Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные особенности и распределение ретротранспозона gtwin, амплифицированного в линии Г32 Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности и распределение ретротранспозона gtwin, амплифицированного в линии Г32 Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

Стефанов Юрий Эдуардович

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РЕТРОТРАНСПОЗОНА СТИЖ АМПЛИФИЦИРОВАННОГО В ЛИНИИ Г32 ОЯОБОРНИА МЕЫКОСЛЯТЕК

03,00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009 год

1 о ДЕК 2009

003488104

Работа выполнена в Лаборатории подвижности генома Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН Юрий Викторович Ильин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михаил Борисович Евгеньев кандидат биологических наук Оксана Геннадьевна Максименко

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологин развития им. Н.К. Кольцова РАН

Зашита диссертации состоится «23» декабря 2009 года в 11:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан «23» ноября 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационно]--------

кандидат фармацевтических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы (МГЭ) широко распространены в геномах всех эукариот. Согласно современным данным, доля таких последовательностей в ДНК различных организмов может достигать 70%. Разнообразие МГЭ также весьма велико, а их классификация, основанная на особенностях жизненного цикла и структуры элементов, постоянно уточняется (Wicker Т 2007; Kapitonov VV 2008).

Мобильные элементы - это мощный источник генетической нестабильности. Они в состоянии провоцировать хромосомные перестройки и разнообразные эпигенетические эффекты, вызывать инсерционные мутации и дупликации генов. Регуляторные последовательности, которые часто входят в состав МГЭ, оказывают воздействие на экспрессию генов организма-хозяина.

Транспозиции мобильных элементов являются одной из движущих сил микроэволюцни. Если в стабильных условиях окружающей среды транспозиции мобильных элементов чаще негативно сказываются на жизнедеятельности хозяина, то в изменяющихся и стрессовых для популяций условиях, активность МГЭ может сыграть положительную роль в адаптации.

Несмотря на то, что возможные последствия распространения МГЭ по геному описаны достаточно хорошо, процессы регуляции активности мобильных элементов изучены не полностью, хотя и представляют большой интерес.

После попадания в геном путем скрещиваний или за счет горизонтального переноса, новый мобильный элемент начинает перемещаться. Этот процесс происходит до тех пор, пока организм-хозяин не приобретает способность контролировать перемещения элемента. Конкретные механизмы этого контроля начали выявляться сравнительно недавно. Считается, что в основе регуляции активности МГЭ лежат механизмы РНК-интерференции, которые сейчас активно изучаются (Brennecke J 2007). Одним из удобных объектов для изучения регуляции мобильных элементов являются представители рода Drosophila.

МГЭ дрозофилы изучены достаточно хорошо. Среди мобильных элементов разных видов Drosophila преобладают ретротранспозоны - элементы, перемещающиеся посредством РНК-интермедиата.

Ретротранспозон gtwin, о котором идет речь в настоящей работе, является ближайшим родственником МДГ4 (в англоязычной литературе известного, как gypsy), наиболее хорошо изученного ретротранспозона Drosophila melanogaster. Этот элемент имеет два прямых длинных концевых повтора (ДКП) и три открытые рамки считывания, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env.

3

Gtwin был впервые клонирован из линии Г32 Drosophila melanogaster при поиске в ней последовательностей, гомологичных МДГ4. Позже было продемонстрировано также, что в линии Г32 наблюдается сильная амплификация ретротранспозона gtwin в сравнении с другими линиями (Котнова А.П. 2005). Это могло свидетельствовать о том, что gtwin подвергается активным транспозициям в настоящее время, либо перемещался в недавнем прошлом. Именно линии, характеризующиеся генетической нестабильностью и амплификацией МГЭ, представляют большой интерес с точки зрения изучения механизмов контроля мобильных элементов со стороны клетки-хозяина.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было выявление причин амплификации ретротранспозона gtwin в линии Г32 Drosophila melanogaster, а также выяснение того, перемещается ли этот элемент в настоящее время и, если нет, то что могло привести к его репрессии.

В связи с данными целями были сформулированы следующие задачи:

1. Провести локализацию копий ретротранспозона gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32

2. Определить последовательность геномного окружения копий gtwin из линии Г32 и локализовать их в геноме Drosophila melanogaster с помощью базы данных FlyBase

3. Клонировать копии ретротранспозона gtwin или их фрагменты из линии Г32, описать их структурные особенности и сравнить между собой и известной последовательностью gtwin

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы с использованием методики гибридизации in situ была проведена локализация копий ретротранспозона gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32. Анализ структуры политенных хромосом личинок линии Г32 выявил наличие в данной линии крупной комплексной хромосомной аберрации, представленной двумя парацентрическими инверсиями в обоих плечах третьей хромосомы. Было показано, что распределение копий gtwin на аберрантной хромосоме значительно отличается от его распределения на ее нормальном гомологе.

Были клонированы фрагменты геномного окружения копий ретротранспозона gtivin из линии Г32 и определена их точная локализация в геноме Drosophila melanogaster с помощью базы данных FlyBase. Была обнаружена копия элемента, встроившаяся в мастерлокус регуляции активности МГЭ. Помимо этого в данной линии были выявлены кольцевые экстрахромосомные копии gtwin.

Большая часть из обнаруженных копий gtwin была клонирована и проанализирована. Сравнение их последовательностей выявило наличие в изучаемой линии двух вариантов ретротранспозона, отличающихся структурой и распределением по геному.

Полученные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований как самого ретротранспозона так и системы клеточного контроля его перемещений. Также большой интерес представляют дальнейшие исследования линии Г32 йгоюрЫк melalюgaster< имеющей ряд генетических особенностей и несущей крупную хромосомную аберрацию, которая не элиминируется из нее с течением поколений.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях:

«Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics», Киев 20-22 сентября 2007 года.

«Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability» Санкт-Петербург, 24-26 нюня 2008 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Из них статей - 2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 2.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 33. страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя ¡IS источников. Работа иллюстрирована (^рисунками и ? таблицами.

Результаты и обсуждение

Настоящая работа посвящена изучению структурных особенностей и распределения ретротранспозона gtwin в геноме линии Г32 Drosophila melanogasier. Этот мобильный элемент был впервые клонирован из данной линии при поиске последовательностей, гомологичных ретротранспозону МДГ4 {gypsy). Ретроэлементы gtwin и МДГ4 являются ближайшими эволюционными родственниками, поэтому их последовательности характеризуются высокой степенью гомологии. До этого gtwin был обнаружен in silica и был также известен под названием hamilton.

После того, как ретроэлемент gtwin был клонирован из линии Г32, его удалось обнаружить и во многих других линиях Drosophila melanogaster, а также в ряде других видов рода Drosophila. В ходе этих исследований было выявлено, что в Г32 gtwin сильно амплифицирован в сравнении с (Котнова А.П. 2005). Амплификация элемента может свидетельствовать о том, что он активно перемещается в линии, либо перемешался в недавнем прошлом. Такие случаи представляют большой интерес, поскольку их подробное изучение способствует пониманию процессов регуляции активности мобильных элементов в геноме.

Основными задачами настоящей работы было определение местоположения копий gtwin в геноме Г32, выявление его возможных ретротранспозиций и поиск структурных особенностей элемента, способных оказывать влияние на его активность. Для этого использовалась гибридизация in situ с политенными хромосомами, а также методики, основанные на полимеразной цепной реакции.

1. Распределение gtwin на политеиных хромосомах личинок линии Г32

В ходе анализа преператов политенных хромосом личинок линии Г32 было выявлено, что у большей части особей данной линии в геноме присутствует крупная аберрация, представленная двумя парацентрическими инверсиями, расположенными в третьей хромосоме. Точки разрывов инверсий были картированы Пасюковой Е.Г. В плече 3L одна точка находится между подсекциями 63С и 63D, а вторая в подсекции 72Н. В плече 3R разрывы располагаются в подсекциях 86А и 97А (рис. 1). Таким образом, перестройки затрагивают практически половину каждого плеча третьей хромосомы. Интересно, что две данные инверсии не встречаются отдельно друг от друга. Возможно, это объясняется тем, что наличие очень протяженной аберрации подавляет рекомбинационные процессы в данной хромосоме (Sniegowski P.D. 1994).

63с 72 е ш-_97л

[ □ ] О О I \

□ ш фа ашсО □□□ ф □□

эгл Э(Ч УН Н98

_ „ сайты С'Г,■.:/!. ассоциированные с п сси'/ты еьпп. присутствую/ние е

□ сайты хпин П ^ П

точками разрывов инверсии нормальной храиосомс

Рисунок 1. Схематическое изображение третьей хромосомы мух линии Г32.

Вверху показана нормальная хромосома с отмеченными сайтами локализации §№¡>1. Внизу показана хромосома с инверсиями. На аберрантной хромосоме отмечены дополнительные сайты локализации элемента и сайты, ассоциированные с точками разрывов инверсий.

На всех исследованных препаратах аберрация наблюдается только в гетерозиготном состоянии, что позволяет предположить, что в гомозиготе перестройка является летальной. Вполне возможно, что точки разрывов инверсий затрагивают жизненно важные гены, или же аберрантная хромосома несет другие мутации, которые в гомозиготном состоянии дают летальный эффект.

Таблица 1. Распространенность аберрантной хромосомы о л шиш Г32

Год 2006 2009

Количество препаратов с инверсиями 79 74

Количество препаратов с нормальными хромосомами 10 9

Частота встречаемости хромосомы с инверсией 0,443 0,445

Сравнение данных о частотах встречаемости нормальной н аберрантной хромосом в линии Г32, полученных с интервалом в 3 года, свидетельствует о том, что тенденция к элиминации мутантной хромосомы отсутствует (таблица 1). Так, частота встречаемости аберрантной хромосомы была сопоставима с частотой встречаемости нормальной хромосомы и, согласно данным 2006 года, составляла 0,443, а три года спустя - 0,445. При этом особи, гетерозиготные по наличию аберрации, существенно преобладали в линии Г32. Возможно, у таких особей существует некое селективное преимущество в сравнении с особями, несущими нормальные хромосомы. Нельзя исключить, что третья хромосома без аберрации содержит аллели, неблагоприятно сказывающиеся па общей

7

приспособленности мух линии Г32, тогда как в гетерозиготном состоянии их наличие компенсируется наличием нормальных аллелей в составе аберрантной хромосомы.

В результате анализа распределения ¿Шп на политенных хромосомах, было выявлено, что паттерн его локализации постоянен. При этом на третьей хромосоме существует два варианта распределения. На нормальной третьей хромосоме обнаруживалось два сайта локализации элемента, тогда как аберрантная хромосома содержала 17 сайтов. Таким образом, на всех исследованных препаратах с нормальными хромосомами наблюдалось 8 сайтов гибридизации с зондом, содержащим последовательность gtwin, тогда как на всех препаратах, содержащих аберрантную хромосому, наблюдалось 25 таких сайтов (таблица 2). Вероятно, копии gtwin были накоплены внутри нее, поскольку эта хромосома стабильно присутствует в линии и в ней подавлены рекомбинационные процессы, за счет которых мобильные элементы могут элиминироваться из генома.

Таблица 2. Распределение на политенных хромосомах личинок линии Г32.

Сайты, характерные только для аберрантной хромосомы, выделены полужирным шрифтом. Сайты, ассоциированные с точками разрывов инверсий, подчеркнуты

Хромосома Сайты локализации gtwin в структурно нормальных ядрах Сайты локализации gtwin в ядрах, содержащих хромосомную аберрацию

X ЗА, 7D, 17F, 19F

2L —

2R 52С, 59В

3L 70В, 78А 63D, 6SA, 65D 67Е, 70В, 73А, 7SD, 77Е, 78А, 78D, 80А

3R — 82А, 83А, 84А, 86Е, 92Е, 93С, 96F. 99F

Всего: 8 сайтов 25 сайтов

Наличие двух постоянных вариантов распределения исследуемого элемента и отсутствие новых сайтов локализации говорит о том, что на момент проведения гибридизации in situ в линии Г32 транспозиций gtwin не происходило, а сама линия была генетически стабильна.

Дополнительные 17 сайтов локализации ghvin, наблюдавшиеся на препаратах с аберрацией, были распределены по третьей хромосоме равномерно. Внутри инверсий было обнаружено 6 сайтов (4 в плече 3L и 2 в плече 3R), а за пределами инверсий - 9 сайтов (5 в плече 3L н 4 в плече 3R). Любопытно также, что места локализации элемента были ассоциированы с граничными точками комплексной аберрации (таблица 2 и рисунок 2).

Тот факт, что сайты локализации gtwin присутствуют в непосредственной близости от точек разрывов инверсий, позволили предположить, что последовательности этого ретротранспозона могли спровоцировать эктопическую рекомбинацию, приведшую к формированию аберрации, что не типично для элементов данного класса. С другой стороны, копии элемента могли попасть в эти области уже после того, как инверсия образовалась. Для того, чтобы проверить эти гипотезы, а также установить точные места локализации gtwin в геноме, была использована методика inverse PCR, позволившая клонировать фрагменты геномного окружения копий gtwin из линии Г32.

Рисунок 2. Инсерции gtwin, ассоциированные с точками разрывов аберрации

На иллюстрации показано плечо 3L.

2. Точная локализация копий gtwin в геноме линии Г32

Для проведения inverse PCR использовалась тотальная ДНК мух линии Г32. ДНК обрабатывалась рестрикционной эндонуклеазой EcoRl, сайтов рестрикции которой нет внутри ретротранспозона gtwin. Это позволяло получить рестрикционные фрагменты, содержащие полноразмерный ретротранспозон gtwin с обоими частями геномного окружения.

Полученную смесь фрагментов обрабатывали лигазой, предварительно разбавив, для того, чтобы обеспечить преимущественное лигирование между собой концов,

принадлежащих одному фрагменту. В результате получалась смесь кольцевых молекул ДНК, некоторые из которых содержали полноразмерный и эта смесь использовалась в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции.

ЕсоШ ЕсоШ ЕсоШ о|\\т ЕсоШ ЕсоШ

у V V ^ | ётш ^ ^ у

дкп дкп

Рестрикция

гт

дкп ; дкп

ЕсоШ

Рисунок 3. Схема эксперимента.

Для ПЦР использовались праймеры, комплементарные последовательностям gtwin, находящимся вблизи ДКП. При этом праймеры были направлены наружу, в сторону геномного окружения. В результате полимеразной цепной реакции мы получали смесь

фрагментов разной длины, соответствующих различным местам встраивания ретротранспозона gtwin и содержащих оба участка геномного окружения, соединенных рестрикционным сайтом EcoRl и окруженных короткими последовательностями самого gftrin.

ПЦР-продукт был клонирован в плазмидный вектор pGEM T-Easy, после чего путем рестрикционного анализа из полученных клонов были отобраны уникальные для последующего секвенирования.

В ходе проведенных экспериментов было отобрано и секвенировано 30 уникальных клонов. Для 25 из 30 полученных уникальных клонов удалось точно определить их локализацию в геноме Drosophila melanogaster согласно FlyBase. Оставшиеся 5 клонов соответствовали копиям gtwin, встроившимся в мобильные элементы, поэтому определить их точное положение в геноме оказалось невозможно.

Результаты, полученные с помощью описанной методики, в основном совпадают с данными, полученными в ходе гибридизации in situ. Так, для 16 сайтов, выявленных цитологическими методами, была определена их точная локализации в геноме (таблица 3). Любопытно, что 4 области несут более одной инсерции gtwin. К этим областям относятся секция 20 на политенных хромосомах с инсерциями 19Е7, 20С1 и 20F1, секция 63 с инсерциями 63D3 и 63Е1, секция 52 с инсерциями 52С2 и 52С5, а также секция 75 с инсерциями 75С4, 75D2 и 75Е2. Такое распределение может быть связано с тем, что данные локусы содержат горячие точки для инсерций gtwin.

Для 9 сайтов, выявленных при помощи гибридизации in situ, не удалось провести точную локализацию копий gtwin в них. Это может быть связано с тем, что в части из данных сайтов последовательности gtwin окружены последовательностями других мобильных элементов, либо с ограничениями, которые накладывает методика inverse PCR.

Стоит отметить, что один эухроматический сайт, локализованный в подсекции 55С2, оказался новым по сравнению с данными гибридизации in situ. Это говорит о наличии незначительной гетерогенности в линии Г32.

Большинство из мест локализации копий ретротранспозона gtwin в линии Г32 соответствовало областям эухроматина (таблица 4). При этом примерно половина инсерций затрагивает межгенные участки - в них попало 10 копий gtwin. Среди этих участков есть один прицентромерный регион, насыщенный инсерциями других мобильных элементов (20С1).

Внутри последовательностей различных генов обнаружилось 11 копий gtwin. Из них 9 попали внутрь интронов и 2 внутрь экзонов. Гены, в интронах которых были выявлены инсерции gtwin, описаны в таблице 4.

Таблица 3. Сопоставление результатов гибридизации in situ и inverse PCR.

Локализации, Локализация в геноме по данным FlyBase по данным in situ_Подсекция_Точная локализация

Хромосома X

ЗА ЗА7 Х:2511978

7D 7D4 Х:7940710

17F _ —

19F 19Е7 Х:20925940

— 20С1 Х:21784129

— 20F1 Х:22263280

Хромосома 2

52С 52С2 2R: 11635082

52С5 2R: 11676040

— 55С2 2R:14174540

59В — —

— — 2ЮШ: 2829193

Хромосома 3

63 D 63D3 3L:3416605

63Е1 3L:3439889

65А — —

65D 65 D2 3L.-6894619

67Е — —

70В 70А7 3L:13366777

73А 73D1 3L:16820140

75D 75С4 3L:18343503

75D2 3L-.18541765

75 Е2 3L:f 8839853

77Е 77С6 3L:20509926

78А 78А2 3L:21019923

78D — —

80А — —

— 80F9+ 3L:24542870

— — 3LHet:712257

82А — —

83А — —

84А — —

86Е 86Е9 3R-.7378808

92Е — —

93С 93С2 3R: 16982490

96F 96Е5 3R:21441802

99F 100А5 3R:26626173

Таблица 4. Описание точек встраивания ^н>ш в геноме линии Г32. № Локализация Геномное окружение_

Эухроматин

1 ЗА7 Межгенный участок

2 704 Интрон пли, в зависимости от сплайсинга, экзон гепа 1 (транскрипционный фактор, ДНК-связывающий белок с протеин-киназной активностью)

3 19Е7 Интрон гена Ьусб (функции неизвестны)

4 20С1 Межгенный участок. Окружен мобильными элементами

5 20П Межгенный участок

6 52 С2 Интрон гена Сб30089 (функции неизвестны)

7 52С5 Интрон гена 7азр. Кодирует цинк-связываюший белок

8 55С2 Экзон гена Св 18536 (функции неизвестны); интрон генов СО 14502 (функции неизвестны) и БЬЬ (транскрипционный фактор, личиночное развитие)

9 63 ИЗ Интрон гена вргошу (регуляторнын фактор процессов развития и путей трансдукцни сигналов в клетке)

10 63Е1 Интрон гена е1Р5В (фактор инициации трансляции, ГТФ-связывающий белок)

11 6502 Межгенный участок

12 70А7 Межгенный участок

13 7301 Межгенный участок

14 75С4 Межгенный участок

15 7502 Межгенный участок

16 75Е2 Межгенный участок. 500 п.п. левее - ген 1пду (трансмембранный транспорт цитрата)

17 77С6 Экзон гена Св5059 (функции неизвестны)

18 78А2 Интрон гена вкиШ (фактор инициации транскрипции, участие в эмбриональном развитии и клеточной дифференцировке)

19 86Е9 Межгенный участок

20 93С2 Интрон гена SNF4Agal'шт)a (позитивная регуляция клеточного цикла, фосфорилирование аминокислот, регуляция гомеостаза холестерина)

21 96Е5 Интрон гена С04673 (структурный компонент ядерной поры)

22 100А5 Межгенный участок

Гетерохроматин

23 21Ше1 Мастерлокус регуляции МГЭ

24 80Р9+ Межгенный участок

25 ЗЬНе(:712257 Межгенный участок

Не локализованы

26 Р-элемент и гтсгорт

27 Р-элемент

28 э1а1кег

29 5й1кег2

30 Ош88

Анализ геномного окружения копий gtwin, картированных рядом с точками разрывов инверсий, показал, что эти копии не находятся непосредственно в точках разрывов. Это говорит о том, что gtwin, по всей видимости, не принимал участия в формировании инверсий.

Несмотря на то, что мобильные элементы значительно чаще встречаются в гетерохроматине, копии gtv.•in в линии Г32 располагаются в основном в эухроматических локусах. Это свидетельствует о том, что gtwin распространился в геноме Г32 сравнительно недавно, и его копии не были элиминированы из эухроматина за счет естественного отбора. В гетерохроматине было обнаружено всего 3 ннсерции элемента. Одна из них оказалась в прицентромерной области плеча ЗЦ а две другие было невозможно сопоставить с положением на цитологической карте. Наибольший интерес представляет ннсерция в точку 2ЯНе(:2829193 (локус в гетерохроматическом участке плеча 2Я). Эта область соответствует одному из описанных Бреннеке и соавторами мастерлокусов регуляции активности МГЭ в геноме йговорИИа melanogaster (Вгеппеске I 2007). Вполне возможно, что именно с попаданием gtwin в этот локус связано прекращение его перемещений.

Амплификация в линии Г32 может быть связана как со свойствами самой линии, так и со свойствами элемента. Для выявления структурно-функциональных особенностей амплифицированных копий gnvi)t, мы клонировали фрагменты этих копии, определили их нуклеотидную последовательность и сравнили последовательности между собой.

3. Структурные особенности gtwin в липни Г32

Для того, чтобы клонировать участки к^'т из линии Г32 были использованы данные об их геномном окружении. К последовательностям геномной ДНК, прилегающей к копиям элемента, были подобраны праймеры для полимеразной цепной реакции. Помимо геномных праймеров в эксперименте также использовались праймеры, комплементарные участкам gtwin. В качестве матрицы использовалась тотальная ДНК мух линии Г32. Всего нам удалось определить нуклеотидные последовательности для 20 копий gtwin из разных сайтов.

Амплификация gtwin в линии Г32 могла быть связана с тем, что в данную линию за счет горизонтального переноса или скрещиваний попал вариант элемента, ранее не присутствовавший в ее геноме. Согласно современным представлениям, новый для линии ретротранспозон не сразу попадает под контроль клеточных механизмов регуляции. Он в

состоянии распространяться по геному ло тех пор, пока не активизируются механизмы сайленсинга.

А

100А5

-21ЧНе1

■ 70А7

- 63Е1

6:3

ЗА7

-93С2

- 52С-5

85

-77С6 •78А2

-20С1

■86Е9

■19Е7 • 75С4

94

■704

96 Е5

67

-75Е2

-6303

7502

■ № 25

В

100

-80Р9+

БЗ

0.001

Рисунок 4. Филогенетическое древо копий из .нпшн Р32.

Копии обозначены в соответствии с их локализацией, кроме: gtwin* - каноническая последовательность элемента из БД генома дрозофилы; №26 - копия, окруженная элементами нисгор 'ш и Р; 2ИИе1 - копия, локализованная в регуляторном мастерлокусе.

Сравнение клсшнрованных нами последовательностей показало, что в линии Г32 присутствуют две четко различимые группы копий ретротранспозона gtw¡n (рисунок 4). Группа В представлена двумя копиями элемента. Одна из них (обозначенная на рис. 4 как 80Р9+) находится в гетерохроматическом прицентромерном районе левого плеча третьей хромосомы, проксимальнее подсекции 80Р9, а положение второй (обозначенной №26) определить точно невозможно, поскольку она окружена последовательностями МГЭ ппсгор'ю и ^-элемента. Эти копии наиболее близки к канонической последовательности gt^\^¡n.

Копии, относящиеся к группе А, сильнее отличаются от канонической последовательности ¿Шп. Наибольший интерес представляют мутации в сайте, с которым связывается лпэпновая тРНК, участок которой служит затравкой на одной из стадий обратной транскрипции. Можно было бы предположить, что эти изменения должны дать преимущество другому, не измененному, варианту однако полученные нами данные свидетельствуют об обратном. Группа неканонических gtw'm в линии Г32 гораздо более многочисленна, чем группа канонических gt^vin. Таким образом, амплификации подверглись именно элементы с мутантным сайтом отжига РНК-затравки.

В настоящее время gШп не перемещается в линии Г32, следовательно неканонический вариант этого ретротранспозона попал под влияние клеточных механизмов регуляции. В основе таких механизмов могут быть пути РНК-ннтерферснцпп с участием коротких РНК, взаимодействующих с белками семейства РЫп (р]РНК). Активизироваться они могут, если новый мобильный элемент попадет в регуляторный локус, который служит источником таких коротких РНК.

Как следует из таблицы 4, одна из выявленных в линии Г32 копий ^/мто присутствует в мастерлокусе регуляции активности МГЭ. Данная копия из локуса 2КНе1:2829193 относится к группе неканонических копий элемента. Вполне возможно, что сайленсинг^Ли'/г в линии Г32 связан с инсерцией элемента в такой локус.

Канонические копни gtwm не активны в линии Г32. Одна из таких копий содержит инсерцию /^-элемента в З'-ДКП, что говорит о ее нефункциональности. Другая каноническая копия локализована в прицентромерном гетерохроматическом регионе, в котором базовый уровень экспрессии сильно снижен. Видимо, по этой причине gtwin из данной области также не может служить источником новых копий.

4. Тандемные повторы gtwin и кольцевые интермедиа™ ретротранспозицин

Интересно, что среди последовательностей, полученных в результате inverse PCR, было выявлено большое количество клонов, включавших только один или два ДКП gh\'in и не содержавших при этом геномного окружения.

Матрицей для образования таких молекул могли стать либо тандемно расположенные в геноме копии gtwin (структура с одним ДКП, общим для двух копий ретротранспозона присутствует в секвенированном геноме Drosopliila melanogaster под номером АС006215), либо экстрахромосомные кольцевые структуры (рисунок 5). Наличие подобных структур представляет большой интерес, поскольку они могут быть как продуктами вырезания элемента из генома, так и интермедиатами ретротранспозицим. Для выяснения природы этих последовательностей был предпринят ряд дополнительных экспериментов.

"flTwin Ештв gtwm

1300 п.н.

"giwin^güMTgiwin ¡[И

800 п.н.

Рисунок 5. Схема образования ПЦР-продуктов с одним и двумя ДКП.

На иллюстрации показаны два возможных варианта образования данных продуктов. Линейные структуры соответствуют участкам генома, а кольцевые -экстрахромосомным копиям элемента. Темным обозначены ДКП gtwin. штриховкой -ПЦР-продукты, а стрелками - места отжига праимеров.

Для анализа линии Г32 на наличие в ней тандемных повторов ретротранспозона gtwin, или его экстрахромосомных копий мы также использовали полимеразную цепную реакцию, прапмерамп для которой служили те же олнгонуклеотиды, что и в случае inverse PCR. В качестве матрицы для этой реакции были использованы препараты тотальной ДНК линии Г32 а также кольцевой ДНК. выделенной из мух данной линии по методу Хирт.

1300 ■ 800 ■

Х-

1 - •

Рисунок 6. Электрофореграмма результатов ПЦР.

На первой дорожке показана маркерная ДНК. на второй - ПЦР-продукт с тотальной ДНК, на третьей - ПЦР-продукт с ДНК, выделенной по методу Хирт.

ПЦР-продукты, полученные с использованием различных препаратов ДНК в качестве матрицы, оказались идентичны (рисунок 6). В обоих вариантах образовывались фрагменты, содержащие как один ДКП gtwin, так и два ДКП этого элемента. Этот результат подтвердил, что в линии Г32 присутствуют экстрахромосомные кольцевые копии исследуемого ретротранспозона.

Для выяснення, является ли наличие подобных структур типичным для элемента gtл^in, нами, помимо линии Г32, были проанализированы еще 9 линий мух Ого5оркИа те!апо°си1ег. В результате ПЦР-анализа с использованием тотальной ДНК мух этих линий было выявлено, что фрагменты, содержащие два ДКП £Лг«, присутствовали только в ПЦР-продукте линии Г32, а фрагменты, содержащие один ДКП, встречались в ряде линий, включая линию Г32. Любопытно, что в ПЦР-продуктах, полученных на тотальной ДНК всех линий, за исключением Г32, присутствовал фрагмент длиной 3000 п.н. (рис. 7).

Сч1 ГО

о

о

сп

т—

с с

X о о со

Ц О) ш с со >-

— го го X

о X о о о X

ся

с о

СП

ф

о

3000

1300 800

Рисунок 7. ГЩР-продукты, полученные с тотальной ДНК исследованных линий

Представлена электрофореграмма с ПЦР-продуктами, полученными с тотально!! ДНК 9 линий мух ОгозорИИа те1апо%а$1ег.

ПЦР-фрагмент длиной 3000 был клонирован, и его нуклеотидная последовательность была определена. В результате этого было показано, что в нем между двумя ДКП %Ы~\п находится последовательность мобильного элемента 1пуас!ег2. Наиболее вероятная локализация этих последовательностей в геноме, согласно Р1уВахс -и:8994914..8995542. Вполне возможно, что такой консервативный участок генома, в котором находятся сразу три ретроэлемента, может выполнять некую регуляторную функцию.

Наличие в линии Г32 экстрахромосомных копий gtwin, содержащих два ДКП данного элемента, оказалось уникальным свойством этой линии, Подобные структуры могут формироваться как из линейного интермедиата ретротранспозиции, так и в результате очень редкого события - точного вырезания элемента из генома. Для того, чтобы выяснить, какой из двух этих возможных вариантов соответствует действительности, был клонирован набор ПЦР-фрагментов длиной 1300 п.н., полученных на матрице тотальной ДНК линии Г32.

В результате секвенирования полученных последовательностей было выявлено 17 уникальных клонов, которые мы сравнили между собой и с каноническом последовательностью ДКП ретротранспозона $Гл'1п.

В нуклеотидных последовательностях полученных клонов помимо единичных замен были обнаружены пять полиморфных сайтов. В каждом из таких сайтов наблюдалось два различных варианта нуклеотидов. Три обнаруженных полиморфных сайта приходились на

область ДКП, а два - на 5'-нетранслируемую область. Особый интерес представляют замены в позициях 497 и 503, так как они затрагивают сайт связывания тРНК-затравкн, необходимой для обратной транскрипции (рисунок 8).

3aaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacac attaattgacgcccgacgtgc atttgaac-ctgc acctagt 3aaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt 3aaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaac acattaattgacgc с с gac gtgc atttgaac с tgc ac ctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattgacgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattggcgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattggcgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt

jaaggaggaacacattaattggcgcccgacgtgcatttgaacctgcacctagt

jaaggaggaacacattaattggcgcccaacgtgcatttgaacctgcacctagt jaaggaggaacacattaattggcgcccaacgtgcatttgaacctgcacctagt

jaaggaggaacacattaattggcgcccaacgtgcatttgaacctgcacctagt

сайт отжига РНК-затравки: TGGCGCCCAACGTG

Рисунок 8. Участок 5'-нетранслируемой области полученных клонов в сравнении с последовательностью канонического gtwin.

Выделен сайт отжига РНК-затравки и мутации в нем.

Среди 17 исследованных клонов 15 содержали замену остатка гуанина на остаток аденина в 503-й позиции. Помимо этого 12 из 17 клонов содержат гуанин вместо аденина в позиции 497, что также должно снижать эффективность связывания затравки в том случае, если используется нормальная тРНК. Здесь стоит отметить, что все геномные копии gtwin, обнаруженные в результате inverse PCR, за исключением двух, также имеют G в положении 503, то есть, содержат точечную мутацию.

В проанализированных клонах различия наблюдались не только в ДКП, но и в области между ними. В 9 из 17 случаев копии gtwin непосредственно соседствовали друг с другом - без вставок или делеций нуклеотидных остатков. В 4 случаях между ДКП обнаружились вставки от I до 13 нуклеотпдов, а остальные 4 клона несли делецин различной длины (от 1 до 80 нуклеотидов) (рисунок 9).

полученные клоны

кяноническнн

gtwin

ег*есА4АтсгесА.«С,5С' ТСС/, :АСЧАч^ссАСАСА7ссс^А;сАССААСА<АГ7АА777Аоом^сс»и;7АсттААСААСГАлсАССЛСАСА?ТА77Алзд£с&САСА7ЛТААС&ААТГМ7?ААтл7А&Шм7вС7еле

йлссаоа1с scca.cc ' i- :лс; а:- с1яса. аi . .. -ла;са&1;аасасм7аа7171лл 7ас77ласаа'лла0лссасасас1ат :ааслссасаса!а1ааскааттаат1аа7к:лалсаг.7сстоас

вС*ССАС4ТСТССАСС=ССТСа;»СГАГССЛ1ГАГА'Г т'тол 1сассаа':х»'АТТ*а1т* ас7таасаас7 ааяасса'лсас 7л77аа0дсс*саса7|>таасааа7таа77а а7а?ла*саатсс|оас

«АССлел1СГеСАС|Г -Ч 7С<^АСС.^С0САСА~ АТ . СССЛА;саСС1а;а<ДГ?АА77С.............- АСТ7ААСААС7ААСАССлаСАС7А7 7А^&АСАСА7А7АА,САААТ7АА7ПА7А:ААА<ШСС7ЛАС

ОгАССАСАтгтССАСССГГТССАСдсСАгеССкСАСАТССССААЗеАССААГАС ».АСААТССТИАС

ВСАССАСАТС1ССАСС...........................................................АОТТААСААСТ ААЛАГ.С АСАСАГ 7А7 ТААСАССАСАСА7АТААС^АА7ТАА77АА7А7А&ЛСААТ(>£Т&АС

± С:АССАСА7С1ССАССССС7С<у.<:ассасс&САСАСАТ«сваа'; нахсаа -: АЛСАГС ■.1-.«.7а7:аасассасаса1а7аас»ааттаа771а7а:АААС.1а.:1.с11у.с С _ СС АССАСАТС7ССлСССГС7ССАСаССАССССАСАСАТССССААЗСАС лг.г7аасаас7аасаога-1агГАТ7ААСАССАСАСА7А7ААСАААТГААТ7АА7АГгААСАА7еС'ГеАС С - ССАССАСА7С1ССАС1«С7СЫ<;АСС ^С'Г.ЙАГ*;ЧТ ':сг.а»^а№ААСА.......-..............асг7аасаас7 аасасг А-.-Ц'-л • т»7 7аасассайаса7атааслааттаат7аа7*7АА»С*)С*«стсас

ъ = с:ассасат:1ссасс. '-7ссаслссас:м;аса;а1 .ла;сассаа^аса::аа: аспааслас1аасассаслслс ;ат7аасассасасата7Мсааагтаа77аа7а7/.аасаа7сс7';ас

^ 7 КАССАСАТСГССАСС-ТСТиСА^АСС -СС6САСАСА7 .ч:'-'»ААЯ5АССААеАГАГ1АА77 АС1 7ААСААС7ААЛА1ЯСАСАСАС 7А77ААС10САСАСА7АТААСААА7ТААГ7АА7А:А*АСАА?«С7«АС -' 'X САСАТ <ГСС»СГ " - - -Г.-1 . д--,- - ;САГА"АТ " " •-А1-.Г.АСеААСАСАТ7АА:7 .....АЛ7 ТААСААС7 ААСАССАСАСАС ТА7 7ААСАССАСАСА7А7ААСАААГ ГАА77ААТА7АААСАА7 ЙС7СА'".

с 5:ассаса7Сгссасс . • 7С1.а-а: л . • -аал;*ссла1.а(;аг7аа77 аут 7Ллсаас7 аауах»слсасас та~7аасассасаса7атаасаалт1,аат1аа7а,.*лаасаа.1>'С7Сас

= «АСеАСА7:7ССА« 7СЙ» '.Г.АСА"».Т -¡АА".ГАСЛААГАСЛГТААТГ..............>,С77ААСААСГАЛРАЙСАСАГДС7АГТААСА^АЛАСАТА7ААСАААТГАА774ЛТл"И*СААГЯГ,7«С

6САССАСАТС7ССАСС;СС7Се*слссассс6аса:А7СееСААгСАСеААСАСАГ7АА:т ...... - аст хаасаасгаасаст асасас гат талса сса£АСАТА га4саллггал г гаага ТАЛАС алгссг<?АС

кассасагсгссасс:«'теы:а са-ч4сасаса7 аа;сассаа «га::аап *с1 гаасаас7аа«аосасасас7а77аасассаоаса7а7аасиаагтаа77аа7а:лаасаа:сс7сас

«АССАвАТГ ТССаСС >г7СЫ КАССАМ 6С.АСАСА7е«СААЪСАееА АС и'АТТАА77 ......... -АС.7 »ААСААСГААСАРС АСАСАС 7А77ААС<.ССАйАСЛ7А7аАСААЛ7 ГААТ7АА7А7АААеАА70С7 лас

касса5аг:1ссасгас7«б/^,ас'-а'.ччоаса.ь7:- :''аа^сас1;аа'.д'дг:<а7: лиг гаасаас*ааолссасасаста? тааоай:асасата7аасала1гаагпага;лаасаа7ссг1;ас

ССАССАСАТСТССАС.СПСС7спасассассссасасат^СССАА5САЛСААСАГАГ7АА77 АС77ААСААС7 ААСАЛСАСАСАС7АТ7ААСАССАС-АСАТАТААСКМТ7ААТ7ЛАТА7А^АСААТ6С?САС

пч'п КАе9ХОАТеГСеА<вМС7СвАГ.)1Л<:Ае1:«вАСАСА7гСееА115СА<»ААС»САТТАА7Т ..........АСЬТ ТААСААС7ААСАЛСАСАСАС7А7 7АА6АССАЙАС А7А7ААСАЛАТТААТ 7 АА7А лаг*

Рисунок 9. Результаты выравнивания областей смыкания двух ДКП.

Показаны концевые участки ДКП gt\v¿n, выделенные из ПЦР-продукта с тотальной ДНК линии Г32. Светло-серым обозначены области с заменами, темно-серым - абсолютно идентичные области. Отсутствие нуклеотидов показано штрихом.

Экстрахромосомные кольцевые копии могут образовываться не только как результат обратной транскрипции, но и как результат точного вырезания элемента из генома посредством интегразы. В описанной ситуации это представляется менее вероятным, поскольку в результате точного вырезания интегразой, между ДКП должны были бы оставаться 4 нуклеотида, соответствующих дупликации сайта-мишени инсерции, однако этого не наблюдается. Таким образом, наиболее вероятно, что §№¡4 в линии Г32 образует интермедиаты ретротранспозиции, которые, однако, не встраиваются в геном, поскольку перемещений элемента не выявлено.

Наличие в большинстве клонированных участков экстрахромосомных кольцевых копий gíwin мутантного сайта отжига РНК-затравки могло свидетельствовать о том, что неканонический вариант элемента, несмотря на мутации, способен к обратной транскрипции.

Выводы

1. В линии Г32 обнаружена и картирована крупная комплексная хромосомная аберрация, затрагивающая оба плеча третьей хромосомы, Показано, что аберрация встречается в линии с высокой частотой и не элиминируется с течением поколений.

2. Методом гибридизации in situ исследовано распределение сайтов локализации регротранспозона gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32. Показано, что аберрантная третья хромосома содержит значительно больше копий элемента, чем нормальные.

3. Распределение копий gtwin на политенных хромосомах линии Г32 постоянно, что свидетельствует о том, что в настоящее время элемент не перемещается.

4. Проведена точная локализация большинства копий gtwin в геноме линии Г32. Показано, что копии элемента находятся преимущественно в эухроматнческих участках генома.

5. Помимо канонического, в линии Г32 обнаружен новый вариант gtwin, имеющий ряд отличий от ранее известного, наиболее интересными из которых являются мутации в сайте отжига тРНК-затравки. Показано, что именно этот новый вариант сильно амплифицирован в линии.

6 Обнаружены экстрахромосомш.ге кольцевые копни gtwin в линии Г32, Показано, что эти структуры вероятнее всего образовались из линейных интермедиатов ретротрапспозишш элемента.

7. Обнаружена инсерцня gtwin в предполагаемый мастерлокус регуляции активности МГЭ, что могло послужить причиной прекращения его ретротранспозиций в линии Г32.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Ю.Э. Стефанов, А.П. Котнова, Е.Г. Пасюкова, Н. В. Любомпрская, А.И. Ким, Ю.В. Ильин. «Ретротранспозон gtwin в линии Г32 Drosophila melanogaster: повышенное число копий элемента привело к возникновению хромосомной аберрации» Докл. Акад. Наук, 2007 т. 4.13(5) с. 696-698

2. Ю.Э. Стефанов, А.П. Котнова, И.А. Глухов, 11.В. Любомпрская, Ю.В. Ильин. «Особенности ретротранспошционной активности эндогенного ретровируса gnvin в линии Г32 Drosophila melanogaster» Докл. Акад. Наук, 2009 т. 424(4) с. 555-558

Тезисы конференции

1. Y.E. Stefanov, А.P. Kotnova, Y.V. llyin. An increased number of copies of retrotransposon gtwin caused chromosomal aberration in G32 Drosophila melanogaster strain. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Kyiv 20-22 September 2007

2. Stefanov Y.E., Kotnova A.P., Pasyukova E.G., Lyubomirskaya N.V., Kim A.I., llyin Y.V. Unusual genetic properties of Drosophila melanogaster strain G32: Increased number of retrotransposon gtwin copies is associated whilh chromosomal aberration. Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenctic Regulation of Genome Stability« Санкт-Петербург, 24-26 июня 2008.

Заказ № 120-a/l 1/09 Подписано в печать 19.11.2009 Тираж 120 эк-j. Усл. п.л. 1.5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:iiifo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стефанов, Юрий Эдуардович

Оглавление.

Список используемых сокращений.

1. Введение.

2. Взаимодействие мобильных генетических элементов с геномом организма-хозяина.

Обзор литературы).

2.1. Классификация мобильных элементов.

2.1.1. Ретротранспозоны.

2.1.2. ДНК-транспозоны.

2.2. Влияние мобильных элементов на стабильность генома.

2.2.1. Инсерционный мутагенез.

2.2.2. Геномные перестройки.

2.2.3. Эволюционная роль мобильных элементов.

2.2.4. Мобильные элементы в симбиозе с геномом организма-хозяина.

2.3. Регуляция активности мобильных элементов.

2.3.1. Экология генома.

2.3.2. Эпигенетические пути сайленсинга мобильных элементов и РНК-интерференция

3. Материалы и методы.

3.1. Линии мух и штаммы бактерий, использованные в работе.

3.1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.

3.1.2. Штаммы Escherichia coli, использованные в работе.

3.2. Молекулярное клонирование.

3.2.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК

3.2.2. Трансформация.

3.2.3. Выделение ДНК.

3.2.4. Рестрикции.

3.2.5. Лигирование.

3.3. Гибридизация in situ.

3.3.1. Приготовление давленых препаратов политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster.

3.3.2 Приготовление ДНК-зонда, меченного биотином.

3.3.3 Гибридизация in situ.

3.3.4 Картирование сайтов гибридизации.

3.4. Полимеразная цепная реакция.

3.4.1. Inverse PCR.

3.4.2. ПЦР на матрице геномной ДНК.

3.5. Определение первичной последовательности и анализ полученных данных.

4. Результаты.

4.1. Распределение gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32.

4.2. Точная локализация копий gtwin в геноме линии Г32.

4.3. Структурные особенности gtwin в линии Г32.

4. Тандемные повторы gtwin и кольцевые интермедиаты ретротранспозиции.

5. Обсуждение результатов.

5.1. Особенности хромосомной аберрации в линии Г32.

5.2. Сопоставление данных гибридизации in situ с точной локализацией gtwin в геноме линии Г32.

5.3. Сравнение последовательностей gtwin в линии Г32.

5.4. Активность старой и новой копий gtwin в линии Г32.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные особенности и распределение ретротранспозона gtwin, амплифицированного в линии Г32 Drosophila melanogaster"

Мобильные генетические элементы (МГЭ) широко распространены в геномах всех эукариот. Согласно современным данным, доля таких последовательностей в ДНК различных организмов может достигать 70% [Biemont et.al., 2006]. Разнообразие МГЭ также весьма велико, а их классификация, основанная на особенностях жизненного цикла и структуры элементов, постоянно уточняется [Wicker et.al., 2007; Kapitonov et.al., 2008].

Мобильные элементы - это мощный источник генетической нестабильности. Они в состоянии провоцировать хромосомные перестройки и разнообразные эпигенетические эффекты, вызывать инсерционные мутации и дупликации генов [Feschotte et.al., 2007].

Регуляторные последовательности, которые часто входят в состав МГЭ, оказывают воздействие на экспрессию генов организма-хозяина [Pereira et.al., 2009].

Транспозиции мобильных элементов являются одной из движущих сил микроэволюции. Если в стабильных условиях окружающей среды транспозиции мобильных элементов чаще негативно сказываются на жизнедеятельности хозяина, то в изменяющихся и стрессовых для популяций условиях, активность МГЭ может сыграть положительную роль в адаптации [Bowen et.al., 2002].

Несмотря на то, что возможные последствия распространения МГЭ по геному описаны достаточно хорошо, процессы регуляции активности мобильных элементов изучены не полностью, хотя и представляют большой интерес. В норме клеточные механизмы регуляции не дают мобильным элементам проявлять высокую активность, однако под контролем этих механизмов МГЭ оказываются не сразу.

После попадания в геном путем скрещиваний или за счет горизонтального переноса, новый мобильный элемент начинает перемещаться. Этот процесс происходит до тех пор, пока организм-хозяин не приобретает способность контролировать перемещения элемента. Конкретные механизмы этого контроля начали выявляться сравнительно недавно. Считается, что в основе регуляции активности МГЭ лежат механизмы РНКинтерференции, которые сейчас активно изучаются [Aravin et.al., 2007; Brennecke et.al., 2007]. Одним из удобных объектов для изучения регуляции мобильных элементов являются представители рода Drosophila.

МГЭ дрозофилы изучены достаточно хорошо. Среди мобильных элементов разных видов Drosophila преобладают ретротранспозоны — элементы, перемещающиеся посредством РНК-интермедиата [Drosophila 12 Genomes Consortium 2007].

Ретротранспозон gtwin, о котором пойдет речь в настоящей работе, является ближайшим родственником МДГ4 (в англоязычной литературе известного, как gypsy), наиболее хорошо изученного ретротранспозона Drosophila melanogaster. Этот элемент имеет два прямых длинных концевых повтора (ДКП) и три открытые рамки считывания, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env [Котнова и др. 2005].

Gtwin был впервые клонирован из линии Г32 Drosophila melanogaster при поиске в ней последовательностей, гомологичных МДГ4. Позже было продемонстрировано также, что в линии Г32 наблюдается сильная амплификация ретротранспозона gtwin в сравнении с другими линиями [Котнова и др. 2005]. Это могло свидетельствовать о том, что gtwin активно перемещается в настоящее время, либо перемещался в недавнем прошлом. Именно линии, характеризующиеся генетической нестабильностью и амплификацией МГЭ, представляют большой интерес с точки зрения изучения механизмов контроля мобильных элементов со стороны клетки-хозяина.

Основной целью настоящей работы было выявление причин амплификации ретротранспозона gtwin в линии Г32 Drosophila melanogaster, а также выяснение того, перемещается ли этот элемент в настоящее время и, если нет, то что могло привести к его репрессии.

В связи с данными целями были поставлены следующие задачи:

1. Провести локализацию копий ретротранспозона gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32

2. Определить последовательность геномного окружения копий gtwin из линии Г32 и локализовать их в геноме Drosophila melanogaster с помощью базы данных FlyBase

3. Клонировать копии ретротранспозона gtwin или их фрагменты из линии Г32, описать их структурные особенности и сравнить между собой и известной последовательностью gtwin

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Стефанов, Юрий Эдуардович

6. Выводы

1. В линии Г32 обнаружена и картирована крупная комплексная хромосомная аберрация, затрагивающая оба плеча третьей хромосомы. Показано, что аберрация встречается в линии с высокой частотой и не элиминируется с течением поколений.

2. Методом гибридизации in situ исследовано распределение сайтов локализации ретротранспозона gtwin на политенных хромосомах личинок линии Г32. Показано, что аберрантная третья хромосома содержит значительно больше копий элемента, чем нормальные.

3. Распределение копий gtwin на политенных хромосомах линии Г32 постоянно, что свидетельствует о том, что в настоящее время элемент не перемещается.

4. Проведена точная локализация большинства копий gtwin в геноме линии Г32. Показано, что копии элемента находятся преимущественно в эухроматических участках генома.

5. Помимо ранее известного, в линии Г32 обнаружен новый вариант gtwin, имеющий ряд отличий от канонического, наиболее интересными из которых являются мутации в сайте отжига тРНК-затравки. Показано, что именно этот новый вариант сильно амплифицирован в линии.

6. Обнаружены экстрахромосомные кольцевые копии gtwin в линии Г32. Показано, что эти структуры вероятнее всего образовались из линейных интермедиатов ретротранспозиции элемента.

7. Обнаружена инсерция gtwin в предполагаемый мастерлокус регуляции активности мобильных элементов, что могло послужить причиной прекращения его ретротранспозиций в линии Г32.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стефанов, Юрий Эдуардович, Москва

1. Aravin A.A., Hannon G.J., Brennecke J. (2007). "The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race." Science 318(5851): 761-4.

2. Aravin A.A., L.-Q. M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland Т., Meyer J., Tuschl T. (2003). "The small RNA profile during Drosophila melanogaster development." Dev Cell. 5(2): 337-50.

3. Arkhipova I.R., Lyubomirskaya. N. V., Ilyin Y.V. (1995). Drosophila retrotransposons, Mol. Biol. Intel. Unit: R. G. Landes Company, USA.

4. Aulard S., Vaudin P., Ladeveze V., Chaminade N., Periquet G., Lemeunier F. (2004). "Maintenance of a large pericentric inversion generated by the hobo transposable element in a transgenic line of Drosophila melanogaster." Heredity 92(3): 151-5.

5. Bartolome C., Maside X., Charlesworth B. (2002). "On the abundance and distribution of transposable elements in the genome of Drosophila melanogaster." Mol Biol Evol. 19(6): 92637.

6. Bazin C., Dejonghe В., Higuet D. (2004). "Is hobo permissivity related to I reactivity and sensitive to chromatin compaction in Drosophila melanogaster?" Genet Res. 84(2): 71-9.

7. Biemont С, Т. A., Vieira С, Hoogland С. (1997). "Transposable element distribution ш Drosophila." Genetics. 147(4): 1997-9.

8. Biemont С, V. C. (2005). "What transposable elements tell us about genome 0rganizatl0n and evolution: the case of Drosophila." Cyto genet Genome Res. 110: 25-34.

9. Biemont C., Vieira C. (2006). "Genetics: junk DNA as an evolutionary force." 443(7111): 521-4.

10. Bingham P.M., Kidwell M.G., Rubin G.M. (1982). "The molecular basis ofP-N* hybnd dysgenesis: the role of the P element, a P-strain-specific transposon family." Cell 29(3)- 9951004.

11. Bowen N.J, Jordan I.K. (2002). "Transposable elements and the evolution of euK^3"^0*10 complexity." Curr Issues Mol Biol. 4(3): 65-76.1. G J

12. Brennecke J., Aravin A.A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R., (2007). "Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity :tl1 Drosophila." CdL 128(6): 1089-103.j tlieir

13. Brookfield, J. F. (2005). "The ecology of the genome mobile DNA elements aix^3-hosts." Nat Rev Genet. 6(2): 128-36.

14. Brosius, J. (2003). "The contribution of RNAs and retroposition to evolutionary novelties." Genetica 118(2-3): 99-116.

15. Bucheton, A. (1995). "The relationship between the flamenco gene and gypsy in Drosophila: how to tame a retrovirus." Trends Genet. 11(9): 349-53.

16. Burwinkel В., К. M. W. (1998). "Unequal homologous recombination between elements as a mutational mechanism in human genetic disease." J Mol Biol. 277(3): 51319. Caceres M., Barbadilla A., Ruiz A. (1999). "Recombination rate predicts inversion^ S1Z°

17. Diptera." Genetics 153(1): 251-9.

18. Cappello J., Handelsman, K. (2001). "The DIRS1 group of retrotransposons." MoI^J^9^ EvoL 18(11): 2067-82.

19. Сару P., Bazin С., Higuet D., Langin Т., Ed. (1997). Dynamics and Evolution of Transposable Elements. Kluwer Academic Publishers.

20. Casals F., Gonzalez J., Ruiz A. (2006). "Abundance and chromosomal distribution of six Drosophila buzzatii transposons: BuTl, BuT2, BuT3, BuT4, BuT5, and BuT6." Chromosoma. 115(5): 403-12.

21. Charlesworth В., Langley C.H., Sniegowski P.D. (1997). "Transposable element distributions in Drosophila." Genetics. 147(4): 1993-5.

22. Chu C.Y., Rana T.M. (2007 ). "Small RNAs: regulators and guardians of the genome." J Cell Physiol. 213(2): 412-9.

23. Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H.E., Ed. (1997). Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

24. Conte C., Dastugue В., Vaury C. (2002). "Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retro transposons." EMBO J. 21(14): 3908-16.

25. Corces V.G., Geyer P.K. (1991). "Interactions of retrotransposons with the host genome: the case of the gypsy element of Drosophila." Trends Genet. 7(3): 86-90.

26. Czech В., Malone C.D., Zhou R., Stark A., Schlingeheyde C., Dus M., Perrimon N., Kellis M., Wohlschlegel J.A., Sachidanandam R., Hannon G.J., Brennecke J. (2008). "An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila." Nature 453(7196): 798-802.

27. Danilevskaya O.N., Arkhipova I.R., Traverse K.L., Pardue M.L. (1997). "Promoting in tandem: the promoter for telomere transposon HeT-A and implications for the evolution of retroviral LTRs." CeH 88(5): 647-55.

28. Deininger P.L., Batzer M.A. (1999). "Alu repeats and human disease." Mol Genet Metab. 67(3): 183-93.

29. Deininger PL, В. M. (2002). "Mammalian retroelements." Genome Res. 12(10): 1455-65.

30. Dolgin E.S., Charlesworth B. (2008). "The effects of recombination rate on the distribution and abundance of transposable elements." Genetics. 178(4): 2169-77.

31. Dunn C.A., Medstrand P., Mager D.L. (2003). "An endogenous retroviral long terminal repeat is the dominant promoter for human betal,3-galactosyltransferase 5 in the colon." Pro с Natl Acad Sci USA. 100(22): 12841-6.

32. Dunn C.A., van de Lagemaat L.N., Baillie G.J., Mager D.L. (2005). "Endogenous retrovirus long terminal repeats as ready-to-use mobile promoters: the case of primate beta3GAL-T5." Gene 364: 2-12.

33. EickbuslbT-.H., Furano A.V. (2002). "Fruit flies and humans respond differently to retrotransposons." Curr Opin Genet Dev. 12(6): 669-74.

34. Engels W.R., Preston C.R. (1984). "Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila." Genetics. 107(4): 657-78.

35. Esnault C., Maestre J., Heidmann T. (2000). "Human LINE retrotransposons generate processed pseudogenes." Nat Genet. 24(4): 363-7.

36. Evgen'ev M.B., Arkhipova I.R. (2005). "Penelope-like elements—a new class of retroelements: distribution, function and possible evolutionary significance." Cytogenet Genome Res. 110(1-4): 510-21.

37. Feschotte C., Pritham E.J. (2007). "DNA transposons and the evolution of eukaryotic genomes." Annu Rev Genet 41: 331-68.

38. Finnegan, D. J. (1989). "Eukaryotic transposable elements and genome evolution." Trends Genet. 5(4): 103-7.

39. Finnegan, D. J. (1992). "Transposable elements." Curr Opin Genet Dev. 2(6): 861-7.

40. Fire A., Albertson D., Harrison S.W., Moerman D.G. (1991). "Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle." Development 113(2): 503-14.

41. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature. 391(6669): 806-11.

42. Frankel A.D., Young J.A. (1998). "HIV-1: fifteen proteins and an RNA." Annu Rev Biochem. 67: 1-25.

43. Galagan J.E., Selker E.U. (2004 ). "RIP: the evolutionary cost of genome defense." Trends Genet. 20(9): 417-23.

44. Gallagher P.C., Lear T.L., Coogle L.D., Bailey E. (1999). "Two SINE families associated with equine microsatellite loci." Mamm Genome. 10(2): 140-4.

45. Ghildiyal M., Zamore P.D. (2009 ). "Small silencing RNAs: an expanding universe." Nat Rev Genet. 10(2): 94-108.

46. Goodwin T.J., Butler M.I., Poulter R.T. (2003). "Cryptons: a group of tyrosine-recombinase-encoding DNA transposons from pathogenic fungi." Microbiology. 149(Pt 11): 3099-109.

47. Greene В., Walko R., Hake S. (1994). "Mutator insertions in an intron of the maize knottedl gene result in dominant suppressible mutations." Genetics 138(4): 1275-85.

48. Gunawardane L.S., Saito K., Nishida K.M., Miyoshi K., Kawamura Y., Nagami Т., Siomi H., Siomi M.C. (2007). "A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila." Science 315(5818): 1587-90.

49. Han J., Lee Y., Yeom K.H., Kim Y.K., Jin H., Kim V.N. (2004). "The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing." Genes Dev. 18(24): 3016-27.

50. Hedges D.J., Cordaux R., Xing J., Witherspoon D.J., Rogers A.R., Jorde L.B., Batzer M.A. (2005). "Modeling the amplification dynamics of human Alu retrotransposons." PLoS Comput Biol. 1 (4)(e44).

51. Hirt, B. (1967). " Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures." J. Mol. Biol. 26: 365-369.

52. Hollister J.D., Gaut B.S. (2009). "Epigenetic silencing of transposable elements: a tradeoff between reduced transposition and deleterious effects on neighboring gene expression." Genome Res. 19(8): 1419-28.

53. Home I., Haritos V.S. (2008). "Multiple tandem gene duplications in a neutral lipase gene cluster in Drosophila." Gene 411(1-2): 27-37.

54. Horowitz H., Berg C.A. (1995). "Aberrant splicing and transcription termination caused by P element insertion into the intron of a Drosophila gene." Genetics 139(1): 327-35.

55. Hummel Т., Klambt C. (2008). "P-element mutagenesis." Methods Mol Biol. 420: 97117.

56. Ikenaga H., Saigo К. (1982). "Insertion of a movable genetic element, 297, into the T-A-T-A box for the H3 histone gene in Drosophila melanogaster." Proc Natl Acad Sci U S A 79(13): 4143-7.

57. Ishimaru S., Saigo K. (1993). "The Drosophila forked gene encodes two major RNAs, which, in gypsy or springer insertion mutants, are partially or completely truncated within the 5'-LTR of the inserted retrotransposon." Mol Gen Genet. 241(5-6): 647-56.

58. Kapitonov V.V., Jurka J. (2001). "Rolling-circle transposons in eukaryotes." Proc Natl Acad Sci US А. 98C15): 8714-9.

59. Kapitonov V.Y., Jurka J. (2005). "RAG1 core and V(D)J recombination signal sequences were derived from Transib transposons." PLoS Biol. 3(6)(el81).

60. Kapitonov V.V., Jurka J. (2006). "Self-synthesizing DNA transposons in eukaryotes." Proc Natl Acad Sci US A. 103(12): 4540-5.

61. Kapitonov V.V., Jurka J. (2008). "A universal classification of eukaryotic transposable elements implemented in Repbase." Nat Rev Genet. 9(5): 411-2.

62. Kidwell M.G., Lisch D. (1997). "Transposable elements as sources of variation in animals and plants." Proc Natl Acad Sci USA. 94(15): 7704-11.

63. Kim A., Terzian C., Santamaria P., Pelisson A., Purd'homme N., Bucheton A. (1994). "Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster." Proc Natl Acad Sci USA. 91(4): 1285-9.

64. Kim J.M., Vanguri S., Boeke J.D., Gabriel A., Voytas D.F. (1998). "Transposable elements and genome organization: a comprehensive survey of retrotransposons revealed by the complete Saccharomyces cerevisiae genome sequence." Genome Res. 8(5): 464-78.

65. Kim V.N., Han J., Siomi M.C. (2009). "Biogenesis of small RNAs in animals." Nat Rev Mol Cell Biol. 10(2): 126-39.

66. Klobutcher L.A., Herrick G. (1995). "Consensus inverted terminal repeat sequence of Paramecium IESs: resemblance to termini of Tcl-related and Euplotes Tec transposons." Nucleic Acids Res. 23(11): 2006-13.

67. Kloeckener-Gruissem В., Vogel J.M., Freeling M. (1992). "The TATA box promoter region of maize Adhl affects its organ-specific expression." EMBO J. 11(1): 157-66.

68. Kramerov D.A., Vassetzky N.S. (2005). "Short retroposons in eukaryotic genomes." lilt Rev Cvtol. 247: 165-221.

69. Kriegs J.O., Churakov G., Kiefmann M., Jordan U., Brosius J., Schmitz J. (2006). "Retroposed elements as archives for the evolutionary history of placental mammals." PLoS BioL 4(4)(e91).

70. Kumar S., Tamura K., Nei M. (2004). "MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment." Brief Bioinform. 5(2): 150-63

71. Ladeveze V., Aulard S., Chaminade N., Periquet G., Lemeunier F. (1998). "Hobo transposons causing chromosomal breakpoints." Proc Biol Sci. 265(1402): 1157-9.

72. Lajoinie О., Drake M.E., Dastugue В., Vaury С. (1995). "Aberrant pre-mRNA maturation is caused by LINE insertions into introns of the white gene of Drosophila melanogaster." Nucleic Acids Res. 23(20): 4015-22.

73. Landry J.R., Rouhi A., Medstrand P., Mager D.L. (2002). "The Opitz syndrome gene Midi is transcribed from a human endogenous retroviral promoter." Mol Biol Evol. 19(11): 1934-42.

74. Langley C.H., Montgomery E., Hudson R., Kaplan N., Charlesworth B. (1988). "On the role of unequal exchange in the containment of transposable element copy number." Genet Res. 52(3): 223-35.

75. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. (1993). "The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14." Cell 75(5): 843-54.

76. Lerman D.N., Feder M.E. (2005). "Naturally occurring transposable elements disrupt hsp70 promoter function in Drosophila melanogaster." Mol Biol Evol. 22(3): 776-83.

77. Levis R.W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L.A., Sheen F.M. (1993). "Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere." Cell 75(6): 1083-93.

78. Lim J.K., Simmons M.J. (1994). "Gross chromosome rearrangements mediated by transposable elements in Drosophila melanogaster." BioEssays 16: 269-275.

79. Lister C., Jackson D., Martin C. (1993). "Transposon-induced inversion in Antirrhinum modifies nivea gene expression to give a novel flower color pattern under the control of cvcloidearadialis." Plant Cell. 5(11): 1541-53.

80. Mack J.A., Smith R.D., Kuhn D.T. (1997). "Mobile element 297 in the Abd-B gene of Drosophila melanogaster, not Delta 88, is responsible for the tuh-3 mutation." Genetics. 147(2): 679-88.

81. Maksakova I.A., Romanish M.T., Gagnier L., Dunn C.A., van de Lagemaat L.N., Mager D.L. (2006). "Retroviral elements and their hosts: insertional mutagenesis in the mouse germ line." PLoS Genet. 2(l)(e2).

82. Malik H.S., Henikoff S. (2005). "Positive selection of Iris, a retroviral envelope-derived host gene in Drosophila melanogaster." PLoS Genet. I(4)(e44).

83. Malik H.S., Henikoff S., Eickbush Т.Н. (2000). "Poised for contagion: evolutionary origins of the infectious abilities of invertebrate retroviruses." Genome Res. 10(9): 1307-18.

84. Martens J.H., O'Sullivan R.J., Braunschweig U., Opravil S., Radolf M., Steinlein P., Jenuwein T. (2005). "The profile of repeat-associated histone lysine methylation states in the mouse epigenome." EMBO J. 24(4): 800-12.

85. Mathiopoulos K.D., della Torre A., Predazzi V., Petrarca V., Coluzzi M. (1998). "Cloning of inversion breakpoints in the Anopheles gambiae complex traces a transposable element at the inversion junction." Proc Natl Acad Sci USA. 95(21): 12444-9.

86. Mevel-Ninio M., Pelisson A., Kinder J., Campos A.R., Bucheton A. (2007). "The flamenco locus controls the gypsy and ZAM retroviruses and is required for Drosophila oogenesis." Genetics. 175(4): 1615-24.

87. Miskey C., Izsvak Z., Plasterk R.H., Ivies Z. (2003). "The Frog Prince: a reconstructed transposon from Rana pipiens with high transpositional activity in vertebrate cells." Nucleic Acids Res. 31(23): 6873-81.

88. Montgomery E.A., Langley C.H. (1983). "Transposable Elements in Mendelian Populations. II. Distribution of Three COPIA-like Elements in a Natural Population of Drosophila melanogaster." Genetics 104(3): 473-483.

89. Morgante M., Brunner S., Pea G., Fengler K., Zuccolo A., Rafalski A. (2005). "Gene duplication and exon shuffling by helitron-like transposons generate intraspecies diversity in maize." Nat Genet. 37(9): 997-1002.

90. Navarro A., Betran E., Barbadilla A., Ruiz A. (1997). "Recombination and gene flux caused by gene conversion and crossing over in inversion heterokaryotypes." Genetics 146(2): 695-709.

91. Nekrutenko A., Li W.H. (2001). "Transposable elements are found in a large number of human protein-coding genes." Trends Genet. 17(11): 619-21.

92. Pardue M.L., DeBaryshe P.G. (2003). "Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres." Annu Rev Genet. 37: 485-511.

93. Pardue M.L., D. O. N., Traverse K.L., Lowenhaupt K. (1997). "Evolutionary links between telomeres and transposable elements." Genetica. 100(1-3): 73-84.

94. Parnell T.J., V. M. M., Skjesol A., Helou C„ Kuhn E.J., Geyer P.K. (2003). "An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila." Proc Natl Acad SciUS A. 100(23): 13436-41.

95. Puig M., Caceres M., Ruiz A. (2004). "Silencing of a gene adjacent to the breakpoint of a widespread Drosophila inversion by a transposon-induced antisense RNA." Proc Natl Acad Sci USA. 101(24): 9013-8.

96. Quesneville H., Bergman C.M., Andrieu O., Autard D., Nouaud D., Ashburner M., Anxolabehere D. (2005). "Combined evidence annotation of transposable elements in genome sequences." PLoS Comput Biol. 1(2): 166-75.

97. Schotta G., Ebert A., Dorn R, Reuter G. (2003). "Position-effect variegation and the genetic dissection of chromatin regulation in Drosophila." Semin Cell Dev Biol. 14(1): 67-75.

98. Seberg O., Petersen G. (2009). "A unified classification system for eukaryotic transposable elements should reflect their phylogeny." Nat Rev Genet. 10(4): 276.

99. Shapiro, J. A. (2005). "A 21st century view of evolution: genome system architecture, repetitive DNA, and natural genetic engineering." Gene. 345(1): 91-100.

100. Slotkin R.K., Martienssen R. (2007). "Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome." Nat Rev Genet. 8 (4): 272-85.

101. Sniegowski P.D., Charlesworth B. (1994). "Transposable element numbers in cosmopolitan inversions from a natural population of Drosophila melanogaster." Genetics. 137(3): 815-27.

102. Sniegowski PD, С. B. (1994 ). "Transposable element numbers in cosmopolitan inversions from a natural population of Drosophila melanogaster." Genetics. 137(3): 815-27.

103. Snyder M.P., Kimbrell D., Hunkapiller M., Hill R., Fristrom J., Davidson N. (1982). "A transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene." Proc Natl Acad Sci USA. 79(23): 7430-4.

104. Song M., Boissinot S. (2007). "Selection against LINE-1 retrotransposons results principally from their ability to mediate ectopic recombination." Gene 390(1-2): 206-13.

105. Song X., Sun Y., Garen A. (2005). "Roles of PSF protein and VL30 RNA in reversible gene regulation." Proc Natl Acad Sci USA. 102(34): 12189-93.

106. Tempel S., Jurka M., Jurka J. (2008). "VisualRepbase: an interface for the study of occurrences of transposable element families." BMC Bioinformatics. 9: 345.

107. Walsh C.P., Chaillet J.R., Bestor Т.Н. (1998). "Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation." Nat Genet. 20(2)(116-7).

108. Wightman В., Ha I., Ruvkun G. (1993). "Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans." Cell. 75(5): 855-62.

109. Wilder J., Hollocher H. (2001). "Mobile elements and the genesis of microsatellites in dipterans." Mol Biol Evol. 18(3): 384-92.

110. Yergeau D.A., Mead P.E. (2007). "Manipulating the Xenopus genome with transposable elements." Genome Biol. 8(Suppl 1:S11).

111. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor Т.Н. (1997). "Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites." Trends Genet. 13(8): 335-40.

112. Zamore, P. D. (2007). "RNA silencing: genomic defence with a slice of pi." Nature 446(7138): 864-5.

113. Котнова А.П., Карпова H.H., Феоктистова M.A., Любомирская Н.В., Ким А.И., Ильин Ю.В. (2005). "Ретротранспозон gtwin: структурный анализ и распределение в линиях дрозофилы." Генетика 41(1): 23-9.

114. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. (1984). Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, Мир.1. Благодарности

115. Автор выражает признательность коллективу лаборатории подвижности генома ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН за помощь при проведении экспериментов, написании данной работы и моральную поддержку.

116. Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю академику РАН Юрию Викторовичу Ильину за чуткое и последовательное руководство и помощь в решении проблем.

117. Особую благодарность автор выражает своей семье и друзьям за терпение и поддержку в данной работе.