Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса

Малышева, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса"

На правах рукописи

Малышева Наталья Михайловна

СВОБОДНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ФОРМЫ ТЕСТОСТЕРОНА КАК НАИБОЛЕЕ АДЕКВАТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНДРОГЕННОГО СТАТУСА

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009 г.

□034Т6738

Работа выполнена в ФГУ Эндокринологический научный центр (директор - академик РАН и РАМН И.И.Дедов)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Николай Петрович Гончаров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ольга Вячеславовна Смирнова

доктор биологических наук, профессор Николай Дмитриевич Фанченко

Ведущая организация: Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова РАН

Защита состоится 12 октября 2009 г. в 15 ч. 30 мин. в ауд. М-1 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Ленинские горы, Москва, ГСП-1, 119991).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан 10 сентября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.93 доктор биологических наук

№

Б.А. Умарова

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Проблемы, связанные с нарушениями физиологических механизмов регуляции функции репродуктивной системы у мужчин в различные периоды онтогенеза занимают одно из важных мест в современной биологии и медицине. Развитие и поддержание репродуктивной функции у мужчин определяется физиологической динамикой секреции тестостерона с формированием востребованного уровня циркулирующих форм тестостерона в крови. Нарушение этого сложного многофакторного процесса приводит к развитию целого ряда патологий в репродуктивном здоровье человека, лабораторная диагностика которых в первую очередь определяется адекватностью и доступностью методов определения главного мужского гормона - тестостерона (Т).

Тестостерон является ключевым элементом системы гипотоламус-гипофиз-гонады. Физиологическая роль его у мужчин хорошо известна и заключается, прежде всего, в формировании мужского фенотипа и обеспечении сперматогенеза. Оценка андрогенного статуса необходима при широком спектре клинических симптомов и патологических состояний, например, таких как тестикулярная недостаточность, бесплодие, сексуальная дисфункция, гипого-надизм различного генеза и др. Мониторинг за уровнем Т необходим при проведении антиандрогенной терапии определенных форм дисгормонального рака, а также при проведении заместительной терапии препаратами. Точное количественное определение Т необходимо для диагностики широко распространенного возрастного андрогенного дефицита. У детей при замедленном или ускоренном половом созревании, нарушении деятельности надпочечников, тес-тикулярных и овариальных нарушениях. У женщин показаниями к определению тестестерона являются гирсутизм, тестикулярная феминизация, аменорея, бесплодие, андроген секретирующие опухоли яичников и надпочечников, синдром поликистозных яичников, апдрогепна-я недостаточность.

Тестостерон циркулирует в крови в комплексе со специфическим глобулином (СССГ) - 35-75% (Кд - 20 сек.) и неспецифическим белком альбумином - 25-65% (Кд - 1 сек), который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет его высокой концентрации в крови. И только 1-2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде. Свободный тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона. Обычно содержание общего тестостерона в сыворотке здоровых мужчин колеблется в пределах физиологической нормы (12-30 нмоль/л) и коррелирует с концентрацией СССГ. Свободный тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона, обеспечивающую его биологические эффекты. Однако даже в физиологических условиях концентрация СССГ широко варьирует в зависимости от диеты, ИМТ, концентрации инсулина и возраста. А при патофизиологических состояниях, таких как острый и хронический стресс, психосоматические патологии, гипогонадизм и т.д., уровень СССГ, а также альбумина и их соотношение нарушается, что неизбежно влияет на содержание биологически доступного Т.

В начале 2007 года опубликовано официальное заявление международной ассоциации эндокринологов о недопустимости использования прямых не экстракционных методов для определения общего тестостерона в диапазоне низких концентраций (об.Т < 10 нмоль/л), поскольку это ведет к ошибкам в диагностике с последующим назначением неправильного лечения.

Именно поэтому только наличие адекватных аналитических методов определения св.Т, обеспечило бы наиболее оптимальную диагностику андроген-ного статуса организма как у мужчин, так и у женщин и детей, особенно до периода полового созревания.

Цель настоящей работы: оценка адекватности определения общего тестостерона крови различными методами иммуноанализа, разработка современного высокочувствительного метода определения в слюне и сыворотке крови свободной формы тестостерона как маркера для оценки андрогенного статуса и

доказательства надежности его применения при различных физиологических и патофизиологических условиях у детей, подростков и взрослых мужчин.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ современных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови и выбрать наиболее надежный.

2. Адаптировать метод определения свободной формы тестостерона в слюнной жидкости, стандартизировать методику сбора слюны и определить диапазон физиологических колебаний уровня свободного тестостерона у детей, подростков и взрослых мужчин.

3. Разработать методические подходы для определения свободной формы тестостерона в сыворотке методом люминесцентного иммуноанализа с предварительной ультрафильтрацией и определить диапазон физиологических колебаний свободного тестостерона в сыворотке.

4. Провести сравнительный анализ современных методов определения свободной формы тестостерона в слюне и сыворотке крови.

5. Оценить возможности LIA и ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в зависимости от используемого диапазона концентраций.

Научная новизна. В представленной работе впервые проведена комплексная сравнительная оценка современных методов иммуноанализа общего и свободного тестостерона у мужчин в различных биологических жидкостях.

Впервые в России адаптирован на различных моделях и обосновано введен в рутинную практику метод определения свободной формы тестостерона в слюнной жидкости на моделях различных физиологических и патофизиологических состояний репродуктивной системы.

Установлено, что использование количественных параметров общего и расчетного Т имеет существенные ограничения для оценки андрогенного стату-

са у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике и важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного гомеостаза.

Впервые разработан оригинальный тандем для определения свободного тестостерона в сыворотке мужчин. Разделение свободной и связанной с белками фракции тестостерона с помощью технологии ультрафильтрации на специальных фильтрах Amicon Ultra - 4 (30 кДа) в комбинации с измерением его уровня в ультрафильтрате высокочувствительным методом люминесцентного иммуноанализа (LIA, IBL), который обеспечивает адекватное определение тестостерона у мужчин в широком диапазоне концентраций.

Практическая значимость. С введением в практику очень чувствительной и специфичной LIA-технологии, концентрация тестостерона в слюне и ультрафильтрате может быть широко использована в качестве объективного гормонального маркера диагностики различных форм андрогенного дисбаланса у детей, подростков и взрослых мужчин. Определение свободного тестостерона LIA-методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга и лечения гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии. Выявление неадекватно используемых методов иммуноанализа, применение которых приводит к завышению результатов определения Т, позволяет избежать возможных диагностических ошибок.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Результаты определения уровня общего тестостерона прямыми неизотопными методами и автоматизированными системами широко варьируют в одних и тех же образцах сыворотки, особенно в диапазоне низких концентраций.

2. Концентрация свободного тестостерона в слюне у мужчин, определенная методом усиленной хемилюминесценции, отражает уровень свободного, несвязанного с белками, тестостерона в крови.

3. Показатель свободного тестостерона в ультрафильтрате является дополнительным к клинической диагностике чувствительным маркером выявления андрогенного дефицита.

4. Единого идеального маркера и метода определения андрогенного статуса не существует, поэтому, в зависимости от поставленной перед исследователем задачи, необходимо правильно выбрать адекватный показатель, а также чувствительный и специфичный метода его определения.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде докладов на 8-ом Международном Конгрессе Андрологии (Сеул, июнь 2005), Международной Конференции «Балтийский форум» (Санкт-Петербург, июнь 2008), в виде тезисов на 9-ом Международном Конгрессе Андрологии (Барселона, Испания, март 2009), на 8-ом Европейском Конгрессе по Менопаузе (EMAS) (Лондон, май 2009). По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в зарубежной печати.

Диссертация апробирована на межотделенческой конференции ФГУ Эндокринологический научный центр (апрель 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 8 отечественных и 170 зарубежных источников. Работа содержит 17 таблиц, 20 рисунков.

Материалы и методы

Пациенты

Были обследованы следующие группы пациентов:

1. Мужчины (п = 100) в возрасте от 19 до 65 лет, которые обращались в клинику для подтверждения или исключения диагноза различных нарушений функции эндокринных желез.

2. Добровольцы-мужчины (п = 55) в возрасте от 21 до 50 лет (медиана 30 лет). В этой группе 41 человек собирали 9 образцов слюны (3 - утром, 3 - днем, и 3 - вечером), согласно протоколу сбора слюны, чтобы определить суточную динамику тестостерона в слюне. Остальные 14 человек собирали только 3 утренние порции слюны. Все исследуемые в этой группе добровольцы были клинически здоровыми.

3. Добровольцы-мужчины (п = 15) в возрасте 38-55 лет (медиана 48 лет). Утренние образцы слюны (3 образца с интервалом в 30 минут, 8.30 - 9.30) были собраны один раз в неделю в течение 5 недель. Эта группа была стандартизирована по профессиональной деятельности, физической и эмоциональной нагрузке, режиму дня (время вставания, характер диеты и т.д.)

4. Пациенты-мужчины (п = 189), которые обращались в клинику для подтверждения или исключения диагноза различных форм гипогонадизма, возрастного андрогенного дефицита, сексуальной дисфункции и других нарушений гормональной функции яичек. Возраст пациентов колебался от 19 до 83 лет.

5. Мальчики (п=93) в возрасте 2-18 лет без эндокринной патологии, с нормальным уровнем полового развития в соответствии со шкалой Таннера.

Процедура сбора крови

Образцы крови были взяты из локтевой вены между 8.00 и 10.00 утра в день сбора слюны. Отделение сыворотки от форменных элементов проходило в течение 6 часов при комнатной температуре, центрифугирование при 3000 об/мин. Образцы сыворотки хранились при -40 С в двух аликвотах до измере-

ния в них содержания общего тестостерона и сексстероидсвязывающего глобулина (СССГ).

Процедура сбора слюны

Образцы слюны были собраны в специальные контейнеры (SaliCaps®, IBL) со специальной трубочкой, изготовленные из материала, который не абсорбирует стероиды. Слюна была собрана не менее чем через 30 минут после еды, питья, чистки зубов или жевания жвачки. Требовалось примерно 2 минуты, чтобы собрать необходимое количество слюны (0,6-0,8 мл). Слюна не должна быть контаминирована кровью, концентрация тестостерона в которой в 10-15 раз выше, чем в слюне. Такие пробы исключали из анализа. Собранная слюна хранилась при -20°С. Перед тестированием образцы слюны размораживали и центрифугировали.

Для дальнейшего исследования три порции слюны, собранные в течение одного часа, смешивали в равных количествах. Такой пул имеет среднее значение концентрации свободного тестостерона, которое реально отражает уровень гормона.

Определение свободного тестостерона в слюне (св.Т). Нами адаптирован метод определения свободного тестостерона в слюне для прицельной диагностики андрогенного дефицита у мужчин и женщин. Образцы слюны, собранные описанным выше способом, анализировались на содержание Т методом усиленной люминисценции LIA (фирма IBL-Гамбург, Германия).

Для сравнения двух различных технологий от фирмы IBL для измерения св.Т в слюне, определение в некоторых образцах слюны проводили также методом твердофазного ферментного иммуноанализа ELISA, с регистрацией фотометрического сигнала на мультианализаторе Victor 2.

Определение свободного тестостерона в сыворотке (св.Т) проводили с предварительным отделением свободной фракции тестостерона методом ультрафильтрации (УФ). Образец сыворотки 0,5 мл помещали в вертикальный цен-

трифужный фильтр Amicon®Ultra-4 (MILLIPORE) с мембраной ЗОК - 30,000 NMWL. Затем добавляли 0,7 мл HEPES буфера (рН 7,4).

Смесь сыворотки с буфером инкубировали 30 минут на водяной бане при 37°С, затем центрифугировали 15 минут при 37°С и 5250g, центрифугу предварительно прогревали в течение 30 минут при 37°С в работающем режиме (5250g). Определение свободной фракции тестостерона в ультрафильтрате проводили методом усиленной люминисценции LIA (фирма IBL-Гамбург, Германия), основанном на принципе конкурентного связывания. Регистрацию люми-нисцентного сигнала проводили на мультианализаторе Victor 2 (фирма Wallac, Финляндия).

Определение общего тестостерона (об.Т) в образцах крови проводили методом усиленной хемилюминисценции с помощью автоматического анализатора Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics, J&J, Великобритания). Для сравнения различных методов измерения общего тестостерона в сыворотке крови и выбора наиболее адекватного анализатора, определение проводили также следующими широко используемыми в настоящее время методами:

1) Vitros ECi ("Ortho-Clinical Diagnostics"), автоматический мультианали-затор;

2) Architect ("Abbott Laboratories"), автоматический мультианализатор;

3) Access ("Beckman Elmer"), автоматический мультианализатор;

4) Déifia ("Perkin Elmer"), мультианализатор;

5) DRG, иммуноферментный набор (ELISA)

6) РИА-набор (3Н-Т), после экстракции, стандартизированный ВОЗ.

Определение сексстероидсвязывающего глобулина (СССГ), проводили с

помощью автоматического анализатора Elecsys 2010 (Hoffmann - La Roche).

Вычисление концентрации свободного тестостерона в крови проводили с помощью математической формулы, использующей показатели содержания в крови общего тестостерона и СССГ (A.Vermeulen, 1999) (сайт в Интернете http://wYTOUssam.ch/freetesto.htm).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные были обработаны с помощью программы Statistica for Windows, StatSoft, Inc. (1999). Результаты представлены в виде медианы, 10/90 и 2,5/97,5-процентилей, геометрической средней и среднего квадратичного отклонения. Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. При р<0,05 распределение признака считалось отличающимся от нормального. Корреляционные связи между показателями с распределением, отличающимся от нормального, оценивали с помощью метода Спирмена. Анализ вида зависимости между показателями (при нормальном распределении) проводили с помощью метода регрессионного анализа. Значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрических методов, U-критерия Манна-Уитни и критерия Уилкоксона. Различия р<0,05 считались статистически достоверными.

Результаты исследования

Взрослые мужчины

Сравнительный анализ различных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови.

На первом этапе исследования мы провели сравнение современных, широко используемых в настоящее время неизотопных методов измерения общего тестостерона в сыворотке крови. В качестве метода сравнения был выбран РИА метод иммуноанализа. РИА метод с предварительной экстракцией и применением высокоспецифичных моноклональных антител в лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ЭНЦ РАМН использовали на протяжении 15 лет. За основу метода была взята технология Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), разработанная в рамках Программы ВОЗ по репродукции человека (Sufi S.B. et al, Лондон, 1992). Этот метод был калиброван с референсным методом (газовая хроматография/ масс-спектрометрия);

нормальный уровень общего тестостерона при его определении данным методом составлял 11-33 нмоль/л у здоровых мужчин репродуктивного возраста.

Суммарные показатели концентрации тестостерона у 100 мужчин представлены в табл. 1. Как показали результаты исследования, наблюдаются значительные различия в значении средних показателей содержания тестостерона, полученных различными методами. Концентрация тестостерона в крови, определенная любыми неизотопными методами, была статистически значимо выше, чем при определении РИА. Самый высокий уровень (медиана 19,2 нмоль/л) зафиксирован при определении методом Déifia, самый низкий (медиана 13 нмоль/л) - при определении РИА. Наиболее близки были показатели Vitros ECi и РИА (медиана 13,1 и 13 нмоль/л соответственно).

Таблица 1. Значения уровня общего тестостерона, полученные РИА и

неизотопными методами (п = 100)

Метод Геометрическое среднее Медиана Разброс min-max Стандартное отклонение Критерий Уил-коксона

Access 13,9 14,2 3,1-50,1 6,8 Access/PHA р < 0.0001

Déifia 19,3 19,2 3,6-94,6 13 Delfia/РИА р< 0.0001

Architect 16,8 17,8 3,8-114,4 12,7 Architect/PHA р< 0.0001

DRG 15,6 16,3 3,5-40,8 6,5 DRG/РИА р< 0.0001

Vitros ECi 12,7 13,1 1,8-44,2 7,7 Vitros ECi/РИА р = 0,0190

РИА 12,1 13 2,1-34,6 6 РИА

При вычислении разницы между показателями РИА и неизотопного метода (табл. 2) оказалось, что медиана этого показателя колебалась от минимальных значений (0,4 нмоль/л для Vitros ECi, что составляло в среднем 0.03%) до максимальных (7,3 нмоль/л для Déifia, что составляло в среднем 65%).

Таблица 2. Отклонения в концентрации общего тестостерона между показателями, полученными РИА и неизотопными методами (п = 100)

Метод Медиана, нмоль/л Разброс, нмоль/л Медиана, % Разброс, %

Access/PMA 1,2 -7,0/41,3 12 -26/469

Delfia/РИА 7,3 -10,4/85,8 65 -61/951

Architect/PHA 4,9 -7,3/105,6 39 -45/1200

DRG/РИА 2,7 -9,8/19 21 -33/284

Vitros ECi/РИА 0,4 -5,2/16,8 0,03 -49/163

Если определять этот показатель по двум подгруппам, ниже физиологической нормы (11 нмоль/л) и в нормальном диапазоне (выше 11 нмоль/л), то оказалось, что при определении уровня тестостерона всеми неизотопными методами, кроме Vitros ECi, в 1-й подгруппе разница значений более выражена, тогда как во 2-й подгруппе эта разница снижается, но остается существенной (рис. 1). Исключением является Access: при определении эти методом концентрация тестостерона в нормальном диапазоне близка к таковой при определении РИА.

Регрессионный анализ результатов показал, что концентрация общего тестостерона, определенная методом РИА, коррелирует с показателями, полученными неизотопными методами (табл. 3). Наиболее сильная корреляция наблюдается между РИА и Vitros ECi, наименьшая - между Delfia/РИА и Archi-tect/РИА. В подгруппе с содержанием тестостерона менее 11 нмоль/л наблюдалась слабая корреляция между показателями, определенными референсным РИА методом и неизотопными методами. В подгруппе с нормальным содержанием тестостерона корреляция между РИА и неизотопными методами возрастает (см. табл. 3).

Рис. 1. Различия (в процентах) между показателями концентрации тестостерона (медиана), полученными РИА и неизотопными методами у мужчин с содержанием тестостерона (по РИА) <11 нмоль/л и >11 нмоль/л.

Таблица 3. Сравнение результатов определения уровня тестостерона, полученных РИА и неизотопными методами, у всех пациентов методом регрессионного анализа.

Метод Вся группа (n = 100) T < 11 нмоль/л (n = 32) T > 11 нмоль/л (n = 68)

r P r P r P

Access 0,708 <0,0001 0,459 0,0080 0,829 <0,0001

Déifia 0,423 <0,0001 0,392 0,0264 0,631 <0,0001

Architect 0,454 <0,0001 0,300 0,0950 0,695 <0,0001

DRG 0,780 <0,0001 0,629 0,0001 0,743 <0,0001

Vitros ECi 0,838 <0,0001 0,607 0,0002 0,794 <0,0001

Таким образом, все неизотопные методы, за исключением Vitros ECi, приводят к завышению определяемого уровня общего тестостерона по сравнению со стандартизированным РИА-методом. Наиболее выраженная системати-

ческая ошибка наблюдается при определении низких концентраций тестостерона, т. е. у тех мужчин, у которых при клиническом обследовании заподозрено наличие клинических признаков дефицита андрогенов.

Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия нор-ма/андрогенный дефицит использовать величину 11 нмоль/л, то из 100 обследованных образцов сывороток по данным РИА концентрация тестостерона 11 нмоль/л и ниже определялась у 38 мужчин, т.е. в 38% случаев предполагалось наличие андрогенного дефицита различной степени тяжести (от 2,1 до 9,8 нмоль/л). Если уровень тестостерона определяли неизотопными методами, то частота выявления андрогенного дефицита при использовании метода Vitros ECi составляла 25%, Architect - 13%, DRG - 10%, Delfia - 7%, Access - 5% (рис. 2).

Рис. 2. Частота (в %%) биохимического диагноза андрогенного дефицита при использовании различных методов определения общего Т в одних и тех же образцах сывороток мужчин.

При использовании значений нормы, рекомендуемых в инструкциях разработчиков неизотопных методов, частота выявления андрогенного дефицита среди всех обследованных мужчин снижается в еще большей степени.

Определение свободной формы тестостерона в слюне.

Неудовлетворительные результаты определения об.Т автоматизированными системами послужили основанием для поиска альтернативных технологий и прежде всего прямого и доступного метода определения свободной формы Т, как наиболее адекватного маркера андрогенного статуса как у мужчин так и у женщин и детей.

Однако прямое определение свободной формы тестостерона в крови сопряжено с определенными технологическими трудностями. Поэтому мы обратились к альтернативной биологической жидкости - слюне, куда поступает только свободные формы стероидов, включая тестостерон. Сбор слюны прост, не инвазивен и имеет большие преимущества перед традиционными методами определения стероидов в венозной крови, взятие которой само по себе является добавочным стрессорным фактором, способным искажать показатели гормональных параметров.

Нами исследованы гормональные показатели здоровых мужчин и мужчин с андрогенным дефицитом в возрасте от 21 до 54 лет.

Таблица 4. Характеристика исследуемых групп (медиана и 10/90 процен-

тили)

Группы п Возраст (годы) Общий тестостерон (нмоль/л) СССГ (нмоль/л) Вычисленный свободный тестостерон (пмоль/л)

здоровые мужчины 41 38 (21-50) 18,8 (12,4-26,1) 36,1 (21-54) 374 (225-544)

мужчины с андрогенным дефицитом 36 35 (21-54) 6,7 (1,2-10,8) 33,0 (14,7-104,1) 135 (9,3-215)

Р 0,2242 <0,0001 0,3958 <0,0001

Обнаружено, что сопоставимые по возрасту здоровые мужчины и мужчины с андрогенным дефицитом имели сравнимый уровень СССГ (табл. 4). Однако уровень общего тестостерона был значительно выше в группе здоровых мужчин.

Таблица 5. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне

(пмоль/л) у здоровых мужчин и мужчин с андрогенным дефицитом (медиана и 10-90 процентили)

Группы Время сбора слюны (часы)

8-30 9-00 9-30 15-30 15-00 16-00 22-00 22-30 23-00

здоровые 371 364 374 329 322 288 212 295 343

(260 (277 (263 (208 (225 (225 (146 (222 (164

-562) -531) -541) -440) -502) -440) -423) -430) -475)

андроген- 205 209 218 240 201 169 131 157 145

ный дефи- (76 (36 (52 (35 (21 (51 (45 (66 (42

цит -250) -267) -302) -416) -319) -347) -364) -305) -316)

Р <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0926 0,0147 0,0037 0,0083 0,0019 0,0056

Средняя концентрация тестостерона в слюне у здоровых мужчин (по 3 утренних образца от каждого, 8-30 - 9-30) составляла 380 пмоль/л (270-544). Средняя концентрация днем и вечером, соответственно, 80 ±15% и 71±21% от

утренней концентрации (рис. 3, табл. 5).

Рис. 3. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне у здоровых мужчин (* - медиана, достоверность разницы - между утром и вечером Р=0,0012, между днем и вечером Р=0,0006)

В отличие от здоровых мужчин, суточная динамика свободного тестостерона в слюне у больных с андрогенным дефицитом выражена менее заметно. Концентрации свободного тестостерона утром и днем практически не отличались, статистически достоверное различие было обнаружено только вечером -68±29% от утреннего уровня (рис.4 табл.5).

утро день вечер

Рис. 4. Суточная динамика свободного тестостерона в слюне больных мужчин с андрогенным дефицитом (* - медиана, достоверность разницы между утром и вечером Р=0,583, между днем и вечером Р=0,0006).

Концентрация св.Т в слюне и расчетная концентрация свТ в крови у здоровых мужчин практически не отличались друг от друга: 380 пмоль/л (270-544 пмоль/л) и 374 пмоль/л (225-544 пмоль/л, р=0,111) (рис. 5), тогда как у пациентов с андрогенным дефицитом концентрация св.Т как правило превышала показатели математического метода определения концентрации св.Т в крови. Медиана свободного тестостерона в трех утренних образцах слюны была выше (215 пмоль/л, разброс 55-249 пмоль/л), чем вычисленная концентрация свободного тестостерона в крови - 135 пмоль/л (разброс 9,3-215 пмоль/л) (рис. 6).

600 550 500 450

1 400

2 с

350 300 250 200

Рис. 5. Сравнение показателей расчетного св. Т в крови и св. Т в слюне в утренние часы у здоровых мужчин.

300 250 200 150

'S §

100 50 0 -50

Рис. 6. Сравнение показателей расчетного св. Т в крови (1) и св. Т в слюне (2) в утренние часы у пациентов с андрогенным дефицитом.

Р=0.605 ■ ■

са.Т в слюне

св.Т в крови

Для оценки воспроизводимости индивидуальных показателей свободного тестостерона в слюне, мы собирали слюну в группе здоровых мужчин в течение 5 недель (один раз в неделю утром). В начале исследования (1-ая неделя) концентрация свободного тестостерона у обследуемых была в пределах 180-745 пмоль/л. Последующие определения тестостерона (2-ая - 5-ая недели) показали приемлемую повторяемость результатов, коэффициент вариации 13 % (рис.7). 800

700 600 500

.С

^ 400

с 300 200 100 о

Рис. 7. Воспроизводимость концентрации св.Т в слюне в группе здоровых мужчин в течение 5 недель (сбор образцов слюны один раз каждую неделю).

Мальчики от 2 до 18 лет

Для оценки информативности определения св.Т в слюне в области низких значений общего Т. мы обследовали группу мальчиков на различных этапах постнатального развития в возрасте от 2 до 18 лет. В группу были отобраны здоровые мальчики без эндокринной патологии, с нормальным уровнем полового развития в соответствии со шкалой Таннера.

В целом по группе содержание общего Т варьировало от 0,05 до 25,8 нмоль/л, расчетного Т от 0,001 до 557 пмоль/л (рис. 8-9).

1 2 3 4 5

недели

30 25 20

о 15

[I 10

5 0

■в-

® @

нижнии интервал референсных

значений взрослых мужчин I • 1

* 0

О... -р-

• • О

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Возраст

Рис. 8. Динамика общего тестостерона у мальчиков на различных этапах пубертатного развития.

Возраст

Рис. 9. Динамика расчетного свободного тестостерона в крови у мальчиков на различных этапах пубертатного развития.

Особый интерес для нас представляла стадия препубертата - дети до 10 лет. Общий тестостерон в данной подгруппе варьировал в пределах 0,05 - 0,44 нмоль/л, т.е. на пределе чувствительности используемой нами автоматизированной системы Витрос, чувствительность которой 0,03 нмоль/л.

Такая же динамика характерна и для расчетного Т, который варьировал практически около нуля, что является естественным результатом специфики стадии препубертата - низкий уровень Т в комбинации с высоким уровнем СССГ. В то же время содержание св.Т. в слюне в данной подгруппе варьирует в диапазоне определяемых концентраций от 3 до 127 пмоль/л (рис.10). С возрастом концентрация об.Т, расч. Т и св. Т в слюне нарастает и к 16-18 годам сглаживается и достигает уровня средних значений взрослых мужчин.

600

500

^ 400 о 5 С

Я 300 х

5 200

I-

со о

100 0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Возраст

Рис. 10. Динамика свободного тестостерона в слюне у мальчиков на различных этапах пубертатного развития.

Во всех возрастных группах показатели св. Т в слюне с различной степенью значимости коррелируют с общим Т к крови. Коэффициент корреляции между общим, расчетным и св. Т в крови достигает статистической значимости только после 10 лет (табл. 6).

Таблица 6. Корреляционные связи между показателями тестостерона в

группах обследованных мальчиков.

Возраст, лет св. Т слюны расч. св. Т крови

г Р г Р

2-10 (п=14) об. Т крови 0,559 0,037 0,237 0,413

св. Т слюны - - 0,085 0,787

10-13 (п = 25) об. Т крови 0,667 <0,0001 0,983 <0,0001

св. Т слюны - - 0,718 <0,0001

13-16 (п = 33) об. Т крови 0,400 0,020 0,688 <0,0001

св. Т слюны - - 0,473 0,005

16-18 (п = 21) об. Т крови 0,452 0,030 0,552 0,009

св. Т слюны - - 0,680 <0,0001

Полученные данные показали, что использование количественных параметров общего и расчетного Т неприемлемо для оценки андрогенного статуса у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного статуса. В таблице 7 представлены выработанные нами интервалы значений уровня свободного Т в слюне в исследованных возрастных подгруппах. Необходимо отметить, что полученные значения могут использоваться только в качестве справочных. Рекомендуется отработка собственных результатов для установления референсных значений в каждой лаборатории.

Таблица 7. Показатели свободного тестостерона в слюне у мальчиков (результаты представлены в виде медианы и 5/95-процентилей).

Возраст, лет св. Т слюны, пмоль/л

2-10 31,6

3,2-127

10-13 82,3

1,5-284

13-16 216

71,2-402

16-18 331

42,0 - 439

Мониторинг заместительной терапии андрогенами по уровню свободного тестостерона в слюне.

Мы проводили мониторинг определения св.Т в слюне у транссексуала (женщина —> мужчина) после лечения сустаноном (рис. 11). До лечения уровень общего и вычисленного свободного тестостерона в крови был очень низок (соответственно 3,9 нмоль/л и 42,3 пмоль/л). Через 1 неделю после инъекции сустанона уровень об.Т в крови вырос на 29%, концентрация вычисленного св.Т в крови - на 140%, тогда как содержание св.Т в слюне возросло утром на 275% и вечером на 527%.

■до лечения —на фоне лечения

Рис. 11. Динамика св. Т в слюне у транссексуала (женщина —> мужчина)

Мониторинг заместительной терапией андрогенами более адекватен при определении св.Т в слюне с помощью ЫА-технологии. С этим методом достаточно просто изучать фармакокинетику в каждом отдельном случае, с тем, чтобы подбирать оптимальную дозу препарата и пути его введения.

Сравнительный анализ LIA и ELISA технологий для определения свободной

формы тестостерона в слюне в широком диапазоне концентраций.

В работе были использованы 160 образцов слюны, в которых содержание св. Т, при определении LIA методом, варьировало в пределах 10 - 990 пмоль/л (3 - 285 пг/мл).

Мы проводили измерение уровней свободного тестостерона в одних и тех же образцах слюны LIA (ультра чувствительный хемилюминесцентный анализ) и ELISA (ферментный иммуноанализ с регистрацией сигнала методом фотометрии) наборами, рекомендованными фирмой IBL для определения св. Т в слюне. Достаточно высокая корреляция между определяемыми показателями регистрируется во всем исследуемом диапазоне концентраций. Коэффициент корреляции составлял 0.94 в диапазоне высоких концентраций (св. Т в слюне > 110 пмоль/л по результатам LIA метода) и 0.86 в диапазоне низких концентраций (менее 110 пмоль/л).

Анализ абсолютных значений св. Т в слюне показал, что в диапазоне высоких концентраций различия между методами практически отсутствовали. В то же время в диапазоне низких концентраций использование метода ELISA завышает показатели Т в 1,5 - 2 раза (рис. 12).

Таким образом, с введением в практику очень чувствительной и специфичной LIA-технологии, концентрация тестостерона в слюне может быть широко использована как объективный и адекватный гормональный критерий в диагностике различных форм андрогенного дефицита у мужчин, а его определение LIA-методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга в процессе терапии гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии.

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 -100

Рис. 12. Сравнительный анализ методов LIA и ELISA при определении Т в слюне в диапазоне его низких (А) и высоких (Б) концентраций.

ELISA LIA

ELISA

LIA

Определение свободной формы тестостерона в сыворотке крови с предварительной ультрафильтрацией.

Коммерческие диагностические наборы для прямого измерения свободных стероидов, в особенности для тестостерона в крови, пока не пригодны для диагностического исследования и могут использоваться лишь в научных целях. «Золотым стандартом» для отделения св.Т от тестостерона связанного с белками является метод равновесного диализа. В последние годы появились работы, демонстрирующие возможности метода ультрафильтрации (УФ) для выделения свободных форм пептидных и стероидных гормонов.

Технология ультрафильтрации для разделения свободного и связанного с белком тестостерона была выбрана нами как наиболее быстрая, доступная и простая в использовании. При отработке методики мы придерживались опубликованных ранее рекомендаций по оптимальному режиму процесса ультрафильтрации для стероидных гормонов. По адсорбционным характеристикам лучшие результаты показали устройства, изготовленные из восстановленной целлюлозы с низко связывающей мембраной (адсорбция 2,0±1,5%). Мы использовали вертикальные центрифужные фильтры Апнсоп®икга-4 (М1ЫЛ-РОЯЕ) с мембраной ЗОК - 30,000 КМ\УЬ. Для поддержания термодинамического равновесия между свободной и связанной фракцией исследуемого гормона выбрана температура 37°С и физиологическое значение рН 7,4. Влияние на равновесие оказывает продолжительность проведения ультрафильтрации, которая в свою очередь зависит от исходного объема образца и его вязкости. Эксперименты с разведением показали в 4 раза большую адсорбцию с использованием нативной сыворотки, по сравнению с разведенной, а также установили, что небольшие разведения (1:1,4) уменьшают концентрацию общего тестостерона и оказывают лишь незначительный эффект на концентрацию свободного (0,3±1,6%). Разница становится значимой при разведении 1:10 (13,7±4,1%). Подобные эффекты согласуются с положениями закона действия масс. На основании детального анализа вышеизложенных данных, процесс ультрафильтра-

ции был проведен нами в оптимальных условиях (см. раздел Материалы и методы), что дает возможность говорить о надежности полученных результатов. Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность ЫА-метода позволяет количественно определять очень низкие (2-3 пг в пробе) концентрации Т в ультрафильтрате и в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного дефицита у мужчин, а также оценки андроген-ного статуса у женщин и детей.

В данном исследовании мы одновременно определяли концентрацию свободного тестостерона в образцах крови и слюны 189 мужчин (19-83 лет), которые обращались в клинику для подтверждения или исключения диагноза различных нарушений функции эндокринных желез.

Суммарные показатели у всех обследованных 189 мужчин представлены в таблице 8.

Таблица 8. Гормональная характеристика пациентов (п=189), включенных в исследование.

Среднее ± стандартное отклонение Медиана Разброс 2,5/97,5 процен-тили

об.Т, нмоль/л 15,6 ±7,0 14,7 2,2-33,2

св.Т крови (УФ), пмоль/л 144 ± 85 130 6,3-359

СВ.Т слюны, пмоль/л 418 ±206 368 119-878

расчетный св.Т, пмоль/л 298±141 279 47-601

СССГ, нмоль/л 40,3 ± 15,9 36,8 18,6-76,7

Наблюдаются значительные различия в значении средних показателей, полученных различными методами. По нашим данным процент свободного тестостерона от общего составил (медиана и 2,5/97,5-процентили): 2,6% (1,08,1%) при определении в слюне, 1,9% (1,1-2,7%) при расчетном способе и 0,9% (0,21-2,1%) при определении в сыворотке с предварительной ультрафильтрацией.

Для оценки связи между анализируемыми параметрами применяли ранговый тест Спирмена, при р<0,05 различия считали статистически достоверными (табл. 9).

Таблица 9. Корреляционные связи анализируемых показателей.

Коэфф. корреляции (г) Р

об.Т/ св.Т крови (УФ) 0,494 <0,0001

об.Т/ св.Т слюны 0,472 <0,0001

об.Т/ расч. св.Т 0,864 <0,0001

св.Т крови (УФ)/ св.Т слюны 0,414 <0,0001

св.Т крови (УФ)/ расч. св.Т 0,600 <0,0001

св.Т слюны/ расч. св.Т 0,489 <0,0001

Статистически значимая корреляция регистрируется между всеми обозначенными в работе маркерами андрогенного гомеостаза: общим Т, св. Т в крови (УФ), св. Т в крови (расчетный метод) и св. Т в слюне. Наиболее сильная связь наблюдается между общим Т и расчетным св.Т. Наличие такой связи заключено в самом принципе расчетного метода, в котором концентрация общего тестостерона наряду с содержанием СССГ является определяющей детерми-нантой в калькуляции св. Т. В то же время показатели св. Т в крови после ультрафильтрации сохраняли значимую положительную связь с показателями расчетного св. Т. Более слабая зависимость характерна для показателей св. Т в слюне.Для количественной оценки абсолютных показателей все пациенты были условно разделены на две группы, исходя из величины нижней границы интервала референсных значений общего Т в крови. Первая группа с содержанием об. Т > 11 нмоль/л, вторая группа - об. Т < 11 нмоль/л.

Таблица 10. Показатели свободного тестостерона у мужчин (результаты

представлены в виде медианы и 2,5/97,5-процентилей).

св.Т пмоль/л

Группы об.Т слюна кровь (расчетный) сыворотка(после ультрафильтрации)

об.Т >11 нмоль/л 17,3 405 309 151

(п=148) 1,8-33,2 161-836 204-604 52-370

об.Т <11 нмоль/л 8,6 274 170 85

(п=41) 0,6-10,9 44-660 10-246 5,7-197

Р <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

Как видно из таблицы 10, в зависимости от содержания общего тестостерона в выделенных подгруппах статистически значимо снижаются все исследуемые показатели свободного тестостерона.

Интересно отметить, что в подгруппе пациентов с нормальным содержанием общего Т регистрируется значимое возрастное снижение показателя св. Т в крови (г = -0,22, р < 0,02). В то время как в динамике общего Т указанная зависимость не прослеживается.

В подгруппе с содержанием об.Т менее 11 нмоль/л корреляция отсутствует по всем показателям.

При анализе процентного соотношения св. Т от общего в подгруппах (табл. 11), выявлено статистически значимое повышение процентного показателя св. Т в слюне и расчетного св. Т у пациентов с содержанием общего Т ниже референсного предела.

Таблица 11. Процент свободного Т в подгруппах.

об. Т > 11 нмоль/л об.Т < 11 нмоль/л Р

Слюна 2,5 3,6 <0,0001

1,0 -4,4 2,2-17,0

Ультрафильтрат 0,9 1,3 0,070

0,3-1,7 0,2-2,5

Расчетный метод 1,9 2,0 0,026

1,1-2,7 1,4-2,8

Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия нор-ма/андрогенный дефицит использовать нижний предел референсных значений, то по данным расчетного метода А.Уегшеи1еп сниженная концентрация свободного тестостерона определялась в 15% случаев (референсный интервал: 225-545 пмоль/л). По результатам определения в слюне - в 18% случаев (референсный интервал: 260-555 пмоль/л), при определении общего тестостерона в сыворотке и свободного тестостерона в сыворотке с предварительной ультрафильтрацией в 20 и 38% случаев (референсный интервал: 11-34 нмоль/л и 110368 пмоль/л соответственно). Согласно этим данным, определение уровня свободного Т в сыворотке с предварительной ультрафильтрацией является более

чувствительным и точным маркером для выявления различных форм андроген-ных нарушений у мужчин.

Выводы

1. Использование прямых неизотопных методов и автоматизированных систем иммуноанализа для определения уровня общего тестостерона в крови является критическим при измерении данного маркера в диапазоне низких концентраций (<8-10 нмоль/л).

2. Концентрация тестостерона в слюне у мужчин, определенная методом усиленной хемилюминесценции, отражает уровень свободного, несвязанного с белками, тестостерона в крови. Физиологический диапазон его содержания в утренние часы составлял 270-544 пмоль/л со снижением в вечернее время на 20-30 %.

3. Использование параметра уровня общего и расчетного Т неприемлемо для диагностики у детей препубертатного этапа развития. Содержание св. Т в слюне является оптимальным биохимическим маркером для оценки андрогенного статуса у детей на всех стадиях пубертатного развития, включая стадию препубертата.

4. Концентрация свободного тестостерона в ультрафильтрате является более чувствительным маркером выявления андрогенного дефицита по сравнению с расчетным методом и методом его определения в слюне. Физиологический диапазон его колебаний в сыворотке крови взрослых мужчин составляет 110-368 пмоль/л.

5. При определении свободного тестостерона в слюне у здоровых мужчин возможно использование как LIA, так и ELISA технологии, однако, для диагностики андрогенного дефицита необходимо использовать LIA метод, также как и для определения свободного тестостерона в слюне у детей и подростков.

Практические рекомендации

1. Полученные результаты показывают важность выбора адекватного маркера уровня тестостерона для диагностики андрогенного статуса и надежного метода определения его содержания.

2. Высокая чувствительность и специфичность LIA-метода в сочетании с неинвазивностью и простотой получения слюны позволяет рекомендовать его для широкого использования в диагностической практике, включая динамический мониторинг различных состояний, изучение фармако-кинетики производных тестостерона при заместительной терапии.

3. Для выявления различных форм андрогенных нарушений у мужчин рекомендуется определять уровень свободного тестостерона в сыворотке, используя LIA метод с предварительной ультрафильтрацией.

4. Оценку андрогенного статуса у детей в период препубертата рекомендуется проводить по уровню свободного тестостерона в слюне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. «Современные подходы к оценке андрогенной функции у мужчин на модели сахарного диабета 1 и 2 типа: значение биологически доступного, свободного и общего тестостерона» (Гончаров Н.П., Кация Г.В., Калин-ченко С.Ю., Тодуа Т.Н., Малышева Н.М., Козлова О.Г., Мамаева Г.Г.)// Андрология и генитальная хирургия, 2003, № 2, стр. 53-56.

2. «Возрастной андрогенный дефицит и его диагностика» (Гончаров Н.П., Кация Г.В., Малышева Н.М.)// 1-я Конференция Российской ассоциации психонейроэндокринологии, Санкт-Петербург, сентябрь 2008.

3. «Андрогенный дефицит и проблемы его диагностики современными неизотопными методами определения тестостерона» (Гончаров Н.П., Кация Г.В., Добрачева А.Д., Малышева Н.М.)// Проблемы эндокринологии, 2008, т. 54, № 5, стр. 30-39.

4. «Диагностические возможности определения биологически активного свободного тестостерона в крови с использованием современной технологии ультрафильтрации» (Малышева Н.М., Кация Г.В., Гончаров Н.П.)// Проблемы эндокринологии, 2009, т.55, №3, стр. 34-37.

5. «Free Testosterone in Serum and Saliva for Assessment of Androgen Status» (Goncharov N, Katsya G, Malysheva N, Herbst V, Westermann J.)// 9-ый Международный Когресс Андрологии (Барселона, Испания, март 2009)

6. «Assessment of Androgen Status in Men and Women used Free Testosterone as Marker: Compare ELISA and Ultrasensitive Immunoluminescence Methods» (Goncharov N, Katsya G, Malysheva N) // 8-ой Европейский Конгресс по Менопаузе (Лондон, май 2009)

Список сокращений

Кд - константа диссоциации

ИМТ - индекс массы тела

СССГ - сексстероидсвязывающий глобулин

Т - тестостерон

об. - общий

расч. - расчетный

св. - свободный

РИА - радиоиммунологический анализ УФ - ультрафильтрация ELISA - ферментный иммуноанализ LIA - люминесцентный иммуноанализ п - размер выборки

р - доверительная вероятность (достоверность) г - коэффициент корреляции

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз. 2009 год.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малышева, Наталья Михайловна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биосинтез, метаболизм и регуляция секреции тестостерона.

1.2. Роль транспортных белков в формировании биологически активного пула тестостерона.

1.3. Биологическая функция тестостерона.

1.4. Тестостерон - ассоциированная патология на различных этапах развития мужского организма.

1.5. Современные методы определения тестостерона, проблемы и перспективы их решения.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Сравнительный анализ различных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови.

3.2. Определение свободной формы тестостерона в слюне.

3.3. Сравнительный анализ LIA и ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в широком диапазоне концентраций.

3.4. Определение свободной формы тестостерона в сыворотке крови методом люминесцентного иммуноанализа с предварительной ультрафильтрацией.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса"

Актуальность темы исследования. Проблемы, связанные с нарушениями физиологических механизмов регуляции функции репродуктивной системы у мужчин в различные периоды онтогенеза занимают одно из важных мест в современной биологии и медицине. Развитие и поддержание репродуктивной функции у мужчин определяется физиологической динамикой секреции тестостерона с формированием востребованного уровня циркулирующих форм тестостерона в крови. Нарушение этого сложного многофакторного процесса приводит к развитию целого ряда патологий в репродуктивном здоровье человека, лабораторная диагностика которых в первую очередь определяется адекватностью и доступностью методов. определения главного мужского гормона -тестостерона (Т).

Тестостерон является ключевым элементом системы гипотоламус-гипофиз-гонады. Физиологическая роль его у мужчин хорошо известна и заключается, прежде всего, в формировании мужского фенотипа и обеспечении сперматогенеза. Оценка андрогенного статуса необходима при широком спектре клинических симптомов и патологических состояний, например, таких как тестикулярная недостаточность, бесплодие, сексуальная дисфункция, гипогонадизм различного генеза и др. Мониторинг за уровнем Т необходим при проведении антиандрогенной терапии определенных форм дисгормонального рака, а также при проведении заместительной терапии препаратами производными Т. Точное количественное определение Т необходимо для диагностики широко распространенного возрастного андрогенного дефицита. У детей при замедленном или ускоренном половом созревании, нарушении деятельности надпочечников, тестикулярных и овариальных нарушениях. У женщин показаниями к определению тестостерона являются гирсутизм, тестикулярная феминизация, аменорея, бесплодие, андроген секретирующие опухоли^ яичников и надпочечников, синдром поликистозных яичников, андрогенная недостаточность.

Тестостерон циркулирует в крови в комплексе со специфическим глобулином (СССГ) — 35-75% (Кд - 20 сек.) и неспецифическим белком альбумином — 25-65% (Кд - 1 сек), который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет его высокой концентрации в крови. И только 1-2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде. Свободный, тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона. Обычно содержание общего тестостерона в сыворотке здоровых мужчин колеблется в. пределах физиологической нормы (12-30 нмоль/л) и коррелирует с концентрацией СССГ. Свободный тестостерон и связанный с альбумином тестостероном обозначают как биологически активную форму гормона, обеспечивающую его биологические ' эффекты. Однако даже в физиологических условиях концентрация СССГ широко варьирует в зависимости от диеты, ИМТ, концентрации инсулина и -возраста. А при патофизиологических состояниях, таких как острый и хронический стресс, психосоматические патологии, гипогонадизм и т.д., уровень СССГ, а также альбумина и их соотношение нарушается, что неизбежно влияет на содержание биологически доступного Т.

Именно поэтому наличие адекватных аналитических методов определения св.Т, обеспечило бы наиболее оптимальную диагностику андрогенного статуса организма как у мужчин, так и у женщин и детей, особенно до периода полового созревания.

Цель настоящей^ работы: оценка адекватности определения? общего тестостерона крови различными методами- иммуноанализа, разработка' современного высокочувствительного метода определения в слюне и сыворотке крови свободной формы тестостерона как маркера для оценки андрогенного статуса; и доказательства надежности его применения при различных физиологических и патофизиологических условиях у детей, подростков и взрослых мужчин:,

Для^достижения этой .цели поставлены следующие задачи:

1. Провести .сравнительный анализ; современных методов определения общего тестостерона в сыворотке крови и выбрать наиболее надежный.

2. Адаптировать метод: определения, свободной формы тестостерона в; слюнной жидкостиj стандартизировать методику сбора слюны и определить, диапазон физиологических, колебаний уровня свободного тестостерона у детей, подростков и взрослых мужчин; ' :

3. Разработать методические подходы для определения- свободной формы тестостерона в- сыворотке методом люминесцентного иммуноанализа с предварительной ультрафильтрацией и определить диапазон физиологических колебаний свободного тестостерона в сыворотке.

4.: Провести сравнительный анализ современных методов определения свободной формы тестостерона в слюне: и сыворотке крови.

5. Оценить возможности LIA и" ELISA технологий для определения свободной формы тестостерона в слюне в зависимости от используемого диапазона-концентраций.

Научная новизна. В представленной работе впервые проведена комплексная сравнительная: оценка современных методов иммуноанализа общего и свободного тестостерона у мужчин в различных биологических жидкостях.

Впервые в России адаптирован и обосновано введен в рутинную практику метод определения свободной формы тестостерона в слюнной жидкости на моделях различных физиологических и патофизиологических состояний репродуктивной системы.

Установлено, что использование количественных параметров общего и расчетного Т имеет существенные ограничения для оценки андрогенного статуса у детей в период препубертата (до 10 лет). В то же время определение содержания св. Т в слюне является дополнительным к клинической симптоматике и важным биохимическим маркером для диагностики возможных нарушений андрогенного гомеостаза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты определения уровня общего тестостерона прямыми неизотопными методами и автоматизированными системами широко варьируют в одних и тех же образцах сыворотки, особенно в диапазоне низких концентраций.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде докладов на 8-ом Международном Конгрессе Андрологии (Сеул, июнь 2005), Международной Конференции «Балтийский форум» (Санкт-Петербург, июнь 2008), в виде тезисов на 9-ом Международном Конгрессе Андрологии (Барселона, Испания, март 2009), на 8-ом Европейском Конгрессе по Менопаузе (ЕМАБ) (Лондон, май 2009). По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в зарубежной печати.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Малышева, Наталья Михайловна

ВЫВОДЫ

2. Концентрация тестостерона в слюне у мужчин, определенная методом усиленной хемилюминесценции' отражает уровень свободного, несвязанного с белками, тестостерона в крови. Физиологический диапазон его содержания в утренние часы составлял 270-544 пмоль/л со снижением в вечернее время на 20-30 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Высокая чувствительность и специфичность LIA метода в сочетании с неинвазивностью и простотой получения слюны позволяет рекомендовать его для широкого использования в диагностической практике, включая динамический мониторинг различных состояний, изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малышева, Наталья Михайловна, Москва

1. Гончаров Н.П. и др. Характеристика стероидогенеза у обезьян при стрессе; зависимость от пола и возраста. // Вестник акад.мед.наук СССР. 1987. - № 10. - стр.88-94.

2. Гончаров Н.П., Кация Г.В., Колесникова Г.С. и др. Сравнительный анализ определения тестостерона в сыворотке крови различными методами. // Пробл.эндокрин. 2005. — т.51. - №6. - стр.31-37.

3. Гормональный анализ в диагностике болезней эндокринных желез. / под ред. Гончарова Н.П. М., 2009.

4. Дегидроэпиандростерон: свойства, метаболизм, биологическое значение. / Гончаров Н.П., Кация Г.В., Нижник А.Н. М., 2004.

5. Кация Г.В. Эндокринная функция тестикул у павианов гамадрилов при хроническом психоэмоциональном стрессе. // Бюл.эксп.биол.мед. -1984. т.97. - №3. - стр.285-287.

6. Урусова М.Е., Головаченко В.А., Гитель Е.П. и др. Сравнение наборов реагентов четырех фирм-производителей по качеству определения аналитов и относительной диагностической ценности. // Коммерческая биотехнология. — 2003. №6. - стр. 1-14.

7. Физиология эндокринной системы. / под ред. Дж. Гриффина, С Охеды. -М., 2008.

8. Элементы эндокринной регуляции. / под ред. Смирнова А.Н. М., 2006.

9. Abbaticchio G., de Fini М., Giagulli V.A. et al. Circannual rhythms in reproductive functions of human males, correlations among hormones and hormone-dependent parameters. // Andrologia. — 1987. Vol.19. - P.353-361.

10. Abbott D.H., Padmanabhan V., Dumesic D.A. Contributions of androgen and estrogen to fetal programming of ovarian dysfunction. // Reprod.Biol.Endocrinol. 2006. - Vol.4. - P.17.

11. Albrecht S., Zimmermann T., Brandi H. et al. Chemiluminescence at the turn of the millennium from annual fair curiosity to indispensable tool of laboratory diagnostics. // J.Lab.Med. - 1997. - Vol.21. - P. 191-204

12. Arregger A.L., Contreras L.N., Tumilasci O.R. et al. Salivary testosterone: a reliable approach to the diagnosis of male hypogonadism. // Clin.Endocrinol.- 2007. Vol.67. - N5. - P.656-662.

13. Bachmann G., Bancroft J., Braunstein G. et al. Female androgen insufficiency: the Princeton consensus statement on definition, classification, and assessment. // Fertil.Steril. 2002. - Vol.77. - P:660-665.

14. Badr F.M., Bartke A., Dalterio S., Bulger W. Suppression of testosterone production by ethyl alcohol. Possible mode of action. // Steroids. 1977. — Vol.30.-P.647-655.

15. Baker H.W.G., Burger H.G., de Krester M.D., and Hudson B.: Relative incidence of etiological disorders in male infertility. // In: Male Reproductive Dysfunction, RJ. Santen and R.S. Swerdloff, eds., Marcel Dekker, New York. 1986. - P.341-372.

16. Bhasin S., Storer T., Berman N. et al. The effects of supraphysiologic doses of testosterone on muscle size and strength in normal men. // N.Engl. J.Med.- 1996.-Vol.335.-P.l-7.

17. Bolour S., Braustein G. Testosterone therapy in women: a rewiew. // Int.Impot.Res. 2005. - Vol.17. - N5. - P.399-408.

18. Boots L.R., Potter S., Potter D. et al. Measurement of total serum testosterone levels using commercially available kits: high degree of between-kit variability. // Fertil.Steril. 1998. - Vol.69. - P.286-292.

19. Brambilla D.J., O'Donnel A.B., Matsumoto A.M., McKinlay J.B. Lack of seasonal variation in serum sex hormone levels in middle-aged to older men in the Boston area. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P.4224-4229.

20. Broadbent J.L. Salivary testosterone: is it an indicator of free testosterone concentration in plasma.// NZ.L.Med.Lab.Science. 2002. - Vol.56. -P.85-89.

21. Burger H.G. et al. Serum gonadotropin, sex steroids and immunoreactive inhibin in the first two years of life. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1991. -Vol.72.-P.682-686.

22. Butler G.E. et al. Salivary testosterone levels and the progress of puberty in the normal boy. // Clin.Endocrinol. 1989. - Vol.30. - P.587-596.

23. Cameron D.R., Braunstein G.D. Androgen replacement therapy in women. // Fertil.Steril. 2004. - Vol.82. - P.273-289.

24. Carruthers M., Trinick T.R., Wheeler M.J. The validity of androgen assays. // Aging Male. 2007. - V.10. - N3. - P. 165-172.

25. Carruthers M. The paradox dividing testosterone deficiency symptoms and androgen assays: a closer look at the cellular and molecular mechanisms of androgen action. // J.Sex.Med. 2008. - Vol.5. - P.998-1012.

26. Chada M. et al. Inhibin B, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone and testosterone during childhood and puberty in males: changes in serum concentrations in relation to age stage of puberty. // Physiol.Res. -2003.-Vol.52.-P.45-51.

27. Chahal H., Drake W. The endocrine system and aging. // J.Pathol. 2007. -Vol.211. -N3.-P.173-180.

28. Chiu S.K., Collier C.P., Clark A.F., Wynn-Edwards K.E. Salivary Cortisol on ROCHE Elecsys immunoassay system: pilot biological variation studies. // Clin.Biochem. 2003. - Vol.36. - P.211-214.

29. Choi H.H., Gray P.B., Storer T.W. et al. Effects of testosterone replacement in human immunodeficiency virus-infected women with weight loss. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. -V. 90. - P. 1531-1541.

30. Christiansen K. Behavioural effects of androgen in men and women. // J.Endocrinol. 2001. - Vol.170. - N1. - P.39-48.

31. Clark B.R., Engvall E. Enzyme-immunoassaay. // CRC Pres. 1983.

32. Corradi G., Szathmari M. Serum and salivary testosterone levels in erectile dysfunction. // Orv.Hetil. 1998. - V.139. - N54. - P.2021-2024. •

33. Cunha G.R., Cooke P.S., Kurita T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. // Arch.Histol.Cytol. 2004. - Vol.67. - N5. - P.417-434.

34. Dabbs Jr J.M. Age and seasonal variation in serum testosterone concentration among men. // Chronobiol.Int. 1990. - Vol.7. - P.245-249.

35. Dabbs J.M. Salivary testosterone measurements: reliability across hours, days and weeks. // Physiology & Behaviour. 1991. - Vol.49. - P.815-817.

36. Dabbs J.M., Campbell B.C., Gladue B.A., et al. Reliability of salivary testosterone measurements: a multicenter evaluation. // Clin.Chem. 1995. -Vol.41. - P.1581-1584.

37. Daly W., Seegers C.A., Rubin D.A. et al. Relationship between stress hormones and testosterone with prolonged endurance exercise. // Eur.J.Appl.Physiol. 2005. - V. 93. - P. 375-380.

38. Davison S., Bell R., Donath S. et al. Androgen levels in adult females: changes with age, menopause and oophorectomy. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. - Vol.90. - P.3847-3853.

39. Diver M.J., Imtiaz K.E., Ahmad A.M. et al. Diurnal rhythms of serum total, free and bioavailable testosterone and of SHBG in middle-aged men compared with those in young men. // Clin.Endocrinol.(Oxf). — 2003. -Vol.58. -P.710-717.

40. Diver M.J. Laboratory measurement of testosterone. // Front.Horm.Res. -2009.-Vol.37. -P.21-31.

41. Dorgan J.F., Fears T.R., McMahon R.P. et al. Measurement of steroid sex hormones in serum: a comparison of radioimmunoassay and mass spectrometry. // Steroids. 2002. - Vol.67. - P.151-158.

42. DPC Technicfl services department. Immulite/immulite, 1000 total testosterone — manufactures instruction. // PILKTW-7, Los Angeles, USA,2005.

43. Dufau M., Catt K., Tsurahara T. et al. Radioimmunoassay of plasma testosterone. // Clin.Chem.Acta. 1972. - Vol.37. - P.109-116.

44. Edwards D.A., Wetzel K., Wyner D.R. Intercollegiate soccer: saliva Cortisol and testosterone are elevated during competition, and testosterone is related to status and social connectedness with teammates. // Physiol.behave.2006. Vol.87. - P.135-143.

45. Ehrmann D.A. Polycystic ovary syndrome. // N.Engl J.Med. 2005. -Vol.352. -P.1223-1236.

46. Ekins R. The free hormone hypothesis and measurement of free hormones. // Clin.Chem. 1992. - Vol.38. - N7. - P. 1289-1293.

47. Ellison P.T., Bribiescas R.G., Bentley GR et al. Population variation in age-related decline in male salivary testosterone. // Hum.Reprod. 2002. — Vol.17.-P.3251-3253.

48. El-Migdadi F., Nusier M., BashirN. Seasonal pattern of leuteinizing, follicle-stimulating hormone, testosterone and progesterone in adult population of both sexes in the Jordan Valley. // Endocr.Res. 2000. -Vol.26.-P.41-48.

49. Elmlinger M.W., Kuhnel W., Wormstall H. et al. Reference interval for testosterone, androstenedione and SHBG levels in healthy females and males from birth until old age. // Clin.Lab. 2005. - Vol.51. - N11-12. -P.625-632.

50. Elwan O., Abdallah M., Issa I. et al. Hormonal changes in cerebral infsrction in the young and elderly. // J.Neurol.Sci. 1990. - Vol.98. -P.235-243.

51. Feldman H.A., Longcope C., Derby C.A. et al. Age trends in the level of serum testosterone and other hormones in middle-aged men: Longitudinal results from the Massachusetts male aging study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2002. - Vol.87. - P.589-598.

52. Fugua J.S., Sher E.S., Migeon C.J. et al. Assay of plasma testosterone during the first six months of life: importance of chromatographic purification of steroids. // Clin.Chem. 1995. - Vol.41. - P.l 146-1149.

53. Fuller S.J., Tan R.S., Martins R.N. Androgens in the etiology of Alzheimer's disease in aging men and possible therapeutic interventions. // J.Alzheimer's.Disease. -2007. Vol.12. - P. 129-142.

54. Garde A.H., Hansen A.M. Long-term stability of salivary Cortisol. // Scand.J.Clin.Lab.Invest. 2005. - Vol.65. - P.433-436.

55. Gnessi L., Fabbri A., Spera G. Gonadal peptides as mediators of development and functional control of the testis: An integrated system with hormones and local environment. // Endocr.Rev. 1997. - Vol.18. - P.541-609.

56. Goncharov N., Katsya G., Dobracheva A. et al. Serum testosterone measurement in men: evalution of modern immunoassay technologies. // Aging Male. 2005. - V.8. - N3-4. - P. 194-202.

57. Gordon M.K., Peloso E., Auker A., Dozier M. Effect of flavored beverage crystals on salivary Cortisol enzymeimmunoreactive assay measurements. // Dev.Psychobiol. 2005. - Vol.47. - P. 189-195.

58. Granger D.A. et al. Salivary testosterone determination in studies of child health and development. // Hormones and Behaviour. 1999. - Vol.35. -P. 18-27.

59. Granger D.A., Shirtcliff E.A., Booth A. et al. The "trouble" with salivary testosterone. // Psychoneuroendocrinology. — 2004. Vol.29. - P. 12291240.

60. Griffin J.E., Wilson J.D. Disorders of the testes and male reproductive tract. // In: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., P.R. Larsen, H.M. Kronenberg, S. Melmed, and K.S. Polonsky, eds. Saunders, Philadelphia, 2003. P.709-769.

61. Groschl M., Rauh M. Influence of commercial collection devices for saliva on the reliability of salivary steroids analysis. // Steroids 2006. Vol.71. -N13-14. -P.1097-1100.

62. Guo T., Taylor R.L., Singh R.J., Soldin S.J. et al. Simultaneous determination of 12 steroids by isotope dilution liquid chromatography-photospray ionization tandem mass spectrometry. // Clin.Chemica.Acta. -2006.-Vol.372.-P.76-82.

63. Hamallainen E.K., Adlercreutz H., Puska P., Pietinen P. Decrease of serum total and free testosterone during a low-fat high-fibre diet. // J.Steroid.Biochem. 1983. - Vol.18. - P.369-370.

64. Hammond G.L., Nikser J.A., Jones L.A., Sitteri R.K. Estimation of the percentage of free steroids in undiluted serum by centrifugal ultrafiltration -dialysis. // J.Biol.Chem. 1980. - Vol.255. - P.5023-5026.

65. Hammond G.L., Langley M.S. Identification and measurement of sex hormone binding globulin (SHBG) and corticosteroid binding globulin (CBG) in human saliva. // Acta.Endocrinol.(Copenh). 1986. - Vol.112. -P.603-608.

66. Hayes F.J., Seminara S.B., and Crowley W.F. Jr. Hypogonadotropic hypogonadism. // Endocrinol.Metab.Clin.North.Am. 1998. - Vol.27. -P.739-763.

67. Heikkonen E., Vlikahri R., Roine R. et al. The combine effect of alcohol and physical exercise on serum testosterone, luteinzing hormone and Cortisol in males. // Alcohol.Clin.Exp.Res. 1996. - V.20. - P.711-716.

68. Hemmula I., Dakubu S., Mukkala V.M. et al. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. // Analyt.Biochemistry. 1984. -Vol.137.-P.335-343.

69. Herold D.A., Fitzgerald R.L. Immunoassays for testosterone in women: better than a guess? // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. - P.1250-1251.

70. Hogervorst E., Williams J., Budge M. et al. Serum total testosterone is lower in men with Alzheimer's disease. // Neuroendocrinol.Lett. — 2001. -Vol.22. -P.163-168.

71. Hubert W. Psychotropic effects of testosterone. // In: Nieschlag E, Behre H.M., eds. Testosterone, Springer Verlag, Berlin, 1990. P.51-71.

72. Hughes I.A. Minireview: sex differentiation. // Endocrinology 2001. -Vol.142.-P.3281-3287.

73. Jeibmann A., Zahedi S., Simoni M. et al. Glucagon like peptide-1 reduces the pulsatile component of testosterone secretion in healthy males. // Eur.J.Clin.Invest. 2005. - Vol.35. - P. 565-572.

74. Jockenhovel F., Haase S., Hoerman R. et al. // J.Clin.Ligand Assay. 1996. -Vol.19.-P.138-144.

75. Jones R.D., Hugh Jones T., Channer K.S. The influence of testosterone upon vascular reactivity. // Eur.J.Endocrinol. 2004. - Vol. 151. - N1. -P.29-37.

76. Kahn S.M. et al. Sex hormone-binding globulin is synthesized in target cells. // J.Endocrinol. 2002. - Vol.175. - P. 113-120.

77. Kalfas S., Rundegren J. Biological qualities of saliva sterilized by filtration or ethylene oxide treatment. // Oral.Microbiol.Immuno. 1991. - Vol.6. -P.182-186.

78. Kaufman J.M., VermulenA. Androgens in male senescence. // In: Nieschlag E, Behre HM, eds. Testosterone: Action, deficiency, substitution. Berlin, Springer Verlag, 1998. -P.437-471.

79. Kirkpatrick S.W., Campbell P.S., Wharry R.E., Robinson S.L. Salivary testosterone in children with and without learning disabilities. // Physiol.Behav. 1993. - Vol.53. - P.583-586.

80. Kivlighan K.T., Granger D.A., Schwartz E.B. et al. Quantifying blood leakage into the oral mucosa and its effects on the measurement of Cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva. // Horm.Behav. 2004. - Vol.46. -P.39-46.

81. Kivlighan K.T., Granger D.A., Booth A. Gender differences in testosterone and Cortisol response to competition. // Psychoneuroendocrinolgy. 2005. -Vol.30.-P.58-71.

82. Klee G.G., Heser D.W. Techniques to measure testosterone in the elderly. // Mayo.Clin.Proc. 2000. - Vol.75. - P. 19-25.

83. Kuhn C.M. Anabolic steroids. // Recent.Prog.Horm.Res. 2002. - Vol.57. -P.411-434.

84. Kushnir M., Rockwood A.L., Roberts W.L. et al. Performance characteristics of a novel tandem mass spectrometry assay for serum testosterone. // Clin.Chem. 2006. - Vol.52. - P. 120-128.

85. Lac G., Lac N., Robert A. Steroid assays in saliva: a method to detect plasmatic contaminations. // Arch.Int.Physiol.Biochem.Biophys. 1993. -Vol.101.-N5.-P.257-262.

86. Landman A.D., Sanford L.M., Howland B.E. et al. Testosterone in human saliva. // Experientia. 1976. - Vol.32. - P.940-941.

87. Laughlin G.A., Barrett-Connor E., Kritz-Silverstein D., von Miihlen D. Hysterectomy, oophorectomy and endogenous sex hormone levels in older women: the Rancho Bernardo study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. — 2000. -Vol.85. -P.645-651.

88. Lewis J.G. Steroid Analysis in saliva: an overview. // Clin.Biochem.Rev. -2006. Vol.27. - N3. - P. 139-146.

89. Liang T. Androgens and skin: 5a-reductase activity in skin and androgen dependent skin disorders. In: Bhasin S, Gabelnick H.L., Spieler J.M. et al. Pharmacology, biology, and clinical applications of androgens. // John Wiley, New York, 1996. P.247-256.

90. Liu P.Y., Death A.K., Handelsman DJ. Androgens and cardiovascular disease. // Endocr.Rev. 2003. - Vol.24. - N3. -P.313-340.

91. Longcope C., Feldman H.A., McKinlay J.B., Araujo A.B. Diet and sex hormone-binding globulin. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2000. - Vol.85. -P.293-296.

92. Lunenfeld B. Endocrinology of aging male. // Minerva.Ginecol. 2006. -Vol.58. - N2.- P. 153-170.

93. Maes M., Mommen K., Hendrickx D. et al. Components of biological variation, including seasonality, in blood concentrations of TSH, TT3, FT4, PRL, Cortisol and testosterone in healthy volunteers. // Clin.Endocrinol.(Oxf). 1997. - Vol.46. -P.587-598.

94. Main K., Smith I.M., Skakkebaek N.E. A possible role for reproductive hormones in newborn boys: progressive hypogonadism without the postnatal testosterone peak. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2000. - Vol.85. - P.4905-4907.

95. Male hypogonadism. / Jockenhövel Fr. Auflage - Bremen: UNI-MED., 2004.

96. Maso F., Lac G., Filaire E. et al. Salivary testosterone and Cortisol in rugby players: correlation with psychological overtraining items. // Br.J.Sports.Med. 2004. - Vol.38. - P.260-263.

97. Matsumoto A.M., Bremner W.J. Editorial: Serum testosterone assays — accuracy matters. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2004. - Vol.89. - P.520-524.

98. McPhaul M.J. Molecular defects of the androgen receptor. // Recent.Prog.Horm.Res. 2002. - Vol.57. P. 181-194.

99. Meulenberg E.P., Hofman J.A. The effect of pre-treatment of saliva on steroid hormone concentrations. // J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1990. — Vol.28.-P.923-928.

100. Miller K., Sesmilo G., Schiller A. et al. Androgen deficiency in women with hypopituitarism. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2001. - Vol.86. - P.561-567.

101. Mohr B.A., Guay A.T., O'Donnell A.B., McKinlay J.B., Normal, bound and nonbound testosterone levels in normally ageing men: Results from the Massachusetts Male Aging Study. // Clin.Endocrinol.(Oxf). 2005. -Vol.62.-P.64-73.

102. Mooradian A.D., Morley J.E., Korenman S.G. Biological actions of androgens. // Endocr.Rev. 1987. - Vol.8. - P. 1-27.

103. Morelius E., Nelson N, Theodorsson E. Saliva collection using cotton buds with wooden sticks: a note of caution. // Scand.J.Clin.Lab.Invest. -2006.-Vol.66.-P.15-18.

104. Morrison J.A., deGroot I., Edwards B.K. et al. Plasma cholesterol and triglyceride levels in 6775 school children, ages 6-17. // Metabolism. 1977. -Vol.26.-P.1199-1211.

105. Morrison J.A., Laskarzewski P.M., Rauh J.L. Lipids, lipoproteins, and sexual maturation during adolescence: the Princeton Maturation Study. // Metabolism. 1979. - Vol.28. - P.641-649.

106. Muller M.J. Salivary testosterone and simple reaction time parameters. // Neuropsychobiology. 1994. - Vol.30. -P.50-55.

107. Obminski Z. Changes in the free (unbound) fraction of testosterone in serum in vitro as affected by pH and temperature. // Exp.ClinJEndocrinol.Diabetes. 1998. - Vol.106. -P.85-88.

108. Olino S., Christian L., Attardi B. Role of testosterone in normal female function. //Nat.New.Biol. 1973. - Vol.243. - P. 119-120.

109. Ohzeki T., Mandella B., Gubelin-De Campo C., Zachmann M. Salivary testosterone concentrations in prepubertal and pubertal males: comparison with total and free plasma testosterone. // Horm.Res. 1991. - Vol.36. — P.235-237.

110. Okun M.S., McDonald W.M., DeLong M.R. Refractory nonmotor symptoms in male patients with Parkinson disease due to testosterone deficiency: A common unrecognized comorbidity. // Arch.Neurol. — 2002. — Vol.59. -P.807-811.

111. Ostatnikova D., Pastor K., Putz Z. et al. Salivary testosterone levels in preadolescent children. // BMC Pediatrics. 2002. - Vol.3. - N2. - 5.

112. Pardridge W.M. Transport of protein-bound hormones into tissues in vivo. // Endocr.Rev. 1981. - Vol.2. - P. 103-123.

113. Pardridge W.M. Serum bioavailability of sex steroid hormones. // Clin.Endocrinol.Metab. 1986. - Vol.15. - P. 259-278.

114. Passelerque P. et al. Saliva Cortisol, testosterone and T/C ratio variations during a wrestling competition and during the post-competitive recovery period. //IntJ.Sports.Med. 1999. - Vol.20. -P.109-113.

115. Perry 3rd H.M., Miller D.K., Patrick P., Morley J.E. Testosterone and leptin in older African-American men: relationship to age, strength, function, and season. // Metabolism. 2000. - Vol.49. - P. 1085-1091.

116. Plymate S.R., Tenover J.S., Bremner W.J: Circadian variation in testosterone, sex hormone-binding globulin, and calculated non-sex hormone-binding globulin bound testosterone in healthy young and elderly men. // J.Androl. 1989. - Vol.10. - P.366-371.

117. Raff H., Homar P.J., Skoner D.P. New enzyme immunoassay for salivary Cortisol. // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. -P.203-204.

118. Ray R., Novotny N:M., Crisostomo P.R. et al. Sex steroid and stem cell function. // Mol.Med. 2008. - Vol.14. - N7-8. -P.493-501.

119. Rilling J.K., Worthman C.M., Campbell B.C. et al. Ratios of plasma and salivary testosterone throughout puberty: production versus bioavailability. // Steroids. 1996. - Vol.61. -P.374-378.

120. Rosario E.R., Pike C.J. Androgen regulation of P-amyloid protein and risk of Alzheimer's disease. // Brain.Res.Rev. 2008. - Vol.57. - N2. - P.444-453.

121. Rosner W. Plasma steroid-binding proteins. // Endocrinol.Metab.Clin.North.Am. 1991. - Vol.20. - P.697-720.

122. Rosner W. Errors in the measurement of plasma free testosterone. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1997. - Vol.82. -P.2014-2015.

123. Rosner W., Auchus R., Azziz R. et al. POSITION STATEMENT: Utility, limitations and pitfalls in measuring testosterone: An Endocrine Society position statement. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P.405-413.

124. Sarkova T., Eriksson C.J. Testosterone increases in men after a low dose of alcohol. I I Alcohol.Clin.Exp.Res. 2003. - P.682-685.

125. Sartorius G., Ly L.P., Sikaris K. et al. Predictive accuracy and sources of variability in calculated free testosterone estimates. // Ann.Clin.Biochem. -2009. Vol.46. - N2. - P.137-143.

126. Scerbo A.S., Kolko D.J: Salivary testosterone and Cortisol in disruptive children: relationship to aggressive, hyperactive, and internalizing behaviors. // J.Am.Acad.Child.Adolesc.Psychiatry. 1994. - Vol.33. - P. 1174-1184.

127. Siekman L. Determination of steroid hormones by the use of isotope dilution—mass spectrometry: a definitive method in clinical chemistry. // J.Steroid.Biochem. 1979. - Vol.11. - P.117-123

128. Sikaris K., McLachlan R.I., Kazlauskas R. et al. Reproductive hormone reference intervals for healthy fertile young men: evaluation of automated platform assays. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2005. - Vol.90. - N11. -P.5928-5936.

129. Simpson E.R. Aromatization of androgens in women: current concepts and findings. // Fertil.Steril. 2002. - Vol.77. - N4. - P.6-10.

130. Sparrow D., Bosse R., Rowe J.W. The influence of age, alcohol consumption, and body build on gonadal function in men. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1980. - Vol.51. -P.508-512.

131. Stanworth R.D., Jones T.H. Testosterone for the aging male; current evidence and recommended practice. // Clin.Interv.Aging. — 2008. — Vol.3. -N1. -P.25-44.

132. Stewart P.M., Whorwood C.B., Mason L. Type 2 11 P-hydroxy steroid dehydrogenase in fetal and adult life. // J.Steroid.Biochem.Mol.Bio. 1995. -Vol.55. -P.465-471.

133. Strazdins L., Meyerkort S., Brent V. Et al. Impact of saliva collection methods on slgA and Cortisol assays and acceptability to participants. // J.Immunol.Methods. 2005. - Vol.307. - P. 167-171.

134. Svartberg J., Jorde R., Sundsford J. et al. Seasonal variation of testosterone and waist to hip ratio in men: the Troms study. // J.Clin.Endocrinol.Metab. -2003. Vol.88. - P.3099-3104.

135. Swinkels L.M., Van Hoof H.J., Ross H.A. et al. Low ratio of androstendione to testosterone in plasma and saliva of hirsute women. // Glin.Chem.- 1992.- Vol.38. -P.1819-1823.

136. Taieb J., Mathian B., Millot F. et al. Testosterone measurement by 10 immunoassays and by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry in sera from 116 men, women and children. // Clin.Chem. -2003. Vol.49. - P. 13 81 -1395.

137. Travison T.G. et al. A population-level decline in serum testosterone levels in American men. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 2007. - Vol.92. - P. 196202.

138. Umehara T., Kumamoto Y., Mikuma N. et al. Salivary testosterone in normal boys at puberty. // Nippon.Naibunpi.Gakkai.Zasshi. 1991. -Vol.67.-P.230-238.

139. Urban R.J., Bodenburg Y.H., Gilkison C. et al. Testosterone administration to elderly men increases skeletal muscle strength and protein synthesis. // Am.J.Physiol. 1995. - Vol.269. - P.820-826.

140. Van Aken M.O., Romijn J.A., Miltenburg J.A., Lentjes E.G. Automated measurement of salivary Cortisol. // Clin.Chem. 2003. - Vol.49. - P. 14081409.

141. Vermeulen A., Kaufman J.M. Aging of the hypothalamo-pituitary-testicular axis in men. // Horm.Res. 1995. - Vol.43. - N1-3. - P.25-28.

142. Vermeulen A., Kaufman J.M., Giagulli V.A. Influence of some biological indexes on sex hormone-binding globulin and androgens levels in aging or obese males. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1996. - Vol.81. -P.1821-1826.

143. Vermeulen A., Verdonc K.L., Kaufman J.M. A critical evaluation of sample methods for the estimation of free testosterone in serum. // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1999. - Vol.84. - P.3666-3672.

144. Vermeulen A., Kaufman J.M. Diagnosis of hipogonadism in the aging male: // Aging male. 2002. - Vol.5. - P. 170-176.

145. Vialard-Miguel J., Belaidi N., Lembeye L., Corcuff J.B. Lemon juice alters Cortisol in saliva. // Clin.Endocrinol. 2005. - Vol.63. - P.478-479.

146. Vining R.F., McGinley R.A., Symons R.G. Hormones in saliva: mode of entry and consequent implication for clinical interpretation. // Clin.Chem. -1983. Vol.29. - P.1752-1756.

147. Vining R.F., McGinley R.A. The measurement of hormones in saliva: possibilities and pitfalls. // J.Steroid.Biochem. 1987. - Vol.27. - P.81-94.

148. Wall J.R., Jarrett R.J., Zimmet P.Z. et al. Fall in plasma testosterone levels in normal vale subjects in response to an oral glucose load. // Lancet.1973.-Vol.1.-P.967-968.

149. Walters K.A., Allan C.M., Handelsman D.J. Androgen actions and the ovary. // Biol.Reprod. 2008. - Vol.78. - P.380-389.

150. Wang C., Yonatt G., O'Connor S. et al. A simple radioimmunoassay for plasma-testosterone plus 5alpha-dihydrotestosterone. // J.SteroidJBiochem.1974.-Vol.5.-P.551-555.

151. Wang C., Catlin D.H., Demers L.M. et al. Measurement of total serum testosterone in adult men: comparison of current laboratory methods versus liquid chromatography tandem mass spectrometry. // J.Clin.Endocrinol.Metab. - 2004. - Vol.89. - P.534-543.

152. Ware V.C. The role of androgens in follicular development in the ovary. I. A quantitative analysis of oocyte ovulation. // J.Exp.Zool. — 1982. — Vol.222. -P.155-167.

153. Weiner C.L., Primeau M., Ehrmann D.A. Androgens and mood dysfunction in women: comparison of women with polycystic ovarian syndrome to healthy controls. // Psychosomatic.Med. 2004. - Vol.66. -P.356-362.

154. Wheeler M.J., D'Souza A., Matadeen Ji et al. Ciba Corning ACS: 180 testosterone assay evaluated. // Clin.Chem. 1996. -Vol.42. - P.1445-1449.

155. Wheeler M.J. Factors that affect the interpretation of testosterone results. // CPD.Clin.Biochem. 2003. - Vol.5. - P.86-90.

156. Whembolua G.L., Granger D.A., Singer S. et al. Bacteria in the oral mucosa and its effects on the measurement of Cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva. // Horm.Behav. 2006. - Vol.49.-P.478-483.

157. Wilson J.D. The role of 5-alpha-reduction in steroid hormone physiology. // Reprod.Fertil.Dev. Vol.13. - P.673-678.

158. Yavus B., Ozakayar N., Halil M. et al. Free testosterone levels and implications on clinical outcomes in elderly men. // Aging.Clin.Exp.Res. -2008. Vol.20. - N3. - P.201-206.

159. Zhan Sh. Critical review of development, validation and transfer for high through put bioanalytical LC-MS/ MS methods. // Current.Pharmaceutical.Analysis. 2005. - Vol.1. - P.3-14.

160. Zitzmann M. Effects of testosterone replacement and its pharmacogenetics on physical performance and metabolism. // Asian.J.Androl. 2008. -Vol.10.-N3.-P.364-372.

Информация о работе

Малышева, Наталья Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Свободные биологически активные формы тестостерона как наиболее адекватные маркеры для оценки андрогенного статуса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы