Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДВИЖЕНИЯ РЕСНИЧЕК И ЖГУТИКОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДВИЖЕНИЯ РЕСНИЧЕК И ЖГУТИКОВ"

На правах рукописи АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А. Н. Баха

БУРНАШЕВА Софья Абдурахмановна

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДВИЖЕНИЯ РЕСНИЧЕК И ЖГУТИКОВ

(Спвциальнвоть—Апологическая химия 03.00.04)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1973

МАДШШ ÜXSI: ссср

ОРДЕНА МНШЛ ИНСТИТУТ БКСШЇШ11 к и. А.Н.БЛХЛ

На правок рукописи

БЇРНАШЕВА СТОЬЯ ЛБ Дї PAXLf Л H ОБ Е І Л

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И Т О JÍÍ I fЛІ Ч £ÎCfï И К ÛCiifôl! 753ЙІШИ РІЇС1ШЧЕК И Ш'ТШЇГВ

tСпециальность - биологичоскэя хииия 03.00.0i)

АВТОРЕФЕРАТ дассертэции на соискешіє ученоіі степени док і э pa биологических іюук

.. . ■ . ..j i и >r 1

Москво, 1973 г.

Ребото выполнена в Лаборатории биохимии движения Ордена Ленина Института бяохииии иы. А.Н.Баха АН СССР

Научный консультант - доктор биологических1 наук, профессор М.Н.Лщб:1иовз-Энгел.ъгардг.

Официальные оппоненты: Доктор (дологических наук Б.Ф.Поглазоз Доктор биологических наук М.М.Заалиивили Доктор биологических наук В.Л.Гилев.

На официальный отзыв работе направлена в Институт биофизики АН СССР.

Автореферат разослан " " О¡ґ. Пу1973 г. Защита диссертации состоится " ^. 1Э78 г. на заседании Ученого Совета Ордена Ленина Института бнозошии им.А.Н.Баха АН СССР (.Москва, В-7І, Ленинский проспект,33).

С диссертацией ножно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь кандидат бтлотческхх наук

/Н.Н.Дъячков/.

Принятые сонpaцения

ЛТФ - а де ноз ин три фо ефо р н ая кислота АД5 - аденозішдкфосфориоя кислота АМФ - адекилосая кислота Л15а?а - аденозинтрифосфатаза 8 - енгстрец

ГТФ - г\'шіозинтркфосфоркгя кислота ГДФ - гуонозшіди фосфорная кислота ИИ - инозинтрифос&орная кислота ДНФ - динитрофенол JiUM - легкий цероыдозин КМ - тяаелші ыероииозин Е1ХМБ - порохлорнеркурнНбепзоот У1Ф - уридіштрнфосфорнзя кислота ФВЇС - ф ос ф ор н обо лъ фр a:.i db ая кислота ЦК> - цитозшітр;іфосфорная кислота ЭДТА - этилзвдиом;штетраацетат Р„ . - фосфор неорганический

ВВЕДЕНИЕ

Одгаи из основных cb0üct3 пнбой цатерии является способность осуществлять функцпэ движения. Эта способность возникла в саше начальные лерпэди существовалал нлзнл. Механическое двикение полонено в основу';::лзк:: - делен;:л клетки, то есть, "воспроизведения себе -подобного" (,3л гель гард?, 1237).

«Зорин проявления двигательной функции разнообразии: это внутриклеточное персте г; сипе хииаческлх веществ и 1:атсбол;1тоз, a tükeo органоидов клетка; строго координированное движение хроиосом в процессах митоза и t,:c.i03 3; дишсгше протоплазму sueo'u; ритипчноо биение респлчеи про ставших и мерцательного эпителия швотешх; волнообразное 1уидул:!руащее) движение нгуткков сперматозоидов; складывание лкстовцх пластшюк и скикзние всего листа шшози (. Mico о q púdica ) п, канон эц3 сокроцение поперечнополосатой к гладкой мшц, п'^ав-щзесл на.!оолеа совершенно!! формой движения, свойственной шсокораз-ektitj ор

Виязнонле t^oлекулярно-хи1.::1ческйх основ механизмов биологической подвланостя на разных уровнях организации от простейших фор« до сложного процесса сокращения ишцц является одной из актуальных проблем соврете j;io.í биология.

В настолцсе Броня наиболее существенные успехи достигнет!) в изучоиии процессов, вощащих в основе иш очно го сокращения. Осново-полагезгпи для этих исследований било открытие В.А.Энгольгардтеу и !.!.H.2bda'J030li (.1939,1942) адсноз;1нтр;:фосфатазних свойств осиошгсго цкзечногэ белка - клюз;! на и ¿'стог:овле;ше рсц:ш рок пего вза:;::одо1<~ с ты: я иехду колочен аккумуляторов хлиическол знерпш клетки - /ЛФ i: сократи гелыша боляои ь^зц - илозшюи. Тек cauiTJ бил искри? иехо-кязи превращений в сивой клетке химической энергии в шхаилческуа и залекгии огаозп нового ¡шпргзлегкпт - иехэиохишш ь^эци. Это открытие послу-кло hoi;:íu:j стг.иул с и к развитии исследовании, посляценпах раскрытии роли со;:р aí ^ т ель líií белкоз - глгозипа и а к тала в

процессе икаечкого сокращении, глпвле)г.1Э локализации их в структуре саркоызрз, шпс;:еш:ю рола ^икорных белкоз - трошнина, трэпошоэинз,

- s -

октинанов » ряда ионов металлов в регуляции процесса сокращения. Ро-sjbltstu этих исследований обобщеки в многочисленных обзорах и монографиях (.Энгольгардт, 1946,1957,1959;.Ллбииова, 1957,1934; франк, 1959,1969; Шншов и Юрьоа, 1961; Гилов, 1934,1855,1959; Поглэзов, IS35; Изазов, IS36.ÏSS8; Заставили, 1971; Saent Gyorgyl,i947,1956; Y/cbor, 1953; Huxley, 1957,1960,1969,1973; Gergely, 1964,l9bb;Daviee I965i Klollcy, I9t>5î Perry, 1965} Tonomura et al.1965,1969; ïoung, 1969; Hoiwnaerta, 1969( Taylor, 1972).

В последило годи вшшанло последователой все пнро « кире привлекается к изучения различай:! иешаечних подьианцх структур, учо-ствуоцзх в двинении. Естественно, в своих поисках исследователи питаются войти аполога с течи закономерностями, к о гор Lie били установлены при кэучонни шиечиого сокращения. Исследовании в едутся кс:с по I11IUCI EU ПйЛСНИЛ КОрфОЛОГЛЧССКН структурной общности СОК]) С TÜT ель ГЮГО аппарата различных подвигшх систем, так » по линии outispyEoism иак-роэргпчоских вощостз и фзрионтатнЕнпх спетом, кэтеяпгарукчвдх реакции, коториз приводя? к освобождение химической зиоргми эокг-^чешюЛ а этих веществах; исследуются свойства белков, гидвлоншх из различных некшечише П0ДВ1ШШХ структур с цель» Ешвления сходство И различии с бедкеаз шц; шясияетсл, насколько универсальна контракт«льние систем различных подвпгццх структур.

В течение ряда лет в Институте бнохишш пк.А.Ц.Бзха /Л СССР вначале (,до 1950 г) в Лаборатории биохимии еивотшН клетки под руководством шадоиина В.Л.Эигольгардтз, позее в Лаборатории биохимии двисонпя, руководи«сД профос сор ou ÎJ. H. LsönüOBOiä -Эн ге лх.гардт, Hair,: проводились исследования сонео словно устрооннсх двпготоганш: аппаратов, таких как йгутаки спориатозоидоз бикэ, реснички инфузории Tetra hymen з pyriforote ц ягутиКИ ПроетеКзоГО StrteoMcmoa CCrithidie) oncopsitL.

Pc citadin u cryinuit прост cUsiîx u сперматозоидов, «ок к сокрапез-цнеся шлци, предстевлшэт coöoii .диффзрешщровошшо сократителышо сн-csoiai. Изу401111 о исхаииэиа росвично-агутикозого датенин и сопоставление его .с более слояиоН ' фораоЗ движения - кшечным сокращенней имеет больоое значение в оирокои сравнительно-эвояацноннои Опарин, 196 8) к иохтахатячосяои аспектах. ■

Конечной цолыз исследований является вилслеш:о иолеяулярио-хикя-~ ческах основ шшшизиов раснично-агутикового двикенип. Работа розги-

в а лось на оснозе иатериалоэ по ив хан охи «и и сокращения шп, В нешх ксследованиях си питались найти аналогии с тени закономерностями,которые были установлены при изучении мышечного сокращения» и в то же вреця выяснить специфические различия, обусловленные характером движения ресничек и вгутиков.

Для выяснения иогсанизма биения или волнообразного движения ягу-тиков и ресничек в первую очередь необходимы были исследования уль- . траструктурц сократительного аппарата этих оргенелл движения, химической природа белков сократительных элементов и Функциональной связи их с хамлческиця процессами, доставляющие,! энергию для осуществления двигательной функции.

В связи о вышеизложенный основные задачи данной работы сводились' к следующему:

1 - изучению ультратонкой структура сократительного аппарата кгутикоь сперматозоидов бына, ресничек Т.руггГогтхв и кгутиков

Э. опсоре! М.

2 - исследованию локализации сократительного белка - аденозин-трифосфг.тазы (.АЗФззы) в отдельных структурных единицах ресничек и кгутикои.

3 - изучению ферментативных и физико-хииических свойств выделенных из ресничек и кгутиков белков,

4 - исследовании структурних превращений сократительных белков ресничек и игутиков при взаимодействии с АК>.

5 - исслодованйю связи энергетических процессов, обеспечиваю сдах ресивтез А1Ф, с двигательной функцией сперматозоидов а инфузорий

Т♦руг!Гогт1в.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ М £ Т О Д Ц -

1. Выращивание и концентрирование культуры простейших т,руг1^огтЛв,

Б. опсорсИ;^

Инфузорзи т.руг!ГогпгЮ выращивали в стерильных условиях на питательно!! с радо, со стоящей из дроосеьой воды и фосфатного буфера (.0,С6 и), рН 0,8 при температуре 25°С. Дли опытов использовали 2-3^ диезные культуры тетрахииен. Выращивание культури з.опсоре1г! проводили в стерильной питательной среде Хоттингера с 2;? глюкозой при 18-20° в течение 7 дней. С целью уменьшения интенсивности движения простейших одерживали в точение 10-12 часов при температуре +4°С и затеа концентрировали-центрифугированием при I ООО g 5 шш. в центрифуге о охлаждением.

2. Изолирование ягугиков и ресничек от тел простейших руг1Гогя1и,

Б.опсооеН;!

Для изолирования ресничек из тела 1'.руПГогт1с били испробованы несколько щ то доз: метод Чнлда (сжпа, 1959 ), Уатсона и Гопкин-са ; \Vatoon.iiopkin3,1931) и воздействие раствора зелоральгидрата и>ур"аиева»Кароуиова, 1967; йгеЪеск!, Киащск!, 1961). В большинстве опытов бил использован иетод Уатсона ц Готшнса с некоторыми модификациями (.Бур;; синева и др., 1985,1967).

Отделение жгутиков от тел з. олсореХЪ! достигали путей иоха-нического ВСТрЯХИВОНИЯ водной суспензии Э.ОПСОреИ;! в иутель аппарате в течение I часа (Островская,Юрзшт.Бурнаиева.Лабннова,1972). Очистку фракции ресничек и нгутиков от тол простевших проводили ые-тодоу дифференциального центрифугирования, затеи игутики и реснички конце г; трирозели центрифугированием при 20 ООО Полноту удаления ресничек и прутиков от тел простерших и чистоту фракции контролировали в электронном микроскопе пря увеличении 10 000-25 ООО х.

3. Изолирование ЛРУТПКОП СПППШТОПОЧТОВ б!лея

Кгутаки-»идеала:! из эякулирование и згыдидианальных бичьвх семенных клеток, отиитих от семенной плгзии 0,65^-нии растворон ИаС1. Разделение сперматозоидов на фрагменты головок и жгутиков достигалось дезинтегрированием .суспензии сперцатозоидов в 0,85£>-иои КаС! в нейтральной среде 7,0) при поиоки гочогенизатора типа Уорннга

с бистр С'Броіцоїіри ся її о «olí Ц5 COO об/мші). Дезинтегрированные спер-иатозслди hjtcj дифференциалы:ого центрифугирования бил;; разделена ка фракции головок и игутпков (Бурпошева, 1955,1360). Чистоту фракций контролировали в фазової; он трастном микроскопе.

4. Фиксация, заливка и приготовление соезов для электрокио-микро-

скотачоскпх исследований

Прсмцтие осадил простейших т.piriformis и s.oncopel-ti, а t6ks6 сгериатозоидов и выделенных из них ресничек и нгутиков фиксировали* по истоду Кслленборгора t K-ellenberger et al., І364Ї при центрифугировании (ДО 000-20 000 є) с последующи« обезвоживанием и' заливкоі; по об де принятой методике (.Федорова,Буриошзва, 19оЗ; Буріїа-вева,Юр:-ииа,Бескровноза, 1233; Еурііаисва,Юрзіша, Любимова, 1969). Срезы изготовляли на ультраиикротоие ькз. для увеличения контрастности изображения препарати докрашивали раствором уранплацетатэ (Д%> іш. РЬ(он)2 по истоду Рсііиольдца I Reynolds, I9G3). Срезы про ска тривали в электронном микроскопе jer-i-sc и j i а при увеличениях 35 ООО и 50 ООО х. Негативное контрастирование суспензии кгутиков и ресничек проводили с 1%-іши растворои фосфорновольфраио-во!1 kucj.otíj t'i'BK), нейтрализованной до рИ 7,0.

5. Локелізепчп АТФОГП] В ресничках T.pyriformta

Гистохимическое определение локализации ЛЇФази /~по современной номенклЕ:Туре ферментов (.1S-66 г.}-АУ5-фосфогидролаэи, аифр 3,6.1.3_7 в рески>кух т. ругi fórrala проводили по видоизмененному методу Вакстейкг и МеЯселя ( v;achetem and iieisel, 1957). Тетрахимены без предваритодьноД фиксации или фиксированные 0,1%-ним раствором глутэ-рового г.дьдепідз на Еэроналацетатнои буфере pit 7,5, инкубировали л среде, t:030pzaa0.1 10 CaCIg, 10 tiM bigCJ2 0,5-1,0 t!J ATO, 0,5 tiíí Ib (но ;)2 в 7,5 íiM трис-НСІ буфере pH 7,3 b течение ЗО ідін. при £5°. В ьекоторих пробах из зтоіі среды исключали либо поїш Kg, либо Са длн мшзленип раздельно Са^+ - и r¿g2+ активируемых АТФаз, В контрольны): пробах предварительно фиксировонкые 0,Г^-ныа глутаровим альдегидоп тетрад ¡лены инкубировали jb вышеуказанной средс, но без добавления'A3S. После инкубации все пробы отделял;: гт среди центрифугирование«. Осадки дофиксировади и готовили для эдектронно-иикро-скогоіческих исследований (,Бурношева,Юрзина,Любимова, I9S9).

6. Экстрагирование из ресничек и г.гутиксз белков, обнаруживакщцх

АТФазнуп активность

Для ИЗЕЛОЧ0Ш1Я белков ресничек и цгутиков были использованы со-левыо раствора низкой и высокой ионной сила (.0,05-1,5j\ ), содерза-щне специфический катион К+ и различило солзобилизируи^ш агенты: детергенты - дигитошш, твшг-80, тритон X-I0Q, дезонспхолат и хели-рующаИ агент ЗДТА. В некоторых случаях экстрагирование белков производили в присутствии мочевины, тиогликолевой кислоты, нейтрализованной до pH 7,0 и гуанидингидрохлорида. Состав экстрагирующих растворов приведен в соответствующих таблицах. Экстрагированию подвергали как целые реснички и жгутики, так и гомогенизированные в ультразвуковой установке USE при силе тока 8 suпер и частоте 20 килогерц в течение 1-2 минут. Гомогенизирование sгутиков сперматозоидов проводила в стеклянных гомогенизаторах при охлаждении до 0°. Экстрагирование белков игутиков s.oncopeitt проводили при постоянной перемешивании суспензии цгутиков на холоду (.3-48 часов) или путей диализа в гут и ков <424-48 часов) против &iccTpariipywvtnx растворов ^Gibbono, 1965). Экстрагированные в раствори белки отделали .от остатка сгутикоз и ресничек центрифугированием при 20 ООО с в течение 15 минут. Из солевых растворов белки выделили снижением КОИЦОНТрОЦ'ЛИ солей либо разбавление«, либо да а ли з ou или осакдснмем ^ IJII4^2S04 *

Для очистки беиковбыл применен метод гельфильтрацнн через софа дек с Г-200 t Andrcwu, 1964, IS GS*, Determaa.lSS?), а такке метод хроматография на ДЭАЭ-сефадексе А-50 ^ Aoai,I963; IUcharda et al. ,1967). Гомогенность болков определяли электрофорезом на полиакрилаииднои геле по методу Девиса (, Davis, 1984). Опиты по определенна констант седиментации белков ресничек т.руriíormie проводили на ультрецен-трифуге "Спинко" при скорости 50 000-56 ООО об/иин и температуре 19° и содержании белка 1-3 иг/мл.

Молекулярный вес белков был определен гельфильграцией через калиброванную колонку сефздзкс Г-200.

Ашшокисдотный состав белков, яадзлеиных из ресничек и жгутиков, определяли на автоматичоскои анализатора аминокислот mtochy ^ Spaokman,Moore,Steia, 1958) и анализаторе БС-200 фирмы Bio-Cal в Институте химии природных соединении АН СССР. В суспензия изолированных ресничек и ягутиков и в выделенных аз них белковых фракциях определяла активность АТФазн «ибо по нарастанию неорганического фосфора в результате отаепления его от AW, либо по убыли AÏ? биолвки-

несцонтньш методом, основанным на способности экстракта из светоносных.органов светляков вида Lucióla mingrellca к биолюминесценции в присутствии ATi (.Тумариэн, Федорович, 1966). Интенсивность свечения измеряли в приборе для определения АТФ биолшинесцентным чегодои, собранной совместно с сотрудниками Института вышей не об но і) деятельности И.Э.Федорович ц В.И.Ганнинш (.по принципиально,! схеме, предложенной-в Институте молекулярной биологии). Интенсивность свечения выраззет в -условных единицах, приводя их к делению одной из шкал прибора.

При определенна АИозиой активности пробы содержали: исследуе-iíiííÍ раствор бел ¡ta, кофактора t Ca2+)ug2+, ка+, к4*, Cd2+ ) в соответствую^« концентрациях, различные субстраты tATt,АД5,АМФ, ГТЇ1,ЦТР, ИТ5, цярэфосфат, р - глицерофосфат). Были использованы буферные растворы с различными.рН. Проби инкубировали при нескольких температурах для' быявления оптимальных условий. Ферментативную реакции останавливал» добавлением трихлоруксусной кислоты конечной коцце-íграции 5$ на холоду. После осазгдения белков в ТХУ центрифугатах опытных п контрольных проб определяли отщепленный неорганический фосфор по методу Фиске и Суббароу; ( Fisko, Subbarow, 1925)'. АТ1>аэную активность виражали в величинах удельной активности, соответствующей шег фосфора, оттопленного от АТФ, но I иг белка исследуемой пробы за 10 минут при т^мкзратуре 30°.

Для определения белка в исходных жгутиках и ресничках и в выделенных белковых фракциях бил использован метод Лоури I buwry et ai., 19 51).

7. Виделанчо и идентификация нуклеотидоз

Содгрканн.з нуклеотядов и их превращения в связи с движением сперматозоидов и инфузории т. pyriformis определяли несколькими методами: негодои хроматографии нуклеотидов на бумаге; методом хроматографии на тонкої! слое ДЭАЭ-целдялозы t stickiana, 1965). Для определения содержания АТФ в изолированных ресничках бцл использован метод биолюминесценции люциферин-люциферазной системы светляков,описанный в предыдущей раздело.

Нунлеотиды выделяли в кислоторастворимую фракцию гомогенизированием исследуемых проб с ТХУ или ЯСЮ4 15-IQ5). Для очистки нуклеотидов от вецестэ, мешающих анализу их биолиминесценткыу методом или хроматографіїчосному разделению, были использованы методы осаждения АЇ9 из 7ХУ экстрактов в виде бариевых солей (.Любимова, 1964) или

адсорбции нуклеотидов но активированном угло с поеледувцей эволюцией о угля спиртовым раствороц wh4oii ЧБурноиева, i960; Бурнашева,, Карэушева, 1967). Нуклсотиды разделялись одно и двуиорнол хроиото-грофаей на б у на го по иетоду (.Вені;стсри,БайВ,Загсльгардт, 1950) или в тонкое слое ДЭЛЭ цолдплози ІБурнамова, Карауыова, I9G7).

Нуклеотиди идещткфіщцровались по характеру спектров поглощения при различных pH и по соотношению фосфора и аденина, по отнозению эхетинкцай E^q/ E^q u е28(/ Е260 и по состаеї оснований и,наконец, по значенияы ßf в различных систеиах растворителей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ •ГЛАВА - I

I. Электронно-кикроскопнческие иеслатванип ультоастауііт.уры росничок и ягу гиков простейших II сперматозоидов

Цельв излагаемых в этой главе исследований било изучение в сравнительной аспекте ультраструктури сократительного аппарате кгутиказ сперматозоидов быка,' ресничек инфузорий т.ругіґогтіа и сгутиков простоЕших s. onoopeiti. Результаты электронно-ижроскоплческпх исследований показали, что сократительный аппарат этих органелл двияе-шія состоит из иуеющих трубчатую структуру фибрилл, упакоиаишх по общеизвестному Принципу ¿*\9 X 2 ) + 2J4 Gibbono.Grtnatoiie, 19СО; Andre, ISoIi Fawcett, 1961; Satir, 1965; Gtbt>one, I9GÜ) . JfiO центральные фибриллы (.рис.І, 3,6) окрузясна девятью сдеознниіпі флбрнлла-ЛІН, 0бразуйВД1«Н периферическое) кольцо ^цф,пф). Били выявлены TSKÄC и другие детолп ультраструктури ресничек и жгутиков vpnc.2-): вторично фибриллы Івтф), отростки или ручка, отходяэде от одной кз пар периферических фибрилл 1 р ) и третичные фибриллы в кгутиках сперматозоидов (,тф), отличаисцюся более плотной структурой. Периферические, вторичнію и центральные фибриллы связаны ііеаду собой радиальными связями - иостикаии (.Федорова,Бурнашева, 1963; Бурнашева,Островекая, Юрзина, 1958).

При исследовании ультратонких Срезов росничек T.pyrtforais в агуТИНOD s.oncopaltt в электронной кикроскопэ БИсокого разрешения JEM-7A цау удалось более детально euявить внутренний структуру центральных и периферических фибрилл (.Бурнеиева.Юрзапа,Бескровнова, 1968; Бурнааева,Островская,Юрзина, I9S8). Было показзно, что цен-

■V," Ч1 1

*■ лг, ц

—- I ь; У ЧУ

л--л к -:} -

ЪуД. ' * ■ - '/{ ■ ^ ^ Ч

■'V' Ч1-?"-;'- ,^ Ч 'Г.'!

{ ¡п

V Ц* 4 ,/ • л:>'\л.. -Л-

I

^ ) ^^Л "Л; Ч.

г 'а х {/ Г'-.' -г; <••:-••.:.. ч

I у:'/'-; •

Рис.1 - Поперечной (.а,б) и продольный (в,г> срезы ресничек Т.руг!-Гогт1а <а,Б) и ззгутиков З.СПСОреИ;! г); пф - периферические, цф - центральные фибриллы; р - ручки; к - мембрана; се - субъедшшцы; стрелкаш показано линейное располонение субъедмшщ вдоль фибрилл.

тральные и периферические фибриллы построены из сферических белковых субъединиц диаметром 60 2 у ресничек и 70 8 у игутиков^рис.2,6), Число субъединиц, определенное по MepKXCtiy { tlarkham et al. , 1963) в калдой фибрилле ресничек - тринадцать, у жгутиков - одиннадцать. На продольных срезах видно линейное расположение субъедигшц вдоль фибрилл (.рис.I,в,г,стрелки), период в их расположении ровен 60 â у ресничек и 80-140 2 у ягутиков.

.Получониые наш данные свидетельствуют о наличии некоторой общности в структурной организации сократительных элементов, связанных с выполнение« функции движения: глобулярные белковые субъединицы диаметрои 25-35 Й были выявлены в миозиновых нитях шиц (.Гилео,1965, 1369), шюфибриллах гладких «ыиц t Permer and Kohig, 1367), в фибриллах веретена л Crlmatone,Klug, I96S; Коог , 1967), в гакротрубках растительных и еивотных клеток t Ledbetter, Porter, 1964; îhillipa, 1966), В жгутах бактерий I Finch,Klug,1962; Kerrldge et al.,1962).

Рие.2. а) Схематическое изображение поперечного среза реснички или крутика: цф - центральные, пф - периферические фибриллы; втф - вторичные фибриллы; р - ручки; ре - радиальные связи.

б) Упаковка сферических глобулярных субъединиц в фибриллах, выявляемая нз поперечных срезах ресничек и вгутиков схеиа ).,-■

а

б

\

2. .Исследование локализации АТФозы а ресничках т. руг!Гогд11о

О функциональной значении центральных и периферических фибрилл ресничек и агуткков в процессе двикецип существуют противоречивые представления. По мнения одних авторов (.Кнуэ, 1961), для нормальной работы рссничек и згутиков необходимы лишь центральные фибриллы, а периферические фибриллы выполняют функцию проведения импульсов возбуждения, идущих из клетки. Это предположение основано на том факте, что реенгчки рецепторных клеток, потерявших подвикность, лишены центральных фибрилл. По данным других авторов (.ВгаапеЫ , 1955;

БзМг, 1931,1965), сократительные функции выполняют периферические фибриллы.

Подтверждением важной роди как периферических, тек и центральных фибрилл в механизме движения ресничек и кгуТИКОБ могли служить результату биохимических и цитохимических исследований локализации в них аденозиптрифосфатази ^АТФазы), фермента, являвшегося основным компонентом любой сократительной системы.

Используя в основном общепринятый гистохимический метод Т„ЫЯВ-

ления АТФази {.см.методы) на уровне электронной микроскопии нами была

2+

показзна локализация Са - и Ые - стимулируемых А1£зз в центральных и периферических Фибриллах ресничек т.руг1Гогт:<9 (.Бурнашева, Юрзина, 1968; Бурнашсва,Юрзина,Любимова, 1959). В расположении фосфата свинца на фибриллах наблюдалась упорядоченность и периодичность, соответствующая линейной упаковке субъединиц, составляющих периферические и центральные фибриллы. Это свидетельствовало об ассоциации АТ-Ззэы с глобулярными белковыми субъединкцамл фибрилл реснички. Наиболее характерная реакция была обнаружена в периферических фибриллах, простирающихся в кинетосому, а также в кинетодесмальных фибриллах, оэеспечизающих, по-видимому, синхронное биение ресничек тетрэхимсн.

Реэу.йтаты проводенних исследований позволяют заключить, что бзлки, обнаруш5ЕгюкЕ!е АТФазну» активность, встроены в структурные элементы ресничри, ответственные за осуществление двигательной функции и являются тем самым интегральной частью сократительного аппарата реснички.

ГЛАВА - П

Исследование АТФазной активности изолированных ресничек и нгутиков

Более детальное выяснение характера и свойств АТФаз, связанних с сократи гель шил структурами ресничек н кгутиков, било возможно после изолирования белков мз этих структур и сопоставления их свойств со свойствам:) известных сократительных белков шдщ и других неиышеч-ных подзихних клеток.

Для этого в первую очередь необходимо было получить чистые фрак цик изолированных ресничек и нгутиков, не загрязненных другими кле-точнышГструктурши. Нами были разработаны методи отделения жгутиков сперматозоидов от головок (.Бурнашево, 1357,1958), изолирования ресничек T.pyrtformie (.Бурнашева и созвт. 1963,1265) и кгуткков Б. onoopeitt (,Островская,Еурітцева,Любиіювз, 1972).

Исследования показали, что изолированные кгутикн сперматоэсидов быка, так же, как и реснички■ т«pyrtformte а кгутики S.cncopeiti, обнаруживают значительную АТФаэную активность (.табл.1, рис.3). Величины активности такого se порядка, как и у других исследованных видов ягутиковцх и реснитчатых простейших її сперматозоидов ^Иванов и C03BT. I94S; Kelson, 1955; Tlbbs, I957;1959; Child, 1961; Brokaw, I960; Gibbons, 1965) И У ШОфНбрИЛН ШЯЗЦ t, Kurphy.Haeoelbach,1968} Schaub, 1969). АІФаза ресничек и жгутиков в значительной степени активируется ионами Mg и в меньшей степени Саг+ (.тебл Л).

10 so

, so

I

^ 30

; Ч

го

ю

■У.-.',

ш

т

Ф*,

>

ш

Ряс.З - АЇФазноя актиз-ность цельного гомогенате дезинтегрированных с периатозои-дов (. I ); фракции изолирован них жгутиков ( £ ); фракции головок I, 8 ).

Таблица X

АТЪазная активность изолированных ресничек Т.руг1Гогт1в и вгутиков э.опсоре1г!

| Удельная . { активность в ыкг 10 мин. Р на иг белка за

■без добавки ; ■ . 1 ионов 1 ' ! активаторы 5.10' .. (Соотношение

%2+ ! 1 Са2+ I К52+/Са2+ ' г

Реснички 13,5 22,5 20,0 1,1/1

6,5 19,3 13,5 1,4/1

7,0 32,8 28,0 1,2/1

7,4 34,0 26,8 1,3/1

Жгутики 9,3 15,4 9,0 1.6/1

9,1 " 13,2 7,0 1,9/1

8,0 14,0 12,0 1,1/1

Определение специфичности ферментативного действии суспензии 'ресничек и вгутиков показали, что кроме АТФ, они способны гидроли-эовать и другие фосфорилированкые нуклеотиды, но в меньше» степени, чем А1Ф Чабл.2). Как видно из данных табл.2, АДО-гидролиэуюиая активность ресничек и ггутиков выявляется в присутствии Мб2+, что может быть обусловлено присутствием аденилаткинээы или А1Ф - АЧФ -фосфотрансферазы. Гиббонсои (.(Нььопэ, 1366,1963) была-показана аде-вилаткинаэная активность в ресничках Т.руг1Гогпи,а. Нгутики Б.оп-соре11;1 обнаруживают незначительную активность в присутствии Ыег+ с ГТФ и в присутствии Са2+ с УТЬ. В суспензии ягутиков и ресничек не было обнаружено неспецифического фосфатазного действия по отношению к таким субстрата», как пирофосфзт и р - глицерофосфат.

Таблица 2

Специфичность ферментативного действия суспензии игутиков 2.оасоре11;1 ( I ) и ресничек Т.руг1Гогш1с(. Ц )

Субстра-;Кол

¡Кон- | Удельная активность »кг Р/нг белка/ 10 цин._

ты ! без добавки ) добавки 5Л0~а 1.1

[ция | ионов Т С а [ Г.'б^*

.цЦ | —...... " ■ ■" ■ . I. ¡1 --------

_{ ; I_П ! I_П ; I_П

АТФ 1,0 8,0 13,5 12,0 20,0 14,0 22,5

АДФ * 2,0 0,0 0,0 0,0 3,4 1,7 12,8

АКФ 4,0 0,5 0,0 1,3 0,0 1,0 0,0

ГСФ 1,0 0,0 - 0,0 - 3,3

' УМ 1,0 0,0 - 2,3 - 1,7.

ЦК 1,0 0,0 - . 0,0 ■ - 0,0 р -глицерофосфат 8,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 . 0,0 Пирофос-

фаг 5,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

ГЛАВА - Ш

Выделение АТЗаз ресничек и г: гу тиков и исследование их свойств.

I) АТФ аз а кгутиков сперматозоидов быка (.спериозин)

Ранее нами (.Бурнашева, 1947) из сперматозоидов млекопитающих была ьыделена белковая фракция, обнаруг^ваиздя АКазнуз активность и названная спериозшюм. Было высказано предположение о роли сперио-зина как сократительного балка, локализованного в кгутиках сперматозоидов ^Энгельгардт,1946; Бурнаиова, 1947).

О локализации АТФазы спормозина в сгутике сперматозоида свидетельств о вали результаты исследований, приведенные в главе П настоящей работы. 80# АТЭазной активности целого гоыогената сперматозоидов обнаруживается во фракции ггутиков (.рнс.З), то есть непосредственно з контрактильнои аппарате подвидиой ссиенноЦ клетки. Спермозин был

выделен из изолированных ягутиков сперматозоидов солевыми раствора-пи высокой ионной силы, применяемыми для экстрагирования миозина и актомиозииа (.тэбл.З). Как видно из данных табл.З в солевые раствора извлекается до 40$ белка, и 90?» АИ?озы кгутиков, причем из солевых растворов во фракции спермозина переходит до 555» белков, обнаруживающих ¿Мазнув активность.

Исследование свойств' спермозина, очищенного переосатдениеы при иоюой'силе 0,025/* и при рИ 6,2, а такяе фракционным высаливанием сернокислым аммонием показали, что спермозин обнаруживает свойств.), сходные со свойствами миозина (.кролика):

а) спермозин, подобно миозину, обнаруживает ферментативную активность: отщепляет терминальную фосфатную группу от АТ5; .

б) АТФаза спермозина, подобно миозину, активируется ионами Са; наибольшее активирующее действие Са2+ (рис.4-) проявляется при концентрации к - 5.10""%!. Яоны Kg не оказывают влияния на ферментативную активность спермозина;.

в) оптимум ферментативного действия АТФэзы спермозина леяит, как и у миозина, в щелочной области рН 8,2-6,5 (.рис.4^-), однако у миозина оптимум сдвинут в более щелочную зону рН 19,0-9,2).'

а б

Рис.4 - АЗФазнзя активность спермозина:

а) влияние ионов Са^+ и Hg2+. I - активности з присутствии Са^1"; 2 - активность в присутствии Kg2+.

б) зависимость АТФазной активности спермозина от pH.

А1Фэза спермозина чувствительна к действию сульфпгдрдльних ядов: порахлср'леркурийбензоэт С.ИХ'^Б) в-концентрации 10"% угнетает АТФазиуо активность спермозина на 70£> (,ряс.5~,2), а в присутствии С(12+ в концентрации 10"^ М достигается 505-ное угнетение ферментативной активности спериозина (рис.5-, I).

Рис.5 - Влияние сульфгидридьЕШХ ядов на АТОазную активность:

а) спериозина: I - сперкозин + СйС!? ,

2 - спериозин 1- ГХ1Б. АТ1> - 2,67.10"%;

б) - активируемая АТФрэа жгутиков з.опсореИ;!

АТФ - 1.10"%; Са2*- 5.10"%; белок - 0 »26 «г/ил.

Чувствительность ЛТЗази спермозшга к сульфгидрилыал яда:.! свидетельствует о воакой ролл бн груди в проявлении ферментативной активности белка. Как известно, сульфгидрилыше группы ьшозина типа 51 ИЕ2 играют существенную роль В проявлении ферМСНТОТИЕНОЙ активности и механохнкиче&вях свойств этого белка. Сульфгидрилыше яды (.ГШШ, п - этилаалеинид, Ае+, са+,сиг+) в палых концентрациях активируют, а при высоких ингибируют ыиозиновую аденозантрифосфстазу (.Любимова, 1957; Поглазов, 1965; Вагшу оЬ а1., 1957; з^ас1гег,СЬап, 19(31; кгвису, 1965; Се^е1у, 1966). Блокирование сульфгидрнлънкми ядами ей ■ групп типа з,, вызывает активацию, а 5Н групп типз -- ингабировшшо энзииатической активности инозина. По аналогии мошю полагать, что »«активирование АКезной активности спешозшш относительно высокими концентрациями 1Ш!Б и СйС12 обусловливается блокированищ-.знгрупп типа б2 .вероятно, ответственных аа ферментативную активность спериозина.

Дополнительное доказательство сходствз спермозина с ккозином было получено в опытах, где изучалась возможность образования кті-плексэ белка сперматозоидов спермозпиа с белком ишц актиноіі, подобно ..тоиу, что наблюдается при взаимодействии ыиоаииа с актинои IЭагельгардт",Любимова, 1943). При смешивании спермозина с актинон.; из мышц Б соотношениях - 2 : I; 4 : I; 12 : I в присутствии Мз2+ был.получзн комплекс актоспериозик, аналогичный актомиозину•

Таблица 3

Выход гїєлкз и АТЭозной актицнооти в солевые раствори и во

фрзкннз спермозина

(.Содернанле белкового азотз и су «марная активность в соловых раст-ворах'и ^о фракции спзрг.юзина выра>.;екн в % от соответствующих величин для гомогената)

і-1-І-

¡Дли- іСолевоіі раст- ¡Фракция спорио-

вор ; _ зино

—,—,--—і----------

пп

Экстрагирующие растворы

ітель-; [ность, ¡зкстр^азот ¡часи д

¡актив- ! ¡¡¡ость !

азот

г еатив— ¡ность

I. 0,5 1£ ХС1+0,03 и МаНСО,

г. 3*

4.

5.

6.0,6 Ы +0,01

рН 8,5

То 'же То ке ТО же То ле

:«:Ї+О,04

3 Ыа2С05 рН 9,2

МаНСО

7. То «с

8. 0,47 У. КСХ+0,01 М пиро-і.:осфаі+0,Х а фосфатный бусзр рН 6,4

9. 7%-ный ьісі рн 6, г

0,5 0,5 2,5 24,0 24,0

14,5 14,4 33,0 25,0 27,0

20,0 42,2 24,0 30,0

24,0 11,0 24,0 40,0

25,0 34,0 60,0 92,0 76,0

58,0 78,0

81,0 65,0

5,7

3,6

13, II,с

18,4 7,0

8,2 17,7

8,0 17,0 55,7 42,0 24,0

34,0 26,0

20,0 43,6

Примечание:

в о датах; 1,2,4,5 сперкозіш шделялл диализом, а в остальных опитах - осаждением сернокислым'аммонием при 505-ноы насыщении.

Ют

йнтвжозин $

J ■■

1

> 8

' 7 : 8 ' 5 4 \ 3

z 1

Рис .в. Образование комплекса актоспериозина из спермозина и актина мышц.

Относительная вязкость: I - Ф-актина; z - спермозина; 3 - спермозина + Ф-актина; 4 - спермозина + 0-актина + + А1Ф; S - миозина; 6 - миозина + ф-актина; 7 - миозина + Ф-актяиа + АФК

Как видно на рис.6, относительная вязкость комплекса спормози-нэ и актина превышает сумму Евличан вязкостен исходных компонентов, что свидетельствует об образовании экто*м;юзино подобно го белка, характеризующегося чувствительностью к воздействия АТ1>. При добавлении АТ5 в концентрации 4,а.10~^Н относительная вязкость комплекса актоспериозина падает до уровня, соответствующего величинам относительных вязкостей исходных компонентов tpiio.G, столбик 4). Для сравнения на рис.6 приведены соотвототвуюцие дашше для актошюзина. При образовании актошюзина относительная вязкость возрастает значительно и добавление АТФ вызывает снижение вязкости*

Таким образом, результата приведенных исследований свидетельствуют о сходства свойств контраятилыюго белка к гут ш сод сперматозоидов спермозина со свойствами инозина в отношении наличия AT?азнoil активности и способности образовывать комплекс с актином мышц. Лкто-спермозин, подобно октошюзину, проявляет мехэн0-хим!1ЧеСКИЙ эффект в ответ на воздействие мокроэрга — А1Ф. Полученные данныо свидетельствуют о структурной специфичности спермозина как контрактильного

\

белка, способного на образование комплексного соединения с контрак-тильным бел кои иьшц актинои.

2) АТЕазц ресничек Tetrahymena pyriformtg

На схеме (.рис.7) показан общий ход выделения белков из ресничек T.pyrifonais, в таблицах 4 и 5 - выход белка и ?.1Эаэы ресничек в солевые раствори.

В результате первичного экстрагирования ресничек солевцмл растворами низкой ионной силы t0,005ju) в присутствии детергентов ди-гатонина\0,05-0,5%), твина-80 (.0,1%) и тритона Х-100 (.0,1-1%) били' выделены белки, связаинта с иатриксои и мембранними структурами ресничек. Эти белки составляю! от 20 до 40% от всех белков ресничек tсхема, табл.4), обнаруживают АТ$азную активность и по своим свойствам ^.см.ннле) сход:ш с I Ка"*" + К*) - АТФазами, участвующими в-переносе ионов' через клеточные ыеабраны (Skou,1957i Judah,Ahmed,1964).

Белки, связанные с фибриллярными структурами ресничек, был.'!, извлечены после вторичного экстрагирования дезинтегрированных гомогенизацией или ультразвуковым воздействием ресничек солевыми растворами высокой.ИОННОЙ СИЛЫ' to,5-1,5yi ), обычно применяемыми для выделения миозина и актомиозина ^Любимова, Энгельгардт, 1939; Weber, Meyer , 1933; Bailey, 1942; Perry, I960). Эти белки составляли ОТ 40 до 60% от oöiyix белков ресничек. Более успешное извлечение белков било достигнуто экстрагированием гомогенизированных ресничек раствором fö 4 (.табл.4), при этом в раствор извлеклось до V0f& белка, обиа-руаиваацего АТФазнузз активность. ■

Параллельными электронно-микроскопическими исследованиями была показана локализация выделяемых белков в «ембранных и фибриллярных структура:: ресничек T.pyriformio.

Результаты проведенных исследований показали, что белки локализованные з фибриллярных сократительных структурах ресничек, по своим свойствам обноруживаэт сходство с миозиноа и спермозином.

Долее буду? приведены результаты исследований свойств выделенных из ресничек T.pyriformis белков (.АФиаз).

F е

--L_

ПеРВИЧЗЯЯ 01) П И d 11 t R

0,05-0,53 E^KSIKS 1,2'í 1С!

««о,и ^

pu-u,j 0,0014 ¿Tí пхи-ао сЪа кстеи V-un^x-iM _r"=ä.5

І. ОКЕйдазїгозаа^/а йєйд ТССЕИ«

Я. солгйггз.ттмкаадв вздла мсл^чок МІ-7І.;

O.ei Ш E.J tweöa O.GÎM'J іпсїега 0,СШ ТИС-ECl ЦкЗ.О

O.OOfl reí и,осой ОіГЛ

тгзг-кэганда-гтагт ісмггз

BÎ. СОЯвгЕЯГрОЕЕйПЗЗ

U. согайзжзгтсваЕоэ Сиял^^еснйчої

Оїтатмс ртскдех

(ю-зд

Mietc-s^œiîiï

Гге. 7 . СИЇД їКітротрогашн CMS« « роcrncs Т.'ругІГогаіе,

Таблица 4

Выход белка и АТФазной активности ресничек т.руг!£огш1в

в солевые растворы

(Содержание белкового азота и суммарная активность солевих растворов выразены в % от соответствующих величин для исходных ресничек)

ИЧ 1И.І ПЯ Экстрагирующие раствора }Про- ідоллит. (Экстраг. ¡час І Солевой экстракт

[белковый і азот ІАТФазкая ¡активность

I. 0,03 \ї три с-НСІ-буфер рН 8,3+0,0025 Н Мв304 +0,5^-ный диглтоннн ІЗ 15-20 20

2. 0,03 трис-НСІ-буфер рН 8,3+0,0025 М «ЄЗС4 +0,5%-ный дигитошш+0,о М КСІ 24 50 57

3. 0,03 И три с-її СІ-буфер рН 8,3+0,0025 Ч +0,5/&— ні:Я дигитонин+0,6 М КІ 24 55 50

4. 1,6 М КСІ+0,01 М пипофосфат + 0,1 Н.фосфатний буфер рН 6,4+ 0,001 Ы МЙС12 24 70 50

Са** - стимулируемая АТФзза ресничек '¿'-ругіГогтіа

ЛТФаза, извлекаемая из фибриллярных структур ресничек т.руП-гогтіз воздействием ультразвука и последующим экстрагированием'солевыми растворами высокой ионной силы (.табл.5, схема, рис.7), во многих отношениях обнаруживает сходство с миозином: I - подобно АТО азе миозина, Лїїозз ресничек стимулируется лиыь ионами Са^+; 2 - оптимуи ферментативного действия - АЗФэзц ресничек, подобно миозину, лепит при двух значеннях рН - 5,3 и 3,3 (.рис.8,а) причем активность более высокая в щелочной зоне рН (.8,3). Однако, в отличие от АТ5азы ресничек, оптимуи рН миозина сдвинут в более делочнуш зону ^9,0-6,2); 3 - ферментативная активность АТ&азы ресничек строго специфична по отношении к субстрату АТІ>, Другае нуклвотиды (.АД5,

* АУ®»ГТФ,ЦК» и^ИТФ), а такие лкрофосфзг к $ - глицерофосфат не гид-ролизуются эткм белком. 3 этом отношении следует отметить и отличие: как известно, миозин способен гидролизовэть кроме АТФ и другие нук-леозидтрифосфаты (.ЛФ,И1Ф,ЦТ5) (. Навво1ЬасЬ, 1957); 4 - АКаза ресничек, подобно миозину, является високсмолекулярным белком. Молекулярный вес Са^+ - ЛТФззы ресничек, определенный петодои гельфильтра-ции через калиброванную колонку сефздекса Г-200 соответствует

л

Рис.8 - Зависимость АМазной активности от рН:

а) Са'"+ - АЗ®азы ресничек т.руг1Гогш18

б) Са^+ - А1Фазы кгутиков З.олсореИ;!

Рис.9'- Годьфлльграция СаЙГ- АТ->азы ресничек Т.ругіГогшіа

через калиброванную колонку (1,5x100) сефадекса Г-200 буфером 0,005 М трис-НСХ рН 7,5 со скорость» 12 ил/час. АЇФазная активность без добавок <Д) ,в присутствии Са2+ ^2) и М32+ О).

Таблица 5

Извлечение Са2+ - стимулируемой АТЗазы ресничек Tetrahymens pyriformiB растворов Веберо-Нейера ОтеЬег,Meyer, 1933), содерзащди: 0,6 M ECI+0,03 l.( NaBCOj + о.ог м ifaaco3+o,oo4 м цистеин, pH 8,5; продолжительность экстракции 20 часов.

¡ Выход белка {Сукиарная АТФазног; активность

Фракции : } иг i t*!* ( fifi i без добэ-j вок i i í добавки 5.IO-öIJ

t i 1 i i j i m

Суспензия ресничек 19,0 100 89,3 125 196

Белковый экстракт_ 8,4 44 146,0 '495 36 '

b'g£+^ активируемая АТФеза ресничек т.ругlformtэ '

Исследования свойств АКази, извлекаемой из фибриллярных структур ресничек Piriformis воздействие солевых раствор03 в присутствии ночевали или трис-тисглаколтеа (.схема, рис.7) показали, что она отличается по своим свойствен от - АТФази: ферментативная активность этого белка стпиулнруется только иономн м5> оптимум ферментативного действия мв + -А^ази в отличие от Са^+-АТФ-азы-лзяит при нейтральной pH - 7,0; в отличие от - АТФазы, являвшейся высокомолекулярном белком (.400 ООО), -АТФаза пред-

ставляет co6oäi низ к о а ол еку л яр кый белок, молекулярный вес этого белка соответствует 60 ООО дальтоиоа Допределен методом гельфилътрации через нал::брозй!шуа колонку сефодокеа Г-200).

При хромотографировании■ ¡-'з2т - АВДазы на ДЭАЭ-софадоксе А-50 белок целикон сорбируется на ионите и элэируется одним таком при градиенте KCl os 0,15 до 0,55 М (,рис.Ю). Как видно на рис., профиль элюция. белка я АТФазной активности совпадают и во фракциях выявляется только Kg2+ - активируемая АТФаза <.Дайя, Бурнаюева, Любимова, 1Э71).

Рис.10 - Хроматография м§г+- Д1Ч?азы ресничек т.руПзГогиНа на ДЭАЭ-сефадексе'А-50 (1,5 X 30). Элгация в градиенте КС1 со скорость» 12 ил/час. АТОаза, активируемая Са^+ и—х), мег+ (.о--о).

к1*" + На* + Щ2+ активируемая АТФаза ресничек т-РУг1Гогш1в

АНФаза, извлекаемая из мембранных структур ресничек т.руг!-¿■огт1о, как уже указывалось выше, проявляет свойства, сходные со свойствами I ка+ + К* ) - АТ^аз, участвующих в переносе ионов через клеточные мембраны. Как видно на рис,II- , АТФаза выделенных белков активируется при совместной действии ионов К + Ма+ + !Авг+г оуа-баин снимает активирующее действие этих ионов. Исследования зависимости АТФазной активности от рН сроды показали, что онтимуи ферментативного действия леаит при рН 7-7,2 в присутствии и при рН 6,0 в присутствии К1" + Ка++ (.рис.II— - 1,2 соответственно). Результаты этих исследований свидетельству/от о том, что в функционировании ресничек как двигательного аппарата инфузорий, по-видиио-иу, участвуют также АЗФазы, связанные с мембранными структурами, наряду с АТФазами фибриллярных структур ресничек.

а

б

ш

□ 'і' Ії-Ів-Чї

п «*-*.•-«,

li

О "»''»і

□

•і %

ъ

о

4

«

а

10

Рис.II - а) АТФазная активность белков ресшічек т, pyrifomia в присутствии различных ионов и оуэбаина. ' б) Зависимость АТїазной активности от рН среды.

I - в присутствии Саг+; 2 - Мєг+;3 - кЧме2++ыа+.

3) ДТ^азы жгутиков Strlgomoaaa onoopeltl

Для извлечения белков из ягутнков s.onoopelti были использованы различные солевые растворы, содержащие детергенты и хелирующие агенты, мочевину и гугнидингадрохлорид в соотноиепиях, указанных на схеме (.рис.12) и таблицах 6,7,

В результате первичного воздействия солевого раствора БеНли (. Bailey, 1942) (табл.6, опыт 3), а такяе иироко применяемого для выделения АТ$оз ресничек и кгутнков метода длительного диализа (.20-40 часов) против растворов, содеряацих ЗДТА (.табл.6,опыт I) и ДИГИТ0ІЇИН ( Gibbono, І£33,1965,1538; Stephens, 1968; Hohry et ai.,1969) (.табл.6, опыт 2) извлекаются белки, обнаруживающие 30-40$ от общего содержания суммарных белков нгутиков. Суммарная АТФазнал активность белков, извлекаемых в раствор, составляет 50-7QS от суммарной активиости исходных нгутнков.

Избирательное экстрагирование - АТФазы, локализованной в фибриллярных структурах нгутикоз, было достигнуто -і.страгированием их солевым раствором Бейлн, ыироко применяемый для выделения миозина мшц и сходных белкоз немышечных подвижных структур. В результате экстрагирования в белковый экстракт переходит около 44$ белка (.тгбд.Є, опыт 3) и вся АТЭззная активность* .

первичное экстрапюовигаз

0,5 13 КС1 0»(Ш' МаНСО^ рН 8,0 0,0?Л КС! о.оадш ЭЛТЛ 0,01% иеркаито-этанол 0,25/3 ди-гитонии в 0,003 Н м'рис-НС! буфере рЯ 8,0 0,0001 и ЭДТЛ О.ООХ М трис-яа буфер рН 8,0

ЯИИйДН 3.0 пс орс1

г! юо °/о

с окгбялизп ро в ан ны е бол-: ки кгутикоз 25-35%

остаток жгутиков 35-45/а

Рис.12 - Схеыэ общего хода выделения белков из кгутикоэ

Э. оЬсореИ;!

ТїОіікз £

ЕЬіход оелка і Шззїоя елтисвоєї« лод воздеИсте*

аастрагирхот раміоро»

* « Врекя :Содеріея«) Іедомя ; Зедса

І : і * І * Зксїрагиртвяке рвгімри акстра-ггроїа- від оитов і-;- і їг, ; %

кості (игг Р/їг вема/ : 10 на)

: без * ' ; дооніш : ковов

с^' і с,

Сікмарт НСазная

ЯХТЯВНОСТІ

; агілаюрї доомха ; (5.КГ=1і)

Си<

і

.2*

І о,оои ш>ш -от? рн єн + о.ооои гдн £) 20 гоксге- ШГ .ксграгт _____і 1И,7 4,Ь!> 100 26 35,г "гї.і 57.7 В,Є 33.8 267,4 по, г 400 37а

* 'іі.; у''

в) га ,'ЗїОГЄ- .»І жмраи П.В 4,б' 100 33 гв.г 61,3 55 89,8 ЗІ ег.е 336 гаг 650 413 363 330 '

І- ' " ьу

і) 40 РСВД геїні ікетралі 9, Зі £.8 100 40 26,7 75,7 65 114,6 33,9 86 317,7 362 776 550 403 410

> 117* 72* юс;

г о,оаи ТРЇС- па -№р ен е,о *о.оооц гатд + + 0,0 у крїаіюзіавоа + + 0,25;! іхмюім * Спілка а) го ГОЛОге- яаі зкмрахт 12,4 1.1 ісо 33 В 31,5 36 79 зг 52 гзб 127 447 318 зза 207

* т 52?

б) 40 гомогенат зксіракт 13 6,4 100 31,3 5,1 3? 33 96 г7,з 66 9і,а 249 684 614 491.4 422

* вад ВУ

з о,5ї Ш * о.оза Хан Со( рН £,0 (рисім; Ьзіиі) вое злггр» ПМШІІ 3-6 часо; ГОЇОГЄ- 45,6 ■ 100 в 14 її,« 370 613 5?а

зїсіракт 15,7 34 . 20 44 го 31» 655 313

чое вкіїра-г<роіанге 10-12 часоь ос»аток ігуті- коа 26 5,в в.г 10,5 150 гіг 272

зксіракт 5 ю 5,1 29 14,7 25 142 72

Из остатка кгутиков воздействием растворов, содержащих дигито-нин (0,5%) , были выделены белки, .составляшио до 43£ от белков остатка или £5?» по отношению к общему белку пгутдаов (тебл.7). Выделенные белксг обнаруаивали АТіозную активность, стимулируемую ііє2+ и ингибируеыуз оуабаикоц, являвшімся ингибитором транспортных АТФаз (табл.8). На основании алектронно-иикроскопичесішх исследований, показавших, что остаток жгутиков, из которых были экстрагированы указанные белки,.состоял в основном из мембранной фракции, маяно сделать заключение о том, что мє2+ - стимулируемая АТФаэа, чувствительная к дейстзию оуабзина, относится к АКазам, связанным с мембранными структурами жгутиков.

Таблица 7

Выделение белков из остатка зггутиков Б.опсореіїі

'Выход белка|Aliазная активность на

; весь белок

Экстрагирующие растворы

Условия опытов

I мг

4-

т

% !без эк— і активаторы

їтиваро-і (5.10-3 )

I ров

І Ca I Mg2+

1

0,5%-ный дигитонин остаток + 0,04 И цистеин в жгутиков 0,03 Ы трисЧІСІ белковыЯ буфере рН 8,5 экстракт

15,8 100 142 173 117

7,0 43 35 63 73

Изучение свайств| Са2+ - АТФвзн кгутиков океореНя (Островская,Буриашева,Любимова,Алексеева,1972)

Са-+АТФаза игутиков, так ке,как и АТ5аза спермозина и ресничек 1;.руг1Гогт1э , обнару:и!вает некоторые черты сходства с миозином: так ие, кок и миозин, имеет два оптимума рН для проявления ферментативной активности: при рН 6,9 и 8,3 (рис.8^), причем активность более высокая, как и у всех упомянутых АЗФаз, в щелочной зоне рИ (8,2)» Сходство с миозином наблюдается в специфическом действии на ферментативную активность одно- и двухвалентных катионов. Как видно из данных таблицы 9, на АТФазу нгутикоз сильное активирующее действие оказывают ионы Са, увеличение АТФаэной активности в 3 раза . достигается при концентрации Са2+ с 5.10 ~3 М. Ионы ме Действуют

гак же, как и на миозин, оказывая ингибирухщее действие как и одновалентные катионы К йИа (.табл.9).

Таблица 8

АКазная активность к£ - ЛТФэзы нгутиков з.опсорезлі в присутствии различных ионов

1 ! Концентрация | 1 , 1- - и ----.... ---- - - ■■-. ¡Удельная ЛГФазная актив-

Ионы ; ионов М ность (.мкг р/иг белка/

| /10 мин

Без добаізки ионов

мЄ2+ 5.І0*"3

Са2+ 5.І0"8

+ Ка+ 5.Ю-3 Ме^чыа* оуеба:ш(Д»М)

+Ма+т К+ _п_ КЙ2+ + Ка+ + К+ +

оуабгин и кМ) -"-

20,8 29,5 20,8 27,1 20,8 20,8

20,8

_.Таблица 9

□ бІКЯ

Влияние ионов металлов на АТ5азнуа активность'кгутиков 5.оп-сорвігі (.содержание белка 0,2 мг/мл.АТФ - 1.10 1.1 ионов 5Л0~3 М, рИ 8,15)

Ионы

В отсутствие ионов Сз ********

Г,!ег+........

Ка+ ........

к+ ........

Саг+ + ма+ + к*..

(Удельная АТ5азнал активность І (мкг Р /ир белка / ХО мин.

19,0 53,0 16,3 18,2 16,5 3-1,1

Гр

100 280 85,8 95,8 85,8 180

Исследование специфичности ферментативного действия Са^+ - АТ5-азы ягугаков показало, что белок проявляет специфичность по отношению к А19 ітабл.10). В присутствии Мбг+ на фоне ингибированной АТФ-озной активности выявляется незначительная способность гидролизовать и*АДО, что, по-видимому, обусловлено совместным действие« МФазы и фермента типа аденилаткиназы, выявляемой такие и в белках ресничек

' Т. piriformis ^Gibbons, 1966), Ферментативной активности в присутствии АМФ, пирофосфата и fi - глицерофосфата не обнарукеио.

Таблица 10

Субстратная специфичность Са2+ - АТФазы ягутиков S.oncopelti Содержание белка 0,2 иг,концентрация ионов 5.Ю-3 М ,

Субстраты

Концентра- j Удельная АТФазиая активность

ция субстрат мкг Р/иг белка / 10 мин.

отсутст^ ! 7ГS+ Г" !вие ионов ! !

тов

tig

2Г

■ Ш 1.10

№ 2*10

АМФ 4.IO

Пирофосфат 5.10'

Р - глицерофосфат 6.I0-0 Ц

,-3

-3

1-3

2S О О . О

о

58,2 О О

о

О '

13

9,8

О

О

а

Ca2+ - АН>аза згутиков, так ке, как и миозин, чувствительна к действию сульфгідрильних ядов. Как видно на рис,5-, пэрахлормерку-рийбензоат в концентрации І.І0"5 моля ингибирует ферментативиуя активность на что свидетельствует о существенной роли sh групп в проявлении каталитической функции исследуемого белка.

Са2+ - АТїаза жгутиков, так же, как и АТФаза ресничек т.ругі-Гогшів и шюэина, является высокомолекулярным белком, иолекулярньЕіі вес равен 380 ООО - 400 ООО дальтона«.

Исследования зависимости скорости ферментативной реакции Са2+ - А1Фазы ягутиков от концентрации субстрата А*№ виявили эффект ингибирования активности избытком субстрата. Как видно из данных, приведенных на рис.13-А, при концентрации белка равной 0,26 иг/ил и активатора Со2+ - I иМ торигасние АТФазной активности наступало при равных молярных концентрациях АЇФ и Са2+ 1.1 чШ. Дпп выяснения того, не связано ли это иигибировоние с недостатком в инкубационной среде активатора Са2+, концентрация послсдного была увеличчина в 5 и 10 раз. Как видно из данных, представленных на рис.13 , при увеличении концентрации Са2+ в 5 и 10 раз ингибирование АИ>азноіі активности наступало при болео высоких концентрациях АИ> (.2 ull), но, как и в первой случае, замедлялась скорость ферментативной реакции при дальнейшем повышении концентрации АТФ. Для АТФазы миозина также характерно субстратное ингибирование, впервые установленные Хассельбахои

(, "Haaeelbach, 1952) и подтвержденное последующими исследованиями (Баев, 1958; Nanntnga.Mommaerta, 1960; Avena,Воиэп, 1971).

Рис.13 - А. Зависимость АТФазной активности Са2+ - АТФазы жгутиков s.oncopeiti от концентрации АТФ и Са2+: I - I иУ, 2 - S uU, 3 - 10 мМ. . „ Б. В координатах ДаМнуивера-Берка: начальная скорость реакции U/У) от начальной концентрации ATI> (i/S0).

На основании результатов исследований свойств АТЬез, выделенных из жгутиков сперматозоидов (спериозшю), из ресничек T.pyri-formie к кгутиков s.onoopeiti и сопоставления их со свойствами АТФазы ыышц - ыиозина (.Любимова, Знгельгардт, 1939,1942; Любимова, 1957; Vatanabe et al. , 1952; Gergely, I9SS), мояно сделать заключение о наличии некоторых черт сходства и различия этих АК>аэ. Сравнительные данные приведены в таблице II. Как видно из таблицы, для указанных белков хзроктерна АНФ-г^ролизующая способность, ферментативное действие специфично к субстрату ATt>; активаторами АТФаз ресничек и кгутиков, как и шюзинэ, являются ионы Са; для eojx АТФаз характерно наличие двух оптииуиов рН для проявления ферментативной активности, менее выразенный в кислой области рН 16,1-6,8) и более выраженный в щелочной области рН (.8,2-8,3). однако, в отличие от *АТЭаз> ресничек и кгутиков, оптируй рН для ииозина сдвинут в более щелочную зону рН (.9,0-9,2); АТФаэи ресничек и жгутиков, как и «ио-зин, чувствительны к ингибирущеау влиянию высоких концентраций тиоловых ядов (.1ШШ, CdCL„),однако иалые концентрации ПХМБ окаэива-

i ют активирую®а влияние ка АТФазную активность миозина t Kielley, Bradley, X95S; Kielley, 1965). АЭДазы ресничек и «рутилов, как и миозин, относятся к классу высокомолекулярных белков. МолекулярниЙ вес - АУЗазы ресничек T.pyriformion нгутиков S.oncopeiti

более близок; к молекулярному весу 11,1 М - фрагмента инозина (3,4-3,5х х I05) I sioyter, Lowey, 1967; Perry,' 1967) и равен дальтон.

Наряду с наличием указанных выше,черт сходства АТ1>аз ресничек и дгутиков с миозином, выявляются и некоторые различия в кинетических характеристиках этих белков. Безусловно, трудно било бы полагать, что сократительные белки выделенные из игутиков и ресничек простейших будут иметь абсолютно одинаковые с инозином высших животных каталитические свойства. Как видно из данных, приведенных в таблице II, величины удельной активности АИаз ресничек и ягутиков, выраженные для сравнения в значениях Qp , отличаются на порядок от Qp шозииа. Соответственно, величины констант Махоэлиса (.Ку) для АТ5 аденозинтрифосфатаз ресничек и жгутиков отличаются от миозина на порядок Стабй.П)', что свидетельствует о различной степени сродства этих ферментов к субстрату - АТФ. Можно было бы отметить и некоторое различие в субстратной специфичности исследованных АТ^зз, а именно, АТФазы ресничек и жгутиков в присутствии Со^+ строго специфичны и расщепляют только АТО, в то время как миозин способен расщеплять кроме АТФ и другие нуклеозидтрифосфатц (.ГГ5, ИИ, ЦТ5).

Таким образом, анализируя, приведенные данные, иокно сказать, ЧТО АТФаЗЫ ЖГУТИКОВ И реСНИЧеК ЦрОСТеЙШЛХ T.pyriformia и S.oncopeiti более близки по своим свойствам, как относящиеся к белкам .идентичных структур. В то время кок при сравнении с миозином наиболее близкие свойства обнаруживаются у спераозииа, выделенного из жгутиков сперматозоидов быка как по каталитическим, так п механическим свойствам.. Как было показано (.рнсХ), спермозин способен соединяться с актином из мыыц кролика с образованием актоспармозина и давать иеханохимический эффект но воздействие А1Ф, подобно екто-миоэину. Тем С-эаыи было доказано наличие в спермозиие свойств, присущих сократительным белкам мышц, то есть способности взаимодействовать с иакро эргом - АК>.

Таблица II

Свойства АЗФаз миозина, спернозина, ресничек т.piriformis,

ЖГУТИКОВ S.oncopelti

1 i Аденозинтри&осфатазы

! миозина j U) ¡спермозина f i (Ресничек : T.pyrifor-t mis ¡жгутиков : S.onco-j pelti

Субстраты АТФ.ИТСчГК.ЦТФ AW АТ1> AT»

Активаторы Са2\ К^, mi]. Са2+ CaS+ ca2+

Ингибиторы ШВ.Ке^ ПДШ, Cd++ ПХИБ ПХМБ

Оптимум 6,2 - 6,3 8,3 6,3 6,8

рН 9,0 - 9,2 8,3 8,2

Оптимум чем-

пературы °С 37 36 30 35-38

НцДЛЯ ATi 5Л0-;> 5.10-i> 2,5 Л О-4 6,6ЛО"4

С.В молпх) U) (б) 3,6ЛСГ4 U) (Г)

Молекулщний 5 Л О5 _ 4,0 Л О5 4.I05

вес U) 4,58.10s (е)

Qp 2500-3000 200-300 200 200

X) Любимова, 1957; a) ^atanabe et al., 1952; <5 ) Kaauo et 1972; В ) Vogelmayer et al., 1969; Г ) Raff, Blum, 1969; д ) Gergely, 1966; e ) Godfrey, Harrington, 7970.

ГЛАВА - 1У

Участие ATO в двигательной фуиккии сперматозоидов и инфузорий T.pyrtformta

л ■

Целью наложенных в этой главе исследован и ¡i било выяснение непосредственного участия ATO в осуществлении двигательной функции ресничек и ягутиков, исследования связи энергетических процессов инфузорий и семенных клеток с ресинтеаоа ыакроэрга - AT?.

, В первую очередь было показано, что основным макроэргам простейшего т.pyrifórrale и сперматозоидов (.быка) является ATO. Абсолютное содержание AT? в кгутикзх спермиев, снэбнешшх митохондриями, встроенными в кгутшс, ко два порядка вше, чем в ресничках: в расчете на сухой вес содержание А1Ф в спермиях составляет 20 мкиоль, а в ресничках 0,21 ыкмоль. Определение A Ti биолюминесцентным методом ^Федорович, IS68; «icElroy , 1947) показало, что содержание АТФ в одной ресничке соответствует ЭЛЛО"*2 микромоля«.

Об участии АК в осуществлении двигательной функции ресничек ц «гутиков можно было судить, изучая- превращения ео в свягги с движением спермиев и инфузорий.

Результаты исследований показали, что при длительной инкубации сперматозоидов И инфузорий Т.pyriformio в аэробных условиях в присутствии глюкозы, где имеются условия для осуществления процессов гликолиза и дыхания, соответственно постокнноау уровня ATÍ, сохраняется и хорошая подвинность ^рис.142. ) этих клеток. Регангез АТ5 компенсирует одновременно протекающие процессы дефо сформирования ее, доставлял ода энергию для двшхения ceueiitioit клеткл и инфузорий.

Многочислен шин исследованиям било показано, что аэробное окисление внутриклеточных субстратов сперматозоидов - фосфолипидов и аэробное расщепление углеводов приводят к ресинтезу AIS Mann, 1949,1964). Энергия окислительных и гликолнтическик процессов акку-' мулируется в фосфатных связях А1Ф (.Знгельгардт, 1946; Иванов, 1945-46; Иванов,Бурнашево, 1945; Бурнашева, 1947,1960; l.iami, 1945, 1949,1954,1964; Lardy,Phillips, 1945» Bishop, 1962; Llohry, 1957).

Нашими исследованиями было показано, что ресинтез Л Tí в с ¡тор-lia т озон д эх И инфузо'риях T.pyriformle сопряжен с фосфорллировэниеи в цепи дыхания. При добавлении к активно двигающимся тетрахцценам и сперматозоидам динитрофенолз (.ЛНО) а концентрации I.I0~5-ft.I0~%t

ч

наблюдалось постепенное замедление двикения и убыль содержания АМ (табл.12). Несмотря на интенсивное дыхание и аэробные условия, 1 присутствии д;!? отсутствует ресинтез АТФ вследствие разобщения фос-форилирозанля с дыханием, а поэтому обнаруживается низкий уровень А2Ф, нодостаточной для обеспечения нормальной подвижности сперматозоидов И инфузорий Т.руг1Гогт10.

•Таблица 12

Содержание нуклеотидов в сперматозоидах быка ( I ) и инфузориях Т .руг1Гогга1а I И ) в шкромолях на мл. клеток

Сперматозоиды

без добавки;+ ДНО

Т.ругіГйгтІа

¡без добавт +

: ни :.

КІ.ІО"5 м і

ки !ПЛО~]

1,0 0,31

0,6 0,41

0,58 1,0

М)

ЛТ5 ¡■■Ю

0,3

При выключении обоих процессов, осуществлякнцих ресинтез АТФ: дыхания (добавлением ЯаСЯ или МаН5 в концентрации Ю~3-Ю"2 М) и гликолизе (.в присутствии МаР (IЛО-" !1) ) наблюдался распад АХ5 и падение интенсивности двикения сперматозоидов (рис.14-). То не с а!.: и с наблюдалось при проведении опытов с тетрахяменами (Бурнаое: а,Э11рс^е11К0, 1362). При восстановлении условий гликолиза или дыхания, обеспечивавших ресинтез АТ5, с появлением аналитически обнаруовеешх количестз АМ (.рис.14, а,б) подвианость спермиев и инфузорий вновь восстанавливается.

Полученные данные позволяют заключить, что энергия окислительных процессов г:одв1шиух инфузорий Т.руг1Гогт1ои сперматозоидов используется для синтеза иокроэршческих фосфатных связей ЛЮ. Основной реакцией, за счст энергии которой осуществляется двигательная функция этих клеток, является, как и в мкице, реакция гидролитического расцепления АТФ, катализируемая АТФазой, локированной в основных сократительных структурах - в периферических и центральных фибриллах ресничек и кгутикоз.

а.

Рис,14 - Анаэробный распад к гликолитический ресзнтез ATD в спермиях; а) изменение содержания нуклеотидсв: I - в исходной пробе; 2 - при выключении дыхания и' гликолиза; 3 - при восстановлении гликолиза.

б) Содержание А"И в цишшдной пробе t I ); Я - то ке, на 60-й минута добавлена глюкоза.

Исследование структурных превращений ресничек T.pyriformts пол влиянием АТ1>

Непосредственное взаимодействие АТЗ с белками фибриллярных и мембранных структур ресничек было обнаружено электрошшмикроскопм-ЧЄСКИМИ исследованиямп^поперечных срезов ресничек T.pyrt formic, подвергнутых воздействию А1Ф. Пол в .та ян нем А1Ф (,в концентрации 0,5-2 мШ происходит сокращение ресничной мембраны ка 6О—VQS» мат-рикса и периферических фибрилл на 20-30^ от исходных величин Чабл.ІЗ), а такие изменение внутренней структури фибрилл ресничек: перестройка внешних двойных фибрилл в одинарные. В результате пе-

рестрой:с( под воздействием ATS на поперечных срезах ресничек вместо о бич пой картини расположения фибрилл по типу ЭХ2+Е наблюдается картина 9+2.

На основанни полученных данных можно полагать, что в результате взаимодействия контрзктильных белков фибриллярных структур реснички с ATJ происходит перестройка упаковки сократительного белка в состазе периферических фибрилл. Возможно, следствием этого взаиио-действал является трансформация химической энергии АЮ в механическую работу реснички. По-видимому, процесс сокращения мембраны, метрик с а и перестройка фибрилл осуществляется при непосредственном участии А ТІ ази, локализованной в этих структурах.

Таблица 13

Размеры ресничек т.piriformis (в 8) до и после воздействия ATS

,to,5-І ыМ)

Т

Ижазатель

контрольные

Рес,,шчки-1- Сокращение

;инкубированкие с! %

I. Внутренний диаметр

реснички .1300-2000

2. Расстояние мезду центральный:! и периферический:! фибриллами

430-630

АТФ

1400-1600

208-453

20-30

30-52

3. Расстояние между ресничной мембраной и внешними фибриллами

150-220

50-91

60-70

4. Расстояние между центрами центральных г,и брил л

444

208-325

25-54

5. Диаметр одной периферической фибриллы 240-260

166-200

20-30

Примечание: каздая величина соответствует среднему измерению из сделанных на 5-Ю »лектронкоыикроскопических фотографиях тонких срезов.

ЗАКЛЮЧЕНИЙ

На основании исследования свойств 'АТФаз, выделенных из котиков сперматозоидов быка, ресничек инфузорий т.руг^огяив и жгутиков простейшего э.опсореИ;!, и сопоставления ИХ СБОЙСТВ со свойствами сократительного белка шац - миозина монно считать установленным, что основным сократительным белком ресничек и кгутиков является миозиноподобный белок, локализованный в фибриллярных структурах этх оргапелл движения. ДТФазная активность присуща белкам, входящим в состав периферических и центральных фибрилл, она локализована в глобулярных белковых субъсдиницах, составляющих кон-трактильнае фибриллы ресничек и кгутиков.

Показана непосредственная связь энергетических процессов, обеспечивающих ресинтез АТФ, с двигательной функцией подвижных клеток инфузорий и сперматозоидов. Основной реакцией, за счет гшоргии которой осуществляется двигательная функция ресничек инфузорий и жгутиков сперматозоидов, является, как и в мышце, реакция гидролитического расцепления АТФ, реакция, катализируемая АКазой, .локализованной в основных сократительных структурах этих органелл движения - в периферических и центральных фибриллах.

Показано сокращение мембраны ресничек т.рупгогт1и и перестройка упаковки сократительного белка в составе периферических фибрилл при взаимодействии с ЛТФ. Предполагается, что процесс сокращения мембраны и перестройки фибрилл реснички осуществляется при непосредственном участии АТФазы, локализованной в этих структурах.

Двигательная функция ресничек и игутиков осуществляется за счет энергии систеиы Л1Ф - АТФаза - сократительный белок.

ВЫВОДЫ

1. Эдектрснно-ыпкиоскопическпми исследованиями ультратонкой структурной организации кгутиков сперматозоидов бика, ресничек ин-фузораіі т.ругіг-огтіа ц кгутиков з.опсорех-ы показано, что сократи те льни ¡і аппарат этих органелл движения состоит из фибрилл, имеющих трубчатую структуру и упакованных по общеизвестному принципу 9X2)+ 2 _7: две контроль низ фибриллы окружены девятью " сдвоен:; ами периферическими фибриллами.

.Показано, что центральные и периферические фибриллы в свою очередь построены из сферических глобулярных белковых субъздиниц диаметр)« 60 й у ресничек и 70 К у игутаков. Субъединицы регулярно упакова ш в продольно ориентированные прямые цепочки вдоль фибрилл с повто мюцоііся периодичностью в 60 Я у ресничек Я Є0-14О д у кгу-тлкоэ.

2. Методом электронно-микроскопической гистохимии показана докализщия А'ГІази, Іермента, являющегося основным компонентом сократительных систем, в фибриллярных структурах ресничек т. ругіГог-• :ріє. АГуаза связана с глобулярными белковыми субъёдиницами периферические и центральных фибрилл, то есть является интегральной частью иократитзлыюго аппарата реснички.

3. Показана индуцированное А Ті сокращение мембраны реснички ї.ругі Гогміій л перестройку упаковки периферических фибрилл из

дзойных 9x2) + 3 в одинарные ¿~Э + 2_7, обусловлепноо непосредственным взаимодействием АТФ с белками мембранных а фибриллярных ;труктур реснички. Предполагается, что процесс сокращения и перестроена упсковкл периферических фибрилл осуществляется при непосредственном участил А^ози, локализованной в этих структурах.

' Разработали методы изолирозания ресничек и жгутиков і: иэ-бирателі.ного экстрагирования из них АТ5>аз, локализованных в мембранных ифибриллярных структурах ( Са^*- АТФазы, - АЇФази, К1" + + Ыа+ + - АТСазіЛ Исследованы каталитически;- л ыеханохишчес-кие своііствз выделенных белков.

5. Показано, что выделенный впервые из кгутиков сперматозоидов быка сократительный белок спериозин обнаруживает сходство с палочный белком миозином по некоторым каталитичоским и иохапо-хиыическии свойством: снермозии, подобно миозину, обладает АТФазной активность» с оптимумом рН действия, близким одному из оптимумов р!1 инозина (.8,3 - 8,5 ); подобно АЗФазо миозина, АКаза спермозина активируется Са^*; спериозин извлекается солевыми растворами, прииснленыии для выделения миозина; сперкозин, подобно миозину, образует комплекс с мышечным белком актшюм - актоспермозин, проявляющий, подобно актомиозину, мохон0-ХНМИЧЄС1ШІІ эффект на воздействие АТ>. Полученные результаты свидетельствуют о структурной специфичности

и сходства центров взаимодействия миозина и спермозина с актинон.

6. Из фибриллярных структур ресничек т •РУГІҐОГІПІ.Ц П ягутиков з.опсореїм выделены белки, обнаруживающие АТФазнуа -активность и

составляющие до 4С?э от общего содержания белков ресничек и жгутиков. Обнаружено сходство АТФэз ресничек и кгутиков с миозином: по специфичности к субстрату АЇФ, активируемости ионами Со, наличию двух оптимумов рН для проявления ферментативной активности 1.6,3-6,9 -6,9 и 8,2-8,3}ДТФазыресничек и кгутиков, как и миозин, пвляютсн высок ом олекулярнши белками I и.б. 3,8 - 4 х І05 дзлътон ). Наряду со сходством обнаружено отлично АТФаз ресничек и кгутиков от іаіозниа по величине каталитической эффективное га Чр и кт я по аминокислотному составу.

7. Показало наличие + ма+ + ¡Лд2+ - активируемых и оуа-баин-чуветвительных АТФэз, локализованных в мембранных структурах ресничек т.ругіїогиів и жгутиков З.опсореіїі. Эти болки составляют 20 - 30$ от общих белков ресничек и ягутиков.

8. Установлено, что основным ыакрооргом, обеспечивающим энергией двидение сперматозоидов я инфузорий т.ругіґогтіс,является АТФ, составлявши от 50 до 70£ от всех нуклеотидов этих клеток. Определено содержание АТФ в двигательных структурах - ресничках и жгутиках. Показано, что содержание АТФ в нгутике сперматозоидов составляет 20 шшоль/г сухого веса, в ресничках 0,21 мкмоль/г сухого века ресничек. Содержание АТФ а одной ресшчке тетрахимен соответствует 3,1»10~*2 шкромолям.

9. Пэкозало непосредственное участие АТі> в осуществлении двигательной функции ресничек и ¿try ти к си. Выявлено наличие тесноії корреляции меаду уровнен ATS в клетке и интенсивностью движении спериото ісидоз и одноклеточных про с твій их т. руг і formis. Гази;:'енне сперматозоидов и инфузорий возможно при наличии определенного уров ня АГО, юддер^івае^ого нормальним течением энергетических процессов - яькан'дя и гликолиза. При выключении этих провесов параллель но сншсе:ша содержания АК> падает и интенсивность движения их вплоть дз полной неподвижности, наступающей к моменту исчерпания имевшихся запасов АТЗ. При восстановлении условий гликолиза и ды- . хания, о¡еспечпзелглх ресиктаз АТ>, с появлением аналитически об-IIарунивазмцх количеств ДТФ подвианостъ сперматозоидов и инфузорий вновь восстанавливается.

10. Лслученные экспериментальные данные дают основание заключить, 4TJ чолокулярпо-химические основы функционирования ресничек а агутикоа, являющихся органеллака дзпкенпя просто Шлих ,T.pyrifjr-raia и :;.oncopoiti, а такие сперматозоидов аналогичны таковым мышц и других немыиечных подвинных клеток. В мерцательном, синхрон нем биеїмн paєничек и волнообразном двикеиии кгутиков простейших

и сперматозоидов участвуют ипозикоподобные белки, лскелизозэнные в фзбриллярных сократительных структурах ресничек и лгутикоз.

Двндітсльизя функция ресничек и жгутиков, как и сокращение мышцы, осуществляется за счет энергии системы ATJ> - ATiaaa -- сократитольный белок. ■

Результаты проведенных нами исследований по выяснению биояши ческих озноз двигательной функции ресничек и нгутиков простейших и кгутикоз споруагоsonдоз могут служить теоретической основой при разработке практических задач, связанных с выявлением причин иммобилизации двигательного аппарата подвижных клеток - сперматозоидов ведущих потере оплодотворяющей способности семенных клеток; при поисках ;редств иммобилизации двигательного аппарата патогенных протозоа, вызывающих заболезония человека и животных.

Список

работ, опубликованных по материалам диссертации

1. В.А.Знгелыардт, С.А.Бурнашева. 0 локализации белка есераозина

в семенных клетках. Биохимии, 22, 554-SG0,

1957.

2. С.А.Бурнашева. К характеристике сократительного бзяка семенных

клеток спермозкиа. Баохииия, £3, 558-SC3,

1958.

3. С.А.Бурнашева. Значение процессов фоефорилированип в осуществле-

нии двигательной функции семенной клетки. Тр. Ии-то Зксп. «ед. Акад. Нед. Наук СССР, £31-142, I960.

4. С.А.Бурнашева, Ц.В.Ешрекзяко. АдешшоЕЫе нуклеотиди к еденозин-

трифосфатазная активность инфузорий вида pyrtforata, докл. д!{ СССР, IS7, 203-205,1931.

5. С.А.Бурнашева, М.В.Ефрсмспко. О биохимических основах движения

кгутиков и ресничек. У Кекдуцародшй биохимический конгресс. Рефераты секционных сообщений. тЛ,- 413, I9SI.

6. С.А.Бурнашева, М.В.Ефременко. Роль АТ$ в двигательной функции

инфузорий вида т.руг-iforoiia. Биохимия, 27, I, 167-172, ISS2. '

7. С.Л.Бурнашева, М.В.Ефремешсо и IL П.Чумакова. Структурная орга-

низация и некоторые биохяшчесвио основы движения ресничек. Тезаси докл. I Всесоюзного бпохии. съезда, I, 4S-47, 1964.

8. С.А.Бурнашева, М.В.Ефремонко и Н.НЛЬбшлсва. Исследование эде-

иозинтрафосфатозсо;! активности изолированных рсспичск инфузорий T.pyriformle ц пиделение из них аденозинтркфосфатазы. Биохимия, 23, 547-551, 1363.

9. С.А.Бурнавева, Л.Г.'Оедсрова и М.Н.Лабиуовз* Структурная органи-

зация и биохимические основы движении ресничек и вгутикоз. Успехи совр. биол. 56, 335-380, ■I96S.

10. Л.Г.Федорова, С4Л Зуиіеі'еьо- Э л з к тро іпю-жк :>о с к о пн ч е с;с.-.е ис-

слодозінпе топкой структуры ресничек инфузорий T.piriformis. Цитология, 5, G89-691, IS63.

11. С.А.ІЇурнашзва. Биделеіша сократительных белков из ресничек

T. pyriforœia и исследование их своііств, Б сб. Prosr.Protoiîooloçy, AM3tr,ii-Y, .London, 259,19б5.

12. С.А.5урнсшезз, 0 элементарных дшмоіші яивых су-

цсстз, Успехи совр. биол. химии, 7, 337-234, ІЕ55.

13. С.А.Зурнашеза, М.В.Е^реиенко, Л.П.Чумакова и Л.В.Зуева, Выде-

ление совратительных белков из ресничек т.ру-rifor.-nls и исследование их свойств. Биохимия, 30, 765, IS65.

14. С.А.Зурнашева. Участие АТО в двигательной Функции инфузорий

Ї.РУГІҐОГШІЗ. Тезисы докл. Всесоюзн. Конф, по ■ ' мизечнсіі биохимии, "зд-зо Наука, 22-23, 1966, Н.-Л.

15. С.А.пурнашева.Participation of ATFase and ATP in the recula- ■

tion of motor function of Tetrahyaiena pyrt-forліз.Abatr.Coram,4th Meeting of Ь'ЗВЗ, 1 15,Univ. Oslo, 1967.

16. С.А.Зурнашева, Т.а.Карау^озз. Учогаїб Al» в двигатель кол

функции инфузориі! т.pyrlforrcta. Биохимик, 32, 270-275, ISS7.

17. С.А.Буриаизвэ, Н.В.Раскидная. К характеристике АТФазы ресни-

чек ï.pyriforisio. Докл. АН СССР, 173, 719,1238.

18. С.А.Бурнааегз, Г.А-йрззи. Ультраструктура ресничек и игутов

и влияние на них АТ5. Тезисы докл. Симпозиума по Биофизике и Биохимии ыьяицы, 40-Я, 1238, Тбилиси. 13. С.А.Бурнауева, Г.А.ЮрзпНО. -be ultrostructuro end localization of ATï^se activity of Tetrahymsna pyrlfor-nis cilic. Suirxiary Reporta of "bird Intern.Cong. IHctochcn) and Cytochom. ,27,Sprinsor-Vcrlos,K-Y., 19ЄЗ.

20. С.А.Еурпзаева, Г.А.Юрзииа и Н.В.Еескровнова. Ультраструктура Й.-лЗрплл ресничек ї.pyriformie. Цитология, 10, 249-251, IS38.

21. С.А.Бурншевз, У.Б.Островская и Г.А.Юрзина. Ультраструктура

Зїгутов s.oncopelti. Докл. АН СССР, 181, 213-215, 1968.

22. С.А.Буриашева, U.В.Островская и Г.А.Юрзина. Thu ultreetructu-

ro of flagella in Strigomonao oncopeltl. Acta Frotozool., 6, 557-362, 19^3.

23. Д.Я.Дайя, С.А.Бурнаиова, М.Н.йзбиг-оза. Исследование фермента-

тивных и ф::зшсо-Jiiiшческих свойств белков ресничек т,pyriformio. Тезисц докл. Симпозиума по Биофизике и биохимии ишц., 40, 1958, Тбилиси.

24. С.Л.Бурнаиева* Влияние АТФ по тонкую структуру ресиичек í.pyrl-

formis и сгутов s.oncopeltt. Тезисы дзкд. П Всесоюзн. биохим. съезда» Изд-во ФАН, Уз.ССР, 1969.

25. С.А.Бурнаиіева, Г.А.Юрзина и М.Н.Любимова. Ультраструктура ісгу-

ТОВ S.oncopelti и ресничек T.pyj-íformts и локализация в них одекошштрифосфатэзи. Цитологии, II, 695-G99, ISS9.

26. С.А.Бурнашева, Д.Н.До£ія и Г.А.Юрзина. Извлечение сократитель-

ных беЛКОВ ИЗ ИНФУЗОРИЙ l.pyriformin и І1ССЛ0-дование их свойств. Биохимия, 34, 443-44Э. 1969.

27. С.А.Вурнасвва, М .¡I.Любимова-Энгельгардт, Г.А.Юрзина. Ультра-

структура ресничек и агутов и влияние АТО на шіх. Тезиси докл. И Кеядуиародн. Конгресса Про-тозоологов, Изд-во Наука, Л., 177, 1969.

28. U.B.Островская, Г.А.Врзпна, С.А.Бурнашева. Исследование фермен-

тативных свойств болкоз жгутов S.oncopelti. Тезисы докл. Ш Меглународи. Конгресса Протозоологов, Изд-во Наука, Л., 151, 1939.

29. Дайя Д.Я., С.А.Бурнзиева и U.iLJLo6:uiOBa. Исследование фермен-

тативных и физико-химических свсйсїв белков ресничек т. руг i f о rmie ,В сб. Биофизики и биокикия мышочн. сокращения. Кзд-во АН СССР, Москва, 1971.

30. Д.Я.Дайя, С.А.Буршшева и М.Н.Ллбшсзс. Исследование аденозин-

трифосфатазных свойств белков ресшічек'r.pyrl-formia. Докл. Atl СССР, 197, 962-965, 1971.

31. М. В. Остров екая, С.А.Бурнмева и М.Н.Любимова. К характера макс ЛЮаз ;::гутсв. Тезисы докл. И Симпозиума по Биофизике шеечного сокращения, Ереван, 1971. 82* С.А.Ьурпоювз. Ультраструктура и функция двигательного аппарата простейших. Лроблемы происхождения и сущно-стл. лизни, ред. А.П.Опарин, 1973. ЙЗ. М.Б.Островская, С,Д.Бураопозо, МЛ.Йебикова. Исслздоаатое аде-!Еозы!1трифзсфатозних свойств кгутов З.ОПСо-ре1-61 и выделенных из них белков. Докл. АН СССР, 202, 475, 1972, ' •

34. С.А.Бурнашева. Ультраструктура и свойства совратительных бел-

коз ииац и немшечнш: клеток. Успехи совр. б;:о:=11Г.иь 13, 80, 1972.

35. а.В.Острозская, Г.А.К?рзапа, Ы.Л.Алексеева, С.А.Вурнэиевз а

Ц.Н.Любимова. Исследование Са^+- АТ-Зазы игутп-коз з.опсорсИ:!. Биохиияя, 33, 1002- 8, 1973. 33. С;А.Рурнзкева, Г.Л.йрзина. Удьтрэструктура ресничек к кгутшгов к ьдипние на них АТО. В сб.' ('еханизыц иыточного сокращения, 175-183, 1972, ,Цос'квз.

37. М.В.Островская, Г.А.Юрзина, С.А.Бурнааева. Исследование фермен-

тативных свойств о'елкоз сгутов З.опсоре1г1. В сб. Механизмы кыаечного сокращения. 153-106, 1972, Москва.

38. Д.Я.£е11я, С.А.Бурнзшева, .Ц.Н.Лэбимозв. Исследование аденозин-

ТрКфОСфЭТЭЗНЫХ СВОЙСТВ белКОВ реСНИЧеК Т.руг!-Гогы1а.В сб. Механизмы мышечного сокращения, 167-174, 1972, Носило.

39. Ц.В.Сстрозская, Г.А.Юрзанз, С.А.Бурнгшсва, И ЛI. Л^С'л м оз а -Зл ге ль -

гардт. К характеристике жгутиков

з.о^сор^И?!* Тезисы езкц. докл. 17 Иевдуна-родкого Биофизического конгресса, т.2, 355, 1972, Кзд-зо А11 СССР, Москва.

40. С.А.БурнБаезэ,. Н.п.Лзбимова, Г.А.Юрзина и Д.Я.Дп'Ьг. К характе-

ристике АТФаз ресничек т.руп г.-гепю.В со. Биофизические основы и регуляции процесса мышечного сокращения. Изд-ро АН СССР, Пущино-на--Оке, 157, 1372.

Материалы диссертации били долозены;

1. На У Международном биохимическом конгрессе, Москва, 1361.

2. На Всзсоюзных биохимических съездах - Ленинград, 1963, Ташкент, 1969.

3. На !.'е.ядународных Протозоологкческих Конгрессах - е Лондоне, 1965 I1. и в Ленинграде, 1929 г.

4. Нз И Международном Конгрессе го Цито и Гистохимии, США, 1958.

5. На Всзсоюзных Симпозиумах по Биофизике и Биохимии мышц.Москва, 1964, Тбилиси, 1933, Ереван, 1971.

6. На 1У Кевдунзродном Биофизическом Конгрессе, Москва, 1972 г.

________________2ак-_21бО____

Типография ХОЗО Госплана СССР