Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободнорадикальные процессы в белках при их механической деструкции

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальные процессы в белках при их механической деструкции"

Агентство биоинформатики и экологии человека Международной неправительственной организации «Форум ученых и специалистов за советско-американский

диалог»

На правах рукописи УДК 547.96:577.3.45:612.014.4

ГАСЫМОВ ОКТАЙ КАЗЫМ ОГЛЫ

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БЕЛКАХ ПРИ ИХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ

03.00.16 — экология, 03.00.02 — биофизика

ДИССЕРТАЦИ Я на соискание ученой степени доктора физикоматематических наук в форме научного доклада

Москве) - 1992

Работа выполнена в Институте физики АН Азербайджана

Официальные оппонентьг.-доктор физико-математических наук, профессор Холмогоров В.Е.

-доктор физико-математический наук Ким Ю.А.

-доктор биологических наук . Хашаев З.Х.

Ведущая организация: Биологический факультет

МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « » ^ •.

1992 года в час 00 мин.1"' на заседании

Специализированного Совета Д.170.01.01 ири Агентстве биоинформатики и экологии человека Международной неправительственной организации «Форум ученых и специалистов за советско-американский диалог» по адресу: і 17342, Москва, пр.60-летия Октября, 7/1, конференц-зал.

Автореферат разослан ________1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор физико-математических наук Добряков С.Н.

ГОСУ,; • •>

БИОЛлО і £‘.кА - з _ • .

■ Обгая характеристика работа

Актуальность проблеми. Вопросы механодеструкиии биомакромолекул выделились на об’соП" проблемы "Мзханодеструкция макромолекул" и связи с особыми свойствами биологических полимэров, с одной стороны, и многообразием и специфичностью форм их использования, с другой.

В последние годи особенно условно продвигается исследование меха-нодэптрукции белков. Здесь нугао отметить, во-первых, фундамонталь-ныэ аспекты проблема : механодеструкция, свободнорзднкзльнке реакции в белках и другие направления исследования. Во-вторых, важными являются прикладные аспекты. Белки всэ больше используются о фармакологической, пищевой, легкой промышленности и в других областях народного хозяйства. В частности, для получения некоторых лекарственных препаратов и пищевых продуктов используются белковые ' порошки, полученные путем механической деструкции. Этот процесс оказывает разрушающее воздействие на белки и ухудаает их физикохимические и другие свойства.В-третьих, следует указать но то, что свободнорадикальные процессы является основными процессами в случае действия на макромолекулы всевозможных повреждающих факторов окружающей среди (ультрафиолетовое излучение, ионизируюызя радиация, механодеструкиия, термодеструкиия и т.д).

Исследование свободнорадикальных процессов при механической деструкции белков является актуальной проблемой и в экологическом аспекте. С развитием науки и техники, Человеческая деятельность все больше воздействует на окружающую сроду и,в результате этого,сильно изменяются ее отдельные факторы. Механическая обработка (измельчение, перемалывание, дробление и т.д.) белковых веществ, все боль-ев используемая в народном хозяйство, призодмт к их нг..:анодеструк-ЦИИ. При МЙХ8КИЧЄСК0П деструкции белков изменяются их свойства, и они но могут выполнять присущие им функции. Накопление таких мехэнодеструктиоовашшх белковых молекул в пица, лекаре гоях и т.д. мотет иметь отрицательные последствия. Но этот процесс эффективно влияет окружамая среда (с>ят, температура, вланлость и т.д.). Поэтому, для ослабления вредного воздействия деструктируыщих процессов при механообработке белковых структур,необходимо изучать первичные процессы разрушения и влияние на них ; ікторов «кр’ткю-лнй сроді.

Несмотря на •, в-ае отр.шятіиьімс» д;-лсть,« механодеструк-

циіі.с 'а испи.;!.:'.',е',' „V. < г:.- єіМл Нг.кч'.'ор.;:: г<,..логических проб

лем.. їм<, с і бр'с-.і "л:-.-;* пролгадче і н

: <-т:' , і ^ . ,■ к

зообразноп формах и, поэтому, по разному влияют на биосферу. Хими- ( ческип состав тверди отходов разнообразен, и имеет кок неорганическую, так и органическую природу. Перед транспортировкой твердых отходов их подвергают механической обработка, которая сильно влияет на катабслическне'процессы р них. Знание механизмов и закономерностей механической деструкции позволит сыйирать режимы механическоя обработки' тверда органических отходов для регуляши катаболичес-ких процессов. • ■ • ■

Оценка и изучение экосистем выполнился на разных уровня::: молекулярном, клеточном, организмонном, популяционном. Несомненно’исследование ашяния различных факторов окружаваеп среда на илвио организмы на нолзкулярном уровне особенно актуально. Знания молекулярних механизмов разруЕония и действия на эти процессы различных факторов позволит создать их полную теорій, понять возможный экологические последствия. Это необходимо и для экологического прогнозирования, учитывающего комплекс явлении и объектов в • оиосферо, ’

Основные события, разсиза;сс:тся п макромолекулах при делствни но— хоничьскол нагрузки Сылн изучат, в основном, на синтетически;: полимерах (Курков С.Н. с сотр., Бутягин П.Ю. с сотр., Баракбспм Н.К. и др.). При этом наблюдаются токко явления, как снижение молекулярной массы, изменение фрзкцисдаого состава, образование разветвленшх, попзрзчніс: связен и нос:;;-: функциональна групп. Вез тго, в свасі очередь, приводит к ис.-ізі:зк:-.с С^-^ко-химичоских,

■ механических и других своПств полимеров. Усісііоіілоцо, что

механическая деструкция полимеров протекает по свободнорадикальнсму

механизму. Порзичным актом язлвугся разрыв хнмияаскоа связи остова гмяиморноА цепи с образованием двух концесых раді разрыве. Лалео следует цепочка вторичных реакции : миграция свободной валентности, рекомбинация, взапмодепствно радикалов с окру^.о-ьлчи молекулами и т.д. Коночная результат зависит от многих фактории: природа первичны:-: радикалов, среды, температуры и т.д.

Есе сснсшмо положения мзханодострукипи синтетических полимеров и равной степени относятся и к белкам. Однако, иселедсвениз сисбоднорадиксхыш процессов в них, оказалось более сложным,

питались нерешенными такие пе.лие вопроси механодесірукции, как определение песта разрыва поптиднон цепи, идентификация иервичніп: свсібодніж радикалов, оерв^укглге* пан этом процесса и изучении их І’инхіїИЛ под действием различных факторов окву^акіГи срода.

Выяснение их откр'.-шоло бы путь к рзсениш таких актуальних вопросов, как механизм механического разрушения Сзлкоз и г-'зториядоз на их оснопв, болео глубокому понимашп і« механических с:;ог:стз, влияния »

различных фзкторов окрукжгтзп срад:; на дострухтигшо произссы и т.д. Ото важно при разработке прин'липез и мзтедоз прогнозирования срока службы и стабилизации маторнплез на осново болкоз при различных условиях ИХ ЗКСПЛуаТЭЦНИ.

При депствии различных пторогдччгсэтх фаістороз окрузккэя среди нп Сисмакромолекул протекаэт езебоднорадлколь'^з процессы, Сразнитель • ноз ксслодогзнш гшсшггескоп деструкции, фотолиза и радиолиза помогает глуб;:э понять процессы, протекагцнэ d биологических макрсмоле-кулах и, з частности, в балках. Разработка этих вспроссз позволит ЛСЛН09 оцзннть !:ас2?2С:і окологілоских послэдстеип дзпсткїя различных деструктиру^іх фнзнчосклх агентоз - непременных спутннкоз современной цивилизации.

"Таким образом, исслздсзанпа егюбоднерадикальных процессов при МЗХ0КІГ-І0СКСП деструкции селкоз пплязтея актуальней проблемен с точки зрении теории и практики.

Цэль н задачи работы. Цзлыо нзстоясеа работы кзллзтс'л нсслэдоззниз

с зоб одн ср ад.-: к а ль і ;ы х препзееоз, проте кз:-;-д,;х при чеханнческел

дзетрукцин Селкоз.

Для дсстіг/зния указанной цели в работа Сили сформулированы слодующие оснознь:э задачи: ,

1. Сг.родэлзние мзета разрыва сстоза пептиднеп нвпи при мэхпнн-'рскоп деструкции белков іг идентификация первично езебодных ради-каДоа.

2. Подбор нодзлькнх систем и ко то,гол исследования для

установления Сетсроакипп г.зртлчкіз: свободных радикален, обрвзугсш-

/ся при ЮХЗНИЧОСКСЯ дзетрукцин бзлкоз. •

. 3. Усслздсзанпз фотсрсакцнп первична: свободных радикалов, обра-

зуслихсп при нохаинчзсксл дзетрукпнн белков.

Д. Подбор нодольн"'-: систем и у.атодез к: иссдагоззния лій

устпноолзния теннопж реакции пзрзичка: сзобс.д ных радикалов,

сбрззулглхсл при мпханичссксп дэструкции болков. '

С. Исследованпо тсхкоиос роакиип порвилных ,сзободкых радикалов, сбразуюютсп при мзханнческсп деструкции бзлкоз.' .

Научная неензпп. Устапозлзно место разреза остоза пьптлгеон при механической деструкции бэлкез и кдзнтігфнц*грсзз;з« ссг.ару.-глизся >ри пгся iwp'-mif,"i соі’Ої'ЛЯ') радикали. - ‘ • ’

Подобраны модальные системы и методы их исследования для

установления фото- и темпових роакиип пораичіих свободных

радикалов, образующихся при кехаыическоя дострукшн белков.

Псслодованн фотореакиии первичных. свободных радикалов,

образующихся "ри моханичссксп деструкции болтов. Установлены

многостпдипнио пути их лревра-дзнпя под ДЭЙСТВИОМ споти.

КССЛОДОВОІИ TCMH0LU3 реакции порзичних рЗДПКаЛОЗ поело

махснпчаскоп деструкции Cjj.j<03 при 77К. Устенсаяош пути и;:

трансферу,ации в темнот реакциях.

Научная и практическая ценность. Гсс-ультота ііссдзДо::п;;їі;і по ссо-боднорэдокашим процзссся при кохшгсоехга дуструкинн балкой поа-иолкит едзлеть сакдэтоняя о кеханпз::ах мзхаиичзсксп десі рукипи бал-коз, пеиоггот гху&з попять механизмы свобсднорадикальных пронос-протекс;с;:'і:; в бпологнчвских накроподекулах в рссдичіш услозп-чч скру,і:ск.г.-лі сроду.

Практическая значимость работы за;сл:у;азтся о тс:-:, чїс она мо:.ог сказаться полезной в:

- tjap: іакологтоскоп прскіитішссіи, т.к. при приготовлении некоторых лекарственных препаратов пре;,вводится растир;;;;;;^ рвилггиш ске-е.. л, еодзра.адих белкн.

- ги.и?воп прсми-доічгости,. где ?сі".о і'.прско прИ'-кч-н-. ;ся катоды рпсги>.!шя и дроблении ду.Я пссу-іокия псрсскоз.

- техники и дегкоя промвавіеннеоги, где іхироки исподьауіагс;-. '•arc-риалы, содзр~;:а:;„:о балки.

Получо;!:і;о результати могут сі.; і ь гюлез;;:::;;::

-при разработка- принципов И методов прогнозирования епоха ол/а.бы издолип, лзготоаяошіос по отих неп,-риалов, псдварганхихся рри эксплуатации механическим-возданс, ви;..: при различных .певних условиях; ':

- для болао глубокого понимания изменения моханическш свойств как

самих балков, так и различных балковых структур при екстремальних условиях. , '

Результаты исследования тэ:с::.о будут полезными при ратании апологических проблем, ензозник разруыакгдпки факторами окру'л;а;:а,зП сроду.

Апробация работы и публикации. Результаты работы дохидаав^ись на: 1 Есосоюзнсм-бй'Пфнзичоскш съезде (h-іосква, август 103?.). Всесоюзной кон^ромии* "Цл-окулор'от мг*уа«изкн биологичиского дерегипч (".ТИЧСС-ХМ’О H3-ty-i"4.-4’‘ («Tin, ҐІГ:р‘*ЛН 1.334), У11 Есосс-юзнон к«і;с-

рениии "Магнитный рэзонвнс в биологии и медицина" (Звенигород, 1889), XI Всесоюзном ссвееании по кинетике и механизму химических реакция п твердой тола (Минск,1932), 11 Туреико-Азербапдаазисксм • симпозиуме по полгоуэрзм (Лнкзра, 1332), XXX меэдунорздном конференции "Плотные сстастзэ и химические препратания под давлением" (Баку, 1532), а тают из семинарах отдела кинетики химических и биологических пропессоз ИСФ ГЛК и Института Сизики АН Азербайджана.

Ссноппиз содоряяние работы изложени в 3-х разделах данной работа и газойэх, в котороп обобщены результаты 23 публикаций.

1 .Место поражения остова пептидной ;;епн и природа первичных свободных радикален при кехсничаскоя деструкции белкоа При гемолитическом разрыве лтооя евтзй остова пептидной цепи белка дол::.1П! появляться дда разных радикала. Одняко, во многих случаи свсСсднио радикала о белках, обрззуюядася при мзханичеехся деструкции, прнпискналп одному из радикалоз, возникатаг/ пр:) разрыве топ или пноя связи. В последующем, анализ спектроз ЭПР рз-ДИКЯЛОП, П03НИК0!Г':Г'Х при кзхеничпехоя деструкции различи’.": полмпоптидез и белке:-!, а такяз такие кзтодическне подход.:, как использование рязнкх твердых растсороз бзлкоз и постепенное нагрз-вяниз механически дзетруктировэнных обрагцоз, но позволили сделать однознач'Г.’П забор о госте разрыва поптидчоп цепи.

При решении зто.1 задачи нз.чи, для здентн.;,'икании горзнч!кх свобода кде радикалоз, образующихся при механическоп деструкции бмкоп, нспользозанз их йоточупствитольнесть. Спектр ЭЯ? фиброина г:елкз после, механичзскся деструкции при 77К гТ:;:зодзн на рис.1 п. Рас':;епленпэ мпхду пзрпс-1 и отсроя кпххт.енгГ'УИ составляет 2,37 -|),С2т,?л, а г"г~у втерся и тратьея- 2,"С - 0,С2мЛ'л (з копраалоини ‘ УПЯЛ!!’,ЗН:'Я МаГЧИТНСГЭ ПОЛЯ). ТчрННЗ ПОрВОП, ЬТОрОЯ И ТреТЬ:’Н КС'ПО-,-_.цт р1г;-:а. соотг'-’гои'енчо, О,СО - 0,02; 0.01 - О,С! л 0,СЗ - О.С'2-. Гг;, •> г,'0'Г"С'-.. иг Г‘ 'ПЛИТУД бЛИЗКО К 1,3:3,0:1. Ли.ЧС'ГЗ!' I еззтл с д’чнол :гч’■' "Г3-.?"Г) на I а'-г’мт к ::а':м:17 пг::гзе'::;.з;:::: и-;,)'од1,а;‘а

ч сингл '■ п-нгл'/тг'. ?::? г. л'Г-1,71 - О.С'чТл (риз.16). 14;тзг-Р".'Чп.1 ■ и.'генсиччсегь спектра Г-ГГ? при атс:: не меняете:!. Это

•;‘Тг')пр'.''р.а",-‘'|';-> б.’:"' исследовано. За кемекенне:-: гелплзтя

•гладили по парно'! и третьей компонентам. ;!а :пн линии ;:5кла;;;а; 'тех кг;:лнч йозкцкагт'то сгн:'.;:"'та, что учиткзслась при ачал.-аа их \

а уг.-,пуг.:. !'а::-:о оГ":тит:>, что находили :;пбро;:н лодке на

гоглолапт са'-т а х>0ГС"ч. "гнетнка умень^аь-лг пераоя и •.реп.'::! ,'г'"Ло:'ант тааллет.а г;.и згетгнч сезга с -\ УЗЭ-ЗЗОнм призедеча на

Рис.1. Спектр Э1ГР фиброина шелка поело механической . деструкции (а) и поело действия на образои (а) соота с ^ 330-3ЭОнм (б). Дострукиию и ойлученио образца, о та юно запись спектра проводили при'77К.

Рйс.2-.' Кчнотичосгао кривдо измононий амплитуд пврвоа (а) и тротьеп (0) дипиа споктра ЭЛ? коханичоски доструктиро-вышо:‘о пр-.1 77К і1'чі5роиіі'л сіслка под действием сі*тв (■ ^ ЗЗО-ЗііОііи . Начальная ьшшпуда тротьоп личи:-. пр^-ззд.’нч

К ІІЧІІ/:.' I УДЯ ПОРГЮН С СООТВОТОТНу .: ц'. "•!

ТС" гс'с ї-Ч'-1 '>• .

рчТ.Г’. :<грг?0 Г.:'Л:!0. ЧТО ПрО’УСХОДЯТ Д.УО фотороокиии- б'.’СТрЯ м !'здлы;нзя. Е;о тру я \пск‘,пп опшпипготся чвроз 2-3 гхс.’.э

уудууунуп сузтч. Уу^-уинз '"ур'-ш г.зрзоа и трзтьсл уу уyi'jin' т;у:п.зга псчс-зало, что черзз 3 !.тн. осресеиня сию стала ссстыпгпь 0,7‘Л - 0,0?(Vfji. Чсхмлта пзрпметра триплета (разное рлсгешюп’З, рг.злзп гирнна дикуп, ссотнотениэ пнтенсивностоп компонент).сссЛвп-уузтъ кпнзтаки гп^хи раяикаюв прл гЛр.'/чсум'л ср.зтом и v.w.oiibi'.'.’.o Г.УрНУИ КЛ'ПСЧеЧТ покозизомт, что р ис.чсднця спектр ОПР МОХСННЧССКИ гзструктирслакисго при 77К (['МСрсиня полка шгасят г.хлад спзктра рз-ЛП'Дхоз днух тигюз. II те и другие рядакзлд при допстснн свотз с дуууол поуун ЗЗО-ЗОСнч првсрзг’.'отся n радпхад1] с сдггдот! ■:?{ спзктрсм DIP.

У; У УЗ 1 • С;;■ иЛ, Ггрснсхо^зЯ! '.УХ Б !!0HTp2J.bi'^n ’’УСТИ СУЗУГУУЗ СП?

грч чротпУ">::'ч утсл 'I’Crc.: у; уу-у, г: у у. угуот у-т " : учу у

Гр ),Д УЧУ УУ ' . yi рУЗ.3 УУУУЗДЗ'У! УрУзУУ ИУКЗМОПЧЯ УУрЧЧЬ!

п: угрууьнг/! котх узмгп спектра по у-уо чрззра: уу-уу трупу ат i у

ЗУШ'УЗТ. '!! У'УУУ УГУПзУУУТЧ Тр'УУУЗТУ, ДУ УУУУ.зУУЛ УУП

"уууууу ii.oi-O.OlK".'!, ууууу уууууз (У'стро ,уо -у у . :-г-:чГ| v

-1 У'У ....'УУ!УУ;-:У до зуууууу 1,71 - 0,С"уу'у, УУ-У -ГУЛ

гу у уся : • у-'-у- у до кс, У) Уусууу::':!, Гусгру ^уу.уу-и, з yyyyy !’■■::; рудыу Л уоуу у--уч] усуг ’уоуо сг .утуз ур до ' 1, '.ч'.'у; ууууу'у.у,-уу 'рг'УП, р ' у; у i Уиил.-у I'oy.poaxyyy ;урууо,:.у трпп. зга и

ууууу 'Т. J'/yyj У о У:УЗ i i.3 У; УУ: И Ч Г руУСТУ УОД’УУУУ рза.СУНЛ УУрУУУ

у у уру ’’ЬУ.О',1 yyyyvi узузстузу до -1 ,71 ! О,УУ::'.1;. Уу.з сууугз,-,

г У!; У' У • ' Р 'У У С .У У У , У ■ .. а о у ■ ■ 1 УУ. ’ ^.у.Уу.ч! ■' :

., у у; ■ н СУ.'У: у У.' ' уу.у у: о; уу • уу зуузр' "уу1'’ у ■ ’.".'С -у " у У- -

■■■, :';гм/1, ^ . У. У ; yyi ..у • у; У .-лЗУУУУУ: УУ У. ;У , У У, У' :■ у;

'■'Ум У сгуу;ру "У:’, 1У1 1 У,У УЗ.УУП У1 зУУУЗУ'УУ 'УУУУУ УД. .УУУУ

"УУУУУСЗ. ГСууууузу у.у isy-.y уч ■'УУ'ууз УУ.У У з ‘

ер г-н';:: : уу., , з уу УзУУ. уууу У'.-У. У:з;а ( !” !' ;У" 1 i ........... уз-

С?ра У 11 ■, ууу: У: УУУ ■, 1 рУ ■ ' 3 ЧУ;'"У'УД1 .з"''Ч • ■ .'I 3

Рис.Э. Изменение) ширини центральной линии спектра ЭПР механически деструктироааннох'о при 77К фиброина шалка под действием света с >. ЗЗО-ЗЭОнм. '

Fnc.4. Спектри ЭПР механически деструктирозанного коллагена (А), л.алатини (Б), кератина (В) до (а) и после сблучнния (б)

• светом с х ‘ ЗЗО-ЗЭОнм. Условия облучения смотри на рис.1.

спектра ЭПР (рис.4Аа). Расщепление между второй и четвертой компонентами составляет '4,5мТл, а соотношение их вмплитуд 1,4:1. Третья компонента искажена линией спектра ЭПР перекисного радикала. Эти параметры близки к соответствующим параметрам спектра ЭПР механически деструктированного при 77К фиброина шелка (рис.1а). Облучение образна светом с х 330-390 нм приводит к протекании фотореакпии, в которой исходные радикали полностью превращаются в радикалы, имевшие синглетниэ спектры ЭПР, суммарная ширина которых равна '1,7 мТді. Это значение ширини образовавшегося сикглетаого спектра ЗГІР таюкз хорошо согласуется шириной соответствующего спектра, полученного для механически деструктированного при 77К фиброина шелка (рис.16).

Такое з;'э фотопрзврвщеннэ наблюдается после механической деструкции при 77К жлатинн (рис.4 Б,а,О). Однако видно, что не все первичные радикали участвовали в фотореакиии. После облучения образна светом с \ 330-330 нм компоненти триплета не исчезают полностью (рис.4Б,б). Это связано с тем, что механическую деструкцию желатины, в отличие от других белков (фиброин, коллаген и кератин), проводили в шаровой микромельнице. Такой способ механической деструкции превращает его в порошок. При облучении образив, свет рассеивается поверхностным слоем и плохо проникает внутрь. Таким образом, неполное фотшреврзьенш 'первичных радикалов в механически доструктиронанноп при 77К »елатинв связан с методическими трудностями, а не с природо;! радикалов.

На рис.-1Г!,а приведем епекір ЭПР механически дегтруктиронанного при 77К сероеодер.чяпего о»їм» кератин» іїереіи. Си npe.'U"iнвляет собеїі налсяоняо хкрякгорн**;ч> анизотропного спектра аЧР "серы.х" радикалов и спектра :)!1Р три:і. етноп цч{»<•(. Рап.;е:,.лчши мезд*’ первой и третьей компонентами триале га равно ■--1, -1 m V'j: . а соотн<':..еи,:е и* амплитуд 1,4:1. Эти параметри хорошо согласим гея с величинами расщоплеинн и соотношением до^игуд ivwretmnwymix Kiw,юнеет в спектрах ЭПР механически пи-'ф.-лтирсшнжх при 77К внлераесмо;рин-инх белк('в. Обручение (Сразил свіч ом с 3;'П 300 нм нрпнгт.ит к ИСЧ&аНОШ’ИИЮ тр.1ш.«ти{||’1> Clie.CI рв Н появлению ГИШ'.ФТНОГО І'ііек'і'ра ЭПР с л1М,(; мТл (рис. -1П, а, 0 ). -

Таким оОрае<>м, механически .мппрукння белков привп.ит к г-0:■■ olu> hu)!Mhi днух ivpwute.’X радива (щ, которое чувствительна к 1

света о ■ ;<;і;; і їм. А ;:ра мегннпчесмчі десі руїніин сер

белков кроме этих, образуются свободные радикалы со свободной валентностью на атома сэры, которые образуются в результате разрыва дисульфидних мостиков.

Анализ радикалов, которые могут возникнуть при разрцво топ или иноп связи поптидноя цапи, показывает, что только о случае разрыва связи Са-С получатся радикалы, которые наблюдаются в эксперименте.

В таблиые1 приведены параметры спектроз ЭПР и чувствительность к . свету радикалов,который могут возникнуть при разрыто разных связей . остова пептиднол цапи волка. В остова поптидноп цопи имеются только три типа связоп: с-м, м-са и са-с, В случае разрыва связи С-м должны образоваться макрорадикалы -сна-со и мн-енгс-. Радикал -сн.ч-со хорошо изучен в литературе. Он имеет синглетный спектр ЭПР с лН=

1,3-0,2 мТл. При действии света с х>520 нм этот радикал

превращается в радикал типа -мн-сня. При облучении светом с >.>520

нм механически доструктироваиных при 77К белков в спектре ЗПР никаких изменений не происходит, следовательно радикал -снгг-со

отсутствует. Споктр ЭПР радикала ми-снк-, который, видимо, представляет собой дублет триплетов, в исходна-; сигнале нэ , наблюдается. Все это доказывает, что при механической деструкции белков но происходит разрыва заметного количества связен с-п.

В случае разрыва связи ы-с допили образоваться макрорадикнлы -со-ни и сня-са-. Радикал -со-мч долу,он иметь спектр ЗПР, представляющий собой дублет триплотоз. Ранее показано, что радикал сш-со-ио чувствителен к свету с *.>320 нм. Этих сведения достаточно чтоСи сделать вывод о том, что при механической деструкции белков при 77К но происходит разрыва заметного количества связей и-св. _

При рэзрнио связи с -с вооникьмг мокрорадикали -мм-атии и со-' ын-( 11) .Радикалы типа'П ранее изучены н Уч'-облученк:)-: белка;: и

модельных системах. Вид спектра ОПР зависит от тина ьмпнокнелотного остатка. В случаи ГЛЧ’МШП он будет Предстой>:,:ть собой трниют (1:2:1, д!)'-2,0 мТл, дИ^О.З мТл, д "■?„«»), а в случи", а Панина . рнитет (1:4:С:4:1, лНг~2,2 м1‘л, лН,лО,9 мТл, д -2,003). Раню Лию .адоедь&ко.что радмкел 1 при действии сиз га с х Зл0-Г>2: Ыч / превращается в радикал --сик-си, име".^.;.п снн'лпетный си-:гр 'У’!' о <‘.Н" 1,0 нГл. _ ,

-4,111'.- СМИ 330-3^ >'М -СЩ» -(.О Н ГЗ! ас-

11;■•.'.Ч/Г/' гах.'.е ^отонронра^ение ц:,0.'.п,:1.,с'и;" ь- г!.> треп

12 3 Таблица 1

‘ ! - I

... -мн-с нк-со-кн-снк-со-ж- ...

СЛ с* (

I N \ ?а;:/кол;: 1 ! Спектр ЗП? ■ ' Г Параметру 1 1 Чувствительность I

; -яг- ! спектра (мТл) | к свету 1

1 [ -С НК-СО Г"1 дН ~ 1.3 | чувств, к х >520нм |

I ) 1 ! 1|п*с,_,кк-1 1 | многоко.'.сганектныЯ 1 -| ! АнЧ.5 | АН(КН)~3,2 1 Ан(^Г1,4'3,7 1 не чувстз. к х >3£0нм|

1 2. 1 [ -сз-ш 1 дуел-зт-тршиютов Ан~3,6;А лг.З | не чувстз. кх>320н.ч |

1 | | С НЯ-СО-{ 1 триплет (й-Н)(1:2:1) I ШЮ! (Н=СК3) (1: 4: 6: 4:1) 1 А., -2,2 ! п не чувств, к л >о20нм 1

1 •-< I 1 ! -кн-санг; ! 1 I трм.кт (Е-Н) (1:2:1) ' жктет (Й-СН0) (1: 4: 6: 4: 1) Атл2,0;дН»^0,9 [ П Л Ан-.?,2;дНк'0,9 [ чувств, к х 330-390км!

1 | С0-К1- ; тр:;п.кт (1:1:1) А^г.г^ьу-о.в ... _ .. .. ] чувств, к х 330-390нм| - |

А теперь рассмотрим свойства второго макрорадикала со-ын-, образующегося при разрыве са-с связи остова пептидной цепи. Он имеет спектр ЭПР триплетной.формы с соотношением интенсивностей компонент 1:1:1. В литературе показано, что это 6-радикал с д-фактором 2,001-

2,002, с расщеплением на атоме азота 2,0-2,4 мТл. Расщепление кэ атоме водорода составляет всего 0,1-0,2 мТл. В нашем.случае, радикал 11 имеет расщепление '2,2 мТл и дН^О.75 мТл. Компоненты этого спектра ЭПР хорошо накладываются на компоненты спектра радикала 1.

Таким образом, анализ свойств радикалов, которые возникали бы при разрыве тех или иных связой в остова пептидной цепи показал, что только разрыв са-с связи дает два радикала, сумма спектров ЭПР которых соответствует экспериментальному спектру. Радикалы, которые возникли Сы при разрыве с-ы и м-са связей, в эксперименте но наблюдаются. Радикал 11, образующийся при гомолитичоском разрыва са-с связи, ранее не исслодовался. Наши эксперименты показывают (рис.1-4), что макрорадикал со-мн- при депствии света с \ 330-390 нм превращается в радикал, имеющий сикглетнып спектр ЭПР с д}М,7 мТл.

Исходя из параметров спектров ЭПР первичных радикалов,возникающих . при механической деструкции белков и разрыва си-с связи, определим соотношение амплитуд компонент суммарного спектра ЭПР. Так как спектр ЭПР радикала 1 зависит от типа аминокислотного остатка, то такие расчеты логче проводить для болкоо, имеющих небольшой набор этих остатков. В пасем случае наиболео удобным является фиброин колка. Он содержит ~45Ж глииина и аланина. Считая, что при

разрыве пептидной цепи возникает равноо количество радикалов типа 1 и 11, майю записать уравнение:

Зл1(дН1)2 = ■»2(дН2)2 + 1&>3(лН3)2 ,

гдз лз' амплитуду первых компонент триплета 1:1:1, триплета

1:2:1 и квинтета 1:4:6:4:1, соответственно, а дН- ширина компоненты.

■Учитывая относительное количество глииина и аланина в фиброине

? р \ шолкв, маяно записать: • = 45‘1б’л3(дН3)Л : Откукда л2=

Ы3. Таким образом

Итак, в данном приближении получим следующие амплитуды компонент 1:29:37:29:1, что хорошо согласуется с экспериментально ноблвдльмнм гоотноиониом.

Рассмотрим спектр ЭПР механически доструктированного при 77К полипептида полиаланина (рис.5). Если принять, что при ого мехоничос-

коп деструкции разрываются с^-с связи, то этот спектр ЭПР является сукмоя равных по ингегральноп интенсивное™ спектров радикалов -N>1-* сн(сн3> (квинтет 1:4:б:4:1, дН * 2,2 нТл, дН » 0,9 мТл) и со-кн-

(триплет 1:1:1, дНр=2,2 мТл, дНк*0,75 мТл). Кз уравнения:

Злт<дН£}2 = 1&к(дн£)2 где л- амплитуда первол компоненты триплета и квинтота, а дНк-шири-на их компонент, легко определить приближенное соотношение амплитуд первых компонент слагагатах спектров: лт=8зк. Откуда примерное соотношение амплитуд в суммарном спектре составит 1:12:14:12:1. Соотношение амплитуд двух первых и двух последних компонент в экспериментальном спектре имеет близкое значение. Средняя компонента спектра искажена синглетным спектром ЭПР с дн=0,5 мТл. интегральные вклад которого составляет ~Ь%.

Итак, теоротическия расчет соотношения амплитуд линия спектров ЭПР перзичных радикалов, проведенный для фиброина шелка и полиаланина подтверди справедливость вывода о преимущественном разрыве в ходе механической деструкции при 77К сд-с сзягея пептидной цепи,

В литературе (Бутягин П.0. ,Д>*5инская А.М. и др.) рассмотрена механическая деструкции гдобудярних Сзлкоз и полипептидов. ■1'срмз и параметры спектров ЗШ\ набдздее^с: поело кехвническся деструкции эти:-: соединении г.рч 77.: хорошо согласуется с вводом о разрадо с -с сз:пги в этом процессе.

Та!-.:м обри'С!! исходя из эдвдвыкгажшас результате;; ноя но сделать зякдашнив, что механическая л*струк«ия бздкеа и полипептидов приводит !; разрызу нменьо с .-с свяси гсглткдноп кепи и к образшаи'.ка радикалов -мн-сня а с.о-я., котсрыз при уоаетвии снега с * ЗЗГ)-ПЗЭ ! ,; подвзргж.'си ^отопрэзреглыкТ’ззр;'..! уо:'»тиого ког.нчзетнз других сиг.ьеа из происходи". В случае езрозодзр'-;^::'.; оллкоа г.рл-.схогз.т тьк • :/з разрпв лнсу."4; гезчнл'щ с образованием радикалов сз

Гис.5. Спектр ЭПР механически деструкти рованного при 77К полиялвнина.

. свободном валентностью на атоме серы. (

Считают, что при механической деструкции полимеров с разными типами связей в полимерной цепи должны разрываться самыэ слабые. Можно твердо сказать, что самой прочной химической связью в остове пептиднод цэпи является пептидная полуторная связь с-м. В литературе имеется много данных об ' энергии разрыва различных связей, встречающихся в полимерах. Подавляющее большинству из них определены либо методом пиролиза, либо электронного удара. Эти значения определены, в основном, для малых молекул и точность их невысока. Приводятся следующие данные для прочности связей : с-с : 310-520 кА:</моль, с-м: 205-344 к№/моль (Веденеев В.И. и др.,1962; Казалэ

А., Портер Р.,1933). Поскольку сила ковалентной связи между двумя атомами определяется слотностью распределения электронов между данными атомами, то любое изменение электронного распределения объяза-тельно влияет на прочность связи.

В остове пептидной цепи белка связи м-ся и с^-с находятся по обе стороны пептидной связи. Поскольку, в пептидной связи имеется резонансная структура, то, видимо она будет влиять на прочность сзязоп и-с^и с -с. В этой связи интересны данные по расчету силовых постоянных в молекуле н „с—со—мн-сн.,. В этом случае ш имеем пептидную связь и, по обе стороны этой связи находятся сн3-группы, образуя с-с И N-0 СВЯЗИ. Получены следующие данные (Ыеестадт С.О., 1965): с-ы (4.763±0,472)-10~8Н/А. г«-сн, (ЗЛ76-0.351)ЧО^Н/А, с-сн3(2,5Э2± Л,582)10_ЦН/А. Эти данные позволяет сделать заключение, что с^-с связь является наиболее слабой в остова пептидной цепи белка.

В остове пептидной цепи белка СВЯЗИ М-С£(, Са-С и с-м чередуются последовательно многократно, йз инх, ка:: Сило показано ил,и, с -с колкетсн нинболез слабой. Одна.чо, этого недостаточно, чтобы при нохсничоскоа дестр/киии разрывались только с -с связи. "Такой путь механической деструкции будет протекать В ТО.-! случае, если при мохоничосксй деструкции критическая кахаиич&сьпд эпаргии (экзрг.н, достаточная для разрызо сеизи) будь/ локализована в 'пе:;ти;;;юг: цепи в областях размером ,Ъ,\. В эток случае такая соласть оуд:л" со-

дерлать с^-с снизь. В протизном случае, к зазиснмс'чти от р-:с:;олс: е-ния зги:: сСлйстой в ттидноп цчли, будут случаи. г> которых отсутствует с с: свизи. ^г.хим сбросом, мл дол:-салн 6.1 ь.,эл;:дать разрывы и друг;:;: связен. Однапо, а го.'о не пгс.;з,:од:л и за;:етнон

личестзз. ■

Итак, мсм-ю сдолать заклзчаниз, что при механической деструкции белков разриззются.с^-с связи остова пзптидноя изпи и образуются радикалы -мн-снп и co-nh- . Критическая кехакичаская зкоргия локализуется в поптидноа изпи б областях размером >5А.

В рядз работ были обнаружены свободно» радикалі! в натуральном гадко, но подвергнутом споцкальноп обработка (прсвздена только отмотка коксно). Кч конпзнтрашя примерно ка два порядка нинь^о, чем поело маханичосксг) дострукиии при 77К. Окспоркуентальнь’з данім» позволяет едэлать сыпод о тем, что сии обусловлены "н.икрообрь.вами” (раорко некоторых фпброккокзе волокон, состоаютгих коконнуи нить) в натуральном іазлко. КУзется стрніатальнея корреляция ме.гду ерэдаеп кониентрзшоп этих свободой рздакалоэ в салхо и значением рггрвв-ного папряжзння полковой нити. На с-оновз этого разработан способ контроля качества натурального галке и получено евторсксо свидетельство.

11 е-тсрзакии.н ;:ьрт-!чк!” радикалов з аиччеекм ,г.осгруктирооак!•>те при 77К Солках.

Пои :'ок^у::ггг‘С'<с’- а’сп.ааастгии на і'олан паоисдодат слаа-ко пр^-иоо-с"., з рааутьтпто ч^г'о hheyj их свойства, сбразуетея по-

вна ^ункннан?"ьн::а групам, ннокс'олскулярнго н .'.'-тучна продук1:.'.;. На агл грсн'^сеп-а!" активно злнтт саванна B-aaja (сват, 'геназра-

ГУрП, ПЛ'-"-!'ЄСТЬ И Т.Д.). 'ГаССНСТВН!' ''ОТГр'-:1" г СВОБОД-" :К рад:- <.3.-03

і азаанп-н-с <н дза-уат^рзвзна':: при 77І' Салках, протака-'.:.!:; ,;од а^аага-зн оз-зал г. >з'-"Св''. лата. Салки, па а-'здаза: г. г ост а га. ;зазвз

r’ivc"", но вазна-аа;- ciay с длине"! ва-л>-] а указ-.на-.-'В з-блзоги, 'n:!;r;;i ганга загоз',... а -ся при -аазнвдастру.-дв.н над дввз:в;,з'! аагго сгагл, у ■" г'"'’у т а '.а:аааа:а:а:аг, ко:~а .з -y:v.>.'д.гааа-Д'-стауктааа"а гг'■,-сг"-а /,к?уал::нгага атса г:р„блза:а аа- саааааа о

’-заанансз ааару:'-'ааа сасноваго слоя страта-а-С-арв’. 3 р-оудз7а:з а-, его завраст.-зт интанснзасоть ’"з-луаап аа'аіиа л с;;с-ааз-рз, з частно сап, в сблпстн с длина'. Boa;:i >.320-CGCa:i, имзиуанои "акаво-вл-загваї" УТ'-сватс.ч. :

Для установления путан образования различии:: ’радикалов а ::адг-Сотораакини кэхмпгоски дзструктирс-вгннав'. балков сга-раа зги лровесси изучались а кодолыкх системах--пептидах.

2.1. Фотопрнооодинвнно СО к радикалам при 77К.

Ранее было показано, что при протекании фотодеструкции алифатических пептидов, сенсибилизированных триптофаном, одним из промежуточных продуктов является радикал типа -со-мн-снп. Этот

радикал появляется пр.и декарбоксилировании или фотопреврашении радикалов пептидной группы. Радикалы -мн-сда под действием света 'Участвуют в следующих фотспреврзаониях (Каааин Л.П.,Грибова З.П., Азизова 0.А.,1973):

-МН-СНИ-СО-Ш-СНЯ: 330-390 нм -ЫН-СНИ-СО + №=СНР! (1 )

-ІМН-СНН-СО >520 нм ЧМН-СНЯ + СО (2)

Предпологалось, что далее, при последовательном действий света с х330-390 нм и с х>520 нм, реакции (1) и (2) многократно

повторяются,и таким путем можно расщепить веш молекулы пептида на

фрагменты і^н=снк и со . -

Исследование фотореакции радикалов, возникающих в ходе фотоде-карбоксилирования алифатических пептидов, показало, что после про— токония фоторсакиии (2), в которой образуется молекулярний фрагмент СО, действие света с \330-3S0hm приводит при 77К к обратному присоединения существенней доли этих фрагментов.

Ранее показано, что 'в присутствии форриаиемзда калии і;ри действии света в полосо его поглощения происходят докарбоксилирова-Н'Лі аминокислот И пептидов. Допствителыю, В УСЛОВИЯХ, ИСіСКаЧС'-йі^ИХ протекание фотороакции (1) (малая экспозиция светом с х--400нм) после дг-карЗоксилирозапия пептида ї-ОІуЛІаЗІу набл..'д:„тсп трнялотшп спектр ЭГТР (соотнсссние амплитуд 1:2:1, лНр'-^.О мТл), характерный дія радикалов (рис.6а),. При последук'дем действии сг^та с

33.0-330 кг<, г.ог.^ маемого С еррииианидом калия, продолжат прстокоть реакция декарбехеилироаания^ а таю;:е протекает реакция (1). Облучение образца спотом проводили до полного востсношіония феррицианида калия. В результате этого полностью заканчиваются процесс декароок-силирозания и реакция (1). .Действительно, облучение образца свигем с >.330-390 нм приводит к полному провревзниа исходного триплетного спектра ЭЛР в сиш’летн"й (д}М,5 мТл), характерный для радикалов ацильного типа (рис.60). При последующем действии света с л, 520 нм протекает реэкшя (2). которая приводит к образованно радикала г-С1у-ГчЧ-СН(СН, ), им е к Сип квинтетнкл спектр Э1ГР (рис.бв). ' При проведении второго никло последовательного облучения светом с х

Рис-G. Спектри ЭПР радикалов в сенсийилизнронанних форриішанниі.н калия пептиде z-Biyfluciy при 77К и после.ьоиитнлыюм ОбЛуЧ0|1ИИ образна спотом:е-400нм(200);0,г,е-330-330нм(4мин);в,д-: 520нн(1мии).

ия run ця сїіГігс: Пункти;!;-.0

rVT!» г -■. , •, -•

и, ч /,і, її, ! ::гл 'ТІЇ и пос::с;;' :гу; >ч іу; пу і і л м-ICT-w (ППс);б.г,1.-300-СЗЗлч(., уич); и. л- -К'-П.ім 11.1 ■

s.v (б' V1} іч.'-ч'.-г-'!!!'! *(ачк«-к>нтн ('і1;-,,

ЗЗО-ЗЗОнм и с х>520 нм. согласно прежним представлениям, должны били протекать реакции (1).(2) и образоваться радикал г-мн-сн2> который имеет триплэтный спектр ЭПР. Однако, экспериментально снова наблюдается к^интетный спектр ЭПР с теми-же параметрами (рис.бд). При проведении третьего цикла облучения светом с х330-390 нм и х> 520 нм также наблюдается квинтвтный спектр ЭПР. Объяснить полученные результаты можно следующим образом. После фотодекарбоксилирова-ния протекают реакции (1) и (2). В ходе реакции (2) происходит отрыв СО-группы от ацильного радикала, при 77К она стабилизируется вблизи радикала -мн-сн (сн3). Последующее действие светом с *.330-390 нм, по-видимому, приводит к эффективному присоединению только что образовавшейся в реакции (2) СО группы к радикалу -^и-сн (сн3):

-мн-сн (сн3) + со ____________„ -ын-сн (сн3 )-со (3)

При очередном воздействии светом с х>520нм, а затем свотом с Х330-ЗЭОнм, происходят, соответственно, отрыв и обратное присоединение • СО-группы к существенной доле радикалов.

Эти реакции при 77К могут быть многократно повторены. В таблице

2 показано изменение амплитуды компонент квитетного спектра ЭПР радикала -мн-сн(сн3) в первом, втором и третьем циклах действия света после декарбоксилирования г-в1уА1а01у. В каждом последующем цикло ' Таблица 2.

Амплитуды (А,мм) компонент квинтеткогэ спектра ЭПР радикала -мн-сн(сн,) в циклах действия света после декарбоксилироваиия и их изменения (дА.%).

Цикл *1 йА1 А2 дА2 А4 лй4 % да5

1 11.5 75 71 15

2 8,5 26 55 27 43 39 10 33

3 7 18 37 33 32 26 7 30

количество радикалов, имексих квинтетный спектр ЭПР, уменьшается на ~30й. Это показывает, что'702 радикалов -nh~ch(ch_,) при действии света с хЗЗО-ЗЗОнм вступает в реакция (3). 'ЗОЙ радикалоз -мн-сн (сн,.) под Діійстрчєн света с х ЗЗО-ЗЗСнн вступает в другие фа-торозкции, в том числе и и реакии.а (1). '

Исследование фотопревращений радикалов в пептидах ftіasіyGі у и

GlyC'lyGlyGly ПООГО ДВКсрООКСИЛИрОВЗНИЯ ТОІСІО ПОКОЗОЛО, ЧТО IK 'УІЙЛЬ-

уи до конца объяснить исходя ю рснсо принятой схемы, по которой в

каздом цикле действия светом протекают только реакции (1) и (2). Действительно, после декарбоксилирования А1а01уК1у, в1уВ1уН1у01у и проведения двух и трех циклов облучения светом, в этих пептидах согласно с прежними представлениями, мы должны Сили Си полу-+ * ,

чить радикалы мн,-си(сн,) (с соотношением интвнсивнострп компонент 1:6:15:20:15:6:1) и +кьц-сн_, (1:4:6:4:1), соответственно-. Сднако в эксперименте в обоих случаях наблюдается спектр ЭПР радикала -ин-сн,, (1:2:1). По-видимому, это означает, что как и в случав г-01УА1аБ1у , после декарбоксилирования и протекания реакции (1) и (2), последук'дее действие светом с \ 330-330 нм приводит к присоединения СО-группы к радикалам, т.е. к протеканию реакции (3). Отметим, что количество радикалов типа -кн-сни, возникающих в реакции (2), кдадач циклом уменьшается (рис.6). Это связано с тем, что в казд;м цикле фотопрозраанап радикалов определенная часть фоточувствительнпх радикалов гр&зрагжотся о радикалн, не чувств.-.телькиг; ч дог;стви:с света и кмьюмпо спнплот-нь'Л спектр ЭИ? с дгГЧ.Ь м'Гл.

Реакция (3) присоединения СО-группи к радикалу мсиет протекать и в белках при разнкх деструктив:-:!’.:: процессах. Ранее показано, что радикалн ацильного типа возникают в белках в ходе Сотореакпии при действии у^-с.вйта, при действии ^ишоирулгсеп радиации. Таким образом, обратимте еотореакции ацильного радикала, могут иметь место и в белках независимо от способа получения этих радикалов.

• 2.2. Фотсоброзовзтю радикала м=-1н., в поптидах при 77К.

Исследование ^отороакнии раликалсв в пептидах 4пус;,1?1у<пу, А1о31у81у, г-п1у,-,1выу после С отссенсибилиаир.лснного декар-бсксилирспакия с ;; еррипизнидом калия показало образование радикала м-сн„. Посла докарбокеилипоззния Шаб1ус1у наблюдается трнплетнпн спектр ЭПР с /.Ь'р'2,0 м'Гл и соотношением инггжсиеностпа кочпошнт 1:2:1, характера I для радикалоз -мн-а-. (рис.7.а)(условия облучоння укапяпи П1и:е). Последу^:: ее поело довг.телыкс обхучонип образца светом с х ЗОО-ЗУО нм и х.520 нм приводит к превращению синглотпого и структурированного спектров ЭГГР дру в друга в центральной части спектра. Как Счло показано вк:со. эго обусловлено с протеканием реакции (1), (2), (3). Кроме этого на кр:№< спектра 02?

при первой жо действии света с х 330-390 нм наблюдаются линии спектра ЭПР с расщеплением между крайними компонентами ~18.0 мТл. Характерные форма линии и расщепление показывают, что две наблхщаемие линии являются средними компонентами двух крайних триплетов в спектре радикала м=сн2. •

Последующее ДеЙСТВИО СВЭТОМ с х>520 нм, при котором из ацильного радикала образуется радикал -1чн-сн2 не приводит к изменению количества радикалов м=сн_, (рис.7,а). В последующих циклах каждый раз при действии света х ЗЗО-ЗЭО нм наблюдается рост концентрации радикалоз м-сн2 (рис.7,г,е).

Па рис.8 приведены кинетические криых изменения количества радикалов в растворе пептида А1а01уй1у при 77К при действии светом С X 030-390 нм во втором цикле. Как видно, кинетика накопления радикалов м=-сн2 хорошо коррелирует с кинетикой гибели радикалов -(.ч-сн2.

На рис.9 показано изменение концентрации радикалоз м=сн_, при последовательном действии светом с х ЗЗО-ЗЭО нм и с х>520 нм в ви;:оуки-огн!1:.1Х пептидах после дзкербоксилнрсвзния. В случаи пептидов А1й01У-П1у и 0:уч1ус1у01у во всех циклах при действии света с х 330-330 нм наблюдается рост когшзнгравии радикалов и=сн2 (рис.9,а,б). А при действии света х>520 км количество этих радикалов во всех трох пептидах но изменяется. В случае г-сиулисау во втором цикле пак облучении светом с х 330-320 нм.рост м=сн„ радикалов но наблюдается. Ого связано с тем, что при действии света с <\>520 нм в первом цикле облучения еиильнио радикалы превращается в радикал:; -1..1 с.не,и>, деист-I;ис) света с х 330-320 нм. на которых не приводит к образованн” радикала .рис.9,в).

Таким (.срезом, образование радикалов -а;в пептидах п.-Одлдао,'ел при действии света с х 330-350 к:.; на радикал;: типа образу,~

'...неси при разрыве г-с связи о остатке глицина. В случае -м-сич (где г^н; действие света с. -х 330-350 нм не приводит к o0po3o.ju.4nj н*(.н, радикала. Вид.,но. при атом могут возникать радикалы типа п-саа, однако их спектр;; ОПР набллдать но уясотся, так как они лс:::ат в области, закрытой спектром ссновних радикалов, концентрация когорт существенно бодьпо. доля радикалов н«сн в об^ем количество '.-тсиндупирс-Езт-г.-х радакалоъ в пептидах мскот достигать значительней ьелил’пны.

Во бсох исследованных пептидах зта доля поело первого цикла денст'ви;;

I 2-3 мин

5 ГО 15 20 1~ч

Рис.8. Кинетика прои-ращання радикалов -сня-со (а),м»сн2(б) и -мн-сн2(в) в пептида А1а31уБ1у ПОД Д0ЙСТВИ8М сзэ-та с х 330-390нм при 77К.

Рис.9. Изменение концентрации радикала и=сн2 при последовательном действии светом с х ЗЗО-оЗОнм(л) И С X. > ггсцм(г»} на пэптнд-1 01 уБ1уС1уС1у (а),

Л1вЦ1> С1у (б),

г-[3:уЛ1ь--С1у (в) послс: 4чяос£!«скбилизиропа!1 •

НОГО ф&рриинш 1ИЯ0М калия дэкарЗоксилиро -пания при 77К.

света составляет '■&%. В ПвПТИДВ АІаБІуОІу после проведения нескольких ЦИКЛОВ фотороакций ИЛИ ПОСЛЭ Облучения В точение 15МИІІ СВЭТОМ С X >320 нм указанная доля вырастала до ~1в%. Полученные результаты показывают, что радикалы м=сн2 образуются в реакции:

-Ст-СО-МН-СН_ 530-390 нм -сни-сон + ы=сн2 (4)

Подобные типы фоторвакиии свободных радикалов наблюдали ранее при протекании их в твердой фазо и объясняли эффектом "клетки". При протекании реакции диссоциации радикалов под действием света образуется новый тип свободных радикалов и норадикальный продукт. Если образующиеся в результате диссоциации радикалов, частицы выходят за пределы "клетки", то они стабилизируются- в матрице того вещества. В противном случае они могут реагировать друг с другом с образованном новых радикалов. Таким образом, можно предполагать, что фотообразованио м=сн2 ■является "внутриклеточным" процессом.

' -Ст-С0-МН-СН2 530-390 НМ /-СНЯ-С0 + МН=СН2/* ____________. -сня-сон +.

■ м*сн2 - .

Протекание подобного типа реакций наблюдалось ранее для многоатомных радикалов в работе (Х.Скабе,1931).

Выло в разделе 2.1 Сило показано, что молекулы СО, образовавшиеся при протекании фотороакиии (2), при последующем действии свота с х 330-390 нм эффективно присоединяется обратно к радикалу -ічн-снг?, от , которого они оторвались. Анализ накопления ы=сн2 радикалов в пептидах в циклах облучения образно сватом подтверждает данный вывод. Действительно, если бы при последовательном действии на дэкарбокси-лированный Пептид цикла облучения светом с х 330-390 нм и х >520 нм протекалч только фотороакции (1) и (2), то в пептиде АіаБіуОіу после второго цикла все.фоточувствительные радикалы должны были бы перейти в радикалы +мц-сн(сн,), а в пептиде сіуоіуеіусіу поело третього цикла - в радикалы +т3-сн2. Эти радикалы нз чувствительны к ивэ-ту с х>330 нм_и, таким образом, но могут участвовать в фотообразона-нии радикала м=сн2. Однако; в пептидах Аіаоїуоіу и оіуоіуоіуеіу при дойствии свота с х 330-330 нм, соответственно, в третьем и четвертом циклах наблюдается существенный рост концентрации радикалов и*сн_, (рис.9,а.б). Это объясняется том, что из-за реакции обратного присоединения СО к радикалом продзикенио фотодеструкции г.оппиа от

С-коииа к м-кониу замодляэтоя н в поздних циклах в образце еще сохраняется значительное количество радикалов типа -мн-сн необходимых для фотообразсвония радикалов м=сн,. ' ■ . ■

Кг:ртинз образования радикалов и=сн0 в циклах облучения пептида

2-С1уА1аС1у ТЕКЛО ПОДТСОрЖДВеТ'ВЫВОД Об ОбраТНОМ ПрИСООДИНеНИИ СО' К радикалам при действия свзта с >. 330-330 нм. В данном случае .при учете только реакции (1) и (2) при действии свата с х 330-330 нм в третьем цикле должен бал Си каблздзться значительный рост концентрации м=сн2, так как во Егором цикле дол;ген бил бы происходить отрыв аланинового остатка и образоваться радикал г-мн-оц, который в фото-рескиии (-1) дает радикал м»сн„. Однако, в эксперименте наблюдается незначительное увеличение шпкжтраиис н-сн.,, что объясняется сильной конкуренцией реакции присоединения СО. •

Итак, при протекании Фотореакиии радикалов в пептидах 7-01>Л1э'ну, л 1с.бIугну,61ущуА 1ус!V, сенсибилизированных чУррицианидо.^ калия, образуются радикалы м=сн„. Геакция (4) вскмоязш текяо в яякх друсих пептидах, но в них, видимо, будет попичкать радикал и-син, где структура к зависит от вида аминокислотного остатка. "Несомненно, радикалу типа гист доджи образоваться и в салках при прсгокаиин фотсриакиин радикалов -|.н-спя, независимо от способа их получения.

2.3. Кч'сроакцня свободных радикалов в механически

д’еструктиреппкних белках.

Облученио светом х»320 нм механически деструкгирсванних при 771С балков приводит к протсканио нновостадиинч-.; роторе ипий радикалов, в результата т,его набл^да.-г: с л соравонанге и .|'огонр?вра! днна раднкьл' а неенал! к’нх гипов. Спасай рассогрим основные ^отораакнни радика юв, сбр:оу!Г.".хся при механически! ;;.-струкшш Селлов.

Спектр ОПР ‘^’Проннл ’ДУ-МС., !'1!Я1!НИЧ!Ч-КИ .'.'’ОГруКТИраВНЫКЧ'О при 77К, права.дн на р.-с. 10,.а. I;р.,м-;тг^ эгоно сне-дра 1:р,а мен^ в разаале 1. С?лу'а.аг'е сагам а > а:’’! ЗДО I." при 77К ьрип-л-нг к Сч'Гор^акпин, при косорот 1'с;,Ч'Г,|.|’и рааила:.:; пв1мда:;’:а:"гск в радикала, пае:; ;.:ан снш'аяг -1"Ж гиектр ОН!' с, /.И-1,71- 0,152 и'Гм (рис. 10,6). Кум пес "еду’Д. м ;;е,тг нип на '"'•'рл а-ц сне 1а о >. >(Г;!) нм шцотчтчесгь онв''ЛеП1 уммл.^аатоя I! ней л'.дается по 'вленпа с I рук: уриронаш 1ого спек'на: ОШ' (рна. И1, )). Центральная к> мпоненга в :тм спектра 32!’ ^ол1.!!П (;■■..та- тс* а; ■ 1 •. н у,' .а;::! ”■!! и в асаадта снактри как по аап дггуг'.е, !;а. и <!«. . • •. ''.Л-

Рис.10. Споктри ЗПР радикале» деспуктированного фибришш шшіки при 77К : « - до облучения, 0,1’ - посли сЛііучония

СБВ'І'ОМ с х 330-390 НМ В ТОЧСНИО ЗО МИН., П.л- ПОСЛОДУ'и-

їїое облучеішо сватам с х >&20 ин (10 мил.).

рина этоя компонента равна 1,60 ± 0,03 мТл. ПоследуюЕво последовательное облучение светом с >. 330-390 ни и ^ >620 нм приводит к превращению структурированного и синглетного спектров ЭПР друг в друга (рис.10,г.д). Интегральная интенсивность спектра при этих фотопревракениях но меняется. ’

В разделе 1 на оснозании анализа перехода исходного спектра ЭПР (рис.10,о) а синглетшя (рис.10,б) и рассмотрения типов радикалов, которые должки били бы возникать при разрыве всех связей остоаа пзптидноп иепи, был сделан вывод о том, что при мехвничэскоп деструкции фиброина при 77К наблюдается разрыв только связи с^-с и образуются радикала типа -мн~сня(1) и со-нн-(Ц). Рассмотрим фотопревращения этих радикалов. Макрорадикалы типа 1 ранее хорошо изучены. Они возникают, например, в УФ-облученных при 77К белках в хода фотореакиии радикалов. Вид спектра ЭПР этих радикалов зависит от типа группы гс, связанной с -атомом. ■Гиброин селка содержит '■44,5.5 остатков глицина, '29,3% аланина, ~12,1Ж серима и '14,1% остатков других аминокислот. В случае, если разрыв разных с^-с связей равновероятен, вид спектра ЭПР радикалов типа 1 будет определяться, в основном, разрывами связи с^-с в остатках глицина и аланина. В случае разрыва связи с^-с в остатке глииина спектр ЭПР радикала 1, будет представлять собоя триплет с соотнесением интенсивностей компонент 1:2:1, в случае остатков алэнина получим квинтет 1:4:6:4:1. Эти спектры имеют близкие величины расцепления и сирины компонент, значения д-факторов рздикалоз тают близки. Поэтому компоненты первого спектра хорошо совмещаются с тремя средними компонентами второго. Соотношение амплитуд компонент суммарного спектр'-) рэдикалоз типа 1 с учетом относительного содержания аминокислотных остаткоз в этом случае будет равно 1:10:10:10:1. КраР.ние компоненты этого спектра слабив. В слсгнсм спектре ЭПР для наблюдения за проведением радикала типа 1 удобны вторая и четвертая компоненты. Растепление но.тду ними определяется спектром радикала глицинового типа, дав:".ого максимальный склад в спектр, и близко к 4,2 мТл. В исходном спектре (рис.10,а) интегральный вклад сигнала ЭПР радикалов1 гипа 1 рапзч 50:Т.

При дэпствии на радикал) 1 енота х 330-390 нм протекает реакции (1) и образуется макрорпдихал -снп-со(111), нмею'лил синглотннн спектр ЭПР с дН-1,3 - 0,2 мТл и ч~2,001. Виго (рязд.1) было показано, что кинетика подходы исходного спектра ЭПР в синглитнин под депонтом

света с х 330-390 нм определяется двумя фотореакциями, В хода реакции, имеющая большую константу скорости, возникает синглетный спектр ЭПР с дН”1,4 мТл. Это свидетельствует о том, что в механически доструктирооанном при 77К фиброине шелка при порвем действии света с х 330-390 н^ действительно протекает реакция (1). • .

Радикалы 111 при действии светом с х >520нм могут участвовать в реакции (2), в которой они снова превращаются в радикалы типа 1. Действительно, при действии-света с х >520 нм на фиброин пелка после моханичоской деструкции и облучения светом с х 330-390 нм наблюдается уменьшение амплитуды синглетного сигнала и появление многокомпонентного споктра ЭПР (рис.10,в). Расщепление мезду крайними компонентами этого споктра составляет '8,4 мТл, а между второй и четвертой компонентами ~4.,3 мТл. Эти величины равны, соответственно, расщепления моэду.крайними компонентами квинтетнего споктра ЭПР в случае, если . в радикале 1 к=сн3 (остаток аланина), или расщеплению мезду крайними компонентами триплотного спектра ЭПР, если r=h (остаток глицина). Соотнснониэ амплитуд первой и второй компонент примерно соответствует прэдсказанному дая суммарного спектра радикала типа 1. Таким образом,

7. фиброине иголка после механической деструкции и облучения светом в диапазоне 330-390 нм при действии свата с х >520 нм действительно протекает фоторезкшш (2) и вновь образуется радикал типа 1. Однако, в этом случае в системе ужо кневтой c.j , которые влияют на даг.ькаяиия ход реакции. В разделе.2.1 было показано, что в пептидах при 77К имеет место фотоприсординениэ со к радикалам -nh-chr.

-NH-CHR + СО S30-390 НМ -KH-CHR-CO ' (5)

Такая !,.о реакция межот протекать и s белках. Отметим, что реакция (5) будет эффективно протекать в твердых матрицах. Так как для протокения этой реакции необходимо, что со группа в" белковой матрице стабилизировались вблизи радикалов -шн-енг; . Итак, по втором цикле под действиом света с х ЗЗО-ЗСО км радикал 1 нар'яду с реикиизг (1),участвует и в реакции (5). Вновь образующиеся аиильныа радикалы участвуют в дальнейших фотсроакцивх. Действительно, при последовательном облучении светом с х 330-330 нм и с х 520 нм механически двструктирозанном при 77К фиброина шелка наблюдается превращение структурированного и синглетного спектров ЭПР друг в друга (рис.10).

Рассмотрим фотсроакшга мскрорзднкала со-ми-снгї- второго радикала, ^бразуюілзгосл при мохгническсп деструкции фнброхна полка при 77К. '"орма споктрз отого радикала но зависит от типа сосодаого у:ннокнслотного остатка. Ото триплет с соотнолскиз.ч интенсивностей кскпснзит 1:1:1 (у«.а?ка к.,нііс!5Ьі ,1?7б). 3 раздала 1 показано, что радикал:; 11 под дгпстписм с сото с х ЗЗО-ЗСО им полностью проврокоятся а радикал1;, н:.г-:гг:::э скнгдзті ын спектр ,?п? с киринся около 1,7 мТл, котсрнз !-:э чуззтзнгзльни к ссзту с х >330 им. 3 сзлаи с зтим еСротт пнн::ззнз ::а от::з!:они» пирты ц&птральнол ксмлонзнти о споктрвх, пріаездошаяс из рис.Ю. 3 исходном сгГ.’ктрз (рис. 10, а) пиричо і!3і:тральіігл :<с::лснонти дК'О.О мТл. Пссхо ззгзртзнил 'зогсрзакнии і:ри ддпз'тг.з:: е"зіа с х ССЗ-ЗССя.ч ширина синглотз сссїпрг.р.сг Ч,? ::їл (рис.10,б) и елр-'-ддлотсл сух.зол споктроз ЗРІ' рад::.з'уз.з, ззрззу:зз:н;:сз гз радзхзззс 1 :: ц. Г’>р:-на гзнгрзльпсл ксхноиз'пы сурулгурирсваю:ого споктра. ззузузхззго псолз ззязрззннл оторваки:-:: ::оц ззлстзху! с.пзта с \ ГГ Г) - і с.ззтппзз-зт 1,00 - О.СС :;’Гл 'рхз.іС.з). з дзлу.эп-:зм с-з, зрз '.у..зззл су'тсч с х СГО-320 зз. ■; х . ХЗС зч, сгззтзз г.осгл:с--і з з.зуу-з :: “I ,0 >.?з (г.: з.Ю,;:.). Г/.^ зззхзтзлзоззуз? о то::, что сірззеззу "у-з і. з-'рззз згс\- уз-'! зз р ууусз 11 рзззкззч VI з з зузстзлтзз.ззч х с з;у с х УЛ-СЗЗ .‘і н х ' х::Ху. :'зз:зо ззуз.ь, хто ззлзчизз 1, П :тТл ззл' о тс.і с-иго точно'*, злз гнр: суслзтиззо

сгзктрз рздзхазз IV. в сугузрзс-м езнзлзтноч еззугзз (рис.10,б,;’) зто-ргч елззпзуч ззлз-у-сз езнг.ут с г'ХМу! з?л іразу-зх: 111). Ха р: с. 10, г;,д ото?’ ч зз сззу:з' ч ^злззтз і ^зулз з.з " "хоч зззз 1. _:..рз::з

ззнтрх'х:-у зз'з "зз,'п которого'"О,и х?л. Г; з.з. : слуззз (з .сли,:;,д; ,:с..,,с,■, _ гзідззз. С'.р'зт хзззхз.

' Чзз у; уз-уз-''.........г 33 У , Ууоз ;гз.1 зузузз : 11 3 .СУЗУ' ззззо--

■У’З-ЗРЗ : ,, .уууалг1 и гр- "з чузз раззу зухзу.ол с.х.зч з--!

;70 Г5'Х-з:--': . ■ ■

3"-'М-С!Х- г ЕсЛ “зн-знз- (Л)

рзззгзузсть т"!:зго пззгззз'ззнз рз,:з-ікз;:а 11 псдтззр'с.язтся оусастпс'г.к’.'г:! го;:.оС::>гс разкиил, юучогскх рззча і:а УЬ облуч&і;ніп: Й^кох'и і’оду'.ьуз: сз.стсззх (Кз:".:г<-::( Л.П. и ;:р.,1373, \з;;зозя О.Д., . 1076). __ _

-с:-::'ї-са-г:н-снг?- ~365и:| . -смп-со + "-<н-снг<-

Я-СО-М-Я 565 Г(-СО + М-Р . I I

Я и .

ГДЗ (*=Н ИЛИ СН3 .

Не чувствительный К СВОТУ СИНГЛ0ТНЫЯ спектр С ДН=1,60 - 0,03 мТл мы связываем с радикалом со+. .

Подобные фотореакции были наблюдены для других белков. На рис.11 показаны спектры ЗПР механически доструктированних при 77К коллагена (рис.НА,а), кератина (рис.ИБ.о), хелатиш (рис.11В,о) и последующие их превращения при последовательном облучении светом с >. 330-330 нм и с \ >520 нм. Основной вклад в спомрах ОПР механически

доструктированних при 77К коллагена и желатины вносят триплетшп

спектр со слодукглими параметрами (расщепление межцу компонентами днр1 £'2,33 мТл;дНр2 з~2,11 мТл;шириной дНк;1~0,99 мТл: дНк2~1,С5 м?л; дн:.3'0,&3 мТл для коллагена, дНр1 2~2,24 мТл, ДНр2 3'2,17 мТл, ДНк1~

0,91 мТл, ДН^'1,12 мТл, дНк3~0,84 кТл - для желатины). А спектр ЗПР механически деструктированного при 77К кератина иерсти представляет ссбоп наложение характерного анизотропного спектра ОПР "сорных" радикалов и спектра ЭПР триплетноп формы. Расшплениа между первой и

третьей компонентами триплета разно дНр1 з~4,4 мТл, а циряна

компонент ДНк1, ДН,^, ДИ^ равны, соответственно, '1.02, ~1,16,~0,е8 мТл. Облучение образное светом х ЗЗС1-ЗС0 нм приводит к умень.зенш) интенсивностей триплетных спектров ЭПР и появлению СИШ'ЛОТНЫХ спектров ОПР, с дН'1,6 мТл (рис.НАО, Бб, ЕО). Последующее облучение образцов свотсм с х >52Пнм приводит к укеньЕзнма интенсивностей синг-лзтних и появлению многокомпонентных спектров ЭП? (рис.НАв, Бз.Вв). Повторное .Длучониз образцов светом сначала с х ЗЗО-ЗЭЗнм.а затем с к > Г>20нм приводит к. превращении многокомпонентных и еннгле.тных спектров ЭПР друг о друга (рис.НАг.д: Бг,д: Вг,д). При протика'нии зтих фотопроцоссов обкзя концентрация радикалов сусоственьо но меняется. В случае кератина иорсти "сорные" рэдикаш с фоторозкииях но участвуют. •

Триплзтния споктр ЭПР механически дэетруктировзмшх при 77К коллагена, кератина и желатины по основным параметрам н по картине 1;.о-: о~-проврасония идентичен спектру ЗПР, наблюдающемуся в фиброине солка.

©отопрезраезния радикалов, наблэдшосиеся при облучении светом мо-у.&ничоски дзетруктироаанных этих болков, как и фиброине езлка. хоро-

Риз.И. Слпктрч ГИГ ікетачитески /,гст?у:<тйроо8.«ноі*о ьри 77Х хсої-' .рлгснэ (А,а), кор-зті!«з (Б,a), roxtrrmi (В.а) и поолелу-г~по сЗпуч'гні'з сгатом: Й,г - ЗЗСКЗООім, 'в.,д - >020нм.

шо согласуются с протеканием реакция (1), (2), (5) многократно и реакции (6).

В отлично от фиброина, коллагена, и желатины, которые но имэнгг серосодержащих аминокислотных остатков, молекулы кератина шерсти содержат болыаос количество поперечных дисульфидных езязеп. При механической деструкции происходит розрив этих связей с образованием "серных." радикалов (рис.ИБ.а-д). Раноо показано /Дубипскаи и др. 1030, Якутева, Дубинская, 1984/, что при моханичоскоп деструкции белков кромо свободнорадикальнга: процессов протекает и мехеноденату-роиия. Образование "серных" радикалов при ^оханичисксп деструкции кератина показывает, что при этом происходит по только разрыв поптикиах иопоп, но я их разрихдонно вслодствио разрыва поперечных дисульфидных мостиков. По ' соотношении интегральных пнтенсизпсетеп спектров ЭПР "сорных" радикалов (603) и суммы радикалов 1 и И (40Я) паи га судить об относительном вклада МЙХаНИЧЄСКОЯ дестрікиии, прагекекпвп по тому или иному пути із различных условии:;.

Детальное исследование фотороокиин радикалсз, протсшапос в Солках поело моханичоскоп деструкпяи при 77К, погасало образованна м-сіи и мзо радлкалов. Рассмотрим возмеміме пути их образования. Из радикале;: и*снгс удобно исследовать и=снг<к*и>. Ток как спектры 'еП? [.ідї.кслсв Ч'снк(и*и) лежат в центральной области суммарного спектри п нодоступни длн наблюдения. П-раздало 11 было показано, что радикали г, пептидах образуюгск в ходе фотороакшга радикала -іін-Сгі , ог-носязшся к глиииноьым остаткам. Из рассмотренных С.-лков самсе і кси-солер;: чнио млиыина имеет фиброин и,елка ('-іаК). Поетому, образовало м--сн„ рассмотрим на примере згого белка.

Спектры ЗПР радикалов (-м і-см.ч і: eu-i.ii-), ;;а;х:.;::.м;,нхся в фиброине Гс'Л.чп в хо.",е ?т!хгл:ическоя деструкции при 77К, и радикалов ио.-нилаик/л; г; поз по. пук:, их фотоееахииих при Последовательном допегзии све.а с \

Зс0-300! С! и > >5Г,Л-;:„ приведены на рис. 12. Сановные фотоаеакпии

радикалов, приводящие к трансформации спектра ЗП? в центральной части (пунктир на рис.12) рассмотрены в:;^о. Показано. что превращение с груктурирозаннсго и сииглотнда спектров ЗЇ1Р при последовательном действии света >. 330-39Спм и х >52Снм обусловлены превращениями радикалов -ын-а«'ц -нн-сн»-си друг и друга в роакшях (1), (2) .(5) и ра-днисдоз со-кй- в реакции (6). . і

PMC.12. Спектр ЭПР рэлжаяси, возникших посла моханичоскоп дзструкиии фиброина lojiko (п), и рвдіїкіиюіз, пок'м^'жья при послеДОВЧТЙЛЬНОМ ДВГМТВ.'.: СВЭТОМ С X. '530—380і'М В 16Ч0КИ» 20 1Н!Н(б,г,о,з) и с >&20нм в течвний 4 мин(в.д.м). Спжшная линия - уси-КіНіїО ;:о.

Обратим внимание на слабио компоненты, появлявшеся ■ на крыльях центрального компонента при облучении фиброина шзлка поело механической деструкции при 77К светом с х 330-390і ім (рис. 12.6).

Величина расщепления (П8.0 мТл и ~12,7 мТл) и чувствительность к свату показывает, что мы имеем дало со спектрам ЭЦР радикалов ы-сн^ и нсо, соответственно. Действительно, действие света с х >520нм приводит к исчезновению двух компонент, расшвпление мовду которых ~12,7мТл (рис.12,в,д,ж). Оставшиеся после исчезновения радикалов нсо слабые компоненты принадлежат спектру ЭПР радикала и=сн2.

. Рассмотрим механизм образования радикалов м=сн2. Выше, в разделе

2.2 было показано их образование в пептидах в фотореакции (4) из радикалов -мн-сн2. ДоисТвие свэто с_х >520нм в данных, системах не приводило к изменению концентрации ы=сн2. Накопление радикалов м=сн2 в фиброине иелка после механической деструкции при 77К происходит также при действии светом с х 330-390нм (рис.12).

На рис.13 приведены кинетические кривые накопления радикалов N=0^ и гибели радикалов -мн-снгі под действием света с х 330-390 ни. Как

Рис.13. Кинетические кривые превращения радикалов -м+-сни(а) и * Н=СН2(б) под действием евзта х ЗЗО-ЗЭОнм в фиброине Ьелка после механической до-струкшш при 77К.

• ' • I ‘2 3 игл

видно, кинетика накопления раді,калов ы-сн2 хоросо коррелирует с

кнмотикоя гибели радикалов -nh-chr. в фиброине иэлка ~45% всох аминокислотных остатков приходится на долга гхииина. Поэтому '-15% радикалов -nh-chr будет иметь вид -nh-ch., . І'монно макрорадикалы -nh-ch2 участвует в образовании радикала м-сн., (раздел 11). Видимо, образование м=сн2 з фиброине солка также, как и в пептидах, происходит в роякиии (4). Уменьшение прироста количества н=сн в каздем последующем никло связано с тем, что в циклах облучения светом часть фоточувствитель-ных макрораднкалов переходит в нефоточувствительнне радикали, ftowio полагать, что радикалы типа -nh-chr (r*h) при действии света с х ЗЗО-ЗЭОнм такзкз могут участвовать в реакции типа (4) с образованием радикалов n=chr:

-CKR-CO-NH-CHR 3.?-0-390HM -CHR-COH + м-снг< (7)

Долл радикалов n-ch., в механически деструктированном при 77К фиброине телка после прзврашения всех фоточувстоительных радикалов в нофоточувствитвльккэ радикалы, составляет ~2DZ.

Как было отмечено вико, з фютореикциях радикалов в квханнчгски де-структированнпм при 77К г|иброиі:о колка, протека.ецпх под действием счета с х 330-3£0ьм возхникамт радикали нсо (рис .126, і\е ,:з). Их образование в резных системах ннблэдали и ранее. Кило показано, что нсо образуются в реакции (8) присоединения стимрного водорода,возникающего в хода фотореакиии, с охисы:) углеродо, которая заранее сила введена О систему (iWrun F.J..15G2, ХОЛИЧШ D.H. И Др. ,1363).

и + со-------------■> нсо (8)

В фиброине ["елка после механической деструкции при 77К i:j соразу-f;rcti n фоі’ореакнии (2) при р.!сна;:е анильніо: радикалов. Аиилиіме

радикали, как показано (Кич (н.А., Лі.И'-з К.Я.. 1271) могут распадаться так’.'-а с oCpaeoiwi'HUM ііт<мирікч'<> і?',пл'Р"Да:

- І.НП-LI) 11>> -fut -lh-cj * h (‘J)

Таким образом, петь ноем' >j:mivth образования пси и механически :'.е-отруктнрое.чнном нри 7VK lелки п реакции (в). )1о радикали пг і

Э|<;«кт>:к> распада іітоіі при допсті’ии света с ч > 5-ІОг>гі* и их рзвнонее--ман концентрации в этих улмчи«>х очонь низка. Поэтчлу, при депсівин споти с a tv;U!:M, :іти радикалы но регистрируется (рнс.ІГі,я,:і). Однако, как i!o.<nu(uwrr резулніа,'u наших .жеперн.ченгов, ріикпкі (j) и CJ) С МіНЬ'Л-ІІ CKO'.JOOTU'l црін’екамі' В фНОрЛИНЗ І',:"ЛКН 'ДОС-Ш ПЄ.ІПІ ПлЄОКСП

деструкии при 77К и при депствии света с х ЗЗО-ЗЭОнм.

Таким образом, под действием света с х 330-390нм на фиброин шелка посла механической деструкции при 77К образуются как молекулы со, так и атомы н. Атом водорода условиях нашего эксперимента нестабилен и реагирует, в частности, с со, образуя пса реакции (8). Радикали нсо почти нечувствительно к сезту с х 330-300нм, и их равновесная концентрация достаточна для регистрации (рис.12б,г,ь,з). ,

Кинетика накопления нсо подтверждает предложенный механизм образо-ваь.ия нсо (рис.14) В перзом цикле накопления радикалов нсо начинается

Рис.14. Кинетические кривив накопления радикалов нсо в до-структироаанном при 77?! фиброине иелка при действия света с х 330-3901 ім в пор- . пои (а), втором (б) и третьем (в) циклах облучения.

толжо через 2 мннуга после начала облучения и только через С минут скорость их образования достигает максимального значения. Это связано' с тем, чго после механической деструкиии в образно нет молекул со, когорце начихают возникать при деиетиии спета с х ЗЗО-ЗОЭнм первом і:н:<.;'о чаяько поел-’ перехода радикалом -мьию в аиильнііо. Скорость ;:.нии иго растет по мере накопления мо;,акул со , кагор!» при 77К (.і.-,Ои;,ьііи. Яепствие еьота с х Ж-Оі.м перед птор;;м ии.ежм приводит к прЬіоканп-і рыпфии (2) и к увеличения концентрации со. Таким образом, і/о «тором цикле \і образно у.-і-.е имеются молекули си и реакции (3) начн-'ііаеТ; протекать сразу )ш поемо образования ацилым:: радикалоз, которце Ь ф^ГОрЬНКЦИИ ('.)), НРДЮ»11И0 ПрОТОКЯйЛШ ПОД действием спета О X ГЛГК^'Пгь;', миг атомарный иодерод. Скорость образования т.о и згом РПрм^ля^гси г:хориг.Ть.ч! образовании п. Аналогичная киріч.иа обра-

зования нсо наблщдаотся в третьем цикле (рис.1-1).

Исследования фотореакцип радикалов, протекакимх в фиброине шелка посла механической дэструкиии при 77К, показали обргзозанип также м=сип и нсо радикалов. Фотообразованиа этих радикалов будут протекать и в других белках посла механически-деструкции. Это связано с том, что первичным актом при механическое деструкции белков являотса разрыв ся- с связи остова пептидноп иэпи и образование радикалов типа -мн-снг?(1) и со-кн-(И). Таким образом, но всвх белках при механическоп дэструкиии одним из образующихся радикалов является ччн-сня, фотореакиии которых приводит к образованию и=снг? и нсо. Отметим, что радикал!! типа 1 в балках образуются и в других деструктивных *про:.’оссах. В частности, они образуются в хода фотореакции УФ-облученннх при 77К болках и, таким образом, появляется возможность фотообразования г.'=снп и нсо радихалоз.

Споктру ЭПР радикалов, появляющихся при УФ облучении фиброина шелка и коллагоиа, показаны на рис.15. Центральная часть спектра ЭГГ? исследована ранее. На краях, спектра виднн слабые компонент» с расцеплением -13,0 нТл и '12,7 мТд , обусловленные радикалами к*сн2 л нсо, соотвэтстсонно. 1Синотичвскиз закономерности накопления этих ра-

Гис.15. Спектры ЭПР фиброина имка (а) и колла-' гена (б) поело У1>-облучения (УФС2) в течение 20

диколог» год дяпстпиэм свата тек^э, показывает ск^оуказаннип путь1 их ©брпзозвния. Таким образом, фотообразование к-си* и ксо•является об-

щим для белков, подвергнутых тем или иным деструктирующим воздействиям. Как и следовало омидать, фотороакиии радикалов но зависят от способа их образования. '

Итак, рассмотренные выше фотопроаос.си являются обідами, для механически деструктированных белков и можно привести следующую схему:

ФОТОРЕАКЦЩ ІІОСЛіЗ МЕХАНИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦІЙ ОЕЖОВ ПРИ 77К.

-СНН-СО-Ж-СНЯ-Са-ЫН-СНГ^СО-Ж-СНП-СО-

-СНР-СО-№1-СНГ<-СО-МН-СНГ< СО-Ш-СНГЇ-СО-

-СНЯ-СО-ІМН-СНГЇ-СОН + П*СН« <-|зйОНМІ 1360 НМІ

-СНК-СО-МН-СНИ-СО + С-1Н=СНг( со"1" * “ш-СНЯ-СО-

-СНН-СО-ІМП-СК^СО + Н —|520НМ ЦзбОНМ |

Н+СО НСО -СНИ-СО-МН-СНК + СО + №НСНЯ

-СН!Ч-СОН + Ы=СНН «-І360НМI

1 .Г"1 •

-СНН-СО -и 1ЧН=СКН + СО + МН=СН«

111. Темносые реакции свободных радикалов, образующихся при моханической деструкции болков при 77К.

При мохвничоском воздействии на белки первичным свободнорадикальным актом является разрыв с£-с связи остова полипептидноя цепи и образование радикалов -nh-chr. co-nh-. Для установления механизма • разрушения целесообразны низкотемпературный исследования, так как, образующиеся свободные радикали стабильны при этом. Однако, в реальных условиях болки подвергаются механическому воздоиствию в>сн-роком температурном интервале. Поэтому, исследование свободнорадикальных реакции, протекающих: при повышении температуры в механически деструктированных при 77К белках весьма актуально.

Первичные свободные радикалі!, образуюциеся в белках при различии:! доструктирушиих вовдзпетвйях (і'Х:- и г-облучопии, мвкшмчеекяч деструкция), как правило, при повышении температуры ст:сг,.'.э пре*ври!,імі:ітср но вторичкно, а затем происходит их гибель. !’.г>р.нн!: радикалы отлич.ччтея кгте но тормостаУильности, ток и гю p?a'Ui.. Оч-

рэдалягащуга роль при разработке этих вопросов сыграли эксперименты на модальных соединениях - аминокислотах и пептидах. Ранее (Котаин и др. 1973, Усатыл, Панин, 1973) были исслодованн тэрмсреакции свободных радикэлоз, ккауииртэниах при 77К з водных растворах таких соединэ-1')!Т>. Показано, что ацильные радикалы исчезают при 12СК, обзй! отжит радикалоз заканчивается к 2СШ. Было установлено, что в пептидах при от.'г.се исходные радикалы прзерагаэтся а радикалы типа -мн-сп-со- с отр:.:пом атома н от сл - атсмп. Сднеко, основные реакции радикалоз в пептидах исследованы далеко т полностью.

Удобной счстомсл для изучзния термср^акияя рпднка.'оз является под>гып раствор пептида с Серрицнанидом калия. При 77К дзпстзна осота

з поласз поглолэнич последнего приводи? к дакербсксяягрозян:зз п^птидл (ПОЗДНПК и др., 1-570, ГсчГ;-., П., 1973) .

3.!. Торчорогкиии радикалоз, фотс^ду^’ирсггтих з водны:: р-.отмха |:2Птидоз с ^еррниианидсм калия.

При дакар^с'силнрс^'М'Ни пептиден в определенных уодр,’н:':: г^Уллда-

• .ту гслы:о р."ги■::! тпгп -’п-и-л1, которые гылту под декетуне" се:-:::

...:у :т." ;г “ ун р .^л^-ч-ых ‘[отспреурадоу;';:, ссноун:;>м среди которых

тся;

ч-гп -* о-г^о::: -г ;. - с.- г^- сп - гч (1)

-1,>1~СН.(-СО >5С01К ~><4-С1-П I- СО (3)

Крат ссыр'м/еинс': (10а) облучение счзточ о ^ ;У0С:-у при 77К >; г плис:; г'Ч'тгоро палдиа •"ь-.глуп^ з присутстз'-'Н Сер; ллаынд': кали'-: по;-'.;олут

..т;.пт:!^п_ Гс.дсиин (:) и (.") з етсн слу'-';".! '.ракт;!’’'--.'!.' гггV,' (У.едел 2.1;. сыг-лр ; К? У

- ■, уу-ухалсз (рис. V.”, 77л). ':л'.у:е'':'’;

- \ у-уу; < ;д •-;•;■!) уд. г :? с::е<7рл УК?

(г а.1 '.',0,77:'). *'-уого еу":'о:-1 уу лу_.; :ре:: гадпк.ед-

-’.''.-го .1’: • г. .'К'1,5 ::?л), -■ 1-с : е] - г. с :У-У г.л лл.-лгнодо

: :■ у а-: .Щ-1Л :.:‘.л) с неустановленно^ природе!.

;Р ага.гу.'.лл) уулг. -а на 'Урасеп спета с л '-Ъ'.0грнуодду •; л.'У'му ; зт'.ч;рг'3ра:.'!ит ацильных редихзлсз по реалы::,! {?.). ‘7-.-г.сл

гУр'УО1-'. с::октр ЭЯ?, присодькнин на риоЛбз (77К) огрс-з^т'"* •'•’.(Я спактрсз ра;р?узлоз типа -м^-сн, и иулоточугстзчтрльиа: ра.;>.х::Ло^.

Рис.16. Спектри ЗПР свободных радиквлоз в водном растворе ' АіаБіуБіу с феррицизнидом калия при 77К после облучения светом с \ : £Г- >400нм (Юс.), б- 330-390нм (8мин), в- 330-390нм (8мин) и затем >520нм (2мин), г- >320ни (ЗОмин) и их трансформация при нагревании образца. Температура измерения 77К. Цифры на спектрах - температура в К.

Рис.17. ‘Изменение концентрации радикалов -мьсн2 (а-б) и к-са (в) в растворе АідзіуБіу с феррицианвдом калия при повышении температури. Условия приготовления исходных образної» смотри: а-ьа рис.ІСа.в.г; б.в - на рис. 166.

При действии на исходныл образен спота с х >320нм в тачекиэ ЗОмин происходит дальнейшая трансформация первичных свободных радикалов (рис.16г,77К)- доля* нефоточувствитольных радикалов растет, -мн-о^ падает, в результата протекания реакция (1) и (2) в небольшом (несколько процентов) количество появляются радикалы +(чн3-сн(сн3).

В таблице 3 приведена оионка вкладов (в %) указанных свободных радикалов в общую концентрацию в образце для исследозанних случаев (рис. 15, а-г, 77К). .

Таблица 3

Радикал а 6 'В Г

-со-ш-о^ 100 ' 29 " 57 42

-сн^-са 0 2? 0 0

Еефоточузств. 0 43 43 58

Такім образом, набор свободных радикалов в четырех рассмотренных случаях сушэственно разный. Это позволяет изучать термореакции отдельных радикалов. Было исследовано изменение вада спектра ЭПР и концентрации радикалов при поикении температуры (рис.16-18). '

, Отеиг радикзлоз -да-сн2 для случаев, предсрзленных на рис.ІСз.б.г протекает одинаково (рис.17,а) и заканчиваются к 22СК. В присутствии В образце ацильных радикалов (рис.ІЄ.б) концентрация радикалов -мн-сн2 вначале растет и только кеэ 150К наблгадазтся ил гибель, ход которая аналогичен ходу отеига в трех других случаях (рис.17,б). Хек. видно, /:зкопдскио радикалов -нн-сн2 происходит в температурном интервала І77-150К, в котором происходит гибель ацильных радикалов (рис.17,в).

< Эхстрзпаяяция конечного участка крироя изменения кеьизнтргиии радикалоз -і.’н-сн., (рис.17,б) к начальному моменту отзкита (77-С) пока-сысаэт, что прирост хснцзнтрзша этих радикалов равен исходное концентрации ацильных радикалов. Таким образом, при увеличении температуры от 77К до 150л аиильнхо радикалы па-.ность:о преирг:я*ггся в радикалы -мн-си? в реакции .

' -г;н-сн2-ш --

Ссвпадэтп крик::; оттого радчхаюз для случа^, грим.-;.--" г.:х

но рис.16а,в,г . в которых-различна доля нефоточувствителымх радикалов (таблица 3), показывает, что они при откиго не перехода в радикалы- -мн-сн2. ' ■

На заключительном этапе отжига во всех исследованных случаях (рис.16) появляются радикалы -ж-сн-со-, имеющие дублетный спектр ЭПР с дНр''2,0 мТл. • и кривые изменения их концентрации подобны

(рис.1В,а-г). Максимальная концентрация этих радикалов растет с рос-

Рис.18. Изменение концентрации -м-і-сн-са- (а-г) и нефото-чувотвительных радикалов (д) при повышении температуры. Условия приготовления исходных образцов: а- облучение светом с х. >400нм (Юс), 0- ЗЗО-ЗЭОнм (Вмин); в- 330-.

ЗЗОнм (8мин) и затем >Ь20нм (2мин); г,д- >320нм (ЗОмин). * том доли нефоточувтвитвльных радикалов-!) исходном образце (таблица). Доля (о) исходных радикалов, превроьдогихся в радикалы -мн-сн-со-,

• приведены ниже: '

Спектр на рис.16 а б в г

О , % . 16 33 42 50

Имеет место хорошая корреляция ыоящу отжигом Ь'ефоточуептситольнг;:: радикалов и ішксилоном радикалов -ш-сн-со- (рис.18,г,;.). Все -это доказывает, что кефоточувствителыше ' радикалы, ммо;^.нз синглетш'я спектр ЭПР с дК~1,4 мТл, являются ііредшоственникауи радмслов -мі-єн--си-, имеюкж даолэтшп спектр ЭП?. Вадимо, при действии спать с > .‘•іООгім в течение 10с (рис. 16а) в образце уьв образуется н;/кииюо количество нофоточуветвитольнц:-: радикалов, котормс приводит к

образования оаднкплов.-ин-сп-са-. '

Другий свободные радикал;; і: еги/ системах на принимает аа,-.епиі'о участии в атом процессе. Ацильнііи радихчл.; распадамтс.! по іти палка-

тыа до того, как при температуре кко 13СК начинают образоваться радикалі -ин-сн-со-, Что касается радикалоз -мн-сн„; то для

псследсзанноя систем отсутствует корреляция мо:кду исходжм количества этик радикалоз в сбразиз и количеством образовавшихся радикалов -ічн-сн-со- (твблича 3).

Таким образом, аиилы.из радикали -мн-ст-са при нагрева превращается з радикалы -кн-о«. Л они, з ссою очередь, при нагрэво гибнут но пазерашзнсь в еанзтнем количества в другие/.радгкзлы. Гибель радикалов -ІІН-СЖ происходит в тем интзрпзло температур, в котором невозможна их трансляционная подвюкностъ. Такая >::о картина наблюдается в у-облу-пошаа оонораузкшх растворах шмнокисяог, где при кагрзво гибель рздчкзлез +г.н,-сн-;, снп-соо" происходит б?£ почвтноп трансформации сп?ктроз ОТІ? (Успті:Гі А.<5., Панин В.И. ,1973). Гибель радиксхов сояоока с их сблн'"0!:н°м, котсроо мо::-п:о сСъяенить слодуккз-.ч образом. При нагропа ко;і'.іпс:із рздлка.'і-; -т-сі-л , видимо, отризачт алзктрон от ~соо' групп:), протекает прекос дакербехюшреезіял и зпозь оЗрззуптси радикалі! -;-'н-сіілї :

-т-сі'ч-сг.о- і- рі т-гн- --------> сз..

іГ -И:і-С!'Ч * со„ -г гн„с-! ч-

'''.рааут’посч радикалу-^н-дн.-ч, і.ногократно участдул в атол раакчи.і, "-.тут гбл;;.'зть.ся н уступать з р^аин:1:з р.ксмбипс::.-:! Раз игмз-

уг'чуг> ии г:уа. Следует от::зт;п\ что ко код тарчорезкак;; егюёоянх:

рзаїкалсз гз пептидах будзт илиять с?ор:г:оскіЬ г^';г:;ти. Так, если хг:;узус;: радикал-им-см стабилизирован в окру:-асі" -групп г;озєгу~-ч гаитид^з, :о з 1 [актиано Судет протекать р: акапн декарбокси-.'уру'а; ?; зл.м случае гнбзль рзддкалаз -г ч-о;;-. .зуазт нрачеквть

і!є:ї "\:аг. на гуду. ІЗ ”'.уг:а' случнг: Суда? гра;:;-днотриа атома додер-'," : г~ ", -гг.\-": а сДра-гу-инан рзд^кадаз -ич-'.г.-г.у-. Урн даль' ууусм уиу'-уі'И у-'-у-рагур'.; набл-д'-зтеч у:а гибел^ а?:а: радакадоз.

Так, а а^аіаа а Г.:-;л;і пУ^адгач:! ра: зо медалыаа: си атома::.

, С.«. їермоззакпин сгсбсдгй-’Х рздикалез з балк=а:

. псслз моханическс:; деструкции при 77К.

изаастно, что длительнее махакическсз диспергирование е^лко..! при 77К или награв приводит к празросани::: перзнчнкх -радикала:; за аасрач-низ, часть из которое имеет дублотнап спектр Г:П?. Ъ ра: рабааах

(Еутпгмі П.'О. и др.,1£61,і£3}) пр'здползгзли. что зтет с:а/ла аахазд-

лежит радикалу, образующемуся в результате миграции свободной ВаЛВНТНОСТИ из карбонильную группу пептидной связи. В последующих работах (Закревский В.А. и др.,1981, ДуСинская А.М.,1382.1984) был сделан вывод, что спектр ЭПР, наблюдаемый после длительного диспергирования белков при 77К в инертной атмосфере, определяется суперпо&иииея спектров ОПР радикалов, возникающих в реакциях отрыва Н первичными радикалами. Изучение реакиии свободных радикалов в механически деструктированном при 77К ■'олиеланине позволило однозначно установить природу вторичных радикалов. В этом случае вид спектра ЭПР радикалов с неспареннкм электроном, локализованным на карбонильной группе пептидной связи или на с^-гтоме, будет отличаться. В первом случае должен наблюдаться дублет с соотношением интенсивностей компонент 1:1, во втором кваргьт с 1:3:3:1.

Ка рис.19,а приводен спсктр ЭП? полиаланина после механической деструкции при 77К, который сбуслозлен суммой равных по интегральной интенсивности спектроз радикалов -ш-снссі-ці (квинтет 1:4:6:4:1, дН'

2.2 мТл, дН^О.Э мТл) и cd-nh- (триплет 1:1:1, дНр'2,2 мТл, діу-0,75 мТл), образующихся в результате разрыза с^-с связи остова пептидной иопн. g- факторы этих радикалов также киолт близкие значения и, поэтому, компоненты триплета хорошо налладвоются на средние каотонон-TW коиитото. Кп среднюю компоненту суммарного спектра на;;о:.:ен так:;.,; сингльтнпп спектр ЭПР с д!Г0,5 мТл, природа которого не установлена, йітогралькза склад этого спектра в суммарной сооташіяот всего ~5ї.

Луш нэгпрм до ЗООЯ исходный спектр ОЛР превращается з квартетнії)і сликтр ОПТ с соотксгониом интенсивностей компонент 1:3:3:1, характерный ;;ля радикала -nh-cich.j-co- (рис.19). Образование другі-::: рад:.кале:- при этом не наблюдается. Полученный результат пскегызеет что оба оснспных радикал^ , с'разу:с::н;;ся при :.ь,;а.:ичьскои дзегр.'ки.-.;! паїиоланина при повышении температура участвует в реакиии отрыва атома водорода от с - атома пептидной цепи:. . ■

Радикалы -(.н-с<сн..)-со- в сухом полиалзнинэ исчезал" только пр.: нагревз образна до 4S0K. Радикали, кмаксие синглетный спектр ЗЛ? с йН~0.5 мТл, стабильны до 500К.

Рассмотрим темнозые реакции свобода;;-: радикалов в увлажненном фиброине селка после механической деструкции при 77К. Исходный спектр ОПР (рИС.20,77К), ОбУСЛОЗЛСПІ СУММОЙ СПСКТрСВ ЭЛР рЗДИКВЛОи -Г<г1-СНг\ и co-N-1-. При нагревании образна концентрация свободных радикалов

Рис.19. Спектр ЭПР диспергированного

77К

при 77К полиаланина ч его трансформация при нагревании образца. Температура измерения 77К.

Рис.?,0. Спектр ЭПР СнЗр'.ИИО ІІІЄЛК11 посла механичвекоп деструкции при 77К и его трансформация при нагревании образна. Температура измерения 77К.

остается постоянной вплоть до 160К (рис.21,а). Однако, ул®, начиная с» 110К, найлвдаются сильные_изменения спектра ЭПР. Исчезают компоненти исходного спохтра и, при температуре вышо 180К, формируется спектр ЭПР, основным составляющим которого яаляэтся дублэтный спектр ЭПР. Накопление, радикалов, имеющих дублетный спектр ЭПР хороао коррелирует с гибелью _ исходных ' радикалов (рис.21,б,в). Изложенные выше экспериментальные -данные, полученные при механической деструкции полиаланина, позволяют сделать заключение о том. что и в фиброина пелка первичные радикалы при помшжии температуры, реагируют с.соседними пептидными цепями с ' отрывом отома водорода от са- атома, образуя радикал типа -мн-св-со-. Форма спектра ЭПР этого радикала зависит от к, следовательно, аминокислотного состава фиброина иелка.

В фиброине шелка основными аминокислотными остатками являются глицин ('44%) и аланин ('ЗОХ). В случае глииинв мы имеем дублот (1:1), а в случае аланина (1:3:3:1). Отметим, что в работе (Усатый А.Ф., Панин В.И.,1973) приведены энергии активации реакции отрыва атома водорода от пептидных звеньев. Показано увеличение энергии активации процесса передачи атома водорода при использовании пептидов более слихного строения чем глицил-глииин. Кроме того, эти реакции являются селективными. Показано, что концовой радикал отцепляет атом водорода от того пептидного звона -ш-снв-со-, в котором аминокислотный остаток, идентичный или структурно более простой по сравнении с атакующим аминокислотным радикалом. Таким образом, вероятность отрыва атода водорода концевыми радикалами от наиболее простого глицинового звена пептидной цепи выше,чем от других. Так как в остатках глицина с^-атом с-вязвн с двумя атомами водорода, то можно полагать, что вероятность отрыва атома водорода от ного в два раза больше, чем от хкбого другого остатка.

Таким образом, соотноиеняе интенсивностей спектров радикалов глицинового ч аланинового остатков должно быть близко к 83:30._ Из этих соображений интегральнее интенсивности спектров радикалов остатка глииина, аланина и суммы остальных остатков относится как (44х2):30:26. Компоненте ду&глтного спектра в «< случае королю наїсладіБаятся на средние компоненты квартетного- спектра. .Учитывая, что линии того и другого спзктроа име'зт близкие значении ширины, и, принимая во внимание соотношение интегральных интенсивное, ей ппоктроз, мыдао считать, что г.ри стноиенич смашуд компонент кварте-

т ** і І/»

Рис.21, Изменение оСікои концентрации радикалов (а),суммарное концентрации исходных рэдикалоэ -ж-сня и со-мн- (б) и концентрации радакалов -мн-ск-со-(в)

При П0ВІЕ1ЄНИИ ТРМПЭрвТУри 3 фЯбрОИНО ШвЛКЭ поело механической деструкции при 77К. -

та 1:3:3:1, отношение компонент дублетного спектра, пходяеэго в сукмарннл споктр ОПР, должно быть близко к 12:12. Таким образом, амплитуда перэеп компоненты квартетного спектра ОПР должна бить в ~15 раз меньше, чем суммарная амплитуда второй компонента киартетно-го н компонент» дублетного спектров ЗПР. Экспериментально полу'іоннил споктр (рис.20,д) инезт отношение амплитуд перво,! и второй компонент, близкое к расчетному.

.. Итак, спектр,-регистрируемые поело нагрева исходного образна до 20СХ, опредэллетсп н&Зором рндикалоа -км-ся-со-, обусловленный шинокислотном составом фиброина солка. При 20СК контнтраиия радикалов

сс- достигает максимума (рис.21,ч) и составляет 72?, с" концентрации исходи; :х с>к<5олиых радикалов (ри.';.21,э).Сл;-дует отмотить, что г.рч. тчперзтурэ в'..".’,'о гіСК. когда исходные свободно радикалы испряли, наблюдается гибель радикалов -г-'м-г.п-са- (рис.21,б.із), так что

максимально грация этих радикалов соотиитстзувт ропноігосми

проиоссоі) их обрааоаания и гибели. Следоаатпльїіо, доля нсхсщгм радикалов, ировр»:ттахся а радикал;! -кп-сгч-со-, сусэстврнно вктд 72%. Это означает, что почти псе исходные радикали .чреррадаются при

нагрдаанпн обрагиа я радикалы типа г:г<-сс- :

-со-нн-сн;; ■> -мі-сня-со- --------- - м; 1-си_.г, + -г-ім-гя-си-

-ЫИ-СО * -ІЧН-СНЯ-СО- ------------ -ІЧН-СОН + -мн-ск—со-

Интересно отметить, что кривые отжига исходных■радикалов в водном растворе Аіаеіувіу и увлажненном фиброине шелка совпадают. Совпадают тпгаке и кривно накопления радикалов -г^н-ск-со-. Это показыват,' что для протекания реакции отрыва атома водорода от са- атомов аминокислотных остатков соседних пептидных иэпеч достаточно размораживания подвижности только концевых свободнорадикальных фрагментов макромолекул. Размеры молекул влияіот на протекание реакции гибели радикалов -ж-ся-со-. В водном растворе Аіаспувіу все эти радикалы исчезают при 230К, в то время как в фиброине шелка при 230К больше половины их стабильны. Подобные результаты били получены и для других болков. На рис.22(Аа,Ба) приведены спектры ЭПР увлажненных коллагена и кератина шерсти поело механическоП деструкции при 77К. В случае коллагена спектр ЭПР обусловлен суммой радикалов -мн-сня, сонм-, гшо, а в случае каратина -кн-енп, со-мн- и "сорных" радикалов. Как видно из рисунка, при повшонии температуры постепенно исчезают компоненты радикалов -мн-енгс, со-ын- и появляется спектр ЭПР -мн-ск-со- радикалов. В этих случаях споктры ЭПР -ын-сй-со- радикалов не разрешены, так как на их центральную часть наложены "узкнл"

синглетныл споктр вторая компонента спектра ЭПР перекисных радикалов в случае коллагена и третья компонента спектра ЭПР "серных" радикалов в случае корвтина шерсти. Накопление радикален --ічн-ск-са- хороао коррелирует с гибелью исходных радикалов (рис.23 АО,в, Бб,в). На отих рисунках (кривые "б") сделана поправка на гибель радикалов

-кн-си-со-. Кок видно, почти все первичные радикалы при нагреве, как и в случае фиброина шелка, сперва превращаются в серединные радикалы, а затем происходит чх гибель. Во всох случаях гибель первігчікх радикалов покапчиваются к 21 ОК. \

Из рис.21,?3 видно, что относительное положение кривых от;кига\u-p-вичннх и вторичных радикалов для исследованных Сзлков сохраняется. 'Гак, кривая огжд'з вторичных радикалов в фиброине шелка расположена в области Оолоэ выс.окоп температури, чем другие. Такое ко относительное расположение кривих наблкщэетсп для кривых от:«ига первичных

радикалов. '

В работах (Кякиин Л.П., Львов К.М., Пулнтова М.К.. ,1970. Ли юн К.М., Асланов Р.В., 1'амидов И.В., 1931) исследованы опконексрносгн р-|«>чйии:ш:їй гиболи свободных радикалов в г- и У-1- облучст’мих і'д'лка;:.

і

Рис.23. Из!>чшонио сотой концентрации ри;;икплои («), суммарной колиоНтрпиии радикален —: j-і - ct.it и со-імп-(О) и концентрации радикалов -.м.-ск-со- (и) up,і покі-ШОМИН їЄМП0р))Ту[:и Li KOJUfUMjiiil (А) И КОраТИНО ІІОрОІ (Б) посли МОХОІІИЧОСКОЙ дострукини при 77К.

Показано, что ход кривых отжига свободных радикалов определяется"' физическими свойствами матрицы. Из исследовании десяти различных белков кривые отжига фибриллярных белков, в частности, фиброина шел-кз, расположена в области более высокой температуры . В работе (Асланов Р.Б.,1903) приведены крише отжига свободных радикалов УФ-облучетш фиброина шелка и кератина (рис.24). Обращает на себч внимание тот факт, что относительное расположение кривих отжига свободных радикалов УФ-облучешшх фиброина шелка и кератина шерсти похожи таковыми для механически деструктированных этих белков. Отметим, что кривые отжига свободных радикалов в УФ-облученных фиброине с-'злка и кератине шерсти сильно сдвинуты в область высоких температур (рис.24). Это связано с тем, что в работе (Асланом Р.Е>., 1‘.Ш) гспо-льзеваны сухие белки. Увлажнение образпов приводит к смешению кривых отжига в область болео низких температур без изменения их характера.

■ Гнс.24. "-'ченинне сб-.еп ксчнецграпин радикалов при повы-

:-!•) тем;,епй';:'р! в УР-обллчег.^ч'Х пр;. 77К фиброин 1:'ел-<й (я) и кератиг‘.ъ '::ерс';й (б).

и юг .-•си,<у в1' есл:.му, ,и»по сделатм еыьод, ч'Ы I [[■> гд.ес: ра.здич;-е в I.р.!рг.дг, перчнчикх радика.',оч в УГ-

о.1 •;■/ ;г.> м;>: белка;;, кг.нше о;ье;'-^гД:::х и [Л(.рмчнн;; радикалов мо-хачпчески деструхгиронанных баскси т;.г■ е опреде^м сч ст.мг'.твгл’и матриц:! - уклндко.ч полипеппщни !;е||;-!'.

При (механической дем рукции белков свободою ралик.'Уы распределяются неравномерно. ФиОрИЛЛярН.Й селчн состоят из уЧОрЛДО•'ы:ны,! и

*

неупорядоченных (ачор1'ш:х) областей. Под дог.сгвие;.! кошгитеских сил и первую очередь, разрушаются емерфтю участка и, пззтому, свободна радикал.:! локализуются преи.мусественно б этих с&шстях. При болео глубокой механической д&струкшш розрушются и упорадшондао чистн вследствие чэго наблядазтея превращение упорядочен: шх частой в неупорядоченные '(ДуСинская Л.М.,1984, Кауи Г.,1331, Капало Л., Псртер Р., 1903). Таким образом, о зависимости от степени механического разрушения, свободные радикалы будут локализованы по-разному. .

Ранее Сило показано, что кинетические закономерности реакции гибели радикалов УФ- и г-облученных Сопках зависит от кост локализации радикалов. Тек, константа скорости реакции гибели радикалов, локали-. зеванных о упорядоченных областях, в нисколько раз прошлаот константу скорости роакции гибели радикалов, локализованных в неупорядочин-шг.с областях. Таким образе;.!, степень механического разрушения Селко. будот'влиять н на кинетику реакции гибели рамнхалов в них.

ССНОЗШЕ БЬШОЛИ

1. Установлено, что первичным свободнороднкальним актом мохеничо-скоп деструкции белков является раорив с£,-с связи остова пептиды:.: иопи и образование радикален -г;п-смя п со-ми-. кригичеекко пехан чоские знергии локализуется в попгидлоя сени в областях размере; >5А.

Под действием света в механически деструкгирозанндх пр-|' 77К б^.

■ ках происходят ело;'дие и мнагсетадиннио процессы, о результате ко-

тосих образуются парамзгшпние аелп’рл нескольких чипев:

а) 1'эди,<ош -ьн-енг? под донствнсм света с д>3о0 пн у..;,сгиу«г

цепных реакциях г.заямопрзьрздения с -с;м-си радилала. 1,1,

вследствие которого происходит разр^денпа поп';п,,нс/; пап.!. ;,--за

^активного обратного присоединения молекул,] и;. о:ддл;_, ..д/д.. при догораепаде тыльного радикала, к радикалу —г->■—г. ,I под света с /. ЗОО-ЗОЦдд, оатор::£Д'.’даатгдг догоразрудсдиа гюг;к,ч.Дг.о.! 1;

б) ^ханизм С'л'оооразозаьия при 7?К радикале- к,о и заключается и том, что изо радикал.; «5р»;.у.-тс~ в ранк!:",! гриссодииония атомарного водорода с молекулами ос., ко;ч;. д. оор,„.а,;-глся в фоторзакциях, а радикала н»а-л образуется 1.з рлдпк^лои .«м-п.н под действием света с л ЗЗО-ЗМнм;

о) С-оторэакния радикала со-t.it- заканчивается при парод; >;.а допспзпи

СВЗТЯ С X 33Q-390HM и в послодуюик фотсрзскииях они но участвуют.

3. Сделано заклачениэ, что пэрричнь'с; радикалы з кохаштски дестру-ктированных при 77К Солках при нагрввз вступает в рзакшп отритэ ате>;о водорода от с^-зтома ппптиднол из ли. Показано, что дм протокзния этоя гзакиич достаточно розморанжаннз подвинности только конизк.'х спобадаюрэдикаяыЕПС Срагмонтоз макромолекул. Посяздуп-wo псзстмшо тгмяоргтури приводит к гибзл» вторит» родикадсз. При этом х«л кривя omani nopcimcix и вторичных радикален о !мха-ПИЧОСКИ дзструктирспзннчх балках олрододг.этся СВОЯСТЕОМИ матриш-укладкоя полипалтидшх ugmn.

4. Устонозлоно, что имеется отрицательная коррзлпиня кезду срэдноп

конионтрапиоя вторичнях свободных рзджалоз и значением разрывного напряжения нити натурального садко. На соновз этого разработан способ контроля качества натурального палка. - '

Обобщая пслучвпига результаты кшзю заключить, что при мэхени-чосксм воздзпстсни на бзлхи в них протвкг.пт слохжз и многостади-пшз свободнорадпкодышз npouoccu, кстсрнэ сильно засисят от фэк-тсроз окружаглая сродч (сгззт, тсмпорэтура, влажность и т.д.). Это нокэт бить нспользозгно при pcsoir.in прикладных задач экологии, в

- частности, устранения разрушающих фактороз окруявмееп ерэд! на бодковьга CTpyiCTypJ.

/ Осногжз рззудьтзты диссертации опубликованы

/ ■ в едэдукгдих работах: .

li Гасымоз О.К, Коримся Т.М., Мзмвдоз Ш.В. Св<у5одныв радикалы в бзлкз фиброина г.'злкэ при ого нохэнггазскс-м разрубании - Тезисы до.члпдов‘1

I Всссе:-езкого бно^изичзского сьвзда, 1332, Москва, 7.1. с.41.

Льзсз К.М., ГаС!Д!ОЭ O.K., !.'л:етдог1 12.В., ЬЬха.чичоскэя даструкпия ( СнОромна колка при 77JC - В^сокечалск. созд.,1В31, т.23(A), К 9,

/ С.1933-1С37. ,

/з. льмч К.!;., rseii-io’j O.K., .'.‘.змздоз 3.3. Фотозогкцаи п&рдоаод ю?к-р"-радикалол при •«хзничеосся дс-струкини С-ябрм'нэ и;лка.- Елочек»-лак. со';ч., 19-3'=, т.Г.10. c.Cliii-.Mio.

.'I;-1';:! К.?!., Гаст-;-1 O.K., ;''-’эД"3 U.3., Грп::с..'ДН.-:г ниа ок>он уг'ла-. ;/л:; к оггз паг.тндах при -K-J, г '",, т.зо, :j.i, -...г' Лык-.; ”.М.. Г.-'г" :r"! O.K., 'эгс.^р^с'у.г-с: ргл-.кала

n=cm2 d пептидах при 77K. - Биофизика, 1985, т.30, в.4, с.559-563.

В. Львов К.М., Гасымов O.K., Мамедоз Ш.В. Фотообразованиэ радикалов

n-=ch2 и нсо в фиброине шелка после механической деструкции при 77К. - Биофизика, 1385, т.30, в.5, с.758-762.

7. Львов К.М., Асланов Р.Б., Гасымов O.K., Мамедоз Ш.В. Образование

n-*ch и псп радикалов в белках поело УФ-облучения. - Биофизику,

1985* т.30, в.5. с.783-767.

8. Керимов Т.М., Мамедов Ш.В., Гасимов O.K., Гумбатов К.М., Еилаллы Д.А., Эминбепли Т.Г., Алиева С.М., Грсанова Э.И. Свободные радикалы в шелке-сырце и ого механические 'вопства. - Шелк, 1985,

■):' Г,, с.20-21.

9. Керимов Т.М., Мамедов Ш.В., Гасимов O.K. Способ контроля качества натурального и:елка. - А.С. 1165354 (СССР), опубл. в БИ, 1335,К 25.

НКЛьвоз К.М., Гасимов O.K., Мамедов Ш.В.,. Асланоз Р.Б. Реакции свободных радикалов, фотопидуциросанных в»водтх растворах пептидов в присутствии феррицианида г.алия. - Биофизика, 1S3G, т.31,

В.2, с.191-194. .

И.Гасимов O.K., Львов К.М. Реакции свободных радикалов в полиаланнне и фиброина колка после механической деструкции при 77К. - Биофизика, 1933, Т.33, в.1, С.46-49.

12.Асланов Р.Б., Мамедов Ш.В., Гасимов O.K., Нуриев С.Р., Львов К.М. Кинетика гибели радикалов_а У^-сблученноч кератине шерсти. - Тоз. докл. У11 Всосааз. конференции "Магиигкия резонанс в биологии н медицине", Черноголовка, 1983, с.46-47.

13.Гасимов O.K., Мдаодоз С.С., Асланов Р.Б., Нуриев С.Р., Львов К.М.

Первичнее сеободнорадпклльние npotisccu при механической деструкции коллягена. - Ti-з. Д01^л. У11 ВсосохЗ. конфер. "Магниткин резонанс в биогэгии и кодяиилэ", Черноголовка, 1930, с.«••-ПК .

14.РЛ'Ч’ф'Ч) ?.У., ЛСбасоьа Ги:.ч:м'и O.K. Г''И'-нп', уела'-'ивп н'.

пределен:,!«! наиграй;;.! etcxje::.:.v: рщ.пиалов, i.'a::r.ne- i,

У-г-инд^цирован;;.;:: li фнерпллгр: ir: бел. а::. - ioe. до;'.. У11

коп', ер. ”i :::гн::тн:;и резе:. ;::с с о;-:о.г,ог':г' и не,';.,:.1;-.:-", Чири д . ,

19\’j, с.Ь2-;.3.

js.l'uci.-'ou O.K., Асланов Р.Б. , Нуриев С.Р., Манедов

CwSiOTopiysJiKwu.ir.Ju процесс-; при механической даструкипп i.ep 'T.'-:.: и коллагена. йлоксгслс. с сод. , 1SC3, т.31 (Б>, ::3, с. 597

Ю.Гссккоз O.K., Асланов Р.Б., Нуриев C.I., Ь.<::адев 11.i). Зотереа::;.:.;..

трупнім рідас.гяот при мзтгпютюскол дострукшш «мяшвп. - ДЛЯ Леєр'., сзр.^зз.-мзт., 1301, п поч. ' • ■ •

17.Гг»с"мез О.ІС., Лі "оз ІС.И., ї*знздта II.В. Сзобод!:сррл!каг.ьге:о розісизн г;р:і усхпничсгїссп ^оструїсинм ^іЗр-.іл.'ггрілк Crvr^cn. - іу.іссхс.оу.с-.:. спд., 1992, 7.91(A), 93, 0.3-1G.

0"Vnov П.К.. M^n.'?dDV 3 ‘і. V. , L' ■ :v К.М. Гг^^-г "ГІ: I nr^rf. 'in

г-^с h-'ni cn 1 cJc.1 n trLC tic.i of .’retain:-. - roly^zr Гсі'-'П-з U'C'P, l'V?2« v.3'1, Г43, p,176-204. /.

П.Г."С” :n O.K. v. •r^i'TDCKC'’ .С’струлпзч ґ?.~:сп при 7?::. - ІТргуїшт,

"тку, 1992, 17о.

19.Гісг"ст O.K. ;огсгі!'',.ин:і пгр^гкпк p:w'3Jlc"! з !:::гг:-:г:оск:і

гостру'гппоті і'-у п;„( 77К С-ггот: - Препринт, 1992, ССо.

Г0.Гпс,"!',з 0.:;., Льз'їз ІГ.М. •• С :сс;с;.і

прсіпсс!! гри ."плгі;:гт:с:ссп ?,г,сгру;сцит.і Солкоз и лапипептиісз.- їрс:<с"і

11 Тур5іі<о-Л" р'Зяпдззі'сзгго сі’мп'тгт:!.': по по.'! vrp.-”, Лі-.—'"},

А 992, с.193.

ПІ.Гї'"- ';з 0.?., Г.у- 'сч 0.;'.., Лг.':"::гз Р.9. 9?рзср::.::;з:';! сзгґо';";-';

г-г--=..........з н.'\‘............: (:"р:;:і

■"'тс гм, ко.’’-"' ':) і r :<j ;py :;p;i 7V". - Jo-vc!

Ч 9/p:':' о- "'■r-.^r.T'r; сз-тсзз;":.': по п?з: 'Г'ргм, Лзз^р),

;19п9, с.151.

г V- 'Г,'П. , ,r:v П.‘С., Г - 1і R.Jj., 'Т\-; / f'h.7, :иг І

•r "is от 1. h. '•? fr—? гг fic.’l” I r* tb-л заспзі irr. (.г"'. :1c-';Ln.iCt.r:;i

t.hc? с t.i т of r r. ica 1 r.‘ tpg'. 'j r of t іc: Ь'з troc t:s

^ пГ * f:-:? з п^сгіїл t ^ гп--’. 1 гспТ'ГГ^пп!’ clcnrr* n itrr і л I r; ~.nd с'.гтас *.1 ’ '

*• г п -nrmtv'V — г ' г г- и гr:, C’.V'u, 1977', р."'*. „

'..j.M-'-'-’-tv STh.V,., г ’«-.уг-т/ О.К*. !гг г;ігі і с<ч 1 ргг?" г -s ::n "„гзіігі ггез-f • ■ ’ n . < * nrJ ■■ 5 *:» . \ ел 1 гзг”:‘г: t.u г *», Г'г* jV і ч t и f tin? jbjtr:ctu of tf»»

in'-'T'ntir-nii r • -і {■" r -re'* ’.і-п'ї*? і у--г- і ] г-. , -r5 г. г а і ^глггЛог- *

МП'-» -гч-мл-о, Г' 'Ьі, , о.?7.