Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме"

На правах рукописи

Губкина Светлана Александровна

Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

--0404 169

Москва - 2009

003464169

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор

Рууге Энно Куставич

Научный консультант:

кандидат биологических наук Шумаев Константин Борисович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

Петрусевич Юрий Михайлович

доктор биологических наук, профессор

Панасенко Олег Михайлович

Ведущая организация:

Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Защита диссертации состоится 19 марта 2009 г. в «17» часов на заседании диссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, физический факультет, аудитория 5-19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени

к. .V « » \ С ГЛ V

(£« -.^Гг'гЧ* диссертационного сонй&Д 5&1-.йб2,11--А * £ доктор фгоиксьматемййй&кйх-наук-^'г " ц с п '<"• с

Автореферат разослав Ученый секретарь

Хомутов Г.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение процессов в которых участвуют активные короткоживущие молекулы, являющиеся регуляторами на различных уровнях организации живых организмов. К таким соединениям, в первую очередь, относятся оксид азота (N0) и его производные. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Кроме сигнальной роли N0, актуальной областью исследования являются реакции оксида азота с активными формами кислорода. Возникающие в этих реакциях активные соединения - пероксинитрит, диоксид азота, 1^02С1 и др. являются важными компонентами иммунного ответа в организме человека и животных, а также участвуют в процессах апоптоза. С другой стороны, изменение концентрации оксида азота под действием различных свободных радикалов и других высокореакционных интермедиатов служит важнейшим фактором, влияющим на физиологическую активность N0, в том числе на сигнальную функцию этой молекулы. Кроме того, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом: атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нейродегенеративные заболевания, катаракта, рак, диабет. Однако, взаимодействия активных форм кислорода с такими производными N0 как Б-нитрозотиолы (Я8М0) и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученными. Существенно, что сам оксид азота и 8-нитрозотиолы в различных модельных системах и в организме проявляют цитопротекторные и антиоксидантные свойства. Предполагается, что редокс-активные ионы железа связываются в составе нитрозильных комплексов, при этом ингибируются реакции свободно-радикального окисления биологических молекул. Известно также, что перекисное окисление липидов ингибируется благодаря взаимодействию N0 с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами и гемовыми группами некоторых белков.

В ходе ряда связанных с диабетом патологий окислительный стресс сочетается с карбонильным, возникающим в результате увеличения концентрации активных соединений, содержащих альдегидные и карбонильные группы. К этим соединениям относятся глиоксаль, метилглиоксаль, 3-гидроксиглюкозон, представляющие собой продукты окисления глюкозы и других сахаров. Активными карбонильными соединениями являются также малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль, возникающие при перекисном окислении липидов. Выше перечисленные соединения модифицируют аминокислотные остатки белков и азотистые основания нуклеиновых кислот, меняя свойства этих важнейших биомолекул. В литературе имеются противоречивые данные о влиянии карбонильного стресса на метаболизм оксида азота. Предполагают, что продукты взаимодействия активных карбонильных соединений с белками могут опосредованно влиять на активность МО-синтазы и в то же время непосредственно перехватывать N0. Тем не менее, механизм этих процессов остается не ясным. Известно, что в реакции метилглиоксаля с аминокислотами образуется супероксидный радикал. Поскольку супероксид чрезвычайно эффективно взаимодействует с оксидом азота, последний должен элиминироваться в ходе карбонильного стресса. В связи с этим, особый интерес представляет изучение взаимного влияния интермедиатов карбонильного стресса и физиологических метаболитов оксида азота (ДНКЖ и Б-нитрозотиолов). Из выше сказанного следует, что эти физиологические производные оксида азота могут играть чрезвычайно важную роль, как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов, сопровождающихся окислительным и карбонильным стрессом. Исследование механизмов процессов, происходящих с участием оксида азота, активных форм кислорода и карбонильных соединений, особо интересно, так как эти процессы являются пересечением ключевых регуляторных путей в клетках и тканях живого организма.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось выяснение роли оксида азота и динитрозильных комплексов железа при карбонильном и окислительном стрессе, а также исследование распределения оксида азота и его метаболитов в тканях и органах животных.

Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:

1. Выяснить физико-химические механизмы антиоксидантного действия ДНКЖ в различных модельных системах.

2. Изучить закономерности взаимодействия кислорода и азота в условиях, моделирующих карбонильный стресс.

3. Выяснить механизмы образования новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами взаимодействия метилглиоксаля со свободными аминокислотами.

4. Исследовать влияние ингаляционного введения N0 и влияние инъекций препарата ДНКЖ на уровень оксида азота в тканях разных органов.

Научная новизна диссертации.

1. Методом спектроскопии ЭПР выяснены закономерности взаимодействия низкомолекулярных и белковых динитрозильных комплексов железа с активными формами кислорода.

2. Установлен молекулярный механизм неферментативного образования супероксида при взаимодействии Ь-лизина с активным карбонильным соединением - метилглиоксалем.

3. Впервые обнаружены новые типы динитрозильных комплексов железа, лигандами которых являются продукты реакций метилглиоксаля с аминокислотами.

4. Выявлены особенности взаимодействия новых типов ДНКЖ и тиол-содержащих динитрозильных комплексов с компонентами крови.

5. Впервые изучено влияние различных методов введения оксида азота в организм экспериментальных животных на накопление в органах и тканях физиологических форм N0.

Научно-практическая значимость исследования.

Представленные в диссертации экспериментальные данные позволяют лучше понять роль оксида азота и его метаболитов в процессах модификации биомолекул активными формами кислорода и карбонильными соединениями и могут быть использованы для оптимизации применения препаратов доноров оксида азота (пролонгированные нитраты и другие) в условиях различных патологий, сопровождающихся окислительным и карбонильным стрессом.

Апробация результатов исследования и публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, еще 4 статьи в данный момент находятся в печати.

Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2005), IV и V международной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск. 2005, 2007), XIV, XV и XVI международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, 2006, 2007 и 2008), международной научной конференции и 6-ом, 7-ом, 8-ом съезде Белоруссокого общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006, 2007 и 2008), Vllth International Workshop on EPR. (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, 2007).

Структура и объем диссертационной работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных результатов и их обсуждения (главы 3 - 6), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 111 страниц, включая 39 рисунков и графиков, 1 таблицу и список литературы из 135 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит литературный обзор, посвященный активным формам кислорода, оксиду азота и его производным, а также активным карбонильным соединениям. Кратко изложены основные физико-химические свойства этих активных форм, описаны их источники в организме. В разделах 13 и 1.4 дана систематизация биологических функций оксида азота, обусловленных как прямым его взаимодействием с биомолекулами, так и влиянием N0 производных. Описана взаимосвязь между окислительным нитрозильным и карбонильным стрессами. Значительное внимание в обзоре уделено физиологическим метаболитам оксида азота: S-нитрозотиолам и динитрозильным комплексам железа. В разделе 1.5 описывается их обнаружение в организме, метаболизм и функции в биологических системах. Заканчивает главу раздел 1.6 о применении различных доноров оксида азота в медицине, в этом разделе рассматриваются также преимущества и недостатки ингляции воздухом с повышенным содержанием N0, как метода лечения пациентов при легочной гипертензии и связанных с ней заболеваний. Целыо обзора литературы было не только показать современное представление о разделе биофизики, посвященном свободным радикалам кислорода и азота, но и показать место данной работы в этом разделе, обосновать актуальность поставленных в ней задач.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования. В разделе 2.1 перечислены препараты, используемые в работе, описывается их получение. Раздел 2.2 посвящен регистрации спектров ЭПР и регистрации образования супероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-109Е фирмы Vanan (США). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл для TIRON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола

регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах по моделированию карбонильного стресса генерирование супероксидного анион-радикала (02") регистрировали по восстановлению супероксидом нитросинего тетразолия (НСТ). Кинетику накопления продукта восстановления НСТ - формазана определяли по поглощению при 560 нм на спекгрофотомере НкасЫ-557 (Япония) при температуре 25°. Реакцию инициировали добавлением 10 мМ метилглиоксаля или 10 мМ МДА к среде, содержащей 100 мкМ нитросинего тетразолия и 10 мМ Ь-лизина в 100 мМ карбонатном буфере рН 9,5.

В разделе 2.3 описывается методика исследования уровня оксида азота в тканях органов крыс после ингаляции воздухом с повышенным содержанием N0 и инъекции препарата динитрозильных комплексов железа с глутатионом. Эксперименты проводились на крысах \Vistar. Уровень оксида азота в тканях определяли с помощью спиновой ловушки, компоненты которой вводились животным путем инъекций: диэтилдитиокарбамат (ЛЕТС, 620 мг/кг в 1,0 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно) и РсЗО^НгО с цитратом Ка (25 и 125 мг/кг, соответственно, в 1,0 мл физиологического раствора, подкожно в область левого плеча). По окончанию физиологической части эксперимента, животных забивали и экстрагировали органы. Изолированные органы промывали в физиологическом растворе, после чего их измельчали и помещали в пластиковые трубки диаметром 5,0 мм, замораживали и хранили в жидком азоте. Спектры ЭПР всех образцов регистрировали при температуре жидкого азота. Амплитуда модуляции магнитного поля составляла 0,2 мТл при частоте 100 кГц. Частота СВЧ-поля составляла 9,32 ГГц, а её мощность во всех случаях устанавливалась на уровне 10 мВт. Раздел 2.4 посвящен описанию получения изолированных митохондрий и определению их функциональной активности. Митохондрии выделяли из сердец крыс. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массы животного). Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4°С) среду выделения. Состав среды выделения: 300 мМ сахароза, 10 мМ НЕРЕв (N-2-гидроксиэтилштеразин-!Ч-2-этансульфоновая кислота), 0,5 мМ ЕБТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); рН 7.4. Измельченную ткань переносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл среды выделения в

соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2-3 минута до превращения суспензии в гомогенную. Осаждение митохондрий производили в два этапа на центрифуге К-24 (ГДР). Полученный осадок митохондрий суспензировали в 150 мл БСА. Далее помещали в маленькую пробирку и хранили во льду или замораживали при -20°С. Концентрация белка в мшохондриалыюй суспензии, определенная по биуретовому методу, составляла 30-35 мг/мл.

В третьей и последующих главах представлены результаты исследований. Третья глава посвящена изучению антиоксидантных свойств ДНЮК в различных модельных системах. В качестве источника О2*" использовались митохондрии, в которых генерация супероксида индуцировалась ангамицином А. Образование Ог" в этих условиях фиксировалось с помощью спиновой ловушки TIRON. На рис. 1 показана деструкция глутатионовых ДНЮК при их инкубации с митохондриями из сердечной мышцы крыс в присутствии сукцината, в качестве субстрата, и антимицина А. При добавлении в систему супероксидцисмугазы (СОД) и каталазы скорость распада ДНЮК значительно снижалась. Этот факт указывает на то, что деструкцию ДНКЖ вызывает именно 02% генерируемый дыхательной цепью митохондрий.

Рис. 1. Деструкция ДНКЖ при генерации Ог*" митохондриями из сердца крысы.

(1) - инкубационная среда + 0,2 мМ ДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А + 5 мМ сукцината;

(2) - то же что и (1) + СОД (150 ед/мл) + каталаза (400 ед/мл).

Кроме супероксида в развитии окислительного стресса в организме человека и животных участвуют и другие соединения. Известно, что гемопротеиды стимулируют процессы перекисного окисления. В связи с этим, ангиоксйдантное действие ДНКЖ оценивалось по ингибированию образования в системе гемин/Н202 феноксильного радикала пробукола. Последний является синтетическим антиоксидантом близким по

Время, мин

структуре и механизму действия к а-токоферолу. Из рис. 2 видно, что ДНКЖ как с глутатионовыми так и с цистеиновыми лигандами, в молярных соотношениях сравнимых с Н2О2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикала пробукола. Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами несколько менее эффективны (-50% ингибирования). Из этого следует, что тиольные лиганды, как и N0, вносят вклад в снижение концентрации радикала пробукола. Представляется вероятным, что активные окислители, образующиеся при взаимодействии гемина с Н2О2 (оксоферрилформа гемина или гидроксильный радикал), перехватываются и нейтрализуются динитрозильными комплексами.

Рис. 2. Влияние ДНКЖ с различными лигандами на образование радикала пробукола. Реакционная смесь содержала: изопропанол/КД^а-фосфатный буфер, 1,5 мМ пробукола и 0,25 мМ гемина.

1 - спектр ЭПР феноксильного радикала пробукола, образовавшегося после добавления в реакционную среду 2 мМ Н202;

2 - то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих цистеин;

3 - то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих глутатион;

4 - то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ с фосфат-анионом в качестве лиганда.

Приведенные выше модельные системы касались в первую очередь низкомолекулярных дишпрозильных комплексов. Но в литературе уже давно обсувдается вопрос о возможной роли и функциях 8-нитрозотиолов и дишпрозильных комплексов, связанных с белками. Такая уникальная молекула, как гемоглобин способна связывать N0 тремя разными способами. Оксид азота нитрозшшрует гем может входить в состав 8-нитрозогемошобина

(белковый ¡З-гоггрозогиол) и, наконец, по цистеиновым остаткам может формироваться ассоциированный с гемоглобином диншрозильный комплекс железа (НЬ-ДНКЖ). Этот комплекс имеет характерный спектр ЭПР (рис. 3, спектр 1). Для понимания роли супероксида и роли таких ингермедиатов окислительного стресса как органические

д=2,003

324 325 326 327 328 329

Магнитное поле, мТл

гацропероксцды в метаболизме этого типа ДНКЖ, исследовалось взаимодействие гемоглобиновых ДНКЖ с О2" и щдропероксидом трст-бупиа. Как видно из рис. 3, при взаимодействии гемоглобиновош ДНКЖ с гидропероксидом трет-бутила происходит зависимая от концентрации последнего деструкция НЬ-ДНКЖ. При этом гидрофильный атиоксидатгг - аскорбаг защищает эти комплексы.

Рис. 3. Деструкция гемоглобиновых ДНКЖ под действием пщропероксида трет-бутила; (1) - НЬ-ДНКЖ, получаемые при смешивании 03 мМ фосфатных ДНКЖ с 20 мМ НЬ в 2 М N8-фосфагаом буфере (2,5 мин. инкубации); (2) - (1) + ОД мМ ЮООН; (3) - (1) + 0,4 мМ I-ВООН; (4) - после МЮОН добавлен аскорбат 8 мМ.

Вероятнее всего деградация НЬ-ДНКЖ происходит в результате образования оксофериллформы гемоглобина и перекисного радикала трет-бутила.

Четвертая глава посвящена изучению окислительной модификации белков и других биомолекул при карбонильном стрессе. В качестве модели была использована система взаимодействия Ь-лизина и метилглиоксаля. В результате такого взаимодействия в анаэробных условиях происходит образование свободнорадикальных интермедиатов, регистрирующихся методом ЭПР. Их спектр имеет многокомпонентную сверхтонкую структуру и, по литературным данным, является суперпозицией спектров анион-радикала метилглиоксаля (МГ~) и катион-радикала диалкилимина. На рис. 4 представлены последовательности реакций, приводящие к образованию свободных радикалов при взаимодействии аминокислот с карбонильными соединениями. Видно, что диалкилимин представляет собой основание Шиффа (имин), возникающее в процессе взаимодействия карбонильных групп метилглиоксаля с двумя молекулами Ь-лизина. В реакции диалкилимина с ещё одной молекулой а-кетоальдегида образуются, соответственно, катион-радикал основания Шиффа и семидион метилглиоксаля (МГ~)-

310 315 320 325 330

лизин н3С I

2 H2NCH(R)COO- + ^—\

метилглиоксаль H,CV ,Н

О

О

анион-радикал метилглиоксаля

продукты конечного гликирования

Н3С.

X

.н

М

-OOC(R)HUN Т» NUH(R)COO-катион-радикал диалкилимина метилглиоксаля

о

-OOC(R)HCN NCH(R)COO-

диалкилимин метилглиоксаля

Рис. 4. Схема возможных реакций L-лизина с метилглиоксалем.

Важно отметить, что в условиях аэрации реакционной смеси нами зарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов. Замена газовой среды на азот после инкубации смеси метилглиоксаля с L-лизином в аэробных условиях приводит к значительному (почти на порядок) росту уровня свободных радикалов, предположительно диалкилимши и метилглиоксаля. Существенно, что в этих условиях содержание свободнорадикальных интермедиатов возрастало при добавлении СОД к реакционной смеси. Вызываемый СОД эффект связан с тем, что этот фермент удаляет супероксидный радикал, генерируемый в исследуемой модельной системе. В работе показано, что 02"~ интенсивно генерируется при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем в карбонатном буфере pH 9,5. Оценку образования супероксида проводили по накоплению формазана при восстановлении HCT. Исходя из того, что СОД значительно (более чем в 4 раза) подавляла образование формазана в описанных условиях, можно утверждать, что большая часть HCT восстанавливается под действием Снижение концентрации регистрируемых методом ЭПР свободных радикалов в аэрируемой реакционной среде, вероятно, не связано с ингибированием их образования. Представляется вероятным, что свободно-радикальные интермедиаты непосредственно реагируют с кислородом, в следствии чего образуются нерадикальные продукты и супероксид.

МГ + 02-> МГ + ОТ (1)

Диалкилимин"* + 02 —> Диалкилимин+2 (дикатион) + 0{~ (2) Таким образом, вероятно, что окислительная модификация белков и других биомолекул может быть следствием локального генерирования Ог~ при

взаимодействии остатков Ь-лизина (и, по-видимому, других аминокислот) с а-, кетоальдегидами. Этот феномен нефермекшивного генерирования супероксида может быть элементом автокаталитического усиления патофизиологического действия карбонильного стресса.

В пятой главе описывается образование новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами реакции метилглиоксаля с цистеином и Ь-лизииом. В присутствии избытка метилглиоксаля в реакционной среде, содержащей фосфатный буфер и цистеиновые ДНКЖ, исчезает характерный для этих комплексов спектр ЭПР с g фактором равным 2,03 (рис. 5, спеюр а), но появляется сигнал фосфатных ДНКЖ и новый сигнал ЭПР с g фактором равным 2,018 (рис. 5, спектр Ъ).

Рис. 5. Спектры ЭПР различных типов ДНКЖ. (а) - 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ; (Ь) - 100 мМ метилглиоксаля + 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ; (с) - 50 мМ цистеина + 150 мМ метилглиоксаля, после 5 мин инкубации добавлены фосфатные ДНКЖ; (d) - то же что и (Ь) + 1,5 мМ батофенантролина. Все реакционные смеси содержали 150 мМ Na-фосфэгный буфер (рН 7,2). Спектры ЭПР регистрировались через 8 мин инкубации при постоянной продувке азотом.

Этот сигнал, имеющий хорошо разрешённую сверхтонкую струзауру из семи компонент, возникает также при добавлении фосфатных ДНКЖ в реакционную среду, содержащую цистеин и метилглиоксаль (рис. 5, спектр с). Новый сигнал, как и

а

318

320 322 324 326 318

Магнитное поле, мТл

320 322 324 326

Магйитное поле, мТл

спектры ЭПР исходных динтрозильных комплесов, исчезает в присутствии хелатора железа - батофенантролина (рис. 5, спектр с1). Эти факты указывают на образование нового типа диншрозштьных комплексов железа (ДНКЖ-цис/МГ). В то же время при взаимодействии с метилглиоксалем глутатионовых ДНКЖ снижается интенсивность сигнала ЭПР, характерного для комплексов с тиольными лигандами, но сигналы нового типа не возникают. Существенно, что при добавлении фосфатных ДНКЖ к реакционной среде, содержащей мотилглиоксаль и Ы-ацеггалцистеин, также не происходит образования нового типа ДНКЖ. Таким образом, модификация аминогруппы цистеина предотвращает образование входящих в состав ДНКЖ-цис/МГ лигандов. Представляется вероятным, что такими лигандами могут быть основания Шиффа, образующиеся в реакции карбонильных груш метилглиоксаля с а-аминогруппой цистеина. Известно, что. основания Шиффа могут участвовать в формировании комплексов металлов переменной валентности. Взаимодействие метилглиоксаля с тиольными лигандами ДНКЖ может быть затруднено, так как атомы серы в этих комплексах образуют координационные связи с ионом железа. Тем не менее, эффективно модифицирующий БН-груллы агент - М-эшлмалеимид (ИЕМ) предотвращает образование ДНКЖ-цис/МГ в реакционной смеси, содержащей метилглиоксаль и цистеиновые ДНКЖ (рис. 6, спектр 1). При этом, под действием №М, цистеиновые ДНКЖ превращаются в фосфатные дишпрозильные комплексы (рис. 6, спектры 1,2).

Рис. 6. (1) -1,8 мМ цисгеиновых ДНКЖ + 24 мМ КЕМ + 4В мМ метилглиоксаля;

(2) -1,8 мМ цисгеиновых ДНКЖ+24 мМ КЕМ;

(3) -1,8 мМ цисгеиновых ДНКЖ + 48 мМ метилглиоксаля, после 5 мин инкубации добавлены 24 мМ ЫБМ;

(4)-1,8 мМглуитмовьк ДЕЖЖ+24мМКЩ

(5) -1,8 мМ глутатионовых ДНКЖ + 48 мМ метилглиоксаля, после 5 мин инкубации добавлены 24 мМ №М.

Все реакционные смеси содержали 100 мМ Ма-фосфапгом буфер (рН 7,2). Спектры ЭПР регистрировались через 8 мин инкубации при постоянной продувке азотом.

и»/

V Аи

--- 4 __^ Иг-

Я —

319 320 321 322 323 324 325

Магнитное поле, мТл

В то же время добавление NEM поете инкубации цистеиновых ДНЮК е метилглиоксалем не влияет на образование ДНКЖ-цис/МГ (рис. 6, спектр 3). Таким образом, ковалетная модификация тиольных групп N-этилмалеимидом разрушает цисггеиновые ДНЮК, но не новый тип динитрозильных комхшексов железа. Эти факты свидетельствуют, что и образование гемигаоацеталя, в ходе реакции метилглиоксаля с SH-группой цистеина, необходимо для формирования ДНКЖ-цис/МГ. Следует отметить, что фосфатные ДНЮК образуются и при взаимодействии NEM с глугатионовыми ДНЮК, но их концентрация существенно меньше (приблизительно в 7 раз), чем в случае с цистеиновыми комплексами. Интересно, что образование фосфатных ДНЮК в этих условиях не зависит от присутствия метилглиоксаля (рис. 6, спектры 4, 5). Исходя из этого, можно предположить, что сера глугатионовых лигандов ДНЮК, в отличии от цистеиновых лигандов, менее доступна модификации NEM. На рис. 7 представлены спектры ЭПР цистеиновых ДНЮК и ДНКЖ-цис/МГ, зарегистрированные при температуре жидкого азота. По литературным данным, форма низкотемпературного спектра ЭПР ДНКЖ-цис/МГ, характерна доя комплексов, имеющих октаэдрическую пространственную структуру, в отличии от ромбической структуры, характерной дая ДНЮК с цистеиновыми и глугатионовыми лигацдами.

Рис. 7. Спектры ЭПР при температуре жидкого азота.

а - цистеиновые ДНКЖ; б - производных цистеиновых ДНКЖ с метилглиоксалем (ДНКЖ-цис/МГ).

Сигнал ЭПР с g фактором равным 2,018 также возникает в реакционной смеси, содержащей лизин, металглиоксаль, фосфатные ДНКЖ или синтетические доноры оксида азота (DETA/NO, PAPA/NO) в сочетании с ионами Рег+(рис. 8). Видно, что спектр ЭПР динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ-лиз/МГ), возникающих при взаимодействии метилглиоксаля с лизином, имеет менее разрешенную

структуру. В то же время сигналы ЭПР ДНКЖ-лю'МГ не регистрируются при замене лизина на №ацетиллизип. Таким образом, а-аминогруппа лизина аналогично ДНКЖ-цис/МГ необходима для образования входящею в состав ДНКЖ-лш/МГ лиганда. Скорее всего, в координации ионов железа в этих комплексах участвует азот основания Шиффа и а-карбоксильная группа аминокислоты.''

Рис. а Спектры ЭПР ДНКЖ, зарегистрированные через 5 мин после добавления к смеси лизина с метилглиоксалем доноров оксида азота.

(1) - реакционная смесь + 0,5 мМ фосфатных ДНКЖ;

(2) - реакционная смесь + 7,5 мМ БЕТА/КО.. В последнем случае в реакционную смесь также добавляли 0,5 мМ Ге504.

Существенно, что в условиях аэрации реакционной среды ДНКЖ-лиз/МГ быстро разрушается, при этом скорость деструкции этого комплекса

уменьшается в присутствии СОД (рис. 9). Этот факт согласуется с полученными нами данными о интенсивной генерации

0=2,018

1 /II V

315 320 325 330 Магнитное поле, мТл

супероксида в ходе взаимодеиствия лизина с метилглиоксалем.

аэрация

Рис. 9. Кинетика деструкции ДНКЖ-лиз/МГ в условиях аэрации.

(1) - в присутствии СОД (600 ед./мл);

(2) - без добавок.

о. с о

о

1,2 1,0 0,8' 0,6 0,4 • 0,2 о,он

6 8 10 12 Время, мин

В шестой главе, в разделе 6.1 описано взаимодействие низкомолекулярных динитрозильных комплексов железа с компонентами крови животных. Предполагается, что одной из основных функций ДНКЖ в организме животных является транспорт оксида азота в кровеносной системе. В связи с этим, представляло несомненный интерес исследование взаимодействия низкомолекулярных ДНКЖ с компонентами крови. С этой целью цистеиновые ДНКЖ и их производные с мстилглиоксалем добавлялись в образцы гепаринизированной крови, отобранные у экспериментальных животных. В контроле ДНКЖ добавлялись в физиологический раствор.

Рис. 10. Введение цистеиновых ДНКЖ в цельную кровь.

1 - ДНКЖ в физиологическом растворе (отношение железа к цистсину 1:20);

2 - крысиная кровь+ДНКЖ;

3 - плазма (кровь после добавления ДНКЖ инкубировали в течении 7 мин. и далее фракционировали);

4 - эритроцитарная масса (из крови, содержавшей ДНКЖ) ресуспензированая в физиологическом растворе.

В цельной крови и плазме цистеиновые ДНКЖ (спектр 1) полностью переходят на белковые компоненты, при этом возникает сигнал, характерный для белковых ДНКЖ с аксиальной симметрией (спектры 2 и 3), в которых железо связано с двумя тиольными лигандами. Введение в образцы цельной крови ДНКЖ-цис/МГ, также приводит к образованию белковых ДНКЖ (рис. 11, спектр 2). Однако, эти ДНКЖ имеют ромбическую симметрию. Более низкая симметрия этих комплексов обусловлена тем, что железо в них координировано разными лигандами, вероятно, цистеином и гисгидином. Известно, что такие сигналы характерны для ДНКЖ, связанных с альбумином.

Таким образом, более низкая симметрия белковых комплексов, возникающих в цельной крови и плазме, под действием ДНКЖ-цис/МГ, подтверждает, что в составе

1<Лл1 Модуляция 2 Гс г

V 4 Гс

\ V 4 Гс .„г,..,„.ч.,-

< ^Л/ 4 Гс

316 320 324 328

Магнитное поле, мТл

последних нет свободных тиольных групп. В то же время следует отметить что как цисгеиновые ДНКЖ, так и ДНКЖ-цис/МГ не вызывают образования динитрозильных комплексов, связанных с эритроцитами.

Рис. 11. Введение ДНКЖ-цис/МГ в цельную кровь. ДНКЖ-цис/МГ получены при обработке метилглиоксалем цистеиновых ДНКЖ (1:20).

1 - ДНКЖ-цис/МГ в физиологическом растворе;

2 - крысиная кровь + ДНКЖ-цис/МГ;

3 - плазма (кровь после добавления ДНКЖ инкубировали в течении 7 мин. и далее фракционировали);

4 - эритроцитарная масса (из крови, содержавшей ДНКЖ) ресуспензированая в физиологическом растворе.

В разделе 6.2 описано исследование избирательного мониторинга уровня N0 в тканях важнейших органов в контроле, и его изменение в результате 30-минутной ингаляции воздухом с повышенным содержанием N0. Работа проводилась методом ЭПР с применением в качестве спиновой ловушки N0 липофильных комплексов ионов железа и диэтилдитиокарбамата (Ре^-ИЕТСз), способных формироваться и накапливаться в гидрофобных компонентах клеток органов. Известно, что такие комплексы способны эффективно взаимодействовать с низкомолекулярным N0 с образованием парамагнитных аддуктов МО-Ре2+-ОЕТС2. Поэтому для регистрации уровня N0 проводилось исследование образцов ткани органов животных с включённой в них спиновой ловушкой.

На рис. 12 представлены полученные при температуре жидкого азота характерные спектры ЭПР образцов ткани органов крыс из контрольной группы в области g=2,04. Из этого рисунка видно, что во всех спектрах регистрируется триплет из узких эквидистантных линий в области g=2,04 (компоненты е, £,)). Этот триплетный сигнал отражает появление в образцах квазистабильных

316 320 324 328

Магнитное поле, мТл

парамагнитных аддуктов ЫО-Ре2+-13Е'ГС2, образующихся в результате взаимодействия молекул ловушки и короткоживущего радикала оксида азота.

Рис. 12. Спектры ЭПР образцов замороженной ткани органов крыс из контрольной группы. 1 - сердце, 2 - лёгкое, 3 - печень, 4 - почка, 5 - скелетная мышца. Температура - жидкий азот.

4

5

3

1

2

320

325

330

335

340

Для количественных оценок уровня N0 в ткани исследуемых органов для всех образцов рассчишвали амплшуду высоколсшьной компонент спектра ЭПР этого адаукга (1ь рис. 12), с нормировкой на массу ткани в акпшной зоне резонатора спектрометра. Значения таких параметров (Ы), усреднённые для всех животных из котрольной группы, представлены на рис. 13.

Максимальные значения параметра N получены для образцов ткани печени животного. Но нельзя исключить, что этот эффект связан с более высоким содержанием ловушки N0 в ткани печени, по сравнению с другими органами, вследсгеии более эффективного переноса компонентов

комплексов Ре^-ОЕТСэ из крови в печень. 5 0--]-

Образцы ткани органов крыс, получавших ингаляцию воздухом с высоким содержанием N0, исследовались

Рис. 13. Усреднённые значения параметра N (отношение амплитуды высокопольной компоненты спектра ЭПР Ш-1'е2+-ВЕТС2 к массе образца ткани в активной зоне резонатора спектрометра). 1 - сердце, 2 -лёгкое, 3 - печень, 4 - почка,

5 - скелетная мышца.

1 2 3 4 5

по аналогичной методике. В результате ингаляции наибольшее увеличение содержания оксида азота регистрируется в сердце, лёгких и печени животного, а для почки и скелетной мышцы данный эффект практически отсутствует (рис. 14.). В целом можно сделать вывод, что в результате длительной ингаляции воздухом с повышенным содержанием оксида азота наблюдается существенное увеличение содержания N0 в гидрофобных областях клеток органов малого круга кровообращения (сердце, лёгкое) и в печени.

исследование изменения уровня N0 в

организме в результате внутривенного введения препарата ДНКЖ с лигавдами глугатиона. На рис. 15 представлены характерные спектры ЭПР цельной крови животного непосредственно после инъекции препарата ДНКЖ (спектр 1), а также в конце опыта (спеюр 2). Полученные в начале опыта сигналы соответствуют ДНКЖ, связанными с высокомолекулярными тиол-содержащими лигандами (альбумин, гемоглобин). К концу опыта регистрировались компоненты остаточного парамагнитного ДНКЖ. При этом положение и форма линий этого комплекса соответствовали сигналу, полученному в начале опыта, а его амплитуда была ниже, что отражает распад этих комплексов в крови и/или их выход из кровотока в ткань органов. Кроме этого, в спегаре 2 (рис. 15) в области |^=2,03 регистрируются три узкие эквидистаншые линии, которые, как известно, принадлежат парамагнитному спиновому адцуюу КО-Ре2+-ПЕТС2, образующемуся в результате взаимодействия спиновой ловушки и радикала N0. Вероятно, что после введения в организм спиновой ловушки, в липидных компонентах эритроцитов формируются комплексы Ре^-ЭЕТСз, которые далее переходят в ЫО-Ре2+-БЕТСг, в результате взаимодействия с N0. Следовательно, в ходе эксперимента, после

120

В разделе 63 описано

СЕРДЦЕ ЛЁГКОЕ ПЕЧЕНЬ ПОЧКА МЫЩА

инъекции нюкомолекулярнош ДНЮК в кровоток, происходит его переход на высокомолекулярные лиганды с последующим медленным распадом этих комплексов, в результате чего часть молекул ловушки переходит в форму парамагнитного аддукта N0.

Рис. 15. Спектры ЭПР цельной крови животного после введения ДНЮК (1) и через 30 мин (2). а, Ь, с -компоненты спектра ЭПР NO-Fe2'-ДЭТК2.

о. с 0

Е

310 315 320 325 330 Магнитное поле, иТп

Значения этих соотношений, соответствующих всем органам, представлены на рис. 16.

Рис. 16. Влияние введения ДНКЖ _ на уровень N0 в ткани различных £

органов. 2

1-сердце; 2-лёгкое; г

3-печень; 4-почка; с?

5-скелетная мышца. I

3 2

Видно, что в результате введения ДНКЖ происходит интенсивное увеличение уровня N0 в тканях всех исследуемых органов, но наиболее сильно этот эффект выражен для сердца и печени животного. Меньший эффект наблюдался для почки, а для лёгкого и скелетной мышцы увеличение уровня N0, в результате введения ДНКЖ, было минимальным, по сравнению с другими органами.

В заключении подведены итоги и сформулированы выводы диссертационной работы.

выводы

1. Показано, что тиол-содержащие динитрозильные комплексы железа проявляют антноксидантные свойства в различных модельных системах, реагируя с супероксидом и органическими радикалами.

2. Показано, что при взаимодействии Ь-лизина с интермедиатом карбонильного стресса метилглиоксалем в условиях близких к физиологическим, происходит неферментативное образование органических свободных радикалов и супероксидного анион-радикала.

3. Установлено, что продукты взаимодействия Ь-цистеина и Ь-лизина с метилглиоксалем могут быть лигандами для новых типов динитрозильных комплексов железа.

4. Показано, что новый тип динитрозильных комплексов железа, лигандом которого являются модифицированный метилглиоксалем цистеин, при введении в кровь образует белковые динитрозильные комплексы с компонентами плазмы, но не с эритроцитами.

5. Установлено, что в результате длительной ингаляции воздухом с повышенным содержанием оксида азота наблюдается существенное увеличение содержания N0 в гидрофобных зонах клеток органов малого круга кровообращения (сердце, легкое) и в печени.

6. Показано, что в результате введения глутатионовых динитрозильных комплексов железа происходит интенсивное увеличение уровня N0 в ткани всех исследуемых органов, наиболее сильно этот эффект выражен для сердца и печени животного.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Шумаев К.Б., Губкина СЛ., Гудков JI.JI., Лакомкин В.Л., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие связанных с альбумином динитрозильных комплексов железа и активных форм кислорода // Биофизика 2007. Т. 52 (3). С. 534-538.

2. Гудков Л.Л., Шумаев К.Б., Каленикова Е.И., Губкина С.А., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Антиоксидантное и прооксидантное действие доноров и метаболитов оксида азота// Биофизика 2007. Т. 52 (3). С. 503-509.

3. Шумаев К.Б., Губкин A.A., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Тимошин A.A., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса // Биофизика 2006. Т. 51 (3). С. 472-477.

4. Шумаев К.Б., Космачевская О.В., Губкина С.А., Топунов А.Ф. Модификация гемопротеидов метилглиоксалем. Влияние активных форм азота // Материалы XVI международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2008) С. 386-387.

5. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Исследование динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР // Материалы XVI международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2008) С. 384-386.

6. Шумаев К.Б., Гудков Л.Л., Губкина С.А., Кумскова Е.М., Рууге Э.К., Космачевская О.В., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф. Роль метаболитов оксида азота в условиях моделирующих окислительный и карбонильный стресс // Международной научная конференция и 8-ой съезд Белоруссокого общественного обединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 25-27 июня 2008) Сборник статей. Т. 2. С. 164-166.

7. Тимошин A.A., Дроботова Д.Ю., Губкина С.А., Орлова Ц.Р., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Парамагнитные дииитрозильные комплексы железа в организме млекопитающих // Международная научная конференция и 8-ой съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 25-27 июня 2008). Сборник статей. Т. 2. С. 143-145.

8. Timoshin A A, Dobrotova D.Yu., Gubkina SA., Vanin A.F., Ruuge EX. Effect of NO donois and acute regional cardiac ischemia on NO level in rat organs: an EPR study // Vllth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, 3-6 October 2007). Abstracts. P. 76.

9. Шумаев КБ., Губкина C.A., Гудков JIJL, Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге ЭК., Лаикин В.З. Возможные механизмы регенерацииоксида азота из продуктов его взаимодействия с активными формами кислорода // Материалы XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007). С. 403-405.

10. Губкина С.А., Шумаев КБ., Рууге Э.К., Космачевская О.В., Ланкин В.З., Топунов А.Ф., Вашш А.Ф. Действие оксида азота на модификацию аминокислот мешлглиоксалем // 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием <Акгивные формы кислорода, оксид азота, антиоксидашы и здоровье человека» (Смоленск, 18-22 сентября 2007). Сборник трудов. С. 22-23.

11. Тимошин А А, Орлова Ц.Р., Губкина CA., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Регистрация оксида азота в ткани органов после инъекции диншрозильных комплексов железа, а также ингаляции NO // 5-я национальная научно-пракгаческая конференция с международным участием (Активные формы кислорода, оксид азота, ангаоксиданш и здоровье человека» (Смоленск, 18-22 сентября 2007). Сборник трудов. С. 191-193.

12. Рууге Э.К., Свиряева И.В., Губкина CA, Шумаев КБ. Митохондрии сердца: ответ на патологический стресс И Научная конференция МГУ «Ломоносовские чтения», секция физики (Москва, 17-27 апреля 2006). С. 107-108.

13. Рууге Э.К., Шумаев КБ., Губкин A.A., Губкина CA, Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Топунов А.Ф. Влияние ионов железа и железосодержащих белков на взаимодействие метаболитов оксида азота с активными формами кислорода // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 21-23 июня 2006). Сборник статей. Т. 2. С. 236-238.

14. Свиряева И.В., Рууге Э.К., Губкина CA, Шумаев КБ. Ответ митохондрий сердца на патологический стресс // Международная даучная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 21-23 июня 2006). Сборник статей, Т. П. С. 239-241.

15. Шумаев КБ, Губкина С. А, Губкин АА, Гудков Л Л., Ланкин В.З., Ванин АФ. Аншоксидшпные и прооксидашные свойства метаболитов оксвда азота // Материалы XIV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 31 мая -9июня 2006). С. 416-417.

16. Шумаев К.Б., Губкина СЛ., Губкин A.A., Гудков Л.Л., Каленикова Е.И., Топунов А.Ф., Рууге Э.К. Антиоксидантная роль производных оксида азота, содержащих катион нитрозония // II Евразийский конгресс по медицинской физике «Медицинская физика - 2005» (Москва, 21-24 июня 2005). Сборник материалов. С. 304-305.

17. Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф., Губкина С.А., Губкин A.A., Гудков Л.Л., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Ланкин В.З., Рууге Э.К. Взаимодействие с активными формами кислорода как механизм антиоксидантного действия динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона // 4-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 26-30 сентября 2005). Сборник трудов. С. 114-115.

18. Рууге Э.К., Свиряева И.В., Губкина С.А., Шумаев К.Б. Митохондриальные болезни: современные концепции // 4-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 26-30 сентября 2005). Сборник трудов. С. 150-151.

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Губкина, Светлана Александровна

Условные обозначения и сокращения.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Биохимия оксида азота.

1.2. Активные формы кислорода.

1.3. Источники активных форм кислорода и азота в биологических системах.

1.3.1. NO-синтазы.

1.3.2. Образование активных форм кислорода митохондриями.

1.3.3. Ксантиноксидоредуктаза.

1.4. Функции оксида азота в биологических системах.

1.5. Карбонильный стресс и его взаимосвязь с окислительным стрессом.

1.6. Физиологические доноры оксида азота.

1.6.1. S-нитрозотиолы.

1.6.2. Динитрозильные комплексы железа.

1.6.3. Физиологические функции ДНКЖ и S-нитрозотиолов.

1.7. Использование оксида азота в медицине.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Получение препаратов.

2.2. Регистрация спектров ЭПР и регистрация образования супероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса.

2.3. Методика исследования уровня и распределения оксида азота в тканях и органах животных.

2.4. Получение изолированных митохондрий.

Глава 3. Антиоксидантные свойства ДНКЖ.

Глава 4. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем.

Глава 5. Образование новых типов ДНКЖ при моделировании карбонильного стресса.

Глава 6. Исследование уровня и распределения оксида азота и его производных в тканях и органах животных.

6.1. Преобразование различных типов ДНКЖ при их введении в кровь.

6.2. Ингаляция воздухом с повышенным содержанием NO.

6.3. Изменение уровня NO в тканях органов крыс после инъекции глутатионовых ДНКЖ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме"

В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение процессов, в которых участвуют активные короткоживущие молекулы, являющиеся регуляторами на различных уровнях организации живых организмов. К таким соединениям, в первую очередь, относятся оксид азота (NO) и его производные. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Кроме сигнальной роли NO, актуальной областью исследования являются реакции оксида азота с активными формами кислорода. Возникающие в этих реакциях активные соединения - пероксинитрит, диоксид азота, N02C1 и др. являются важными компонентами иммунного ответа в организме человека и животных, а также участвуют в процессах апоптоза. С другой стороны, изменение концентрации оксида азота под действием различных свободных радикалов и других высокореакционных интермедиатов служит важнейшим фактором, влияющим на физиологическую активность NO, в том числе на сигнальную функцию этой молекулы. Кроме того, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом: атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нейродегенеративные заболевания, катаракта, рак, диабет. Однако, взаимодействия активных форм кислорода с такими производными NO как S-нитрозотиолы (RSNO) и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученными. Существенно, что сам оксид азота и S-нитрозотиолы в различных модельных системах и в организме проявляют цитопротекторные и антиоксидантные свойства [1]. Предполагается, что редокс-активные ионы железа связываются в составе нитрозильных комплексов, при этом ингибируются реакции свободно-радикального окисления биологических молекул. Известно также, что перекисное окисление липидов ингибируется благодаря взаимодействию NO с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами и гемовыми группами некоторых белков.

В ходе ряда связанных с диабетом патологий окислительный стресс сочетается с карбонильным, возникающим в результате увеличения концентрации активных соединений, содержащих альдегидные и карбонильные группы. К этим соединениям относятся глиоксаль, метилглиоксаль, 3-гидроксиглюкозон, представляющие собой продукты окисления глюкозы и других Сахаров. Активными карбонильными соединениями являются также малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль, возникающие при перекисном окислении липидов. Выше перечисленные соединения модифицируют аминокислотные остатки белков и азотистые основания нуклеиновых кислот, меняя свойства этих важнейших биомолекул [2-3]. В литературе имеются противоречивые данные о влиянии карбонильного стресса на метаболизм оксида азота. Предполагают, что продукты взаимодействия активных карбонильных соединений с белками могут опосредованно влиять на активность NO-синтазы и в то же время непосредственно перехватывать NO. Тем не менее, механизм этих процессов остается не ясным. Известно, что в реакции метилглиоксаля с аминокислотами образуется супероксидный радикал [4]. Поскольку супероксид чрезвычайно эффективно взаимодействует с оксидом азота, последний должен элиминироваться в ходе карбонильного стресса. В связи с этим, особый интерес представляет изучение взаимного влияния интермедиатов карбонильного стресса и физиологических метаболитов оксида азота (ДНКЖ и S-нитрозотиолов). Из выше сказанного следует, что эти физиологические производные оксида азота могут играть чрезвычайно важную роль, как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов, сопровождающихся окислительным и карбонильным стрессом. Исследование механизмов процессов, происходящих с участием оксида азота, активных форм кислорода и карбонильных соединений, особо интересно, так как эти процессы являются пересечением ключевых регуляторных путей в клетках и тканях живого организма.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось выяснение роли оксида азота и динитрозильных комплексов железа при карбонильном и окислительном стрессе, а также исследование распределения оксида азота и его метаболитов в тканях и органах животных.

Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:

1. Выяснить физико-химические механизмы антиоксидантного действия ДНКЖ в различных модельных системах.

2. Изучить закономерности взаимодействия активных форм кислорода и азота в условиях, моделирующих карбонильный стресс.

3. Выяснить механизмы образования новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами взаимодействия метилглиоксаля со свободными аминокислотами.

4. Исследовать влияние ингаляционного введения NO и влияние инъекций препарата ДНКЖ на уровень оксида азота в тканях разных органов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Губкина, Светлана Александровна

Выводы.

1. Показано, что тиол-содержащие динитрозильные комплексы железа проявляют антиоксидантные свойства в различных модельных системах, реагируя с супероксидом и органическими радикалами.

2. Показано, что при взаимодействии L-лизина с интермедиатом карбонильного стресса метилглиоксалем в условиях близких к физиологическим, происходит неферментативное образование органических свободных радикалов и супероксидного анион-радикала.

3. Установлено, что продукты взаимодействия L-цистеина и L-лизина с метилглиоксалем могут быть лигандами для новых типов динитрозильных комплексов железа.

4. Показано, что новый тип динитрозильных комплексов железа, лигандом которого являются модифицированный метилглиоксалем цистеин, при введении в кровь образует белковые динитрозильные комплексы с компонентами плазмы, но не с эритроцитами.

5. Установлено, что в результате длительной ингаляции воздухом с повышенным содержанием оксида азота наблюдается существенное увеличение содержания NO в гидрофобных зонах клеток органов малого круга кровообращения (сердце, легкое) и в печени.

6. Показано, что в результате введения глутатионовых динитрозильных комплексов железа происходит интенсивное увеличение уровня N0 в ткани всех исследуемых органов, наиболее сильно этот эффект выражен для сердца и печени животного.

Заключение.

На основании полученных результатов, можно заключить, что различные типы ДНКЖ в большинстве исследованных модельных системах проявляют антиоксидантные свойства. Быстрый распад как низкомолекулярных, так и белковых динитрозильных комплексов под действием активных форм кислорода позволяет предположить, что эти соединения способны защищать другие биологические молекулы от деструкции в ходе окислительного стресса При этом, вероятно, в отличие от взаимодействия свободного N0 с супероксидом, не образуется таких токсичных соединений, как пероксинитрит. Подобный механизм взаимодействия ДНКЖ и активных форм кислорода делает возможным регуляцию различных физиологических функций оксида азота через изменение его концентрации в результате деструкции динитрозильных комплексов железа. Реакции ДНКЖ с оксоферрилформами гема могут также защищать компоненты клетки от окислительной модификации, т. е. имеют антиоксидантное значение.

Интересен факт образования новых типов динитрозильных комплексов при взаимодействии активного карбонильного соединения - метилглиоксаля - со свободными аминокислотами. Из полученных данных следует, что при взаимодействии цистеиновых Д НКЖ с метилглиоксалем не происходит разрушения этих комплексов, более того они преобразуются в новый тип ДНКЖ. При этом оксид азота и ионы железа в основном остаются связанными в составе ДНКЖ-цис/МГ. Новый комплекс, как и цистеиновые ДНКЖ, является хорошим донором Fe-(NO)2 для белков плазмы крови. Таким образом, в условиях карбонильного стресса ДНКЖ-цис/МГ могут выполнять функции аналогичные низкомолепкулярным тиолсодержащим динитрозильным комплексам железа. В то же время нельзя исключить, что ДНКЖ, в состав которых входят модифицированные метилглиоксалем аминокислоты, могут играть особую регуляторную и протекторную роль. Так, связывая ионы железа, новые варианты ДНКЖ могут защищать биологические молекулы не только от окислительного повреждения, но и от процессов модификации активными карбонильными соединениями. Известно, что многие соединения, предотвращающие образование продуктов глубокого гликирования, являются хелаторами металлов переменной валентности [46, 49]. Антиоксидантные свойства ДНКЖ также могут иметь большое значение в условиях карбонильного стресса, т. к. патологические явления, связанные с гипергликемией, часто сопровождаются усилением свободно-радикальных процессов в клетках и тканях.

Еще одним интересным результатом работы является гипотензивное дозозависимое действие динитрозильных комплексов. Было показано, что продолжительность такого действия ДНКЖ составляла 20-90 мин Одновременно происходило повышенное накопление NO в органах. При введении ДНКЖ в кровоток происходит его переход на высокомолекулярные лиганды. Далее освобождаемый из ДНКЖ оксид азота поступает в увеличенных количествах в интенсивно работающие органы (сердце, почки). В целом, накопление NO за 30 мин в этих органах превышало уровень для контрольной группы в 50-60 раз. Хотя значение таких изменений для функции органов ещё предстоит выяснить, эти результаты позволяют полагать, что ДНКЖ может быть потенциальным средством купирования гипертонических кризисов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Губкина, Светлана Александровна, Москва

1. Shafer F.Q., Wang Р.Н., Kelley, Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing beta-carotine, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants // J. Biol. Chem. 2002. V. 383. P. 671-681.

2. Uchida K. Histidine and lysine as targets of oxidative modification // Amino Acids. 2003. V. 25 P. 249-257.

3. Thorpe S.R., Baynes J.W. Maillard reaction products in tissue proteins: new products and new perspectives // Amino Acids. 2003. V. 25. P. 275-281.

4. Yim H.S., Kang S.O., Hah Y.Ch., Chock P.B., Yim M.B. Free radicals generated during the glycation reaction of amino acids by methylglyoxal. A model study of protein-cross-linked free radicals // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28228-28233.

5. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models // FASEB J. 1993. V. 7. P. 349-360.

6. Inoue M., Sato E., Nishikawa M. et. al. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life // Curr. Med. Chem. 2003. V. 10. P. 12411253.

7. Kissner R., Nauser Т., Kurz C., Koppenol W.H. Peroxynitrous acid where is the hydroxyl radical? // IUBMB Life. 2003. V. 55. P. 567-572.

8. David A. Wink and James B. Mitchell. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide // Free Radical Biology & Medicine. 1998. V. 25. P. 434-456.

9. Fridovich I. Biological effects of the superoxide radical // Arch Biochem. Biophys. 1986. V. 247(1). P. 1-11.

10. Владимиров Ю.А., Азизова О.А. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1991. Т. 29. С. 252.

11. Saran М., Michel С., Bors W. Reaction of NO with 02' : Implications for the action of endothelium-derived relaxing factor (EDRF) // Free Radic. Res. Commun. 1990. V. 10. P. 221-226.

12. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // Biochem. J. 1994. V. 298. P. 249-258.

13. Kumar A., Takada Y., Boriek A.M., Aggarwal B.B. Nuclear factor-kB: its role in health and disease // J. Mol. Med. 2004. V. 82. P. 434-448.

14. Loesch A., Belai A., Burnstock G. Ultrastructural localization of NADPH-diaphorase and colocalization of nitric oxide synthase in endothelial cell of rabbit aorta // Cell and Tissue Res. 1993. V. 274. P. 539-545.

15. Ernst R. Werner, Antonius C.F. Gorren, Regine Heller, Gabriele Werner-Felmayer and Bernd Mayer. Tetrahydrobiopterin and nitric oxide: mechanistic and pharmacologicalaspects // Exp Biol Med (Maywood). 2003. V. 228. P. 1291-1302.

16. Loesch A., Belai A., Burnstock G. An ultrastructural study of NADPH-diaphorase and nitric oxide synthase in the perivascular nerves and vascular endothelium of the rat basilar artery // J Neurocytol. 1994. V. 23(1). P. 49-59

17. Pollock J.S., Forstermann U., Tracey W.R., Nakane M. Nitric oxide synthase isosymes antibodies //Histochem. J. 1995. V. 27. P. 738-744.

18. Меныцикова Е.Б., Ланкин B.3., Зенков H.K., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты // М: Слово. 2006.

19. Stuehr D., Рои S., Rosen G.M. Oxygen reduction by nitric-oxide synthases // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 14533-14536.

20. Xu K.Y. // FEBS Lett. 2000. V. 474. P. 252-253.

21. St-Pierre J., Buckingham J.A., Roebuck S.J., Brand M.D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 44784-44790.

22. Genova M.L., Pich M.M., Bernacchia A. et al. The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology // Annals of the New York Academy of Sciences. 2004. V. 1011. P. 86-100.

23. Schulz R., Kelm M. & Heusch G. Nitric oxide in myocardial ischemia/reperfusion injury // Cardiovascular Research. 2004. V. 61. P. 402-413.

24. Mitchell P. Protonmotive redox mechanism of the cytochrome bci complex in the respiratory chain: Protonmotive ubiquinone cycle // FEBS Lett. 1975. V. 56. P. 1-6.

25. Rasmussen J.T., Rasmussen M.S., Petersen Т.Е. Cysteines involved in the interconversion between dehydrogenase and oxidase forms of bovine xanthine oxidoreductase // J. Daily Sci. 2000. V. 83. P. 499-506.

26. Beny C.E., Hare J.M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications // J. Physiol. 2004. V. 555. P. 589-606.

27. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998. Т. 63(7). С. 1007-1019.

28. Berry С.Е., Hare J.M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications // J. Physiol. 2004. V. 555. P. 589-606.

29. Stone J.R., Marietta M.A. The ferrous iron heme of soluble guanylate cyclase: formation of hexacoordinate complexes with carbon monoxide and nitrosomethane // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 16397-16403.

30. Cooper С. E. Nitric oxide and iron proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1411. P. 290-309.

31. Maria S.S., Lee J., Groves J.T. Peroxynitrite rapidly permeates phospolipid membranes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14243-14248.

32. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: The cytotoxic potential superoxide and nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 288. P. 481-487.

33. Alvarez В., Rubbo H., Kirk M. et al. Peroxynitrite-dependent tryptophan nitration // Chem. Res. Toxicol. 1996. V. 9. P. 390-396.

34. Herold S., Rehmann FJ. Kinetics of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl hemoglobin // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 34. P. 531-545.

35. Cassina A.M., Hodara R., Souza J.M., Thomson L., Castro L., Ischiropoulos H., Freeman B.A., Radi R. Cytochrome с nitration by peroxynitrite // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 21409-21415.

36. Murray J., Taylor S.W., Zhand В., Ghosh S.S., Capaldi R.A. Oxidative damage to mitochondrial complex I due to peroxynitrite // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 37223-37230.

37. Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz S.L., Schopfer F., Carreras M.C., Poderoso J.J., Baveris A. Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29. P. 349-356.

38. Scopfer F., Riobo N., Carreras M.C., Alvarez B. et al. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: Implications for protection of mitochondria against nitrosative damage //Biochem. J. 2000. V. 349. P. 35-42.

39. Troy C.M., Derossi D., Prochiantz A. et al. Downregulation of Cu/Zn superoxide dismutaze leads to cell death via the nitric oxide-peroxynitrite pathway // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 253-261.

40. Stuehr D J., Marietta M.A. Mammalian nitrate biosynthesis: Mous macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 7738-7742.

41. Brownlee M. Advanced protein glycosylation in diabetes and aging // Annu. Rev. Med. 1995. V. 46. P. 223-234.

42. Ahmed K.A., Muniady S., Ismail I.S. Role A^-(carboxymethyl)lysine in the development of ischemic heart disease in type 2 diabetes mellitus // J. Clin. Biochem. Nutr. 2007. V. 41. P. 97-105.

43. Голубев А.Г. Изнанка метаболизма // Биохимия. 1996. Т. 61(11). С. 20182039.

44. Schalkwijk C.G. Therapeutic intervention in the glyc(oxid)ation pathway // Immun. Endoc. & Metab. Agents in Med. Chem. 2007. V. 7. P. 57-68.

45. Goldin A., Beckman J.A., Schmidt A.M., Creager M.A. Advanced glycation end products. Sparking the development of diabetic vascular injury // Circulation. 2007. V. 114. P. 597-605.

46. Thornalley P.J. Monosaccharide autoxidation in health and disease // Environmental Health Perspectives. 1985. V. 64. P. 297-307.

47. Price D.L., Rliett P.M., Thorpe S.R., Baynes J.W. Chelating activity of advanced glycation end-product inhibitors // J. Biol. Chem. 2001. V. 276(51). P. 48967-48972.

48. Ahmed M.U., Fiye E.B., Degenhardt T.P., Thorpe S.R., Baynes J.W. Nc-(carboxyethyl)lysine, a product of the chemical modification of proteins by methylglyoxal, increases with age in human lens proteins // Biochem. J. 1997. V. 324. P. 565-570.

49. Shilton B.H., Walton D.J. Sites of glycation of human and horse liver alcohol dehydrogenase in vivo // J. Biol. Chem. 1991. V. 266(9). P. 5587-5592.

50. Seidler N.W. Carnosine prevents the glycation-induced changes in electrophoretic mobility of aspartate aminotranspherase // J. Biochem. Mol. Toxicol.2000. V. 14(4). P. 215-220.

51. Thornalley P.J., Langborg A., Minhas H.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose // Biochem. J. 1999. V. 344. P. 109-116.

52. Lo T.W.C., Westwood M.E., McLellan A.C., Selwood Т., Thornalley P.J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions //J. Biol. Chem. 1994. V. 269(51). P. 32299-32305.

53. Thorpe S.R., Baynes J.W. Maillard reaction products in tissue proteins: new products and new perspectives // Amino Acids. 2003. V. 25. P. 275-281.

54. Murata-Kamiya N.M., and Kamiya H. Methylglyoxal, an endogenous aldehyde, crosslinks DNA polymerase and the substrate DNA // Nucleic Acids Research.2001. V. 29(16). P. 3433-3438.

55. Ванин А. Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы — две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия. 1998. Т. 63(7). С. 924-938.

56. Власова М.А, Ванин А.Ф., Мюллер Б., Смирин Б.В., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Выявление и характеристика разных пулов депо оксида азота в стенке сосуда//Биофизика. 2003. Т. 13. С. 69-77.

57. Woolum J.C., Commoner В. Isolation and identification of a paramagnetic complex from livers of carcinogen-treated rats // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 201. P. 131-140.

58. Foster M., Stamler J. New insights into protein S-nitrosylation // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 25891-25897.

59. Miersch S., Mutus B. Protein S-nitrosation: Biochemistry and characterization of protein thiol-NO interactions as cellular signals // Clin. Biochem. 2005. V. 38. P. 777-791.

60. Van Faassen E., Vanin A.F. Nitrosospecies and S-nitrosothiols: fhysico-chemical properties and biological activity // In: Radicals for Life. The Various Forms of Nitric Oxide / Eds. E. van Faassen, A.F. Vanin. Elsevier. 2007. P. 95-123.

61. Mallard J.R., Kent M. Difference observed between electron spin resonance signals from surviving tumour tissues and from their corresponding normal tissues // Nature. 1964. V. 204. P. 1192.

62. Commoner В., Woolum J.C., Senturia B.H., Ternbeg J.L. The effects of 2-acetoaminofluirene and nitrite on free radicals and carcinogenesis in rat liver // Cancer Res. 1970. V. 30. P. 2091-2097.

63. Налбандян P.M., Ванин А.Ф., Блюменфельд JI.A. Сигнал ЭПР нового типа в дрожжевых клетках // Тезисы докладов конференции: «Свободно-радикальные процессы в биологических системах». Москва. 1964. С.18.

64. Ванин А.Ф., Четвериков А.Г. Парамагнитные нитрозильные комплексы гемового и негемового железа // Биофизика. 1968. Т. 13. С. 608-613.

65. Vanin A.F. and Varich V.Ya// Studia biophys. 1981. V. 86. P. 175-185.

66. Vanin A.F., van Faassen E. DNICs: physico-chemical properties and their observations in cells and tissues // In: Radicals for Life. The Various Forms of Nitric Oxide / Eds. E. van Faassen, A.F. Vanin. Elsevier. 2007. P. 17-74.

67. Lancaster J.R., Hibbs J.B. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 1223-1227.

68. Sergent О., Griffon В., Morel I., Chevanne M., Dubos M-P., Cillard P., Cillard J. Effect of nitric oxide on iron-mediated oxidative stress in primary hepatocyte culture // Hepatology. 1997. V. 25. P. 122-127.

69. Muller В., Kleschyov A.L., Stoclet J-C. Evidence for N-acetylcystein-sensitive nitric oxide storage complexes in lipopolysaccharide-treated rat aorta // Br. J. Pharmacol. 1996. V. 119. P. 1281-1285.

70. Mtilsch A., Mordvincev P.I., Vanin A.F., Busse R. Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 196. P. 1303-1308.

71. Chamulitrat W., Jordan S.U.J., Mason R.P., Litton A.L., Wilson J.G., Wood E.R., Wolberg G., Molina Y., Vedia L. Targets of nitric oxide in a mouse model of liver inflammation by Corynebacterium parvum // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V.316. P. 30-37.

72. Ванин А.Ф., Маленкова И.В., Мордвинцев П.И., Мюльш А. // Биохимия. 1992. Т. 58. С. 1094-1103.

73. Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina Е.В. Physical properties of dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands in relation with their vasodilator activity // Biochim Biophys Acta. 1996. V. 1295(1). P. 5-12.

74. Vanin A.F., Papina A.A., Serezhenkov V.A., Koppenol W.H. The mechanisms of S-nitrosothiol decomposition catalyzed by iron //Nitric oxide. 2004. V. 10. P. 6073.

75. Vedernikov Y.P., Mordvintcev P.I., Malenkova I.V., Vanin A.F. Similarity between the vasorelaxing activity of dinitrosyl iron cysteine complexes and endothelium-derived relaxing factor // Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 211. P. 313-317.

76. Vanin A.F., Mokh V.P., Serezhenkov V.A., Chazov E.I. Vasorelaxing activity of stable powder preparations of dinitrosyl iron complexes with cysteine or glutathione ligands //Nitric oxide. 2007. V. 16. P. 322-330.

77. Galagan M.E., Oranovskaya E.V., Mordvintcev P.I., Medvedev O.S., Vanin A.F. Hypotensive effect of dinitrosyl iron complexes in conscious animals // Bull. Vsesoyuznogo Kardiolog. Nauchnogo Centra AMNSSSR. 1988. V. 2. P. 75-80.

78. Gaston B. Summary: Systemic Effects of Inhaled Nitric Oxide // The Proceedings of the American Thoracic Society. 2006. V. 3. P. 170-172.

79. Wang Т., Kebir D., Blaise G. Inhaled nitric oxide in 2003: a review of its mechanisms of action// Canadian Journal of Anesthesia. 2003. V. 50. P. 839-846.

80. Ng E., Jourd'heuil D., McCord J., Hernandez D., Yasui M., Knight D., Kubes P. Enhanced S-nitroso-albumin formation from inhaled NO during ischemia/reperfusion // Circ Res. 2004. V. 94. P. 559-565.

81. Taylor R., Zimmerman J., Dellinger R., Straube R., Criner G., Davis K. Jr., Kelly K., Smith Т., Small R. Low-dose inhaled nitric oxide in patients with acute lung injury // JAMA. 2004. V. 291. P. 1603-1609.

82. Jindal N., Dellinger R. P. Inhalation of nitric oxide in acute respiratory distress syndrome // J Lab. Clin Med. 2000. V. 136. P. 21-28.

83. Mestan K.L., Marks JD., Hecox K., Huo D., Schreiber M.D. Neurodevelopmental outcomes of premature infants treated with inhaled nitric oxide // N Engl J Med. 2005. V. 353. P. 23-32.

84. Lucas D.T. & Szweda L.I. Cardiac reperfusion injury: aging, lipid peroxidation, and mitochondrial dysfunction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 510514.

85. Nonami Y. The role of nitric oxide in cardiac ischemia-reperfiision injury // Jpn. Circ. J. 1997. V. 61(2). P. 119-132.

86. Leonard S.S., Harris G.K. & Shi X. Metal-induced oxidative stress and signal transduction // Free Rad. Biol. Med. 2004. V. 37. P. 1921-1942.

87. Vanin A.F., Huisman A., Stroes E.S.G., de Ruijter-Heijstek F.C., Rabelink T.J., Faassen E.E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping // Free Rad. Biol. Med. 2001. V. 30. P. 813-824.

88. Kagan V.E., Kozlov A.V., Tyurina Y.Y., Shvedova A.A., Yalowich J.C. Antioxidant mechanisms of nitric oxide against iron-catalyzed oxidative stress in cells//Antiox., Redox Signaling. 2001. V. 3. P. 189-202.

89. Ueno Т., Suzuki Y., Fujii S., Vanin A.F., Yoshimura T. In vivo nitric oxide transfer of a physiological NO carrier, dinitrosyl dithiolato iron complex, to target complex // Biochem. Pharmacol. 2002. V. 63. P. 485-493.

90. Коркина O.B., Рууте Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца: исследование методом спиновых ловушек в условиях непрерывной оксигенации // Биофизика. 2000. Т. 45. С. 695-699.

91. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L. Production of reactive oxygen species by mitochondria: central role of complex 1П // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 36027-36031.

92. McLeod L.L., Alayach A.I. Detection of a ferrylhemoglobin intermediate in an endothelial cell model after hypoxia-reoxygenation// Am. J. Physiol. 1999. V. 277. P. H92-H99.

93. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Дмитровский А.А., Быховский В.Я., Кухарчук В.В. Влияние антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов на образование радикала пробукола в липопротеидах низкой плотности // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 769-773.

94. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова Н.Э. Рууге Э.К. //Биофизика. 2004. Т. 49. С. 659-665.

95. Stadtman E.R., Berlett B.S. Reactive oxygen-mediated protein oxidation in aging and disease // Drug Metab. Rev. 1998. V. 30. P. 225-243.

96. Brennan M.L., Hazen S.L. Amino acid and protein oxidation in cardiovascular disease // Amino Acids. 2003. V. 25. P. 365-374.

97. Stadtman E.R., Levine R.L. Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins // Amino Acids. 2003. V. 25. P. 207-218.

98. Bourajjaj M., Stehouwer C.D., van Hinsbergh V.W., Schalkwijk C.G., Role of methylglyoxal adducts in the development of vascular complications in diabetes mellitus // Biochemical Society Transactions. 2003. V. 31. P. 1400-1402.

99. Lee C., Yim M.B., Chock P.B., Yim H.S., Kang S.O. Oxidation-reduction properties of methylglyoxal-modified protein in relation to free radical generation // J. Biol. Chem. 1998. V. 273(39). P. 25272-25278.

100. Phillips SA, Thornalley PJ. Formation of methylglyoxal and D-lactate in human red blood cells in vitro // Biochem. Soc. Trans. 1993. V. 21(2). P.163.

101. Thornalley P.J. The glyoxalase system in health and disease // Mol. Aspects Med. 1993. V. 14. P. 287-371.

102. Suji G., Sivakami S. DNA damage during glycation of lysine by methylglyoxal: assessment of vitamins in preventing damage // Amino Acids. 2007. V. 33. P. 615-621.

103. McLaughlin J.A., Pethig R., Szent-Gyorgyi A. Spectroscopic studies of the protein-methylglyoxal adduct//Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 949-951.

104. Kang J.H. Oxidative damage of DNA induced by methylglyoxal in vitro // Toxicol. Lett. 2003. V. 145(2). P.181-187.

105. Tarpey M.M., Wink D.A., Grisham M.B. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 2004. V. 286. P. R431-R444.

106. Bisby R.H., Paker A.W. Reactions of the alpha-tocopheroxyl radical in micellar solutions studied by nanosecond laser flash photolysis // FEBS Letters. 1991. V. 290. P. 205-208.

107. Берберова H.T. // Соросовский образовательный журнал. 1999. Т. 5. С. 4853.

108. Mason RP. Redox cycling of radical anion metabolites of toxic chemicals and drugs and the Marcus theoiy of electron transfer // Enviromental Health Perspectives. 1990. V. 87. P. 237-243.

109. Gupta K.C. and A.K. Sutar Catalytic activities of polymer-supported metal complexes in oxidation of phenol and epoxidation of cyclohexene // Polym. Adv. Technol. 2008, V. 19. P. 186-200

110. Satish C. Tripathi, Satish C. Srivastava, Ajit K. Shrimal and Om P. Singh Schiff-Base Derivatives of Molybdenum Carbonyl // Transition Met. Chem. 1984. V. 9. P. 478-482

111. Бурбаев Д.Ш., Ванин А.Ф., Блюменфельд JI.А. Электронная и пространственная структура парамагнитных динитрозильных комплексов железа // Журнал структурной химии. 1971. Т. 2. С. 252-256.

112. Vanin A.F., Menshikov G.B., Moroz I.A., Mordvintcev P.I., Serezhenkov V.A. and Burbaev D. Sh. The source of non-heme iron that binds nitric oxide in cultivated macrophages // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1135. P. 275-279.

113. Van Faassen E., Vanin A.F. // In Radicals for life. The various forms of Nitric Oxide / Eds. van Faassen E., Vanin A.F. Elsevier. 2007. P. 3-13.

114. Ignarro LJ. // Thromb.Haemost. 1993. V. 70. P. 148-151.

115. Tsikas D. J. // Chromatogr. В Analyt.Technol.Biomed.Life Sci. 2007. V. 851(1-2). P. 51-70.

116. Тимошин A.A., Доркина Е.Г., Паукова E.O., Ванин А.Ф. Кверцетин и гесперидин подавляют образование радикалов оксида азота в печени и сердце крыс в условиях острого гепатоза // Биофизика. 2005. Т. 50(6). С. 1145-1149.

117. Timoshin A.A., Pisarenko O.I., LakomkinV.L., Studneva I.M., Ruuge E.K. Free radical intermediates in isolated rat heart during perfusion, ishemia and reperfusion: effect of ischemic preconditioning // Exp. Clin. Cardiol. 2000. V. 5(2). P. 59-64.

118. Jiang J., Corbett J., Hogg N., Mason R.P. An electron paramagnetic resonance investigation of the oxygen dependence of the arterial-venous gradient of nitrosyl hemoglobin in blood circulation // Free Radic.Biol.Med. 2007. V. 43(8). P. 12081215.

119. Takahashi Y., Kobayashi H., Tanaka N., Sato Т., Takizawa N., Tomita T. Nitrosyl hemoglobin in blood of normoxic and hypoxic sheep during nitric oxide inhalation//Am.J.Physiol. 1998. V. 274. P. H349-H357.

120. Piknova В., Gladwin M.T., Schechter A.N., Hogg N. Electron paramagnetic resonance analysis of nitrosylhemoglobin in humans during NO inhalation // J.Biol.Chem. 2005. V. 280(49). P. 40583-40588.