Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ промоторных областей гена oct-1 мыши

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ промоторных областей гена oct-1 мыши"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЫАРДТА

На правах рукописи

г

СЫТИНА Елена Вячеславовна

Структурно-функциональный анализ промоторных областей гена оМ-1 мыши

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетической иммунологии Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель: к б н Панкратова Елизавета Владимировна

Научный консультант: д б н, профессор Поляновский Олег Леонидович

Официальные оппоненты: д б н, профессор Георгиева Софья Георгиевна к б н Николаев Лев Григорьевич

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится а июня 2005г в а на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан^мая 2005 г

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат химических наук /7/ '/УЦ/^ ' — АМКрицык

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Белок Oct-1 - фактор транскрипции, принадлежащий к POU-семейству Описанный в конце 80х годов, Oct-1 долгое время считался исключительно «вездесущим» фактором транскрипции, регулирующим работу генов «домашнего хозяйства» клетки Позднее было показано, что Oct-1 принимает участие в регуляции экспрессии ряда тканеспецифических генов, в том числе генов интерлейкинов, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, генов пролактина, гонадолиберина, тиреотропина и др

Ранее в нашей лаборатории была клонирована кДНК гена oct-1 человека - Oct-IR, которая отличалась на 5'-конце от известной в то время человеческой кДНК ос/-/ Было обнаружено, что разные субформы oct-1 мРНК имеют альтернативный 5'-концевой экзон Oct-IR кодирует 10 аминокислот, Oct-lA,B,C - 21 аминокислоту Сотрудниками нашей лаборатории было показано существование альтернативного сплайсинга для гена oct-1 мыши и наличие тканеспецифической регуляции экспрессии гена oct-1 Сходная картина наблюдается при образовании субформ человеческого белка Oct-1 Кроме того были описаны вездесущие и тканеспецифические изоформы Oct-1, показано существование двух первых экзонов гена oct-1 - 1U (обнаружен в «вездесущих» изоформах), присутствует в мРНК oct-1 только в лимфоидных клетках, тимусе, селезенке, лимфатических узлах и в костном мозге) и 1L (присутствует в тканеспецифических изоформах) Были определены точки инициации транскрипции для обоих промоторов Для экзона 5'-области перед экзоном 1U это позиции -160 и -384 от кодона ATG, перед 1L - проксимальный старт -159 и дистальный -307

К настоящему моменту описано более полутора десятков генов-мишеней Oct-1, несколько взаимодействующих с ним кофакторов, показано его участие в прикреплении хроматина к ядерной мембране При этом ничего не известно о регуляции экспрессии самого гена oct-1 Данная работа посвящена анализу промоторных областей гена oct-1 мыши, поиску возможных механизмов регуляции экспрессии гена этого полифункционального фактора

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы было клонирование промоторных областей гена oct-1 мыши и изучение механизмов его экспрессии на уровне транскрипции В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи

1 Составить экзон-интронную карту генов oct-1 мыши и человека и локализовать положение экзона 1L, определить расстояние между экзонами 1U и 1L в геномах мыши и человека

2 Клонировать 5'-области гена oct-1 перед экзонами 1U и 1L , которые альтернативно включаются в oct-1 мРНК. ____

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

•ш4

3 Провести поиск возможных регуляторных элементов в 5'-областях перед экзонами Ш и 11, Методами задержки подвижности в геле и футпринтинга провести поиск потенциальных регуляторных элементов, отвечающих за ауторегуляцию гена ос/-/

4 Охарактеризовать промоторную активность 5'-областей гена ос/-/ с помощью временной экспрессии в лимфоидных и нелимфоидных клетках

Научная новизна и практическое значение работы. Белок ОсМ - фактор транскрипции, принимающий участие в регуляции экспрессии как генов "домашнего хозяйства", так и многих тканеспецифических генов Вместе с тем о регуляции экспрессии самого гена ос/-/ ничего не известно Нами впервые была клонирована 5'-нетранслируемая область гена ос/-/ и проанализировано ее строение и функциональная активность, показано наличие двух альтернативных промоторов Ш и - универсального и тканеспецифического, показана возможность существования ауторегуляции гена ос/-/ через изменение активности промотора 1Ь

Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию механизмов регуляции экспрессии генов эукариот, образования различных изоформ одного белка, в том числе за счет использования альтернативных промоторов Подобные данные не только углубляют представление о таких фундаментальных биологических процессах, как пролиферация и дифферецировка клеток, но и могут быть использованы при разработке новых терапевтических подходов к лечению рака и вирусных инфекций, при изучении механизмов возникновения наследственных заболеваний

Апробация работы и публикации. Материалы работы были представлены на 7ой Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (2003), годичных конференциях федеральной подпрограммы «Геном человека» в 1998, 1999, 2002 г, по материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и одну таблицу, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (всего 109 наименований)

,1'»^! * 1411. .

* 1 Ь/, г -I # <?

»•*

Результаты исследования.

1 .Экзон-интронная структура гена oct-1 мыши и человека.

Перед нами стояла задача определить, какой из двух экзонов, 1U или 1L, является 5'-концевым в гене oct-1 и локализовать промоторную область гена oct-¡ Для решения этих задач нами была составлена экзон-интронная карта гена oct-1, определено положение экзонов Ш и 1L и клонированы 5-области перед этими экзонами

Локализовать на геномной ДНК положение экзонов 1U и 1L нам удалось только после того, как стала известна последовательность геномов человека и мыши в области гена oct-1 Анализ нуклеотидной последовательности из банка генов (Gene Bank асс no АС093371 6) показывает, что ген oct-1 (локус otf-1) мыши имеет протяженность более 128 тпн и содержит по крайней мере 17 экзонов, а соответствующий человеческий локус OTF-I имеет протяженность более 195тпн (Gene Bank асс no AL45050 и AL 136984) и имеет 18 экзонов

д РОИ,, POU„

Л- I-II-1

1U 1L 2 3 45 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17

I -1 I ИМИ I 1111—IIн

I-^-1-Н^Н-1-,-1-.-,

О 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Б. POU„POUi

I-1-1

1U IB 1L 2 3 4 5 67 8 9 10111213 1415 16

ЬМ-1+ I IIII II ИИ III

-1-1-1-1--1-1-1-1-1-1-1

80 90 100 110 140 150 160 170 180 190 200

Рис 1 Строение локусов 0777-/ и о//-/, где соответственно расположены гены тос1-1 (А) и Лос?-/ (Б) Черными прямоугольниками обозначены экзоны, отмечено положение РОи-домена

Анализ нуклеотидной последовательности показал, что в локусе (>(/-! экзоны I и и 1Ъ разделяет около 67 т п н, а экзон 1Ь в свою очередь находится на 4 т п н «выше» второго

экзона Похожая картина получена и для локуса ОТТ-1 человека экзоны 1 и и 11. разделяет 108 т п н , что составляет около половины длины всего гена (Рис 1)

2 Клонирование и анализ 5 '-областей перед экзонами Ш и 1Ь

В результате скрининга обогащенной геномной библиотеки был получен фрагмент 5'-области гена ос 1-1 длиной 1,3 тпн Установление нуклеотидной последовательности 5'-области гена (Рис 2) позволило локализовать первый экзон (27 п н ) и часть первого интрона Девять кодонов первого экзона полностью соответствуют аминокислотной последовательности ТЧ-кониевой области гена оси], установленной ранее и соответствуют экзону 11. В У-области перед экзоном 1Ь были найдены цис-элементы, которые могут участвовать в регуляции экспрессии гена ос/-/ (Рис 2) В частности, обнаружены две канонические октамерные последовательности в разной ориентации АТТТ<ЗСАТ (-370/-377 п н от начала трансляции) и АТОСАААТ (-493/-500 п н), к которым имеют высокое сродство все Ой-белки (и могут взаимодействовать белки семейства РОТГ) Эта область содержит также три вырожденные ой-последовательности - две с заменой одного нуклеотида - АТТТ(ЗСАА (-758) и АТТТСЮАТ (-781), и третью со вставкой одного нуклесггида между участками, узнаваемыми РОШ- и РОШ-доменами АТТТ^СгСАТ(-1126), и перекрывающийся с ней октамер АТТТССОТ (-1120) с двумя заменами В Ь-промоторной области гена ос.1- 1 также как и в промоторах генов факторов транскрипции Ой-З и Вгп-4, отсутствует канонический ТАТА-бокс Наличие двух канонических ой-последовательностей говорит о возможности ауторегуляции экспрессии гена оси!

В этой же области (положения -330/-1261) расположены пять кластеров, обогащенных А/Т-парами (Рис 2) Содержание А/Т-пар внутри кластеров более чем вдвое превышает содержание О/С-пар В промежутках между кластерами это соотношение лишь немногим больше единицы В кластерах имеются 23 гомеоспецифических мотива, каждый из которых содержит неизменную последовательность ТААТ Всего лишь один гомеоспецифический участок находится между кластерами Местоположение всех идентифицированных цис-элементов указано в нуклеотидной последовательности, приведенной на рисунке 2 Первый кластер содержит три гомеоспецифических участка и каноническую ой-последовательность в обратной ориентации АТТГССАТ Второй - семь гомеоспецифических ТААТ-участков и канонический октамер АТОСАААТ Здесь обнаружены также два участка, содержащие коровую ССААТ-последователыюсть в разной ориентации, которая может служить мишенью для ядерных белков М^-У В этом кластере дважды встречаются тандемы перекрывающихся регуляторных элементов Один тандем из четырех перекрывающихся

последовательностей (-493/-509) ой-, ССААТ- и двух участков, содержащих ТААТ Здесь находится также второй тандем из трех перекрывающихся гомеоспецифических участков (-50/-558) Третий кластер содержит пять гомеоспецифических ТААТ-содержащих участков и ой-последовательность с заменой С-й Четвертый - три гомеоспецифических участка А.

V с1.и«ег(-1261 со -1126)

ГД^ГЛГСТСАЛДСаТГАТААСТГ/иГГГСАААСТТГЛДГ<ААСЛТСГТГДЛГ<?Д5ССТДТАГАТСТЛСЛаД АССТТТТТСТСАААСЛСОСАвАСаТССАГГААСТСХдТАТТССТТСААААААТАСТТАТТТСССАТ

IV с1л1Квг<-1021 Со -976)

Г г Д-ГГ-ТТГТСТГ»ДТ7-ГП.ГГ>АТ1>Т»1>А»1Ц;»ГТС*СЛТЖГА ДГВ1

III с1ивьег{-808 м -715)

ТААГГТСТТТССТТССОАГГАТТТОСАТТСТСТАСАААасСТТТТВСАААТССТСГГЛГТДСТСААОТСАТ ТВТТСССАССАОСААТМВАТТАКАОСТССТТМСТСТСТДСАСТТДТТТСГАДГГГ

II с1и»«г<-684 ^ -495)

ДТГеОКАСАААТСТСАТТТТАТССТССТАДИ'ЛГГДТССТебСАСТСАССАОАГЛЛГДТТТСССТТСАТес АСТСССЛАГГАЛТАТССАААТСТССТСАТАААТАТТТАТСТАТТСАТТТАЛДГГЛ

I с1иве«г(-377 « -293)»па I ехоп (+1 со +27)

ЖТИОСДТААСОСССГДДГСДСЖСССЛТАСГСДГГДАОСТГСДГГДТООАААСТСССАОСТССААТСТТТС ТТТСТАТТГТАТТАСАААААСАЙСААСТТТТСАТССТТСАСТТСССТТСАСААТВТСАСТССТСССТССТА СААСАСАСТААААСТСеТСАСАССААСТСААСТТТССТТАТТСАеТТЯААСАТТаСТАТаеТеТААСТСАА СТТОТАОТТТССТТСТСТТСТТААТТСАСТЭТССЛСТСТТСССАСССТТСТТСТСТТАЛбААСАТАСТАСА САТТТДТТАСАМТАСТАСТГГТТСССССТССССАААСОШ'АССТСТТСеИ'СТТССгатеСАСТСТСТСС

НЬВСвВСУЬ АССТСТТСААЙАТТТТАСАСССАТДд^АСТССАОТаАСТатеСТСТАССТС »31

в.

V № «I н I Ига)

■НИ IV-(Н-I-VI II-г II I I И» I-»нн-шТ Т т ЕееК! НЫШ РэН

Рис 2 Строение 1Ь-промотора гена ос1-1 мыши А Нуклеотидная последовательность АТ-богатых кластеров, ой-сайты, вырожденные ой-сайты, сайты с коровой последовательностью и сайты ССААТ подчеркнуты Два канонических октамера выделены жирным шрифтом Нетранслируемая область кДНК и первый экзон подчеркнуты В Схема строения кластеров в промоторе гена Ой-1 мыши показаны ТААТ-коровые последовательности (I), ой- (♦), вырожденные ой- (V) и ССААТ- (<->) сайты Перекрывающиеся сайты подчеркнуты

Между третьим и четвертым кластерами расположен еще один гомеоспецифический участок В пятом кластере обнаружены пять гомеоспецифических участков и два перекрывающихся ой-мотива (-120/-1134)

С ТААТ-сайтами могут взаимодействовать как регуляторные белки гомеосемейства, так и РОи-белки Встречаемость этих нуклеотидных последовательностей в 5'-области перед экзоном 1Ь гена ос/-/ в семь раз превышает среднестатистическую Ранее было показано, что Ой-белки взаимодействуют т упго не только с канонической ой-последовательностью и

родственными о«-мотивами, но и с гомеоспецифическими участками Эффективность этого взаимодействия очень сильно зависит от двух З'-концевых нуклеотидов ТААПЧЫ Такая же картина наблюдается и в случае белков гомеосемейства 3'-фланкирующие нуклеотиды определяют сродство и специфичность взаимодействия гомеобелков с олигонуклеотидами, содержащими ТААТ-участки

Таким образом, 5'-область перед экзоном 1Ь гена оси1 содержит большое число участков, узнаваемых Ой-белками, те контроль экспрессии этого гена может включать механизм ауторегуляции

Кроме того, в 5'- 1Ь нетранслируемой области обнаружены 2 сайта связывания вездесущего фактора вр1 (-69, -28), №4 (-37) и Ар-2 (-70) сайты

1U

человек

-Л-—•—•—А-А-•——

мышь

-•-mm Л0-Л*—А-»И-

-1-1-!-!-1-1-1-1-1-1-1-!-1-Г I

-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 тпи

человек ' ^

I1|UU|||U dllJII-W -HI-1-

мышь

-ffl-H—II I Ib di-дША I -III-шш—

-1-1-1-'-I-^-1-1-1-1-1-1-1-г

-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 T It H

Рис 3 Схема строения промоторных областей 1U и 1L гена oct-1 человека и мыши Цветом выделены области наибольшей гомологии, показаны сайты • - Spl, А - Ар-2, Д-ССААТ, ■ -octa, □ - вырожденные octa, | - ТААТ

Для анализа 5'-UTR Ш экзона гена oct-1 мыши был проклонирован фрагмент длиной 820 п н Анализ его нуклеотидной последовательности и последовательности из Gene Bank асс no АС093371 6 показал, что данный фрагмент содержит GC-богатые участки протяженностью более 100 п н, где содержание G/C пар превышает 80%, 2 сайта Ар2 и множество сайтов Spl, но совсем не содержит ни од-сайтов, ни каких либо других сайтов, позволяющих говорить о возможности ауторегуляции

Анализ 5'- нетранслируемой области перед экзоном 1U человека (Gene Bank асс по AL45050) также выявил 5 сайтов Spl, 2 сайта Ар-2 и 2 ССААТ-сайта, но при этом не обнаружены ни oct-, ни ТААТ-сайгы Перед экзоном 1U и мыши, и человека не обнаружено четкого группирования цис-элементов в кластеры

Анализ нуклеотидной последовательности показал, что 5-UTR перед экзоном 1U мыши не содержит ТАТА-бокса, a 5-UTR человеческого экзона 1U содержит канонический ТАТА-бокс

3. Поиск сайтов связывания, потенциально способных участвовать в ауторегуляции гена Oct-1 методом задержки подвижности в геле.

3.1 Анализ ДНК-белковых комплексов.

Белки, взаимодействующие с гомеоспецифическими участками, выявляли по их способности образовывать комплекс с ТААТ-пробами, имеющими различные 3'-фланкирующие нуклеотиды в положениях 5 и 6 TAATGA, ТААТСА, ТААТТТ и TAATTG Опыт проводили в одинаковых условиях для всех испытуемых проб Одновременно иденитфицировали ядерные белки, образующие комплекс с oct-еодержащей пробой ДНК С помощью метода задержки подвижности в геле установлено, что в лизате клеток миеломы NS/0 гомеоспецифичсские участки образуют комплексы с белками Oct-1 и Oct-2, но с разным сродством Те же пробы взаимодействуют и с невдентифицированными белками (Рис 4) Так последовательности ТААТТТ и TAATGA преимущественно узнают белки Oct-1 и Oct-2 Они образуют также комплекс с низкомолекулярным белком (молекулярная масса ниже, чем у Oct-2) Образование указанных комплексов конкурентно ингибируется "холодной" пробой ДНК, содержащей ой-последовательность К пробе, содержащей ТААТСА, Oct-белки имеют слабое сродство, но зато с этой пробой связываются два других белка - низкомолекулярный (образование комплекса ингибируется "холодной" oct-пробой) и высокомолекулярный (слабо ингибируется "холодной" oct-пробой) С последовательностью TAATTG образуют комплекс оба Oct-белка и низкомолекулярный белок (конкурентно ингибируется "холодной" oct-пробой), и еще один белок с молекулярной массой, промежуточной между Oct-1 и Oct-2, взаимодействие с которым слабо ингибируется "холодной" пробой ДНК

Таким образом, последовательности ТААТТТ и TAATGA имеют большее сродство к Oct-белкам по сравнению с другими гомеоспецифическими участками (ТААТСА, TAATTG) С последними, как это видно из рис 4, образуют комплексы ядерные белки, которые слабо

ингибируются "холодной" oct-пробой Вероятно, это гомеобелки, не принадлежащие к семейству POU

Рис 4 Анализ задержки подвижности в геле (EMSA) комплексов белков ядерных экстрактов клеток NS/0 с ДНК-зондами - элементами промотора 1L мышиного гена ott-l Дорожки 1 -0,3 ng зонда, меченого 32Р, 2 - реакция в присутствии 20-кратного избытка "холодного" oct-зонда Стрелками без подписей обозначены комплексы, не ингибируемые или не полностью ингибируемые добавлением "холодного" oct-зонда

3 2 Поиск методом футпринтита сайтов связывания, потенциально способных участвовать в ауторегупяции гена oct-l

Методом ПЦР были получены фрагменты ДНК, соответствующие первому и второму АТ-богатым кластерам Методом футпринтинга были локализованы участки связывания ядерных белков из экстракта миеломных клеток NS/0 и очищенного POU-домена белка Oct-l с соответствующими участками промоторной области

При взаимодействии белков экстрактов NS/0 с зондом 2*-1 (Рис 5А) (соответствующим области -469/-261 п н) обнаружено несколько участков, защищенных от расщепления А именно, oet-сайт с прилежащими к нему 13 проксимальными и 3 дистальными п н, и три менее протяженных участка, соответствующих мотивам ATTA и двум ТААТ, расположенных дистальнее области, включающей октамер Для всех указанных областей прослеживается зависимость степени защиты от концентрации белков в реакционной смеси При связывании очищенного POU-домена белка Oct-l с этим же зондом видно, что защищенными оказываются те же участки, что и в опыте с экстрактами NS/0 октамер с прилежащими участками и три ТААТ-сайта (с четко прослеживающейся зависимостью от разведения белка) Защищены еще два сайта AGCCA (-436/-443 п н ) и ACTTTGAAGT

(. 446Л455 п н ), причем белки экстракта клеток N8/0 в данном случае обеспечивают более эффективную защиту по сравнению с очищенным РОи-доменом ОсЫ При проведении аналогичного эксперимента с зондом 3*-4 (Рис 5Б) показано, что другой канонический ой-сайт (-535/-541) промоторной области тоже оказывался защищенным

Рис 5 Локализация участков связывания ядерных белков экстрата клеток линии N8/0 и чистого РОи-домена белка Ой-1 методом футпринтинга а Связывание с зондом 2*-1, б и в - связывание с зондами 3*-4 и 4*-3 соответственно Сверху указано количество клеточного экстракта (ц1) или разведение белка, «—» - контроль в отсутствие белков, А,О - положение соответствующих нуклеотидов на нуклеотидной последовательности зонда Сбоку указано положение октамера и гомеоспецифических сайтов ТААТ

как чистым РОи-доменом, так и белками клеточного экстракта Этот же ос1-сайт выявляется при взаимодействии с зондом 4*-3 (Рис 5В)

Результаты экспериментов по футпринтингу подтвердили предположение о возможности ауторегуляции экспрессии гена ос/-/, т к ос1-ге1а1ес! и ТААТ-сайты окзываются защищенными, как в случае использования экстрактов N8/0, так и в случае очищенного РОи-домена белка Осо! (Рис 5)

Относительная люшнЬеоашая активность 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2

2,25

U-promotcr

800 bp

1267 bp

pGL3-800U

pGL3-1200L

lue

pGL3-EnhV

Рис 6 Промоторная активность 5'-фланкирующих областей экзонов 1U и IL А Относительная активность люциферазы в фибробластах 10(1), трансфецированных конструкциями, показанными на рис 6Б Плазмиды, несущие ген firefly Luc под промоторами 1U или 1L, были котрансфецированы с контрольной плазмидой pRL-CMV (несет ген Remlla Luc) Активность firefly l ue была нормализована к активности Renilla Luc Показаны средние значения величин и стандартное отклонение Б Схема конструкций, использованных для трансфекции Старты транскрипции обозначены стрелками

4 Изучение промоторной активности 5'-областей пред экзонами 1U и IL в клетках линии фибробластов 10(1).

4 1 Определение активности промоторов 111 и 1L.

Временная трансфекция L-промоторной области гена oct-1, клонированной в векторе pCAT-Enhancer Vector (Promega), показала, что промоторная активность этой области примерно в 20 раз слабее, чем у промотора вируса SV40 (последний использовался в качестве контроля в составе вектора pCAT-control vector (Promega)

Для выявления участков, необходимых для экспрессии гена oct-l, 5'-фланкирующие области экзонов 1U (820 п н ) и 1L (1267 п н ) были проклонированы в векторе Luc reporter pGL3-Enhancer vector (Promega) и проведена транзиентная трансфекция в клетки линии фибробластов 10(1) Значительная людиферазная активность наблюдалась в этих линиях для обеих 5'-областей 1L и 1U, свидетельствуя о наличии в каждой из них функционально активного промотора (Рис 6) Полученный результат позволяет предположить, что in vivo транскрипция гена ос(-/мыши находится под контролем двух промоторов, расположенных на расстоянии 67 т п н друг от друга

4 2 Функциональный анализ 5 '-фланкирующей области экзона 1Ь Для более точной локализации области, отвечающей за промоторную активность, были получены делеции 11. промоторной области гена ос1-1 и клонированы в репортерный вектор рСЬЗ-ЕпЬапсег (Рис 7) Делеция фрагмента -1267/-337 (активность рСЬЗ-1200Ь по сравнению с рОЬЗ-ЗЗО!) приводит практически к полной потере промоторной активности Те область -1267/-337 содержит, по-видимому, регуляторные цис-элементы, необходимые для базальной транскрипционной активности промотора 1Ь

А.

126 Г

R1

i i lue

I I I I I ' I ' I—I-1 PCL3-1Z00L

SipT ítfft- P+-.2H |uc

pGL3 3301

_' r^-w Inr

Il II I I-1-1 pC.I 3-12ЛЛД1

pOI 3 330Д2

I-*'

r—rn^lçT-! pcu-ззплз

r-^ -158 lue

-pGL3-330A4

C=E

lue

] pCL3-EnhV

Огноси-гельпая лкщиферазная активность

) 3 в 9 12 15

г- Г—.44 lu

I ÚÜJ-1 pCIJ-lSOLAI

.99 'UC

1 I-1 pGIJ 330Д1

18

Рис 7 Определение промоторной активности различных участков промотора 1Ь гена ос/-/ мыши А Схемы констукций, использованных для трансфекции Б Относительная активность люциферазы в фибробластах 10(1), трансфецированных плазмидами, изображенными на рис 6А

Ингибиторный элемент находится на позиции -99/-20 промотора 1L (Рис 7) делеция фрагмента -99/-20 приводит к почти девятикратному увеличению активности промотора ( ср конструкций pGL3-1260L и pGL3-1200Al)

Делеция фрагмента -1267/-337 также вызывает практически полное выключение промотора (ср активность pGL3-1260L и pGL3-330L) Удаление области промотора -20/-99 приводит не только к восстановлению промоторной активности, но и ее восьмикратному увеличению по сравнению с исходной (pGL3-1200Al, pGL3-480Al, pGL3-330Al) Компьютерный анализ показал, что этот ингибиторный участок содержит два Sp-1 сайта, и сайты связывания NF-1 и Ар-2 Дальнейшее делегирование фрагмента -99/-138 повышает уровень экспрессии еще почти на 30% (pGL3-330Al, pGL3-1260A2, pGL3-l26043) Дальнейшее делегирование фрагмента 20 п н, содержащего проксимальный сайт старта транскрипции, разрушает промотор, лишая его акшвпости (pGL3-330A4)

BMecie взятые эти данные позволяют предположить, что во-первых, «минимальный промотор» локализован между -337 и -137 п н, и, во-вторых, участок между -20 и -99 пн содержит ингибиторный цис-регуляторный элемент

5 Изучение активности промоторов IUи /L в чимфоидных и нелимфоидных кмтках Ряд полученных конструкций с делениями с 5'- и З'-концов были проклонированы в pGL3-Enhancer (содержит энхансер вируса SV40) и pGL3-Basic векторах, несущих репортерный ген люциферазы firefly luc Промоторную активность определяли в трансфецированных клетках линий миеломы NS/0 и фибробластов 10(1) Основная цель эксперимента, изображенного на рис 8, состояла в сопоставлении активности 1U и 1L промоторных областей в лимфоидных NS/0 и нелимфоидных 10(1) линиях клеток В качестве контроля использовался вектор pRL-CMV, несущий ген люциферазы Remlla luc Из рис 8 видно, что промоторная активность, локализованная в облает и 1L, в несколько раз ниже соответствующей активности 1U области Это различие особенно заметно в отношении конструкции Ll(pGL3-1200L), которая содержит дистальный оя-сайт В то же время в клетках NS/0 активность транскрипции с 1L промотора даже в отсутствие энхансера многократно возрастала Включение энхансера в конструкцию усиливало промоторную активность L1 в несколько раз и практически не оказывало влияния на активность промотора U (Рис 8) Удивительно сильно эффект энхансера проявлялся в конструкции L2 (pGL3-1200Д1), как в нелимфоидных, так и, в осбенности, лимфоидных клетках

В отсутствие энхансера промотор 1L не активен, однако, деления участка -99/-20 приводит к тому, что в лимфоидных клетках промотора 1L становится сравнима с активностью промотора 1U В присутствии энхансера (pGL3 Enhancer Vector) в клетках миеломы NS/0 активность 1L промотора возрастает многократно и превышает активность промотора 1U, а в фибробластах становится сравнима с активностью 1U промотора В присутствии энхансера делеция -99/-20 вызывает увеличение активности промотора IL по сравнению с активностью промотора Ш в миеломе NS/0 в 14 раз, а в фибробластах 10(1) примерно в 7 раз

U L1 L2 к

миелома NS/0

U U L2 фибробласты 10(1)

□ pGL3 Basic Vector BpGL3 Enhancer Vector j

Рис 8 Относительная люциферазная активность промогоров Ш (и) и 1Ь (конструкции Ы и Г,2) в лимфоидной клеточной линии N5/0 и линии фибробластов 10(1) в присутствие и в отсутствии энхансера При определении относительной активности за единицу была принята активность Ш-промотора

Обсуждение результатов

Экспрессия многих генов, вовлеченных в сложные клеточные процессы, регулируется на разных уровнях Альтернативный сплайсинг - наиболее изученный механизм тонкой регуляции экспрессии генов, проиводящий к образованию нескольких белковых изоформ с одного гена По последним оценкам альтернативному сплайсингу подвер1аются РНК 35-50%

генов человека В последнее время накапливается все больше сведений, касающихся регуляции транскрипции с помошью альтернативных промоторов - еще одного источника как белкового, так и регуляторного разнообразия Альтернативные промоторы обеспечивают тонкую временную либо тканеспецифическую регуляцию экспрессии гена Во многих случаях один из промоторов является конститутивным и отвечает за экспрессию гена во многих тканях и типах клеток, обеспечивая синтез белков «домашнего хозяйства» или вездесущих белков Другой промотор обладает определенной тканеспецифичностью и отвечает за синтез белков, экспрессируемых лишь в некоторых тканях и/или на определенных стадиях дифференцировки и развития По данным Landry и соавт экспрессия от 9% до 18% генов млекопитающих регулируется более чем с одного промотора Этот механизм, наряду с механизмами альтернативного сплайсинга, обеспечивает тонкую пространственную и временную регуляцию экспрессии генов, необходимую для развития и жизнедеятельности сложных многоклеточных организмов По данным Landry и соавт альтернативные промоторы можно подразделить на несколько типов (Рис 9) Простейший и наиболее распространенный случай, когда при использовании любого из альтернативных промоторов получается белковый продукт с идентичной открытой рамкой считывания (Рис 9а) К этой группе, видимо, отностися 60-80% генов, имеющих альтернативные промоторы Поскольку белок остается неизменным, различие состоит только в месте (тканеспецифичность) или времени его появления (специфичен для какой-либо стадии развития или дифференцировки) В остальных случаях к возможным различиям в транскрипции добавляется появление двух или более белковых изоформ с различными N-концами (Рис 9Ь) или и вовсе другой ORF (Рис 9с), хотя последний случай является, по-видимому, большой редкостью Существование трех белковых изоформ, отличающихся N-концевой последовательностью и появляющихся за счет активации транскрипции с одного из трех альтернативных промоторов, описано в частности для фактора Skn-1/Oct-ll человека, экспрессирующегося в коже и принимающего участие в регуляции пролиферации и дифференцировки кератиноцитов

В данной работе охарактеризованы две области гена Oct-1 мыши, одна из которых (длиной 820 п н ) граничит с экзоном 1U данного гена, а вторая (1300 п н ) - с экзоном 1L Эти области содержат соответственно U и L промоторы гена Oct-1, различающиеся по нуклеотидному составу и содержанию функциональных элементов, которые могут связываться с ядерными белками и участвовать в регуляции экспрессии гена Последовательность перед 1U экзоном обогащена G/C парами В некоторых участках,

превышающих по длине 100 пн, содержание С/С пар превышает 80% Анализ цис-элементов обнаружил здесь большое число сайтов связывания белка 5р1

(■) San« р<оШ\ (i) CYP19

1а 1Ь 1с

им I

./г J « s ю

r r"° -1—%f

»ATо ÎIats

Il ï Ж—

V/a i «

m «то

î» ATG

I jlHf I

/г 3 4 б с 13

2 3 4 9 0 7

(W) SHC{p6204t>aMpeei

АГО * ATO

rl I I ri

tt+4-

"ATO »«ГО/. /

/2 3 3 4 S G

(4

N ATG

Рис 9 Типы альтернативных промоторов [по Landry и соавт 1RENDS in genetics 19, 640-648] (а) Использование альтернативных промоторов (обозначены стрелками) не проиводит к появлению белковых изоформ, т к сайт инициации трансляции расположен в начале второго второго экзона Транслируемые экзоны обозначены черным, З'-UTR не показан (Ь) С альтернативних промоторов кодируются изоформы с разными N-концевыми последовательностями (с) Использование альтернативных промоторов приводит к образованию белков, транслирующихся в разных ORF (представлены белыми и черными прямоугольниками) Для всех приведенных примеров указаны названия соответствующих генов челевека и мыши (кроме случая c(ii), который описан только для человека) В некоторых случаях не все промоторы показаны на рисунке

Анализ 5'-области перед экзоном 1L выявил здесь наличие пяти А/Т-богатых кластеров, содержащих регуляторные цис-последовательности В двух первых, проксимальных по отношению к ATG-кодону, содержатся канонические oct-последовательности в прямой (ATGCAAAT) и обратной (ATTTGCAT) ориентации, с которыми взаимодействуют белки семейства POU В 1L промоторной области гена Oct-1 так же, как и в промоторах генов факторов транскрипции Oct-З и Вгп-4, отсутствует канонический ТАТА-бокс Наличие двух канонических oct-последовательностей и сайтов ТААТ говорит о возможности ауторегуляции гена Oct-1 Ауторегуляция свойственна, видимо, факторам семейства POU Этот механизм, в частности, реализуется при экспрессии гена Pit-1, и вероятно Вгп-4

В области -1261/-330 п н выявлены также 24 гомеоспецифических ТААТ-содержащих участка, с которыми могут взаимодействовать как регуляторные белки гомеосемейства, так и POU-белки Встречаемость этих нуклеотидных последовательностей в области L-промотора в семь раз превышает среднестатистическую

Показано, что Oct-белки способны связываться с сайтами, содержащими ТААТ, за счет своего POU-гомеодомена (как гомеобоксные факторы транскрипции), так что ТААТ- «

сайты являются функциональными для Oct-белков in vivo Большое количество этих последовательностей в L-промоторе и их упорядоченность говорят о том, что гомео-участки могут играть роль в регуляции экспрессии гена Oct-1 В 1L промотороной области гена Oct-1 из 16 возможных вариантов последовательностей TAATNN представлены 10 Нами были изучены те из них, которые встречаются чаще других и находятся в первом и втором кластерах (ТААТСА, TAATTT, TAATGA), особенно по соседству с oct-последовательностью (TAATTG, ТААТСА) Гомеоспецифические участки, обнаруженные в промоторной области 1L, могут функционировать несколькими способами во-первых, одни из них взаимодействуют преимущественно с Oct-белками (TAATGA, TAATTT), во-вторых, другие мотивы имеют повышенное сродство к гомеобелкам (ТААТСА, TAATTG), в-третьих, не все последовательности, содержащие ТААТ, могут быть функционально активны (участвуют непосредственно в инициации транскрипции), однако имея достаточно высокое сродство к Oct-белкам, они могут их связывать и, таким образом, играть роль накопителей и увеличивать локальную концентрацию Oct-белков на данном участке хромосомы Мы предполагаем, что регуляция экспрессии гена Oct-1 может осуществляться как при участии неизвестных нам гомеобелков, так и посредством ауторегуляции через octa- и гомеоспецифические последовательности, с которыми POU-гомеодомен Oct-белков устанавливает специфические контакты

В регуляции экспрессии гена Oct-1 участвуют, вероятно, и другие факторы транскрипции, в частности белки семейства NF-Y (ССААТ-белки) Ранее было показано, что белок С/ЕВР, связывающийся с энхансером, содержащим последовательность ССААТ, и белок Oct-1 являются антагонистами в регуляции гена интерлейкина 8 В этом случае белок I

Oct-1 сильно подавляет транскрипцию с промотора гена интерлейкина 8, связываясь с oct-последовательностью, перекрывающейся с участком ССААТ, узнаваемым С/ЕВР Во втором А/Т-богатом кластере промоторной области 1L присутствуют две последовательности, содержащие ССААТ в разной ориентации (Рис 2) Одна из них находится на расстоянии 4 п н от oct-последовательности и перекрывается с сайтом TATTG, с которым в клетках NS/0 взаимодействует неизвестный белок (вероятно, гомеобелок) (Рис 3) Эта область (-493/-509

п н) состоит из четырех перекрывающихся цис-элементов ой-последовательности, двух гомеоспецифических участков и ССААТ (Рис 2), что может свидетельствовать о тесном взаимодействии в регуляции экспрессии гена Oct-1 гомеобелков, Oct-белков и белков, связывающихся с ССААТ Распределение сайтов связывания по кластерам тоже может свидетельствовать о кооперативности и о сложной картине взаимодействия белков, участвующих в регуляции экспрессии гена Oct-1

Как показано в настоящей работе, тканеспецифическая регуляция транскрипции гена Oct-1 мыши может осуществляться на стадии инициации транскрипции В этот процесс вовлечены два промотора, энхансер и ингибирующие регуляторные элементы Из рис 8 видно, что в лимфоидных клетках NS/0 экспрессия с промотора L в несколько раз возрастает по сравнению с экспрессией в линии фибробластов 10/1 Это проявляется особенно отчетливо при трансфекции в клетки конструкций, содержащих внешний энхансер SV40 Сходный результат наблюдался ранее при исследовании регуляции экспрессии гена Oct-1 человека Следует отметить, что энхансер оказывал незначительное влияние на транскрипцию с промотора U

Oct-1 является вездесущим фактором транскрипции, который в виде нескольких субформ обнаружен во всех тканях, однако содержание отдельных субформ и их набор сильно варьируют в разных тканях

Тканеспецифическая экспрессия генов может быть опосредована несколькими механизмами Во-первых, на уровне экспрессии гена Oct-1 происходит альтернативная инициация транскрипции с двух промоторов и альтернативный сплайсинг про-мРНК, в результате чего в клетках иммунной системы и в мозге образуются субформы, которые не обнаружены в других тканях А именно, Oct-IL и Oct-IR, которые экс прессируются в лимфоцитах Эти субформы генерируются в незрелых В-лимфоцитах, в клетках селезенки и лимфатических узлов Клетки миеломы NS/0, соответствующие терминальной стадии дифференцировки В-лимфоцитов, содержат много Oct-II РНК В небольших количествах эта РНК содержится в клетках тимуса и Т-клеточной лимфомы EL-4 Во-вторых, белок Oct-1 способен образовывать комплексы с тканеспецифическим ко-регулятором OCA-B/OBF-1/Bob-l, что является обязательным условием активации промоторов генов иммуноглобулинов в зрелых В-клетках Другой коактиватор - OCA-S, синтезирующийся во всех клетках, образует комплекс с Oct-1, необходимый для активации промотора гистона Н2В и системы клеточной пролиферации

Транскрипция в большей мере зависит, как правило, от относительной концентрации регуляторного фактора, чем от его только наличия или отсутствия Как было показано ранее,

достаточно 2х-3х кратного изменения этой величины, чтобы достичь изменений в регуляции (обеспечить дифференциальную регуляцию) транскрипции Oct-1 - вездесущий фактор транскрипции, тем не менее уровень его экспрессии в разных типах клеток неодинаков и подлежит регуляции Как показали Veenstra и соавт, по крайней мере шестикратное различие в концентрации Oct-1 наблюдается в эмбриональных клетках Относительно высокий уровень экспрессии Oct-1 при этом не коррелирует с высоким уровнем клеточной пролиферации Показано, что в процессе развития происходит дифференциальная регуляция экспрессии Oct-1 первоначально высокий уровень экспрессии Oct-1 затем сохраняется во все более ограниченной области, т е подвергается прогрессирующей пространственной рестрикции Oct-1, вероятно, участвует в дифференцировке клеток иммунной системы и в специализации и дифференцировке нейронов и клеток нервного гребня

Регуляция уровня Oct-1 в клетках, по-видимому, происходит с использованием двух различных промоторов, требующих разных условий для активации и репрессии Несмотря на разницу в структурной организации, оба промотора 1U- и 1L- имеют черты, общие для промоторов генов «домашнего хозяйства» Кроме того, один из них может быть конститутивным, а другой - индуцибельным Нами был обнаружен ингибиторный участок (-99/-20) в промоторе 1L Делетирование этого участка вызывает почти 9-ги кратное увеличение люциферазной активности Этот район содержит сайты связывания белков Sp-1, Ар-2 и NF-1 Ранее было показано, что в области, содержащей дистальный oet-сайт, имеется сайленсерный участок, что находится в соответствии с результатом, полученным в данном исследовании В данной работе обнаружен мощный ингибирующий элемент в области между стартами инициации транскрипции и трансляции (-20/-99) Удаление этого участка увеличивает экспрессию репортерного гена Luc в присутствии энхансера в 7 раз в клетках линии ¡0/1 ив 14 раз в клетках линии NS'O Эта область содержит сайты связывания белков Spl, Ар-2 и NF-1 Известно, что уровень Spl и Ар-2 регулируется при развитии организма Spl и NF-1 являются вездесущими факторами транскрипции, в то время как уровень Ар-2 наиболее высок в клетках нервного гребня и их производных Экспрессия некоторых факторов транскрипции, относящихся к POU-семейству, регулируется тканеспецифически с преобладанием их содержания в клетках нервной и иммунной систем

Некоторые факторы семейства POU, в том числе принимающие участие в развитии головного мозга и нейрогенезе или в развитии иммунной системы, экспрессируются тканеспецифически, в то время как Oct-1 экспрессируется повсеместно Однако экспрессия Oct-1 также может подвергаться тканеспецифической регуляции с использованием по крайней мере трех механизмов Во-первых, тканеспецефические изоформы Oct-1

экспрессируются в лимфоидных клетках и в мозге Во-вторых, ОсЫ может формировать комплексы с тканеспецифическими корегуляторами, например с ОСА-В/ОВР- 1/ВоЬ 1 чтобы активировать иммуноглобулиновые промоторы в зрелых В-клетках И в-третьих, тканеспецифическая экспрессия, вероятно, может зависеть от активности промотора I. в том или ином клеточном типе

Выводы.

1 Составлена экзон-интронная карта гена осИ-1 мыши и человека, локализовано положение экзона 1Ь экзоны Ш и 1L разделяют 67тпн и108тпн в генах мыши и человека соответственно

2 Проклонированы 5'-нетранслируемые области экзонов Ш и 1Ь гена ОсЫмыши

3 Составлена карта потенциальных регуляторных сайтов этих областей, проведен анализ строения промоторов Ш и 1Ь гена ОсИ человека и мыши Перед экзоном II обнаружены сайты, потенциально способные обеспечить ауторегуляцию гена ОсЫ

4 С помощью временной трансфекции функционально охарактеризованы промоторные области Ш и 1Ь Для промотора II^ мыши локализован "минимальный промотор" в области -337/-137 Обнаружен ингибиторный элемент в области -99/-20, удаление которого приводит к могократному увеличению промоторной активности

5 Проведен анализ активности Щи 11. промоторов в лимфоидных и нелимфоидных клетках, показана тканеспецифическая экспрессия промотора \Ь в лимфоидных клетках

Список публикаций по теме.

1 Сытина ЕВ, Панкратова ЕВ 2003 Фактор транскрипции Oct-1 - пластичность и полифункциональность Молекулярная Биология, т 37 (5) 755-67

2 Pankratova EV, Sytina EV, Luchina NN, Krivega IV 2003 The regulation of the oct-1 gene transcription is mediated by two promoters Immunol Lett ,v 88(1) 15-20

3 Панкратова E В , Сытина E В , Степченко А Г , Поляновский О JI Oct-гены и Oct-факторы транскрипции 1998 Тезисы отчетной конференции по программе "Геном человека", с 54

4 Панкратова Е В , Сытина Е В , Юдина Г Ф, Степченко А Г, Поляновский О Л Регуляция экспрессии генов Oct-1 nOct-2 1999 Тезисы отчетной конференции по программе "Геном человека", с 72

5 Панкратова Е В , Деев И Е , Женило С В , Лучина Н Н , Сытина Е В , Поляновский О Л Регуляция экспрессии фактора транскрипции Oct-1 и образование его тканеспецифических субформ в клетках иммунной системы 2002 Тезисы отчетной конференции по программе "Геном человека", с 74

6 Pankratova Е, Sytina Е, Luchina N , Krivega I, Manuylova E 2003 Oct-1 gene alternative splicing and transcription regulation Advances in molecular cell biology Conference devoted to the 10th anniversary of the Center for Medical Studies (1993-2003) 149-158

7 Сытина Е В , Лучина Н Н, Кривега И В , Панкратова Е В Регуляция экспрессии вездесущего фактора транскрипции ОсН опосредована двумя промоторами 2003 Тезисы доклада Сборник тезисов 7ой Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", с 380

Заказ № 904 Подписано в печать 18 05 05 Тираж 100 экз Уст п л 0,84

ООО "Цифровичок", те!. (095) 797-75-76 www.cfr.ru

049?

РНБ Русский фонд

2006-4 9489

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сытина, Елена Вячеславовна

щ Введение.

Список обозначений и сокращений.

Литературный обзор.

1. Инициация транскрипции эукариотической РНК-полимеразой II.

1.1 Элементы последовательности ДНК, участвующие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.

1.2 Общие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II.

1.3 Медиатор РНК-полимеразы II.

2. Oct-1 - полифункциональный фактор.

2.1 Строение белка Oct-1.

2.2 Взаимодействие Oct-1 с участками связывания.

2.3 Альтернативный сплайсинг Oct-1 пре-мРНК.

2.4 Взаимодействие Oct-1 с факторами транскрипции и коактиваторами

2.5 Фосфорилирование Oct-1 в клеточном цикле.

2.6 Взаимодействие Oct-1 с белками HMG.

2.7 Взаимодействие Oct-1 с белками ядерного матрикса.

2.8 Участие Oct-1 в репликации ДНК. . .-г

2.9 Участие Oct-1 в эмбриональном развитии, морфогенезе и дифференцировке клеток.

2.10 Oct-1, иммунная система и гемопоэз.

2.11 Oct-1 и эндокринная система.

Цели и задачи исследования.

Материалы и методы.

1. Реактивы и материалы.

2. Стандратные методы.

2.1 Выделение плазмидной ДНК с тритоном Х-100.

2.2 Получение компетентных клеток.

2.3 Трансформация.

2.4 Мечение ДНК.

2.5 Получение клеточных экстрактов из клеток миеломы NS/0.

2.6 Задержка подвижности в геле комплексов ДНК-белок. 2.7 Выделение больших количеств суперскрученной плазмиды с очисткой bCsCI.

2.8 Рестрикция.

2.9 Лигирование.

2.10 Электрофорез ДНК в агарозном геле.

• 2.11 Выделение ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.12 Культивирование клеток.

2.13 Транзиентная трансфекция и определение люциферазной активности

3. Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши

3.1 Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши перед экзоном 1L.

3.2 Клонирование 5'-нетранслируемых областей гена oct-1 мыши перед экзоном 1U.

4. Футпринтинг.

5. Создание репортерных плазмид.

Результаты исследования.

1. Экзон-интронная структура гена Oct-1 мыши и человека.

2. Клонирование и анализ 5'-областей перед экзонами 1U и 1L

3. Поиск сайтов связывания, потенциально способных участвовать в ауторегуляции гена Oct-1.

3.1 Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки подвижности в геле.

3.2 Поиск методом футпринтинга сайтов связывания, потенциально способных участвовать в ауторегуляции гена Oct

4. Изучение промоторной активности 5'-областей перед экзонами

IUhIL в клетках линии фибробластов 10(1).

V/ 4.1 Определенте активности промоторов 1U и 1L.

4.2Функциональный анализ 5'-фланкирующей области экзона 1L . . . .71 4.3Изучение активности промоторов 1U и 1L в лимфоидных и нелимфоидных клетках.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ промоторных областей гена oct-1 мыши"

В отдельной клетке экспрессируются не все представленные в геноме гены, а только малая их часть. Спектр экспрессирующихся генов зависит от типа клетки и степени ее дифференцированности и может изменяться в ответ на поступающие извне сигналы. Одним из основных процессов, определяющих экспрессию, является процесс регуляции транскрипции через регуляторные элементы: промоторы, энхансеры, сайленсеры (цис-регуляторные элементы) и белковые транскрипционные факторы (транс-регуляторные элементы). В настоящее время описаны десятки факторов транскрипции и множество сигнальных путей, конечной точкой приложения которых являются универсальные процессы инициации (и реинициации) транскрипции и синтеза пре-мРНК РНК-полимеразами. При изучении процессов регуляции транскрипции и механизмов действия различных белковых транскрипционных факторов важно понять в какой мере данный процесс является специфическим или универсальным. Несомненный интерес представляет изучение механизмов, позволяющих одному и тому же белку участвовать как в активации, так и в репрессии целого ряда генов.

Белок ОсИ — фактор транскрипции, принадлежащий к РОИ-семейству. Описанный в конце 1980х годов, ОсИ долгое время считался исключительно «вездесущим» фактором транскрипции, регулирующим работу генов «домашнего хозяйства» клетки. Позднее было показано, что Ос1-1 принимает участие в регуляции экспрессии ряда тканеспецифических генов, в том числе генов интерлейкинов, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, генов пролактина, гонадолиберина, тиреотропина и др.

К настоящему моменту описано более полутора десятков генов-мишеней ОсМ, несколько взаимодействующих с ним кофакторов, показано его участие в прикреплении хроматина к ядерной мембране. При этом ничего не известно о регуляции экспрессии самого гена оси!. Данная работа посвящена анализу промоторных областей гена ос1-1 мыши, поиску возможных механизмов регуляции экспрессии гена этого полифункционального фактора.

Список обозначений и сокращений

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотреитол

ИЛ (IL) — интерлейкин мРНК — матричная РНК мяРНП - малый ядерный рибонуклеопротеид

ПААГ — полиакриламидный гель п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНКполН - РНК-полимераза II т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов

ЭДТА — этилендиамин-тетрауксусная кислота

Cdk - Cycle dependent kinase CTD - C-terminal domain EMSA - electromobility shift assay HMG - high mobility group proteins GTFs — general transcription factors MAR — matrix attachment regions

MOPS — 3-[М-морфолино] порпансульфониевая кислота

ORF - open reading frame

POUh - POU-гомеодомен

POUs - POU-специфический домен

TBP - TATA-binding protein

TAFs — TBP-assotiated factors t*

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сытина, Елена Вячеславовна

Выводы.

1. Составлена экзон-интронная карта гена ос11-1 мыши и человека, локализовано положение экзона 1Ь: экзоны Ш и 1Ь разделяют 67 т.п.н. и 108 т.п.н. в генах мыши и человека соответственно.

2. Клонированы 5'-нетранслируемые области экзонов Ш и 1Ь гена ос/-7мыши.

3. Составлена карта потенциальных регуляторных сайтов этих областей, проведен анализ строения промоторов Ш и 1Ь гена ос/-1 человека и мыши. Перед экзоном 1Ь обнаружены сайты, потенциально способные обеспечить ауторегуляцию гена осг-1.

4. С помощью временной трансфекции функционально охарактеризованы промоторные области Ш и 1Ь. Для промотора 1Ь мыши локализован "минимальный промотор" в области -337/-137. Обнаружен ингибигорный элемент в области -99/-20, удаление которого приводит к могокрагному увеличению промогорпой активности.

5. Проведен анализ активности Ш и 1Ь промоторов в лимфоидных и нелимфоидных клетках, показана тканеспецифическая экспрессия промотора 1Ь в лимфоидных клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сытина, Елена Вячеславовна, Москва

1. Struhl К. 2005. Transcriptional activation: mediator can act after preinitiation complex formation. Mol Cell 17: 752-753

2. Kuras L., Struhl K. 1999. Binding of TBP to promoters in vivo is stimulated by activators and requires Pol II holoenzyme. Nature 399: 609-613

3. Agalioti T., Lomvardas S., Parekh В., Yie J., Maniatis T., Thanos D. 2000. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell 103: 667-678

4. Orfanides G., Lagrange T., Reinberg D. 1996. The general transcription factors of RNA polymerase II. Gen. Dev. 10:2657-2683

5. Martinez E., Chiang C.M., Ge H., Roeder R.G. 1994 TAFs in TFIID function through the initiator to direct basal transcription from a TATA-less class II promoter. EMBOJ. 13: 3115-3126

6. Maldonado E., Ha I., Cortes P., Weis L., Reinberg D. 1990. Role of transcription factors TFIIA, TFIID and TFIIB during formation of a transcription- competent complex. Mol. Cell. Biol. 10: 6335-6347

7. Ha I., Roberts S., Maldonado E., Sun X., Kim L.-U., Green M., Reinberg D. 1993. Multiple functional domains of transcription factor IIB: distinct interaction with two general transcription factors and RNA polymerase II. Genes Dev. 7: 10211032

8. Sun X., Ma D., Sheldon M., Yeung K., Reinberg D. 1994. Reconstitution of human TFIIA activity from recombinant polypeptides: a role in TFIID-mediated transcription. Genes Dev. 8: 2336-2348

9. Blazek E., Mittler G., Meisterernst M. 2005. Mediator of RNA polymerase II. Chromosoma 113: 399-408

10. Struhl 2005, Sato S., Tomomori-Sato C., Parmely T.J., Florens L., Zybailov В., Swanson S.K., Banks C.A., Jin J., Cai Y., Washburn M.P. 2004 Mol Cell 14: 685691.

11. Ranish J.A., Yudkovsky N., Hahn S. 1999. Intermediates in formation and activity of the RNA polymerase II preinitiatioin complex: holoenzyme recruitment and a postrecruitment role for the TATA-box and TFIIB. Genes Dev. 13:49063

12. Davis J.A., Takagi Y., Kornberg R.D., Asturias F.A. 2002. Structure of the yeast RNA polymrease holoenzyme: mediator conformation and polymerase interaction. Mol. Cell 10: 409-415

13. Hatzis P., Talianidis I. 2002. Dynamics of enhancer -promoter communication during differentiation-induced gene activation. Mol. Cell 10: 1467-1477

14. Cosma M.P., Panizza S., Nasmyth K. 2001. Cdkl triggers assotiation of RNA plymerase to cell cycle promoters only after recruitment of the mediator by SBF. Mol Cell 7: 1213-1220

15. Sakurai H., Fukusawa T. 2000. Functional connections between mediator components and general transcription factors of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275: 37251-37256.

16. Akoulitchev S., Chuikov S., Reinberg D. 2000. TFIIH is negatively regulated by cdk8-containing mediator complexes. Nature 407: 102-106.

17. Rani P.G., Ranish J.A., Hahn S. 2004. RNA polymerase II (Pol II)-TFIIF and Pol II-mediator complexes: the major stable Pol II complexes and their activity in transcription initiation and reinitiation. Mol. Cell. Biol. 24: 1709-1720.

18. Ryan A.K., Rosenfeld M.G. 1997. POU domain family values: flexibility, partnership, and developmental codes. Genes Dev. 11, 1207-1225.

19. Phillips K., Luisi B. 2000. The virtuoso of versatility: POU proteins that flex to fit. J. Mol. Biol. 302, 1023-1039.

20. Sturm R.A., Das G., Herr W. 1988. The ubiquitous octamer-binding protein Oct-1 contains a POU domain with a homeo box subdomain. Genes Dev. 2, 15821599.

21. Hinkley C., Perry M. 1992. Histone H2B gene-transcription during Xenopus early development requires functional co-operation between proteins bound to the CCAAT and octamer motifs. Mol. Cell. Biol. 12, 4400-4411.

22. Fletcher C., Heintz N., Roeder R.G. 1987. Purification and characterization of OTF-1, a transcription factor regulate cell cycle expression of a human histone H2b gene. Cell. 51, 773-781.

23. Yang J., Mullerimmergluck M.M., Sciepel K., Janson L., Westin G., Schaffner W., Petterson U. 1991. Both Oct-1 and Oct-2a contain domains which can activate the ubiquitously expressed U2 snRNA genes. EMBO J. 10, 2291-2296.

24. Kunkell G.R., Pederson T. 1988. Upstream elements required for efficient transcription of human U6 RNA gene resemble those of U1 and U2 genes even though a different polymerase is used. Genes Dev. 2, 196-204.

25. Janson L., Weller P., Pettersson U. 1989. Nuclear factor I can functionally replace transcription factor Spl in a U2 small nuclear RNA gene enhancer. J. Mol. Biol. 205, 387-396.

26. Strom A.-C., Forsberg M., Lillhager P., Westin G. 1996. The transcription factors Spl and Oct-1 interact physically to regulate human U2 snRNA gene expression. Nucleic Acids Res. 24, 1981-1986.

27. Ullman K.S., Flanagan W.M., Edvards C.A., Crabtree G.R. 1991. Activation of early gene expression in T lymphocytes by Oct-1 and an inducible protein, OAP. Science. 254, 558-562.

28. Wu C.D., Lai E.J., Huang N., Wen X. 1997. Oct-1 and GGAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) bind to overlapping elements within the interleukin-8 promoter. J. Biol. Chem. 24, 2396-2403.

29. Kaushansky K., Shoemaker S.G., O'Rork C.A., McCarty J.M. 1994. Coordinate regulation of multiple human lymphokine genes by Oct-1 and potentially novel 45 and 43 kDa polypeptides. J. Immunol. 152,1812-1820.

30. Malone C.S., Patrone L., Wall R. 2000. An essential octamer motif in the mb-1 (Ig alpha) promoter. Mol. Immunol. 37, 321-328.

31. Malone C.S., Patrone L., Buchanan K.L., Webb C.F., Wall R. 2000. An upstream Oct-1- and Oct-2-binding silencer governs B29 (Ig beta) gene expression. J. Immunol. 164, 2550-2556.

32. Tovar V., de la Fuente M.A., Pizcueta P., Bosh J., Engel P. 2000. Gene structure of the mouse leukocyte cell surface molecule Ly9. Immunogenetics. 51, 788-793.

33. Luo J., Roeder R.G. 1995. Cloning, functional characterization, and mechanism of action of the B-cell specific transcriptional co-activator OCA-B. Mol. Cell. Biol. 15,4115-4124.

34. Shah P.C., Bertolino R.E., Singh H. 1997. Using altered specificity Oct-1 and Oct-2 mutants to analyze the regulation of immunoglobulin gene transcription. EMBOJ. 23,7105-7117.

35. Delhase M., Castrillo J.-L., de la Hoya M., Rajas F., Hooge-Peters E.L. 1996. AP-1 and Oct-1 transcriptional factors down-regulate the expression of the human Pitl/ GHF1 gene. J. Biol. Chem. 271, 32349-32358.

36. Subramaniam N., Cairns W., Okret S. 1998. Glucocorticoids repress transcription from a negative glucocorticoid response element recognized by two homeodomain-containing proteins, Pbx and Oct-1. J. Biol. Chem. 273, 2356723574.

37. Voss J.W., Wilson L., Rosenfeld M.G. 1991. POU-domain proteins Pit-1 and Oct-1 interact to form a heteromeric complex and can cooperate to induce expression of the prolactin promoter. Genes Dev. 5, 1309-1320.

38. Bingle C.D., Gowan S. 1996. Oct-1 interacts with consreved motifs in the human thyroid transcription factor 1 gene minimal promoter. Biochem. J. 319, 669-674.

39. Pruijn G.J.M., van Miltenburg R.T., Claessens A.J., van der Vliet P.C. 1988. Interaction between the octamer-binding protein nuclear factor III and the adenovirus origin ofDNA replication. J. Virol. 62, 3092-3102.

40. Kim M.K., Lesoon-Wood L.A., Weintraub B.D., Chung J.H. 1996. A soluble transcription factor, Oct-1, is also found in the insoluble nuclear matrix and posesses silencing activity in its alanine-rich domain. Mol. Cell. Biol. 16, 43664377.

41. Imai S., Nishibayashi S., Takao K., Tomifuji M., Fujino T., Hasegawa M., Takano T. 1997. Dissociation of Oct-1 from the nuclear peripheral structure induces the cellular aging-associated collagenase gene expression. Mol. Biol. Cell. 8, 2407-2419.

42. He X., Treacy M.N., Simmons D.M., Ingraham H.A., Swanson L.W., Rosenfeld M.G. 1989. Expression of a large family of POU-domain regulatory genes in mammalian brain development. Nature 340, 35-42.

43. Veenstra G.J.C., van der Vliet P.C., Destree O.HJ. 1997. POU domain transcription factors in embryonic development. Mol. Biol. Reports. 24, 139-155.

44. Verrijezer C.P., Alkema M.J., van Weperen W.W., van Leeuwen H.C., Strating M.J., van der Vliet P.C. 1992. The DNA binding specificity of the bipartite POU domain and its subdomains. EMBO J. 11, 4993-5003.

45. Klemm J.D., Rould M.A., Aurora R., Herr W., Pabo C.O. 1994. Crystal structure of the Oct-1 POU domain bound to the octamer site: DNA recognition with tethered DNA-binding modules. Cell. 77, 21-32.

46. Stepchenko A.G. 1994. Noncanonical Oct-sequences are targets for mouse Oct-2B transcription factor. FEBS Lett. 337, 175-178.

47. Klemm J.D., Pabo C.D. 1996. Oct-1 POU domain DNA interactions: cooperative binding of isolated subdomains and effects of covalent linkage. Genes Dev. 10,27-36.

48. Herr W., Cleary M.A. 1995. The POU domain: versatility in transcriptional regulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain. Genes Dev. 9, 16791693.

49. Seipel K., Georgiev O., Schaffner W. 1992. Different activation domains stimulate transcription from remote ("enhancer") and proximal ("promoter") positions. EMBO J. 11: 4961-4968.

50. Stepchenko A.G. 1992. Interaction of Oct-binding transcription factors with a large series of "noncanonical" oct-sequences. Primary sequence of murine Oct-2B cDNA. Dokl Akad Nauk. 235,175-179.

51. Stepchenko A.G., Luchina N.N., Pankratova E.V. 1997. Cysteine 50 of the POUH domain determines the range of targets recognized by POU proteins. Nucleic Acids Res. 25, 2847-2853.

52. Stepchenko A.G., Luchina N.N., Polanovsky O.L. 1997. Conservative Val47 residue of POU homeodomain: role in DNA recognition. FEBS Lett. 412, 5-8.

53. O'Hare P., Goding C.R. 1988. Herpes simplex virus regulatory elements and the immunoglobulin octamer domain bind a common factor and are both targets for virion transactivation. Cell. 52, 435-445.

54. Baumruker T., Sturm R., Herr W. 1988. OBPIOO binds remarkably degenerate octamer motifs through specific interactions with flanking sequences. Genes Dev. 2, 1400-1413.

55. Gstaiger M., Georgiev O., van Leeuwen H., van der Vliet P.C., Schaffner W. 1996. The B-cell coactivator Bobl shows DNA sequence-dependent complex formation with Oct-l/Oct-2 factors, leading to differential promoter activation. EMBO J. 15,2781-2790.

56. Sauter P., Matthias P. 1998. Coactivator OBF-1 makes selective contacts with both the POU-specific domain and the POU homeodomain and acts as a molecular clamp on DNA. Mol. Cell. Biol. 18, 7397-7409.

57. Cepek K.L., Chasman D.I., Sharp P.A. 1996. Sequence-specific DNA binding of the B-cell-specific coactivator OCA-B. Genes Dev. 10, 2079-2088.

58. Babb R., Cleary M.A., Herr W. 1998. OCA-B is a functional analog of VP 16 but targets a separate surface of the Oct-1 POU domain. Mol. Cell. Biol. 18, 2430.

59. Lefstin J.A., Jamamoto K.R. 1998. Allosteric effects of DNA on transcriptional regulators. Nature. 392, 885-888.

60. Xia Y.-R., Andersen B., Mehrabian M., Diep A.T., Warden C.H., Monandas T., McEvilly R.J., Rosenfeld M.G., Lusis A.J. 1993. Cromosomal Organization of Mammalian POU Domain Factors. Genomics 21, 126-130.

61. Suzuki N., Peter W., Ciesiolka T., Gruss P., Scholer H. 1993. Mouse Oct-1 contains a composite homeodomain of human Oct-1 and Oct-2. Nucl. Acids Res. 21,245-252.

62. Stepchenko A.G. 1991. The nucleotide sequence of mouse OCT-1 cDNA. Nucleic Acids Res. 20, 1419.

63. Панкратова Е.В., Деев И.Е., Поляновский O.JL 2001. Тканеспецифический сплайсинг 5'-экзонов гена фактора транскрипции Oct-1. Молекулярная биология 35: 34-41.

64. Панкратова Е.В., Деев И.Е., Женило С.В., Анфалова Т.В., Поляновский O.JI. 2001. Субформы фактора транскрипции Oct-1, синтезируемые в лимфоцитах. Молекуляр. биология 35, 816-823.

65. Pankratova E.V., Deev I.E., Zhenilo S.V., Polanovsky O.L. 2001. Tissue-specific isoforms of the ubiquitous transcription factor Oct-1. Mol. Genet. Genomics 266, 239-245.

66. Luchina N.N, Krivega I.V., Pankratova E.V. 2002. Human Oct-1 isoform has tissue-specific expression pattern similar to Oct-2. Immunol Lett. 85(3), 237-41.

67. Женило C.B., Деев И.Е., Серов C.M., Поляновский O.JI. 2003. Регуляция транскрипции гена oct-1 человека с участием двух промоторов. Генетика 39, 280-285.

68. Zhenilo S., Deyev I., Serov S., Polanovsky O.L. 2003 Regulation of oct-1 gene is different in lymphoid and non-lymphoid cells. Biochemie 85, 715-718.

69. Das G., Herr W. 193. Enhanced Activation of the Human Histone H2B Promoter by an Oct-1 Variant Generated by Alternative Splicing. J. Biol. Chem. 268, 25026-25032.

70. Gstaiger M., Knoepfel L., Georgiev O., Schaffner W., Hovens C.M. 1995. A B-cell coactivator of octamer-binding transcription factors. Nature. 373, 360-362.

71. Dulic V, Lees E, Reed SI. 1992. Association of human cyclin E with a periodic Gl-S phase protein kinase. Science. V. 257. P. 1958-1961

72. Zhao J, Kennedy BK, Lawrence BD, Barbie DA, Matera AG, Fletcher JA, Harlow E. 2000. NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent histone gene transcription. Genes Dev.: 2283-2297

73. Zheng L., Roeder R.G., Luo Y. 2003. S phase activation of the histone H2B promoter by OCA-S, a coactivator complex that contains GAPDH as a key component. Cell 114: 255-266.Kakizava Т., Miyamoto Т., Ichikawa K., Kaneko

74. A., Suzuki S., Hara M., Nagasawa T., Takeda T., Mori Ji., Kumagai M., Hashizume K. 1999. Functional interaction between Oct-1 and retinoid X receptor. J. Biol. Chem. 274, 19103-19108.

75. Ronai Z. 1993.Glycolytic enzymes as DNA binding proteins. Int J Biochem. V. 7. P. 1073-1076.

76. Wright P.E., Dyson H.J. 1999. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J. Mol. Biol. 293, 321-331.

77. Mittal V., Cleary M.A., Herr W., Hernandez N. 1996. The Oct-1 POU-specific domain can stimulate Small Nuclear RNA gene transcription by stabilizing the basal transcription complex SNAPc. Mol. Cel. Biol. 16, 1955-1965.

78. Kakizawa T., Miyamoto T., Ichikawa K., Kaneko A., Suzuki S., Hara M., Nagasawa T., Takeda T., Mori Ji., Kumagai M., Hashizume K. 1999. Functional interaction between Oct-1 and retinoid X receptor. J. Biol. Chem. 274, 1910319108.

79. Botquin V., Hess H., Fuhraman G., Anastassiadis C., Gross M.K., Vriend G., Scoler H.R. 1998. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev. 12, 2073-2090.

80. Tomilin A., Remenyi A., Lins K., Bak H., Leidel S., Vrieno G., Wilmanns M., Scholer H.R. 2000. Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration. Cell. 103, 853-864.

81. Pomerantz J.L., Pabo C.O., Sharp P.A. 1995. Analysis of homeodomain function by structure-based design of a transcriptional factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92,9752-9756.

82. Cleary M.A., Pendergrast P.S., Herr W. 1997. Structural flexibility in transcription complex formation revealed by protein-DNA photocrosslinking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 8450-8455.

83. Mysiak M.E., Wyman C., Holthuizen P.E., van der Vliet P.C. 2004. NF1 and Oct-1 bend the Ad5 origin in the same direction leading to optimal DNA replication. Nucl. Acid Res. 32: 6218-6225

84. Cleary M.A., Stern S., Tanaka M., Herr W. 1993. Differential positive control by Oct-1 and Oct-1: activation of a transcriptionally silent motif through Oct-1 and VP-16 corecruitment. Genes Dev. 7, 72-83.

85. Williams D.C.Jr., Cai M., Clore G.M. 2004. Molecular basis for synergistic transcriptional activation by Octl and Sox2 revealed from the solution structure of the 42-kDa Octl.Sox2.Hoxbl-DNA ternary transcription factor complex. JBC 279(2): 1449-57

86. Hermann B.P., Heckert L.L. 2005 Silencing of Fshr occurs through a conserved, hypersensitive site in the first intron, Mol. Endjcrynol. Apr.7, Epub ahead of print

87. Inman C.K., Li N., Shore P. 2005 Oct-1 counteracts autoinhibition of Runx2 DNA binding to form a novel Runx2/ Oct-1 complex on the promoter of the mammary gland-specific gene beta-casein, Mol Cell Biol 8: 3182-93.

88. Coyle A.T., Kinsella B.T. 2005 Characterisation of promoter 3 of the human thromboxane A receptor gene. A functional AP-1 and octamer motif are required for basal promoter activity, FEBS J. 4: 1036-53.

89. Zwilling S., Annweiler A., Wirth T. 1994. The POU domains of the Oct-1 and Oct-2 transcription factors mediate specific interaction with TBP. Nucleic Acids Res. 22, 1655-1662.

90. Nakshatri H., Nakshatri P., Currie R.A. 1995. Interaction of Oct-1 with TFIIB: implications for a novel response elicited through the proximal octamer site of the lipoprotein-lipase promoter. J. Biol. Chem. 270, 19613-19623.

91. Segil N., Roberts S.B., Heintz N. 1991. Mitotic phosphorylation of the Oct-1 homeodomain and regulation of Oct-1 DNA binding activity. Science 254: 18141816.

92. Schild-Poulter C., Shih A., Yarymowich N., Hache RJ.S. 2003. Down-regulation of histone H2B by DNA-dependent protein kinase in response to DNA damage through modulation of Octamer Transcription Factorl. Cancer Res. 63: 7197-7205

93. Wirth T., Koning H., Zwilling S. 1995. High mobility group protein 2 functionally interacts with the POU domains of octamer transcription factors. EMBO J. 14, 1198-1208.

94. Abdulkadir S.A., Krishna S., Thanos D., Maniatis T., Strominger J., Ono S.J. 1995. Functional roles of the transcription factor Oct-2A and the high mobility group protein I/Y in HLA-DRA gene expression. J. Exp. Med. 182, 487-500.

95. Bolting C.H., Hay R.T. 1999. Characterization of the adenovirus preterminal protein and its interaction with the POU homeodomain of NFIII (Oct-1). Nucleic Acids Res. 27, 2799-2805

96. Mysiak M.E., Wyman C., Holthuizen P.E. and van der Vliet P.C. 2004. NFI and Oct-1 bend the Ad5 origin in the same direction leading to optimal DNA replication. Nucleic Acids Research. 32 (21), 6218-6225.

97. Koyasu S., Hussey R.E., Clayton L.K., Lerner A., Pedersen R., Delany-Heiken P., Chau F., Reinherz E.L. 1994. Targeted disruption within the CD3 zeta/eta/phi/Oct-1 locus in mouse. EMBO J. 13, 784-797.

98. Wang V.E., Tantin D., Chen J., Sharp P.A. 2004. В cell development and immunoglobulin transcription in Oct-1-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (7), 2005-10.

99. Kakizava Т., Miyamoto Т., Ichikawa K., Kaneko A., Suzuki S., Нага M., Nagasava Т., Takeda Т., Mori Ji., Kumagai M., Hashizume K. 1999. Functional interaction between Oct-1 and retinoid X receptor. J. Biol. Chem. 274: 1910319108.

100. Dowling A.L., Martz G.U., Leonard J.L., Zoeller R.T. 2000. Acute changes in maternal thyroid hormone induce rapid and transient changes in gene expression in fetal rat brain. J. Neurosci. 20, 2255-2265.

101. Chin L.S., Weigel C., Li L. 2000. Transcriptional regulation of gene expression of sec6, a component of mammalian exocyst complex at the synapse. Brain. Res. Mol. Brain Res. 79, 127-137.

102. Deng J., Madan A., Banta A.B., Friedman C., Trask B.J., Hood L., Li L. 2000. Characterization, chromosomal localization, and complete 30-kb DNA sequence of the human Jugged2 (JAG2) gene. Genomics 63, 133-138.

103. Галактионов В.Г. Иммунология. М, изд-во «Нива России», 2000

104. Cron RQ, Zhou В, Brunvand MW, Lewis DB. 2001. Octamer proteins inhibit IL-4 gene transcription in normal human CD4 T cells. Genes Immun.8: 464-468

105. Salerno M., Mordvinov V., Sanderson C. 2000. Binding of octamer factors to a novel 3'-positive regulatory element in the mouse interleukin-5 gene. J.Biol.Chem. 257: 4525-4531

106. Gonzalez M.I., Robins D.M. 2001.0ct-l preferentially interacts with androgen receptor in a DNA-dependent manner that facilitates recruitment of SRC-1. J. Biol. Chem. 276, 6420-6428.

107. Taniguchi A., Hasegava Y., Higai K., Matsumoto K. 2000. Transcriptional regulation of human beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase (hST6Gal I) gene during differentiation of the HL-60 cell line. Glycobiology 10, 623-628.

108. Ройт Д., Мейл Б. Иммунология.- М. изд-во «Мир». 2000

109. Schaffer A, Kim EC, Wu X, Zan H, Testoni L, Salamon S, Cerutti A, Casali P. 2003. Selective inhibition of class switching to IgG and IgE by recruitment of the

110. HoxC4 and Oct-1 homeodomain proteins and Ku70/Ku86 to newly identified ATTT cis-elements. J Biol Chem 278: 23141-23150

111. Akizawa Y, Nishiyama C, Hasegawa M, Maeda K, Nakahata T, Okumura K, Ra C, Ogawa H. 2003. Regulation of human Fc-epsilon RI beta chain gene expression by Oct-1. Int Immunol.: P. 549-556

112. Schubart K., Massa S., Schubart D., Corcoran L.M., Rolink A.G., Matthias P. 2001. В cell development and immunoglobulin gene transcription in the absence of Oct-1 and OBF-1. Nature Immunol. 2: 69-74.

113. Bharadwaj RR, Trainor CD, Pasceri P, Ellis J. 2003. LCR-regulated transgene expression levels depend on the Oct-1 site in the AT-rich region of beta -globin intron-2. Blood: 1603-1610

114. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М. «Мир» 1984, стр. 333-334.

115. Inoue Н. Et al. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.

116. Manley, J.L. (1984) in: Transcription and Translation. A Practical Approach (Hames, B.D. and Higgins, S.G., Eds.) pp. 89-110, IRL Press, Oxford.

117. Carbon P., Murgo S., Ebel J.P., Krol A., Tebb G. And Mattaj L.W. 1987. Cell 51, pp. 1071-1080.

118. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М. «Мир» 1984, стр. 99-104.

119. Malik K.F., Kim J., Hartman A.L., Kim P., Scott Young-III W. 1996 Binding preferences of the POU domain protein Brain-4: implications for autoregulation. Mol.Brain Res. 38, 209-221.

120. Tranche F., Ringeisen F., Blumenfeld M., Yaniv M., Pontoglio M. Analysis of the distribution of binding sites for a tissue-specific transcription factor in the vertebrate genome. 1997 J.Mol.Biol. 266, 231-245.

121. Pikarsky E., Sharir H., Ben-Shushan E., Bergman Y. 1994 Retinoic acid represses Oct-3/4 gene expression through several retinoic acid-responsive elements located in the promoter-enhancer region. Mol.Cel.Biol. 14, 1026-1038.

122. Степченко А.Г., Поляновский О.Jl. 1996. Взаимодействие Oct-белков с ДНК. Молекул. Биология 30, 296-302.

123. Scott М.Р., Tamkun J.W., Hartzell G.W. 1989. The structure and function of the homeodomain. Biochim. Biophis.Acta 989, 25-48.

124. Percival-Smith A.,Muller M., Affolter M., Gehring W.J. 1992. The interaction with DNA of wild-type and mutant fushi tarazu homeodomains. EMBO J. 9, 3967-3974.

125. Рубцов П.М. 2000. Альтернативные промоторы и процессинг РНК в экспрессии эукариотического генома. Молекулярная биология 34, 626-634.

126. Landry J.-R., Mager D.L., Wilhelm В.Т. 2003. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genimes. TRENDS in genetics 19, 640-648.

127. Adriana Cabral, David F. Fischer, Wilbert P. Vermeij, Claude Backendorf. 2003. Distinct functional interactions of human Skn-1 isoforms with Ese-1 during keratinocyte terminal differentiation. J. Biol. Chem. 278(20), 17792-99.

128. Gstaiger M., Knoepfel L., Georgiev O., Schaffner W., Hovens C.M. 1995. A B-cell coactivator of octamer-binding transcription factors. Nature 373: 360-362.

129. Strubin M, Newell JW, Matthias P. 1995. OBF-1, a novel В cell-specific coactivator that stimulates immunoglobulin promoter activity through association with octamer-binding proteins. Cell 80(3), 497-506.

130. G.Struhl, K.Struhl, P.M.Macdonald. 1989. The gradient morphogen bicoid is a concentration-dependent transcriptional activator. Cell 57, 1259-1273.

131. M.Carey, J.Kolman, D.A.Katz, L.Gradoville, L.Barberis, G.Miller. 1992. Transcriptional synergy by the Epstein-Barr virus transactivator ZEBRA. J.Virol. 66,4803-4813.

132. Faisst S., Meyer S. 1992. Compilation of vertebrate-encoded transcription factors. Nucl. Acids Res. 20, 3-26.

133. Pankratova E.V., Polanovsky O.L. 1998. Oct-1 promoter region contains octamer sites and TAAT motifs recognized by Oct proteins. FEBS Let. 426, 8185.

134. Bajic V.B.,Choudhary V., Hock C.K. 2004. Content analysis of the core promoter region of human genes. In Silico Biol. 4(2): 109-125.

135. Список публикаций по теме.

136. Сытина Е.В., Панкратова Е.В. 2003. Фактор транскрипции Oct-1 -пластичность и полифункциональность. Молекулярная Биология, т.37 (5):755-67.

137. Pankratova EV, Sytina EV, Luchina NN, Krivega IV. 2003. The regulation of the oct-1 gene transcription is mediated by two promoters. Immunol Lett.,v.88(l):15-20.

138. Панкратова E.B., Сытина E.B., Степченко А.Г., Поляновский O.JI. Oct-гены и Oct-факторы транскрипции. 1998. Тезисы отчетной конференции по программе "Геном человека", с.54.

139. Панкратова Е.В., Сытина Е.В., Юдина Г.Ф., Степченко А.Г., Поляновский O.JI. Регуляция экспрессии генов Oct-1 nOct-2. 1999. Тезисы отчетной конференции по программе "Геном человека", с. 72.

140. Автор благодарит А.Г. Степченко за предоставление ос/-7 кДНК геномную ДНК мыши и методическую помощь.