа спаренных оснований и относятся к истинно конформационным.

5. По данным нуклеазного зондирования структуры конформационный переход при 2 мМ связан с изменением конформация двуспиральных участков молекулы и усилением стэкинг-взаимодействий между основаниями тРНК, что может соответствовать переходу в наиболее компактную и жесткую конформацию, близкую к конформации тРНК in vivo. Переходы I и II при 4 и 16 |дМ Mg2+ соответствуют двум этапам формирования третичной структуры и пар оснований D-петли.

6. Для тРНКРЬе из Е. coli и транскркпта ее гена показано влияние минорных нуклеотидов на стабильность структуры и связывание Mg2+. Отсутствие миноров приводит к значительному ослаблению третичной структуры и сродства ионов Mg2+ к связывающим центрам тРНК. При этом не происходит изменения механизма формирования нативной структуры при связывании Mg2+ и характера этого связывания.

7. Высокая концентрация М^2+ способна компенсировать отсутствие миноров, и при миллимолярной концентрации М§2+ транскрипт находится в нативной конформации тРНК.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям Л. Л. Киселеву и Л. Ю. Фроловой за постоянную помощь и поддержку; всей группе Физики белка Института белка за помощь в выполнение работы; профессору X. Гроссу и доктору Р. Кларку за финансовую поддержку и возможность работать в их лабораториях; К. Василенко за сотрудничество и дискуссии; Е. Гупало за помощь в написании статей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Серебров, Виктор Юрьевич, Москва

1. Киселев JI. JI., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК. М.: Наука, 1984. - 408с.

2. Aoyama, Н. (1990) Spermine stimulates the threonvl-tRNA formation in rat liver, Chem. Biol Interact., 74, 33-43.

3. Beier, H. and Gross, H. J. (1991) Sequence analysis of RNA. In Essential Molecular Biology -A Practical Approach (T. A. Brown, Ed.), vol. 2, pp. 221-236, IRL Press, Oxford, New York, Tokyo.

4. Bjork G. (1995) In tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function. Eds. Soli D., RajBhandary U., ASM Press, pp. 165-206.

5. Cole, P. E. and Crothers, D. M. (1972) Conformational changes of transfer ribonucleic acid. Relaxation kinetics of the early melting transition of methionine transfer ribonucleic acid (Escherichia coli). Biochemistry, 11, 4368-4374.

6. Cole, P. E., Yang, S. K. and Crothers, D. M. (1972) Conformational changes of transferribonucleic acid. Equilibrium phase diagrams. Biochemistry, 11, 4358-4368.

7. Correll, C. C., Freeborn, B., Moore, P. B. and Steitz, T. A. (1997) Metals, motifs, andrecognition in the crystal structure of a 5S rRNA domain. Cell, 91, 705-712.

8. Crotheis, D. M. and Cole, P. E. (1978) In Transfer RNA (Altman, S., Ed.), pp. 196-247, MIT

9. Press, Cambridge (Mass.), London.

10. Danchin, A. and Gueron, M. (1970) Cooperative binding of manganese (II) to transfer RNA. Eur. J. Biochem., 16, 532-536.

11. Davanloo, P., Sprinzl, M., Watanabe. K. et al. (1979) Role of ribothymidine in the thermal stability of transfer RNA as monitored by proton magnetic resonance. Nucleic Acids Res., 6. 1571-1581.

12. Helm, M., Brûlé, H., Degoul, F., Cepanec, C., Leroux, J. -P., Giegé, R. and Florentz, C. (1998) The presence of modified nucleotides is required for cloverleaf folding of a human mitochondrial tRNA. Nucleic Acids Res., 26,1636-1643.

13. Helm, M., Giegé, R. and Florentz, C . (1999) A Watson-Crick base-pair-disrupting methyl group (ralAi)) is sufficient for cloverleaf folding of human mitochondrial tRNALys. Biochemistry, 38, 13338-13346.

14. Hermann, T. and Westhof, E. (1998) Exploration of metal ion binding sites in RNA folds by Brownian-dynamics simulation. Structure, 6, 1303-1314.

15. Hilbers, C. W. and Shulman, R. G. (1974) Assignment of the hydrogen bonded proton resonances in Escherichia coli tRNAGlu by sequential melting. Proc. Nat. Acad. Set. USA, 71, 3239-3242.

16. Hoburg, A. and Aschhoff, H. J. (1977) Modification of tRNA^'61 from B. subtilisby tRNA(guanine-7)-methyl transferase from E. coli. Hoppe-Seyler's Ztschr. physiol. Chem., 358, 1220-1224.

17. Holbrook, S. R., Sussman, J. L., Warrant, R. W„ Church, G. M. and Kim, S.-H. (1977) RNA-ligand interactions: (I) magnesium binding sites in yeast tRNAPhe Nucleic Acids Res., 4, 28112820.

18. Holbrook, S., Sussman, J., Warrant, R. and Kim, S.-H. (1978) Crystal structure of yeast phenylalanine transfer RNA. J. Mol. Biol., 123, 631-660.

19. Holley, R. W., Apgar, J., Everett, G. A. et al. (1965) Structure of a ribonucleic acid. Science, 147, 1462-1465.

20. Jcnts, C. and Kearns, D. (1974) Investigation of the structure of yeast tRNAphe by nuclear magnetic resonance: paramagnetic rare earth ion probes of structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71,4237-4240.

21. Klug, A., Robertus, J. D., Ladner, J. E. et al. (1974) Conservation of the molecular structure of yeast phenylalanine transfer RNA in two crystal forms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3711 -3715.

22. Komatsoulis, G. and Abelson, J. (1993) Biochemistry, 32,7435-7444.

23. Krol, A. and Carbon, P. (1989) A guide for probing native small nuclear RNA andribonucleoprotein structures. Methods Enzymol., 180, 212-227.

24. Matsuyama, S., Ueda, T., Crain, P. F., McCloskey, J. and Watanabe, K. (1998) J. Biol. Chem., 273, 3363-3368.

25. Michakowski, D., Wrzesinski, J. and Krzysosiak, W. (1996a) Biochemistry, 35, 10727-10734. Michakowski, D., Wrzesinski, J., Ciesioska, J. and Krzysosiak, W. (1996b) Biochimie, 78, 131138.

26. Mironov, A. A., Dyakonova, L.P. and Kister, A. E. (1985) A kinetic approach to the prediction of the RNA secondary structures. J. Biomol. Struct. Dyn., 2, 953-962.

27. Mironov, A. A. and Lebedev, V. F. (1993) A kinetic model of RNA folding. Biosystems, 30, 4956.

28. Misra, V. K. and Draper, D. E. (2000) Mg2+-binding to tRNA revisited: the nonlinear Poisson-Boltzmann model. J. Mol. Biol, 299, 813-825.

29. Pan, J., Thirumalai, D. and Woodson, S. A. (1997) Folding of RNA involves parallel pathways. J. Mol. Biol, 273, 7-13.

30. Pan, T,. Long, D. M. and Uhlenbeck, O. C. (1993) Divalent metal ions in RNA folding and catalysis. In The RNA World (Gesteland, R. and Atkins, J. Eds.), pp. 271-302, Cold Spring Harbor Lab., New York.

31. Peattie, D. A. and Gilbert, W. (1980) Chemical probes for higher-order structure in RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4679-4682.

32. Plohl, M,, Kucan, Z. (1988) Effec s of spermine and magnesium ions on the aminoacylation of yeast tRNATyr. Biochimie, 70, 637-644.

33. Piivaiov, P. L. and Filimonov, V. V. (197K) Thermodynamic analysis of transfer RNA unfolding. J. Mol. Biol., 122,447-464.

34. Rich, A., Quigley, G. and Teeter, M. (1979) Recent progress in tRNA structural analysis. In Transfer RNA: structure, properties and recognition (Schimmel, P., Soil, D. and Abelson, J., Eds.), pp. 101-113, Cold Spring Harbor Lab., New York.

35. Roe, B., Michael, M. and Dudock, B. (1973) Function of N2 methylguanine in phenylalanine transfer RNA. Nature New Biol. 246, 135-138.

36. Römer, R. and Hach, R. (1975) tRNA conformation and magnesium binding. A study of a yeast phenylalanine-specific tRNA by a fluorescent indicator and differential melting curves. Eur. J. Biochem., 55,271-284.

37. Sampson J.R., Uhlenbeck O.C. (1988) Biochemical and physical characterisation of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 85, 1033-1037.

38. Schimmel, P. and Redfield, A. (1980) Transfer RNA in solution: selected topics. Annu. Rev. Bicpitys. Bioeng., 9, 181-221.

39. Schreier, A. A. and Schimmel, P. R. (1974) J. Mol. Biol., 86, 601-620.

40. Schulman, L. H. and Pelka, H. (1989) The anticodon contains the major element of the identityof arginine transfer RNAs. Science, 246, 1595-1597.

41. Sigman, D. S., and Chen, C. B. (1990) Chemical nucleases: new reagents in molecular biology. Ann. Rev. Biochem., 59, 207-236.

42. Smith, J. D. and Dunn, D. B. (1959) The occurrence of methylated guanines in ribonucleic acids from several sources. Biochem. J., 72, 294-301.

43. Stein, A. and Crothers, D. M. (1976b) Conformational changes of transfer RNA. The role of magnesium(n). Biochemistry, is 160-168.

44. Vlassov, V. V., Giege, R. and Ebel, J-. P. (1981) Tertiary structure of tRNAs in solution monitored by phosphodiester modification with ethylnitrosourea. Eur. J. Biochem., 119, 51-59.

45. Westhqf, E., Dumas, P. and Moras, D. (1985) Crystallographic refinement of yeast aspartic aciditransfer RNA. J. Mol. Biol., 184, 119-145.

46. Woo, N. H., Roe, B. A. and Rich, A. (1980) Three-dimensional structure of E. coli initiator tRNA™61. Nature (London), 286, 346-351.

47. Wrede, P., Wurst, R., Vournakis, J. and Rich A. (1979) Conformational changes of yeast tRNAPhe and E. coli tRNA2G,u as indicated by different nuclease digestion patterns. J. Biol. Chem., 254, 9608-9616.

48. Watanabe, K., Kuchino, Y., Nishimura, S. et al. (1979) Nucleotide sequence of formylmethionine tRNA from an extreme thermophile, Thermus thermophilics HB8. J. Biol. Chem., 86, 893-905.

49. Yokoyama S., Nishimura S. (1995) tRNA: Structure, Biosynthesis, and Function / Eds. Soll D., RajBhandary U., ASM Press,, pp. 207-224.

50. Yue D., Kintanar A., Horowitz J. (1994) Biochemistry, 33, 8905-8911.

51. Zamir, A., Miskin, R. and Elson, D. (1971) J. Mol. Biol., 60, 347-364.

52. Zarrinkar, P. P. and Williamson,./. R. (1994) Kinetic intermediates in RNA folding. Science,263,918-924.

53. Zarrinksr. P. P. and Williamson, J. R. (19v6) Slow folding kinetics of RNase P RNA. RNA, 2, 564-573.

54. Zuker, M. and Stiegler, P. (1981) Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Res., 9, 133-148.