Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное сопряжение митохондрий печени при старении крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное сопряжение митохондрий печени при старении крыс"

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ' ХАРКІВСЬКИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ'

На правах рукопису

УДОВІКОВА Олена Анатоліївна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНЕ СУПРЯЖЕННЯ МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ПРИ СТАРІННІ ИУРІВ

03.00.04 - Біохімія

- . . АВТОРЕФЕРАТ .

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 1994

Дисертацією е рукопис

Робота виконана у відділі біофізики иембран НДІ біологи . Харківського державного університету .

Науковий керівник: доктор біологічних наук,”

, • професор Леиевко Віктор Васильович

Офіційні-опоненти: доктор, біологічних наук, '

■ . . . професор Бондаренко Валерій Антонович

доктор біологічних наук, професор Колодуб. їелікс АркадіЙович

Провідна організація: інститут геронтології

153 України, М.КИЇВ

Захист дисертації відбудеться 8 грудня 1994 р.

о 14-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.03В. 23.04 у Харківському державному медичному університет і за адресою 310022, м. Харків, пр. Лзніна.4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Харківського державного медичного університету (310022, м. Харків, пр. Лзніна,4).

Автореферат розіслано "________________;______,1994р. %

Учзний секретар спеціалізованої ради

Л. 0. Кубрікова

■ ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ '

АКТУАЛЬНІСТЬ ТА СТУПІНЬ ДОСЛІДНЕНІЮСТІ ТЕМАТИКИ ЕИСЕР-Щіі. Вивчення механізмів, які зумовлюють розвиток І гаріння організму людини та тварин, е однією з найваж-івіших сучасних загальнобіологічних проблем. Згідно іскую-ім уявленням, процес старіння може бути пов'язаний зі <іною ефективності систем трансформації енергії [Harman, 381; Лемешко, 1982; Culter, 1984; Fleming et al. , 1985; jrolsier, 1990]. Провідна роль в забезпеченні аеробних

і.гин енергією належить мітохондріям. Нззважачи на велику ;лькість роСіт, присв’ячених вивченню вікового аспекту іергозаСезпечення клітин і тканин [Latruffe et al., 1978; '

>rton, Spencer, 1981; Лемешко, 1983 Jung et al. , 1988; Crus , al. , 1990;. Darnold et al. , 19901,. дані літератури щэдо

гнкці опального стану мітохондрій дуте суперечні і свідчать, і про зниження [Hansford, 1978; Nohl et al., 1978; Литокек-), 1986; Srunucker, 1990; Cruse et al.. 1990], так і про

дсутність суттєвих змії! [Wilson et al., 1975; Spenser,

irton, 1979; Berdanier, McNäirura, 1980; Vfeindruch et al., 1803 ефективності мітохондріально'і трансформації енергії їй старінні.

В літературі є також дані про те, со старіння організму

■проводжусться . значними змінами і структури мітохондрій

rorbeck et al. , 1982; Beregl, Regius, 1983; Ступина и

іавт. , 1986; Shmucker, 19S0; Crus, 1990]. Відомо, пр струк- -'pm зміни мітохондрій, зокрема, набухання органед, відбу- " иоться як при фізіологічних реакціях організму (у відповідь і змінення гормонального статусу [Harada, 1S86; Brovin et ., .1988; Конов, 1992]), так і при патологічному стані

- 4 - .

(ішемії CAsIïraf, 1978; Schmlodl, 19901, великому фізичної навантажанш [Gollnick-, Кіг.г, 1969], впливі іонізуючого сиг ром інювання С Абдурахманов, 1987J, ксенобіотикі в С Bogucki

Vojtczak, 1979; ГуОский, 1982; Суслова и соавт. , 1988;‘Лаврз тонко, 19901) і супроводжується порушенням функції ОКИСЛІ вального фосфорилывання [Семенов, 1988 Лаврушенко, 199! Veitch et al. . 19921.. Таке порушення окислювального фосфор; лювання може знаходитись в основі вікових змін стійкос їй і тіш і тканин до дії патогенетичних факторів [Taudii. S, to, 19781. Так с дані про збільшення у старих шурів ступо гіпотонічного та ісемічного ношїодмзішя зовнішньо і мембра мітохондрій СЛемешко, 1962; Leræshko, Shekh, 1993; Ut 19931, більш виразне пригнічення функції окислювально фосфорилюЕаная мітохондрій старих тварин в умовах ко рот к частого гіпотонічного иску [Barrett, Horton, 1975] зміну віком ідурів чутливості мітохондрій до гіпоксії [Ступина соавт., 19891, зашрояувашія-відігріву [Миронова, Лем-звк 198ul, діі тироксину [Лемешко и соавт., 19861. Однак, відомості нечислен і, розрізнені і не дають повного уявлеь про характер та причини вікових змін струотурнс-фуккціоїш ’ ного стану штохоидій. Актуальне у зв’язку з цим питання і: механізми, за допомогою яких висові зміни структури оргаї ' впливають на їх функціональний стан і навпаки, мало ьпвчеі Разом з тим, такі дослідження необхідні для з’ясування ь ханізмів зміни надійності функціонування клітин при стара організму. ■ ..

* УЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДКЕННЯ. Метою роботи с дослідк

вікових ¿шін структурно-функціонального стану мітохондрій,

' ïwt:i.r ¡икоьнх особли отой впливу деяких екстремальних ф<

. - 5 -

□рів на макроструктури і та Функціональні зміни органе л.

У зв'язку з поставленою метоп були сформульовані такі авдання роботи: .

1. Вивчити вплив осмотично-зумовленої ЗМІНИ СТРУКТУРНОГО тану мітохондрій на їх дихання, окислювальне фосфорилювання

♦ -а ІІ-ЛТгІалну активність в залежності від вису щурів.

2. Дослідити висові зміни та особливості регуляції висо-г.амплітудного набухання мітохондрій.

3. Еивчити вікові особливості дії де я ют екстремальних ¡¡акторів, ( іпємі і, гепатотскснчних доз ксенобіотнка парацета-юлу та довгочасного застосування тироксину) на структур-ю-функцюнальний стан мітохондрій,

ТЕОРЕТИЧНА ТА ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЙОГО НАУКОВА НОВИЗНА. В роботі встановлено, що при відносно неве-гдкій віковій різниці в функціональному стані мітохондрій, який сціншався в ізотонічних умовах, має місце суттєва вікова різниця в чутливості системи окислювального ^оформлювання до гіпо- і г тероскотичного впливу. ;;/

- ' */

Еилвлено, по при старінні змінюється такая щїррструк-турнкй стан органел, ер проявляється в збільшенні часу висо-коамплітудного набухання мітохондрій. в ізотонічних ссредови-иах. Вперше показано, пю вікова різниця в часі високо-амплітудного набухання пов’язана з особливостями метаболічної регуляції неспецифічної проникливості внутріаньої мембрани мітохондрій.

Токаззяо, го тотальна ішемія печінки та довгочасне застосування тирсксику приводять до прксксргннг, жскоаісш-тудкого набухання мітохондрій, в найбільаій мірі ві*ракс;юму ЛЛЯ старих сурів-самаів. Вг.тжовл'но. ш юксикальну чут-

. - 6 -

лив їсть (як за структурним, так і за функціональним станої до лі і гепатотоксичних доз парацетамолу проявляють 'мітохоі дріі печінки молодих-статевозрілих аур і в. ■

Отримані дані про вікові особливості структурно-фукнц опального супряження мітохондрій в нормі, а також при ; ряду екстремальних факторів, розширюють існуючі уявлення і характер та механізми зміни властивостей цих органел при с рінні організму і можуть Оуги основою для з’ясування прі вікових змін надійності функціонування клітин і ті:ашш.

РІВЕНЬ РЕАЛІЗАЦІЇ ТА ВПРОВАДЖЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ "ОСЛіДЖЕ!

Результати даного дослідження являються фрагментами держбюджети;« ЦДР.

■ ¡,‘лтеріали роботи використовуються в лекційних курс; які читаються на кафедрі загальної та медичної біофізики ф культету фундаментальної медицини ,ХДУ. .

АПРОБАЦІЯ ТА ПУБЛІКАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛиЗїЕНЬ. М тер іаги дисертації повідомлялися та оговорювалися на Загал носоюзній жол і-семінар і ■ "Епологическпе мембран:

(м. Звенігород, 1989, 1991 рр.), Загальносоюзній нараді "М лекулярныа механизмы и регуляция энергетического обмен (м. Пущина-на-Окі, 1990 р.), Загальносоюзній школі-конф ренції "Проблемы мембранной биознергетики" (м. Яу^ілс-на-Ок 1991 р.), 6 Українському біохімічному з їзді (м. Київ. 19

р.), науковій конференції "Ускоренное старение, сеязь с во растной патологией" -(-м. Київ, 1992), симпозиум і "Биолог ческие механизмы старения" (м. Харків, 1994 р.), 1 з' із

Українського біофізичного товариства (м. Київ, - 199-1 р.), та;»* на конференціях молодих учених Харківського державно університету (м. Харків, 1090-1994 рр.).

- 7 - . '

Основні положення дисертьції викладені в 10 друкованих роботах, в тому числі у 4-х статтях.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, глави "Матеріали і методи", трьох глав спису результатів власних досліджень, заключения, висновків, списку літератури, я кий вї^лючае 238 найменувань. Робота Еикладена на 137 стар, машинописного тексту, віслючає 23 малюнки та 11 таблиць.

ОСОБИСТИЙ ЕНЕСОК ДИСЕРТАНТА В ВИКОНАННЯ РОБОТИ ТА ОСНОВНІ ПОЛОЖЕНІЙ, ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ. Особистий внесок ди -сертанта в виконання роботи полягає в повністю самостійному виконанні всього обсягу експериментальної роботи, ста-' тистичній обробці отриманих даних. На підставі аналізу результатів експерименту та спі вставлення їх з даними літератури дисертантом сформульовані такі положення, шр виносяться на захист:

1. функціональний стан мітохондрій печінки пурів різного

віку має різну чутливість-до гіпо- та гіперосмоткчнпго впливу. ■ ■ • .

2. Старіння організму супроводжується збільшенням часу високоамплітудного набухання мітохондрій, що пов’язане з віковими"особливостями метаболічної регуляції неспецифічної проникливості внутрішньої мембрани органел.

3. Вікові зміни чутливості структурно-Функціонального стану мітохондрій до дії ішемії та довгочасного застосування тироксину проявляються в більп вираженому зменшенні часу метаболічно-залежного високоамплітудного набухання органел старих щурів. І’аксимальну чутливість до гепатотоксичних доз парацетамолу виявляють мітохондрії молодих-статевозрілих

"•'Pit.

МЕТОДОЛОГІЯ. МЕТОДИ ДОСЛІДНИЙ ПРЕДМЕТУ І ОБ'ЄКТУ.

У роботі були використані щури-самці лінії Вістар 1, • 3.

•і. 12. 24 та 20-місячного віку та самиці 24-місячного віку.

Тотальну іеємів печінки моделювали, вміщуючи наважку тканини в Сисс при температурі +37 С на 20, або 60 хвилин інкуОаці і. • ■ • * .

Парацетамол вурам’вводили внутріпньобрхшінно у. дозі 80 мг на 100 г маси тіла протягом 2-х діб. Тироксин тваринам давали у вигляді розчину в 0,02« КаОН (б мг/л), як питтеву воду протягом 2-х місяців. • Штохондрії печінки одержували методом диференційного центрифугування з однією промивкою [Jenson et al., 1967]. ііітохондрі\ з ..ішемізованщ: тканин І .

відповідних контрольних зразків отримували £ез промивки.

Швидкість дихання і окислювального фосфорилювання вимірювали полярографічним методом . за допомогою закритого платинового електроду Кларка. ГЬ крив;ш споживання кисню розраховували швидкість дихання в метаболічному стані 4ГЗ за Чансом (Y4 t Y3), в присутності розрізнювача 2,4-ДНФ (V3p), а також дихальний контроль ДК (V3/V4). Швидкість окислення екаогенного НАМ також'реєстрували полярографічним методом. .

» • ♦ ' • Вимірювання Н-АТїазної активності проводиш по- • тенціометркчшш методом ГБолдьфєв, 1977]. . .

Еисокоамплітудне набуханій мітохондрій реєстрували при . довгочасній інкубації органе): по зміненню їх оптичної цільності при довжині хвилі 620 нм на фотоелекгроколориметрГ KF-77i з термзстатованою кюветою,. магнітною мішалкою,.додат-'’ ковим логарифмічним підсилювачем та самопишучим потенції? мат- ; ром. . ’

■ 9 - ..

. Рівень відновленості та час окислення ендогенних я.рк диннуклеотидів вимірювали флуорометрично [Лзмєеко, 1031].

Бміст іонів магнію та кальцію в мітохондріях визначали на атомно-абсорбційному спектрофотометрі "Сатурн" в полум’яному варіанті "ацетилен-повітря". . '

Гідроперекиси ліпідів вимірювали за методом Ofikawa, COhkawa, 1979] з деякими модифікаціями СЛемеико и соавт., 1986].

Бміст малату в мітохондріях визначали, ресструичи флуо-риметрично утворення НАДН. яке екві молярно кількості малату, .окисленого в присутності НАЛН-малатдегідрогенази.

Визначення концентрації білка проводили за методом Ло-урі І співавт. в модифікації Міллера [Miller, 1959].

Результати були оброблені за методом Фівера-Ст’юдента [Терентьев и соав. , 1977] з використанням програмуємого

мікрокалькулятора МК-51 та ЕОМ IBM-386 DX.

• РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

ВПЛИВ ОСМОТИЧНОГО ТИСКУ СЕРЕДОВИЩА ІНКУБАЦІЇ НА ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ. З віком відбуваються значні зміни структури і функціонального стану мітохондрій [Spenser, Horton, 1979; Hansford. 1983; Лемеико, 1983; Schmucker, 1990]. Однак. механізм структурно-функціонального супряжнчя мітохондрій та особливості його змінення при старінні організму залишаються нез’ясовани-ми. У зв’язку з цим нами було досліджено функціональний стан мітохондрій печінки щур і в-самці в 1-, 3-, 12 І 24-місячного

віку-в залежності від структурних змін, які викликали ln vitro через варіювання осмотичного тиску середовища інкубації (36-516 мОсм).

. - 10 - .

Як свідчать отримані дані (табл. 1), про вікові зміни Д (при окисленні сукцинату). можна зробити 3 різних-висновки в залежності від осмотичного тиску середовища інкубації: і) Про відсутність суттєвих ЗМІН ДК в середовищі з осм . тичним тиском 165 мОсм. •

2) Про більш виражене знижання ДК у старих щурі порівняно з молодими при зменшенні осмотичного тиску ВІД 1Є до Зб’мОсм (на 30.8. 40.0, 41.5' і 43.9% у 1-, 3-, ’ 12- і

24-місячних с/ріе, відповідно). Ці результати узгоддуютьс з данини [Barrott, Hortonч 1976] про більш високу чутливісі мітохондрій старих цур і в до короткочасного гіпотонічного шс ку.

. V

' 3) Про збереження високого ДК мітохондрій її- і 12-м

сячних шурів в діапазоні осмотичного тиску ' 160-316 мОсм достовірному зниженні ДК у 1- та 24-місячних тварин (на 25, і 22.0%, відповідно) в середовищі З' осмотичним тис»

' ЗібмОсм порівняно до середовищ' з осмотичним тиском ібЄмОс ; В дуже гіпертонічному середовищі (515 мОсм) ДК у шу всіх вікових груп мав край низькі значення.

Отримані' результати дозволяють припустити, шо однією причин протиречності даних літератури про характер віков змін функціонального стану мітохондрій (Nohl, '.978; Berd nier, KfcNamura, 1980; Banga, Penzer, 1984; Crus et al 1090] може бути використання різних за складом середої інкубації. Вікова різниця» в змінах ДК у діапазоні осмзтичі . го тиску 166-35 мОсм і 166-31 б мОсм пов’язана з особливою . ми зміни V3 (але не V4) за цих умов (табл. 1). Вікова різні у-^ зміні V3 в гіпо- ; і гіперосмотичних середовища;: не J ляетьсй наслідком різного .ступеню порушення в самому диха

■ ' 11 ■ , ..

ТсіОДІІЦЛ и

Вплив осмотичного тиску середовкцз інкубації ;м У4, ’/З атом О/ХБКлшу. мг білка), ЯК'і ДИФ-стимульовану сілігсмі-нчутлкву АТФазну активність (ншль Лі/хвилину, мг йілгл) ТОХОІІДРІЙ печінки ІДУ15 ІВ різного Віку (¡1=4-8).

мотичний: Вік тварин, місяці \

^1 V» см ■ : 1 : 3 : 12 • 24

дк

36 2,710,1* 2,4+0, І* 2,4+0,2* 2,310,1*

136 3,910,1 4,0+0,2 4,1+0,2 4,1 + 0.1

•Л6 2,9+0,2* 3,5+0,2 4, ПО, 2 3,2і0,2*

516 1,2+0,1* 1,4+0,1* и 1,6+0,2* 1,410,1а

36 ЗЄ.З±1,2* 40,2+2,3* 35,3_И,9л 34,6±1,1*

165 27,6+0,8 25,5±1,0 23,7і0,9 24.1±0,8

316 27,6+0,8 24,2і1.5 24-, 9 (-1,1 25,4+1,0

516 27,8+1,0 20,1+0,7 23,6+1,5 26,1+1,4

О0 ' 95,4+6,5 УЗ 96,0+7,5 85,012,1* оО,Зі2,о*

166 108,5+4,9 102,315,3 93,0+3,4 101,5х*і, 5

316 сп о.иг> П-*-ии, / ,1/'л 84,2+7,1 101,0+3,8 СО, ¿л-ї , / > '

516 34,3+1,5* 28,5+1,3* 34,8+1,4* 36,3+1,9*

АТїазна активність (серздопипз не в.місуе і‘» )

36 107,5+8,7 122,0+3,3 100,6+14,4* 113,2+9,7*

166 112,3+4,4 135,917,3 143,8+10,4 144,9+5,7

316 . 55,3+3,6* 71,2+8,5* 57,2+12,1* 74,4+7,1*

516 0,9+0,4л 6,0+1,4* 4,1+1,0* . 2,4-11,1*

АТФазна активність (середовище вміщує ?.і? ).

36 83,5+6,1 90,9+7,2 100,0112,0 112,7і8,3

1.66 87,6+7,1 110,216,8 100,8+18,7 юз,п±іі,;

о-? а о і ^ 45,5+6,5* 77,4+7,7* 48,6+8,8* 63,513,6-

516 * - 8,2+3, б* 7,7+1,1* 4.3±1.7* Р<0,05 відносно варіанту 166 мОсм. 3,4і0,8>

• - 12 -

ному лаіщвзі (оскільки швидкість дихання в ¡¡рисутное розрізшовача у щурів різного віку у всьому дослідженому д апазоні осмотичного тиску змінювалась однаково), а зумовл на, напевно, особливостями структурного супряжен ■ ♦ • аденіннуклестидтранслокази і Н-АТФ-синтетазного комплексу.

При вимірюванні ДНФ-стимульованоі олігоміцинчутлив АТФаз но і активності мітохондрій (табл.1), максимальні зн чення цього параметра спостерігались в слабогіпотонічно середовищі (165 мОсм), що узгоджується з даними Chav [Chavez et al., 1987] і не залежали від віку твг-рин. П збільшеній осмотичного тиску' до 316, І далі до 516 мОс .спостерігалось прогресуюче інгібірування АТФазно. активное

с. .

мітохондрій печінки ШуріВ всіх вікових груп (незалежно в присутності в середовищі інкубації іонів магнію), що мо бути пов’язане зі зниженням активності аденіннуклєотид ракслокази в гіпертонічному середовищі .[tUcholls et al 1978J. При зниженні осмотичкого' тиску від 166 до 36 мС спостерігалась вікова різниця в АТФазній активності в сер довила без магнію, яка заключалась у зниженні ферментної а тивності у 12- і 24-місячних щурів (на 28.9, та 21.С відповідно) без достовірних змін у 1- і 3-місячних тварі: Змінення ферьзнтної активност-і, можливо, пов’язане з вихог

' *- ♦ магнію (який є необхідною умовою для робо лі Н-АТФе [Пеигу, 19801) в дуже-гіпотонічному середовищі. І ДІЙСІІ швидкість• виходу іонів лагнію з мітохондрій при зішжєї осмотичного тиску від 166..до 36 мОсм збі.Vиувалась в нас експериментах на 58, 6 та 79. 8% у. 1?- -л 24-місячних щурі

■ відповідно і статистично значимо ні .-чінювалась у 1-З-місячних. .

- 13 - ,

'Отримані дані свідчать, та функціональний стан што-ндрій печінки щур їв різного віку, який визначається в (зоні чних умовах, суттєво не відрізняється. Значні вікові дміни проявляються в реакції мітохондрій на гіпо- та гіпе-смотичний ’ вплив, • який зачіпає механізми струїстурно-нкц і опального супряжння цих органел.

СОКОЛМІШТУДНЕ НАБУХАННЯ МІТОХОНДРПІ ПЕЧІНКИ І ОСОБЛИВОСТІ

•ГО РЕГУЛЯЦІЇ У ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ. Висові зміни чутливості

т!/Хондрій печінки щурів до гігїо— та гіперосмотичноі інку—

дії, при відсутності суттєвої різниці в функціональному

ані в ізотонічних умовах, мояуть бути пов'язані з особлн-

стями макроструктурного стану органел. Вивчення високо-

плітудного набухання мітохондрій, яке відбиває,в тому

елі, і структурний стан .органел, показало, що в ізо-

нічних умовах час високоамплітудного набухання мітохондрій

-місячних щурів більш тк в 2 рази бількин, порівняно до

місячних, що якісно узгодиться з отриманими раніш ре-

льтатамп ГЛемешКО, Виявлена різниця у ивидісості Ьс'-

хання зберігається при наявності у середовищі ішс^бації

тиоксиданту іонолу, або .інгібітору фосфоліпаз нуперкаіну.

зом з тим, в присутності речовин, які здатні модифікувати • ‘ 2+ специфічну білкову пору внутрішньої мембрани (ДЛЯ, !.£ ,

ТА), вікова різниця У швидкості набухання мітохондрій стає

на вираженою, або зникає зовсім. Слід звернути увагу, що

■І, ¡4: та ЕГТА здатні не тільки збільшувати лаг-період ка-

хання мітохондрій, але і зупиняти, або значно уповільнюва-

процес на різних стадіях після його печатку. Таким чином,

ільшоння з віком часу вксокоамплітудного наухання міто-

гщрій' не є наслідкам простого порушення структур;.'

фосфоліпідіюго б і шару внутрішньої мембрани,’ а пов'язане з

більш специфічними змінами вмісту б органелах факторів, які

регулюють стан неспецифічної білкової пори. Одним з 'таких

і* і*

факторів можуть бути іони Са і Us [Crompton,1987; Halestrap, Davidson, 1989; Bernardi, 19893. Наш встановлено, що від 1

до 24-місячного віку зменшується (на 38.8%) загальний вміст 2» .

Са в отриманих препаратах мітохондрій. Показано також зниження на 65.0% при старінні організму швидкості виходу іонів магнію (який с інгібітором відкривання пори) з мітохондрій. Отже, вікові особливості регуляції неспецифічної білкової пори внутрішньої мембрани мітохондрій і, як наслідок, зміни у часі високоам'плітудного набухання органел, можуть бути пов’язані з віковими змінами їх Са /¡4? гомеостазу.

■ Значне зменшення вікової різниці у швидкості набухання мітохондрій спостерігали в присутності ротенону, або гідро-перекису кумолу, які впливають на метаболічний стан мітохондрій (а саме, на рівень відновленості піридиннуклео-тдців). ІІри цьому, в присутності ротенону час набухання мітохондрій молодих щурів збільшувався до рівня старих, а в присутності гідроперекису кумолу час набухання мітохондрій старих щурів зменшувався до величин, характерних для 1-місячних тварин. В іншій серії дослідів було 'показано, шр окислення ендггенних п.іридиннуклеотидів передує високо-амплітудному набуханню мітохондрій і. мабуть, являються одним з ключових регуляторів пускового механізму цього процесу. У зв'язку з цим важливі) відзначити, що мітохондрп 1-шсячних лурів характеризуються більш низьким (на 42.5%) рівнеї! відновленості ендогенних піридиннуклеотидів і меншим ;.(на 62.2/^ "часом їх напівокислення порівняно до 24-місячних,

. - 15 -

ЩО їлОлЗЗ ОуТК ОДНИМ З пояснень СіЛЬНІ ВЯССКОІ шВіїДКОС? І набухання мітохондрій молодих тварин. Підвищення з віком рівня відновлєності ендогенних піридиннуклеотидів може бути наслідком збільшення вмісту в мітохондріях старих щурів єн. «

догенішх Н'Д-залежних субстратів. В наших дослідах показано статистично значиме збільшення на 26.7% рівня малату в мітохондріях 24-МІСЯЧНИХ щурів порівняно до 1-місячних.

Зменшення вікової різниці в швидкості вксокоамплітудно-го набухання спостерігали також при внесенні в середовище інкубації розрізшсвача ФКФ, який вирівнює метаболічний стан мітохондрій через деенерпзацію внутрішньої мембрани. Слід' відзначити, що <гкф здатен впливати.на швидкість набухання тільки у тому разі, . коли він початково додавався до середовища інкубації, але не на етапі вже розпочавшогося процесу. Отая, наявність мембранного потенціалу, як і відзначений ви*>

ще перехід піридиннуклеотидів до окисленого стану, відіграє суттєву роль тільки на початкових етапах -відкривання пори. Таким чином, серед факторів, які зумовлюють вікову різницю у швидкості набухання, важливу роль грає, різна ступінь енергизаціі внутрішньої мембрани мітохондрій, суттєва для регуляції стану неспецифічної білкової .пори [Тесіезсіїї, 1981; НоНєпЬегд, 1989]. і . -

Зменшення вікової У.зниці у швидкості набухання відбувалось також гри внесенні до середовища інкубації субстрату окислення сукщшату. Важливо відзначити, що ефект сукцйнату значно зменпуз^вся в присутності ротенону, шр дозволяє зробити висновок про важливу роль в механізмі висскоашілітудно— ■ го набухання бнергозалежного зворотнього переносу електронів в дихальному ланцюзі.' Ротенон, блокуючи зворотній перенос-

♦

електронів, гальмує відновлення НАД і далі, постачання відновлюючих еквівалентів через трансгідрогеназу до НАДФН-GSH-залежноі ферментативної системи відновлення гідро--піфєкисів ліпідів [Jocelyn, 1978]. Більш швидке набухання мітохондрій печінки 1-місячних щурів не пов^язане зі ЗМІНОЮ з віком рівня гідроперекисів ліпідів (оскільки нами не знайдено суттєвої різниці за цим параметром між молодими і старії)« тваринами). ’ ■

Е цілому, отримані результати свідчать, що основною причиною збільшення з и і ком часу високоамплітудного набрання мітохондрій гвляється зміна метаболічної регуляції енергоза-лежної неспецифічної білкової пори внутрішньої мембрани ор-ганел. ■ . ■

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ СТРУтРНОФУШЦЮКАЛЬНОГО СТАНУ Ы1ТО ЖЧДРІЙ ПЕЧІНКИ ПРИ ЕКСТРЕМАЛЬНО!# ВПЛИВІ. Відомо, ідо важливу роль в реалізації дії на організм несприятливих фактор:Ь грає порушення енергозабезпечення клітин і тканин, головним чином, за рахунок зміни функціонального стану мітохондрій [Ashraf, 1978; Cogucka, .Vojtczak, 1979; Губекий, 1982; Shmiedl, 1990J. Однак,_ ■ віковий ' аспект структурно-функціонального стану мітохондрій при екстремальному 'станГорганізму дослідзвзний недостатньо.

Вивчення впливу тотальної клемії печінки на високо-шяілітудио набухання мітохондрій показало, го 20-хвилинна Ішемія приводить до зменшення часу високоачплітулдкого набування, в найбільшій мірі вигаженому для мітохондрій 24-місячних шурів-самців порівняно до 1-місячних самців та 24-місячних самиць (на 77.9, 45.5. ”а 66.7%, відповідно, у

відношенні ДО КОНТРОЛЮ). В прис}тності сукшінату, пдропере-

- • - 17 -

кису кумолу, 'або щільному додаванні цих речовин, вікова та статева різниця впливу ішемії на швидкість набухання міто-хондрій ставала менш вираженою. При цьому 20- хвилинна тотальна ішеШя приводила до зменшення рівня відновленості' ендогенних піридиннуклеотидів і часу їх напівоккслення, причому. В більшій мірі ДЛЯ МІТОХ'-'НДРІЙ 24-мі- сячних самців порівняно до 1-місячних. Слід відзначити, що вплив тотальної ішемії на високоаплітудне набухання мітохондрій мав одна'со-вий характер як у випадку ізольованих органел, так і в системі гомогенату. Збільшення часу ішемії до 60 хвилин приводило до подальшого зменшення часу високоамплітудного набухання, причому, як і при 20-хвилинній ішемії, в найбільшій мірі у 24-місячних самців порівняно до молодих нестате-возрілих самців та старих самиць. Отримані результати дозволяють припустити, що саме метаболічні зміни мітохондрій, які виникать при ішемії, являються основним фактором, який зумовлює швидкість високоамплітудного набухання, а подібність метаболічного стану мітохондрій печінки молодих і старих щурів після ішемічного впливу зумовлює суттєве вирівнювання швидкостей набухання органел.

• Відомо, що до числа факторів, які можіть приводити- до порушення енергоза&зпечення печінки, відкосяться гепато-токсичні дози лікарських препаратів, зокрема, широко вливаний нестероїдний протизапалювальний засіб - парацетамол (ацетамінофен) [ІаєзсЬїко, 1990]. В даній роботі було встановлено, що введення парацетамолу приводить до: статистично значимого зниження УЗ і ДК 4-місячних турів (при окисленні як НАД-залежного субстрату маіату+глутамату. так і ФАД-за-леиного субстрату - "сукщ"іату) без достовірних змін цих по-

’казників у 1- та БО-місячних тварин. При цьому дихання мітохондрій в присутності рогрізнюзача (УЗр), яке відображує ,стан дихального ланцюга, а також коефщиент стимуляції дихання розрізнювачем (Кр) в умовах досліду не змінювались в згодній о зікових груп. Огж, вплив гепатотоксичної дози.парацетамолу на УЗ і ДК мітохондрій 4-місячних щурів не пов'язаний з порувеннями в самому дихальному ланцюзі і зумовлюється, мабуть, гнидапіням аі:тявності перечосчика аденіннуклеотиді;-, або безпосередньо ЛТФ-синтетазногр комп-. лексу. При вивчена і високоамплітудного набухання мітохондрій в умовах введення щурам парацетамолу, встановлено, зр у 1-місячких тварин час напівнаоухання п досліді достовірно ке зміниться, а у 4- та 30-місячних зменшується на 56.8 і 52.3%, відповідно. Е"присуткості гідроперекнсу кумолу, метаболізм якого пов’язаний з окисленням глутатіону і піридин-нуклеотядіБ [КоґзЬеиог еЬ аі. . 1981], у тварин контрольної групи спостерігазтьсяефект, подібний до дії парацетамолу: прискорення набухання мітохондрій 4- і 30-шсячшіх ¡цур і в без зміненая цього показника у 1-шсячних тварин. Конжзо, що дія парацетамолу на високоамгілітудне набухання молодих статевозрілих - і с.:арих тварин реалізується через окислення тіолових груп і ендогенних нірі:дігануклеот:;дів. Цей висновок 'УоГоДі'^'с'Гьсїт з даними Спзізсг», 19913, які свідчать, що основной мішанню дії парацетамолу на мікросомальні мембрани

• являються тіолові групи. Отримані результати дозволяють зробити висновок, ер максимальну чутливість до дії гепато-токсіічішх дез парацетамолу, (як за структурним, так і за функціональним станом) масть мітохондрії молоди статевозрілих (.4-місячних иурів),- ер може пояснюватись ВІ КО ВИШ!

■ . - 19 - '

особливостями мікросомального окислення цього ксенобютика [Rikans, 1989; Peterson, Rumack, 1981].

Вивчення впливу довгочасного застосування тироксину, як фактора прискоренного старіння організму, . на високоамплі-тудне набухання мітохондрій показало, що в умовах гіпертире- ; озу відбувається достовірне зменшення часу напівнабухання мітохондрій, причому, в 6ільіЗі‘’І мірі у 12- (на 83.ОХ) і 24-місячних (на 87.0;:) шурів порівняно до 3-місячни:( (на 62. IX). Отже, при введенні тироксину мітохсндрп доросли І старих піурів за макроструктурним станом наближаються до молодих тварин.- Ці результати узгоджуються з отриманими раніше в нашій лабораторії даними про так звану ’’омололяуючу” дію тироксину на структурний стан мітсхсмдріальних мем'ран, що являється складовою частиною в механізмі прискореного старіння [Лемешко, 1986]. При наявності в середовищі інкубації гідроперекісу кумола, або спільному додаванні гідропе-рекису і сукцинату, вікова різниця впливу тироксину на набухання ставала менш вираженою. Вазглива роль в регуляції проникливості внутрішньої мембрани, окрім гідроперегаїсу, нале- •

г* . ■ '

жить1 іонам Са [Crompton,- 1987; Bernardl, 1989]. На прикладі однієї з вікових груп (24 місяці) нами встановлено, що довгочасне застосув?£ня тироксину приводить до’Збільсеннл на

г*

28.4% вмісту Са в мітохондріях, що є однією з причин приско- .

рення набухання органел. Отримані результати свідчать, пр.

візова різниця вп.іиву тироксину на високогмплітудне набухан-

і - - • г»

ня > пов'язана з особливостями регуляції. Са г. гідропе- .

роксид-залежно і неспецифічної б t лісової пирії внутрішньої .

мембрани мітохондрій.1'. • • ; ‘ : * . . , -.

, 1 'Таким чином,1 результати цієї роботи свідчать про важливу

ю.іь метаболічної регуляції неспецифічної проникливості внутрішньої мембрани в зміні з віком структурно-функціонального стану мітохондрій і чутливості органел до дії екстремальних факторів.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, па функціональний стан мітохондрій печінки щурів рівного віку, який визначається в ізотонічних умовах, відрізняються несуттєво. Виразна вікова різниця виявляється в рє-іадії мітохрндрій на гіпо- та гіперосмотичні умови інкуСрдіі .і заключається:

- в найбільш високій чутливосії до гіпоосмотичної інкубації системи окислювального фосфорилювання мітохондрій 12- І 24-місячних шурів; ■

- в більш високій чутливості до гіперосмотичного впливу

системи окислювального фосфорилювання мітохондрій 1- і 24-місячлих шурів. ■

2. Показані суттєві зміни з віком макрсструктурного стану мітохондрій печінки, які виявляються в значному збільшенні часу високоамплітудного набухання органел в умовах іп уИ,г6, щр ! вв'язане з особливостями їх метаболічного ■стану-, суттєвого для регуляції неспецифічної енергозалежної

білкової пори внутрішньої мембрани, а саме: зі зміненням і* г*

Са /Щ гомеостазу і збільшенням рівня ендогенних субстратів.

3. Показано, що при тотальній ішемії печінки відбуваються прискорення високоамплітудного набухання мітохондрій, найбільш в'ражене для 24-місячних самців порівняно до 1-місячних самців та 24-місячних самидь. Вплив ішемії на набухання мав однаковий характез як у випадку ізольованих орга-

нел. так і в системі гомогенату.

4. Найбільп високу чутливість до дії гепатотоксичних доз парацетамолу виявляє система окислювального фосфорішшання і високсашілітудне набухання мітохондрій молодих статевозрілих (4-місячних щурів) порівняно до 1- і 30-місячних тварин.

. . 5. В умовах прискореного старіння, яке моделювали довгочасним застосуванням тироксину, показано більа виражене зменшення часу набухання мітохондрій печінки 12- і 24-мі-сячних’щурів порівняно з 3-місячнимн тваринами. Вікова

різниця впливу довгочасного введення тироксину на швидкість • • г*

набухання мітохондрій пояснюється особливостями Са -пдропе-

роксид-залеюгаї регуляції неспецифічної проникливості їх

внутрішньої мембрани.

' ПУБЛІКАЦІЇ ЗА ТЕИОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Удовикова Е. А.. Язмешко а К Возрастные различия вли-

яния осмотического давления на дыхание митохондрий печени крыс // Бшл. эксп. биол. и мед. - 1991. - N2. - С. 150152. •

2. Лемешко В. а . Удовикова Ё. А. Влияние осмотического давления на олигомицинчувствительную АТФазнуп. активность' и выход ионов магн'гп из митохондрий печени крыс' разного возраста // Укр. бкохим. журн. - 1992. - И1. - С. 83-88.

• : 3. Удовикова Е. А. Дыхание и дыхательный контроль мито-

хондрий печени крыз разного возраста при изменении осмотического давления среды инкубации // Сборник йаучяых работ аспирантов ХГУ (естественные и физико-матемаїические ;науки)

- Харьков: Основа. 1992. - С.' 52-56. ■ .

V ' 4. Удовикова Е. А.. Лемешо ЕЕ. ' Возрастные особенности спонтанного вьюокоампллтудного набухания.митохондрий печен».

- 22 -

крыс // Докл. АН Украины. - 1932. - N8. - С. 155-158.

5. Удовікова О. А., Лемешко В. В. Регулювання структурно-фучкцюналыюго супряження мітохонлрій печінки щурів різного віку осмотичним тиском середовиїга інкубації // Тез. доп. 6 Укр. біохім. З'ЇЗДУ. - Київ. 1<?У2. - 4.1. - С. 232.

6. Удовикова Е.А. Еысокоамплитудное спонтанное набухание митохондрий и выход йогов магния как поісазатели биологического возраста организма // Ускоренное старение, связь с воз- . ■растной патологией: Тез. докл. научн. конф. , Киев, 1992. -С. 174.

7. Удоьикова Е. А. Возрастные особенности ишемического повреждения митохондрий печени крыс // Тез. докл. научн.

• конф. молодых ученых биологич. ÎMa и НИИ биологии ХГУ. -Харьков. - 1993. - С! 24.

■ 8. Удовикова Е. А. Возрастные особенности струкгурно-

функционального сопряжения' митохондрий печени // Биологические механизмы старения: Тез. докл. симпозиума - Харьков,

1994. - С. 182. '

9. Удовікова О. А. Особливості регуляції .проникливості внутрішньої мембрани мітохонлрій печінки щурів різного віку // 1 з'їзд Укр. біофізичн. товариства. - Київ, 1994. -' С. 237-238. • '

. 10. Ійдалко В. І., Удов і кова 0. А., Козлова 0, В. Міто-

.хондріашіа та мікросомальна елеіггрон--транспортні системи печінки щурів різного віку’в умовах введення парацетамолу //

' 1 з’їзд Укр. біофізичн. товариства - Київ, 1994.;- С. 182.

' * - 23 -

Удовикова Е. А. Структурно-функциональное сопряжение митохондрий печени при старении крыс.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Харьковский

государственный медицинский университет, Харьков. 1994.

о

Изучено влияние ' осмотически-обус^овленного изменения структуры митохондрий печени крыс разного возраста С 1,3,12.24 месяца) ,ча их функциональное состояние. Исследованы возрастные особенности высокоамплитудного набухания митохондрий в норме и при действии ряда экстремальных факторов. Установлено, что функциональное состояние митохондрий, определяемое в средах, близких к изотоническим, у крыс разного возраста отличается незначительно. Показана более высокая чувствительность системы’ окислительного фосфорилирования к гипоосмоти-ческсй инкубации митохондрий 12- и 24-месячных крыс и к ги-перосмотической инкубации митохондрий 1- и 24-месячных крыс. Выявлено значительное замедление с возрастом высокоамплитудного набухания митохондрий, которое в наибольшей степени ускорялось у старых крыс после тотальной ишемии и длительного применения тироксина •

Udovikova Е. A. Stm° ural-furntional coupling of liver mitochondria under the process of rat aging.

The thesis for Doctor of Biology on speciality 03.00.04

- biochemistry, ' ..

Kharkov State Medical University, Kharkov, 1994. ..

\ ,

In this work the influence of osmotic-caused change of the ' structure of liver mitochondria cf rats of different ages (1, 3, 12, 24 months old) си thmr functional state has be-

en studiei Tliere have been researched age-related peculla-rii-i9S of hlgh-arp] itude stalling of nltochondrla In the rorne end under the influence of a number of extreme factors, fes teen established that the functional state of mitochondria. defined in conditions close to Isotonic, at the rats of different ages differed slightly. There has b>en shoved the higher sensibility of the system of oxidative phosphorylation to hypoosnotlc incubation of mitochondria of 12- and 24-month old rats and to hyperosmotic incubation of mitochondria of 1- and 24-month old rats. There has been discovered a considerable slowing with the ago of hlgh-amp-lltudfc . swelling of mitochondria To the largest extent the swelling was speeding at old rats after the total ischemia and the prolonged application of thyroxine.

4

KjirriOBt cJioBa: '

uiToxoHApll, cTapuma, HaSyxamiH, imeulH, thpokchh.