Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вейко, Наталья Николаевна

Введение.

ГЛАВА 1. НЕРАДИОАКТИВНОМЕЧЕНЫЕ ДНК-ЗОНДЫ; ОСОБЕННОСТИ

ФРАГМЕНТАЦИИ рДНК.

1.1. Нерадиоактивномеченые ДНК- зонды для гибридизации.

1.1.1. Обзор литературы.

1.1.2. Задачи исследования.

1.1.3. Синтез и свойства фотоактивируемых арилазидов.

1.1.4. Получение и свойства ДНК-зондов.

1.1.5. Использование фотобиотинилированных ДНК-зондов.

1.1.5.1. Дот -, блот - и in situ - гибридизация.

1.1.5.2. Количественные методы анализа последовательностей ДНК.

1.1.5.3. Зонды на транскрибируемую область рибосомного повтора.

1.2. Особенность фрагментации ТО рДНК при действии реагентов, индуцирующих в ДНК однонитевые разрывы.

1.2.1. Анализ длины фрагментов рДНК в образцах ДНК, выделяемой из различных тканей и биожидкостей.

1.2.2. Устойчивость ТО рДНК к фрагментации при внесениии в ДНК однитевых разрывов.

1.2.3. Практическое применение свойства устойчивости ТО рДНК к парным разрывам.

1.2.3.1. Детекция фрагментов рДНК в сыворотке крови человека в норме и при патологии.

ГЛАВА 2. ОБЩЕЕ ЧИСЛО И ЧИСЛО АКТИВНЫХ КОПИЙ РДНК В

ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА.

2.1. Обзор литературы.

2.1.1. Общее число копий РГ в геноме человека.

2.1.2. Количество копий рДНК в ЯОР хромосом человека.

2.1.3. Определение количества активных копий рДНК.

2.1.3.1. Анализ сателлитных ассоциаций, Ag-окраска хромосом.

2.1.3.2. Метод непрямой иммунофлуоресценции.

2.1.3.3. Потенциально активные копии РГ млекопитающих.

2.1.4. Задачи исследования.

2.2. Число копйй рДНК в геноме человека.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Метод определения числа копий РГ в геноме.

2.2.2.1. Выделение ДНК из клеток.

2.2.2.2. Измерение концентрации ДНК и ее фрагментация.

2.2.2.3. Контрольные последовательности; калибровочные кривые.

2.2.2.4. Условия гибридизации; характеристика зондов.

2.2.2.5. Дополнительные контрольные эксперименты.

2.2.2.6. Число коп ий РГ в геноме человека.

2.3. Определение числа активных копий рДНК в стимулированных лимфоцитах человека.

2.3.1. Объекты исследования.

2.3.2 Число активных копий РГ в стимулированных лимфоцитах.

2.3.3. Число неактивных копий РГ, содержащихся в активных и неактивных ЯОР хромосом.

2.4. Определение относительного количества потенциальноактивных копий РГ в в клетках человека.

2.4.1. Объекты исследования.

2.4.2. Определение двух фракций РГ.

2.4.2.1. Кинетика гидролиза ядер лимфоцитов человека рестриктазой Rsal.

2.4.2.2. Количественные соотношения между копиями РГ, находящимися в "открытой " и "закрытой " конформации.

2.5. Обсуждение и выводы по главе 2.

ГЛАВА 3. МЕТИЛИРОВАНИЕ ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ РИБОСОМНОГО ПОВТОРА ЧЕЛОВЕКА.

3.1. Обзор литературы.

3.1.1. Общие сведения о метилировании ДНК в клетках млекопитающих.

3.1.2. Последствия метилирования ДНК в клетке.

3.1.3. Методы изучения метилирования геномной ДНК. :.

3.1.4. МетилированиерДНКмлекопитающих.

3.1.5. Связь метилирования и транскрипции рибосомных генов.

3.1.6. Задачи исследования.

3.2. Метилирование ТО рДНК лейкоцитов человека.

3.2.1. Объекты исследования.

3.2.2. Методы изучения метилирования рДНК.

3.2.3. Анализ метилирования ТО рДНК человека с помощью гидролиза рестриктазой Hpall.

3.2.4. Гидролиз ТО рДНК человека рестриктазой Bsp 1201.

3.2.5. Изучение метилирования ТО рДНК с помощью рестриктазы Hinfl.

3.2. 6. Количественная оценка метилирования тотальной ДНК и рДНК.

3.2.7. Сравнение результатов цитогенетического анализа РГ и данных о метилировании ТО рДНК.

3.3. Метилирование ТО рДНК в различных типах клеток.

3.3.1 Метилирование рДНК в лимфоцитах и лейкоцитах.

3.3.2. Метилирование ТО рДНК в сперматозоидах человека.

3.3.3. Метилирования рДНК в различных тканях.

3.4. Обсуждение результатов и выводы по главе 3.

3.4.1. Вариабельность метилирования ТО рДНК человека.

3.4.2. Вариабельность метилирования копий рДНК одного генома.

3.4.3. Сопоставление количеств неактивных и метилированных копий.

3.4.4. Метилирование ТОрДНК в различных типах клеток человека.

3.4.5. Возможный механизм образования паттерна метилирования рДНК.

ГЛАВА 4. ЭЛЕМЕНТЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТО рДНК В КЛЕТКАХ

ЧЕЛОВЕКА.

4.1. Обзор литературы.

4.1.1. Локализация РГ в структурах ядрышка.

4.1.2. Расположение транскрибируемых копий РГ.

4.1.3. Взаимодействие рДНК с ядерным матриксом.

4.1.4. Конформация потенциальноактивных и неактивных копий РГ.

4.1.5. Задачи исследования.

4.2. Доступность различных участков ТО РГ в клетках и ядрах человека действию эндонуклеаз и арилазида.

4.2.1. Объекты исследования.

4.2.2. Rsal - гидролиз ТО рДНК в изолированных ядрах лимфоцитов.

4.2.3. Rsal - гидролиз ТО рДНК в изолированных ядрах фибробластов и клеток лимфобластоидной линии.

4.2.4. Гидролиз ТОрДНКядер лимфоцитов ДНКазой 1.

4.2.5. Модификация арилазидом ТО рДНК в лимфоцитах и изолированных ядрах лимфоцитов.

4.3. Прочносвязанные с рДНК белки РП человека.

4.3.1. Обнаружение прочносвязанных белков.

4.3.2. Прочносвязанные с рДНК белки в изолированных ядрах, нуклеоиде и нуклеопротеиде.

4.3.3. Выделение и частичная характеристика белков, экранирующих R-caüm

10701 в ТО рДНК.

4.3.4. Количество копий РГ с экранированным Rsal- сайтом 10701 при различных состояниях клетки.

4.4. Расположение метилированных копий РГ в ядрах лимфоцитов.

4.5. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека"

Гены, кодирующие рибосомные РНК (рРНК), имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Продукты экспрессии этих генов (28S, 18S, 5.8S рРНК) являются составными частями рибосом - структур, в которых происходит трансляция генетической информации. От уровня активности рибосомных генов (РГ), в какой-то степени, зависит способность клетки обеспечивать в нужном количестве синтез необходимых белков.

РГ локализованы в локусах хромосом, объединенных в интерфазных ядрах клеток в ядрышки - сложные динамические образования, в которых происходит транскрипция и процессинг рРНК и реализуются основные этапы биогенеза больших и малых субъединиц рибосом. Изменение формы и размеров ядрышка, свидетельствующее об изменении его функциональной активности, наблюдается при любых значимых воздействиях на клетку (канцерогенез, апоптоз, старение, стимуляция к делению и ингибирование клеточных синтезов, вирусные и бактериальные инфекции, ионизирующее облучение и т.д.). В работах последних лет (Visintin, Amon, 2000) показано, что ядрышко является не только «фабрикой рибосом», но и непосредственно участвует в контролировании активности белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Понимание закономерностей организации и функционирования ядрышка является фундаментальной проблемой молекулярной биологии и молекулярной генетики. Для ее решения необходимо, прежде всего, иметь представление об организации составляющих компонентов ядрышка; одним из основных компонентов являются тандемные рибосомные повторы (РП).

Процесс транскрипции рибосомных генов в клетках млекопитающих достаточно хорошо изучен (обзор Grumpt, 1999), определены основные белки и ферменты, участвующие в этом процессе. Вместе с тем, ряд вопросов, связанных с организацией и функционированием рибосомных генов в клетках человека, остаются нерешенными. До настоящего времени неясно, сколько копий РГ содержит геном человека и насколько вариабелен этот показатель, можно ли в популяции выделить группы людей, у которых число копий РГ увеличено или уменьшено? Все данные о числе копий РГ у человека были получены более 20 лет назад на единичных образцах ДНК. Содержание РГ, по оценкам разных авторов, варьирует от 70 (Young et at., 1976) до 800 (Schmikel, 1973) копий на клетку. Определение числа копий РГ для большой группы людей является непростой задачей и требует развития новых методов гибридизационного анализа.

Практически не изучен вопрос о количестве активных копий РГ в клетках человека. Данные цитогенетических исследований указывают на существование кластеров "молчащих" рибосомных генов (КМРГ), в которых могут находиться до 30% копий РГ (Ляпунова и соавт., 2001). Однако, мало известно об организации активных, ядрышкообразующих районов хромосом (Ag®3P): все ли копии в них активны или, наряду с активными, эти ЯОР содержат определенное количество неактивных копий РГ? Для решения этого вопроса необходимо разработать подход, позволяющий анализировать соотношение в геноме общего числа копий и количества активных копий.

Для клеток млекопитающих (крысы и мыши) показано, что РГ, с точки зрения конформации, делятся на две фракции (Conconi et al., 1989): "открытую" и "закрытую". В "открытой" конформации (ТО рДНК в целом повышенно доступна действию различных агентов) находятся активные и потенциальноактивные копии РГ. В литературе не приводится более конкретных данных об организации копий "открытой" ("закрытой") фракции РГ. Неясно, как различаются конформации отдельных, непротяженных областей ТО рДНК, особенно в структурной части, чем отличается организация активнотранскрибирующихся и потенциальноактивных копий РГ, которые все находятся в «открытой» конформации? Исследования соотношения двух типов конформации РГ для клеток человека неизвестны. Для проведения таких исследований необходимо разработать метод, позволяющий анализировать доступность непротяженных участков ТО рДНК в ядрах и клетках.

Известно, что метилирование цитозиновых оснований ДНК в регуляторной части генов эукариот ингибирует транскрипцию. Метилирование ТО рДНК человека практически не изучено. Имеется только одна работа, в которой на примере одного образца ДНК делается вывод о низком уровне метилирования ТО рДНК (Brock, Bird, 1997). Данные цитогенетических исследований указывают на то, что КМРГ содержат 5-метилцитозин (De Сароа et al., 1991). Представляет интерес исследовать уровень метилирования ТО рДНК для достаточно большой группы людей и связать этот показатель с такими параметрами, как общее число и число активных (неактивных) копий РГ в геноме. В литературе не содержится сведений о том, различается ли локализация метилированных и неметилированных копий РГ человека в ядре. Кроме того, интересно выявить особенности метилирования отдельных районов на протяжении ТО рДНК человека, а также определить уровень метилирования РГ в тканях одного организма. Эти данные могли бы нас приблизить к пониманию того, каким образом и на каком этапе эмбрионального развития происходит метилирование ТО РГ человека.

Нам представлялось важным изучить перечисленные выше параметры прежде всего для достаточно большой группы здоровых доноров. Однако, не меньшее значение имеет исследование особенностей организации РГ при патологии. Логично предположить, что общий уровень синтеза белка в клетке, который определяется, в том числе, и количеством активных копий РГ, в некоторых случаях может влиять на развитие заболевания или на компенсацию биохимического дефекта, связанного с патологией. В качестве патологии была выбрана активная форма шизофрении-заболевание в большом проценте случаев имеющее наследственную природу.

Окончательно причина этого заболевания не выяснена. В последние годы высказано предположение о наличии дефекта в полигенной системе, связанной с метаболизмом ретинола, который, в свою очередь, вовлечен в процессы морфогенеза плода и последующих стадий развития организма, влияя на генную экспрессию, дифференцировку, пролиферацию и апоптоз клеток (Goodman, 1995, 1998; Jones, Cannon, 1998).

Цель работы.

Изучить особенности структурно-функциональной организации рибосомных генов человека, связанные с общим числом копий РГ, количеством активных копий и уровнем метилирования ТО рДНК.

Основные задачи.

1. Определить общее число копий РП в геномах достаточно большой выборки людей.

2. Определить число активных (потенциально активных) копий РГ в клетках человека.

3. Проанализировать метилирование транскрибируемой области РП в образцах ДНК, выделенной из клеток человека.

4. Изучить некоторые свойства конформации активных, неактивных и метилированных копий РП в клетках человека.

5. Для реализации задач 1-4 разработать новые метода анализа РП человека.

Научная новизна.

Впервые исследована вариабельность числа копий РП в геномной ДНК человека на большой выборке индивидов (84 человека). Обнаружено, что геномы больных шизофренией в среднем содержат большее число копий РП, чем геномы здоровых доноров.

Впервые определено число активных и неактивных копий РГ в ФГА-стимулированных лимфоцитах людей (46 человек). Показано, что активные ЯОР хромосом (ЯОР, которые не содержат кластеров «молчащих» рибосомных генов), включают, наряду с транскрибируемыми РГ, неактивные копии, причем, соотношение числа активных и неактивных копий в этих ЯОР- достаточно постоянная величина.

Показано, что визуальная оценка размеров AgЯOP, разработанная в цитогенетике, действительно отражает число копий РГ в отдельных ЯОР и в геноме в целом и может быть использована для сравнения индивидуальных геномов человека по количеству активных РГ.

Впервые определено относительное количество потенциальноактивных копий РГ в клетках человека. Показано, что, даже в активно пролиферирующих клетках, количество потенциальноактивных копий меньше, чем неактивных копий РГ.

Впервые обнаружен и охарактеризован межгеномный и внутригеномный полиморфизм метилирования ТО РГ человека. Выявлен мозаичный характер метилирования участков ТО РГ. Показано, что «рисунок» метилирования ТО РГ одинаков в соматических клетках одного индивида (на примере 11-ти типов клеток), но существенно изменен в клетках спермы.

Выявлена связь уровня метилирования ТО РГ с общим числом копий РГ и числом неактивных копий. Показано, что неактивные копии РГ, входящие в состав активных ЯОР, метилированы незначительно; неактивные копии, образующие кластеры «молчащих» РГ (КМРГ), высокометилированы. Впервые высказано предположение о возможной активности неметилированных неактивных копий РГ соматической клетки на стадии раннего эмбриогенеза.

Получена новая информация об особенностях конформации потенциальноактивных, активных, неактивных и высокометилированных копий РГ. Обнаружено, что часть потенциальноактивных копий РГ содержит на всем протяжении ТО РГ прочносвязанные с рДНК белки. Количество копий РГ, экранированных прочносвязанными белками, тем выше, чем ниже пролиферативная активность клетки; оно изменяется при различных воздействиях на клетку (малые дозы радиации, индукция апоптоза, стимуляция к делению). Выделены и частично охарактеризованы два белка, прочно связанных с участком гена 28S рРНК.

Обнаружено новое свойство нуклеотидной последовательности ТО РГ: устойчивость к возникновению двунитевых разрывов при накоплении в молекуле ДНК однонитевых разрывов, вносимых нуклеазами, модифицирующими агентами и ионизирующей радиацией.

Все перечисленные выше результаты получены с использованием новых подходов к анализу свойств РП.

Практическая ценность работы.

Разработаны новые способы нерадиоактивного мечения и детекции НК-зондов, на которые получено три авторских свидетельства. Наибольшее практическое применение нашел метод нерадиоактивного мечения ДНК-зондов, позволяющий получать зонды с заданным количеством метки (биотин, дигоксигенин, флуоресцентные красители и фотоактивируемые группы) для дот-, блот- и in situ- гибридизации; для реализации метода синтезирован ряд новых фотоактивируемых арилазидов. Гибридизационные схемы с использованием фотобиотинилированных зондов нашли применение в медицинских и научных учереждениях страны при проведении дот-, блот- и in situ гибридизации.

Разработан новый способ нерадиоактивной количественной гибридизации, позволяющий определять содержание и уровень метилирования повторяющихся последовательностей генома одновременно в большом числе образцов ДНК. Предложен подход к анализу генетической индивидуальности (патологии), заключающийся в одновременном определении в геномной ДНК содержания и уровня метилирования нескольких повторяющихся последовательностей.

Предложен способ, позволяющий определять в клетке число активных копий РГ и наличие КМРГ без проведения трудоемкой процедуры in situ гибридизации.

Разработан ряд новых методик: (1) определение относительного содержания потенциально активных копий РГ в ядрах клеток человека; (2) выделение из лизатов и экстрактов клеток белков, специфически связывающихся с ДНК-зондами; синтезирован новый фотореагент для мечения таких ДНК-зондов, содержащий лабильную S-S -связь в линкере между фотоактивируемой группой и биотином; (3) выделение фрагментов ДНК человека различной длины из малых объемов сыворотки и плазмы крови. Некоторые из методик уже используются при проведении биохимических анализов в медицинских учреждениях г. Москвы.

Показано, что определение содержания в Rsal-гидролизатах ядер фрагмента рДНК, содержащего экранированный сайт 10701, может быть использовано для оценки физиологической активности клетки после некоторых воздействий (стимуляция к делению, апоптоз, малые дозы ионизирующей радиации).

Предложен новый способ анализа «открытой» и «закрытой» конформации ДНК в клетках по доступности участков повторяющихся последовательностей, фотоактивируемому арилазиду.

На основе обнаруженного свойства последовательности РГ (устойчивость к парным разрывам при накоплении однонитевых) предложен метод определения относительного количества погибших клеток организма путем анализа содержания фрагментов РГ в сыворотке крови в норме и при патологии.

15

Положения, выносимые на защиту.

1. Определено число копий РП в геномах 84 человек. Этот показатель высоковариабелен. Геномы больных шизофренией в среднем содержат большее число копий РП, чем геномы здоровых доноров.

2. Копии РП одного генома гетерогенны с точки зрения функциональной активности, свойств конформации и метилирования транскрибируемой области.

3. Имеет место межгеномная вариабельность таких параметров, как число потенциальноактивных и транскрибируемых копий, число неактивных копий, общий уровень метилирования транскрибируемой области РП.

4. Метилирование ТО РП имеет мозаичный характер, одинаково для ДНК соматических клеток одного организма, но изменено в ДНК сперматозоидов.

5. Описано ранее неизвестное свойство ТО РП: устойчивость к возникновению парных разрывов при накоплении однонитевых.

6. Разработаны новые схемы использования фотоактивируемых арилазидов для исследования повторяющихся последовательностей генома.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Вейко, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Определено число копий рибосомных повторов (РП) в геномах 84 человек. Этот показатель высоковариабелен. Геномы больных шизофренией в среднем содержат большее число копий РП, чем геномы здоровых доноров.

2. В ФГА-стимулированных лимфоцитах 60-80% всех копий РП не транскрибируются. По цитологической локализации неактивные РП подразделяются на два типа: (а) входящие в состав активных ядрышкообразующих районов хромосом (на 10 активных копий приходится в среднем 17-21 неактивных); эти копии малометилированы; и (б) образующие кластеры «молчащих» рибосомных генов. Эти копии высокометилированы, локализованы в ядре вне ядрышка и практически не связаны с ядерным матриксом.

3. Копии РП в составе ядрышка лимфоцитов делятся на две фракции:

1) повышенно доступные в транскрибируемой области эндонуклеазам и арилазиду («открытая» конформация, примерно 30 % всех копий). Эти копии связаны с ядерными структурами посредством взаимодействий, устойчивых к протеиназному гидролизу; часть копий содержит на всем протяжении транскрибируемой области прочносвязанные с рДНК белки. Частично охарактеризованы два белка (р52 и р67). Количество копий РП, содержащих в Rsal- сайте 10701 прочносвязанные белки, тем больше, чем ниже пролиферативная активность клетки;

2) ограниченно доступные указанным реагентам («закрытая» конформация, около 70 % всех копий); в части этих копий области генов 18S и 5,8S рРНК более «открыты», чем области внешнего транскрибируемого спейсера и гена 28S рРНК; после протеиназного гидролиза эти копии экстрагируются из ядра.

4. Для метилирования транскрибируемой области РП человека характерна внутри- и межгеномная вариабельность. Метилирование имеет мозаичный характер, одинаково в соматических клетках одного организма, но сильно снижено в клетках спермы.

231

4. Для метилирования транскрибируемой области РП человека характерна внутри- и межгеномная вариабельность. Метилирование имеет мозаичный характер, одинаково в соматических клетках одного организма, но сильно снижено в клетках спермы. Метилирование ТО РП не играет решающей роли в регуляции активности РГ в клетках различного типа.

5. Впервые показано, что последовательность транскрибируемой области РП обладает устойчивостью к возникновению парных разрывов при накоплении однонитевых. Это свойство должно учитываться при анализе рДНК и может быть использовано для оценки относительного количества погибших клеток организма.

6. Разработаны новые способы получения и использования (количественная гибридизация, выделение белков) нерадиоактивномеченных НК-зондов. Для этих целей были синтезированы несколько фотоактивированных арилазидов с различными заместителями в ароматическом кольце и в боковой цепи.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТО рДНК ЧЕЛОВЕКА

В этом разделе суммируются результаты анализа ТО РП человека, полученные при выполнении данной работы, и результаты анализа ядрышка клеток человека с использованием световой и электронной микроскопии. Объединение этих данных позволяет более полно представить организацию РП в клетке и ее связь с функциональной активностью РГ.

Геном человека в норме содержит от 210 до 600 копий РП (408 ±103, п=42). В популяции можно выделить группы индивидов, у которых количество копий РГ повышено. Это больные с синдромом Дауна, геном которых содержит лишнюю 21 хромосому и, соответственно, увеличенное на 3-40 % число РГ (01йез а1., 1975), а также больные с активной формой шизофрении, которые при нормальном кариотипе содержат большее число копий РГ (от 280 до 670, среднее 494 ± 94, п=42). Дальнейшие исследования, по-видимому, позволят выявить и другие группы индивидов с увеличенным (уменьшенным) содержанием РГ.

Копии РП генома человека гетерогенны с точки зрения функциональной активности, эпигенетической мутации (метилирование) и конформации. Эту гетерогенность отражает схема, представленная на рис. 5-1.

5.1. Неактивные копии рибосомных генов.

Примерно 70 % всех копий РГ в клетках человека (стимулированные лимфоциты и культивируемые фибробласты) составляют неактивные копии (заштрихованная часть круга). Неактивные копии делятся на два типа: копии, входящие в состав активных ЯОР хромосом, и, копии, образующие кластеры «молчащих» РГ. КМГР содержат примерно 14% доноров (Ляпунова и соавт., 2000). Метилированные копии, образующие КМРГ, открытая" конформация активные/ потенциальноактивные копии неактивные копии

Рис.5-1. Схема, отражающая гетерогенность копий рибосомных повторов человека. Светлое поле- активные и потенциальноактивные копии РП, в рамке обозначены прочносвязанные с рДНК белки, которые, предположительно, присутствуют в неработающих в данный момент копиях; темное поле - неактивные копии РГ, которые могут быть метилированы и неметилированы. плотно метилированы на всем протяжении ТО РГ, локализованы в ядре вне ядрышка и практически не связаны с ядерным матриксом. Эти выводы полностью согласуются с данными световой и электронной микроскопии о наличие в ядрах лимфоцитов некоторых доноров копий РГ, расположенных вне ядрышка, неактивных и легко экстрагирующихся из ядра (ЧУасШег е1 а1., 1986; М^роЬзЬапипег е1 а!., 1999). Наши данные указывают на то, что неактивные высокометилированные копии ассоциированы со специфическими белками, экранирующими в геноме метилированные Срв- сайты . Уровень и плотность метилирования ТО рДНК одинаковы в тканях одного организма. Этот факт говорит о том, что паттерн метилирования рДНК (и образование КМРГ) формируется в эмбриональной клетке на ранней стадии, в период, предшествующий клеточной дифференцировке.

Для комплекса РГ человека наблюдается положительная корреляция между уровнем и плотностью метилирования РГ (и, соответственно, количеством КМРГ) и общим числом копий РГ в геноме. Это позволяет высказать предположение о том, что метилирование копий РГ является частью механизма регулирующего максимальное количество копий РГ в геноме.

Копии рибосомных генов, не входящие в КМРГ, локализованы в ФЦ и ПФК ядрышка (см. обзор, глава 4). Наши данные показывают, что рДНК в этих структурах в составе ядра лимфоцитов относительно малодоступна гидролизу эндонуклеазами. Требуется предварительная фрагментация ДНК ядер, чтобы начался активный гидролиз рДНК, т.е. ФЦ и ПФК - это достаточно закрытые и обособленные образования в ядре.

В ФЦ ядрышка присутствуют копии РГ и ферменты, ответственные за транскрипцию, но транскрипция осуществляется, по данным большинства авторов, вне ФЦ ядрышка (см. обзор, глава 4). Таким образом, можно предположить, что в ФЦ локализованы неактивные, неметилированные (малометилированные) копии РГ, входящие в состав активных ЯОР. Их расположение в структуре ФЦ таково, что большая часть ТО рДНК (особенно область 5'-ETS и гена 28S рРНК) относительно малодоступна действию эндонуклеаз и низкомолекулярных агентов типа арилазида и псоралена (Conconi et al., 1989), но центральная часть ТО рДНК (гены 18S и 5,8S рРНК и внутренние спейсеры) значительной части копий доступны перечисленным агентам. Малая доступность некоторых областей ТО неактивных копий РГ связана прежде всего с низкой скоростью диффузии реагентов в структуру ФЦ. Вместе с тем некоторые данные электронной микроскопии отрицают наличие компактной упаковки ДНК в составе ФЦ клеток человека, обусловленной образованием нуклеосом (Thiry, Goessens, 1996); в ФЦ лимфоцитов не удается также обнаружить и гистоны (Derenzini et al., 1985). Возможно, низкая скорость диффузии молекул в указанные районы связана не столько с экранированием ТО рДНК белками, но со стерической укладкой молекул рДНК в ФЦ. ДНК копий РГ, локализованных в ФЦ, взаимодействует с белками ядерного матрикса в областях NTS и 5'-ETS, близких к началу транскрипции. Наши данные подтверждают выводы Тири и Госсенса (Thiry, Goessens, 1996), основанные на результатах электронной микроскопии, о том, что участок 5'-ETS находится глубоко внутри структуры ФЦ ядрышка и малодоступен для ДНК-зондов. Копии рДНК, входящие в состав ФЦ, крепятся к структурам ядрышка посредством белок-белковых взаимодействий, чувствительных к протеазному гидролизу.

Уровень и плотность метилирования неактивных копий, входящих в состав активных ЯОР, в целом не высоки, за исключением области гена 18S рРНК, которая сильно метилирована примерно в 10 % копий РГ доноров, не содержащих КМРГ. Уровень метилирования отдельных областей ТО коррелирует с уровнем их доступности модифицирующим агентам в ядре (и клетке). Этот факт может свидетельствовать о том, что метилтрансфераза модифицирует только относительно более доступные участки ТО РГ фракции неактивных копий, локализованной в ФЦ ядрышка.

5.2. Активные (потенциально активные) копии РГ.

Около 30 % копий РГ лимфоцитов человека составляют потенциальноактивные копии (см. рис.5-1, незаштрихованная часть круга). Это особая фракция рДНК в клетке, которая неметилирована и находится в конформации, значительно отличающейся от конформации неактивных копий. В интерфазных лимфоцитах, по-видимому, активны (происходит транскрипция) только небольшая часть копий РГ этой фракции; при ФГА-стимуляции транскрибируются большинство копий. В ФГА-стимулированных лимфоцитах число транскрибируемых копий у индивидов (п=46) варьирует от 130 до 190 копий на клетку, тогда как общее число копий РГ в этой выборке изменяется от 370 до 670 копий на клетку, т.е. вариабельность числа активных копий (46 %) существенно ниже, чем общего количества копий РГ (81 %). Активные копии локализованы в активных AgilOP хромосом, причем, на 10 активных копий РГ в этих ЯОР приходится, как правило, 19 ± 2 неактивных копии. В редких случаях число неактивных копий, приходящееся на 10 активных, снижается до 14-15.

По данным электронной микроскопии транскрипция РГ происходит на границе ФЦ и ПФК или в областях ФЦ и ПФК расположенных в непосредственной близости от этого участка (см. обзор, глава 4). По-видимому, именно в этом районе локализованы потенциально активные копии РГ. Эти копии организованы таким образом, что область ТО рДНК (за исключением области NTS и 5'-ETS, прилегающих к участку начала транскрипции) на всем протяжении доступна действию эндонуклеаз (в условиях, обеспечивающих достаточную предварительную фрагментацию ДНК ядер) и арилазида. Потенциальноактивные копии по иному (по сравнению с неактивными в составе ФЦ)

229 крепятся к структурам ядра: протеиназный гидролиз не нарушает ассоциации этих копий с ядром. Это одно из объяснений того, что многие авторы находят РГ только в ПФК: протеиназный гидролиз ядер, проводимый перед гибридизацией in situ оставляет интактными потенциальноактивные копии, локализованные в ПФК, но приводит к элюции из ядра неактивных копий, локализованных в ФЦ.

Фракция потенциальноактивных копий неоднородна (см. рис.5-1, пунктирная линия). Часть копий содержит на всем протяжении ТО рДНК прочносвязанные белки, комплексы которых с рДНК устойчивы к действию ионных и неионных детергентов и протеиназы К. В нашей работе подробно изучены факторы, экранирующие область сайта 10701 в гене 28S рРНК. Определены два белка (р52 и р67), которые прочно взаимодействуют с этим участком. Корреляция количества копий РГ во фракции потенциальноактивных копий, содержащих экранированный сайт 10701, с уровнем пролиферативной активности клетки позволяет предположить, что прочносвязанные белки ассоциированы с копиями РГ, которые в данный момент (Go-фаза) не транскрибируются, но при изменении условий (стимуляция клетки к делению) начинают транскрибироваться; при этом их комплексы с прочносвязанными белками диссоциируют.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вейко, Наталья Николаевна, Москва

1. Вейко В.П., Ратманова К.И., Осипов A.C., Вейко H.H., Карпухин A.B., Дебабов В.Г. Твердофазный синтез биотинилированных олигодезоксирибонуклеотидов // ДАН СССР. 1990. Т. 313. С. 214-216.

2. Вейко H.H., Карпухин A.B., Салимов А.Г., Немцова М.В., Спитковский Д.М. Биотинирование ДНК с использованием фотоактивируемого реагента М-(4-азидо-2-нитробензоил)-1,7-диаминогептана//Биотехнология. 1989. Т.5. С. 414-418.

3. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Богуш А.И., Цветкова Т.Г. Громова Э.В. Определение количества рибосомных генов в индивидуальных геномах человека// Молекулярная биология. 1996. Т. 30. С. 1076-1084.

4. Ганнушкина И.В., Фараго М.Л., Антелава А.Н., Баранчикова М.В., Вейко H.H. Гемодинамический эффект ДНК плазмы крови // Вестник РАМН. 1998. № 5. С. 16-22.

5. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Из-во « Мир», М., 1994.

6. Карпухин A.B., Вейко H.H., Салимов А.Г., Спитковский Д.М. (1988) Способ биотинирования нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство на изобретение № 1443404.

7. Карпухин A.B., Вейко H.H., Спитковский Д.М. (1989) Способ детекции нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство № 1538126.

8. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова H.A., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. Из-во «Химия», М., 1970.

9. Куприянова Н.С. Консервативность и изменчивость рибосомной ДНК эукариот// Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 753-765.

10. Ляпунова H.A., Еголина H.A., Цветкова Т.Г., Вейко H.H., Кравец-Мандрон И.А.,

11. Громова Э.В., Косякова Н.В., Викторов В.В., Малиновская Т.Н. Рибосомные гены в геноме человека: вклад в генетическую индивидуальность и фенотипическое проявление дозы гена // Вестник РАМН. 2000. № 5. С. 19-23.

12. Потапов В.К., Вейко Н.Н., Карпухин А.В., Спитковский Д.М. (1991) Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство на изобретение № 1613493.

13. Рябченко Н.И. Радиация и ДНК. Из-во «Атомиздат». М., 1979.

14. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Из-во «Наука», М., 1984.

15. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. Из-во «Химия», М., 1978.

16. Aggarwal А.К. Structure and function of restriction endonucleases// Curr. Opin. Strut. Biol. 1995.V. 5. P. 11-19.

17. Albarella J.P., Anderson L.H.D. 1986. U.S. Patent 4563417.

18. Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Scheffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman . Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs// Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

19. Antequera F., Bird A.P. Number of CpG islands and genes in human and mouse // PNAS USA. 1993. V. 90 . P. 11995-11999.

20. Antequera I., Lucchini R., Koller T., Sogo J.M. Chromatin structure and methylation of rat rRNA genes studied by formaldehyde fixation and psoralen cross-linking // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 1727-1735.

21. Antequerra F., Boyes J., Bird A.P. High level de novo methylation and alteredchromatin structure at CpG island in cell lines // Cell. 1990. V.62. P. 503-514.

22. Antequerra F., Macleod D., Bird A.P. Specific protection of methylated CpG in mammalian nuclei // Cell. 1989. V. 58. P. 509-517.

23. Arrighi F.E., Lau Y.F., Spallano A. Nucleolar activity in different cells after Stimulation// Cytogen. Cell Genet. 1980. V. 26. P. 244-250.

24. Attardi G., Amaldi F. Structure and synthesis of ribosomal RNA // Annu. Rev. Biochem. 1970. V.173. P. 183.

25. Baeuerle P.A., Henkel T. Function and activation of NF-kappa B in immune system // Annu Rev. Immunol. 1994. V. 12. P. 141-179.

26. Bauman J.G.J., Wiegant J., Van Duijn P. Cytochemical hybridization with fluorochrome-labeled RNA. I. Development of the method using nucleic acids bound to agarose beads as a model // J. Histochem. Cytochem. 1981a.V.29. P. 227-237.

27. Bauman J.G.J., Wiegant J., Van Duijn P. Cytochemical hybridization with fluorochrome-labeled RNA. II. Applications // J. Histochem. Cytochem. 1981b . V. 29. P. 238-246.

28. Bauman J.G.J., Wiegant J., Van Duijn P. Cytochemical hybridization with fluorochrome-labeled RNA. III. Increased sensitivity by the use of anti-fluorescein antibodies // Histochemistry. 1981 c . V. 73. P. 181-193.

29. Bauman J.G.J., Wiegant L., Van Duijn P. The development, using poly (Hg-U) in a model sistem, of a new method to visualize cytochemical hybridization in fluorescence microscopy // J. Histochem. Cytochem. 1983.V. 31. P. 571-578.

30. Baverstock K.F., Will S. Evidence for the dominance of direct excitation of DNA in the formation of strand breaks in cells following irradiation // Int. J. Radiat. Biol. 1989. V. 55. P. 563-568.

31. Bazar L.S., Deeg H.J. Ultraviolet B-induced DNA fragmentation (apoptosis) in activated T-lymphocytes and Jurkat cells is augmented by inhibition of RNA and protein synthesis// Exp. Hematol. 1992. V. 20. P. 80 86.

32. Besse S., Puvion-Dutilleul F. Distribution of ribosomal genes in nucleoli of herpessimplex virus type 1 infected cells //Eur. J. Cell Biol. 1996. V. 71. P. 33-44.

33. Bestor T.H., Verdine G.L. DNA methyltransferases //Cur.Opin.Cell Biol. 1994.V.6. P.380-389.

34. Bird A.P. The essentials of DNA methylation // Cell. 1992. V.70. P. 5-8.

35. Bird A.P. DNA methylation versus gene expression // J Embryol.Exp.Morphol.l984.V.83. P. 31-41.

36. Bird A.P. Methylation of the genes for 18S, 28S, and 5S ribosomal RNA // Current Top. Microbiol. Immun., 1984, V., P.129-140.

37. Bird A.P. The relationship of DNA methylation to cancer// Canc.Surv. 1996. V. 28. P. 87 101.

38. Bird A.P., Southern E.M. Use of restriction enzymes to study eukariotic DNA methylation // J. Mol. Biol. 1978. V. 118. P. 27-47.

39. Bird A.P., Taggart M.H. Variable pattern of total DNA and rDNA methylation in animals // Nucleic acids Res. 1980. V. 8. P. 1485-1497.

40. Bird A.P., Taggart M.H., Gehring C.A. Methylated and unmethylated ribosomal RNA genes in the mouse //J.Mol. Biol. 1982. V.152. P. 1-17.

41. Birnstiel M.L., Selles B.H., Purdom J.F. Kinetic complexity of RNA molecules // J. Mol. Biol. 1972. V. 63. P. 21-39.

42. Bloom S.E., Goodpasture C. An improved technique for selective silver staining of nucltolar organizer regions in human chromosomes // Hum.Genet. V. 24. P. 199-206.

43. Boulikas T. Chromatin and nuclear matrix in development and in carcinogenesis: A theory // Int. J. Oncol. 1992. V. 1. P. 357-372.

44. Boulikas T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences // Int. Rev.Cytol. 1995. V. 162. P. 279-388.

45. Boyes J., Bird A.P. Repression of gene by DNA methylation depends on CpG density and promoter strenght // EMBO J., 1992, V. 11, p. 327-333.

46. Boyes J., Bird A. DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methyl-CpG binding protein//Cell. 1995.V.64P. 1123-1134.

47. Boyes J., Bird A.P. DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methyl CpG binding protein//Cell, 1991, V.64, P. 1123-1134.

48. Brock G.J.R., Bird A.P. Mosaic methylation of the repeat unit of the humanribosomal RNA genes // Hum. Mol. Genet. 1997. V.6. P. 451-456.

49. Brock G.J.R., Bird A.P. Mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 451-456.

50. Broker T.R., Angerer L.M., Yen P.H., Hershey N.D., Davidson N. Electron microscopic visualization of tRNA genes with ferritin-avidin: biotin labels // Nucl. Acids Res. 1978. V. 5. P. 363-384.

51. Bross K., Dittes H., Krone W., Schmid M., Vogel W. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions of man // Humangenet. 1973. V.20. P. 223-229.

52. Bross K., Krone W. On the number of ribosomal RNA genes inman // Humangenet. 1972. V. 14. P. 137-141.

53. Bross K., Krone W. Ribosomal cistrons and acrocentric chromosomes in man // Humangenet. 1973. P. 71-75.

54. Budde A., Grummt I. P53 repress ribosomal gene transcription // Oncogene. 1998. V. 19. P. 1119-1124.

55. Buys H.M., Osinga J. Abundance of protein bound sulfhydril- and disulfide group at chromosomal nucleolus organizer regions // Chromosoma. 1980. V. 77. P. 1-11.

56. Cedar H., Solage A., Glaser G., Razin A. Direct detectiom of methylated cytosine in DNA by use of the restriction enzyme Mspl// Nucleic acids Res. 1979. V. 6. P. 2125-2132.

57. Chargaff E., Lipshitz R., Green C. Composition of the deoxypentose nucleic acids of 4 generation of sea urchin // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. P. 155-166.

58. Cheng X. Structure and function of DNA methyltransferase // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. V.24. P. 293-318.

59. Cimino GD, Gamper HB, Isaacs ST, Hearst JE. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: organic chemistry, photochemistry, and biochemistry// Annu Rev Biochem. 1985. V. 54. P. 1151-93.

60. Clark S.J., Harrison J., Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells // Nat. Genet. 1995. V.10.P. 20-27.

61. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosine // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2990-2997.

62. Conconi A., Widmer R.M., Koller T., Sogo J.M. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle // Cell. 1989. V. 57. P. 753-761.

63. Cook H.J., Hindley J. Cloning of human satellite 3 DNA. Different component are on different chromosomes //Nucl. Acids Res. V.6. P. 3177- 3197.

64. Cook P.R., Brazell I.A. Jost E. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA // J. Cell Sci. 1976. V. 22. P. 303-324.

65. Cooper D., Yoessoufian H. The CpG dinucleotide and human genetic disease // Hum. Genet. 1986. V. 78. P. 151-155.

66. Cote B.D., Uhlenbeck O.C., Steffensen D.M. Quantitation of in situ hybridization of ribosomal ribonucleic acids to human diploid cells // Chromosoma. 1980. V. 80. P. 349-357.

67. Croce C.M., Talavera A., Basilico C., Miller O.J. Suppression of production of mouse 28S ribosomal RNA in mouse-human hybrids segregating mouse chromosomes // PNAS USA. 1977. V. 74. P. 694-697.

68. Cutler R.G. Redundancy of information content in the genome of mammalian species as a protective mechanism determining aging rate // Mechanisms of ageing and development. 1973/1974. V. 2. P. 381-408.

69. Dale R.M.K., Martin E., Livingston D.C., Ward D.C. Direct covalent mercuration of nucleodides and polynucleotides // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 2447-2457.

70. Delgado S., Gomes M., Bird A.P. Antequera F. Initiation of DNA replication at CpG island in mammalian chromosomes // EMBO J. 1998. V. 17. P. 2426-2435.

71. Derenzini M., Farabegoli F., Trere D. Localization of DNA in the fibrillar components of the nucleolus. A cytochemical and morphometric study // J. Histochem. Cytochem. 1993. V. 41. P. 829-836.

72. Derenzini M., Pession A., Licastro F et al. Electron-microscopical evidence that ribosomal chromatin of human circulating lymphocytes is devoid of histones // Exp. Cell Res. 1985. V. 157. P. 50-62.

73. Derenzini M., Viron A., Puvion-Dutilleul F. The Feulgen-like osmium ammine reaction as a tool to investigate chromatin structure in thin sections // J. Ultras. Res. 1982. V. 80. P. 133-147.

74. Diala E.S., Cheah M.S., Rowitch D., Hoffman R.M. Extent of DNA methylation in human tumor cells // J. Natl. Cancer Inst. 1983. V. 71. P.755-764.

75. Dittes H., Bross K., Krone W., Schmid M., Vogel W. Biochemical and cytogenetic studies on the nucleolus organizing regions of man // Humangenet. 1975. V. 26. P. 47-59.

76. Doscocil J., Sorm F. Distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine sequence of deoxyribonucleic acids // Biochim. Biophys. Acta. 1962.V.5. P. 953-959.

77. Evans H. J., Buckland R.A., Pardue M.L. Location of the genes coding for 18S and 28S ribosomal RNA in the human genome // Chromosoma. 1974. V.48. P. 405-426.

78. Fakan S., Hancock R. Localization of newly-synthesized DNA in a mammalian cell as visualized by high resolution autoradiography // Exp.Cell Res. 1974. V. 83. P.95-102.

79. Feil R., Charlton J., Bird A.P., Walter J., Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: impruved protocol for bisulphite genomic sequencing // Nucleic Acids Res. 1994. V. 25. P. 695-696.

80. Ferguson-Smith M.A. The site of nucleolus formation in human pachytenechromosomes // Cytogenetics. 1964. V. 3. P. 124-134.

81. Ferguson-Smith M.A., Handmaker S.D. The assocciation of satellited chromosomes with specific chromosomal regions in cultured human somatic cells // Ann. Hum. Genet. 1963. V. 27. P. 143-156.

82. Ferguson-Smith M.A., Handmaker S.D. Observation on the satellited human chromosomes // Lancet J. 1961. P 638-640.

83. Ferraro M., Lavia P. Differential gene activity visualized on sister chromatids after replication in the presence of 5-azacytiline // Chromosoma. 1985. V. 91. P. 307-312.

84. Ferraro M., Lavia P. Activation of human ribosomal genes by 5-azacytidine // Exp. Cell Res. 1983.V.145. P. 452-457.

85. Ferraro M., Prantera G. Human NORs show correlation between transcriotional activity, Dnase I sensitivity, and hypomethylation // Cyt. Cell Genet. 1988. V. 47. P. 58-61.

86. Fey E.G., Wan K.M., Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold: Three-dimensional organization and protein composition // J. Cell Biol. 1984. V. 98. P. 1973-1984.

87. Foster A.C., Meinnes J.L., Skingle D.C., Symons R.H. Non-radioactive hybridization probes prepared by the chemical labelling of DNA and RNA with a novel reagent, photobiotin // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 745-761.

88. Frits L.R., Smerdon M.J. Repair of UV damage in actively transcribed ribosomal genes // Biochemistry . 1995. V. 34. P. 13117-13124.

89. Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul C.L. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands // PNAS USA. 1992. V. 89. P. 1827-1831.

90. Fuks F., Burgers W.A., Brehm A., Hughes- Davies L., Kouzarides T. DNA methyltransferase Dmntl associated with histone deacetylase activity // Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 88-91.

91. Gaubatz J., Cutler R.G. Hybridization of ribosomal RNA labeled to high specific radioactivity with dimethyl sulfate // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 760-765.

92. Gaubatz J., Prashad N., Cutler R.G. Ribosomal RNA gene dosage as a function of tissue and age for mouse and human // Biochim. Biopsys. Acta.1976. V. 418. P. 358-375.

93. Gaudet F., Talbot D., Leonard H., Jaenisch R. A shot DNA methyltransferase isoform restores methylation in vivo // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 32725-32729.

94. Gazit B., Cedar H. Active genes are sensitive to deoxyribonuclease 1 during metaphase // Science. 1982. V. 217. P. 648-650.

95. Gebeyehu G., Rao P.Y., SooChan P., Simms D., Klevan L. Novel biotinylated nucleotide analogs for labeling and colorometric detection of DNA // Nucl. Acid Res. 1987. V. 15. P. 4513-4534.

96. Getzenberg R.H., Plenta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. Nuclear structure and the three-dimensional of DNA // J. Cell Biochem. 1991. V. 47. P. 289-299.

97. Gillam I.C., Tener G.M. N4-(6-aminohexyl)cytidine and deoxycytidine nucleotides can be used to label DNA // Anal. Chem. 1986. V. 157. P. 199-207.

98. Goessens G. Nucleolar structure // Int. Rev. Cytol. 1984. V. 87. P. 107-158.

99. Goessens G. Relation between fibrillar centres and nucleolus-associated chromatin in Ehrlich tumor cells // Cell Biol. Int. Rep. 1979. V. 3. P. 337-343.

100. Goessens G., Lepoint A. The nucleolus-organizing regions (NORs): recent data and hypotheses // Biol. Cell. 1979. V. 35. P. 211-220.

101. Gonzalez I.L., Schmickel R.D. The human 18S ribosomal RNA gene: evolution and stability // Am/ J/ Hum/ Genet/ 1986. V. 38. P. 419 -427.

102. Goodman A.B. Three independent lines of evidence suggest retinoids as causal to schizophrenia // PNAS USA. 1998. V.95. P. 7240-7244.

103. Goodman AB. Chromosomal locations and modes of action of genes of the retinoid (vitamin A) system support their involvement in the etiology of schizophrenia // Am J Med Genet. 1995. V. 60. P. 335-48.

104. Goodpasture C., Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining // Chromosoma. 1975. V.53. P. 37-50.

105. Gosh S., Paweletz N. Localization of ribosomal cistrons at the ultrastructural level by in situ hybridization technique // Cell Biol. Int. Rep. 1990. V. 14. P. 551-525.

106. Granick D. Nucleolar necklaces in chick embryo fibroblast cells. II. Microscope observations of the effect of adenosine analogues on nucleolar necklace formation.// J.Cell Biol. 1975. V. 65. P. 418-427.

107. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. Mutation in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 48554878.

108. Grimm S., Baeuerle P.A. The inducible transcription factor NF-kB; structure function relationship of its protein subunits // Biochem. J.1993.V. 290.297-308.

109. Grippo P., Iaccarino M., Parisi E., Scarano E. Methylation of DNA in developing sea urchin embryos // J. Mol. Biol. 1968. V.36. P. 196-208.

110. Gustafson T.A., Taylor A., Kedes L. DNA bending is induced transcription factor that interacts with the human c-FOS and oc-actin promoters // PNAS USA. 1989. V. 86. P. 2162-2166.

111. Haaf T., Ward D.C. Inhibition of RNA polymerase II transcription causes chromatin decondensation, loss of nucleolar structure, and dispersion of chromosomal domains // Exp. Cell Res. 1996. V. 224. P. 163-173.

112. Haaf T., Hayman D.L., Schmid M. Quantitative determination of rDNA transcription units in vertebrate cells // Exp. Cell Res. 1991. V. 193. P. 78-86.

113. Hadjiargyrou M., McDowell K.A., Henderson A.S. A trasfected human ribosomal RNA gene is present in the nucleolus of human cells // Cytogenet. Cell Genet. 1994. V. 66. P. 58-62.

114. He D., Nickerson J.A., Penman S. Core filaments of the nuclear matrix // J.Cell Biol. 1990. V. 110. P. 569-580.

115. Henderson A.S., AtwoodK.C. Satellite-association frequency and rDNA content of a double -satellited chromosome // Hum. Genet. 1976. V.31. P. 113-115.

116. Henderson A.S., Warburton D., Atwood K.C. Location of ribosomal DNA in the human chromosome complement // PNAS USA. 1972. V. 69. P. 3394-3398.

117. Hendrich B., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins //Mol. Cell Biol. 1998. V.18 P.6538-6547.

118. Hendrich B., Hardeland U., Ng H.H., Jiricny J., Bird A. The thymidine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG-site // Nature. 1999. V. 401. P. 301-304.

119. Hernandez-Verdun D., Derenzini M., Bouteille M. The morphological relationship in electron microscopy between NOR-silver proteins and intra-nucleolar chromatin // Chromosoma. 1982. V. 85. P. 461-473.

120. Holliday R., Ho T. Evidence for gene silencing by DNA methylation in normalhuman diploid fibroblasts // Somat. Cell Mol. Genet, 1995, V. 21, P. 215-218.

121. Holliday R, Ho T. Gene silencing in mammalian cells by uptake of 5-methyl deoxicytidine 5'phosphate // Somat. Cell Mol. Genet, 1991, V. 17, P. 537-542.

122. Howell W.M, Denton T.E, Diamond J.K. Differential staining of the satellite regions of human acrocentric chromosomes // Experientia. 1975. V. 31. P. 260-262.

123. Hozak P, Novak J.T, Smetana K. Three-dimensional reconstructions of nucleolus-organizing regions in PHA-stimulated human lymphocytes // Biol. Cell. 1989. V. 66. P. 225-233.

124. Hozak P, Hassan A.B, Jackson D.A, Cook P.R. Visualization of replication factories attached to a nucleoskeleton // Cell. 1993. V. 73. P. 361-373.

125. Hozak P, Sasseville A.M.J, Raymond Y, Cook P.R. Lamin proteins form an internal nucleoskeleton as well as a peripheral lamina in human cells // J.Cell Sci. 1995. V. 108. P. 635644.

126. Hozak P, Schoefer C, Sylvester J et al. A study on nucleolar DNA: isolation of DNA from fibrillar components and ultrastructural localization of different DNA probe // J. Cell Sci. 1993. V. 104. P. 1199-1205.

127. Hsieh C.L. In vivo of murine de novo methyltransferase, Dmnt3a and Dmnt3b// Mol. Cel. Biol. 1999. V.19. P. 8211-8218.

128. Hubbell H.R. Silver staining as an indicator of active ribosomal genes // Stain Technology. 1985. V. 60. P. 285-294.

129. Hume D.A., Weidemann M.J.Mitogenic lymphocyte transformation. 1980. Elsevier.Amsterdam.

130. Jablonski E., Moomaw E.W., Tulles R.H., Ruth J.L. Preparation of oligonucleotide-alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probe // Nucl. Acids Res. 1986. V. 14. P.6115-6129.

131. Jackson D.A., Cook P.R. Replication occurs at a nucleoskeleton // EMBO J.1986. V. 5. P. 1403-1410.

132. Jackson D.A., Cook P.R. Transcription occurs at a nucleoskeleton // EMBO J. 1985. V. 4. P. 919-925.

133. Jackson D.A. Chromatin domains and nuclear compartments: establishing sites of gene expression in eukaryotic nuclei // Mol. Biol. Rep. 1997. V. 24. P. 209-220.

134. Jackson D.A., Cook P.R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat // EMBO J. 1988. V. 7. P. 3667-3677.

135. Janssen O, Wesselborg S, Kabelitz D.Immunosuppression by OKT3-induction of programmed cell death (apoptosis) as a possible mechanism of action// Transplantation. 1992. V. 53. P. 233-234.

136. Jeanpierre M. A rapid method for the purification of DNA from blood. // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 9611.

137. Jelinek W.R., Toomey T.P., Leinwand L., Duncan C.H., Biro P.A., Choudary P.V., Weissman S.M., Rubin C.M., Houck C.M., Deininger P.L., Schmid C.W. Ubiquitous, interspersed repeated sequences in mammalian genomes // PNAS USA. 1980. V. 77. P. 1398-1402.

138. Jimenez-Garcia G., Seguravaldez M., Ochs R. et al Electron microscopic localization of ribosomal DNA in rat liver nucleoli by non isotopic in situ hybridization // Exp. Cell Res. 1993. V. 207. P. 220-225.

139. Johnston B.H., Rich A. Chemical probes of DNA conformation: detection of Z-DNA t nucleotide resolution // Cell. 1985. V. 42. P. 713-724.

140. Jones P., Cannon M The new epidemiology of schizophrenia // Psychiatr. Clin. North Am. 1998. V. 21(1). P. 1 -25.

141. Jones P.A., Gonzalgo M.L. Altered DNA methylation and genome instability: a new pathway to cancer? // PNAS USA. 1997. V. 94. P. 2103-2105.

142. Jones P.L., Veenstra G.J., Wade P.A., Vermaak D., Kass S.U., Landsberger L., Strouboulis J., Wolff A.P. Methylated DNA and MeCP2 recruit deacetylase and repress transcription // Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 187-191.

143. Kafri T., Ariel M., Brandeis M., Shemer R., Urven L., McCarrey J., Cedar H., Razin A. Developmental pattern of gene specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line // Genes Dev. 1992. V.6. P. 705-715.

144. Kafri T., Gao X., Razin A. Mechanistic aspects of genom-wide demethylation in the preimplantation mouse embryos // PNAS USA. 1993. V. 90. P. 10558-10562.

145. Kass S.U., Landsberger N., Wolff A.P. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation // Curr. Biol. 1997. V.7. p.157-165.

146. Kass S.U., Pruss D., Wolffe A.P. How does DNA methylation repress transcription? // TIG. 1997. V. 13. P. 444-449.

147. Kavwasaki K., Minochima S., Kudoh J., Fukuyama R., Shimizu N. Methylation status of ribosomal RNA gene clusters in the flow-sorted human acrocentric chromosom // Mamm. Genome. 1992. V.3. P. 173-178.

148. Keppel F. Transcribed human ribosomal RNA genes are attached to the nuclear matrix // J. Mol. Biol. 1986. V. 187. P. 15-21.

149. Koch J., Gregersen N., Kolvraa S., Bolund L. The use of biotinylated hybridization probes for routine analysis of unique sequences in human DNA// Nucl. Acids Res. 1986. V. 14. P. 7133.

150. E., Beard C., Jaenich R. Role for DNA methylation in genomic imprinting //Nature. 1993. V.366. P. 362-365.

151. Machwe A., Orren D.K., Bohr V.A. Accelerated methylation of ribosomal RNA genes during the cellular senescence of Werner syndrome fibroblasts // FASEB J. 2000. V. 14. P. 17151724.

152. Macleod D., Charlton J., Mullins J., Bird A. Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island // Gen Dev. 1994. V. 8. P. 2282-2292.

153. Maleod D., Ali R.R., Bird A. An alternative promoter in the mouse major histocompatibility complex class II I-A( gene: implication for the origin of CpG islands // Mol. Cel. Biol. 1998. V. 18. P. 4433-4443.

154. Mancini M.A., He D., Ouspenski I.I., Brinkley B.R. Dynamic continuty of nuclear and mitotic matrix proteins in the cell cycle // J.Cell Biochem. V.62. P. 158-164.

155. Marin M., Karis A., Visser F., Glosveld F., Philipsen S. Transcription factor Spl is essential for early embrionic development but dispensable for cell growth and differentiation // Cell. 1997 .V. 89. P. 619-628.

156. Marx J. Cell death studies yield cancer clues// Science. 1993. V. 259. P. 760-761.

157. Matsuo K., Silke J., Georgiev 0., Marti P., Giovannini N., Rungger D. An embrionic demethylation mechanism involving binding of transcription factors to replicating DNA // EMBO J. 1998. V. 17. P. 1446-1453.

158. Mattern K.A., van Coethem R.E., de Jong L., van Driel R. Major internal nuclear matrix proteins are common to different human cell types // J.Cell Biochem. 1997. V. 65. P. 42-52.

159. Matthew J.A., Kricka L.J. Analytical strategies for the use of DNA probes // Anal. Biochem. 1988. V. 169. P. 1-25.

160. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages // Meth. Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

161. McDowell K.A., Hadjiargyrou M., Patsalis P., Henderson A.S. Transcription of rDNA is essential for satellite association // Cytogenet. Cell Genet. 1994. V. 66. P. 63-67.

162. Meehan R., Lewis J., Cross S., Nan X., Jeppesen P., Bird A.P. Transcriptional repression by methylation of CpG // J.Cell Sci. Suppl. 1992. V.16. P. 9-14.

163. Meehan R.R, Lewis J.D, Bird A.P. Characterization of MeCP2, a vertebrate DNA binding protection with affinity for methylated DNA // Nucl.Acids Res.1992. V.20. P.5085-92.

164. Meehan R.R, Lewis J.D, McKay S, Kleiner E.L, Bird A'.P. Identification of mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpG // Cell. 1989. V.58. P. 499507.

165. Miller D.A, Breg W.R, Warburton D, Dev V.G, Miller O.J. Requlation of rRNA genes expression in a human 14p+ marker chromosome // Hum.Genet. 1978. V. 43. P. 289-297.

166. Miller D.A, Dev V.G, Tantravahi R, Miller O.J. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse human somatic hybrid cells // Exp. Cell Res. 1976. V. 101. P. 235-243.

167. Mirre C, Stahl A. Peripheral RNA syntesis of fibrillar centres in nucleoli of Japanese quail oocytes and somatic cells // J. Ultrastruct Res. 1978. V. 64. P. 377- 387.

168. Monk M, Boubelic M, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cells lineages during mouse embryo development // Development. 1987. V.99.P. 371-382.

169. Mosgoeller W, Schofer C, Wesierska-Cadek J, Steiner M, Muller M, Wachtier F. Ribosomal gene transcription is organized in foci within nucleolar components // Histochem. Cell Biol. V. 109. P. 111-118.

170. Mosgoller W, Shofer C, Derenzini M. et al. Distribution of DNA in human Sertoli cell nucleoli // J. Histochem. Cytochem. 1993. V. 41. P. 1487-1493.

171. Moyne G. Methods in ultrastructural cytochemistry of the cell nucleus // Prog. Histochem. Cytochem. 1980. V. 13. P. 1-70.

172. Mummaneni P, Walker K.A, Bishop P.L, Turker M.S. Epigenetic geneinactivation induced by a cis-acting methylation center // J. Biol. Chem, V.270.P. 788-792.

173. Nagata Y, Yokota H, Kosuda О, Yokoo К, Takemura К, Kikuchi T.Quantification of picogram levels of specific DNA immobilized in microtiter wells// FEBS Lett. 1985. V. 183. P.379-82.

174. Nakayasu H., Berezney R. Nuclear matrins: identification of the major nuclear matrix proteins // PNAS USA. 1991. V. 88. P. 10312-10316.

175. Nan X., Campoy J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin // Cell. 1997. Y.88. P. 1-11.

176. Nan X., Cross S, Bird A. Gene silencing by methyl-CpG-binding proteins // Novartis Found Symp. 1998. V.214. P.6-16.

177. Nan X., Tate P., Li E., Bird A. DNA methylation specifies chromosomal localization of MeCP2 // Mol. Cell Biol. 1996. V.16 P. 414-421.

178. Newell-Price J., Clark A.J.L., King P. DNA methylation and silencing of gene expression // ТЕМ. 2000. V. 11. P. 142-148.

179. Ng HH., Jeppesen P., Bird A. Active repression of methylated genes by the chromosomal protein MBD1 // Mol. Cell Biol. 2000. V.20 P. 1394-1406.

180. Ochs R.L., Smetana K. Fibrillar center distribution in nucleoli of PHA-stimulated human lymphocytes // Exp. Cell Res. 1989. V. 184. P. 552-557.

181. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferase Dnmt3a and Dmnt3b are essencial for de novo methylation and mammalian development // Cell. 1999. V. 99. P. 247257.

182. Olert J., Sawaitzki G., Klin H., Gebauer J. Cytological and histochemical studies on the selective silver staining of nucleolus organizer regions (NOR) // Histochem. 1979. V. 60, P. 9199.

183. Olins A., Moyer B., Kim S.M. et al. Synthesis of a more stable osmium ammine electron-dense DNA stain // J. Histochem. Cytochem. 1989. V. 37. P.395-398.

184. Owen-Schaub L.B., Yonehara S., Crump III W.L., Grimm E.A. DNA fragmentation and cell death is selectively triggered in activated human lymphocytes by Fas antigen engagement// Cell Immun. 1992 V. 40. P. 197-205.

185. Pfeifer G.P., Spiess E., Grunwald S., Boehm T.L., Drahovsky D. Mouse DNA-cytosine-5-methyltransferase: sequence specificity of the methylation reaction and electron microscopy of enzyme-DNA complexes // EMBO J. 1985. V. 4. P. 2879-2884.

186. Puvion-Dutilleul F., Bachellerie J.P., Puvion E. Nucleolar organization of HeLa cells as studied by in situ hybridization // Chromosoma. 1991. V. 100. P. 395-409.

187. Puvion-Dutilleul F., Mazan S., Nicoloso M. Et al. Alterations of nucleolarultrastructureand ribosome biogenesis by actinomycin D. Implications for U3 SnRNP function // Eur. J. Cell Biol. 1992. V. 58. P. 149-162.

188. Ramsahoye B.H., Biniszkiewicz D., Lyko F., Clark V., Bird A.P., Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a // PNAS USA. 2000. V.97. P. 5237-5242.

189. Raska J., Dundr M., Koberna K. et al. Does the synthesis of ribosomal RNA take place within nucleolar fibrillar centers or dense fibrillar components? A critical appraisal // J. Struct. Biol. 1995. V. 114. P.1-22.

190. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O., Gromova I., Georgiev G.P. Structural-functional organization of chromosomal DNA Domains // Cold Spring Harb. Symp. Quantit. Biol. 1993. V. LVIII. P. 25-35.

191. Recher L., Whitescarver J., Briggs L. The fine structure of a nucleolar constituent // J. Ultrastruct. Res. 1969. V. 29. P. 1-14.

192. Reimer G., Rose K.M., Scheer U., Tan E.M. Autoantibody to RNA polymerase I in scleroderma sera. // J. Clin. Invest. 1987. V. 79(1). P. 65-72.

193. Reisfeld A., Rotthenberg J.M., Bayer E.A., Wilchek M. Nonradioactive hybridization probes prepared by the reaction of biotin hydrazide with DNA // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1987. V. 142. P. 519-526.

194. Renz M., Kurz C. A colometric method for DNA hybridization // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. P. 3435-3444.

195. Richardson R.W., Grumport R.I. Biotin and fluorescent labeling of RNA using T4 RNA ligase// Nucl. Acids Rep. 1983. V. 11. P. 6167-6184.

196. Rigby P.W.G., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase III J. Mol. Biol. 1977. V. 113. P. 237-241.

197. Roussel P., Sirri V., Hernandez-Verdun D. Quantification of Ag-NOR proteins using Ag-NOR staining on Western blots // J. Histochem. Cytochem. 1994. V. 42. P. 1513-1517.

198. Sakai K., Ohta T., Miroshima S., Kudon J., Wang Y., de Jong P.J., Shimidzu N. Human ribosomal gent cluster : Identification of the proximal end containing a novel tandem repeat sequence// Genomics. 1995. V. 26. P. 521-526.

199. Sakamoto H., Traincard F., Vo-Quang T., Ternynck T., Guesdon J.L., Avrameas S. 5-Bromodeoxyuridine in vivo labelling of M13 DNA, and its use as a non-radioactive probe for hybridization experiments // Mol. Cell Probes. 1987. V. 1. P. 109-120.

200. Samdrook J., FritschE.E., Maniatis T. Melecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, N.Y. (1989).

201. Saragosti S., Moyne G., Yaniv M. Absence of nucleosomes in a fraction of SV 40 chromatin between the origin of replication and the coding for late leader RNA // Cell. 1980. V. 20. P.65-73.

202. Scheer U., Hugle B., Hazan R., Rose K.M. II J.Cell Biol. 1984. V. 99. P. 672-679.

203. Scheer U., Rose K. Localization of RNA polymerase I in interphase cells and mitotic chromosomes by light and electron microccopic immunocytochemistry // PNAS USA. 1984. V. 81. P. 1431-1435.

204. Scherberg N.H., Refetoff S. Hybridization of RNA labelled with 125 I to high specific activity // Nat. New Biol. 1973. V. 242. P. 142-145.

205. Schmickel R.D. Quantitation of human ribosomal DNA: hybridization of human DNA with ribosomal RNA for quantitation and fractionation // Pediatr. Res. 1973. V. 7. P. 5-12.

206. Schofer C., Weipoltshammer K., Almeder M., Wachtler F. Arrangement of individual human ribosomal DNA fragments on stretched DNA fibers // Histochem. Cell Biol. 1998. V. 110. P. 201-205.

207. Schwartzman RA, Cidlowski JA. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death// Endocr. Rev. 1993. V. 14. P. 133-151.

208. Schwarzacher H.G., Mikelsaar A. V., Schnedl W. The nature of Ag-Staining of nucleolus organizer regions // Cytogen. Cell Genet. 1978. V. 20. P. 24-39.

209. Schwarzacher H.G., Wachtler F. The functional significanct of nucleolar structure //Ann. Genet. 1991. V. 34. P. 151-160.

210. Selker E.U. DNA methylation and chromatin structure: a view from below //Trends Biochem. Sei. 1990. V. 15. P. 103-107.

211. Shapiro R., Weisgras J.M. Bisulfite catalized transamination of cytosine and cytidine // Biochem. Biophys. Res.Comm. 1970. V. 40. P. 839-843.

212. Shaw P.J., Jordan E.G. The nucleolus // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1995. V. 11. P. 93-121.

213. Singer J., Roberts-Ems J., Luthardt F.W., Riggs A.D. Methylation of DNA in mouse early embryos, tetratocarcinoma cells and adult tissues of mouse and rabbit // Nucleic Acids Res., 1979, V.7, P.2369-2385.

214. Sirri V., Roussel P., Gendron M.C., Hernandez-Verdun D. Amount of the two major Ag-NOR proteins, nucleolin, and protein B23 is cell-cycle dependent // Cytometry. 1997. V. 28. P. 147156.

215. Sirri V., Roussel P., Trere D., Derenzini M., Hernandez-Verdun D. Amount variability of total and individual Ag-NOR protein in cell stimulated to proliferate // J. Histochem. Cytochem. 1995. V. 43. P. 887-893.

216. Smith H.C., Rothblum L.I. Ribosomal DNA sequences attached to the nuclear matrix // Biochem. Genet. 1987. V. 25. P. 863-879.

217. Sozansky O.A., Zakharov A.F., Benjsh V.A. Intercellular NOR-Ag -variability in man. I. Technical improvements and marker acrocentric chromosome// Hum. Genet. 1984. V. 68. P. 299-302.

218. Spector D.L., Ochs R.L., Busch H. Silver staining, immunofluorescence, and immunoelectron microscopic localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23. // Chromosoma. 1984. V. 90. P. 139-148.

219. Spitkovsky D.M., Talyzina T.A. The evolutionary reserve cell concept and model of cellular response induced by low doses of radiation // Radiat. Prot. Dosim. 1995. V. 62. P. 23-26.

220. Stephanova E., Stancheva R., Avramova Z. Binding of sequences from the 5'- and 3'-nontranscribed spacers of the rat rDNA locus to the nucleolar matrix // Chromosoma. 1993. V. 102. P. 287-295.

221. Stirzaker C., Millar C.L., Paul C.L., Warnecke P.M., Harrison J et al. Extensive DNA methylation spanning the R6 promoter in retinoblastoma tumors // Cancer Res. 1997. V. 57. P. 2229-2237.

222. Struhl K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 599-606.

223. Sved J., Bird A. The expected equilibrium of the CpG dinucleotide in vertebrate genomes under a mutation model // PNAS USA. 1990. V.87. P. 4692-4696.

224. Syvanen A.C., Tchen P., Ranki M., Soderlund H. Time-resolved fluorometry: a sensitive method to quantify DNA-hybrids //Nucl. Acids Res. 1986. V. 14. P. 1017-1028.

225. Takahhashi T, Arakawa H, Maeda M, Tsuji A. A new biotinylating system for DNA using biotin aminocaproyl hydrazide and glutaraldehyde // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 48994900.

226. Tantravahi R, Miller D.A, Miller OJ. Ag- staining of nucleolus organizer regions of chromosomes after Q-, C-, G- or R-banding procedures // Cytogenet. Cell Genet. 1977. V. 18. P. 364-36.

227. Tantravahi U, Breg W.R, Wertelecki V, Erlanger B.F, Miller O.J. Evidence for methylation of inactive human rRNA genes in amplified regions // Hum. Genet. 1981. V. 56. P. 315-320.

228. Tate P.H, Bird A.P. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression // Curr. Opin. Genet. Dev. 1993. V.3. P. 226-231.

229. Tchen P, Fuchs R.P.P, Sage E, Leng M. Chemically modified nucleic acids as immunodetectable probes in hybridization experiments // PNAS USA. 1984. V. 81. P. 34663470.

230. Temper V, Razin A, Cedar H. Spl element protect a CpG island from de novo methylation // Nature. 1994. V. 371. P. 435-438.

231. Thiry M. //Highly sensitive immunodetection of sections with exogeneous terminal deoxynucleotidyl transferase and nonisotopic nucleotide analogues // J. Histochem. Cytochem. 1992. V. 40. P. 411-419.

232. Thiry M. // Nucleic acid compartmentalization within the cell nucleus by in situ transferase-immunogold techniques // Microscopy Res. Techn. 1995. V. 31. P. 4-21.

233. Thiry M. Ultrastructural detection of DNA within the nucleolus by sensitive molecular immunocytochemistry//Exp. Cell Res. 1991. V. 200. P. 135-144.

234. Thiry M, Goessens G. The nucleolus during the cell cycle // R.G. Landes Company. Austin. 1996.

235. Thiry M, Goessens G. Ultrastructural study of the relationships between the various nucleolar components in Ehrich tumour and Hep-2 cell nucleoli after acetylation // Exp. Cell Res. 1986. V. 164. P. 232-242.

236. Thiry M., Goessens G. Where, within the nucleolus, are the rRNA genes located? // Exp.Cell Res. 1992. V. 200. P. 1-4.

237. Thiry M., Muller S. Ultrastructural distribution of histones within Ehrlich tumor cell nucleoli. A cytochemical and immunocytochemical study // J. Histochem. Cytochem. 1989. V. 37. P. 853-862.

238. Thiry M., Thiry-Blaise L. In situ hybridization at the electron microscope level: an improved method for precise localization of ribosomal DNA and RNA // Eur. J. Cell Biol. 1989. V. 50. P.235-243.

239. Thiry M., Thiry-Blaise L.Locating transcribed and nontranscribed rDNA spacer sequences within the nucleolus by in situ hybridization and immunoelectron microscopy // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 11-15.

240. Tureskey R.J. DNA Adducts of heterocyclic aromatic amines, arylazides and 4-nitroquinoline 1-oxide // DNA adducts. Ed. Hemminki K., Dipple A. et al., Int. Agenc. Res. Cane. Lyon. 1994. P. 217-228.

241. Turker M.S., The establishment and maintenance of DNA methylattion patterns in mouse somatic cells // Cancer Biol. 1999. V. 9. P. 329-337.

242. Tweedie S., Charlton J., Clark V., Bird A. Methylation of genomes and genes at the invertebrate-vertebrate boundary//Mol.Cell Biol. 1997. V.17. P. 1469-1475.

243. Tykocinski M.L., Max E.C. GC clusters in MHC genes and 5' demethylated genes // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 4385 4385.

244. Van Lier J.J., Smits M.T., Buck H.M. B-Z transition in methylated DNA // Eur. J. Biochem. 1983. V. 132. P. 55-62.

245. Vanyushin B.F., Tkacheva S.G., Belozersky A.N. Rare base in animal DNA // Nature. 1970. V.225.P. 948-951.

246. Vassetzky Y., Hair A., Mechali M. Rearrangement of chromatin domains durind development in Xenopus // Genes Dev. 2000. V. 14. P . 1541-1552.

247. Vermes I, Haanen C. Apoptosis is and programmed cell death in health and disease //Adv Clin Chem. Review. 1994. V. 31. P. 77-246.

248. Vertino P.M., Chiu Yen R.W., Gao J., Baylin S.B. De novo methylation of CpG island Sequences in human fibroblasts overexpressing DNA (cytosine-5)-methyltransferasee // Mol. Cell Biol. 1996. V. 16. P. 4555-4565.

249. Viscidi R.P., Connelly C.J., Yolken R.H. Novel chemical method for the preparation ofnucleic acids for non-isotipic hybridization // J. Clin. Microbiol. 1986. V. 23. P. 311-317.

250. Visintin R., Amon A. The nucleus: the magician's hat cell cycle tricks // Current opinion in cell biology. 2000. V. 12. P. 372-377.

251. Wachtler F., Ellinger A., Schwarzacher H.G. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphoctyes // Cell Tissue Res., 1980. V. 213(2). P. 351-360.

252. Wachtler F., Hopman A.H.N., Wiegant J., Schwarzacher H.G. On the position of nucleolus organizer regions (NORs) in interphase nucleoli.Studies with a new, non-autoradiographic in situ hybridization method // Exp. Cell Res. 1986. V. 167. P. 227-240.

253. Wachtler F., Mosgoller W., Schwarzacher H. Electron microscopic in situ hybridization and autoradiographic: localization and transcription of rDNA in human lymphocyte nucleoli // Exp. Cell Res. 1990. V. 187. P. 346-348.

254. Wachtler F., Musil R. Nucleoli visualized by silver staining combined with a new RNA-specific fluorochrome // Stain Technol. 1979. V. 54. P.265-268.

255. Warburton D., Atwood K.C., Henderson A.S. Variation in the number of genes for rRNA among human acrocentric chromosomes: correlation with frequency of satellite association // Cytogenet. Cell Genet. 1976. V. 17. P. 221-230.

256. Warburton D., Henderson A.S. Sequential silver staining and hybridization in situ on nucleolus organizing regions in human cells // Cytogenet. Cell Genet. 1979. V. 24. P. 168-175.

257. Warnecke P.M., Binizskiewicz D., Jaenisch R., Frommer M., Clark S.J. Sequence- specific methylation of the mouse HI9 gene in embryonic cells deficient in the Dmnt-1 gene // Dev. Genet. 1998. V. 22. P. 111-121.

258. Warnecke P.M., Mann J.R., Frommer M., Clark S.J. Bisulphite sequencing in preimplantation embryos: methylation profile of the upstream region of the mouse imprinted H19 gene // Genomics. 1998. V. 51. P. 182-190.

259. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation // Science. 1976. V. 193(4256). P. 848-856.

260. Weipoltshameer K., Schofer C., Wachtler, Hozak P. The transcription unit of ribosomal genes is attached to the nuclear skeleton // Exp. Cell Res. 1996. V. 227. P. 374-379.

261. Wilson V.L., Jones P.A. DNA methylation decreases in aging but not in immortal cells // Science. 1983. V. 220. P. 1055-1057.

262. Xu G.L., Bestor T.H., Bourc'his D., Hsieh C.L., Tommerup N., Bugge M.B., Qu X., Russo J.J., Viegas Pequignot E. Chromosome instability and immunodeficiency Syndrome caused by mutation in a DNA methyltransferase gene // Nature. V. 402. P. 187-191.

263. Yabusaki K.K., Isaacs S.T., Gamper H.B. 1985. Ir. World Patent Application 02628.

264. Yen R.W., Vertino P.M., Nelkin B.D., Yu J.J., el-Deiry W., Cumaraswamy L.G.G., Trask B.J., Celano P., Baylin S.B. Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase //Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P.2287-2291.

265. Young B.D., Hell A., Birnie G.D. A new estimate of human ribosomal gene number // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 454. P. 539-548.

266. Zatsepina O.V., Voit R., Grummt I., Spring H., Semenov M.V., Trendelenburg M. F. The RNA polymerase I- specific transcriptionfactor UBF is associated with transcriptionally active and inactive ribosomal genes // Chromosoma. 1993. V. 102. P. 599-611.