Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное исследование механизмов организации веретенообразной активности нейронов бочонка соматической коры крысы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование механизмов организации веретенообразной активности нейронов бочонка соматической коры крысы"

На правах рукописи ци^4"—

КИРИЧЕНКО Евгения Юрьевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОРГАНИЗАЦИИ ВЕРЕТЕНООБРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОНОВ БОЧОНКА СОМАТИЧЕСКОЙ КОРЫ КРЫСЫ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2009

003468188

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нейрокибернетики им. А.Б. Когана Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ст. н. с. Сухов Александр Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шульговский Валерий Викторович

доктор медицинских наук Мационис Александр Эдуардович

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (РАН, г. Москва)

Защита диссертации состоится « 21 » мая 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105/42, ЮФУ, ауд. 203).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Колмакова Т.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из важнейших свойств функциональных групп нейронов мозга является ритмическая активность. Функциональное состояние коры головного мозга отражает баланс между тормозными и возбуждающими процессами в коре и проявляется в смене частотных диапазонов ЭЭГ (Гусельников, 1976; Шевелев с соавт., 1991; Шевелев с соавт., 2001). Так, дельта-ритм наблюдается в состоянии глубокого сна, а альфа-ритм характерен для спокойного и дремотного состояний (Коган, 1964; Нарикашвили с соавт., 1965; Супин, 1968; Фельдман, 1974; Вербицкий, 1980; Буриков, 1985; Ковальзон, 1993; Сухов, 1995). Ритмы тета-диапазона усиливаются в состоянии активного бодрствования при выработке рефлексов (Котляр, 1977; Шульгина, 1978; Кураев, 1982; Кирой, 1998). По данным ряда авторов, тета-ритм также участвует в механизмах квантования сенсорного потока (Гусельников, Супин, 1968; Гусельников, Изнак, 1983; Шульгина, 1978; Симонов, 1979; Данилова, 1985; Сухов, 1995). Согласно многочисленным данным, ритмы ЭЭГ играют важнейшую роль в механизмах восприятия, обработки и передачи информации в мозге и обусловлены множеством механизмов, вклад которых зависит от текущего функционального состояния и частных проявлений ритмической активности (Gray, Singer, 1989).

В классических гипотезах ритмогенеза доминируют представления о ведущей роли подкорковых структур (Буриков, 1971; Нарикашвили, 1975; Вербицкий, 1980; Буриков 1985; Чаянов, 1986; Сунцова, 2000, и соавт.; Andersen, Eccles, 1962; Steriade, et. al., 1984-1991). В настоящее время все больше сторонников приобретают представления о локальном внутрикорковом происхождении ряда проявлений ритмической активности. В частности, ведущими в развитии локальных ритмов корковых колонок рассматриваются не повторные залпы таламокортикальной синаптической активации, а эндогенные волны пейсмекерной активности, обусловленные потенциалзависимыми калиевыми, натриевыми и кальциевыми Н-каналами (Семьянов, 2003; McCormick, Pape, 1990; Pape, 1996; Santoro et al., 2000). Как показано при внутриклеточной и внеклеточной регистрации импульсной и фокальной активности, в начальной стадии развития локальных автономных ритмов в корковых структурах, в частности, веретенообразной активности колонок соматической коры крысы в зоне проекции вибрисс, импульсная активность нейронов нередко отсутствует вследствие доминирования процессов гиперполяризации (Сухов, 1995; Бездудная, 2000; Сухов, Сердюк, Коняхина, 2007; Timofeev et al., 2001). Эти данные свидетельствуют о незначительном вкладе процессов, опосредованных химическими синапсами, на ранних этапах формирования этого вида активности нейронов.

В этой связи возникает вопрос относительно механизма синхронизации осцилляторной активности пейсмекерных Н-каналов разных нейронов в начальной стадии веретена. По современным данным, важную роль в электротонической синхронизации этих каналов, активируемых при гиперполяризации мембраны отдельных нейронов одной колонки, могут играть электрические дендро-дендритические синапсы, выявленные в локальных системах тормозных нейронов в разных отделах мозга млекопитающих, в том числе в соматосенсорной коре крыс (Deans et al., 2001; Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003; Connors, Long, 2004; Gibson et al, 2005). Однако до настоящего времени структурные особенности и механизмы функционирования электрических синапсов, их распределение и роль в центральной нервной системе остаются мало изученными. В частности, несмотря на то, что электрические синапсы были описаны повсеместно в коре и подкорковых структурах мозга млекопитающих, в доступной литературе не удалось обнаружить сведений о количественном соотношении электрических и химических контактов в бочонках на уровне четвертого слоя соматической коры и о возможном вкладе электрических и химических синапсов на разных этапах развития веретенообразной активности в зоне представительства вибрисс.

Целью настоящей работы являлось изучение основных структурно-функциональных закономерностей организации бочонков и возможных механизмов синхронизации фокальной веретенообразной активности в колонках (баррелях) соматической коры крысы.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить особенности пространственно-временной организации фокальной веретенообразной активности в морфофункциональных группировках нейронов четвертого слоя соматической коры крыс - в поле бочонков и в соответствующих баррелоидах таламуса. Исследовать особенности процессов синхронизации фоновой фокальной веретенообразной активности нейронов, отводимой от бочонков одного и разных рядов.

2. Провести электронномикроскопическое исследование функционально идентифицированных при микроэлектродной регистрации бочонков соматической коры крыс с целью определения ультраструктурных характеристик электрических и химических синапсов в бочонках баррельной коры крыс. Провести ультраструктурное исследование особенностей взаимного пространственного расположения электрических и химических синапсов на серийных срезах.

3. Выполнить иммуногистохимическое исследование экспрессии антигенов к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку (Synaptophysin, Mielin Basic Protein, Glial Fibrillar Protein, Neurofilament), которые позволяют выявить особенности пространственного распределения химических синапсов, глиальных

клеток и аксонов нейронов в баррельной коре крыс.

4. Сформулировать тсорстичсски и экспериментально обоснованную гипотезу о роли электрических и химических синапсов в локальной эндогенной генерации разных фаз веретенообразной активности в корковых бочонках с использованием собственных и литературных данных.

Научная новизна работы.

1. Разработан новый метод комплексного электрофизиологического, электронномикроскопического и иммуногистохимического исследования функционально и морфологически идентифицированных бочонков баррельной коры.

2. Впервые проведено иммуногистохимическое исследование баррельной коры с использованием антител к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку, которое позволило обнаружить некоторые особенности структурной организации бочонков с помощью реакции «антиген - антитело».

3. Получены оригинальные данные об особенностях пространственно-временной организации веретенообразной активности в разных бочонках баррельной коры, идентифицированных функционально по представительству вибрисс. Показано, что медленная электрическая активность в гомологичных зонах представительства вибрисс коры и таламуса формируется более или менее независимо.

4. Впервые проведено исследование электрических синапсов на серийных срезах бочонков баррельной коры, оценена частота встречаемости электрических и химических синапсов и их взаимное пространственное расположение.

5. Сформулирована новая гипотеза о роли электрических и химических синапсов в локальном ритмогенезе в бочонках баррельной коры на разных фазах развития веретенообразной активности. Предполагается, что электрические синапсы обусловливают локальную (внутри одного бочонка) электротоническую синхронизацию начальных фаз формирования веретена, в то время как химические синапсы вносят основной вклад в дистантную синхронизацию активности различных корковых бочонков.

Научно-практическая значимость работы. На основании полученных результатов сформулирована гипотеза, согласно которой в качестве водителя ритма веретенообразной активности баррельной коры могут выступать пейсмекерные Н-каналы гиперполяризации. Синхронизацию начальной подпороговой активности пейсмекерных Н-каналов в отдельном бочонке могут обеспечивать щелевые контакты или электрические синапсы. В дальнейшем, когда ритмические потенциалы достигают порога импульсной активности, в процесс синхронизации ритма в разных бочонках включаются химические синапсы.

Полученные результаты и разработанные методы комплексного

морфофункционального исследования могут быть использованы как студентами и аспирантами-физиологами, так и морфологами при исследовании механизмов синхронизации и структурной организации баррельной коры крыс, а также для подробного изучения ультраструктуры электрических и химических синаптических контактов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В пределах таламокортикальной системы крыс в гомологичных зонах представительства вибрисс наблюдается относительно независимое формирование медленной электрической активности в коре и таламусе.

2. Генерация веретенообразной активности имеет локальный эндогенный характер в каждом бочонке баррельной коры крыс без закономерного разделения соседних бочонков на ведущие или ведомые, без фиксированной последовательности их вовлечения в ритмогенез.

3. Бочонки баррельной коры имеют особую клеточную и синаптическую организацию, а ультраструктура, количество и локализация электрических синапсов в баррелях позволяет рассматривать их как структуры, обеспечивающие электротонический этап синхронизации локального эндогенного ритмогенеза.

4. Ведущую роль в локальной внутриколончатой синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические дендро-дендритические синапсы, которые обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной активности нейронов одного бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические синапсы не активизированы.

5. Предложена новая гипотеза о механизме развития начальных фаз веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс, в которой ведущая роль отводится электротонической синхронизации активности нейронов одного бочонка и формированию элементарного ансамбля тормозных нейронов, объединенных электрическими дендро-дендритиче-скими синапсами.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2006» (Москва, Россия, 2006), на 10-й Школе-конференции молодых ученых «Биология XXI века» (Пущино, Россия, 2006), на 5-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), на 18-м Конгрессе ESRS (Европейское общество изучения сна) (Инсбрук, Австрия, 2006), на XX Конгрессе Общества физиологов имени Павлова (Москва, Россия, 2007), на Третьем Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007), на Научно-практической школе по конфокальной и флуоресцентной микроскопии «Горизонты современной микроскопии» (Leica) (Пущинский научный центр

РАН, Россия, 2007), а также на конференции «Структурно-функциональные нейрохимические и иммунохимичсскис закономерности асимметрии и пластичности мозга» (отдел исследования мозга ГУ НИИ неврологии РАМН) (2007), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Функциональное состояние и здоровье человека» (Ростов-на-Дону, ЮФУ, 2008), на заседании ученого совета НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ.

Публикации. По теме диссертации было опубликовано 11 печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и одна статья в журнале Neuroscience and Behavioral Physiology, общим объемом 1,524 п.л., личный вклад автора - 62,5%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 204 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 48 рисунками и двумя таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Постановка экспериментов. Объектом исследования являлись бочонки соматической коры головного мозга беспородных лабораторных белых крыс. Представленные в работе результаты были получены в опытах на 30 животных обоего пола, весом 150-200 г, которые содержались в виварии в стандартных лабораторных условиях при оптимальном температурном режиме и стандартном питании. При постановке экспериментов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные директором НИИ НК РГУ имени А.Б. Когана, с учетом рекомендаций ученого совета НИИ нейрокибернетики РГУ им. А.Б. Когана и заключения комиссии по биомедицинской этике Российской академии наук, а также в соответствии с международными регламентациями экспериментов на животных (Копаладзе, 1998).

Трепанацию черепа проводили под эфирным наркозом ручным трепаном диаметром 3 мм, края кожных разрезов дополнительно инфильтрировали 1%-м раствором новокаина. После трепанации подачу эфирного наркоза останавливали, крыс обездвиживали введением d-тубокурарина внутримышечно (2 мг на 1 кг веса) и затем переводили на искусственное дыхание, обеспечивая частоту дыхания один раз в секунду.

Электрофизиологические методы исследования. Для отведения фокальной активности отдельных бочонков и баррелоидов таламуса использовали стеклянные

капиллярные микроэлектроды, заполненные 2,5 М раствором NaCl, сопротивлением 2-5 МОм и диаметром кончика менее 1 мкм. Для регистрации активности соседних баррелей использовались склейки из четырех-шести микроэлектродов с расстоянием между кончиками 200-400 мкм. Микроэлектроды погружали в мозг с помощью микроманипуляторов ММ-1 с шагом погружения 10 мкм под контролем микрометра. Колонки коры определяли по первичному ответу при отклонении соответствующей вибриссы, а также оценивали на слух нейронную активность, трансформированную в звуковые сигналы. Регистрация фоновой активности производилась через АЦП L-205 (аналологово-цифровой преобразователь LCard, Россия). После регистрации электрической активности кончики регистрирующих микроэлектродов обрезали и оставляли в ткани мозга для определения расположения микроэлектродов в конкретном барреле по локализации их треков при последующем гистологическом контроле.

Морфологические методы исследования. В конце эксперимента крысам вводили нембутал в дозе 60 мг/кг и проводили транскардиальную перфузию головного мозга вначале изотоническим раствором фосфатного буфера, затем раствором 4%-го параформальдегида (Sigma) на 0,1-молярном фосфатном буфере (pH 7,2-7,3). Скорость перфузии соответствовала скорости движения крови по сосудам. После окончания перфузии головной мозг извлекали, далее на вибратоме VT 1000Е (Leica, Германия) изготавливали тангенциальные срезы толщиной 100 мкм по ходу микроэлектродного трека. Срезы просматривали под световым микроскопом, баррели обычно обнаруживали на глубине 400-800 мкм от поверхности коры. В дальнейшем толстые срезы с идентифицированной баррельной корой использовали для светооптического и иммуногистохимического (10 животных) и электронно-микроскопического (10 животных) исследования.

Обработку материала для электронной микроскопии проводили по общепринятой методике (Robenson, Gray, 1990; Bozzola, Russell, 1992). Одиночные и серийные ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме Ultracut-E (Leica, Германия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе ЕМ-208 (Philips, Нидерланды).

Для иммуногистохимического исследования баррельной коры использовали первичные мышиные моно- и кроличьи поликлональные антитела против нейрофиламентов (Neurofilament), основного белка миелина (Mielin Basic Protein), глиального фибриллярного кислого белка (Glial Fibrillar Acid Protein), синаптофизина (Synaptophysin) и систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (AEC) (antirabbit, antimouse), Dako (Германия).

Методы анализа биоэлектрической активности. Для анализа фоновой фокальной

активности длительностью 30-60 секунд использовался метод статистического анализа временных рядов - спектральный анализ Фурье из пакета Slalislica 5.0 Stat Soft. Средние спектры мощности, спектры когерентности и фазовые спектры с шагом по частоте 1 Гц изучали с помощью программы Spectrum.

Морфометрические методы исследования. Для морфометрического анализа ультраструктуры электрических и химических синапсов при помощи системы ввода и анализа изображений электронного микроскопа ЕМ-208 производилась запись изображений с исходным увеличением х8900 и х44000 в графическом формате .tif. Морфометрию проводили на IBM РС/АТ-486 с использованием входящего в систему лицензированного программного пакета AnalySis (Нидерланды). Результаты исследований обрабатывались статистически и представлялись в виде таблиц и графиков. Для статистической обработки использовали пакет программ Statistica for Windows 6.0 (Боровиков, 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организация веретенообразной активности в мопосинаптически связанных бочонках и соответствующих им баррелоидах коры и таламуса.

При визуальном анализе полученных в экспериментах записей фокальной биоэлектрической активности коры и таламических ядер обнаружено, что веретена коры имели различную форму и длительность, которая колебалась от одной до нескольких секунд. При этом, как правило, наблюдались существенные расхождения во времени начала и окончания веретен в коре и таламусе, а также различия в частотных и амплитудных характеристиках внутриверетенных волн в этих структурах.

Так, в случае, представленном на рисунке 1, начальная стадия коркового веретена характеризовалась двумя медленными отрицательными потенциалами, в таламусе же начало веретена сопровождалось одним положительным пиком, ассоциированным с торможением импульсной активности нейронов (рис. 1). Проведенный анализ частотной сонастройки в процессе формирования веретен в коре и таламусе показал, что при формировании более частых колебаний (17-18 Гц) в коре подобных частот в таламических ядрах не наблюдается. Отражение в таламусе находят только более низкие (8-9 Гц) частотные колебания. К примеру, на рисунке 1 в таламусе веретено начинается с положительной волны гиперполяризации без предшествующего возбуждения импульсной активности. Первая положительная волна ассоциирована с торможением импульсной активности нейронов, активация импульсной активности наблюдается только в середине развития веретена.

В различных экспериментах рассчитанные значения коэффициентов корреляции

между ритмической активностью коры и ядер таламуса были менее 0,45, что значительно ниже коэффициентов корреляции между фоновой ритмической активностью таламических ядер, значения которых близки к единице (>0,85). Анализ спектров мощности показал, что в таламусе преобладают частоты 1-3 Гц, тогда как в коре - 1-11 Гц. Анализ спектров когерентности выявил большую когерентность между ядрами таламуса, чем между корой и таламусом, что может свидетельствовать в пользу более выраженной синхронизации внутри таламических структур, по сравнению с таламокортикальными. Фазы усредненного кросспектра показали противофазное развитие веретенообразной активности в коре и таламусе и, наоборот, синфазное развитие веретенообразной активности внутри таламуса практически на всех частотах.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об относительно независимом характере формирования фоновой веретенообразной активности в бочонках коры и баррелоидах таламуса.

Рис. 1. Индивидуальные особенности развития веретенообразной активности в коре (3) и таламусе (1,2) в состоянии спокойного бодрствования; Условные обозначения: 1 -релейное ядроталамуса-

баррелоид 03,2 - релейное ядро таламуса - баррелоид 02,3 - соматическая кора, стрелкой обозначена импульсная активность, пунктирные линии показывают частотную сонастройку коры и таламуса, звездочкой обозначена противофазностъ активности коры и таламуса

Пространственно-временная организация веретенообразной активности в баррельной коре.

Исследование фокальной фоновой биоэлектрической активности, одновременно регистрируемой от разных бочонков четвертого слоя первичной соматосенсорной коры крыс

81, выявило во всех экспериментах периодически возникающую волновую веретенообразную активность с длительностью веретен от 500 мс до 24 секунд, чаще 1-2 секунды. Однако, когда в бочонке одного ряда гранулярного слоя регистрировались высокоамплитудные ритмичные потенциалы, модулированные в характерные «веретена», в бочонке другого ряда могли наблюдаться меньшие по амплитуде ритмичные осцилляции (рис. 2). На приведенном рисунке 2 веретена, регистрируемые в бочонке СЗ, начинались только на третьем пике внутриверетенных потенциалов, зарегистрированных в бочонке 02. На шестнадцатом пике у веретен бочонка СЗ уменьшалась амплитуда, в то время как в бочонке 132 она оставалась прежней. Кроме того, веретена, регистрируемые в одном бочонке, могли заканчиваться и начинаться раньше, чем регистрируемые в другом бочонке.

!, 1.111,,,щ!,.,.!..!,,.111.1,.Им!., г

0,5 мв

1 сек.

Рис. 2. Фоновая веретенообразная активность двух соседних баррелей.

Условные обозначения: 1,2- активность от одного бочонка, 3,4 - активность от другого бочонка, стрелка - обозначение начала и конца веретена

На рисунке 3 представлен один из примеров фоновой веретенообразной активности, регистрируемой тремя микроэлектродами, расстояние между кончиками которых было не более 200 мкм. Проведенный после данного эксперимента гистологический контроль локализации микроэлектродов позволил установить, что два микроэлектрода из склейки были погружены в один бочонок ряда С (полость - 1, стенка - 2), а третий микроэлектрод отводил ритмическую активность от бочонка соседнего ряда О (рис. 3, б). Поскольку в данном случае все три микроэлектрода находились на достаточно близком расстоянии друг от друга, можно было ожидать веретена одинаковой длительности, амплитуды с одинаковым количеством пиков внутриверетенных потенциалов. Однако даже при визуальном анализе приведенных на рисунке 3 записей веретенообразной активности очевидно, что веретено на

третьем канале, отводимое от бочонка ряда О, начинается позже, имеет меньшую длину и амплитуду, по сравнению с веретеном бочонка ряда С. Корреляционный анализ показал, что коэффициент корреляции данных, полученных от бочонка ряда С, составил 0,92, тогда как коэффициенты корреляции данных от разных бочонков (О и С) составили 0,56 и 0,65 соответственно. Полученные данные свидетельствуют о достоверно более высокой синхронизации внутриверетенных потенциалов внутри одного бочонка, по сравнению с бочонками различных рядов.

Каналы

Я ж и »'ж ж * ш ж «ю щ, ш» ШЙ В « п «1

а)

шш

0,5 мм

Рис. 3. Ритмическая активность двух колонок соматической коры крысы. Условные обозначения: а) 1,2- запись активности из одного бочонка ряда С, 3 - запись из другого бочонка ряда Б; б) гистологический контроль. Стрелками указаны места локализации микроэлектродов во время опыта, С, О, Е - ряды бочонков поля баррельной коры крыс, 1, 2, 3 - треки микроэлектродов, соответствующие каналам 1, 2, 3

Таким образом, результаты спектрального анализа фоновой биоэлектрической активности, зарегистрированной в разных бочонках различных рядов четвертого слоя соматической коры крыс, показали возможность асинхронного развития веретенообразной активности в разных бочонках, различия в степени выраженности веретенообразной активности в разных баррелях соматической коры крыс. Анализ когерентности фокальной биоэлектрической активности, зарегистрированной в двух бочонках одновременно, показал более высокую согласованность изменения потенциалов внутри одного бочонка, чем между двумя баррелями, т.е. выявил большую синхронизацию активности внутри одного бочонка. Согласно проведенному статистическому анализу фаз усредненного кросспектра, наблюдается согласование фазовых отношений в пределах одного бочонка поля баррельной коры. Вместе с тем у разных бочонков наблюдаются значимые различия.

Макро- и микроскопическая организация баррелыюй коры и экспрессия основных антигенов, специфичных для нервной ткани.

При исследовании тангенциальных серийных срезов соматической коры головного мозга толщиной 100 мкм, сделанных на вибротоме, структуры баррелей обнаруживаются на глубине 400-600 мкм от поверхности коры независимо от выбранного (левого или правого) полушария. Баррельная кора идентифицируется на срезах в виде компактных ячеистых структур, названных из-за своей формы бочонками или баррелями, стенки ячеек оптически более плотные, нежели середина. Результаты морфологического и иммуногистохимического исследования показали, что баррельную кору невозможно идентифицировать на тонких срезах, применяя стандартные гистологические методы, такие как окраска гематоксилином и эозином.

Изучение экспрессии основных нейроспецифичных антигенов позволило установить, что в стенках баррелей наблюдается повышенная по сравнению с центральной частью экспрессия белка синаптофизина, что позволяет после проведения иммуногистохимической реакции идентифицировать характерное сетчатое строение баррельной коры даже на срезах, толщина которых не превышает 4 мкм, чего ранее в литературе никем не отмечалось (рис. 4). Это свидетельствует о большем содержании синаптических везикул и, следовательно, химических синапсов в стенках баррелей.

Изучение серийных срезов баррельной коры после проведения иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к нейрофиламентам показало, что характерный ячеистый рисунок выявляется очень слабо, в отличие от реакции на синаптофизин. Наблюдаются небольшие колебания плотности, однако четко идентифицировать стенки и среднюю часть отдельных баррелей практически невозможно.

Рис. 4. Экспрессия синаптофизина в срезах баррельной коры неокортекса крыс.

Иммуногистохимическая реакция с первичными антителами к синалтофизину. Условные обозначения: ПК — просветы капилляров, звездочками обозначены менее интенсивно окрашенные полости бочонков, пунктирными линиями обведены границы бочонка. Увел. хЮО

Изучение срезов баррельной коры после проведения иммуногистохимической реакции с антителами против глиального фибриллярного кислого белка показало, что в центральной части каждого барреля располагается скопление астроцитов и их отростков, благодаря чему баррели легко идентифицировать. Выявленные в нашем исследовании особенности расположения этих глиальных клеток в баррельной коре свидетельствуют об особом значении астроглии для обеспечения структурно-функциональной организации колонок. Изучение экспрессии основного белка миелина показало, что этот антиген распределен в баррельной коре равномерно. На больших увеличениях визуализируются многочисленные окрашенные миелинизированные мелкие аксоны, срезанные в продольном и поперечном направлении. В целом распределение миелинизированных нервных волокон, по-видимому, относительно равномерно как в стенках, так и в центральной части бочонков.

Электронномикроскопическое исследование сииаптической организации баррельной коры и ультраструктурных особенностей электрических синапсов.

Проведенное электронномикроскопическое исследование синаптической организации отдельных бочонков корковых колонок показало, что как в стенке, так и в центральной части баррелей кроме типичных химических синапсов обнаруживаются электрические синапсы или щелевые контакты, как правило, между тонкими отростками, имеющими ультраструктуру мелких дендритов, шипиков, а иногда и аксонов.

Чаще всего электрические синапсы расположены рядом с химическими -аксошипшсооыми или шссодепдритическими. При этом, ссли щелевой контакт находится в плоскости среза, то щель химического синапса нередко не попадает в плоскость, что, по-видимому, связано с особенностями расположения этих контактов на дендритах. В отдельных случаях в отростках, формирующих электрические синапсы, обнаруживаются синаптические везикулы, и эти отростки, судя по всему, являются аксонами, нередко один из отростков можно идентифицировать как шипик или дендрит. Некоторые электрические синапсы сформированы теми же отростками, что и химические.

Как правило, химические и электрические синапсы расположены настолько близко, что наблюдается контакт пдазмалемм одного из отростков, формирующих электрический синапс, с отростком, являющимся постсинаптической или, гораздо реже, пресинаптической частью химического синапса, при этом обе синаптические щели могут находиться строго в плоскости среза, о чем свидетельствует ультраструктура их синаптической щели.

Все обнаруженные нами электрические синапсы были строго прямой формы, т.е. не имели кривизны, характерной для активной зоны химических синапсов. В зоне стенок бочонков встречаются щелевые контакты с подобием перфорации активной зоны. К особенностям электрических контактов стенок бочонков также можно отнести наличие двойных щелевых контактов, в центральной части баррелей они не встречались. Двойные щелевые контакты имеют характерное строение: это две активные зоны, которые всегда расположены под углом друг к другу, при этом такие контакты образованы не двумя, а тремя отростками. В месте перегиба активной зоны контакт прерывается, обе синаптические щели всегда находятся в плоскости среза. Практически все двойные щелевые контакты, которые нам удалось обнаружить, были локализованы в постсинаптической части химического синапса.

Анализ ультраструктуры двойных и одинарных щелевых контактов при большом увеличении показал, что контакт имеет семь слоев: это две трехслойные мембраны, между которыми имеется узкая электронно-прозрачная щель. Ширина синаптической щели составляет около 3 нанометров, в ней определяются электронно-плотные поперечные тяжи или скопления электронно-плотного материала в виде ячеек (рис. 5). На цитоплазматической стороне мембран, формирующих электрический синапс, также имеются небольшие скопления хлопьевидного электронно-плотного материала, «опушающего» контактирующие мембраны с обеих сторон. Все обнаруженные нами щелевые контакты имели одинаковую ультраструктуру, независимо от того, где они располагались и какие отростки (нервных или глиальных клеток) их образовывали. На телах нейронов щелевые контакты не обнаружены.

Рис. 5. Ультраструктура синаптической щели электрического синапса (указан стрелкой).

Увеличение х 131 500

Проведенное морфометрическое исследование показало, что обнаруженные нами щелевые контакты по своим основньм ультраструктурным параметрам соответствуют описанным в литературе. Ширина синаптической щели электрических синапсов колеблется от 2,9 до 4,4 нм и в среднем составляет 3,5 нм. В среднем площадь отростков, формирующих щелевые контакты, составила 0,7 мкм2. Достоверных различий в количественных характеристиках между электрическими синапсами центральной части баррелей и их стенок не обнаружено. Подсчет числа электрических и химических синапсов показал, что количество электрических синапсов составляет 7% от общего числа синаптических контактов в бочонке.

Для подробного изучения особенностей расположения электрических синапсов относительно химических синаптических контактов был проведен анализ серийных срезов баррельной коры. С этой целью были изготовлены несколько серий, состоящих из 6-12 последовательных срезов толщиной 50-60 нм, что позволяет проанализировать определенные ультраструктуры (в нашем случае - электрические и химические синапсы) в трехмерном пространстве. Такой анализ дает представление о расположении и строении исследуемых объектов в объеме. Всего на различных сериях просмотрено семь электрических синапсов. Анализ начинали с центрального среза каждой серии, на нем находили щелевой контакт, который потом исследовали и на других срезах серии. Серии получены как со стенок, так и с центральной части баррелей.

Проведенный анализ показал, что все электрические синапсы, включая те, которые на одиночных срезах не имеют связи с химическими синаптическими контактами, при анализе

их локализации в объеме на самом деле контактируют с одним или с обоими отростками, формирующими химический аксошипиковый или аксодендритический синапс. Причем хотя бы на одном из срезов серии можно наблюдать близкое расположение щелевого контакта и щели химического синапса. В некоторых случаях щелевой контакт расположен так, что находится в непосредственной близости от активной зоны химического синапса, в других случаях наблюдается только контакт плазмалемм отростков синапсов различного типа. Интересно, что в одной из анализированных серий срезов в объеме выявлено два аксошипиковых синапса на одном аксоне, которым соответствуют два различных по локализации щелевых контакта, из чего можно сделать заключение, что каждый щелевой контакт каким-то образом связан только с одной активной зоной химического синапса.

Таким образом, взаимное расположение химических и электрических синаптических контактов может говорить об их кооперированной деятельности, в частности, об осуществлении функции синхронизации ритмической активности. Электрические синапсы могут синхронизировать подпороговый сигнал, обеспечивая локальную синхронизацию, а многочисленные химические синапсы, в том числе перфорированные, могут осуществлять дистантную синхронизацию сигнала, достигшего порогового значения, итогом чего может быть появление первичного спайка. Благодаря взаимной кооперированной деятельности обоих типов синаптических контактов, осуществляющих синхронизацию ритмической активности, и возможно полноценное формирование веретена.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существующие гипотезы ритмогенеза веретенообразной активности выдвигают на роль генераторов ритма различные подкорковые и корковые структуры. В классических гипотезах центральную роль в ритмогенезе веретен отводят таламическим структурам, при этом кора является ведомой, вторично вовлекаемой в ритмическую активность (Нарикашвили, 1975; Буриков с соавт., 1985; Andersen, Eccles, 1962; Andersen, Andersson, 1968). В соответствии с другими гипотезами, не только таламус, но и целый ряд подкорковых структур может участвовать в процессе формирования ритма веретен (Могилевский, Романов, 1989; Сунцова, 2000; Sterman, Clemente, 1961 и др.). Имеются также работы, посвященные изучению способности неокортекса к самостоятельной осцилляторной активности (Серков с соавт., 1963; Дуринян, 1975; Кратин, Сотниченко, 1987; Lopes de Silva, 1978; Contreras et al., 1996; Fuentealba et al., 2004 и др.). Однако, несмотря на многочисленные гипотезы, не существует единой теории происхождения ритмической веретенообразной активности в головном мозге млекопитающих.

В наших экспериментах по отведению фокальной биоэлектрической активности из одного и нескольких бочонков баррельной коры были выявлены заметные отличия в характеристиках веретенообразной активности. Так, если в одном бочонке наблюдались высокоамплитудные продолжительные веретена, то в другом бочонке одновременно могли регистрироваться веретена меньшей амплитуды и длительности, позднее формирующиеся и раньше заканчивающиеся. Амплитуда внутриверетенных потенциалов могла по-разному варьироваться в разных бочонках. Подобные отношения наблюдались и в пределах таламических структур. Эти результаты не соответствуют гипотезе о наличии единого водителя ритма, локализованного либо в коре, либо в подкорковых структурах, и свидетельствуют о наличии независимого, автономного локального генератора веретен в отдельных бочонках.

Выявленные в настоящей работе щелевые контакты баррельной коры имели ультраструктуру типичных электрических синапсов, которые описаны в работах других авторов (Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003). Как показано в этих и других исследованиях, щелевые контакты, имеющие описанную специфическую ультраструктуру, могут выполнять роль специализированных межклеточных каналов коммуникации, в состав которых входят трансмембранные канальные белки коннексины, обеспечивающие электрическую связь между цитоплазмами соседних нейронов. Наличие электрических дендро-дендритических синапсов у звездчатых нейронов бочонков соматической коры крысы, выявленное в настоящем исследовании, согласуется с результатами исследований, выполненных рядом других авторов, преимущественно на переживающих срезах других отделов мозга крыс (Beierlein et al., 2000; Deans et al., 2001; Amitai et al., 2002; Connors, Long, 2004). В этих работах было установлено наличие электротонической связи между нейронами за счет электрических синапсов, что позволило предполагать их участие в синхронизации ритмической активности мозга, которая, однако, отсутствует при работе со срезами коры.

Установленный в наших экспериментах на целом мозге локальный характер ритмогенеза веретен, индивидуальный для каждой колонки, свидетельствует об участии электрических синапсов между дендритами звездчатых нейронов одного бочонка в электротонической синхронизации пейсмекерных гиперполяризационных потенциалов нейронов этого бочонка в начальной нарастающей фазе развития веретена, когда вследствие гиперполяризации мембраны еще отсутствуют импульсные разряды нейронов. Импульсная активность нейронов появляется только на вершине веретена за счет постгормозной активации низкопороговых кальциевых каналов, что показано при внутриклеточном исследовании веретенообразной активности (Timofeev et al., 2001) и наблюдалось нами при внеклеточной регистрации импульсной активности. Появление этой импульсной активности

на вершине веретена способствует не только локальной, как у электрических синапсов, но и более дистантной синхронизации веретенообразной активности между удаленными корковыми колонками за счет аксонных связей и химических синапсов, что и отмечалось в наших опытах.

Полученные нами в морфологической части работы результаты позволяют сделать вывод об особой синаптической организации баррельной коры, отражением которой является, в первую очередь, выявленная разница в плотности химических синапсов между стенками и центром отдельных бочонков. Установленное в настоящем исследовании при анализе серийных срезов близкое расположение и даже контакт химических и электрических синапсов, а также наличие этих синаптических контактов на одном отростке нервной клетки баррельной коры крыс также может говорить об их совместном участии в процессах синхронизации ритмической активности разных корковых колонок.

Ранее методом окрашивания по Гольджи был выявлен асимметричный характер ориентации дендритов звездчатых нейронов, направленный в полость соответствующего бочонка, причем у 85% клеток дендриты и их отростки не выходили за пределы соответствующего бочонка (Сухов, 1992). Позднее эти результаты были подтверждены и данными зарубежных исследований (Lubke et al., 2000). Для локального ритмогенеза это является важной особенностью структурной организации колонок нейронов, так как создает оптимальные предпосылки для формирования электрических дендро-дендритических синапсов нейронов одного бочонка. По-видимому, именно поэтому в работах на срезах мозга электротонические связи между парами внутриклеточно регистрируемых нейронов наблюдались на близких расстояниях между клетками, не превышавшими 200 мкм, что соответствует среднему размеру одного бочонка, выявленному в целом ряде работ (Beierlein et al., 2000; Amitai et al., 2002; Connors, Long, 2004).

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют в пользу наличия элементарного ансамбля тормозных интернейропов бочонка четвертого слоя соматической коры. По нашему мнению, такой ансамбль интернейронов участвует в механизмах генерации и развития веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс с ведущей ролью электротонической синхронизации эндогенной осцилляторной активности нейронов одного бочонка. Одну из главных ролей в локальной (внутри колонок) синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические дендро-дендритные синапсы, которые, по нашим данным, составляют около 7% от общего числа синаптических контактов в баррельной коре и расположены в непосредственной близости от химических синапсов. Электрические синапсы обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной осцилляторной активности нейронов одного

бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические синапсы не активизируются. Эти результаты свидетельствуют в пользу гипотезы об эндогенном происхождении веретенообразной активности внутри каждого отдельного бочонка.

ВЫВОДЫ

1. С использованием методов спектрального и корреляционного анализа фокальной электрической активности, регистрируемой одновременно в зонах представительства вибрисс в таламусе и соматической коре белых крыс, показано, что фоновая веретенообразная активность внутри баррелоидов и бочонков развивается относительно независимо. Полученные данные указывают на возможность индивидуального развития ритмической активности на уровне таламуса и соматической коры.

2. При одновременном отведении активности от бочонков разных рядов соматосенсорной коры обнаружена более высокая степень синхронизации фокальной веретенообразной активности в бочонках одного ряда, тогда как фазовые сдвиги колебаний, регистрируемых от бочонков разных рядов, могли достигать 180°. Полученные результаты указывают на важную роль синхронизации активности в структурно-функциональных группах нейронов соматической коры - бочонках.

3. Иммуногистохимическое исследование баррельной коры крыс показало, что в стенках баррелей наблюдается повышенная, по сравнению с центральной частью, экспрессия белка синаптофизина. Это свидетельствует о большем количестве в стенках баррелей химических синапсов и позволяет идентифицировать баррелъную кору даже на тонких срезах. В отдельных баррелях определяются группы астроцитов, что может указывать на структурно-функциональную неоднородность поля бочонков. При маркировании нейрофиламентов вьивлена интенсивная реакция как на телах, так и на отростках нейронов.

4. При ультраструктурном исследовании поля баррельной коры крыс обнаружены многочисленные щелевые контакты, имеющие ультраструктуру типичных электрических синапсов. Морфометрическое исследование показало, что электрические синапсы составляют около 7% от общего числа идентифицированных синапсов, они встречаются равновероятно в полости и в стенке бочонка и располагаются на отростках мелких дендритов, тогда как на телах клеток отсутствуют. На серийных элехроннограммах обнаружено, что в большинстве случаев щелевые контакты расположены в непосредственной близости и нередко контактируют с химическими синапсами.

5. Результаты проведенного комплексного исследования позволяют сформулировать

предположение о том, что локальную подпороговуто (до генерации импульсов) синхронизацию активности нейронов в пределах одного бочонка в период первых фаз веретена обеспечивают электрические синапсы, более поздние этапы синхронизации обеспечиваются химическими синапсами. Возрастание гиперполяризации мембраны нейронов с участием электрических синапсов приводит к активации калиевых и кальциевых Н-каналов, а этот процесс, в свою очередь, инициирует активацию химических синапсов и формирование полного цикла веретена. Существенный вклад в локальный эндогенный ритмогенез в отдельных баррелях соматической коры вносит пространственная близость электрических и химических синапсов.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Кириченко, Е.Ю. Роль электрических синапсов в электротонической синхронизации веретенообразной активности в корковых колонках / Е.Ю. Кириченко, А.К. Логвинов // Валеология. - 2008. - № 3. - С. 57-62 (0,375 п.л., личный вклад - 50%).

2. Кириченко, Е.Ю. Роль щелевых контактов в локальном ритмогенезе корковых колонок / Е.Ю. Кириченко, П.Е. Повилайтите, А.Г. Сухов // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 1. - С. 31-34 (0,25 п.л., личный вклад - 30%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

3. Kirichenko, E.Yu. The role of electrical synapses in the organization of spindle activity on the rat barrel cortex / E.Yu. Kirichenko, P.E. Povilaitite, A.G. Sukhov // Journal of Sleep Research. -2006. - V. 15. - P. 105 (0,025 пл., личный вклад - 30%).

4. Сухов, А.Г. Структурные предпосылки внурикорковой организации фокальной веретенообразной активности колонок соматосенсорной коры / А.Г. Сухов, П.Е. Повилайтите, Е.Ю. Кириченко // Морфология (спец. вып.). - 2006. - С. 103 (0,025 п.л., личный вклад - 30%).

5. Кириченко, Е.Ю. К вопросу о механизмах генерации и синхронизации веретенообразной активности / Е.Ю. Кириченко // Материалы конференции «Биология XXI века» (Москва, Россия, 2006). - М., 2006. - С. 23-24 (0,125 пл., личный вклад - 100%).

6. Кириченко, Е.Ю. Возможная роль электрических синапсов в ритмической активности соматической коры крысы / Е.Ю. Кириченко // Материалы конференции «Ломоносов - 2006» (Москва, Россия, 2006). - М., 2006. - С. 90 (0,025 п.л., личный вклад -100%).

7. Кириченко, Е.Ю. Иммуногистохимичеекое исследование баррельной коры крыс / Е.Ю. Кириченко // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 291-295 (0,312 п.л., личный вклад - 100%).

8. Кириченко, Е.Ю. Ультраструктурное исследование электрических синапсов баррельной коры крысы / Е.Ю. Кириченко II Материалы конференции «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 37 (0,0625 п.л., личный вклад - 100%).

9. Кириченко, Е.Ю. Ультраструктурное и иммуногистохимичеекое исследование синаптоархитектоники баррельной коры крысы / Е.Ю. Кириченко, А.Г. Сухов, П.Е. Повилайтите // Материалы Третьего Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2007). - Судак, 2007. -С. 64-65 (0,025 п.л,, личный вклад - 30%).

10. Кириченко, Е.Ю. Морфофункциональное исследование электрических синапсов баррельной коры головного мозга крыс / Е.Ю. Кириченко, П.Е. Повилайтите // Материалы Конгресса Общества физиологов (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 115 (0,025 п.л., личный вклад - 50%).

11. Kirichenko, Е. Yu. Role of gap junctions in local rhythmogenesis in cortical columns / E.Yu. Kirichenko, P.E. Povilaitite. A.G. Sukhov // Neuroscience and Behavioral Physiology. -2008. - V. 39, № 2. - P. 199-202 (0,25 п.л., личный вклад - 30%).

Список сокращений

ЭЭГ - электроэнцефалограмма

ЦНС - центральная нервная система

Н-каналы - каналы, активируемые на гиперполяризацию

М - молярность

Работа под держана грантом РФФИ № 07-04-00424 и грантом Минобразования № 2.1.1/1129

Сдано в набор 14.04.09 г. Подписано в печать 14.04.09 г. Заказ № 94. Тираж 100 экз. Формат 60*84 1/ 16. Печ. лист. 1,0. Усл. печ. л. 1,0. Копировально-множительный отдел НИЧ Южного федерального университета 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, тел (863) 263-82-91.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кириченко, Евгения Юрьевна

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о механизмах формирования ритмической активности.

1.2. Структурно-функциональная характеристика электрических синапсов.

1.3. Организация бочонков на уровне четвертого слоя колонок соматической коры крыс.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Постановка экспериментов.

2.2. Электрофизиологические методы исследования.

2.3. Морфологические методы исследования.

2.4. Методы анализа полученных данных.

2.4.1. Методы анализа биоэлектрической активности.

2.4.2. Морфометрические методы исследования и анализ ультраструктуры синапсов на серийных срезах.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Пространственно-временная характеристика таламокортикальной и корково-корковой веретенообразной активности.

3.1.1. Организация веретенообразной активности в коре и таламусе.

3.1.2. Пространственно-временная организация веретенообразной активности в баррельной коре.

3.2. Макро и микроскопическая организация баррельной коры и экспрессии основных антигенов, специфичных для нервной ткани.

3.3. Электронномикроскопическое исследование синаптической организации баррельной коры и ультраструктурных особенностей электрических синапсов.

3.4. Морфометрический анализ электрических синапсов баррельной коры крыс.

3.5. Исследование электрических и химических синапсов на серийных ультратонких срезах.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Список сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное исследование механизмов организации веретенообразной активности нейронов бочонка соматической коры крысы"

Актуальность исследования

Одним из важнейших свойств ансамблей нейронов головного мозга является ритмическая активность. Функциональное состояние организма отражается в смене частотных диапазонов ритмов ЭЭГ. Так, дельта- ритм наблюдается в состоянии глубокого сна, а альфа-ритм характерен для спокойного и дремотного состояний (Коган, 1969; Нарикашвили и соавт., 1965; Супин, 1970; Вербицкий, 1980; Буриков, 1985; Ковальзон, 1993; Сухов, 1995). Дельта и альфа ритмы возникают при относительном балансе между тормозными и возбуждающими процессами в коре (Гусельников, 1976; Шевелев,И. А. с соавт., 2001; Шевелев И. А. с соавт., 1991). Ритмы тета-диапазона усиливаются в состоянии активного бодрствования при выработке рефлексов у животных (Котляр, 1977; Шульгина, 1978; Кураев, 1982; Кирой, 1998). По данным ряда авторов, тета ритм также участвует в механизмах квантования сенсорного потока (Гусельников, Супин, 1968; Гусельников, Изнак, 1983; Шульгина, 1978; Симонов, 1979; Данилова, 1985; Сухов, 1995). Таким образом, по мнению многих авторов, ритмы ЭЭГ играют важнейшую роль в механизмах восприятия, обработки и передачи информации в мозге.

Наличие локального автономного ритма было показано при анализе особенностей пространственно-временной организации фокальной фоновой активности в колонках соматической коры крысы в зоне проекции вибрисс (Сухов, 1995; Бездудная, 2000). Ведущими в развитии локальной веретенообразной активности корковых колонок являются не повторные залпы таламокортикальной синаптической активации, а эндогенные, внутрикорковые волны пейсмекерной гиперполяризации, обусловленные активацией потенциалзависимых калиевых, натриевых, кальциевых Н-каналов (McCormick, Pape, 1990; Pape, 1996; Santoro et. al., 2000). Вместе с тем, в ряде экспериментов по внутриклеточной и внеклеточной микроэлектродной регистрации ритмической активности показано, что в начальной стадии развития веретен импульсная активность нейронов отсутствует вследствие доминирования процессов гиперполяризации. Эгн результаты исключают участие химических синапгических контактов в процессе синхронизации осцилляторной активности нейронов (Сухов, Сердюк, Коняхина, 2007; Timofeev et. al., 2001). В этой связи, возникает вопрос относительно механизма синхронизации осцилляторной активности пейсмекерных Н-каналов разных нейронов в начальной стадии веречена. По современным данным, важную роль в электротонической синхронизации этих каналов, активируемых при гиперполяризации мембраны отдельных нейронов одной колонки, могут играть электрические дендро-дендритические синапсы, выявленные в локальных системах тормозных нейронов в разных отделах мозга млекопитающих, в том числе в сенсомоторной коре крыс (Deans et. al., 2001; Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003; Connors, Long, 2004; Gibson et. al. 1999, 2005). Однако до настоящего времени структурные особенности и механизмы функционирования электрических синапсов, их распределение и роль в центральной нервной системе остаются мало изученными. В частности, несмотря на то, что электрические синапсы были описаны повсеместно в коре и подкорковых структурах мозга млекопитающих, нами не обнаружено сведений о количественном соотношении электрических и химических контактов в бочонках на уровне 4 слоя соматической коры, а также сопоставления этих данных с особенностями веретенообразной активности в этих структурах.

Целью настоящей работы являлось изучение основных структурно-функциональных закономерностей организации бочонков и возможных механизмов синхронизации фокальной веретенообразной активности в колонках (баррелях) соматической коры крысы.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1) Изучить особенности пространственно-временной организации фокальной веретенообразной активности в морфофункциопальпых группировках нейронов четвертого слоя соматической коры крыс — в поле бочонков и в соответствующих баррелоидах таламуса. Исследовать особенности процессов синхронизации фоновой фокальной веретенообразной активности нейронов, отводимой от бочонков одного и разных рядов.

2) Провести электронномикроскопическое исследование функционально идентифицированных при микроэлектродной регистрации бочонков соматической коры крыс с целью определения ультрасгруктурных характеристик электрических и химических синапсов в бочонках баррельпой коры крыс. Провести ультраструктурное исследование особенностей взаимного пространственного расположения электрических и химических синапсов на серийных срезах.

3) Выполнить иммуногистохимическое исследование экспрессии антигенов к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глпальному фибриллярному кислому белку (Synaptophysin, Myelin Basic Protein, Glial Fibrillar Protein, Neurofilament), которые позволяют выявить особенности пространственного распределения химических синапсов, глиальных клеток и аксонов нейронов в баррельной коре крыс.

4) Сформулировать теоретически и экспериментально обоснованную гипотезу о роли электрических и химических синапсов в локальной эндогенной генерации разных фаз веретенообразной активности в корковых бочонках с использованием собственных и литературных данных.

Научная новизна работы: 1) Разработан новый метод комплексного электрофизиологнческого, электронномикроскопического и иммуногистохимического исследования функционально и морфологически идентифицированных бочонков баррельной коры.

2) Впервые проведено иммуногистохимическое исследование баррельной коры с использованием антител к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку, которое позволило обнаружить некоторые особенности структурной организации бочонков с помощью реакции «антиген — антитело».

3) Получены оригинальные данные об особенностях пространственно-временной организации веретенообразной активности в разных бочонках баррельной коры, идентифицированных функционально но представительству вибрисс. Показано, что медленная электрическая активность в гомологичных зонах представительства вибрисс коры и галамуса формируется более или менее независимо.

4) Впервые проведено исследование электрических синапсов на серийных срезах бочонков баррельной коры, оценена частота встречаемости электрических и химических синапсов и их взаимное пространственное расположение.

5) Сформулирована новая гипотеза о роли электрических и химических синапсов в локальном ритмогенезе в бочонках баррельной коры на разных фазах развития веретенообразной активности. Предполагается, что электрические синапсы обусловливают локальную (внутри одного бочонка) электротоническую синхронизацию начальных фаз формирования веретена, в то время как химические синапсы вносят основной вклад в дистантную синхронизацию активности различных корковых бочонков.

Научно-практическая значимость работы.

На основании полученных результатов сформулирована гипотеза, согласно которой в качестве водителя ритма веретенообразной активности баррельной коры могут выступать пейсмекерные Н-каналы гиперполяризации. Синхронизацию начальной подпороговой активности пейсмекерных Н-каналов в отдельном-бочонке могут обеспечивать щелевые контакты или электрические синапсы. В дальнейшем, когда ритмические потенциалы достигают порога импульсной активности, в процесс синхронизации ритма в разных бочонках включаются химические сипапсы.

Полученные результаты и разработанные методы комплексного морфофункционального исследования могут быть использованы как студентами и аспирантами-физиологами, так и морфологами при исследовании механизмов синхронизации и структурной организации баррельной коры крыс, а также для подробного изучения ультраструкгуры электрических и химических синаптических контактов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1)В пределах таламокортикальной системы крыс в гомологичных зонах представительства вибрисс наблюдается относительно независимое формирование медленной электрической активности в коре и таламусе.

2)Генерация веретенообразной- активности имеет локальный эндогенный характер в каждом бочонке баррельной коры крыс без закономерного разделения соседних бочонков на ведущие или ведомые, без фиксированной последовательности их вовлечениям ритмогенез.

3)Бочонки баррельной коры имеют особую клеточную п синаптическую организацию, а ультраструктура, количество и локализация электрических синапсов в баррелях позволяет рассматривать их как структуры, обеспечивающие электротонический этап синхронизации локального эндогенного ритмогенеза.

4)Ведущую роль в локальной внутриколончатой синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические дендро-дендритические синапсы, которые обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной активности нейронов одного бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические сипапсы не активизированы.

5)Предложена новая гипотеза о механизме развития начальных фаз веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс, в которой ведущая роль отводится электротонической синхронизации активности нейронов одного бочонка и формированию элементарного ансамбля тормозных нейронов, объединенных электрическими дендро-дендритическими синапсами. Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2006» (Москва, Россия, 2006), на 10-й Школе-конференции молодых ученых «Биология XXI века» (Пущино, Россия, 2006), на 5-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские Ч1ения -2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), на 18-м Конгрессе ESRS (Европейское общество изучения сна) (Инсбрук, Австрия, 2006), на XX Конгрессе Общества физиологов имени Павлова (Москва, Россия, 2007), па Третьем Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007), на Научно-практической школе по конфокальной и флуоресцентной микроскопии «Горизонты современной микроскопии» (Leica) (Пущинский научный центр РАН, Россия,

2007), а также на конференции «Структурно-функциональные нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (отдел исследования мозга ГУ НИИ неврологии РАМН) (2007), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Функциональное состояние и здоровье человека» (Ростов-на-Дону, ЮФУ,

2008), на заседании ученого совета НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ.

Публикации.

По теме диссертации было опубликовано 11 печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и одна статья в журнале Neuroscience and Behavioral Physiology, общим объемом 1,524 пл. личный вклад автора — 62,5%.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 151 страницах машинописного тексча.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кириченко, Евгения Юрьевна

ВЫВОДЫ:

1. С использованием методов спектрального и корреляционного анализа фокальной электрической активности, регистрируемой одновременно в зонах представительства вибрисс в таламусе и соматической коре белых крыс, показано, что фоновая веретенообразная активность внутри баррелоидов и бочонков развивается относительно независимо. Полученные данные указывают на возможность индивидуального развития ритмической активности на уровне таламуса и соматической коры.

2. При одновременном отведении активности от бочонков разных рядов соматосенсорной коры обнаружена более высокая степень синхронизации фокальной веретенообразной активности в бочонках одного ряда, тогда как фазовые сдвиги колебаний, регистрируемых от бочонков разных рядов, могли достигать 180°. Полученные результаты указывают па важную роль синхронизации активности в структурно-функциональных группах нейронов соматической коры — бочонках.

3. Иммуногистохимическое исследование баррельной коры крыс показало, что в стенках баррелей наблюдается повышенная, по сравнению с центральной частью, экспрессия белка синаптофизина. Это свидетельствует о большем количестве в стенках баррелей химических синапсов и позволяет идентифицировать баррельную кору даже на тонких срезах. В отдельных баррелях определяются группы астроцитов, что может указывать на структурно-функциональную неоднородность поля бочонков. При маркировании нейрофиламентов выявлена интенсивная реакция как на телах, так и на отростках нейронов.

4. При ультраструктурном исследовании поля баррельной коры крыс обнаружены многочисленные щелевые контакты, имеющие ультраструктуру типичных электрических синапсов. Морфометрическое исследование показало, что электрические синапсы составляют около 7% от общего числа идентифицированных синапсов, они встречаются равновероятно в полости и в стенке бочонка и располагаются на отростках мелких дендритов, тогда как на телах клеток отсутствуют. На серийных элекроннограммах обнаружено, что в большинстве случаев щелевые контакты расположены в непосредственной близости и нередко контактируют с химическими синапсами.

5. Результаты проведенного комплексного исследования позволяют сформулировать предположение о том, что локальную подпороговую (до генерации импульсов) синхронизацию активности нейронов в пределах одного бочонка в период первых фаз веретена обеспечивают электрические синапсы, более поздние этапы синхронизации обеспечиваются химическими синапсами. Возрастание гиперполяризации мембраны нейронов с участием электрических синапсов приводит к активации калиевых и кальциевых Н-каналов, а этот процесс, в свою очередь, инициирует активацию химических синапсов и формирование полного цикла веретена. Существенный вклад в локальный эндогенный ритмогенез в отдельных баррелях соматической коры вносит пространственная близость электрических и химических синапсов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириченко, Евгения Юрьевна, Ростов-на-Дону

1. Автандилов Г. Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии.-М.: Медицина, 1996.-256 с.

2. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия: Руководство. М.: Медицина, 1990.-384 с.

3. Айрапетян А. А., Костанян Э.Г., Жарская В. Д. Электрофизиологическое и нейроанатомическое исследование неспецифических таламо-кортикальных связей // Биол. Журн. Армении.- 1982.- Т. 35, № в.- С. 466-472

4. Ашмарин И. П., Стукалова П. В. Нейрохимия, учебник для биологических и медицинских вузов, 1996.- 470 с.

5. Бездудная Т. Г. Организация фоновой и вызванной фокальной активности в колонках соматической коры крысы в разных функциональных состояниях: Дис. на соискание ученой степени кандидата биолог, наук.- Ростов-на-Дону, 2000.-124 с.

6. Беркинблит М. Б., Чайлахян Л. М. Общая физиология нервной системы.-Л.: Наука, 1979.- С. 398-441

7. Боровиков В. 81аЙ81лса: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов./СПб. Литер, 2001ю-655с.

8. Брагина Т. М. К пространственно временной организации таламического уровня сенсомоторного анализатора крысы: Днпл. работа: РГУ.-1976

9. Буриков А. А. Организация неспецифической таламо-кортикальной системы во сне и бодрствовании: Автореф. дис. на соискание ученой степени д-ра биолог. наук.-Л., 1985.- 44 с.

10. Буриков А. А., Вербицкий Е. В., Фельдман Г. Л. Пространственно-временная организация веретен ЭКоГ при развитии сна // Жур. высш. нервн. деят.- 1980,- Т. 30, №6.- С. 1237-1250

11. Вербицкий Е. В. Исследование организации таламо кортикальной системы по показателям веретенообразной активности в процессе развития медленноволнового сна: Автореф. дис. на соискание ученой степени кандидата биолог, наук.- Ростов-на-Дону, 1980.-23 с.

12. Волошин М. Я. Нейронная организация и функциональные связи ретикулярного и вентрального переднего ядер таламуса: Авторефер. дис. доктора мед. наук.:Киев.- 1981

13. Глебов Р. Н., Крыжановский Г. Н. Функциональная биохимия синапсов. М.: Медицина, 1978.-328 с.

14. Гусельников В. И. Электрофизиология головного мозга (курс лекций): Учеб. пособие для биолог, специальностей ун-тов. М.:«Высш. школа», 1976.-424 с.

15. Гусельников В. И., Изнак А. Р. Ритмическая активность в сенсорных системах.-М.: МГУ, 1983.-215 с.

16. Гусельников В. И., Супин А. Я. Ритмическая активность головного мозга.-М.: МГУ, 1968.-253 с.

17. Данилова Н. Н. Функциоанльные состояния: механизмы и диагностика.- М.: Наука, 1985.-е.

18. Дуринян P.A. Корковый контроль неспецифических систем мозга. М.: Медицина, 1975. - 203 с.

19. Зефиров А. JI. Везикулярная гипотеза освобождения медиатора в синапсе // Статьи Соросовского Образовательного журнала.- 2000

20. Камкин А. Г., Киселева И. С., Кирищук С. П., Лозинский И. Т. Потенциал-управляемые кальциевые каналы (Часть 1)// Успехи физиол. наук.-2006.-Т. 37, №4.-С. 3-33

21. Камкин А. Г., Киселева И. С., Кирищук С. И., Лозинский И. Т. Потенциал-управляемые кальциевые каналы (Часть II)// Успехи физиол. наук.-2007.-Т. 38,№1.-С. 14-38

22. Кирой В. Н.Электроэнцефалография.Ростов-на-Дону.-1998.-239 с.

23. Ковальзон В.М. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии.-1993.-Т.29, № 5-6.-С.627-634

24. Коган А. Б., Косицкий Г.И., Кураев Г. А., Чораяп О. Г.Физиология человека и животных: учебник для студентов ун-ов по спец. «Биология» в 2 ч.: М., Высш. шк, 1984, ч. II, 288 с.

25. Коган А. Б., Сухов А. Г. О нейронной организации центральных механизмов рефлексов с вибрисс// Физиол. Журн. СССР.- 1977.- Т. 63,№2.- С. 224-231

26. Коган А.Б. Электрофизиология. -М:Высш.школа. -1969. 368 с.

27. Копаладзе P.A. Регламентация экспериментов на животных -этика, законодательства, альтернативы // Успехи физиол. наук,- 1998.-Т 29,№ 4.-С. 74-91

28. Котляр Е. И. Механизмы формирования временной связи.-М.: МГУ, 1977.-208 с.

29. Кратин Ю.Г., Сотниченко Т.С. Неспецифические системы мозга.-Л.: Наука, 1987.-159 с.

30. Криволапое Ю.А., Леенман Е.Е. Морфологическая диагностика лимфом.//СПб. «Коста», 2006.- 2008 с.

31. Кураев Г. А. Функциональная ассиметрия коры мозга и обучение.-Ростов-на-Дону: РГУ, 1982.- 160 с.

32. Лапенко Т.К., Подладчикова О. Н. Изучение методом ретроградного аксонного транспорта ПХ внутрикорковых связей между группами нейронов «бочонками» в соматической области коры мозга крысы // Нейрофизиология.-1983.-Т. 15, №1.-С. 22-26

33. Леонтович Т. А. Нейронная организация подкорковых образований переднего мозга.-М:Мир, 1978

34. Ливанов М. Н., Свидерская Н. Е. Психологические аспекты феномена пространственной синхронизации потенциалов // Психол. журн,- 1984.- Т. 5, №5.- 71-83 с.

35. Лиманский Ю. П. Структура и функции системы тройничного нерва.- Киев, 1976.- 225 с.

36. Маунткасл В. Организующий принцип функции мозга -элементарный модуль и распределенная система. М.: Мир, 1981.-67 с.

37. Менджерицкий A.M., Михалева И.И., Мационис А.Э., Повилайтите П.Е. Дельта-сон индуцирующий пептид как модулятор ультраструктуры синапсов. //Морфология, 1994.-t.106.-4-6.-C. 55-63.

38. Могилевский А.Я., Романов Д.А. Гипоталамус: активация мозга и сенсорные процессы. — Киев.: Наука, 1989. — 216 с.

39. Моянова С. Г. Участие релейных ядер таламуса в генезе барбитуровой веретенообразной активности// Журн. высш. нервн. деят,- 1977.- Т. 27,№5.- С. 957-964

40. Нарикашвили С. П., Мониава Э. С., Арутюнов В. С. Происхождение периодических колебаний амплитуды корковых медленных потенциалов// Физиол. жур. СССР им. И. М. Сеченова. -1965.- T.L1, №1.-С.9-18

41. Нарикашвили С.П. Некоторые данные и соображения о таламокортикальной реверберации импульсов // Нейрофизиология. -1975b.-Т.7, №4. С.339-344.

42. Нарикашвили С.П. Таламокортикальные отношения при спонтанной и вызванной ритмической активности головного мозга // Журн. высш. нервн. деят. 1975а. - Т.25, №3. - С.562-567.

43. Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу.- 2003 г.

44. Повилайтите П.Е. Пластичность перфорированных синаптических контактов поля CAI гиппокампа в динамике ЬТР//Материалы 18 Съезда Физиологов России, Казань, 2001 .-с.45

45. Повилайтите П.Е. Ультраструктурные основы пластичное гп синаптических контактов сенсомоторной коры и гиппокампа.//

46. Проблемы нейрокибернетики (Материалы юбилейной международной конференции), Ростов-на-Дону, 2002.-с.274-275

47. Самосудов Н.В., Реутов В.П., Ларионов Н.П., Чайхалян Л.М. Нейро-глиальные контакты, образующиеся в мозжечке при электрической стимуляции в присутствии N0—генерирующего соединения.//Морфология, 2006.-Т.131, №2-с.53-58

48. Серков Ф.Н., Казаков В.Н. Нейрофизиология таламуса,- Киев: Наукова думка, 1980.-260 с.

49. Серков Ф.Н., Макулькин Р.Ф., Русеев В.В. Электрическая активность коры мозга изолированного полушария // Физиол. жури. СССР. 1963. - Т.49, №2. -С.149-157.

50. Симонов П. В. Тета-ритм и механизм квантования извлекаемых из памяти энтграмм// Память и следовые процессы.- Пущино, ,1979Ь

51. Сунцова Н. В. Переднемозговые механизмы развития сна // Автореферат диссертации на соискание степени доктора биологических наук.- Ростов-на-Дону.-2000, 36 с.

52. Сунцова II. В., Буриков А. А. Прямое активирующее влияние латеральной преоптической области гипоталамуса на синхронизирующую систему таламуса// Журн. высш. нервн. деят.-1996.- Т. 46, №2.- С. 328-334

53. Супин А.Я. Электрофизиологический анализ взаимодействия синаптических систем в коре головного мозга // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 1970.

54. Сухов А. Г. Нейронная организация тактильного анализатора крысы//Ростов-на-Дону, Издательство РГУ, 1992, 101 с.

55. Сухов А. Г., Лапенко Т. К. Конвергенция проекций различных таламических ядер к колонкам сомато-сенсорной коры крысы// Нейрофизиология.- 1989.- Т. 21,№2.- С. 168-174

56. Сухов А. Г., Лапенко Т. К. Роль афферентных входов в морфо-функцнональной организации нейронов IV слоя соматосенсорной коры // В сб.: Локализация и организация церебральных функций.-М.: Институт мозга, 1978.-С. 158-159

57. Сухов А. Г., Сердюк Т. С., Коняхина J1. А. Внутрикорковый механизм генерации веретенообразной активности в колонках соматической коры крысы //Вестник южного научного центра РАН.-2007.-Т. 3,№2.- С. 86-94

58. Сухов А.Г. Структурно- функциональная организация колонок нейронов тактильного анализатора крысы в зоне проекции вибрисс: Автореф. дис. на соискание ученой степени д-ра биолог, наук.- Ростов-на-Дону, 1995,.- 44 с.

59. Толкунов Б.Ф. Стриатум и сенсорная специализация нейронной сети .-Л.: Наука, 1978. 176 с.

60. Шевелев И.А., Барк Е.Д., Верхлютов В.М. (2001) Альфа-сканирование зрительной коры: данные ЭЭГ и магнитно-резонансной томографии. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 87(8): 1050-1059.

61. Шевелев И.А., Каменкович В.М., Костелянц Н.Б., Шараев Г.А. Опознание изображений на разном расстоянии от центра взора в зависимости от фазы альфа-волны ЭЭГ // Сенсорные системы.- 1988.-Т.2, №4. С.368.

62. Шевелев И.А., Костелянсц Н.Б., Каменкович В.М., Шараев Г.А. Опознание движений и альфа-волна ЭЭГ. // Сенсорные системы. 1991. - Т.5, №3.- 54-59 с.

63. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека, Москва: «Мир».- 1996.-Т.1

64. Шульгина Г. И. Биоэлектрическая активность головного мозга и условный рефлекс.- М.: Наука, 1978.-231 с.

65. Alexander S. P. H., Mathie A., Peters J. A., Guide to Receptors and Channels (GRAC), 3rd edition. British Journal of Pharmacology.- 2008.1532, Sl-209 P.

66. Alloway K.D., Crist J., Mutic J.J., Roy S.A. Corticostriatal projections from rat barrel cortex have an anisotropic organization that correlates with vibrissal whisking behavior//J.Neorosci.- 1999. -V.19, №24. -P. 1090810922.

67. Altevogt B.M., Paul D.L. Four classes of intercellular channels between glial cells in the CNS// J. Neurosci.-2004 .- V.24, №18.-P.4313-4323

68. Amitai Y., Gibson J., Beierlein M., Patrick S., Ho A., Connors B. The Spatial Dimensions of Electrically Coupted Networks of Intemeurons in the Neocortex // J. Neurosci., 2002, 22(10), 4142-4152

69. Andersen P., Andersson S.A. Physiological basis the alpha rhythm// N.Y.:Applton-Century-Crofts. -1968, 235 p.

70. Andersen P., Eccles J. C. Inhibitory phasing of neuronal discharge// Nature.-1962,-V. 196.-P. 645-647

71. Anderson J.M., Lowe J. Histometry and image analysis// in: Theory and practice of histological techniques, (eds. Bancroft JD, Stevens A.), Churchill livingstone, New York.- 1990,- P. 597-618.

72. Asada Y., Pappas G.D., Bannett M.V.L. Alteration of resistance at an electrotonic junction and morphological correlates // Fed.Proc.-l 967.-V.26, №2.-P. 330

73. Bader C. R., Bertrand D. Effect of changes in intra- and extracellular sodium on the inward (anomalous) rectification in salamander photoreceptors // J. Physiol. (Lond.).- 1984.- V. 347.- P. 611-631

74. Beamont V., Zucker R. S. Enhancement of synaptic transmission by cyclic AMP modulation of presynaptic Ih channels // Nat. Neurosci.-2000.-V.3.-P. 133-141

75. Beierlein M., Gibson J., Connors B. A Network of Electrically Coupled Interneurons Drives Synchronized Inhibition in Neocortex. // Nature Neuroscience, 2000, V.3, №9,904-910 P.

76. Bennett M. V. Gap junctions as electrical synapses // J. Neurocytol.-1997.-V.26.- P.349-366

77. Bennett M. V., Zukin R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain // Neuron .-2004.- V. 41.- P. 495511

78. Bhat M.A. Molecular organization of axo-glial junction.//Curr. Opin. Neurobiol., 2003.-13.-5.-552-559 P.

79. Bozzola J. J., Russel L. D. Electron Microscopy: principles and techniques for biologists.- Boston: Jones and Bastlett Publishers.- 1992.- 542 P

80. Brivanlou I.H., Warland D. K., Meister M., Mechanisms of concerted firing among retinal ganglion cells // Neuron.-1998.-V.-20.-P. 527-539

81. Brodin A., Fontana A., Borjesson L., Carini G., Torell L. M. Low-Energy Modes in Phosphate Glasses: A Comparison with the Soft Potential// Model Phys. Rev. Lett.- 1994.-.73.- P.2067 2070

82. Carverley R. K. S., Jones D. G., Determination of numerical density of perforated and nonperforated synapses// Methods in Neuroscience.-1990.-V. 3.- P. 155-171

83. Cauli B., Porter J.T., Tsuzuki K., Lambolez B., Rossier J., Quenet B., Audinat E. Classification of fusiform neocortical interneurons based onunsupervised clustering // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000.- V. 97.- P. 6144-6149

84. Chu Z., Galarreta M., Hestrin S. Synaptic interactions of late-spiking neocortical neurons in layer 1 // J. Neurosci.- 2003.- Vol.23.- P.96-102

85. Condorelli D.F., Belluardo N., Trovato-Salinaro A., Mudo G. Expression of Cx36 in mammalian neurons // Brain Res. Brain Res. Rev.-2000.- № 32.-P.72-85

86. Connors B. W., Long M. A. Electrical synapses in the mammalian brain// Annu. Rev. Neurosci.-2004.- V. 27.-P.393-418

87. Contreras D., Destexhe A., Sejnowski T.J., Steriade M. Control of spatiotemporal coherence of a thalamic oscillation by corticothalamic feedback// Science. -1996. -V.274. -P.771-774.

88. Deans M., Gibson J., Sellitto C., Connors B., Paul D., Synchronization activity of inhibitory networks in neocortex requires electrical synapses containing connexin 36. // Neuron.-2001.- V.31,- P.477-485

89. Deans M.R., Volgyi B., Goodenough D.A., Bloomfield S.A., Paul D.L. Connexin36 is essential for transmission of rod-mediated visual signals in the mammalian retina // Neuron.- 2002.- Vol.36.- P.703-712

90. Detzer K. Course and distribution of apical dendrites of layer V pyramids in the barrel field and area parietalis of the mouse//Anat. Embrioi., 1976.- №149.-p.251-258.

91. DeVries S. H., Schwartz E. A. Modulation of an electrical synapse between solitary pairs of catfish horizontal cells by dopamine and second messengers//J Physiol.-1989.-V. 414.-P. 351-375

92. DiFrancesco D., Pacemaker mechanisms in cardiac tissue // Annu. Rev. Physiol.-1993.- V.55.- P. 455-472.

93. Dityatev A.E., Clamann H.P. Reliability of spike propagation in arborizations of dorsal root fibers studied by analysis of postsynaptic potentials mediated by electrotonic coupling in the frog spinal cord // J Neurophysiol.-1996.-V.76, №5.-P.3451 -3459

94. Draguhn A., Traub R.D., Schmitz D., Jefferys J.G. Electrical coupling underlies highfrequency oscillations in the hippocampus in vitro // Nature.-1998.-Vol.394.-P. 189-192

95. Eng L.F., Ghirnikar R.S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-therty-one years (1969-2000).// Neurochem Res, 200.-25.-p. 14391451

96. Evans W. H., Martin P. E. M. Gap junctions: structure and function // Mol. Memb. Biol.- 2002,- V. 19.- P. 121-136

97. Fanselow E. E., Richardson K. A., Connors B. W. Selective, State-Dependent Activation of Somatostatin-Expressing Inhibitory Interneurons in Mouse Neocortex //J Neurophysiol.- 2008.-V. 100.-P. 2640-2652

98. Fellin T., Carmignoto G. Neurone-astrocyte signaling in the brain represents a distinct multifunctional unit.//J. Physiol., 2004.-559.-1 .-p.3-15

99. Fletcher G. H., Chiappinelli V. A. An inward rectifier is present in presynaptic nerve terminals in the chick ciliary ganglion // Brain Res.-1992.-V. 575.-P. 103-112

100. Fuentealba P., Timofeev I., Steriade M. From The Cover: Prolonged hyperpolarizing potentials precede spindle oscillations in the thalamic reticular nucleus// PNAS.- 2004.- V. 101, № 26.- P. 9816-9821.

101. Fukuda T., Kosaka T. Ultrastructural study of gap junctions between dendrites of parvalbumin-containing GABAergic neurons in various neocortical areas of the adult rat // Neuroscience.- 2003.-V. 120.- P. 5-20

102. Galarreta M., Hestrin S. Electrical and chemical synapses among parvalbumin fastspiking GABAergic interneurons in adult mouse neocortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002,- №99.- P. 12438-12443

103. Galarreta M., Hestrin S. Electrical and chemical synapses among parvalbumin fast-spiking GABAergic interneurons in adult mouse neocortex // PNAS.- 2002.- V. 99, №19.- P. 12438-12443

104. Galarreta M., Hestrin S. Electrical synapses betweenGABA-releasing interneurons // Nat. Rev. Neurosci.- 2001a.- №2.-P.425-433

105. Galarreta M., Hestrin S. Spike transmission and synchrony detection in networks // Annu. Rev. Neurosci.- 2001b.- №27.- P. 393-418.

106. Galarreta M., Hestrin S.A. network of fastspiking cells in the neocortex connected by electrical synapses // Nature.- 1999.- №402.-P.72-75

107. Gatter K.C., Sloper J.J., Powell T.P. The intrinsic connections of the cortex of area 4 of the monkey// Brain.-1978.-V.101, №3.-P.513-541

108. Genoud Ch., G.W. Knott, K. Sakata, B.Lu, E. Welker. Altered synapse formation in the adult somatosensory cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor heterozygote mice.//J. Neurosci., 2004.-24.-10.-p.2394-2400

109. Gibson J. R., Beierlein M., Connors B. W. Functional properties of electrical synapses between inhibitory interneurons of neocortical layer 4 // J. Neurophysiol.- 2005.- V. 93.-P. 467-480

110. Gibson J.R., Beierlein M., Connors B.W. Two networks of electrically coupled inhibitory neurons in neocortex // Nature.- 1999.- №402.- P.75-79

111. Gupta A., Wang Y., Markram H. Organizing principles for a diversity of GABAergic interneurons and synapses in the neocortex // Science.-2000.-V. 287.- P.273-278

112. Gyello A.C. (Ed). Immunohistochemistry (IJ).//IBRO handbook series, 1993 ,-v.l 4.-45 5p.

113. Halabisky B., Shen F., Huguenard J. R., Prince D. A. Electrophysiological Classification of Somatostatin-Positive Interneurons in Mouse Sensorimotor Cortex // J Neurophysiol.- 2006,- V.96, №2.- P. 834845

114. Hampson E.C.G.M., Vaney D.I., Weiler, R. Dopaminergic modulation of gap junction permeability between amacrine cells in mammalian retina//J. Neurosci.- 1992.-V.12.-P. 4911-4922

115. Hardy R.J., Lazzarini R.A., Colman D.R., Hriedrich V.L. Cytoplasmic and nuclear localization of myelin basic proteins reveals heterogeneity among oligodendrocytes.// J Neurosci Res, 1996.-46.-p.246

116. Hersch S., White E.A. A quantitative study of the thalamocortical and other synapses in layer IV of pyramidal cells projecting from mouse Sm 1 cortex to the cuadate putamen nucleus// J.Comp.Neurol. -1982. -V.211, №3. -P.217-225.

117. Hersch S., White E.A. Thalamocortical synapses with corticothalamic projection neurons in mouse Sml cortex: electron microscopic demonstration of a monosynaptyc feed-back loop// Neurosci. Let. -1981. -V.24, №3. -P.207-210.

118. Hille B. Ion channels of excitable membranes :Third edition.- 2003, 814 p.

119. Homuzdi S. G., Filippov M.A., Mitropoulou G., Monyer H., Bruzzone R. Electrical synapses: a dynamic signaling system that shapes the activity of neuronal networks // Biochem. Biophys. Acta.- 2004.-V. 1662.- P. 113137

120. Hoogland P.V., Welker E., Van der Loos H. Organization of the projections from barrel cortex to thalamus in mice studied with Phaseolus vulgaris-l'eucoagglutinin and HRP //Exp.Brain Res. -1987. -V.68. -P.73-87.

121. Hoogland P.V., Welker E., Van der Loos H. The organization and structure of the thalamic afferents from the barrel cortex in the mouse; a PHA-L study// In.Cell.Thalamic.Mech. -Elsevier Science Publishers. -1988.-P. 151-162.

122. Hormuzdi S.G., Pais I., LeBeau F.E., Towers S.K., Rozov A., et al. Impaired electrical signaling disrupts gamma frequency oscillations in connexin 36-deficient mice // Neuron.- 2001.- V.31 .-P.487^195

123. Hubel D. H., Wiesel T. H. Functional architecture of macaque monkey cortex// Proc. R. Soc. Lond.- 1977.-V. 198.- P. 1-59

124. Ishii T.M., Takano M., Xie L.H., Noma A., Ohmori II. Molecular characterization of the hyperpolarization-activated cation channel in rabbit heart sinoatrial node //J Biol Chem.-1999.- V. 274.- P. 12835-12839

125. Ivy J.O., Killackey H.P. Ephemeral cellular segmentation in the thalamus of the neonatal rat// Dev.Brain Res. -1981 .-V.2, № 1. -P. 1 -17

126. Karube F., Kubota Y., Kawaguchi Y. Axon branching and synaptic bouton phenotypes in GABAergic nonpyramidal cell subtypes // J Neurosci.-2004.-V. 24.-P.2853-2865

127. Kawaguchi Y., Kubota Y. Neurochemical features and synaptic connections of large physiologically-identified GABAergic cells in the rat frontal cortex // Neuroscience.-1998.- V.85.- P.677-701

128. Kawaguchi Y., Kubota Y. GABAergic cell subtypes and their synaptic connections in rat frontal cortex // Cereb. Cortex.-1997.- V. 7.- P.476-486

129. Keller A., Carlson G.C. Neonatal whisker clipping alters intracortical, but not thalamocortical projections, in rat barrel cortex // J. Comp. Neurol.-1999.-V.412.- P.83-94

130. Kies M.W. Myelin basic protein. Scand J Immunol, 1982.-15.-9,-p.125

131. Kirichenko E. Yu., Povilaitite P. E., Sukhov A. G. Role of gap junction in local rhythmogenesis in cortical columns // Neuroscience and behavioral physiology.- 2009.-V. 39, №2.- P. 199-202

132. Kuraev G. A., Mendzheritskii A. M., Povilaitite P. E. Effect of delta-sleep peptide on the ultrastructural features of the rat sensomotor cortex// Tsitol Genet.- 1991.- V.25, №2.- 6-13 P.

133. Lewis T.J., Rinzel J. Dynamics of spiking neurons connected by both inhibitory and electrical coupling // J. Comput. Neurosci.- 2003.-V. 14.-P. 283-309

134. Loewenstein W.R. The Touchstone of Life. Molecular information, Cell Communication, and the Foundations of Life: N. Y., 1999.-5-61 1 p.

135. Long M.A., Deans M.R., Paul D.L., Connors B.W. Rhythmicity without synchrony in the electrically uncoupled inferior olive // J. Neurosci.-2002.-V.22.- P. 10898-10905

136. Lopes de Silva F.H., Storm van Leeuwen W. The cortical alpha rhythm in dog: the depth and surface profile of phase// In. Architectonics of the cerebral cortex. Raven Press:New York. -1978. -P.319-333.

137. Lorente de No R., Graham H. T. Recovery cycle of motoneurons// J. Physiol.- 1938.-V.123.- P. 388-399

138. Lubke J., Egger V., Sakmann B., Feldmeyer D. Columnar organization of dendrites and axons of single and synaptically coupted excitatory spiny neurons in layer 4 of the rat barrel cortex. // J. Neurosci. 2000,20, №14,5300-5311

139. Lubke J., Feldmeyer D. Excitatory signal flow and connectivity in a cortical column: focus on barrel cortex // Brain Struct. Funct.- 2007.-V.212.-P.3-17

140. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M., Hofmann F., Biel M. A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels // Nature.-1998.- V. 393.- P. 587-591.

141. Ludwig A., Zong X., Stieber J., Hullin R., Hofmann F., Biel M. Two pacemaker channels from human heart with profoundly different activation kinetics // EMBO J.-1999.- V. 18.- P. 2323-2329.

142. Luthi A., McCormick D. A. H-current: properties of a neuronal and network pacemaker//Neuron.-1998a.-V. 21.- P. 9-12

143. Luthi A., McCormick D. A. Periodicity of thalamic synchronized oscillations: the role of Ca2+ mediated upregulation of Th// Neuron.-1998b.-V. 20,№3.-P. 553-563

144. Mancilla J.G., Lewis T.J., Pinto D.J., Rinzel J., Connors B.W. Synchrony of firing in coupled pairs of inhibitory interneurons in neocorte // Soc. Neurosci.- 2003.-23.-P. 173

145. Maxeiner S., Kruger O., Schilling EC, Traub O., Urschel S., Willecke K. Spatiotemporal transcription of connexin45 during brain development results in neuronal expression in adult mice // Neuroscience.- 2003.-V.l 19.-P. 689-700

146. Mayer M. L., Westbrook G. L. A voltage-clamp analysis of inward ( anomalious) rectification in mouse spinal sensory ganglion neurons// J. Physiol.- 1983.-V. 340.-P. 19-45

147. McCormic D. A., Pape H. C. Noradrenergic and serotonergic modulation of a hyperpolarization-activated cation current in thalamic relay neurons //J. Physiol. Lond.-1990b.-V. 431.-P. 319-342

148. McCormic D. A., Pape H. C. Properties of a hyperpolarization-activated cation current and its role in rhythmic oscillation in thalamic relay neurons//J. Physiol. Lond.-1990a.-V. 431.-P. 291-318

149. McCormick D.A., Bal T. Sleep and arousal: thalamocortical mechanisms // Annu. Rev. Neurosci.- 1997.- V. 20.-P. 185-215

150. Moroni A., Barbuti A., Altomare C., Viscomi C., Morgan J. Baruscotti M., DiFrancesco D. Kinetic and ionic properties of the human HCN2 pacemaker channel.// Pflugers Arch.-2000.- V. 439,- P.618-626

151. Mountcastle V. B. Modality and topographic properties of single neurons of cat,s somatic sensory cortex // J. Neurophysiol.- 1957.- V. 20.-P.408-434

152. Nagy J.I., Dudek F.E., Rash J.E. Update on connexins and gap junctions in neurons and glia in the mammalian nervous system// Brain Res Rev.-2004.-V.47.- P. 191-215

153. Naus C., Flumerfelt B., Hrycyshyn A. A. Anterograde HRP-WGA study of aberrant corticorubral projections following neonatal lesions of the rat sensorimotor cortex// Exp.Brain Res. -1985. -V.59, №2. -P.365-371.

154. Pape H. C. Queer current and pacemaker: The hyperpolarization — activated cation current in neurons// Annu. Rev. Physiol.-1996.- V. 58.- P. 299-327

155. Petrovicky P., Druga R. Peculiarities of the cytoarchitectonics and some afferent systems of the parietal cortex// Folia Morph.-1972.-V. 20.-P. 161-163

156. Porter J.T., Johnson C.K., Agmon A. Diverse types of interneurons generate thalamus-evoked feedforward inhibition in the mouse barrel cortex // J Neurosci.-2001.- V. 21.- P. 2699-2710

157. Potts M. A. Method for location specific histological features lor electron microscopy//J. Roy. Micr. Soc., 1965,85,1,97-102

158. Purves D., Augustine G. J., Fitzpatrick D., Katz L. C., La Mantia A., McNamara J. O., Williams S. M. Neuroscience: Sunderland, Mass- Sinauer Assocaites, Inc., 2001.- 681 p.

159. Rash J.E., Yasumura T., Davidson K.G., Furman C.S., Dudek F.E., Nagy J.I. Identification of cells expressing Cx43, Cx30, Cx26, Cx32 and Cx36 in gap junctions of rat brain and spinal cord // Cell Commun. Adhes.-2001a.- V.8.-P. 315-320

160. Rash J.E., Yasumura T., Dudek F.E., Nagy J.I. Cell-specific expression of connexins and evidence of restricted gap junctional coupling between glial cells and between neurons // J. Neurosci.- 2001b.- V.21.-P. 1983-2000

161. Robinson G., Gray T. Electron microscopy 2: Tissue preparation, sectioning and staining// in: Theory and practice of histological techniques, (eds. Bancroft JD, Stevens A.), Churchill livingstone, New York.- 1990.- P. 525-562.

162. Rutka J.T., Murakami M., Dirks P.B., Hubbard S.L., Becker L.E., Fukuyama K., et al. Role of glial filaments in cells andTumors of glial origin: a review.//J. Neurosurg, 1997.-87.-p.420-430

163. Santoro B., Baram T.Z. The multiple personalities of h-channels // Trends Neurosci.-2003.- V.26, №10.- P. 550-554

164. Santoro B., Liu D.T., Yao H., Bartsch D., Kandel E.R., Siegelbaum S.A., Tibbs G.R. Identification of a gene encoding a hyperpolarizationactivated pacemaker channel of brain // Cell.-1998.- V.93, P.717-729

165. Santoro B., Shan C., Luthi A., Pavlidis P., Shumyatsky G., Tibbs G., Siegelbaum S. Molecular and functional heterogeneity of hyperpolarizationactivated pacemaker channels in the mouse CNS // The Journal of Neuroscience.-2000.- V.20, №14,- P. 5264-5275

166. Santoro B., Tibbs G.R. The HCN gene family: molecular basis of the hyperpolarization-activated pacemaker channels // Ann. N.Y. Acad. Sci.-1999.- V. 868.- P.741-764.

167. Schlaepfer W.W. Neurofilaments: structure, metabolism, and implication in disease.//.!.Neuropathol Exp Neurol, 1987.-46.-p. 117-129

168. Sloper J.J. An electron microscope study of the commissural connexions of the primate motor complex // J. Anat.-1972.-V.l 1 1P.503

169. Sohl G., Maxeiner S., Willecke K. Expression and functions of neuronal gap junctions // Nature Rev. Neurosci.- 2005.- V. 6.- P. 191-200

170. Spain W. J., Schwindt P. C., Crill W. E. Anomalous rectification in neurons from cat sensorimotor cortex in vitro // J. Neurophysiol.- 1987.- V. 57.-P. 1555-1576

171. Steriade M., Deschenes M.,Domich L., Mulle C. Abolition of spindle oscillations in thalamic neurons disconnected from nucleus reticularis thalami //J.Neurophysiol. -1985. -V.54. P. 1473-1497.

172. Steriade M., Llinas R.R. The functional states of the thalamus and the associated neuronal interplay // Physiol. Reviews.-1988.- V. 68,№ 3.- P. 649-742

173. Sterman M., Clemente C. Cortical recruitment and behavioral sleep induced by basal forebrain stimulation // Fed. Proc. — 1961. V.20. -P.334-338.

174. Swadlow H.A. Fast-spike interneurons and feedforward inhibition in awake sensory neocortex // Cereb. Cortex.- 2003.- V. 13.- P. 25-32

175. Szabadics J., Lorincz A., Tama' s G. b and g frequency synchronization by dendritic GABAergic synapses and gap junctions in a network of cortical interneurons // The Journal of Neurosci.- 2001.- V. 21, №15.- P.5824-5831

176. Tam'as G., Buhl E.H., Lorincz A., Somogyi P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons // Nat. Neurosci.- 2000.- V.3.- P. 366-371

177. Tama's G., Somogyi P., Buhl E.H. Differentially interconnected networks of GABAergic interneurons in the visual cortex of the cat // .1. Neurosci.- 1998.- V. 18.- P.4255^1270

178. Teubner B., Odermatt B., Guldenagel M., Sohl G., Degen J. Functional expression of the new gap junction gene connexin47 transcribed in mouse brain and spinal cord neurons // J. Neurosci.- 2001.- V. 21,- P. 1117-1126

179. Timofeev J., Bazhenov M., Synovski T., Steriade M. Contribution of intrinsic and synaptic factors in the desynchronization of- thalamic oscillatory activity // Thalamus and relayted systems.-2001.- V. 1 .-P.53-69

180. Tony N., Pierre-Alan Buchs, Niconenko I., Povilaitite P., Parisi L., Muller D. Remodelling of sinaptic membranes after induction of long-term potentiation.//The Journal of Neuroscience, 2001 .-21 .-16.-p.6245-6251

181. Tony N., Pierre-Alan Buchs, Niconenko I., Povilaitite P., Parisi L., Muller D. Remodelling of sinaptic membranes after induction of long-term potentiation.//The Journal of Neuroscience, 2001 .-21.-16.-p.6245-6251

182. Vaccari T., Moroni A., Rocchi M., Gorza L., Bianchi M., Beltrame M., DiFrancesco D. The human gene coding for HCN2, a pacemaker channel of the heart// Biochim. Biophys. Acta.-1999.-V. 1446.- P.419-425.

183. Vaney D. 1., Charles Nelson J., Pow D. V. Neurotransmitter Coupling through Gap Junctions in the Retina//The Journal of Neuroscience.- 1998.-V. 18, №24.-P. 10594-10602

184. Weller W., Johnson J. Barrels in cerebral cortex altered by receptor disruption in newborn, but not in five-day old mice// Brain Res.-1975.- V. 83, №3.- P. 504-508

185. Wiedenmann W, Franke W.W Identification and localization of synaptophysin, an integral mmembrane glycoprotein of Mr 38,000 characteristic of presinaptic vesicles.//Cell, 1985.-41.-P. 1017-1028

186. Willecke K., Eiberger J., Degen J., Eckardt D., Romualdi A. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome // Biol. Chem.- 2002.- V.383.-P.725-37

187. Wise S., Jones E. Cells of origin and terminal distribution of descending projection of the rat somatic sensory cortex// J.Comp.NeuroI. -1977a. -V. 175. -P. 129-158.

188. Wise S., Jones E. Developmental studies of thalamocortical and commissural connections in the rat somatic sensory cortex// J.Comp.NeuroI. -1978. -V. 178. -P. 187-208.

189. Wise S., Jones E. Somatotopic and columnar organization in the corticotectal projection of the rat somatic sensory cortex// Brain Res. -1977b. -V.133. -P.233-235.

190. Woolsey T. A. Some anatomical bases of cortical somatotopic organization//Brain Behav. Evol.- 1978.-V. 15,- P. 325-371

191. Woolsey T. A., Van der Loos H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex// Brain Res.-1970.-V. 17, №2,- P. 205-242

192. Woolsey T. A., Welker K., Schwartz R. H. Comparative anatomical studies of the SmI face cortex with special reference to the occurrence of« barrels» in layer IV // J. Comp. Neurol.-1985.-V. 164, № 1.- P. 79-94

193. Yanagihara K., Irisawa H. Potassium current during the pacemaker depolarization in rabbit sinoatrial node cell // Pflugers Arch.-1980.-388, №3.-P. 255-260

194. Zhang C, Restrepo D. Expression of connexin 45 in the olfactory system // Brain Res.- 2002.- V.929.- P. 37^17