Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободное железо и его стабилизирующее влияние на оксид азота в биосистемах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Свободное железо и его стабилизирующее влияние на оксид азота в биосистемах"

РГВ ид

г:-. Г"

' !

министерство образования азербайджанской республики

бакиискии государственный университет им. Л1. Э. расулзаде

На правах рукописи .УДК 158.577, 547.965.541.63,541.124

О

ИЕВ ДЖАВАНШИР ИСМЕТ оглы

СВОБОД^ ЖЕЛЕЗО И ЕГО СТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ОКСИД АЗОТА В БИОСИСТЕМАХ

03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

б а к у —

1 994

1

Работа выполнена в Бакинском Государственном университете

Научные консультанты:

— доктор биологических наук, профессор, действительный член Ныо-йоркской Академии Наук А. Ф. ВАНИН

— доктор физико-математических наук, профессор

Р. И. ХАЛИЛОВ

Официальные /оппоненты:

— доктор биологических наук 3. К- АВИЛОВ

— доктор биологических наук Н. М. МАГОМЕДОВ

— доктор физико-математических наук, профессор

Э. К. РУУГЕ

Ведущая организация — Институт физико-химической медицины Минздрава РФ

Защита состоится ж.»... ..мШйш/.............. 1994 года в

«.../?/.'>> часов на заседании разового Специализированного совета Б'/Д 054. 03.05 по зашиге диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Бакинском Го-судаоственном университете по адресу: 370148, Баку ул. 3. 'Халилова 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бакинского Государственного университета.

Автореферат разослан «..^А...» .... .........1994 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук,

доцент АБДУЛЛАЕВ X. Д.

ОБЩАЯ ХШКТЕРйдТИКА,. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время установлено, что активация различными нитро- и нитрозосоединенияки одного из юш-чевых регуляторшх внутриклеточных ферментов гуанилатциглазы .обусловлена обилм метаболитом - оксидом азота (N0) .который эти соединения могут продуцировать в бесклеточкых препаратах /Игнар-ро с соавт.,1981,Мурад с соавт;,1978/.

Ранее считалось, что оксид азота возникает в тканях только из экзогенных соединений /Ванин,1984/. Однако, не так давно было показано, что Ш продуцируется в ходе некоторых метаболических процессов из эндогенных предшественников. Одни;.! аз них может быть аминокислота аргинин, окисление аминогруппы которой с последующим отрывом и может приводить к образованию в организме оксида азота /Гиббс,19В6,Монкада с ссавт.,1937/.

Оксид азота в тканях но мо-ет существовать длительное время з свободной виде лрезде всего из-за атаки на него различных реагентов - в первую очередь активных форм кислорода.. Поэтому ватное значение имеют агенты, способные эффективно стабилизировать и связывать КО,.предотвращая его тем самим от всевозможных превращений.

Известно, что железо и оксид азота образуют в тканях вместе с тиояовыми грушами белков данатрозильние комплекс«, характеризующиеся сигналом ЭПР с БСр~2,03. Впервые такие комплексы, названные в соответствии со средним значением е-фактора сигнала ЭПР, которым они характеризуются, комплексами 2,03, были обнаружены и изучены в тканях животных Ванияш А.Ф. и сотрудникам его группы.

Б-этой связи возникает необходимость детального изучения комплексов 2,03 в биообъектах. Мы начали такие исследования в 1978-79 гг. До появления нашей работа не было известно могут ли железо п оксид азота в тканях .образовывать комплексы с другима анионными лигаядами, природа которых отличается .от тиоловых. О возможности возникновения таких' комплексов могли свидетельство -вать, например, результаты работ Рича с соавг./1970/, обнаруживших в биообъектах високос пиковые (ВС) нитрозильнне комплексы железа. Ясио, что если железо 2 оксид азота могли бы наряду с комплексами 2,03 включаться я в комплексы о другими анионными лиганда-ми , то причлось бы по-новому пересмотреть предложенные к настоящему временя механизмы образования комплексов 2,03 и количественные ошшки компонентов этих комплексов - хелеза и оксида азота в

тканях. Таким образом исследование комплексов 2,03 может дать сведения о взаимоогдалении и некоторых сторонах метаболизма компонентов этих комплексов железа и оксида азота в тканях. Исходя из вышеизложенного, целью работы явилось:

- изучение взаимоотношения железа и оксида азота в различных био-'логических системах - тканях животных,листьях высших растений и бактериях;

- выявление возможности образования в биообъектах комплексов железа и оксида азота с различными анионными лигавдаш, отличными от тиоловых;

- исследование возможности продукции НО из экзогенных источников оксида азота - нитропруссида и нитроглицерина в водных растворах и тгаяях животных.

Достижение указанной цели составило,основу развиваемого в работе научного направления, связанного ,с исследованием проблемы стабилизации железом универсального регулятора внутриклеточного метаболизма - оксида азота в биологических системах. Основные положения, выносимые на защиту;

1.Свободное железо связывает оксид азота только посредством включения в комплексы 2,03 с столовыми грушами белков. В биообъектах отсутствуют эндогенные лигавды , отличные от тиоловых .способные образовывать комплексы с железом и оксидом азота.

2.Тиолсодеркащие соединения и ионы железа влияют на распад нитропруссида и нитроглицерина, в результате этого усиливается выход по из растворов этих соединений.

3.В листьях высших растений и бактериях имеется свободное железо, детектируемое с помощью метода &ПР по включению в да- или К'ононитрозильные комплексы о различными лигавдамя.

4.Методика определения количественного содержания оксида азота, образующегося в табачном дыме.

Н\учная новизна. Предложена концепция о стабилизирующей роли иегемового железа в функционировании оксида азота в клетках и тканях.

Зперп«,в установлено, что комплексы 2,03, являющиеся едийствен-К!Л'и,' которые образуют железо и оксид азота представляют собой оптимальную -Тзорму хранения во в клетках.

Показано, что в листьях высших растений и бактериях имеется свободное железо, количество которого составляет 4-5 мкг/г влажной

ткани и 5-10 мкг/r влатаих клеток.

Впервые установлено, что ионы нитропруссида в тканевых препаратах подвергаются восстановительному распад/ с образованием групп Fe - NO, которые включаются с тиоловими группами белков в комплексы 2,03. Показано, что восстановители и тиолсодержащие соединения оказывают воздействие на продукция ко из растворов нитропруссида (Ш1) и нитроглицерина <НГ). При распаде НП и НГ в присутствии лигаядов свободный оксид азота, оставаясь в растворе, образует комплексы 2,03.

Обнаружено, что внутриклеточная среда влияет на структуру комплексов 2,03, возннкающяхт vivo в печена животных. Таким образом биологически активное соединение оксид азота мокет присутствовать внутри клеток, подцерживаясь на-стационарном уровне.

Разработана методика для количественного определения но .образующегося при сгорании табака. Установлено, что в табачном дане, образующемся при сгорании одной сигареты, содержится lO"f,M Ж).

Практическая ценность работы, Обнаруженная нагла способность раствора ЭДТА извлекать железо из жедезодепонирующих систем может быть использована для оценки с помощью метода сПР негемового ке-леза в биологических объектах. Наша данные свидетельствуют, что липосомн, нагруженные нигропруссидом мокно использовать в качестве метки, позволяющей судить как об интактности их в крови, так к распределении липосом в тканях животных in vivo . Полученные данные о наличии свободного железа в высших растениях и бактериях имеют ваяное значение при изучения метаболизма мелеза в этих биообъекта х. Результаты экспериментов по исследованию высвобождения Ш из рзствороЕ НП н ЯГ могут найти применение при изучения фармакологического действия указанных кардиотерапевтических средств. Данные о внутриклеточной локализации комплексов 2,03 могут быть полезны при количественной оценке й исследовании превращений N0 в тканях.

Методика количественного определения оксзда азота в табачном дыне может найти вржленеиив при создании сигаретных фильтров, улавливающих физиологически активное соединенно - ЯО .образующийся при сгорании табака и предотвращающие его попадание в организм курящего.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биология и медицине"

(Москва, 1981} ; 1-ом советско-индийском симпозиума "Спектроскопия магнитного резонанса неорганических материалов" (Душанбе, 1982); 1 Всесоюзном биофизическом съезде ( Москва, 1982); 17 Международном симпозиуме "Регуляция метаболизма в растениях"(Варка, Болгария, 1985); Конференция молодых ученых Академик наук Азерб. ССР С Баку, 1987); 11 республиканской конференции ученых-химиков (Баку, 198^ ; У республиканской межвузовской конференции по физике (Баку, 1992); Республиканской научной конференции "Физика-1993" ( Баку,1993) и 11 Международном симпозиуме "Энергия,экология, экономика" ( Баку, 1993), а также включены в материалы 1 Международного симпозиума "Минеральное питание и фотосинтез" ( Варна .Болгария , 1987); 3-го Международного конгресса "Гормоны и рак" (Гамбург,ФРГ, 1987); 71-го конгресса Федерация европейского общества исследоватаяей растений ( Сплит,Югославия, 1988); 5-го симпозиума "Спектроскопия ЭПР 2 баохиши,[.вдекуллрно$ биологии"-( Прага,Чехословакия, 1983); 9-ой международной конференции "Болки в транспорте 2 накоплении железа" ( Брисбац,Австралия, 1985); 19 заседании Федерация европейских биохиетлестах обществ ( Ри;;,,Италия, 1989) и Международной конференции по гемохроматозису и клиническим проблемам метаболизма железа( Тель-Авив,Израиль, 1993).

Публикаций. Основные результаты диссертационной работы отражены в 44 научных трудах, в том число а 18 статьях, опубликованных в республиканских и зарубежных изданиях.

Объем и стогктура таботн. Диссертационная работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы и 67 рисунков; состоит из введения;, шести глав,выводов и списка цитируемой литература, состоящего из 215 изиконозокяй.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМП/ШСОВ 2,03 И ИХ КОМПОНЕНТОВ - СВОБОДНОГО 2ЕЯБЗА И ОКСИДА АЗОТА В БИООБЪЕКТАХ ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .

Глава состоит из семя разделов. В них приводится анализ работ, посвяшеяннх исследованию железа в организме человека и животных. Рассмотрены данные. о строении и функциях железодепонируюцих систем тканей - ферритвна и гемоендерина и происхождении слабосвязанного железа негемовой природы или свободного железа, входящего в состав биологических объектов. Показано, что хотя и существование этой форели келеза в тканях признается большинством исследователей, в настоящее время пет единого мнения о происхождении

\

и функциях его в организма человека л живо тени. Подробно проанализированы результаты исследований, в которых изложены основные этапы изучения природы и идентификации компонентов комплексов 2,03 и рассмотрены механизмы образования'этих комплексов в тканях животных. Рассмотрены также современнее данные о электронной и пространственной структуре комплексов 2,03 и динитрозильннх комплексов закисного келеза с цистеином, моделирующих комплексы 2,03 в биологических объектах.

Приведен обзор литературных данных о биологической роли оксида азота и условиях его образования в организме.Интерес к исследованию НО резко усилился в 70-а года после того,как было установлено, что нуклеофнлыше агенты - азид.гадроксиламин.^еяил-нидрозин, а тают различные нитроэосоедшения - нктропруссид С НП) нитроглицерин ( НГ), производные нитрозогуанидина и //-ннтрозоами-нов являются мощными активаторами одного из ключевых внутриклеточных ферментов - гуаяилатциклазы ( Щ). Бш.о показало, что такая способность к активации ГЦ была обусловлена возможностью этих соединений продуцяровать в тканевых препаратах оксид азота. Рассмотрены данные о высокоспиновых (ВС) нлтрозилышх комплексах железа, которые были обнаружены в растительных и бактериальных препаратах, обработанных оксидом азота, приведены данные о сигналах ЗПР этих комплексов и их предполагаемой электронной структуре. Рассмотрены виещяеоя в литературе сведения о мононитрозпль-ных комплексах закисного железа с различными анионными лигандаш. Приведены характеристики сигналов ЭПР этих комплексов и данные о их электронной, и пространственной структуре.

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

1;'итрознлыше комплексы закисного железа с <|ос£атом,цитратом, аскорбатом,восстановленным гдютатионом,водой,этилендиамннтетрааце-татом (ЭДТА),гастядиновшш остатка.® сывороточного альбумина человека (САЧ), различными а»га но кя слотакя синтезировали следующим образом. 2 мл дистилированной воды продували предварительно в течение 5-.10 минут аргоном и добавляли 5-Ю"3 М Гв304 х ^О. Затем в раствор вводили один из перечисленных выю лигандовь отношение ко- ' личества лигавда и железа Ге2+ составляло 30-50, а для аминокислот Ь / ¥е?л - ЮО-ЯОО . Для образования нитрозильных комплексов полученный раствор обрабатывали газообразным1оксидом азота из установки, собранной наг® и позволяющей вводитыю в реакционную

смесь при строго определенном давлении.

Нитрозильные комплекса железа в тканях животных in vit-co получали, обрабатывая предварительно перфузированнке физиологическим раствором ткани животных газообразным ко или раствором нитрита натрия ( ЯаК02) . Образование комплексов 2,03 in vivo в печени животных инициировали по методике Варича ( 1982) введением в их питьевой рацион нитратного комплекса железа я нитрита натрия, а также внутрибрвшиннкм введением "готовых" низкоыолекуляр-ных нитрозильних комплексов с различны!® анионными лигандами. Для количественного выражения различий форм сигнала 2,03 мы вводим параметры формы указанного сигнала - отношение компонентов сигнала 2,03 А,В,С и Д А/В, А/С, В/С, С/Д , ширине компонент А и Б на их полувысотн - л Hj, и д Hg и расстоянияш между максимумами В и С ¿Hg . А и В лй ,

В экспериментах по исследованию превращений, которым подвергается нятропруссяд в тканевых препаратах мы использовали изотоп : , имеющий магнитное ядро 1=1/2. Включение этого ядра в ко.лплетск 2,03 приводило к появлении неразрешенной сверхтонкой структуры (СТО) в сигнале 2,03. Параметр ширина компонен-

ты сигнала 2,03 при на ее полувнсоте был использован.. для оценки процентного содержания изотопа в комплексах 2,03. Величина параметра 5" при содержании s комплексах 2,03 только изо-тспа ÍV5 составляла 1Б Э. При включении в комплексы 2,03 наряду с изотопом Ге56 изотопа величина начинала ув&тачиваться пропорционально содержании в этих комплексах изотопа Го®7 к становилась равной 22 Э при включении в комплексы 2,03 только изотопа Fe57.

Лйпосош, нагруконные нитропруссидом, приготовляли по методу, ош;ашому Шабарчиной М.Н. (1331).

Оценку содержания свободного железа в листьях выспгах растений - листьях табака типа "Самсун", бобои "Vicia faba »китайской розы, виноградной лозы и бактериях -Eaherlca Coli C6CC,Renobaotür veculatuia ¡¡T^OO.MethylfcaoteriUia oreahcpbilua KP2Û0 .Canlooacter 0105 производили, основываясь на его способности включаться в комплексы 2,03. Их образование инициировали двумя способами или обработкой этих объектов газообразным но, ила ке введением в их гомогенат вля суйпеизию низкомолекулярных динитрозильных комйлокоов кблоза с фосг|атсм в дозе 5~10~7 М/г влажной гкдни.

Сашпролзволышй выход газообразного оксида азота из раство-"ров питропруссида я нитроглицерина в 0,05 М фосфатном буфере конт- , ролировали по его вкючени» в МН комплексы железа с ДЗЗК и по изотопному обмену в этих комплексах Н15 на' н14

Количественное содержание оксида азота, образующегося при сгорании одной сигареты определяли путем пропускания дыма через водный раствор железа о тиосульфатом или Д31К б дмлетилсульгтюкси-'мо(дасО). Оксид азота, содержащийся в табачном доме, при прохок-дении через эти раствори включался в ДН комплексы железа с тиосульфатом или Ш комплексы железа о ДЭ1К.

Количество комплексов 2,03, а тем самым и количество включившегося в них свободного железа я оксида азота, оценивали по интегральной интенсивности сигнала ЗПР этих комплексов.

Спектры ЗПР регистрировали на радиоспектрометрах 3х- сантиметрового диапазона "Рубин", "Рг-гЗСб", "ЭИР-2ИХФ", "ЭПР-В" "Брукер" с компьютером той же фирш при температуре от 290 до 10 К. Некоторые измерения проводили па радиоспектрометре "Вариан-Е 401" 8-ми миллиметрового диапазона.

ШВА 3. КСМПШШ 2,03 В ТШ1ЯХ 11Ш0ТШХ. 3.1» комплексы 2.03 - единственные представители динит-розчльннх комплстоов яелзза, образующихся в тканях животных.

Даяний раздел посвящен изучению возможности образования в тканях животных низкоыгановых динитрозилышх комплексов негемового келеза, отлкчаюздхся от комплексов 2,03 природой своего таолового лиганда. Предполагалось, что если в тканях животных могли бы возникать такие комплексы, то их сигнал ЗПР, характеризующийся по литературный даягшм в 0~ 2,03-2,04 »должен искажать форму сигнала 2,03. В результате этого сигнал ЭПР будет несколько отличаться от сигнала 2,03 замороженного раствора дикитрозильного комплекса закионого железа с пиететом, рассматривающегося в качестве соединения, моделирующего комплексы 2,03,возникающие в тканях животных, в таком направлении анализа Лорки овгнала 2,03 до сих пор не проводилось. О возможности образования в биологических объектах динятрозильнух комплексов нагеювого железа, отличных от кошлеясов 2,03 природой своего таолового дагацда,могли свидетельствовать результата работ Тарасовой о ссавторами(1980), обнаруживших, что болгяая часть нега-мового аелеза в тканях не кмеот доступа к аз'-содеркатя?« лигап-дам. По этой причине можно было бы предположить, что это» калезо

могло образовывать такие комплексы в тканях при наличии в них но

Наш была изучена форма сигнала 2,03, регистрирующегося в печени мышей и крыс ta vivo. Было показано, что форма этого сигнала несколько отличалась от Форш сигнала Э11Р модельного соединения, что не наблюдалось ранее для сигналов 2П? комплексов 2,03, образующихся la vivo в печени кролика и в дролжах( Ванин с соавторами, 1967 ). Речь вдет о сдвиг© центра сигнала, а также об изменении соотноления амплитуд компонент гри и g1(,a также соотношении центральной компоненты и компоненты при z¡, ( рис.-î ),

Обнаруженное narra различие формы, как уже отмечалось вше, могло быть связано с яалояеняем на сигнал 2,03 сигнала ЭПР другого парамагнитного центра ( ПЦ ), для которого характерно ЭПР-пог-лощение в той ко области значений g-фактора, что и для сигнала 2,03. Такими Щ могли бы быть нитрозильные комплексы железа с различными анионными лигавдами - аминокислотами, фосфатами органической и неорганической природа, карбоковши кислотами и бедками, содержащими остатки гистидияа, а также шттрозильные комплексы гемопротеинов. Эти комплексы в принципа могли бы возникать в тканях животных при наличии в них оксида азота.

Суммирование сигналов ЭПР каждого из перечисленных визе комплексов и сигнала 2,03 модельного соединения показало, что "специфику" сигнала 2,03 в печени мышей и крыс нельзя объяснить наложение!,i на этот сигнал ЭПР какого-либо яитрознлызого комплекса неге-мового лалеза, отличающегося от комплексов 2,03 природой своего тиолового ляганда. Этот вывод был подтвержден также к при исследования форш сигнала 2,03, регистрирующегося в печени кшсей in vivo при 290 К.Гшрение сигнала, обусловленное анизотропией g -фактора сохранялось, но при этом не наблюдалось "узкого" сигнала 2,03 с дН = 7-10 Э В центром поглощенкя при g~2,03, за который ответственны нитрозильные комплексы железа с лигаядакя небелковой природа. Таким образом.результаты наших исследовагай свидетельствуют об отсутствии в тканях нитрозильных .комплексов железа с низкомоле-куллряымп лигаидами нетиоловой природы.

Мы предполагали, что если сигнал 2,03, регистрирующийся в печени мышей tu vivo представляет собой сушу нескольких сигналов ЭПГ, то они по-разному должны насыщаться СВЧ-мощностыз, Эксперименты во изучении зависимости Формы втого сигнала от уровня СВЧ-мощ-носта в резонаторе спектрометра ЭПР, а также вычитание о помоцьв

6 = 2,037

2,012

Рис. I Сигналы 2,03 (а,г>-да кошлекса железо с цис-теином, (б,в) - печени >.<и-шей in vivaPerHcxpfii^iH при 77 К, (а,б) - на радио-спектроматре ШР-ЗШ (л-даацезон ), (в,г) - на радиоспектрометра "Баради-Б401"( Q -диапазон).

компьютера из зарегистрированного на радиоспектрометре "Брукер" сигнала 2,03 в печени мыией1п vivo сигнала 2,03 модельного соединения показали, что в тканях животных на имеется ПЦ, сигнал ЭПР которого, накладываяоь на сигнал 2,03,мог бы искажать его форму.

При регистрации сигнала 2,03 в печени шгаюЯ ia vivo на радиоспектрометре 8-ми миллиметрового диапазона был зарегистрирован сигнал с тремя главными значениями s -фактора: gj=2,037, gg-~2,029, Бз=2,012, характерный для ПЦ о ромбической симметрией. Форма указанного сигнала но изменялась при изменении уровня СВЧ-мощности в резонаторе спектрометра с 5 до 50 мвт. Тепловая обработка этого препарата приводила к исчезновении центральной компоненты сигнала, я форг/л его сигнала ЗПР становилась идентично'* форме сигнала 2,03 модельного соединения ( рас.1) зарбгестрйроБаЕного на том спектрометре. Следовательно, сигнал 2,03 о ромбической симметрией Tárate был о.';оловлен железосодержащими комплексуй, вкличаюдами в себя no йтиоловно грутм белков. Таким образом результата па-

ашх экспериментов свидетельствуют, что в тканях отсутствуют лигая-ды, способные образовывать с негемовым железом я оксидом азота нитрозильнне комплексы и возникающие i» vivo комплексы 2,03 являются единственными представителями ндзкоспиновнх юатрозилышх комплексов пегемового железа е ткаляхГ

3,2. Воздействие рюгтшкяаточной отадн на структуру образующихся в тканях вяводгнкх комплексов 2.03.

В раздело рассмотрены причины появления в печени животных сигнала ЭПР комплексов 2,03, имеющего ромбическую симметрию тензора е,-фактора. Наш показано, что после введения в гомогенат • печени мышей динитрозильного (ДН) комплекса железа с фосфатом в ней возникали комплексы 2,03, сигнал ЭПР которых имел ромбическую симметрию тензора с-фактора и был близок по форме, к сигналу 2,03, регистрирующемуся в тканях .¿a vivo . Аналогичный сигнач наблюдался и в целой печени яивотшх, обработанной в течение 15 -минут газообразным оксидом азота код давлением 250-300 мм.рт.ст. 3 перфу-зкрованной 10 ия водного раствора ДН комплексов железа с фосфатом целой печени, предварительно освобожденной от крови, регистрировался сигнал 2,03, который по 'форме совпадал с сигналом 31IP модельного соедянеиш, т*о. характеризовался аксиально-сдаааетрнчшш тензором е-фактора С риз.2). Это нам позволило предположить, что во внутриклеточной ораде печени имеются пизкомолекулярныо соединения, которые могут оказывать воздействие на структуру образующихся в ней комплексов 2,03. Указанное предположение наягло свое подтверждение в экспериментах по "ди&изу" плазмы крови протаг гомо-r-енатз печени мнией, Этн рлзкоглояекулярные соединения переходили t> плазму крови к "трансформировали'' комплексы 2,03, образующиеся в кей(рнс.З),

Полученные результаты позволили иш ратать вопрос о месте локализация комплексов 2,03, возникающих в тканях ответных в уоловк-ях iu vivo . Через 30-40 минут коале внутрябршпчного введения животным ДН комплексов железа о оиладыми лагаидами - тяооульфатом, восстановлениям глютатиоирм, даотеином в печени аоаиамш комплексы 2,03, характврйаущиооя ромбической окшатриеа тензора g-фак-тора,'а пооле введения ДН комплексов железа со слабыми лигандами-фосфатом и гидроксилом - амиашю-оимметричным тензором g-факто-ра„ Инкубация орозоь печени, в которых регистрировался сигнал ЭПР комплексов 2,03 0,02 И водным раствором феррициаивда калия, при-

Рис. 2 Фогига сигналов 2,03, I возншсашях: < б)- в гомогена-то почеки шеей после введения в него ДН комплекса яело-за с фосфатом/ е )- целой печени, обработавшей газсобраэ- . ннмНО^ р)- пвчепл шздва.иер-фузпхювааной водным раствором ДН комплекса нелвза с фосфатом; (а)'- сигнал 2,03 ыодедьао-г го соединения,; Ь»77К, •

Рис. 3 Форвд сигналов 2,03,ре-, гистрируквшхея а гоыогеяаге дачам мышей после введения в него ДН комплекса железа о фосфатоц( а), в плазме крови после введения ¿Я кошшэксоЬ железа с фосфатом ( б ), в ир9йа£»1э ( б ) , дийлабсваняоц против гокогенета пачази ( а ) ; А препарате ( в .),даалазоЕаннои про-®ав физр®отвор«с г ). Т«?7К.

водила к тому, что интенсивность сигнала 2,03 с аксиально-евы-метрмчнкм тензором б-фактора снижалась более чем на порядок, а с ромбической симметрией - в 2-3 раза. Этот 5акт позволяет предположить, что окислитель - феррицаанид при контакте с комплексами 2,03 окислял те из них, которые локализовались на поверхности меток. Комплексы 2,03, локализованные внутри клеток,были недоступны воздействия ионов йеррнвданида. Исходя из изложенного вше, нами сделан внеод о том, что комплексы 2,03, возникающее в печени мышей после введения ДН комплексов железа с сильными лигаццами локализуются внутри клеток, а комплексы 2,03, образующиеся после введения ДН комплексов 90 слабыми ллгандами, локализуются на поверхности клеток - клеточной мембране. Таким образом, комплексы 2,03 могут локализоваться во внутриклеточной срэде печени и оксид азота может существовать внутри клеток.

В заключении данного раздела приведены результаты" расчетов методами теоретического конформационкого анализа и квантовой хидаи ковариационных и электронных аспектов стабилизации модального соединения - ДН комплекса заетсного железа с плетенном, находящихся вне возможностей метода ЗПР. Показано, что наличие молекул растворителя воды является фактором, стабилиздруивим электронную структуру ДН комплекса закисного иеяеза с плетейном' и оп представляет собой иестикоординированннй комплекс со структурой искаг.етга-го октаэдра.

3.3. Виоэкосттновно мононитгозильнц? .коуяиексн железа о различии,1ж анаонзши яигандамя.

Раздел посвящен изучение вопроса о возможности образования в тканях животных ВО нлтрозвлънше комплексов негеыового железа с ля-гандадп вндогечного происхождения.

Наши эксперименты показали, что сигналы ЭПР ЕС гштрозильных комплексов железа, аналогичные обнаруженный рдчем с соавторами (1978) при гелиевых температурах, можно зарегистрировать и при 77 й. Единственной их отличие от сигналов,,зарегистрированная американскими исследователями, оостояло в отсутствии расщепления компоненты при Яоэтому дальнейшее исследование ВО штрозильных ■ комплексов мы проводили, регистрируя их сигналы ЭПР а основном при 5>тоЯ температуре. Установлено, что ВО состояния электронный спин в "3/2 наблюдаются для нитроз агенда комплексов железа с такими ли-паздаии, как (Тоофат, датрат, аокорбат & Н20. При этом форма оягяа-

ла ЭЛР ВС натрозлльных комплексов жзлеза с перечисленными выше ли ганда!® не изменялась п при более кчзгах .температурах регист- . рация указанных комплексов, то есть в отличие от ГС нитрозилышх комплексов Fe^+ с ЗДТА, ВС? нитрозалънне комплекс« яелэза с тос,fa-том, аскорбатом, цитратом и водо^ характеризовались только аксиальным тензором 6 -фактора с ех=4,0 и е =2,0. Шесте с сигналами ЗПР ВО нитрозилъяых комплексов железа с перечисленными вше ллгайдзги в спектрах регистрировались такие НС формы этих комплексов. Нитрозильные комплексы с ЭДТЛ и цастеаном находятся только в ВС и НС ¡юрках соответственно. ЗДТА оказался наиболее эффективным лигандом, который образовывал с железа/; ВО нитрозильше комплексы. Опыты, проведенные нами, таким образам, показали, что железо может включаться в ЕС нятрозяльнне комшгексы не только с ЭДТЛ, но и с фосфатом, аскорс'атом, цитратом а бодой. Поэтому, если железо находилось бн в тканях внутри замкнутых мембранных структур в дгухвалентном состоянии, оно должно было бы образовать ВС шт-розильные комплексы, детектируемое с помощью метода SUP. Одпрхо, кам не удалось обнаружить такие комплексы даае при регастрз-цин спектров ЗПР при .10-12 К. Поэтому можно предполог.т, что свободное железо находится в мембранных структурах в тядрооласиой трехвалентной -|орме, на способно^ образовывать ВС нитрозильних комплексов. Свободное гедезо образовывало ВС нитрозидыше комплак-си только послэ введения в препарата печет ЭДТА. Без тепловой обработки в ВС нятрозяльше комплексы с ЗДТА включалось 1,5-2 ыкг квлезя т.е. то количество свободного железа, которое включалось в комплексы 2,03 в отсутствие ЭДТА . Количество железа, образующего FC комплексы увеличивалось до 4-6 мкг посла тепловой обработки препаратов печени, приводящей я высвобождению негемового железа из мембранных структур п рН используемого раствора ЭДТА, равном 7,3-7,5. Пониженно рП раствора ЭДТА до значений, равных 7-6,5 приводило к резкому увеличению количества ВО комплексов, регистрирующихся в препарате печени, достигая максима при pll 6,5. В этом случае в комплексы Го'^-ЗДТА-51 0 включалось до 70 мкг железа на грамм влажной ткани, что соответствовало количеству железа, находящегося в железодепопирувадах Системах ткани - ферритине и гемоси-дернне.

Обн&руаенная нами способность ЗДТА извлекать авлезо из желе-эодепонвруших систем vio:sqt бить иополшшана.для oaeffiW с ломо-

щью метода ЭПР негемового железа в биологических объектах.

Все приведенные выше эксперименты, таким образом, свидетельствуют о том, что в тканях животных отсутствуют лиганды эндогенного происхождения, которые могут образовывать с негемовкм железом и оксидом азота ВС комплексы. По этой причине в тканях возникают только комплексы 2,03.

ГЛАВА 4. ПРОДШЩ _ЖПЭДА АЗОТА ИЗ НИТРОПРУССМА И даТР0ГЛШЕг№1А.

4.1. Реакция ионов нитропруссида с тканевыми препаратами.

Сосудорасширяющее действие таких известных кардиотерапевти-ческих средств, как нитроглицерин и нитропруссид связано с их способностью продуцировать N0 , который активирует в стенках кровеносных сосудов растворимую форму гуанилатциклаз^Клещев,1986; Мурад с соавторами,1978). НП при воосгановлении в зависимости от pH раствора образует две парамагнитные форты(Бурбаев,1971; Ван Воорсг,Хеммерих,1966), Первая возникает при pli7 и характеризуется сигналом ЭПР с е=2,031 и е(( =2,005 и триплетной СТО (сигнал 1 нп>.Вторая парамагнитная форма возникает при одиоэлектронном восстановлении Iffl в щелочных средах. Она характеризуется сигналом ЭПР с 6^=2,0 и б(| =1,92 ( сигнал 2 НП X Бурбаевым(1971) показано, что НП, восстановленный в кислой среде, неустойчив и распадается с высвобождением железа и НО .которые могут образовывать с различными анионными лигандами НС нитрозилыше комплексы. В связи с этим есть основания полагать, что введение НП в тканевые препараты могло бы приводить к образованию комплексов 2,03. В этой связи в данном разделе изучены химические превращения НП в гомо-генате и его супернатантнЫх (Тракциях, полученных из тканей печени почек и сердца белых беспородных мышей.

Через 1-2 шш после введения НП в препаратах наблюдался сигнал ЭПР, характеризующийся значениями g-фактора максимумов 2,037 и 2,012 (рис.4). Анализ формы этого сигнала показал, что значительный вклад в него вносит сигнал 1 НП, триплетная СТО которого смазана из-за уширения ее компонент. При дальнейшей инкубации препарата интенсивность сигнала 1 НП снижалась. Через 10 мин в препарате регистрировался интенсивный сигнал' 2 НП и сигнал 2,03. Чореэ 30 мин п препарате регистрировался в основном сигнал 2,03.

Наряду с сигналами 1 НП и 2 НП восстановленного НП к сита-

2,012 6=2,037 2,0 1,92 III I

Рас, 4 Спектры ЭНР гомогената почала мышей' через 1 шнС а') , 10 шш (б) , 30 щн ( в ) посла введения в него Ш. Запись при 77 К. Справа унизано усиленно спектрометра в относительных единицах. Штрихом ( в ) показан сигнал НЪ - НО.

лом ЭПР комплексов 2,03 в гомогенате регистрировался также сигнал ЭПР нитрозильного комплекса гвмоглобинага.ъ-Шс компонентой при е =2,07. О его присутствии свидетельствуют результаты вычитания сигнала ЭПР комплексов 2,03 из суммарного спектра, представленного на рис.4. Полученный при этом сигнал, отмеченный на этом рисунке пунктиром, совпадал о сигналом ЗПР нитрозильных комплексов НЪ. Сигнал НЪ-КО наблюдался уже в первую минуту поолв введения в препарат НП (ряс.4 > К десятой минута он достигал максимума, соответствующего включению в нитроз ильные комплексы всего нь, имеющегооя в препарате.

Через 10-20 мин после введения НП количество комплексов 2,03 достигало предельного уровня, определяемого содержанием ш'-ли-гандов, имеющихся в препарате. Введение в этот препарат соли двухвалентною железа о последующей обработкой препарата но на приводило к увеличению количества комплексов'2,03, образование которых было уже инициировано НП. Количество этих комплексов мокно

било повысить, вводя в гомогенат SH -содержащие соединения, например G Sil , в количестве 3 10"^ И. В данном случае в образовании комплексов 2,03 участвовало болео 60? ВО ,поступившей из введенного в препарат НИ.

Таким образом, полученные результат!; показывают, что НП,вводимый г гомогенат печени мышей, почти полностью распадается, л Егделягдаеся из него железо и оксид азота идут на образование нитрозмльиых комплексов нъ и комплексов 2,03. Распаду НП пред-яеотвует его одноэлектроняое восстановлен;!», 5те превращения ьш наблюдали и на белое nucoтой системе - водном раотворэ Щ.и ОД M трио-буфере pií 7,4 шоле введения в него GSH.

При изучении методом ЭПР превращений НП в гомогонато других тканей мышей почек,сердца мы наблвдали аналогичную,картину: такие гроисходило восстановление НП и орразояанпе комплексен 2,03. Однако их количество было не столь зк&чптельныи, как в гомогена-те печени. Оно возрастало поело введения в гомогенат восстановителей ПП - аскорбиновой киолоты или GSS. Такой жо результат наблюдался и для суперкатантной фракции печени жпей, полученной цен-тря:1ушрованяем гоногенати при 20 ООО и 1G5 ООО g в течение 30 и 60 мин соответственно.

Таким образом, в беоклеточных тканевих препаратах происходит распад 1Ш с высвобождением железа и оксида азота, образующих за-тш комплексы 2,03.

4.2. Висвобоудоние катионов СЕе-НО)^* пщ -распаде ; в бесклеточннх тканогчх препаратах.

Эксперименты, которые будут описаны шже позволили выяснить в. каком »иде - свободном или связанном с яелэзом высвобождается оксид азота при восстановительном распаде НП. С этой целью в гомогенат печени наряду о НП вводили нитратный комплекс двухвалентного изотопа Ро57. При егом считаюсь, что если при распаде НП но высвобождается в свободном виде, то он должен включиться в комплексы 2,03 как с входившим а состав НП Ге56, так и с вводимым в препараты Так как количество образующихся в гомогенате комп-

лексов Я, 03 лимитировано количеством lis-содержащих лигандов, то пра избытке в препарате ПО возникающие при этом комплексы 2,03 долгим включать в оебя этот изотоп. При введении в гомогенат пе-

п ^ сл

чени мышей ¡Í1! в концентрации 10 ■ М, ц!«ротксго комплекса Гэ 1С~Ы и нитрата натрия 2-10"% в качеттве источника оксида

- 19 - 1

азота, через 5 минут Ш1 регистрировал сигнал 2,03, патыетр <Г которого свидетельотЕОьал о ИС% содержании изотопа Го. в этом препарате С р/с.5).

Рис. 5 Форма сигнала 2,03 в гомогенате печени мшгэй после введения в пего 'НИ,и а п 0g и нитратного кошшекса ?е57(а) , после введения з гомогана^НП и цатрагного кошл&кса Fe ( б ). Т » 77 К.

Другой результат бил получен нами при введении в гомогенат печени мышей только Ш1 и нитратного комплекса железа Ге^7 (10-|М). Возникакицие при этом в препарате комплексы 2,03 включали в себя только 5'е56 £=16э(рио.5). Аналогичный результат был получен нам в более простой: системе - водном растворе НП при введении в него нитратного комплекса н восстановленного глюта-тиспа. Такта образом, результаты описанных экспериментов свидетельствуют, что при восстановительном распада НП оксид азота высвобождается из него связанным о железом в виде катионов С?е-1!0)?'4' которые, по-видимому, сначала образуют комплексы 2,03 с низкомоле-кулярныия зн-содержащими лигандамн. "Низкомолекулярные" комплексы 2,03 менее устойчивы, чем комплексы 2,03, включающие в себя ВЗ-груптг белков ( Ванян с сотр.1975). В результате этого происходит переход группы Е'е-РО на белки и образуются "высокомолекулярные'' комплексы 2,03.

4.-3. Взаимодействие ли нос ом. нагруженных иитропруосчлом . о тканевыми препаратами. ■ I • ■ '

Вяутрибркашшое введение чшгаам НП приводило к быстрой гибели тавотных в'результате циаяидпого отравления, происходящего,, по-ви-

дикому,'из-за высвобождения в крови ионов Ой" ,образующихся при восстановительном распаде нитропрусскда. Это но позволило нам изучить превращение НП в тканях животных ln vivo. Поэтому мы попытались ввести НП в организм животных в составе фос^олихшдных бислоЯных везикул-лнпосом С ЛД),предполагая, что в этом случае не будет происходить отравления животных,При пероральногл и вйутрь-бришянном введении .улвогнкм липосом о НП гибели животных не происходило даже на 4--5 сутки пооле введения ЛП с НП. Еиэопше быстро погибали при обоих способах введения им того же количества ЛП с ТШ, предварительно разрушенных обработкой детергента - 2% раствора додецилсульфата натрия (ДНО). Агония насаупала к 7 минуте со времени введения животным препарата, а в их крови был зарегистрирован интенсивный сигнал ЭПР $срмы 1НП со "смазанной" СТО, соответствующей переходу в ату форму'6 мкг НП на мл крови. Это позволяет утверждать, что интактные липосомы с НП при обоих способах введения сохраняли свою целостность по" крайней пере в крови животных. invivo, В печени,селезенке и легких животных, которым внутри-бркдшшо вводили' интактные ЛЛ с Ш1 через 15 мнут после инъекции и далее в течение 2-х часов регистрировался сигнал ЭПР фермы 1НП, после чого его интенсивность необратимо снижалась. В исследуемых образцах не было обнаружено сигнала ЭПР фэрш 21Ш и сигнала 2,03. Для оценки количества НП, наподВергнувшегося в тканях каким-либо превращениям "нехфореагировавшего Ш" препараты тканей обрабатывали диметил'Хормашдом, ДЕЗ и дитк'онитом. Это приводило к восстановлению НП ы переходу его в стабильную $орму, регистрируемую ые. тодом ЭПР. Через 1,5 часа после внутрибрхшинного введения мышам ЛИ с Щ. "непрореагироваввий нятропруссид" был обнаружен в крови, печени, селезенке и легких в количестве соответственно 10,10,30 я 10 мкг/г влажной ткани. В почках п сордце "нопрореагдровавшего ;ПГ обнаружено не было. Таким образом полученные нами данные свидетельствуют, что "непрореагировавапзй НИ" накапливается в тканях с высоким содержанием клеток ретиодо-эндотелмашю? системы. Поэтому можно полагать, что,ЛП с НП в организме киэоткнх Id vivo в основном поглощаются макрофагами. Этот вывод согласуется с результатами Роердника о соавторами(1981).

Проведенные исследования, следовательно, показывают, что вклю--Ченио НП в липосомы в качетсве метки позволяет судить как об ин-tiki'koct!! ,1Л в крови, так и об ■распределении их в тканях животных

4.4. Продукция оксида азота под действием различных

тиолсодержапих соединений из растворов нитвопруссида и нитроглицерину.

Некоторые авторы оценивает эффективность генерации WO пз Ш и.НГ по количеству свободного околда азота, выделяющегося в.э их растворов. Однако N0 , выделявши Лея пз НП и 1ГГ может оставаться э .. растворе, включаясь в различные соединения.Эксперимента, которые будут описаны ншге; проведены для изучения влияния на образование оксида азота¿фидгяхирувдёгосяиз НП и НГ соединений, которые мохут элективно связывать НО. С этой целью нами было изучено самопроизвольное выделение ТО из растворов НП и НГ я ксследоваяа возможность включения оксида азота в этих ха растворах в другие комплексы, например, комплексы 2,03. Выделение оксида азота из растворов НП и НГ регистрировали двумя способами:

1.Выделяющийся :;з НП и НГ ПО поступал п раствор, содержали?, комплексы двухвалентного железа с ДЭТК и образовывал МН комплексы с железом и ДЭТК. Количество высвобождающегося оксида азота определяли во интенсивности; регистрирующегося при этом сигнала ЭПР комплекса Ге?+-ДйТК-К0.

Э.Высвобояда-вдайся из НП и НГ оксид азота н14о заменял' молекулы в синтезированных нами комплексах Fe-ДЭТК- li^'o. В этом случае вместо сигнала ЭПР комплексов Ге-ДЭТК- н^О, харак-торизущихся дублетной СТС, регистрировался сигнал ЭПР Га-ДЗТК™ ПО, характоризуящийся.триплвтноЯ; CTG. Различно СТС сигналов ЭПР этих комплексов обусловлено разной величиной ядерного спина н и И*"^ соответственно I =1/2 и 1 , взаимодействующего о носп&рекшш ■ электроном.

Результата наших экспериментов показывают, что при 45-50°С ' вря комнатном освещении. в минуту распадаются 0,0£# НЕТ в 1 i,U раствора. При введений в раствор ЙП ли ги они та натрия 50 мМ происходило усиление выхода КО -количество Ш комплексов железа о ДЭТК увеличивалось в 2-3 раза. Наряд}' о этим в самом растворе 1Ш рех-лотри-роззялоя сигнал "ЛР Ш! комплексов железа о тиосульфатом с интеисив-~osTъп, соответствовавшей включению в эти комплексы 1i железа, исходно ьяодяхэго в состав НП. Если вместе о д? июни том в раствор, со-дертяши? нптропруссид добавляли цистеин злп тиосульфат 50>.М ,в я том случао т? комплексы 2,03 вклэтчалось до 20$ железа из НП и уси-дипятст Tftrtse выгод оксида азота в свободной форме.

• Продукции оксида азота из НГ, находящегося в фосфатном буфере рН «7,4 обнаружено не было. Освобождение ыо из раствора НГ происходило после добавления в него восстановленного таататиона, цистеина шга дитионита, концентрации которых соответственно соста-; вшга 15 иМ, 15 Ш, 30 ыМ. Скорость высвобождения НО из раствора НГ составила 0,6 £ 0,2 шМ/шн, что находится в хорошем соответствии с результатами работы Феелиша с соавтора!® < 1987) . Надо отметить, что указанные исследователи не обнаружили продукции НО после введения в раствор КГ восстановленного глютатиона. Кроме этого ш обнаружили 2х -3х кратное увеличение вихода КО из НГ при введении в раствор наряду с вдстеином,восстановленным глмтатаоном или т-тионитон, сернокислого железа. ,

Описанные в данном разделе результаты находятся в удовлетворительном соответствии с данными работ, авторы которых исследовали возможность самопроизвольной продукции КО иь растворов НП и возможности раствора НГ выделять оксид азота под действием ряда восстановителей(Феелит с соавг. 1987 г Феатша,15оак 1987 ). Однако, в отличие от результатов работ этих авторов, наш обнаружено усиление выброса НО из раствора НГ под действием цистеина,восстановленного глататиона, дитионита Елгдние этого реагента на высвобождение оксида азота из НГ в указанных работа*: не рассматривалось . Кроме этого в отличие от западногерманских исследователей мы получили данные, свидетельствутедие о влияши негшового железа на выброс N0 из раствора НГ. Основное ке отличие нашей работы от исследований Феалиша с соавт.(1987 ),Феалма,Ноака(1587) заключается в том, что ш обнаружили включение Ьт0 в ДН комплексы желе за, возникающие в этих растворах. Появление этих комплексов в растворах Ш связано с восстановительным распадом указанного ооединешя, в результате которого железо и КО .входившие в состав нитропруссида взаимодействуют с тиолсодеряадаын лигандами и образуют с ниш ДН комплексы. Если в растворе присутствуют дигиоли,например, ДЭТК, ь нем возникают соответствующие МН комплексы железа, в которые мояет включаться до 20% № .предварительно содержащегося в НП.

.При введении В'раствор НГ соли сернокислого .«елеза, цлстеина, восстановленного глататиона или тиосульфата происходит образование ДН.комплексов железа, в результате чего происходит уоцденяо выхода •НО из. НГ/Лоз то,му количество оксида .азота, идушего на образование ДН комплексов железа на.-, два порядка вшо того количества МО .котэр рое ввделяегея из раствора НГ В допободаом виде. .. ' ,■„.

Результаты наших экспериментов показывают, что восстановите' ли и тиолсодержат« е соединения оказывают воздействие на продукцию оксида азота из растворов НП и КГ. Необходимо отметить,что в продукции КО из раствора НГ существенную роль играют ионы двухвалентного желога. Возникавший из НП И НГ оксид азота сохраняется в растворе, содержащем эти соединения в связанном виде, образуя ДЯ комплекса железа с тиолаодэржашли лишщами. Аналогичная ситуация сохраняется при введении HTi и НГ з биологические системы.

Из вьчяе изложенного следует, что ПО , образуются в организме из КП и НГ ОЕязюается различными соединение, что необходимо учитывать при исследовании процесса активации гуанилатциклазы НП и НГ, которые продуцируют в тканях оксид азота.

ГЛАВА 5. К0НСК1 ДВШТРОЗИЛЬШЕ КОЖШЕКСЫ НЕЛЕЗА С РАЗЛНЧ1Ш1 АНГОНЖШ ЛИГЩШ Б ЛИСТЫ! ВЫСШИХ PACTEïïtà И' Ю1КРООРГА1ШЛАХ.'

5.1. Свободное уелезо .в Растениях-

Ко времени появления напей работы вопрос о том, имеется ли в клетках растительного проъсхозденвд свободное железо,оставался открыты?,!.Для ответа на него мы попыталась инициировать образование комплексов 2,03 в листьях высших растений. Эксперименты протюдшм на листьях высших растений - чайной розы,бобов (Vicia i&ba ) ^абака типа "Саксуп",листьях виноградной лозы» Обработка оксидом азота листьев чайной розы и бобоз приводила к рагастращге в них при 77 К сигнала 2,03Срис.5.). При комнатной температуре форма этого сигната не изменялась (рис.6} .Кроме сигнала 2,03 в препарате- листьев регистрировался также сигнал ЭБР свободных раяикдлоп, который маскировгл компоненту сягнача 2,03 при е|(.Это было подтверждено результатами вычитания на компьютере "Аспект",находящегося в ко®г-лекте с радиоспектрометром "Брукер", зарегистрированных при 290 К сигналов.ЭПР листьев чайной розы,обработанных а необработанных оксидом азота. Разностный сигнал, приведенный на рис.7 по овооЯ форме я параметрам был идентичен сигналу 2,03,регистрирующееся.в тканях животнзд, обработанных по , Комплексы 2,03 в препаратах чайной роян бшщ связаны ù белками, а не с кизкомолекулярнчмп Ell -содержа 1пг'.ми соединениями, Об мом свидетельствует сохранение анизотропии stoic сигнала при повшешш температуры регистрация от 77 до 290 1С. .

Для изучения вопроса о месте локализации комплексов 2,03 в

т 24 -

5=» 2,037

2,012 2,002 » *

Рас. 6 Спектры молельного соединения (а) , листьев чайной розы, обработанных оксидом азота (б,в) . Т«7? К га,б) ; 290 К (в) .

Рас, 7 Спектры ЭДР листьев чайной розы, обработанных (а) я иеобсв бота иных (б) оксидом азота; (в) - разностный сигнал. Т= 230 К.

растительных клетках листьёв бобов, обработанных ко .листья гомогенизировали, а затем гомогенат центрифугировали при 2СОСО к .До 1Ъ% комплексов 2,03 в супернатантной фракции были локализованы в клеточном соке. Аналогичное распределение мы получали, когда комплексы 2,03 инициировали, обрабатывая оксидом азота предварительно разделенные фракции гомогената,

Комплексы 2,03 не регистрировались в супернатантной фракции гомогената после ее 3-4 часового диализа против 0,01 М раствора цитрата натрия. При этом происходило также резкое снижение концентрации в супернатантв комплексов марганца. Введение в диализо-ванный препарат соли двухвалентного железа и последующая обработка этого препарата оксидом азота приводила к регистрации в нем комплексов 2,03(рис.8).

Таким образом, эксперимент с диализом супернатантной фракции гомоганта листьев высших растений дали результат, аналогичный полученному в экспериментах о диализом бесклеточннх препаратов тканей животных (Ванин,1080).Описанные опыты позволяют сделать нывод, что в лкотъят высших рэстениЛ так га, как и в тканях животных пра-

9" гея зт

Еио. 8 Спектры ЭПР листьев бобов'

я лх препарбтсв, обработанных оксидом азота: ( о ) - листья, бобов; (б ) -оудоряатЕНгная фракция гомогэяота

листьев; (в) - в препарат (г) добавлена соль двухвалентного келеза и оп обработай КО; (Г) - препарат (б) даа-лязован в течение 3-4 часов. Т = 77 К.

сутствует свободное железо, которое и включается в комплексы 2,03.

Следующим этапом наших исследований свободного железа в растениях стало выяснение вопроса о том, каким из двух компонентов 2,03 - слабосзязанным железом или парными й£~ -группами белков лимитируется в них образование комплексов 2,03 при избытке третьего компонента.- оксида азота. С этой целью в гомогенат листьев до обработки его КО добавляли цитратный комплекс железа ГеБО^^О Количество комплексов 2,03 при этом увеличивалось в 2-3 раза при выдеоживании листьев чайной розы в 0,1 М растворе цитратного комплекса железа. Последующая обработка этих листьев МО приводила к тому, что количества комплексов 2,03 в ¡ах в 2-3 раза превышало их уровень б исходном препарате. Отсвда следует, что содержание в це~ , льх листьях парных -групп белков не лимитирует образование в них-комплексов 2,03 ври включении в них эндогенного желеаа^ т.е. по количеству,,комплексов 2,СЗ иокно судить о содержании в листьях свободного железа. Оно составило 4-5 мкг/г влажной' ткани листа.

В разделе приводятся также результаты исследования влияния восстановителей протеина и восстановленного глютатиона ,а также ДЗТК на содержание свободного железа в листьях высших растений.

5.2. Оксид азота в табачном дыме, .'Известно, что табачный дым является экзогенным источником оксида азота, попадающего в организм ( ШтаЯн и др., 1980 ¡Ленинский, Ыарев,1982). По этой причине особую значимость в настоящее время приобретает исследование физиологического действия табачного дыма на организм курящегоДтобы решит* ее, необходимо оценить количество оксида азота в табачном дыме душ сравнения его с количеством, которое оказывает физиологическое действие, например, при использовании -известных лекарств, в частности, при применений минимальной нитроглицерина. В опытах т использовали 10 М водный раствор двухвалентного капеза с тиосульфатом и 10"^ I! раствор двухвалентного железа с даэмлдитиокарбоматш в ДМСО в отсутствии 02. После прохождения сигаретного дыма через растворы приведенных соединений, которые находились в сосуде-реакторе, в этих растворах возникали ДН комплексы железа с тиосульфатом или МН комплексы железа с ДЗТК. Сопоставление интенсивноетей зарегистрированных вами сигналов ЭПР ыоко- и.динитрозильных комплексов железа о сигналами тех ке комплексов, концентрация которых известна, свидетельствует, что в комплексы в сосуде-реактор8 вклачалооь 10*^ М КО .Так как концентрации

тиосульфата я диэтилдитиокарбомата были значительно выше концентраций оксида азота, то эти лигандн не лимитировали образование в растворе ДН и ГШ комплексов железа. Отсюда следует, что весь Ж) .образующийся при сгорании одной сигареты и поступавший с дымом в раствор, включался е комплексы. Об этом свидетельствует также и то, что дальнейшее пропускание через опытныЯ раствор ок- . сида азота приводило к резкому увеличению образования в нем ди-и мононитрозильных комплексов железа с тиосульфатом кля ДЗТК соответственно.

Полученные нами данные,таким образом, свидетельствуют, что при сгорании табака, содержащегося в одной сигарете образуется 10"® М или 30±10 мкг оксида азота. В физиологическом отношения это количсотво оксида азота приближается к количеству РО .образующегося при потреблении минимальной дозы НГ0ЛошковскиЗ,1972), В отличие от оксида азота, образующегося из нитроглицерина л поступающего в организм одномоментно,ко .содержащийся в табачном дыма поступает в организм порциями и тем не менее его количество достаточно для оказания физиологического дентсвия, которое, по-этгдимому, состоит не только в сосудорасширяющем эффекта, но и может вызывать по данным Да Рубертиса и Гравена(197б) патологические изменения в тканях.Таким образом, с псиощья метода ЗПР по включению в ДН и МН комплексы яелеза рязработа методика коянчест-венного определения оксида азота, содержащегося в табачном дыма» Следует отметить, что такие г.е сигналы ЗПР мы наблюдали в фпльт--рах сигарет после обработки водным раствором,оодоркацад ".'алейо и один из указанных «нзе лигандов ДЗТК или тиосульфат . йтот результат позволяет нам предположить, что с пемопью ди- и мононатрозидь-ш комплексов яелеза можно Таксировать оксид азота,образующийся* в табачном даме и предотвратить его попадание В' организм курящего.

5.3» Свободное..келозо в клетках бактериального .происхождения,

В экспериментах ш испо'льзоз&чи штаммы рзтотрофных и олиго- ■ трофных бзхториЯ. Свободное келвзо в этих препаратах било исследовано по включению его в комплексы 2,03, которне,возникали в цатах глотках, а такие гомогенате клеток при обработке их оксидом азота, Все исследуемые нами штаммы при контакте с КО давали сигнал 2,СЗ, анализ форма и параметров которого свидетельствуют) что они одина-коэк для всех наученных нами образцов.

Количество комплексов 2,03, образутапихся в цатах бактериальных клетках после их контакта с .-НО бнло в среднем одинаково и

соответствовало включению в них 0,4* 0,2 мкг железа ка грамм влажных клоток. По-видимому, эта цифра может отражать уровень свободного железа при условии, если бы содержание тиоловых лигандов в этих препаратах ке лимитирует образование в них комплексов 2,03. Мы проверили эту возможкооть.При введенил в суспензию целых клеток ДЭТК. в ней регистрировался МН комплекс железа с ДЭТК,интенсивность которого соответствовав включению в комплексы Ге2+-ДЭТК-н О 8-12 ыкг железа на грамм влажных клеток. Однако ранее наш было показано, что ДЭТК способен высвобождать жалезо из ферритина и повышенное количество железа в бактериальных препаратах может быть связано именно о этим фактором.

Для оценки вклада ферритина в образование МН комплексов желвт-за с ДЭТК были поставлены опыты с гомогенатом,приготовленным из клеток E.col.i . В. препараты вводила циотеин или восстановленный глютатиок, которые по данным Ванина с соавторами (1977 ) по-разному влияют на высвобождение железа из ферритина. При инкубации целых. клеток о циотеином или глптатионом эти соединения практически не влияли на образование в них комплексов 2,03. Иная картина наблюдалась в экспериментах о гомогенатом бактериальных клеток, в который вводили цистеин или ДЭТК. Количество железа, включающегося в ДЙ и МН комплексы в препаратах увеличивалось в 20-30 раз при использовании ДЭТК я цисгаика я в 10-20 раз при использовании гхвтатиона по сравнению с гомогенатом, обработанным только НО Использованная в'экспериментах доза восстановленного глютатиона по данным Ванина о соавторами (1377) могла высвобождать не более 1-2 мкг железа из 100-200 мкг железа, входящего в состав феррите-на,Таким образом, дополнительный прирост железа {количество комп- ! лехсов 2,03), который наблюдался в препарате'гомогената при вве- . дениа в него глютатиона был обусловлен его участием в этом процессе как тиолсодержащэго даганда. Следовательно,образование ди- и i иононитрозильвых комплексов железа в гдаогенате бактерий было ис-i ходко лимитировано содержанием -гаолсодержакдос лигандов. Исходя из результатов, описанных выше, только ь присутствии глютатиона можно говорить о включении' й комплексы 2,03 всего содержащегося в го-могенате бактерий свободного железа - (?но составляет по нашим раст четам 5-10 мкг/г влажных клеток. • < ■

, ГЛАВА -Б, СТДШИЗ!ФУЩ2Е ШЯШЗ СВОБОДНОГО ШГЕз1.Щ'(ЖСЭД

- Азфк пмоошшах i-вотще)* у'

л. Б гшаве приведена атом. Ьродекаано? щл. раО^ты.'^бш данные'

свидетельствуют о той, что дшгитрозилытие комплексы свободного железа с В3~"гругаага белков - единственная форма существования свободного железа и оксида азота в биообъектах. Этот вывод бил сделан, как уже отмйчялооь вше, на основе анализа параметров форм» и исследовании релаксационных характеристик сигналов ЗПР динитрозиль-ных комплексов хелеза с различными анионным лигандами. Таким образом, ни НО, ни ВС комплексов негемового железа в тканях не возникает.

• В настоящее время высказывается предположение (6айнерт,1576; Рзди о соовт., 1983),что комплексы 2,03 образуются в результате реакции ко с различными железо-серными белка1.®. Однако, оно противоречит тезису о стабилизации оксида азота негемоЕым железом, так как в этом случае долото происходить разрушение жизненно валсных -~е-лезо-серных белков. Поэтому мн считаем, что стабилизация оксида азота происходит при помокде свободного яалеза и тиоловнх групп белков и низкомолекулярннх соединений. О наличии этой формы негемового железа наряду с тканями -тавотных в других биообъектах - листьях высших растений и бглтерзях свидетельствуют результату огшсангшх выше экспериментов. По включении з ДН комплексы с тйоловкш группа-;.'и" белков и шзкомолекуляршх соединений показало, что в этих объектах содергщтся слабосвязанное келезо негемовой природы. По аналогии о функциональной ролью этого железа в тканях яивотпнх могло предположить, что оно в листьях растений и бактериях приникает' участие в синтезе моталдопротепков, иОобходкш длл йшкщюнпрова^ ния ряда ферментов, процессов йинтеза ДШ и меточного деления,'

Надш даннно свидетельствуют, что содержало свободного железа в высших растениях л бактериях так же,как и в тканях животных определяется родохс-системэЗ,которая влияет на включение и высво»» бояденяв железа из желез одеггонирукшдах систем,'причем рэдокс-споте-ма в растениях и бактериях долета бить сдвинута в более восстановительную область, обеспечивая- тем самым высвобождение из депо в равных условиях больяего количества свободного железа.

Результаты, полученные вами, свидетельствуют о том, что по содержанию свободного железа лиотья высших рсдтякий и бактерии в ста-ционарной;$ме роста ближе к дрожжевым клеткам, нежели чем к животным.!! листьях высших растений 'эта форма негемового железа преобладает над остальными. В отличив от тканей животных, в которых свободное явлено локализуется в "белковых структурах" - ферратине, в бактериях и листьях высших раотертй в нормальных условиях кианедад-

тельноети свободное железо локализовано в замкнутых мембранных образованиях, напоминающих вакуоли.

К 1991 году Ваниным была высказана гипотеза о том, что широко исследуемый в последнее десятилетие "эндотелиалышй фактор релаксации'' кровеносных сосудов, выделяющийся из кх эндотелия под действием различных вазоактивкых веществ представляет собой негемовое железо, связанное с оксидом азота. Такта образом, но .возникающий из эндогенных предшественников может стабилизироваться негемовш железом. Можно предположить, что такая стабилизация характерна и для оксида азота, источником которого являются экзогенные соединения. В первую очередь это касается нитропруссида. Наш данные свидетельствуют, что при распаде этого соединения N0 высвобождается • из него будучи какое-то врем связанным о железом. Такая связь,по-видимому обеспечивает стабильность НО и его "транспорт" до-мишени действия. Однако,' очевидно, что образующиеся при распаде НП грушш Ге - КС саш по себе существовать не могут и обрастает "шубой",состоящей из различных лигандов - воды .аминокислот, вполне возможно и тиолсодержащима соединения;,и. Из-за невысокой концентрации их трудно обнаружить. Но тот факт,что при восстановительном распаде НП возникают комплексы 2,03 нами было показано о помощью метода ЭПР.

.Аналогичный процесс может происходить и при стабилизации по, еыс-Еобоудающегося из другого кардиотерапевтзческого средства - ниаро-глицерина. Только в этом случае будет использоваться железо эндо-. генного, происхождения. В настоящее время некоторые исследователи полагают, что оксид азота,вясвобоадаюдайоя из.ЕГ,образует нктрозо-тиолы из"- ко в тканях(йгяарро с соавт.,1981;Катсуки с соавт.,1977) Мы считаем.что в этом случае вероятнее всего возникают комплексы вида ВО - 1е - ЕЗ". • "

Таким образом,результаты нашей работа свидетельствуют о том, что один из важнейших биорегуляторов - оксид азота стабилизируется в клетках и тканях посредством образования с ним и тиоловимг лп-гандами дикитрозгльных-комплексов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1»Пр«дяожена концепция о стабилизирующей ролй негемового железа в Функционировании оксада азота в'клетках и тканях, позболнв-шая пересмотреть шаказиваащееся ранее цренив 6 дестабилизирующем вХаяшш железа как решающем па окезд азота £ этих объектах.

-/ 2.Дитцрозша>&Цб комплексы негеыопохо железа, о тиолозши хруп-паии балков едннйгвенйыв, которые могут возникать в Клетках г гк&~

нях животных при участии железа и оксида азота. Комплексы с другими лигандами - высокоспяновые или низкоспиновие в этих объектах практически не существуют. Способностью двухвалентного железа связывать оксид азота с образованием нптрозллышх комплексов, включающих в себя тиолсодержащие лигавды обусловлено более эффективное вазодилататорное действие нитропруссдда п динитрозильного . комплекса железа по сравнении со свободным оксидом азота.

3.Внутриклеточная среда печени влияет на структуру образующихся в ней комплексов 2,03, что проявляется в понижения симметрии тензора е -фактора сигнала ЭПР этих комплексов. Комплексы 2,03, локализованные на внешней стороне меток печени характеризуются тензором е -фактора сигнала ЭПР с аксиальной симметрией. Таким образом $срма сигнала 2,03 является индикатором локализации комплексов 2,03.

4.Динктрозильные комплексу в высота растениях и микроорганизмах, как и в тканях животных,образует исходно слабосвязанная форма негем.ового железа, так называемое свободное железо. В листьях высших растений эта с£орма ногемозого железа преобладает над остальными. В растениях практически все запасаемое железо находится в свободной форме и локализовано в замкнутых мембранных структурах,имеющих в отличие от жеяезодепокируищих систем животных, небелковую природу.

5.В микроорганизмах образование комплексов 2,03 в отличие от тканей животных лимитируется в основном тиолсодериащиш лигандами.

6.Экзогенные источники оксида азота - нитропрусспд и нитроглицерин в биосистемах,распадаясь,могут включать в себя основную часть оксида азота, выделяющуюся из этих соединений. Эту способность следует учитывать при изучении механизма физиологического " действия нитропруссида и нитроглицерина.

7.Способность железа образовывать да- и монснитрозильнне комплексы с тиоловкмд лигандами использована для, обнаружения Физиоло- • гичестш активного соединения - оксида азота, образующегося дри сгорании табака. На этой основе разработа методика количественного определения оке 1/да азота, содержащегося в табачном дчме.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1.Ванин А.'7-., Али ев Д.И. ,Варич В.Я. .Кубрика Л.П. 0 :|орме сигнала сХТР читрепплт.кнх коьшлекоов нвтатового железа в тканях животных. //Био-Г'чзика, 1979, т. 25, с. 350.

2. 'Ванин А.Ф.Дубрдна Л.Н..Алиев Д.И. О механизме образования комплексов кегшоввго .железа в тканях животных. // Stuäia Ъ1о-Sbyai.ce, 1980, v.80,5.221-230.

3. Алиев Д.И. ,Ванин А»Ф. Высокосииновце нитрозилыше комплексы негемового хелэза. //В сб.тезисов докладов на Всесоюзном симпозиуме "Магнигаый резонанс в биологии и медицине", 198.1,с. 138, Москва..

4. Алиев Д.й.,Вашш А.Ф. ,Кубрина Л.Н. .Мордвинцев П.И. .Мошковский Ю.Ш,«Шабарчана '.'.Я. О взаимодействии липосом.уагрузкенных нит-ропруссидом с тканями .тавотных in vivo и la vitro . //В сб. тезисов докладов на 1-оы Всесоюзном биофизическом съезде, 1982, т.-!, с, 91, Москва.

Б. Балля А.Ф,,Алиеь Д.И, Высоко- и низкоспинойне нитрозильные комплексы нвгемового железа с белками тканей яивотных. //В сб. тезисов докладов на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде,1982, т.4,с.121,Москва.

6. Алиев Д.И.,Ванин А.Ф. О реакщш нитропруссида с тканевыми препаратами. /УКуЬя^зУ химия, 1982,т.56,с.2362-2364.

7. Алиев Д.И.,Ванин А.Ф. Высвобождение катионов Ге-ЫО 2+ пра распаде нитропруссида в бесклеточяых тканевых препаратах. //• нура.дйз, хехия, 1982,т.56,c.23S5-2366.

8. Äliev D.I.,Vania À .F. Higb and low epia coa-haem iron nifcio-ayl ooaplezes vith ¿ii'ítreat aaica ligaaâs. //Proceeding of the 1-at Sovict-Ibdian Symposium oa actual ркйиз of magnetic resonance spectr.of inorganic materials,Dushanbe,1982,p.177*178.

9. Ванин А.Ф.,Мордвинцев П.И.«Шабарчика М.М,,Алиев Д.И..Кубрина Л.И» .Мошковский Ю.И. Иош китропруссида как метка липосом. //Биофизика,1983,Т.28,вып.6,O.990-993.

10. Vania, A.Ï. ,i.liev B.I, Higa épia nitrosyl non-terne iron complexes in auisial tieeuee. //Studie bioph36iea,'5983,v.93,p.6S-6ß.

11.Ванин А.Ф.,Алиев Д.И. Форма сигнала ЭПР иптрозильных комплексов негемового келеза как индикатор белковой компоненты этих комплексов. // stuàia tioj>hjeic«,19S3,y,93.P»223-229.

12.Алиев Д.Й.,Ванш А.8»,Гезалов.Х.Е, Нитрозилыше комплексы не-гемсзого железа в тканях растительного и аивогаого происхождения. /Д1звьсгая АН Аз.СГЯ3 серия ,lS84,B3,c.65-69.

13.Алиев Д.Й.,Еурбанрв И.(!.,Г0залов S.S.,Ванин АЛ. ' Слабосвязан'' ' ное негеиовоз яелезо к зеленах"листья* тебака. //Гокл.АН Аз„ССР

; 1Э85,J:-IÜ,о.93-Ш.. .. \ : ?

14.Курганов И.О.,'Алиев Д.И.,Геззлов Х.Б.,Ванин А.О. Исследование методом ЭПР херментированного и не^ермеитарованного табака. /Л!зв. ЛЯ Аз.ССР серия биол.яаук ,1985,ЯЗ,с.94-97.

15. Aliev D.l.,7anin A.?. New forra поп - heme iron in tobacco leaves. //IV International Bynpcaium "Plant metabolism Regulation" .Bulgaria,1986,p.8. ■

16» Aliev D.I.,КигЪanov I.S.,Vantn A.J. Presence non - heme iron in higher plant leaves. //Studio biophysica, 19B6_,v.115,p.173-iec.

17.Тйфбанов И.О. .Алиев Д.И. О форме сигнала ЭБР данитрозильных комплексов негемового железа в тканях вистах раотечий. //В грудах конф.мол.ученых АН Аз.СС?,Баку,1937,С,50.

18.Курбапов И.О.,Алиев Д.И. ?иксацяя о помощью нитрозильных комд-лексов негемового железа окаси азота,образующейся при горения табака. //В сб.тезисов догаь п республиканской конференции ученых-химиков,Баку,1987,0.86-87. '

19.Ванин А.'!'..Кабаков Й.С,,Мордвшщез II.II.,Алиев Д.И. Влияние йнутриклэточной среды на структуру дапктрозилышх котлсксов негемового железа в пэченл .тавотных, //studio biopbysica,-l98?.

20. Aliev D.I. ,V«nin A.jF. Loosely-bound ncn-Ьеиз iron in'heality and affected of bacterial cancer higher-plant leaves.//3-rd International Congress on Horaon and .Cancer,IB2-,"193?,p.26«

21. Alieva t.II,,Aliev D.'I. ,Go3ao7 H.M. Electronic structure of. dinltrccyl complexes with simulate the 2,03 ooaplesss in plsmt and aninal tissues. //International Sjtapoaim on Mineral Hutrition and Photosynthesis,Bulgaria,19S7,p.29.

2.2. Aliev D.I.»AlisUenderova U.K. »Yanin Bacterial cancer ef-

fect on IoobsIj bound non-hema iron content in higher plant leaves,Ibid.,p.49«

23ьКурбанов И.О.,Алиев Д.И.,Ванин А.Ф. Содоржаниа окиси азота в табачком днме. //Дурнал $яз.хюшДЭ80,т,е2,с,1122-1124. •

24

• Aliev Iron dinitrosyl coaplexea la the leaves of higher

plants affoot;ad by pathogenio factors. //6-th Congress of the ЗГ2РР, Jugo si avia, 19B8, ]? . 601\

S5. Aliiva I.1?.,Aliev D,I.,Godiaev H.M. Elootroaic aspects of atn~ biliraKlcm of iron <3initro3yl coaploxes formed ia plant ciaaueg, lbid.,pH301. • ....

2?.Ал и on Д.Ч.,ВаяЕя хл. Нитрозмльнкэ комплексы негековогэ жале-

■ за с тиолсшкми группами белков - единственные комплексы негемо-вого железа,возникающие в тканях животных. //Изв.АН Азерб.ССР (серия биол.наук) ,155,1986,с.123.

27.Aliev D.I.,Kurbanov I.S.,Vanin A.P. Investi£atien of воп-Ьзеш iron in 'biological objects by ESE nethod. //G-th СШ5А Symposium ■op. electron spin resonance spectroscopy in Biochemistry ,l!olecu-lar Biology and Medicine,Czechoslovakia,1988,p.1.

28.Alieva I.H.,Aliev D.I. .Godjeev Л.Ы. The study of electron end spatial structure of ferrous protoxide dinitrosyl ccuplex with cysteine,ibid.,p«2.

23,Kurbanov I.S. ,Alicv D.I. ,Yaula A.F. "RSS signal pattern of dinitrosyl поп - Ьаш conplexea in higher - plant leaves, ibid.,- , p.31.

30.Курбанэв К.С.,Цордвинцев П.К.,Алиев Д.И.,Вашш А.Ф. Влияние тиоловах соединений и зкелеза на продукции № из нитропруссида и нитроглицерина . //Вопросы мед.химии, 1989,И,с.87-91.

31.Aliev D.I.,Vanin A.F. High, spin nitrosyl complexes of iron in plants. // IX International Conference on protein of iron transport end storage,Australia,19S9>P«43«

32.Alieva I.H. ,A.liev D.I. ,Gcdjaev 11.14. Blectroa and spatial structure of the Сскр1еа;ез that take part in the aotaboliea of iron in the. onanism,ibid.,p.44.

33 .Kuroenov I.S.,Aliev D.l.,Vanin A.i. Поп-heme iron and uethoda of.its deposition in vegetable and bacterial cells, ibid., p.46.

34.Vanin A.T.jUalenfcov A.G.,Aliev D.I. Biotransformation of exogenic Pe in organism, ibid., p.47 ■.. 35.дц^ D.I.,A.lieva I.H. ,God;jaev П.Ы. Electron and spatial atruc-tures of possible nitrogen oxide carriers in tissues. //"19-th IEB3 Meeting,Home,Book of Abstracts, 1989,p.2?

36.Алиев Д.И.,Алиева И.Н.,Годжаав Н.'Л. Электронное и пространственное строение данитрозильного комплекса закисного железа с цкстеином. //Нурн.химии,1939,т.68,№10,с.2656-2660.

37.Курбанов И.С.,Златкнп Й.В.»Никитин Д.И..Мордвинцев П.1!.,Алиев Д.И.,Ванин А.Ф. Свободное з&елезо в бактериях. //Кзз.АН ССОР ( серия биол.наук), 1990,ЯЗ,с.44.3-446..

38M±eva I.M. .Aliev D.I.,Godjuev Й.Ш, .Effect of ligands environment Ob electron and epatial structures of iron protoxide dinitrosyl compleacec with cysvcino. //Studia biopiiyaioa,1991,^139,

nc1,p.17-28. •

ЗЭ.Алиева И.Н.,Алиев Д.й..Бзлиева Л.И,,Годжаев Н.Н. Взаимосвязь оксида азота и нвгемового железа в тканях. //Тезисы докл. Республиканской межвузовской конф.по физике,Баку, 1392,с.111. 40.Алиев Д,И.,Курбанов И.С.,Алиева Й.Н. Нитропруссид и нитроглицерин - экзогенные источники оксида азота в организме. //Рее- • публиканскал• научная конференция п5язика-93",Баку,1993,с.72. H.Aliev D.I. ,Alleva I.N. 2,03 complexes - the optimal fort» of nitrogen oxide storage in bioeyaterns.//4-th International. Qoc-ference on Hemochromatosis and Clinical Problems in Iron Metabolism, Israel,1993 |Нешо 207,p. t2.Alieva I.S.,Aliev D.I.,Шэавот 3.G. Correlation of nitrogen oxide and acn-hene iron in tissues.//ibid.tBemo 208,p.

43. Халзлоз P .И.,Алиев Д.И, .Алиева И.Н. Некоторые особенности строения комплексов 2,03 и использование их дал фиксации но, содертагагося в табзчыон дамеУ/3 тр.1 Мэздувар.ксяф.

■ "Современные проблэкм з'кологиа, метода и средства ах решения", Баку, 1994, ¿.181.

44.Chalil0T П.I.,Al.ler D.I. Parematric and relaxing features of the EHi signal of 2,03 ooBplexea. //Inter.Conf.on Application of Fuzzy. Systems, 10ЛГЗ,1гвп,1994,рИ5б-158.

2 У Л А с е

Диссертасиза аши бакгериал, битки ва Ьвзван мэншелы то-хумаларында ¿аранак згляллярын гаол груши ры ил б гедри - Ьеы дешрал зэиф баглы форма синын (сарбэс? двмар ) диннтрозил комп-лекслерикии тадгигине Ьвср олуаур. кошлекслер ЕПР сигни линии в -факторунун орта гизмети 2,03-е берабэр олдугуна кера 2,03 комплекслврн адланыриар, 2,02 комялякслеришш кашонент-лзри олан гелри - Ьеы даиирин ва азот оксядичин ( Н 0 ) гарш-лыглы те сиришш езренилкэск натачесииде азот оксиданин фза-лнззатшда гедра - Ьег/, дел-дран стабаллешдарнча ролу Ьаггиида консепсида прели стгрхлштвдгр. ¡.¡Ув^ен едшишвдкр ки, дэккр ва • азот оксидакад заратдцги декане кошлекслер олан 2,03 кошлек-слера НО - ыун Ьхчезрелардэ сахланцаоыяш опадал формасыдир. Ькхтохиф шшон лигандаарын дааирап да- ьв ьоношзтрозил ксшг-лаксларинв дохал едалыесд ила кестаршгша.шр кя, йле биткиле-ран зэрп^гяарында ва бактеризалорда сербаст дег;.-,у вярдыр. Мгед-зек едагииишр ки, тохума п рапа ратла рында нитроаруссид донла-рцнш редуксвда парчаланиоск нетичьсандв ¿а рака и Га - иОгруп-лары зхлалларын тиол грулларц иле 2,03 кошлексларинв гсшулур. Ьучедрэдахали мсЬит Ьедвабла рш тара чиз'ерикде .таракан 2,03 кошлекслеранин садктуцуяа те сир еда р. Бу те сир 2,03 кош-лекслерии 5ИР сагналидын к -факторукун садмэтризесшша ромШк снмяетразаиша г еде у азалиаоывде езуюс кестэрвр. Гарз чизер 1тезрэлериаиц харичи терефлнде локелизе олунак 2,03 комола кодера & -факторун аисаал сишетрадаса млв характернее едщщрлер. Дэмиран тиол лаганла ры ила нитрозил кошлекслер Задатка си 1лаб-лиздвза сигарет тхтхпунхн займаси нвтпчасшщв дареная фазиоло-кп актив бирдешма алая азот оксддииич ишкер вдалмесанде иста$а-дв.олунуб. Бунуп есасында тхтхн тхотгм теркибиндэ олан азот оксадишш шгдары тв Зин етыек хчхн методика ишленяб Ьазирлан-мышдыр.

SUMMARY

Doctoral Thesis dedicate to the investigation of the dinitrosyl complexes of loosely hound form of ron-heme iron (free iron) with thiol group of proteins appeared in bacterial, vegetable and animal tissues by the using of the ESI?-method. These complexes are characterized by an ESR-3lgnal with Cav~2,03 and may be identified as 2,03 complexes according to the average value of the G-factor. The conception about stabilization role of non-hcrnc iron during nitrogen oxide functioning in cells and tissues was suggested on the bose of the studying the 2,03 complexes components -free iron end nitrogen oxide. It r/ns established that 2,03 complexes represent the optimal form of nitrogen oxide keeping in cells fend nicy be consideration as only form of free iron and nitrogen oxide binding. Ipon introduction a bivalent iron, into di~ and mo-nonitrosyl iron complexes with'different anion Uganda it wan shown that the plant leaves and bacterial preparations contain the free iron n.nd its. content provedi to be 4-5 jUg/p, of moist tiosue end 5-10 jitJk moist cell, For the fiat tine it was established that nitropruanide ions in cell's preparations subject to restoration disintegration and formed Fe-IiO groups which was included with thiol groups of proteins into 2,03 complexes. Restorers and thiol-consisting compounds con be influence on MO production from solutions of nitroprucside tmd nitroglycerine. The free nitrogen oxide was formed 2,03 complexes after disintegration of these compounds 'Wider thiol consisting ligands presenoe. The intracellular environment of snimrl livers influenced on the structure of 2,03 complexes formed in there and lead to lover of the uymmetry of these complexes ESR-signal's tensor of g-fsctor to rocbienl. lhe 2,03 completes localized on the external side of liver ceils 7,-ere characterized by the tensor of the g-factor of the ESR-aignal with axial eymmet-;.*y. The ir^n afcility to form nit.rcryl complexes T.ith thiol ligiinds wfts used for ths finding the physiologically*active compound -nitrogen oxide forming during tobacco burning. .The method of the quantitative calculation of nitrogen oxide containing in tobacco leaves smoke 7,am »Isbornted on this baee.