Структурная характеристика белка YB-1

Гурьянов, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная характеристика белка YB-1
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная характеристика белка YB-1"

Нап^^хр^^тси

ГУРЬЯНОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА УВ-1

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ОКТ 2012

Пущино - 2012

005053559

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка РАН.

Научный руководитель:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Овчинников Лев Павлович

Официальные оппоненты:

Тер-Аванесяп Михаил Давидович, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, заведующий лабораторией молекулярной генетики.

Никонов Станислав Владимирович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН, главный научный сотрудник.

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова».

Защита состоится «18» октября 2012 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д002.038.01 при ИБК РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан «18» сентября 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета '

кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в семейство белков с доменом холодового шока. В цитоплазме YB-1 упаковывает и стабилизирует мРНК, регулирует ее трансляционную активность. В ядре YB-1 может участвовать в репликации и репарации ДНК, выступает в качестве фактора транскрипции, а также принимает участие в регуляции альтернативного сплайсинга. Кроме нуклеиновых кислот, YB-1 может взаимодействовать с множеством различных белков.

На клеточном уровне YB-1 участвует в регуляции пролиферации, дифференцировки и ответа на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей вызывает серьезные нарушения эмбрионального развития, что приводит к пренатальной или постнатальной ранней гибели. Внутриклеточное содержание YB-1 часто увеличивается в раковых клетках, поэтому этот белок рассматривается в качестве одного из маркеров злокачественных опухолей (Елисеева и др., 2011).

YB-1 содержит 324 аминокислотных остатка, среди которых преобладают остатки аргинина (12%), глицина (12%), пролина (11%), аланина (9%) и глутамата (8%). Преобладание положительно заряженных остатков определяет высокое значение изоэлектрической точки pi 9,5 (Minich et al, 1993). Белок состоит из трех доменов: N-концевого аланин/пролин-богатого (А/Р) домена, высококонсервативного домена холодового шока (CSD) и С-концевого домена (CTD), отличающегося наличием чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислот. К настоящему времени известна только структура CSD, определенная методом ядерного магнитного резонанса (Kloks et al, 2002). Домен представляет собой Р-бочонок, образованный пятью р-тяжами. CSD содержит мотивы РНП-1 и РНП-2, благодаря которым способен специфично и неспецифично связываться с нуклеиновыми кислотами. CSD также участвует в связывании ряда белковых партнеров YB-1. Согласно данным ЯМР, CSD YB-1 имеет низкую стабильность: при 25 °С в растворе только около 70% молекул CSD находятся в нативном состоянии (Kloks et al., 2004), в то время как температура плавления белка-гомолога Ее-CspA из Escherichia coli, по данным микрокалориметрии, составляет 56 °С (Petrosian & Makhatadze, 2000). Такое различие в стабильности CSD про- и эукариот связывают с

наличием в СББ белка УВ-1 длинной подвижной петли, которая отсутствует в прокариотических белках.

О структуре доменов А/Р и СТБ известно мало. Ряд данных указывает на отсутствие регулярной вторичной структуры в этих доменах. Так, гомологичный белок Р1ШУ2 со сходным аминокислотным составом имеет спектр КД, характерный для полипролиновой спирали второго типа (Матуа! е1 а1., 2001). Кроме того, сообщалось, что согласно предсказаниям неструктурированных участков с использованием разных алгоритмов белок УВ-1 на 87% неупорядочен (Тотра & Сяегте1у, 2004). В А/Р-домене был обнаружен участок связывания актина (Яигапоу е1 а1., 1999). СТО характеризуется большим содержанием положительно заряженных аминокислот и обладает высоким неспецифическим сродством к нуклеиновым кислотам. В этом домене сосредоточено большинство участков взаимодействия с белковыми партнерами УВ-1, а также сигнал ядерной локализации, сайт удержания в цитоплазме и место расщепления белка 20Б протеасомой (Елисеева и др., 2011).

В нашей группе было обнаружено, что в растворе белок УВ-1 способен образовывать олигомеры массой до 800 кДа (Еус1октюуа е1 а1., 1995). С помощью электронной и атомно-силовой микроскопии было определено, что адсорбированные на подложку олигомеры имеют округлую форму, диаметр 35-40 нм и высоту 9-10 нм (БкаЬкт е1 а1., 2004). Образование олигомеров происходит, по-видимому, за счет взаимодействия противоположно заряженных кластеров аминокислот в СТО разных молекул белка. Интересно, что при насыщении мРНК белком УВ-1 наблюдаются похожие олигомеры, при этом мРНК, по-видимому, находится на поверхности олигомеров.

Цель и задачи исследования. Представленная работа посвящена изучению структуры белка УВ-1 в олигомерных комплексах в растворе и в составе фибриллярных структур. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить вторичную структуру УВ-1 в растворе; 2) исследовать термодинамические параметры белка УВ-1; 3) оценить компактность белка и размер и морфологию олигомерных комплексов в растворе; 4) определить участок белка УВ-1, отвечающий за образование фибрилл; 5) проверить способность белка УВ-1 и его фрагментов образовывать фибриллы при разных концентрациях солей; 6) проверить наличие признаков амилоидной

структуры в фибриллах YB-1; 7) исследовать процесс формирования фибрилл YB-1.

Научная новизна работы. Данным исследованием установлено, что в белке YB-1 в растворе присутствуют три типа вторичной структуры: клубкообразная, поли(Ь-пролиновая) спиральная второго типа и ß-структурная (небольшое количество). Обнаружено, что домен холодового шока белка YB-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении. Определено, что олигомеры YB-1 могут достигать молекулярной массы 1010 кДа и иметь радиус инерции 106 Ä. Показано, что в составе олигомеров белок YB-1 компактен, что указывает на наличие достаточно развитых внутримолекулярных взаимодействий, хотя и недостаточных для формирования жесткой третичной структуры. Установлена способность олигомеров YB-1 распадаться при понижении концентрации белка.

Обнаружено, что в условиях высокой ионной силы YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы. За образование фибрилл отвечает CSD; А/Р-домен стимулирует фибриллообразование; первая половина CTD блокирует образование фибрилл, а его вторая половина снимает блокирующее действие первой половины. Доказано, что фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными. Показана способность фибрилл YB-1 распадаться при понижении ионной силы до физиологической, что отличает фибриллы YB-1 от большинства известных амилоидоподобных структур. Установлено, что фрагменты YB-1 без CTD обладают способностью образовывать фибриллы и при физиологической ионной силе. На основании опытов на фрагменте белка YB-1^29 предложена модель организации фибрилл.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: VIII European Symposium of the Protein Society (Zurich, Switzerland, 2009), International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Moscow-Pushchino, Russia, 2009), The 4th international IMBG conference for young scientists "Molecular biology: advances and perspectives" (Kiev, Ukraine, 2011); на ежегодных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, 2011), ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино 2010, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе четыре статьи в реферируемых журналах и одна статья в периодическом сборнике из списка ВАК.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа содержит 20 рисунков и одну таблицу.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Исследование белка YB-1 в растворе

1.1. А/Р-домен и CTD белка YB-1 предсказываются как неструктурированные

Анализ гомологии белка YB-1 с известными белками показал наличие

высоко консервативного домена CSD. Фланкирующие CSD

последовательности были обозначены как А/Р-домен и CTD (рис. 1, а).

неупорядоченность

-г

100 150 200 250 номер аминокислотного остатка

Рис. 1. Предсказание вторичной структуры в белке YB-1. (а) Доменная структура белка YB-1. (б) Предсказание распределения a-, ß- и нерегулярной структуры в белке YB-1 по алгоритму PROF (Ouali & King, 2000. http://www.aber.ac.uk/~phiwww/prof7). (в) Предсказание неупорядоченности в белке YB-1 по алгоритму PONDR VL-XT (Li et al., 1999. http://www.pondr.com). Оценка >0,5 означает неупорядоченность.

Известно, что CSD белка YB-1 имеет структуру ß-бочонка. Для оценки возможной структуры остальных участков YB-1 мы провели компьютерный анализ аминокислотной последовательности с помощью алгоритма предсказания вторичной структуры PROF (Ouali & King, 2000) (рис. 1, б). Результат указывает на наличие ß-тяжей в CSD, что хорошо согласуется с экспериментальными данными. В то же время это предсказание указывает на отсутствие а- или ß-структуры в доменах А/Р и CTD, что может говорить о неструктурированности полипептидной цепи в этих доменах. Для подтверждения предсказания неструктурированности мы провели анализ аминокислотной последовательности YB-1 с использованием специализированного алгоритма предсказания природной неструктурированности белков PONDR (Li et al., 1999) (рис. 1, в). Полученный результат также указывает на неструктурированность доменов А/Р и CTD. Таким образом, большая часть белка YB-1 может быть неупорядочена.

1.2. Спектры кругового дихроизма указывают на большое содержание клубкообразной формы и структуры поли(Ь)-пролииовой спирали второго типа

Для экспериментальной оценки содержания элементов регулярной вторичной структуры в белке YB-1 мы измерили спектр кругового дихроизма при 25 °С. Полученный спектр имеет минимум при 200 нм и слабо выраженный максимум при 220 нм (рис. 2, а). Такая форма спектра характерна для структуры поли(Ь)-пролиновой спирали второго типа (Sreerama & Woody, 1994). Известно, что при повышении температуры

Рис. 2. Исследование белка YB-1 методом спектроскопии кругового дихроизма.

Оптическое вращение 2,4 мг/мл YB-1 в 0,5 M фосфате калия, рН 7,4 измеряли на спектрополяриметре Jasco 815. (а) Спектр кругового дихроизма белка YB-1 при температуре 25 °С (сплошная линия) и 95 °С (точечная линия); (б) Зависимость оптического вращения белка YB-1 при 220 нм от температуры.

спектры полипролиновой спирали приобретают форму, характерную для ß-структуры, то есть имеют минимум около 215-220 нм и максимум около 195 нм (Bochicchio & Tamburro, 2002). Действительно, при нагревании белка YB-1 до 95 °С происходит заметное уменьшение величины оптического вращения при 200 нм и увеличение при 220 нм (рис. 2, а). За изменением спектра удобно следить по изменению вращения при 220 нм (рис. 2, б). Выявленная зависимость оптического вращения от температуры подтверждает наличие структуры полипролиновой спирали в некоторой части белка. Поскольку CSD белка YB-1 является ß-структурным, по-видимому, структура полипролиновой спирали содержится в доменах А/Р и CTD. Структура полипролиновой спирали характерна для природно неструктурированных белков (Rath et al., 2005), поэтому можно предположить, что большая часть белка YB-1 действительно неупорядочена.

1.3. Домен дсолодового шока белка YB-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает деиатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

Известно, что изолированный CSD белка YB-1 обладает низкой стабильностью, поскольку этот домен в растворе при 25 °С (298 К) находится в равновесии между свернутой (70%) и несвернутой формами (30%) (Kloks et al., 2004). Для определения термодинамических параметров CSD в составе YB-1 мы провели микрокалориметрическое исследование белка YB-1, его фрагмента YB-li.129, содержащего домены А/Р и CSD, и фрагмента YB-I52.129. представляющего собой изолированный CSD (рис. 3, см. также рис. 8). Рассчитанные из эксперимента параметры приведены в таблице 1. Близость значений ДСР при плавлении YB-1 и его фрагментов со значениями АСР бактериальных белков холодового шока говорит о том, что в белке YB-1 кооперативной единицей плавления является только CSD. При этом оказалось, что стабильность изолированного CSD белка YB-1 ниже (Тм=312К), чем стабильность бактериальных доменов холодового шока (Tm,cspa=329 К) (Petrosian & Makhatadze, 2000). Интересно, что добавление домена А/Р к CSD понижает стабильность белка (Тм=308 К), однако полноразмерный YB-1 плавится при более высокой температуре (318 К), что свидетельствует о стабилизирующем влиянии CTD на CSD.

280

(6)32

290 300 310 320 330 Т. К

Рнс. 3. Микрокалориметрическое исследование белка УВ-1 и его фрагментов. Кривые плавления (о) УВ-1 в 20 мМ фосфате калия, рН 7,0, 0,2 М КС1, (б) фрагмента УВ-ІМ29 в 20 мМ фосфате калия, рН 6,5, 0,2 М К.С1, (в) фрагмента УВ-І52-і29 в 0,1 М фосфате калия, рН 6,5 были получены на микрокалориметре СКАЛ-1. Точечная кривая -экспериментальные данные, сплошная кривая - результат подгонки данных по модели двух состояний.

Таблица 1. Термодинамические параметры плавления YB-1, УВ-1ы29> YB-I52.129 п бактериальных гомологов CSD белка YB-1.

YB-1 YB-11-129 YB-I52-129 CspA* CspB**

Тм> К 318 308 312 329 326

ДСр, kJ К"1 шоГ1 3,2 5,4 5,2 3,2 3,7

ДН, kJ тої"1 118 85 99 181 154

»Petrosian & Makhatadze, 2000; **Makhatatze & Marahiel, 1994.

Наличие небольшого минимума теплоемкости в левой части кривых плавления YB-I52-129 и YB-11.129 позволяет предположить наличие холодовой денатурации CSD белка YB-1 (Privalov, 1990). Для проверки этого предположения мы использовали спектроскопию ЯМР. Метод 'Н-ЯМР позволяет определить присутствие жесткой третичной структуры в исследуемом белке по наличию пиков в высокопольной части спектра. Были получены спектры 'Н-ЯМР белка YB-1 при различных температурах (рис. 4). При температуре 25 °С (298 К) действительно наблюдаются пики в высокопольной части спектра. Эти пики, по-видимому, соответствуют

жесткой третичной структуре CSD. При температуре 64 °С (334 К) пики в высокопольной части спектра не наблюдаются, что говорит об отсутствии в белке жесткой третичной структуры в этих условиях. Это согласуется с тем, что по данным микрокалориметрии CSD в составе белка YB-1 при этой температуре расплавлен. Однако высокопольные пики не наблюдаются и при температуре 2 °С (275 К), что подтверждает разрушение жесткой третичной структуры CSD вследствие холодовой денатурации. Таким образом, данные микрокалориметрии и ЯМР указывают на существование денатурационных переходов в CSD как при нагревании, так и при охлаждении.

Рис. 4. Спектры 'Н-ЯМР белка YB-1 при различных

температурах.

Спектры 2,4 мг/мл YB-1 в 0,5 M фосфате калия, рН 7,4 получены на спектрометре AVANCE III 600. Справа на вставках показаны высокопольные части спектра.

0 рргл

1.4. YB-1 в растворе обладает высокой степенью компактности

Мы решили исследовать, каким образом организована неструктурированная часть белка YB-1. Для этого мы оценивали компактность белка методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS). Анализ кривой рассеяния в координатах Гинье (Feigin & Svergun, 1987; Glatter & Kratky, 1982) указывает на существование небольших олигомеров YB-1 со средней массой 85 кДа в 0,5 М фосфата калия при pH 7,4 (рис. 5, а). При этом наличие выраженного максимума на графике в координатах Кратки (Semisotnov et al., 1996) (рис. 5, б) говорит о том, что белок компактен. При понижении pH до 4,0 ассоциаты диссоциируют до мономеров с молекулярной массой 36 кДа, однако белок теряет компактность, о чем свидетельствует менее выраженный максимум на графике Кратки (рис. 5, а, б). Распад олигомеров и нарушение компактности белковой молекулы при pH 4,0 может быть связано с

увеличением положительного заряда полипептидной цепи белка и, следовательно, как внутримолекулярного, так и межмолекулярного электростатического отталкивания. Мы также оценили компактность YB-1 методом скоростной седиментации (рис. 5, в). Полученное значение коэффициента седиментации S2o,w=2,65 S подтверждает, что белок YB-1 обладает компактностью, сравнимой с компактностью глобулярных белков такой же молекулярной массы (рис. 5, г), несмотря на неструктурированность значительной части белковой цепи. Это может объясняться тем, что в доменах А/Р и CTD существуют определенные взаимодействия внутри доменов и/или с CSD. Для С-концевого домена можно предложить модель компактной укладки за счет взаимодействия противоположно заряженных кластеров аминокислот.

0.5 М K-PO,, pH 7.4 * Rg=83 А, Mw=85 кДа t 0,15 М KCl. pH 4.0 ' Rg=63 А. Mw=36«fla

3 4 5 6 S,сведберг

0,5 M К-Р04, pH 7,4 0,15 М KCl, pH 4,0

0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 Q2, А"2

10" 105 10" 10' 10" молекулярная масса, Да

Рис. 5. Исследование компактности белка УВ-1. (а), (б) Исследование УВ-1 методом ЭАХЭ в 0,5 М фосфате калия, рН 7,4 и 20 мМ глицин-НС1, рН 4,0, 0,15 М К.С1. Данные представлены в координатах (а) Гинье и (б) Кратки, (в) Определение коэффициента седиментации белка УВ-1 методом аналитического ультрацентрифугирования в 20 мМ Нерез-КОН, рН 7,4, 0,2 М КС1. (г) Сравнение компактности УВ-1 с компактностью глобулярных белков, о - глобулярные белки. А - УВ-1.

1.5. Олигомеризация YB-1

Способность YB-1 к олигомеризации отмечалась ранее. Мы исследовали YB-1 методом SAXS и определили, что YB-1 в условиях повышенной ионной силы (1 M КС1 при нейтральном рН) образует олигомеры с молекулярной массой 1010 кДа и радиусом инерции 106 Â (рис. 6, а). При этом в составе больших олигомеров YB-1 остается довольно компактным, на что указывает наличие выраженного максимума на графике Кратки (рис. 6, б). Степень ассоциации уменьшается с уменьшением концентрации белка. Так, в присутствии 1 M NaCl при сравнительно высокой концентрации белка (около 2,7 мг/мл или 75 мкМ) методом гель-фильтрации выявляются комплексы массой свыше 440 кДа. При уменьшении концентрации белка эти комплексы распадаются вплоть до мономеров (при концентрации белка 10 мкг/мл или 0,3 мкМ эффективная молекулярная масса не превышает 45 кДа) (рис. 6, в).

0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016

а', А-2

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Q, А"'

т—- Г " "■" I

10 15 20 25

Объем элюции, мл

Рис. 6. Исследование олигомеризации белка YB-1. (а), (б) YB-1 исследовали методом SAXS в 20 мМ фосфате калия, рН 7,4, 1 М KCI. Данные представлены в координатах (а) Кратки и (б) Гинье. (и) Хроматограммы гель-фильтрации белка YB-1 в 20 мМ Tris-HCl, рН 7,6, 2 М KCI на колонке Superóse 12 при различных концентрациях белка. Значения максимальной оптической плотности в каждой хроматограмме взяты за единицу. Отмечены объемы элюции глобулярных белков-маркеров. На вставке указаны концентрации белка в пиках.

Поскольку молекулярная масса YB-1 равна 36 кДа, можно сделать вывод о высокой степени компактности белка в мономерной форме. Кроме того, эти данные свидетельствуют о высокой лабильности ассоциатов YB-1 в растворе.

2. Формирование фибрилл белком YB-1

2.1. Белок YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы с участием домена холодового шока

При исследовании процесса олигомеризации YB-1 мы обнаружили, что при длительной инкубации в условиях высокой ионной силы белок формирует протяженные фибриллы. Белок YB-1 инкубировали в присутствии 2 М LiCl, затем препарат адсорбировали на подложку и получали изображения белка с помощью электронной или атомно-силовой микроскопии (рис. 7, а-в). Формирование фибрилл наблюдалось уже через 1 час инкубации (рис. 7, а). С увеличением времени инкубации длина фибрилл увеличивалась и могла превышать 10 мкм, при этом длинные фибриллы имели тенденцию к упорядочению в пучки или ленты (рис. 7, б, в). Более тщательный анализ изображений фибрилл показал, что они обладают спиральной организацией с периодом 50-52 нм и имеют толщину 15-20 нм.

Рис. 7. Образование фибрилл белком УВ-1. Белок УВ-1 инкубировали в присутствии 2 М ЫС1 в течение (а) 1 часа, (б) 24 часов или (в) 30 дней и анализировали с помощью (а, б) электронной или (в) атомно-силовой микроскопии.

Для того чтобы определить, какая часть УВ-1 отвечает за образование фибрилл, мы использовали ряд фрагментов белка (рис. 8). Самый крупный фрагмент УВ-1 [.219, У которого отсутствовала примерно половина С-концевого домена, был ранее обнаружен нами как продукт процессинга УВ-1 208-протеасомой. Также мы использовали описанные выше фрагменты УВ-11_129 и УВ-152-129-

YB-1

YB-11-219 YB-11-129

| A/P

CTD

324 □

YB-1

52-129

Рис. 8. Доменная структура белка YB-1 и его фрагментов, использованных в работе.

YB-1 и его фрагменты инкубировали в присутствии 2 М LiCl, затем препараты анализировали с помощью электронной микроскопии (рис. 9). Оказалось, что в этих условиях фрагмент YB-I1.219 не образовывал фибриллы (рис. 9, б), в отличие от полноразмерного белка YB-1 (рис. 9, а). Однако, фрагмент YB-11.129, у которого CTD полностью отсутствовал, был способен эффективно образовывать фибриллы (рис. 9, в). При дальнейшем удалении А/Р-домена с образованием фрагмента YB-152-129 способность белка к фибриллоообразованию сохранялась (рис. 9, г). Таким образом, для образования фибрилл достаточно CSD. Можно отметить, что добавление к CSD домена А/Р стимулировало образование фибрилл, что может быть обусловлено дестабилизацией CSD А/Р-доменом (см. табл. 1). Различные участки CTD по-разному влияли на фибриллоообразование: первая половина CTD блокирует способность к образованию фибрилл, в то время как вторая половина CTD снимает блокирующее действие первой половины этого домена (рис. 9).

(а)

ЩЁ2

(в)

Рис. 9. Образование фибрилл белком УВ-1 и его фрагментами при высокой ионной силе, (а) УВ-1, (б) фрагмент УВ-1,. 219, (в) фрагмент УВ-1М29, (г) фрагмент УВ-152-129 инкубировали при

концентрации 10 мкМ в присутствии 2 М 1ЛС1 при 20 °С в течение 24 часов, затем анализировали с помощью электронной микроскопии. Масштабная метка 0,4 мкм.

Способность белка YB-1 образовывать фибриллярные структуры ранее не отмечалась. Это могло быть связано с тем, что большинство экспериментов с белком проводилось в условиях физиологической ионной силы. Мы решили проверить, могут ли белок YB-1 и его фрагменты образовывать фибриллы при физиологической ионной силе. Для этого препараты инкубировали в присутствии 0,15 М KCl, затем образцы анализировали с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что в этих условиях в препаратах полноразмерного YB-1 и фрагмента без второй половины CTD YB-11-219 наблюдались только глобулярные ассоциаты, но не фибриллы (рис. 10, а, б). По-видимому, как полноразмерный, так и укороченный CTD при физиологической ионной силе подавляют фибриллообразование. При этом фрагменты YB-1 без CTD: YB-152-129 и YB-11_129 - в этих условиях способны образовывать фибриллы практически так же, как и при высокой ионной силе (рис. 10, в, г).

Рис. 10. Образование фибрилл белком YB-1 и его фрагментами при

физиологической ионной силе, (ä) YB-1, (б) фрагмент YB-11-219, (в) фрагмент YB-h.129, (г) фрагмент YB-I52-129 инкубировали при концентрации 10 мкМ в присутствии 0,15 М KCl при 20 °С в течение 95 часов, затем анализировали с помощью электронной

микроскопии. Масштабная метка 0,4 мкм.

2.2. Фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными Мы предположили, что фибриллы белка YB-1 являются амилоидоподобными. Амилоидные и амилоидоподобные структуры образуются за счет формирования межмолекулярной кросс-р-структуры. Основными признаками образования амилоидных и амилоидоподобных белковых структур являются (Nelson & Eisenberg, 2006):

а) формирование фибриллярных структур;

б) появления способности окрашиваться специфичными красителями тиофлавином Т (ТИТ) и конго красным;

в) увеличение доли Р-структуры;

г) характерное рассеяние рентгеновских лучей ориентированными препаратами.

Мы исследовали, способны ли фибриллы УВ-1 связывать специфичный к амилоидам флуоресцентный краситель ТЪТ. Белок УВ-1 инкубировали при высокой ионной силе, затем анализировали с помощью атомно-силовой микроскопии или флуоресцентной микроскопии после окраски ТЬТ. На рисунке 11, а видно, что после инкубации в препарате УВ-1 появились фибриллы. На изображении, полученном с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 11, б), видно, что эти фибриллы окрашиваются красителем.

(а)

(б)

(в)

(г)

Рис. 11. Фибриллы УВ-1 связывают специфичные к амилоидам красители, (а), (б) Окраска фибрилл УВ-1 тиофлавином Т. УВ-1 (3 мкМ) инкубировали в присутствии 2 М ЬіС1, затем исследовали с помощью (а) атомно-силовой микроскопии или (б) конфокальной микроскопии после окраски тиофлавином Т. (в) Окраска фибрилл УВ-1 конто красным. УВ-1 (—1,4 мМ) инкубировали в присутствии 2 М ЬіСІ, образовавшийся гель отмывали от соли в деионизированной воде, затем высушивали на стекле и окрашивали 0,1% водным раствором конго красного. Препарат фотографировали в режиме светлого поля (слева) или в поляризованном свете (справа), (г) Окраска фибрилл УВ-11.129 конго красным. УВ-11-129 (1,4 мМ) инкубировали в 0,2 М КСІ, образовавшийся гель высушивали на стекле, затем окрашивали и анализировали как описано для полноразмерного УВ-1.

Мы также проверили, способны ли фибриллы УВ-1 связывать другой специфичный к амилоидам краситель - конго красный. Белок УВ-1 инкубировали при концентрации 1,4 мМ в присутствии 2 М ЫС1. В процессе инкубации происходило формирование геля, которое указывало на фибриллообразование. Гель высушили на стекле, окрасили конго красным, полученный препарат анализировали с помощью поляризационного микроскопа. На рисунке 11, в видно, что препарат белка после окраски конго красным (слева) проявлял характерное зеленое окрашивание в поляризованном свете (справа). Мы также проверили способность фибрилл фрагмента УВ-1ы29, полученных инкубацией в условиях, близких к физиологическим (0,2 М КС1), связывать конго красный. При инкубации препарата также происходило формирование геля, указывающее на образование фибрилл, а исследование окрашенного препарата с помощью поляризационного микроскопа выявило специфичное для амилоидов связывание красителя (рис. 11, г).

Поскольку при формировании амилоидной кросс-р-структуры часто наблюдается увеличение общего содержания Р-структуры в белке, мы исследовали изменение вторичной структуры УВ-1 и фрагмента УВ-11.129 при формировании фибрилл. Были сняты спектры кругового дихроизма белков при физиологической ионной силе или после инкубации при высокой ионной силе. На полученных спектрах (рис. 12, а, б) видно, что при физиологической ионной силе в обоих белках наблюдается малое содержание регулярной вторичной структуры. После инкубации белков при высокой ионной силе их спектры приобретают форму, характерную для Р-структурных белков.

Для того, чтобы подтвердить формирование кросс-Р-структуры при образовании фибрилл УВ-1, мы исследовали ориентированные препараты фибрилл УВ-1 и его фрагмента УВ-11.129 с помощью дифракции рентгеновских лучей. Для получения ориентированных препаратов использовали те же образцы белков, что и для окраски конго красным. Небольшое количество белкового геля отмывали от солей в деионизированной воде и готовили препарат методом растягивания капли. На полученных дифракционных картинах видны рефлексы, соответствующие периодам 4,7 и 10-11 А, характерные для амилоидной кросс-Р-структуры (рис.12, в, г).

Таким образом, фибриллы белка УВ-1, а также его фрагмента УВ-1М29 обладают набором свойств, характерных для амилоидных

структур.

(а).

&-15

Рис. 12. Формирование кросс-р-структуры при образовании фибрилл белка YB-1 и его фрагмента YB-11.129. Спектры кругового дихроизма (a) YB-1 и (б) фрагмента YB-11-129- Спектры были получены в условиях физиологической ионной силы (0,15 M КС1, сплошная линия) и после инкубации в условиях высокой ионной силы (1 M MgS04, точечная линия) на спектрополяриметре Jasco J-815. Картины рентгеновской дифракции (в) YB-1 и (г) фрагмента YB-11.129. Белки с концентрацией 1,4 мМ были инкубированы в присутствии 2 M LiCl (YB-1) или 0,2 M КС1 (YB-11.129), образовавшийся гель отмывали от солей в деионизированной воде, затем готовили ориентированный препарат методом растяжения и высушивания капли. Картины дифракции получали с помощью генератора Microstar X-ray с оптикой HELIOX, оборудованного детектором Platinum'35 CCD detector (Х8 Proteum system, Bruker AXS).

2.3. Исследование процесса образования фибрилл YB-1

Исследование процесса образования амилоидоподобных структур представляет большой интерес для поиска путей предотвращения накопления амилоидных отложений. Известно, что промежуточной стадией амилоидообразования является формирование олигомеров, однако процесс перехода от олигомеров к фибриллам остается малоизученным (Uversky, 2010). Мы проанализировали электронно-микроскопические изображения препаратов фибрилл YB-1 и его фрагментов и обнаружили кольцевые олигомерные структуры (рис. 13, верхний ряд). Эти кольцевые

олигомеры имеют диаметр около 13 нм и состоят из 5-6 более мелких частиц, точное число частиц определить затруднительно. Подобные кольцевые структуры часто обнаруживаются в препаратах амилоидоподобных фибрилл и считаются интермедиатом их образования. На изображениях препаратов фибрилл УВ-1].|29 были также замечены структуры, которые могут представлять собой промежуточные стадии роста фибрилл из кольцевых олигомеров. На рисунке 13 эти структуры расположены в порядке увеличения их размера, предложена модель их организации.

Рис. 13. Олнгомериые структуры в препаратах фибрилл фрагмента УВ-11-129. Предполагаемые

интермедиа™ образования фибрилл УВ-1 1-129 в присутствии 2 М 1ЛС1. Изображения получены методом электронной микроскопии и расположены сверху вниз в порядке увеличения размера структур. Справа представлена модель их организации. Масштабная метка 50 нм.

Анализ данных электронной микроскопии также выявил, что фибриллы УВ-1 имеют выраженную полярность, поскольку заметна разница в изображениях концов частиц. Один конец («закрытый») хорошо контрастируется уранилацетатом (рис. 14, а), в то время как другой конец («открытый») контрастируется значительно хуже (рис. 14, б). Можно предположить, что полярность фибриллы отражает направленность ее роста, при этом «закрытый» конец является началом роста фибриллы, а «открытый» - местом присоединения белка, приводящего к увеличению длины фибриллы. Действительно, исследования роста амилоидных фибрилл различных белков показали его направленность (Вап е1 а1., 2003; 1поие е1 а!., 2001).

100 мм

Рис. 14. Электронно-микроскопические изображения концевых фрагментов фибрилл белка УВ-1. (а), (б) - «Закрытые» и «открытые» концы фибрилл, соответственно. Фибриллы получены инкубацией УВ-1 в присутствии 2 М ЫС1.

2.4. Влияние различных катионов на рост амилоидоподобных фибрилл УВ-1

Чтобы исследовать влияние различных катионов, мы сравнили действие различных солей, таких как КС1,1ЛС1, М^СЬ и №С1 (содержащих различные катионы и один и тот же анион, СГ), на образование амилоидной структуры полноразмерного УВ-1. Образцы УВ-1 инкубировали в присутствии высокой концентрации различных хлоридов металлов, амилоидообразование анализировали по связыванию специфичного флуоресцентного красителя ТЬТ (рис. 15). По способности вызывать образование амилоидной структуры, определенной этим

катионы

методом, Mg2+>Li+>Na+>K+.

расположились

следующем порядке:

5 600-1

I 500

£ 400-н

| 3003"

о 200гг

| 100 о

i-1

*** —

(-1

0,15МКа 2MKCI 2MNaQ 2MUCI IMMgCfe

Рис. 15. Эффект различных солей на образование амилоидоподобных

фибрилл YB-1. YB-1 (10 мкМ) инкубировали в буфере 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, содержащем различные соли, указанные на графике, в течение 24 часов при 20 °С. Амилоидообразование отслеживали по флуоресценции тиофлавина Т. Указаны средние значения и стандартное отклонение (п=3); *, *** обозначают /-test /><0.05, р <0.001, соответственно.

2.5. При понижении ионной силы фибриллы УВ-1 распадаются

Одним из общих свойств амилоидных и амилоидоподобных структур является их нерастворимость в физиологических условиях. Следствием такой нерастворимости является накопление белковых отложений при амилоидогенных патологиях. Мы решили проверить, устойчивы ли фибриллы УВ-1 в условиях физиологической ионной силы. Фибриллы получали инкубацией белка в условиях высокой ионной силы, а затем переводили в физиологические условия. Наличие амилоидной агрегации отслеживали по флуоресценции тиофлавина и электронной микроскопией (рис. 16).

(а) ¿1505125 -

h"100 -.с

к 75-I 50-

(в)

2 М KCl—>0,15 М KCl

2 М LICI

2 М

15 М KCl

Рис. 16. Распад амилоидоподобных фибрилл YB-1 при физиологической ионной силе, (а), (б) YB-1 (56,8 мкМ) инкубировали в 0,15 М или 2 М KCl в течение 24 часов. После инкубации часть образца YB-1 в 2 М KCl разбавляли до концентрации соли 0,15 М KCL Концентрация белка составила 4,26 мкМ. Остальные образцы разбавляли до той же конечной концентрации белка растворами 0,15 М или 2 М KCl так, чтобы концентрация соли не изменялась. Полученные образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и анализировали (о) по флуоресценции тиофлавина (показаны средние значения и стандартное отклонение (п=3); *** обозначает /-test /7<0,001) или (б) электронной микроскопией, (в) YB-1 (30 мкМ) инкубировали в 0,15 М или 2 М LiCl в течение 24 часов. После инкубации часть образца YB-1 в 2 М LiCl диализовали против 0,15 М KCl. Наличие фибрилл отслеживали атомно-силовой микроскопией. Масштабная метка 0,4 мкм. Указаны условия инкубации.

Было замечено, что при замене 2 М LiCl на 2 М KCl белок УВ-1 образует сходные фибриллы (рис. 16, б), поэтому простым разбавлением соли можно достичь ионных условий, близких к физиологическим (0,15 М KCl). Мы инкубировали образец УВ-1 в 2 М KCl, а затем разбавляли водой до 0,15 М KCl для понижения ионной силы до физиологической. В

отрицательном контроле образец YB-1 инкубировали в 0,15 М KCl, а в положительном - в 2 М KCl, затем разбавляли растворами 0,15 М или 2 М KCl, соответственно, чтобы концентрация соли оставалась неизменной. Таким образом, конечная концентрация YB-1 во всех образцах при измерении флуоресценции ThT была одинаковой. Как и ожидалось, флуоресценция ThT в образце YB-1 после инкубации в 0,15 М KCl практически не отличалась от флуоресценции самого ThT. После инкубации YB-1 в 2 М KCl флуоресценция ThT значительно повышалась, что говорит о появлении амилоидной структуры. Если же в таком образце YB-1 после инкубации в 2 М KCl концентрацию соли понижали до 0,15 М KCl, то флуоресценция ThT понижалась до значения, близкого к значению для образца, инкубированного только в 0,15 М KCl (рис. 16, а). Это понижение флуоресценции ThT указывает на распад амилоидной структуры. Эти же образцы анализировали с помощью электронной микроскопии (рис. 16, б). Как и ожидалось, в отрицательном контроле после инкубации YB-1 в 0,15 М KCl не наблюдалось каких-либо фибрилл (рис. 16, б, слева), а в положительном контроле после инкубации YB-1 в 2 М KCl наблюдались протяженные фибриллы (рис. 16, б, в центре). Если в образце после инкубации YB-1 в 2 М KCl концентрация соли была понижена разбавлением до физиологической, то количество и длина фибрилл существенно уменьшались (рис. 16, б, справа).

Аналогичные результаты были получены для фибрилл, образованных в 2 М LiCl, при понижении концентрации соли диализом (рис. 16, в). YB-1 инкубировали в присутствии 0,15 М KCl или 2 М LiCl. Визуализация образцов YB-1 с помощью атомно-силовой микроскопии показала, что после инкубации в 0,15 М KCl также не наблюдается фибриллярных структур (рис 16, в, слева). В присутствии 2 М LiCl появляются протяженные фибриллы (рис. 16, в, в центре), которые исчезают после диализа образца против 0,15 М KCl (рис. 16, в, справа). Таким образом, амилоидоподобные фибриллы полноразмерного YB-1, образованные при повышенной ионной силе, способны распадаться при физиологической ионной силе.

выводы

1. На основании компьютерного анализа и исследования вторичной структуры белка YB-1 методом кругового дихроизма показано, что значительная часть белка YB-1 не имеет регулярной вторичной структуры, стабилизированной водородными связями, и может быть неупорядоченной.

2. Исследование YB-1 методами дифференциальной микрокалориметрии и 'Н-ЯМР выявило, что в белке YB-1 кооперативной единицей плавления, обладающей жесткой третичной структурой, является только домен холодового шока, который претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

3. Гидродинамическими методами и методом малоуглового рентгеновского рассеяния показана высокая компактность белка YB-1 в растворе как в мономерной форме, так и в составе олигомеров. Показана непрочность ассоциатов YB-1 в растворе.

4. Методами атомно-силовой и электронной микроскопии обнаружено, что в условиях высокой ионной силы белок YB-1 образует фибриллы. С использованием различных фрагментов белка YB-1 было установлено, что за образование фибрилл отвечает CSD. При этом А/Р-домен стимулирует образование фибрилл, первая половина CTD подавляет фибриллообразование, а вторая половина CTD снимает блокирующее действие первой половины.

5. Обнаружено, что в условиях физиологической ионной силы фрагменты YB-1 без домена CTD способны образовывать амилоидоподобные фибриллы, а добавление полноразмерного CTD или только его первой половины блокирует фибриллообразование.

6. Исследование свойств фибрилл белка YB-1 и его фрагментов с помощью специфичных красителей, спектроскопии кругового дихроизма и рентгеновской дифракции показало, что фибриллы YB-1 являются амилоидоподобными.

7. Исследовано влияние катионов на фибриллообразование, предложена модель организации фибрилл. Установлено, что амилоидоподобные фибриллы YB-1 обладают низкой стабильностью и распадаются при понижении ионной силы раствора до физиологической.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Guryanov S.G., Selivanova О.М., Nikulin A.D., Enin G.A., Melnik B.S., Kretov D.A., Serdyuk I.N., Ovchinnikov L.P. (2012) Formation of amyloid-like fibrils by Y-box binding protein 1 (YB-1) is mediated by its cold shock domain and modulated by disordered terminal domains. PLoS One, 7,5:e36969.

2. Eliseeva, I.A., Kim, E.R., Guryanov. S.G., Ovchinnikov, L.P., and Lyabin, D.N. (2011). Y-box-binding protein 1 (YB-1) and its functions. Biochemistry (Moscow) 76, 13:1402-1433.

3. Елисеева И.А., Ким E.P., Гурьянов С.Г.. Овчинников Л.П., ЛябинД.Н. (2011) Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции. Успехи биол. химии, 51:65-132.

4. Селиванова О.М., Гурьянов С.Г.. Енин Г.А., Скабкин М.А., Овчинников Л.П., Сердюк И.Н. (2010) Белок YB-1 обладает способностью образовывать протяженные нанофибриллы. Биохимия, 75, 5:629-636.

5. Sorokin А.V., Selyutina А.А., Skabkin М.А., Guryanov S.G.. Nazimov I.V., Richard C., Th'ng J., Yau J., Sorensen P.H., Ovchinnikov L.P., Evdokimova V. (2005) Proteasome-mediated cleavage of the Y-box-binding protein 1 is linked to DNA-damage stress response. EMBO J. 24, 20:3602-3612.

6. Гурьянов С.Г.. Селиванова O.M., Никулин А.Д., Енин Г.А., Мельник Б.С., Кретов Д.А., Сердюк И.Н., Овчинников Л.П. (2012) Белок YB-1 образует амилоидоподобные фибриллы. Ежегодная научная конференция Института белка РАН (Пущино, 8-9 июня 2012 г.). Сборник тезисов, с. 12. Пущино.

7. Guryanov S.G.. Selivanova О.М., Nikulin A.D., Kretov D.A., Enin G.A., Serdyuk I.N., Ovchinnikov L.P. (2011) Amyloid-like structure of Y-box binding protein 1 (YB-1) dissociates in native conditions. The 4th international IMBG conference for young scientists "Molecular biology: advances and perspectives" abstract book. p. 51. Kiev.

8. Гурьянов С.Г.. Кретов Д.А., Никулин А.Д., Селиванова О.М., Овчинников Л.П. (2011) Мультифункциональный белок YB-1 способен образовывать амилоидоподобные фибриллы. Биология — наука XXI века: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18-22 апреля 2011 года). Сборник тезисов, с. 58. Пущино.

9. Сердюк И.Н., Гурьянов С.Г.. Селиванова О.М., Енин Г.А., Овчинников Л.П. (2010) Белок YB-1 и его фрагмент AP-CSD обладают способностью к молекулярной самосборке в протяженные тяжи длиной несколько микрометров. Ежегодная научная конференция Института белка РАН (Пущино, 8-9 июня 2010 г.). Сборник тезисов, с. 11. Пущино.

Ю.Гурьянов С.Г.. Селиванова О.М., Енин Г.А., Сердюк И.Н., Овчинников Л.П. (2010) Мультифункциональный белок YB-1 способен образовывать протяженные фибриллы. Биология — наука XXI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов, с. 128. Пущино.

11.Guryanov S.G.. Melnik B.S., Filimonov V.V., Timchenko A.A., Kutyshenko V.P., Ovchinnikov L.P., Semisotnov G.V. (2009) The major mRNP protein YB-1: structural and association properties. International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov September 28 - October 2, 2009. Abstracts, p. 60. Moscow - Pushchino.

12.Gurvanov S.G.. Melnik B.S., Filimonov V.V., Timchenko A.A., Kutyshenko V.P., Ovchinnikov L.P., Semisotnov G.V. (2009) The major mRNP protein YB-1: structural and association properties. VIII European Symposium of The Protein Society June 14-18, 2009. Book of Abstracts, p. 172. Zurich.

13. Гурьянов С.Г.. Мельник Б.С., Семисотнов Г.В., Овчинников Л.П. (2008) Исследование структуры белка YB-1 методом кругового дихроизма. Биология - наука XXI века: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 1014 ноября 2008 года). Сборник тезисов, с. 17. Пущино.

Подписано в печать:

11.09.2012

Заказ № 7576 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vw\v. autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гурьянов, Сергей Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Неупорядоченные белки.

1.1. История открытия.

1.2. Свойства неупорядоченных белков.

1.3. Методы идентификации неупорядоченных белков.

1.4. Функции неупорядоченных белков.

2. Амилоидные и амилоидоподобные белки.

2.1. Природные патогенные амилоидные белки и прионы.

2.1.1. История изучения амилоидов.

2.1.2. Методы идентификации и исследования структуры амилоидов.

2.1.3. Структура амилоидных фибрилл.

2.1.4. Олигомеризация амилоидных белков и цитотоксическое действие амилоидов.

2.2. Функциональные амилоиды.

3. Мультифункциональный белок YB-1.

3.1. Структурная организация YB-1.

3.2. Функции YB-1.

3.2.1. Функции YB-1 в цитоплазме.

3.2.2. Функции YB-1 в ядре.

3.2.3. Транслокация YB-1 из цитоплазмы в ядро.

3.2.4. Распределение YB-1 в цитоплазме и ядре.

3.2.5. Секреция YB-1 из клеток.

3.2.6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии.

3.2.7. Связь YB-1 с онкогенезом.

3.3. Молекулярные основы многофункциональности YB-1.

3.3.1. Взаимодействие YB-1 с нуклеиновыми кислотами.

3.3.2. Взаимодействие YB-1 с белками.

3.3.3. Посттрансляционные модификации УВ-1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Генетические конструкции, использованные в работе.

2. Получение белка УВ-1 и его фрагментов.

3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии

4. Спектроскопия кругового дихроизма.

5. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

6. Спектроскопия ЯМР.

7. Малоугловое рентгеновское рассеяние.

8. Аналитическое ультрацентрифугирование.

9. Аналитическая гель-фильтрация.

10. Электронная микроскопия.

11. Атомно-силовая микроскопия.

12. Флуоресцентная микроскопия.

13. Окраска конго красным.

14. Дифракция рентгеновских лучей на ориентированных препаратах.

15. Анализ образования амилоидов по флуоресценции тиофлавина Т.

16. Диссоциация фибрилл.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Исследование белка УВ-1 в растворе.

1.1. А/Р-домен и СТЭ белка УВ-1 предсказываются как неупорядоченные

1.2. Спектры кругового дихроизма указывают на большое содержание клубкообразной формы и структуры поли(Ь)-пролиновой спирали второго типа.

1.3. Домен холодового шока белка УВ-1 обладает низкой стабильностью и претерпевает денатурационный переход как при нагревании, так и при охлаждении.

1.4. УВ-1 в растворе обладает высокой степенью компактности.

1.5. Олигомеризация УВ-1.

2. Формирование фибрилл белком УВ-1.

2.1. Белок УВ-1 способен образовывать протяженные фибриллы с участием домена холодового шока.

2.2. Фибриллы УВ-1 являются амилоидоподобными.

2.3. Исследование процесса образования фибрилл УВ-1.

2.4. Влияние различных катионов на рост амилоидоподобных фибрилл УВ-1.

2.5. При понижении ионной силы фибриллы УВ-1 распадаются.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Белок УВ-1 является нативно неупорядоченным белком.

2. Возможные причины компактности УВ-1.

3. Роль ионной силы в фибриллообразовании.

4. Способность УВ-1 к амилоидообразованию может быть обусловлена низкой стабильностью домена холодового шока.

5. Особенности роста фибрилл.

6. Возможная структура амилоидов УВ-1.

7. Возможное значение способности УВ-1 образовывать амилоидоподобные структуры.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная характеристика белка YB-1"

Мультифункциональный ядерно-цитоплазматический У-бокс-связывающий белок 1 (УВ-1) является представителем группы белков, содержащих эволюционно древний домен холодового шока. Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. УВ-1 играет важную роль в эмбриональном развитии, обладает онкогенной и антионкогенной активностью, повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации и является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости. В ядре УВ-1 участвует в регуляции транскрипции многих генов, вовлечен в процессы репликации и репарации ДНК, а также сплайсинга пре-мРНК. В цитоплазме УВ-1 упаковывает мРНК в мРНП, стабилизирует мРНК и регулирует их трансляцию. Кроме того, УВ-1 может секретироваться из клеток и выступать в качестве лиганда клеточных рецепторов.

Участие УВ-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками. УВ-1 является компонентом стрессовых гранул и телец процессинга, взаимодействует с актиновым и тубулиновым цитоскелетами. Большое количество макромолекулярных партнеров УВ-1, по-видимому, связано с уникальной структурой этого белка. Известно, что центральный домен холодового шока отвечает за специфичное узнавание нуклеиновых кислот. УВ-1 содержит также И-концевой домен, богатый остатками аланина и пролина (А/Р-домен), участвующий в связывании белковых партнеров, и протяженный С-концевой домен, отвечающий за связывание белков и неспецифическое связывание нуклеиновых кислот.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что УВ-1 в растворе образует крупные гомомультимеры массой до 800 кДа. Методом электронной микроскопии было установлено, что мультимеры на подложке имели округлую форму с диаметром около 35-40 нм и высотой 10 нм. Похожие мультимеры обнаруживались в комплексе с мРНК при ее насыщении белком. По своим физико-химическим свойствам эти комплексы с мРНК были близки к природным мРНП. Было выяснено, что в ненасыщенных УВ-1 комплексах с мРНК белок связывается как доменом холодового шока, так и С-концевым доменом. При насыщении белком с мРНК остается связанной только Ы-концевая часть белка, содержащая домен холодового шока, а С-концевой домен вытесняется из комплекса с мРНК. Кроме того, в нашей лаборатории было обнаружено, что белок УВ-1 может образовывать фибриллы в присутствии 2 М ЫС1.

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению структуры белка УВ-1. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить вторичную структуру УВ-1 в растворе; 2) исследовать термодинамические параметры белка УВ-1; 3) оценить компактность белка и размер и морфологию олигомерных комплексов в растворе; 4) определить участок белка УВ-1, отвечающий за образование фибрилл; 5) проверить способность белка УВ-1 и его фрагментов образовывать фибриллы при разных концентрациях солей; 6) проверить наличие признаков амилоидной структуры в фибриллах УВ-1; 7) исследовать процесс формирования фибрилл УВ-1.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM - Атомно-силовая микроскопия. КД - Круговой дихроизм. мРНП - Матричный рибонуклеопротеид. PC А - Рентгеноструктурный анализ. ЯМР - Ядерный магнитный резонанс.

ANS - 8-anilino-naphtalen-l-sulfonate, 8-анилинонафтален-1-сульфонат. А/Р-домен - alanine/proline rich, аланин/пролин-богатый домен. BRCA1 - Breast cancer gene 1, ген рака груди 1. CRS - Cytoplasmic retention site, сайт удержания в цитоплазме. СРЕВ - Cytoplasmic polyadenylation element binding protein, белок, связывающийся с элементом цитоплазматического полиаденилирования. CSD - Cold shock domain, домен холодового шока. CSP - Cold shock protein, белок холодового шока. CTD - C-terminal domain, С-концевой домен. EGF - Epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста. MSY - Mouse Y-box binding protein, Y-бокс-связывающий белок мышей. NLS - Nuclear localization signal, сигнал ядерной локализации. РАВР - Poly(A) binding protein, поли(А)-связывающий белок. PB - Processing bodies, тельца процессинга. PDB - Protein Data Bank, банк белковых структур. PDGF-BB - Platelet derived growth factor subunit В dimer, димерная субъединица В фактора роста из тромбоцитов SAXS - Small angle X-ray scattering, малоугловое рентгеновское рассеяние. SG - Stress granules, стресс-гранулы. TGF(3 - Tumor growth factor J3, фактор роста опухоли {3. YB-1 - Y-box binding protein 1, Y-бокс-связывающий белок 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гурьянов, Сергей Георгиевич

выводы

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение я приношу слова благодарности всем, кто помог мне выполнить данную работу. Прежде всего, я благодарен моему научному руководителю Льву Павловичу Овчинникову за школу научных исследований, поддержку и помощь в моих научных изысканиях. Неоценим его вклад и в написание текста диссертации.

Я искренне благодарен моему первому «микрошефу» Алексею Сорокину, который научил меня основным принципам работы в лаборатории, помог овладеть многими экспериментальными навыками и стал примером увлеченного и целеустремленного исследователя.

Огромную роль в этой работе сыграл Максим Скабкин, который начал изучение структуры УВ-1 в нашей лаборатории, а также оказал мне огромную поддержку в ходе работы. Кроме того, его профессиональное отношение к научной работе стало для меня отличным примером.

Я благодарю Диму Лябина, Ирину Елисееву, Надю Попову, Костю Чернова, Настю Селютину, Катю Ким, Диму Кретова, Дашу Мордовкину, Сашу Доронина и Лиру Нигматуллину за дружескую атмосферу и поддержку в течение совместных лет работы в лаборатории.

Спасибо Елене Алексеевне Соболевой и Нине Михайловне Гришиной за техническую помощь и создание уюта в лаборатории.

Я очень признателен Евгении Викторовне Серебровой за помощь в написании статей, автореферата и диссертационной работы.

Отдельные слова благодарности моим старшим коллегам Геннадию Васильевичу Семисотнову, Владимиру Васильевичу Филимонову и Игорю Николаевичу Сердюку, совместно с которыми была выполнена значительная часть работы.

Благодарю также всех сотрудников Института белка РАН, с которыми я работал и общался.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гурьянов, Сергей Георгиевич, Пущино

1. Вайман А. В., Гене Г. П., Стромская Т. П., Рыбалкина Е. Ю., Сорокин А. В., Гурьянов С. Г., Овчинников Л. П., Ставровская А. А. (2007) Исследование роли белка YB-1 в лекарственной устойчивости опухолей молочной железы. Молекулярная медицина 1: 31-37.

2. Елисеева И. А., Ким Е. Р., Гурьянов С. Г., Овчинников Л. П., Лябин Д. Н. (2011) Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции. Успехи биол. химии 51: 65-132.

3. Миронова Л. Н., Гогинашвили А. И., Тер-Аванесян М. Д. (2008) Биологические функции амилоидов: факты и гипотезы. Молек. биология 42: 798-808.

4. Скабкин М. А., Скабкина О. В., Овчинников Л. П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. хим. 44: 3-52.

5. Alberti S., Halfmann R., King О., Kapila A., Lindquist S. (2009) A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell 137: 146-158.

6. Alexandrescu А. Т., Rathgeb-Szabo K. (1999) An NMR investigation of solution aggregation reactions preceding the misassembly of acid-denatured cold shock protein A into fibrils. J. Mol. Biol. 291: 1191-1206.

7. Almeida C. G., Takahashi R. H., Gouras G. K. (2006) /?-Amyloid accumulation impairs multivesicular body sorting by inhibiting the ubiquitin-proteasome system. J. Neurosci. 26: 4277-4288.

8. Ansari S. A., Safak M., Gallia G. L., Sawaya В. E., Amini S., Khalili K. (1999) Interaction of YB-1 with human immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity. J. Gen. Virol. 80 ( Pt 10): 2629-2638.

9. Bader A. G., Felts K. A, Jiang N, Chang H. W., Vogt P. K. (2003) Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100: 12384-12389.

10. Bader A. G, Vogt P. K. (2005) Inhibition of protein synthesis by Y box-binding protein 1 blocks oncogenic cell transformation. Mol. Cell. Biol. 25: 2095-2106.

11. Bader A. G, Vogt P. K. (2008) Phosphorylation by Akt disables the anti-oncogenic activity of YB-1. Oncogene 27: 1179-1182.

12. Bahadur R. P, Zacharias M. (2008) The interface of protein-protein complexes: analysis of contacts and prediction of interactions. Cell. Mol. Life Sci. 65: 1059-1072.

13. Ban T, Hamada D, Hasegawa K, Naiki H, Goto Y. (2003) Direct observation of amyloid fibril growth monitored by thioflavin T fluorescence. J. Biol. Chem. 278: 16462-16465.

14. Baskakov I. V. (2007) Branched chain mechanism of polymerization and ultrastructure of prion protein amyloid fibrils. FEBSJ. 274: 3756-3765.

15. Bates G. (2003) Huntingtin aggregation and toxicity in Huntington's disease. Lancet 361: 1642-1644.

16. Baxa U, Cassese T, Kajava A. V, Steven A. C. (2006) Structure, function, and amyloidogenesis of fungal prions: filament polymorphism and prion variants. Adv. Protein Chem. 73: 125-180.

17. Baxa U, Taylor K. L, Wall J. S, Simon M. N, Cheng N, Wickner R. B, Steven A. C. (2003) Architecture of Ure2p prion filaments: the N-terminal domains form a central core fiber. J. Biol. Chem. 278: 43717-43727.

18. Berson J. F., Theos A. C., Harper D. C., Tenza D., Raposo G., Marks M. S. (2003) Proprotein convertase cleavage liberates a fibrillogenic fragment of a resident glycoprotein to initiate melanosome biogenesis. J. Cell. Biol. 161: 521-533.

19. Blobel G. (1972) Protein tightly bound to globin mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 47: 88-95.

20. Bloomer A. C., Champness J. N., Bricogne G., Staden R., Klug A. (1978) Protein disk of tobacco mosaic virus at 2.8 A resolution showing the interactions within and between subunits. Nature 276: 362-368.

21. Bochicchio B., Tamburro A. M. (2002) Polyproline II structure in proteins: identification by chiroptical spectroscopies, stability, and functions. Chirality 14: 782-792.

22. Boublik M., Bradbury E. M., Crane-Robinson C., Johns E. W. (1970) An investigation of the conformational changes of histone F2b by high resolution nuclear magnetic resonance. Eur. J. Biochem. 17: 151-159.

23. Bouvet P., Matsumoto K., Wolffe A. P. (1995) Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain. J. Biol. Chem. 270: 28297-28303.

24. Breslow E., Beychok S., Hardman K. D., Gurd F. R. (1965) Relative Conformations of Sperm Whale Metmyoglobin and Apomyoglobin in Solution. J. Biol. Chem. 240: 304-309.

25. Butler J. C., Angelini T., Tang J. X., Wong G. C. (2003) Ion multivalence and like-charge polyelectrolyte attraction. Phys. Rev. Lett. 91: 028301.

26. Capowski E. E., Esnault S., Bhattacharya S., Malter J. S. (2001) Y box-binding factor promotes eosinophil survival by stabilizing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA. J Immunol 167: 5970-5976.

27. Caughey B., Lansbury P. T. (2003) Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev. Neurosci. 26: 267-298.

28. Chansky H. A., Hu M., Hickstein D. D., Yang L. (2001) Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein. Cancer Res. 61: 3586-3590.

29. Chapman M. R., Robinson L. S., Pinkner J. S., Roth R., Heuser J., Hammar M., Normark S., Hultgren S. J. (2002) Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science 295: 851-855.

30. Chen B., Thurber K. R., Shewmaker F., Wickner R. B., Tycko R. (2009) Measurement of amyloid fibril mass-per-length by tilted-beam transmission electron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 14339-14344.

31. Chen C. Y., Gherzi R., Andersen J. S., Gaietta G., Jurchott K., Royer H. D., Mann M., Karin M. (2000) Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation. Genes Dev. 14: 1236-1248.

32. Chen E., Kumita J. R., Woolley G. A., Kliger D. S. (2003) The kinetics of helix unfolding of an azobenzene cross-linked peptide probed by nanosecond time-resolved optical rotatory dispersion. J. Am. Chem. Soc. 125: 1244312449.

33. Chen M., Margittai M., Chen J., Langen R. (2007) Investigation of a-synuclein fibril structure by site-directed spin labeling. J. Biol. Chem. 282: 24970-24979.

34. Chen N. N., Khalili K. (1995) Transcriptional regulation of human JC polyomavirus promoters by cellular proteins YB-1 and Pur a in glial cells. J. Virol 69: 5843-5848.

35. Chernov K. G., Curmi P. A., Hamon L., Mechulam A., Ovchinnikov L. P., Pastre D. (2008a) Atomic force microscopy reveals binding of mRNA to microtubules mediated by two major mRNP proteins YB-1 and PABP. FEBS Lett. 582: 2875-2881.

36. Chibi M., Meyer M., Skepu A., DJ G. R., Moolman-Smook J. C., Pugh D. J. (2008) RBBP6 interacts with multifunctional protein YB-1 through its RING finger domain, leading to ubiquitination and proteosomal degradation of YB-1. J. Mol. Biol. 384: 908-916.

37. Chiti F., Dobson C. M. (2006) Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75: 333-366.

38. Coles L. S., Lambrusco L., Burrows J., Hunter J., Diamond P., Bert A. G., Vadas M. A., Goodall G. J. (2005) Phosphorylation of cold shock domain/Y-box proteins by ERK2 and GSK3(3 and repression of the human VEGF promoter. FEBSLett. 579: 5372-5378.

39. Cortajarena A. L., Lois G., Sherman E., O'Hern C. S., Regan L., Haran G. (2008) Non-random-coil behavior as a consequence of extensive PPII structure in the denatured state. J. Mol. Biol. 382: 203-212.

40. Cortese M. S., Baird J. P., Uversky V. N., Dunker A. K. (2005) Uncovering the unfoldome: enriching cell extracts for unstructured proteins by acid treatment. J. Proteome Res. 4: 1610-1618.

41. Cortese M. S., Uversky V. N., Dunker A. K. (2008) Intrinsic disorder in scaffold proteins: getting more from less. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98: 85106.

42. Das S., Chattopadhyay R., Bhakat K. K., Boldogh I., Kohno K., Prasad R., Wilson S. H., Hazra T. K. (2007) Stimulation of NEIL2-mediated oxidized base excision repair via YB-1 interaction during oxidative stress. J. Biol. Chem. 282: 28474-28484.

43. Daughdrill G. W., Pielak G. J., Uversky V. N., Cortese M. S., Dunker A. K. (2008) Natively Disordered Proteins. In Protein Folding Handbook, pp 275357. Wiley-VCH Verlag GmbH.

44. Davydova E. K., Evdokimova V. M., Ovchinnikov L. P., Hershey J. W. (1997) Overexpression in COS cells of p50, the major core protein associated with mRNA, results in translation inhibition. Nucleic Acids Res. 25: 29112916.

45. Dephoure N., Zhou C., Villen J., Beausoleil S. A., Bakalarski C. E., Elledge S. J., Gygi S. P. (2008) A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105: 10762-10767.

46. Dhalla A. K., Ririe S. S., Swamynathan S. K., Weber K. T., Guntaka R. V. (1998) chk-YB-lb, a Y-box binding protein activates transcription from rat □ 7(7) procollagen gene promoter. Biochem J. 336 ( Pt 2): 373-379.

47. Dooley S., Said H. M., Gressner A. M., Floege J., En-Nia A., Mertens P. R. (2006) Y-box protein-1 is the crucial mediator of antifibrotic interferon-y effects. J. Biol. Chem. 281: 1784-1795.

48. Dunker A. K., Cortese M. S., Romero P., Iakoucheva L. M., Uversky V. N. (2005) Flexible nets. The roles of intrinsic disorder in protein interaction networks. FEBSJ. 272: 5129-5148.

49. Dunker A. K., Obradovic Z. (2001) The protein trinity linking function and disorder. Nat. Biotechnol. 19: 805-806.

50. Dutertre M., Sanchez G., De Cian M. C., Barbier J., Dardenne E., Gratadou L., Dujardin G., Le Jossic-Corcos C., Corcos L., Auboeuf D. (2010) Cotranscriptional exon skipping in the genotoxic stress response. Nat. Struct. Mol. Biol. 17: 1358-1366.

51. Dyson H. J., Wright P. E. (2005) Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 197-208.

52. Eanes E. D., Glenner G. G. (1968) X-ray diffraction studies on amyloid filaments. JHistochem Cytochem 16: 673-677.

53. Eisenberg D., Jucker M. (2012) The amyloid state of proteins in human diseases. Cell 148: 1188-1203.

54. Eliezer D. (2007) Characterizing residual structure in disordered protein states using nuclear magnetic resonance. Methods Mol. Biol. 350: 49-67.

55. En-Nia A., Yilmaz E., Klinge U., Lovett D. H., Stefanidis I., Mertens P. R. (2005) Transcription factor YB-1 mediates DNA polymerase a gene expression. J. Biol. Chem. 280: 7702-7711.

56. Evdokimova V., Ruzanov P., Anglesio M. S., Sorokin A. V., Ovchinnikov L. P., Buckley J., Triche T. J., Sonenberg N., Sorensen P. H. (2006) Aktmediated YB-1 phosphorylation activates translation of silent mRNA species. Mol. Cell. Biol 26: 277-292.

57. Evdokimova V., Ruzanov P., Imataka H., Raught B., Svitkin Y., Ovchinnikov L. P., Sonenberg N. (2001) The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5' cap-dependent mRNA stabilizer. EMBOJ. 20: 5491-5502.

58. Fandrich M., Forge V., Buder K., Kittler M., Dobson C. M., Diekmann S. (2003) Myoglobin forms amyloid fibrils by association of unfolded polypeptide segments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100: 15463-15468.

59. Feigin L. A., Svergun D. I. (1987) Structure Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering, New York: Plenum Press.

60. Ferreira S. T., Vieira M. N., De Felice F. G. (2007) Soluble protein oligomers as emerging toxins in Alzheimer's and other amyloid diseases. IUBMB Life 59: 332-345.

61. Ferrone F. (1999) Analysis of protein aggregation kinetics. Methods Enzymol. 309: 256-274.

62. Fink A. L. (1995) Compact intermediate states in protein folding. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 495-522.

63. Fischer E. (1894) Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 27: 2985-2993.

64. Fisher W. R., Taniuchi H., Anfinsen C. B. (1973) On the role of heme in the formation of the structure of cytochrome c. J. Biol. Chem. 248: 3188-3195.

65. Flieger O., Engling A., Bucala R., Lue H., Nickel W., Bernhagen J. (2003) Regulated secretion of macrophage migration inhibitory factor is mediated by a non-classical pathway involving an ABC transporter. FEBS Lett. 551: 7886.

66. Flocco M. M, Mowbray S. L. (1994) Planar stacking interactions of arginine and aromatic side-chains in proteins. J. Mol. Biol. 235: 709-717.

67. Fowler D. M, Koulov A. V, Alory-Jost C, Marks M. S, Balch W. E, Kelly J. W. (2006) Functional amyloid formation within mammalian tissue. PLoS Biol. 4: e6.

68. Furie B, Furie B. C. (1979) Conformation-specific antibodies as probes of the □ -carboxyglutamic acid-rich region of bovine prothrombin. Studies of metal-induced structural changes. J. Biol. Chem. 254: 9766-9771.

69. Gasset M, Baldwin M. A, Fletterick R. J, Prusiner S. B. (1993) Perturbation of the secondary structure of the scrapie prion protein under conditions that alter infectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 1-5.

70. Gast K, Damaschun H, Eckert K, Schulze-Forster K, Maurer H. R, Muller-Frohne M, Zirwer D, Czarnecki J, Damaschun G. (1995) Prothymosin a: a biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry 34: 13211-13218.

71. Gessner C, Woischwill C, Schumacher A, Liebers U, Kuhn H, Stiehl P, Jiirchott K, Royer H. D, Witt C, Wolff G. (2004) Nuclear YB-1 expression as a negative prognostic marker in nonsmall cell lung cancer. Eur. Respir. J. 23: 14-19.

72. Gilks N, Kedersha N, Ayodele M, Shen L, Stoecklin G, Dember L. M, Anderson P. (2004) Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol. Biol. Cell 15: 5383-5398.

73. Gimenez-Bonafe P, Fedoruk M. N, Whitmore T. G, Akbari M, Ralph J. L, Ettinger S, Gleave M. E, Nelson C. C. (2004) YB-1 is upregulated during prostate cancer tumor progression and increases P-glycoprotein activity. Prostate 59: 337-349.

74. Giorgini F., Davies H. G., Braun R. E. (2001) MSY2 and MSY4 bind a conserved sequence in the 3' untranslated region of protamine 1 mRNA in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 21: 7010-7019.

75. Glatter O., Kratky O. (eds) (1982) Small angle X-ray scattering. London: Academic Press.

76. Gowri Shankar B. A., Sarani R., Michael D., Mridula P., Ranjani C. V., Sowmiya G., Vasundhar B., Sudha P., Jeyakanthan J., Velmurugan D., Sekar K. (2007) Ion pairs in non-redundant protein structures. J. Biosci. 32: 693704.

77. Grant C. E., Deeley R. G. (1993) Cloning and characterization of chicken YB-1: regulation of expression in the liver. Mol. Cell. Biol. 13: 4186-4196.

78. Graumann P., Marahiel M. A. (1994) The major cold shock protein of Bacillus subtilis CspB binds with high affinity to the ATTGG- and CCAAT sequences in single stranded oligonucleotides. FEBSLett. 338: 157-160.

79. Greenwald J., Riek R. (2010) Biology of amyloid: structure, function, and regulation. Structure 18: 1244-1260.

80. Guo Z., Eisenberg D. (2006) Runaway domain swapping in amyloid-like fibrils of T7 endonuclease I. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 103: 8042-8047.

81. Harauz G., Ladizhansky V., Boggs J. M. (2009) Structural polymorphism and multifunctionality of myelin basic protein. Biochemistry 48: 8094-8104.

82. Hartmuth K., Urlaub H., Vornlocher H. P., Will C. L., Gentzel M., Wilm M„ Luhrmann R. (2002) Protein composition of human prespliceosomes isolated by a tobramycin affinity-selection method. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 16719-16724.

83. Hayakawa H., Uchiumi T., Fukuda T., Ashizuka M., Kohno K., Kuwano M., Sekiguchi M. (2002) Binding capacity of human YB-1 protein for RNA containing 8-oxoguanine. Biochemistry 41: 12739-12744.

84. He B., Wang K., Liu Y., Xue B., Uversky V. N., Dunker A. K. (2009) Predicting intrinsic disorder in proteins: an overview. Cell Res. 19: 929-949

85. Higashi K., Inagaki Y., Fujimori K., Nakao A., Kaneko H., Nakatsuka I. (2003 a) Interferon-y interferes with transforming growth factor-(3 signalingthrough direct interaction of YB-1 with Smad3. J. Biol. Chem. 278: 4347043479.

86. Higashi K., Inagaki Y., Suzuki N., Mitsui S., Mauviel A., Kaneko H., Nakatsuka I. (2003b) Y-box-binding protein YB-1 mediates transcriptional repression of human a2(I) collagen gene expression by interferon-}*. J. Biol. Chem. 278: 5156-5162.

87. Holt C., Sawyer L. (1993) Caseins as rheomorphic proteins: interpretation of primary and secondary structures of the aSl-, (3- and k-caseins. J. Chem. Soc. Faraday Trans. 89: 2683-2692.

88. Homer C., Knight D. A., Hananeia L., Sheard P., Risk J., Lasham A., Royds J. A., Braithwaite A. W. (2005) Y-box factor YB1 controls p53 apoptotic function. Oncogene 24: 8314-8325.

89. Hong D. P., Fink A. L., Uversky V. N. (2008) Structural characteristics of a-synuclein oligomers stabilized by the flavonoid baicalein. J. Mol. Biol. 383: 214-223.

90. Horn G., Hofweber R., Kremer W., Kalbitzer H. R. (2007) Structure and function of bacterial cold shock proteins. Cell. Mol. Life Set 64: 1457-1470.

91. Huang J., Tan P. H., Li K. B., Matsumoto K., Tsujimoto M., Bay B. H. (2005) Y-box binding protein, YB-1, as a marker of tumor aggressiveness and response to adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int. J. Oncol. 26: 607613.

92. Iakoucheva L. M., Brown C. J., Lawson J. D., Obradovic Z., Dunker A. K. (2002) Intrinsic disorder in cell-signaling and cancer-associated proteins. J. Mol. Biol. 323: 573-584.

93. Inoue Y., Kishimoto A., Hirao J., Yoshida M., Taguchi H. (2001) Strong growth polarity of yeast prion fiber revealed by single fiber imaging. J. Biol. Chem. 276: 35227-35230.

94. Isbell D. T., Du S, Schroering A. G., Colombo G., Shelling J. G. (1993) Metal ion binding to dog osteocalcin studied by !H NMR spectroscopy. Biochemistry 32: 11352-11362.

95. Janowski R., Kozak M., Abrahamson M., Grubb A., Jaskolski M. (2005) 3D domain-swapped human cystatin C with amyloidlike intermolecular (3-sheets. Proteins 61: 570-578.

96. Janz M., Jürchott K., Karawajew L., Royer H. (2000) Y-box factor YB-1 is associated with the centrosome during mitosis. Gene Function & Disease 1: 57-59.

97. Jenkins R. H., Bennagi R., Martin J., Phillips A. O., Redman J. E., Fraser D. J. (2010) A conserved stem loop motif in the 5'untranslated region regulates transforming growth factor-^ translation. PLoS One 5: el2283.

98. Jiang W., Hou Y., Inouye M. (1997) CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. J. Biol. Chem. 272: 196-202.

99. Jiménez J. L., Guijarro J. I., Orlova E., Zurdo J., Dobson C. M., Sunde M., Saibil H. R. (1999) Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. EMBO J. 18: 815-821.

100. Jiménez J. L., Nettleton E. J., Bouchard M., Robinson C. V., Dobson C. M., Saibil H. R. (2002) The protofilament structure of insulin amyloid fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 9196-9201.

101. Johnson G. D., Davidson R. S., McNamee K. C., Russell G., Goodwin D., Holborow E. J. (1982) Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J. Immunol. Methods 55: 231-242.

102. Jung A., Bamann C., Kremer W., Kalbitzer H. R., Brunner E. (2004) High-temperature solution NMR structure of 7wCsp. Protein Sci. 13: 342-350.

103. Karush F. (1950) Heterogeneity of the Binding Sites of Bovine Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 72: 2705-2713.

104. Kedersha N., Anderson P. (2007) Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431: 61-81.

105. Kelm R. J., Jr., Elder P. K., Getz M. J. (1999) The single-stranded DNA-binding proteins, Pura, Pur/?, and MSY1 specifically interact with an exon 3-derived mouse vascular smooth muscle a-actin messenger RNA sequence. J. Biol. Chem. 274: 38268-38275.

106. Khandelwal P., Padala M. K., Cox J., Guntaka R. V. (2009) The N-terminal domain of Y-box binding protein-1 induces cell cycle arrest in G2/M phase by binding to cyclin Dl. Int. J. Cell Biol 2009: 243532.

107. Klement K., Wieligmann K., Meinhardt J., Hortschansky P., Richter W., Fandrich M. (2007) Effect of different salt ions on the propensity of aggregation and on the structure of Alzheimer's A(3(l-40) amyloid fibrils. J. Mol. Biol. 373: 1321-1333.

108. Kloks C. P., Spronk C. A., Lasonder E., Hoffmann A., Vuister G. W., Grzesiek S., Hilbers C. W. (2002) The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1. J. Mol. Biol. 316: 317-326.

109. Kloks C. P., Tessari M., Vuister G. W., Hilbers C. W. (2004) Cold shock domain of the human Y-box protein YB-1. Backbone dynamics and equilibrium between the native state and a partially unfolded state. Biochemistry 43: 10237-10246.

110. Koike K., Uchiumi T., Ohga T., Toh S., Wada M., Kohno K., Kuwano M. (1997) Nuclear translocation of the Y-box binding protein by ultraviolet irradiation. FEBS Lett. 417: 390-394.

111. Kojic S., Medeot E., Guccione E., Krmac H., Zara I., Martinelli V., Valle G., Faulkner G. (2004) The Ankrd2 protein, a link between the sarcomere and the nucleus in skeletal muscle. J. Mol. Biol. 339: 313-325.

112. Kozak S. L., Marin M., Rose K. M., Bystrom C., Kabat D. (2006) The anti-MV-1 editing enzyme APOBEC3G binds HIV-1 RNA and messenger RNAs that shuttle between polysomes and stress granules. J. Biol. Chem. 281: 29105-29119.

113. Kremer W., Schuler B., Harrieder S., Geyer M., Gronwald W., Welker C., Jaenicke R., Kalbitzer H. R. (2001) Solution NMR structure of the cold-shock protein from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. Eur. J. Biochem. 268: 2527-2539.

114. Krishnan R., Lindquist S. L. (2005) Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity. Nature 435: 765-772.

115. Kryndushkin D. S., Alexandrov I. M., Ter-Avanesyan M. D., Kushnirov V. V. (2003) Yeast PS7+. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04. J. Biol. Chem. 278: 49636-49643.

116. Ladomery M., Sommerville J. (1994) Binding of Y-box proteins to RNA: involvement of different protein domains. Nucleic Acids Res.22: 5582-5589.

117. Landsman D. (1992) RNP-1, an RNA-binding motif is conserved in the DNA-binding cold shock domain. Nucleic Acids Res. 20: 2861-2864.

118. Lasham A., Lindridge E., Rudert F., Onrust R., Watson J. (2000) Regulation of the human fas promoter by YB-1, Pura and AP-1 transcription factors. Gem? 252: 1-13.

119. Lashuel H. A., Aljabari B., Sigurdsson E. M., Metz C. N., Leng L., Callaway D. J., Bucala R. (2005) Amyloid fibril formation by macrophage migration inhibitory factor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 338: 973-980.

120. Lee B. J., Cansizoglu A. E., Suel K. E., Louis T. H., Zhang Z., Chook Y. M. (2006) Rules for nuclear localization sequence recognition by karyopherin|32. Cell 126: 543-558.

121. Lenz J., Okenquist S. A., LoSardo J. E., Hamilton K. K., Doetsch P. W. (1990) Identification of a mammalian nuclear factor and human cDNA-encoded proteins that recognize DNA containing apurinic sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 3396-3400.

122. Li J., Hawkins I. C., Harvey C. D., Jennings J. L., Link A. J., Patton J. G. (2003) Regulation of alternative splicing by SRrp86 and its interacting proteins. Mol. Cell. Biol. 23: 7437-7447.

123. Li W. W., Hsiung Y., Wong V., Galvin K., Zhou Y., Shi Y., Lee A. S. (1997) Suppression of grp78 core promoter element-mediated stress induction by the dbpA and dbpB (YB-1) cold shock domain proteins. Mol. Cell. Biol. 17: 6168.

124. Li X., Romero P., Rani M., Dunker A. K., Obradovic Z. (1999) Predicting Protein Disorder for N-, C-, and Internal Regions. Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform. 10: 30-40.

125. Lian L. Y. (1998) NMR structural studies of glutathione S-transferase. Cell. Mol. Life Sci.54: 359-362.

126. Liebovitch L. S., Selector L. Y., Kline R. P. (1992) Statistical properties predicted by the ball and chain model of channel inactivation. Biophys J. 63: 1579-1585.

127. Liu J., Sato C., Cerletti M., Wagers A. (2010) Notch signaling in the regulation of stem cell self-renewal and differentiation. Curr. Top. Dev. Biol. 92: 367-409.

128. Liu W., Rui H., Wang J., Lin S., He Y., Chen M., Li Q., Ye Z., Zhang S., Chan S. C., Chen Y. G., Han J., Lin S. C. (2006) Axin is a scaffold protein in TGF-(3 signaling that promotes degradation of Smad7 by Arkadia. EMBO J. 25: 1646-1658.

129. Lopez M. M., Makhatadze G. I. (2000) Major cold shock proteins, CspA from Escherichia coli and CspB from Bacillus subtilis, interact differently with single-stranded DNA templates. Biochim. Biophys. Acta 1479: 196-202.

130. Lopez M. M., Yutani K., Makhatadze G. I. (1999) Interactions of the major cold shock protein of Bacillus subtilis CspB with single-stranded DNA templates of different base composition. J. Biol. Chem. 274: 33601-33608.

131. Lovett D. H., Cheng S., Cape L., Pollock A. S., Mertens P. R. (2010) YB-1 alters MT1-MMP trafficking and stimulates MCF-7 breast tumor invasion and metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 398: 482-488.

132. Lu Z. H., Books J. T., Ley T. J. (2005) YB-1 is important for late-stage embryonic development, optimal cellular stress responses, and the prevention of premature senescence. Mol. Cell. Biol. 25: 4625-4637.

133. Luca S., Yau W. M., Leapman R., Tycko R. (2007) Peptide conformation and supramolecular organization in amylin fibrils: constraints from solid-state NMR. Biochemistry 46: 13505-13522.

134. Lundmark K., Westermark G. T., Olsen A., Westermark P. (2005) Protein fibrils in nature can enhance amyloid protein A amyloidosis in mice: Cross-seeding as a disease mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 60986102.

135. Lutz M., Wempe F., Bahr I., Zopf D., von Melchner H. (2006) Proteasomal degradation of the multifunctional regulator YB-1 is mediated by an F-Box protein induced during programmed cell death. FEBSLett. 580: 3921-3930.

136. Macario A. J., Conway de Macario E. (2005) Sick chaperones, cellular stress, and disease. N. Engl. J. Med. 353: 1489-1501.

137. MacDonald G. H., Itoh-Lindstrom Y., Ting J. P. (1995) The transcriptional regulatory protein, YB-1, promotes single-stranded regions in the DRA promoter. J. Biol. Chem. 270: 3527-3533.

138. Maddelein M. L., Dos Reis S., Duvezin-Caubet S., Coulary-Salin B., Saupe S. J. (2002) Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 7402-7407.

139. Makhatadze G. I., Marahiel M. A. (1994) Effect of pH and phosphate ions on self-association properties of the major cold-shock protein from Bacillus subtilis. Protein Sci. 3: 2144-2147.

140. Manival X., Ghisolfi-Nieto L., Joseph G., Bouvet P., Erard M. (2001) RNA-binding strategies common to cold-shock domain- and RNA recognition motif-containing proteins. Nucleic Acids Res. 29: 2223-2233.

141. Matsumoto K., Tanaka K. J., Tsujimoto M. (2005) An acidic protein, YBAP1, mediates the release of YB-1 from mRNA and relieves the translational repression activity ofYB-1. Mol. Cell. Biol. 25: 1779-1792.

142. McGlinchey R. P., Gruschus J. M., Nagy A., Lee J. C. (2011) Probing fibril dissolution of the repeat domain of a functional amyloid, Pmell7, on the microscopic and residue level. Biochemistry 50: 10567-10569.

143. McGlinchey R. P., Shewmaker F., McPhie P., Monterroso B., Thurber K., Wickner R. B. (2009) The repeat domain of the melanosome fibril protein Pmell7 forms the amyloid core promoting melanin synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 13731-13736.

144. Merlini G., Bellotti V. (2003) Molecular mechanisms of amyloidosis. N. Engl. J. Med. 349: 583-596.

145. Mertens P. R., Alfonso-Jaume M. A., Steinmann K., Lovett D. H. (1998) A synergistic interaction of transcription factors AP2 and YB-1 regulates gelatinase A enhancer-dependent transcription. J. Biol. Chem. 273: 3295732965.

146. Mertens P. R., Alfonso-Jaume M. A., Steinmann K., Lovett D. H. (1999) YB-1 regulation of the human and rat gelatinase A genes via similar enhancer elements. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2480-2487.

147. Mertens P. R., Harendza S., Pollock A. S., Lovett D. H. (1997) Glomerular mesangial cell-specific transactivation of matrix metalloproteinase 2 transcription is mediated by YB-1. J. Biol. Chem. 272: 22905-22912.

148. Minich W. B., Korneyeva N. L., Berezin Y. V., Ovchinnikov L. P. (1989) A special repressor/activator system controls distribution of mRNA between translationally active and inactive mRNPs in rabbit reticulocytes. FEBS Lett. 258: 227-229.

149. Minich W. B., Maidebura I. P., Ovchinnikov L. P. (1993) Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes. Eur. J. Biochem. 212: 633-638.

150. Minich W. B., Ovchinnikov L. P. (1992) Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation. Biochimie 74: 477-483.

151. Minich W. B., Volyanik E. V., Korneyeva N. L., Berezin Y. V., Ovchinnikov L. P. (1990) Cytoplasmic mRNP proteins affect mRNA translation. Mol. Biol. Rep. 14: 65-67.

152. Molina H., Horn D. M., Tang N., Mathivanan S., Pandey A. (2007) Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104: 2199-2204.

153. Moraes K. C., Quaresma A. J., Maehnss K., Kobarg J. (2003) Identification and characterization of proteins that selectively interact with isoforms of the mRNA binding protein AUF1 (hnRNP D). Biol. Chem. 384: 25-37.

154. Morel C, Kayibanda B, Scherrer K. (1971) Proteins associated with globin messenger RNA in avian erythroblasts: Isolation and comparison with the proteins bound to nuclear messenger-like RNA. FEBS Lett. 18: 84-88.

155. Morris A. M, Watzky M. A, Finke R. G. (2009) Protein aggregation kinetics, mechanism, and curve-fitting: a review of the literature. Biochim. Biophys. Acta 1794: 375-397.

156. Mueller U, Perl D, Schmid F. X, Heinemann U. (2000) Thermal stability and atomic-resolution crystal structure of the Bacillus caldolyticus cold shock protein. J. Mol. Biol. 297: 975-988.

157. Mukhopadhyay S, Krishnan R, Lemke E. A, Lindquist S, Deniz A. A. (2007) A natively unfolded yeast prion monomer adopts an ensemble of collapsed and rapidly fluctuating structures. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 104: 2649-2654.

158. Munishkina L. A, Henriques J, Uversky V. N, Fink A. L. (2004) Role of protein-water interactions and electrostatics in a-synuclein fibril formation. Biochemistry 43: 3289-3300.

159. Murphy K. P, Freire E. (1992) Thermodynamics of structural stability and cooperative folding behavior in proteins. Adv. Protein Chem. 43: 313-361.

160. Murray M. T. (1994) Nucleic acid-binding properties of the Xenopus oocyte Y box protein mRNP3+4. Biochemistry 33: 13910-13917.

161. Nashchekin D, Zhao J., Visa N, Daneholt B. (2006) A novel Dedl-like RNA helicase interacts with the Y-box protein ctYB-1 in nuclear mRNP particles and in polysomes. J. Biol. Chem. 281: 14263-14272.

162. Nelson R, Eisenberg D. (2006) Structural models of amyloid-like fibrils. Adv. Protein Chem. 73: 235-282.

163. Nelson R, Sawaya M. R, Balbirnie M, Madsen A. 0, Riekel C, Grothe R, Eisenberg D. (2005) Structure of the cross-(3 spine of amyloid-like fibrils. Nature 435: 773-778.

164. Neves M. A. C, Yeager M, Abagyan R. (2012) Unusual arginine formations in protein function and assembly: rings, strings, and stacks. J. Phys. Chem. B 116: 7006-7013.

165. Nilsson M. R. (2004) Techniques to study amyloid fibril formation in vitro. Methods 34: 151-160.

166. Nixon R. A. (2006) Autophagy in neurodegenerative disease: friend, foe or turncoat? Trends Neurosci. 29: 528-535.

167. Ohashi S., Atsumi M., Kobayashi S. (2009) HSP60 interacts with YB-1 and affects its polysome association and subcellular localization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 385: 545-550.

168. Ohba H., Chiyoda T., Endo E., Yano M., Hayakawa Y., Sakaguchi M., Darnell R. B., Okano H. J., Okano H. (2004) Sox21 is a repressor of neuronal differentiation and is antagonized by YB-1. Neurosci. Lett. 358: 157-160.

169. Ohga T., Uchiumi T., Makino Y., Koike K., Wada M., Kuwano M., Kohno K. (1998) Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J. Biol. Chem. 273: 5997-6000.

170. Okamoto T., Izumi H., Imamura T., Takano H., Ise T., Uchiumi T., Kuwano M., Kohno K. (2000) Direct interaction of p53 with the Y-box binding protein, YB-1: a mechanism for regulation of human gene expression. Oncogene 19: 6194-6202.

171. Oldfield C. J., Cheng Y., Cortese M. S., Brown C. J., Uversky V. N., Dunker A. K. (2005) Comparing and combining predictors of mostly disordered proteins. Biochemistry 44: 1989-2000.

172. Olofsson A., Ippel J. H., Wijmenga S. S., Lundgren E., Ohman A. (2004) Probing solvent accessibility of transthyretin amyloid by solution NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 279: 5699-5707.

173. Olsen J. V., Blagoev B., Gnad F., Macek B., Kumar C., Mortensen P., Mann M. (2006) Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell 127: 635-648.

174. Onishi H., Kino Y., Morita T., Futai E., Sasagawa N., Ishiura S. (2008) MBNL1 associates with YB-1 in cytoplasmic stress granules. J. Neurosci. Res. 86: 1994-2002.

175. Ono K., Condron M. M„ Teplow D. B. (2009) Structure-neurotoxicity relationships of amyloid (3-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106: 14745-14750.

176. Osherovich L. Z., Weissman J. S. (2002) The utility of prions. Dev. Cell 2: 143-151.

177. Ouali M., King R. D. (2000) Cascaded multiple classifiers for secondary structure prediction. Protein Sci. 9: 1162-1176.

178. Paranjape S. M., Harris E. (2007) Y box-binding protein-1 binds to the dengue virus 3'-untranslated region and mediates antiviral effects. J. Biol. Chem. 282: 30497-30508.

179. Perl D., Mueller U., Heinemann U., Schmid F. X. (2000) Two exposed amino acid residues confer thermostability on a cold shock protein. Nat. Struct. Biol. 7: 380-383.

180. Perl D., Welker C., Schindler T., Schroder K., Marahiel M. A., Jaenicke R., Schmid F. X. (1998) Conservation of rapid two-state folding in mesophilic, thermophilic and hyperthermophilic cold shock proteins. Nat. Struct. Biol. 5: 229-235.

181. Petkova A. T., Buntkowsky G., Dyda F., Leapman R. D., Yau W. M., Tycko R. (2004) Solid state NMR reveals a pH-dependent antiparallel P-sheet registry in fibrils formed by a |3-amyloid peptide. J. Mol. Biol. 335: 247-260

182. Petrosian S. A., Makhatadze G. I. (2000) Contribution of proton linkage to the thermodynamic stability of the major cold-shock protein of Escherichia coli CspA. Protein Sci. 9: 387-394.

183. Phadtare S., Inouye M. (1999) Sequence-selective interactions with RNA by CspB, CspC and CspE, members of the CspA family of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 33: 1004-1014.

184. Powers E. T., Morimoto R. I., Dillin A., Kelly J. W., Balch W. E. (2009) Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annu. Rev. Biochem. 78: 959-991.

185. Privalov P. L. (1990) Cold denaturation of proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25: 281-305.

186. Privalov P. L., Makhatadze G. I. (1990) Heat capacity of proteins. II. Partial molar heat capacity of the unfolded polypeptide chain of proteins: protein unfolding effects. J. Mol. Biol. 213: 385-391.

187. Ptitsyn O. B. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Protein. Chem. 47: 83-229.

188. Radivojac P., Vucetic S., O'Connor T. R., Uversky V. N., Obradovic Z., Dunker A. K. (2006) Calmodulin signaling: analysis and prediction of a disorder-dependent molecular recognition. Proteins 63: 398-410.

189. Raj G. V., Safak M., MacDonald G. H., Khalili K. (1996) Transcriptional regulation of human polyomavirus JC: evidence for a functional interaction between RelA (p65) and the Y-box-binding protein, YB-1. J. Virol. 70: 59445953.

190. Rapp T. B., Yang L., Conrad E. U., 3rd, Mandahl N., Chansky H. A. (2002) RNA splicing mediated by YB-1 is inhibited by TLS/CHOP in human myxoid liposarcoma cells. J. Orthop. Res. 20: 723-729.

191. Rath A., Davidson A. R., Deber C. M. (2005) The structure of "unstructured" regions in peptides and proteins: role of the polyproline II helix in protein folding and recognition. Biopolymers 80: 179-185.

192. Rauen T., Raffetseder U., Frye B. C., Djudjaj S., Muhlenberg P. J., Eitner F., Lendahl U., Bernhagen J., Dooley S., Mertens P. R. (2009) YB-1 acts as a ligand for Notch-3 receptors and modulates receptor activation. J. Biol. Chem. 284: 26928-26940.

193. Receveur-Brechot V., Bourhis J. M., Uversky V. N., Canard B., Longhi S. (2006) Assessing protein disorder and induced folding. Proteins 62: 24-45

194. Ritter C., Maddelein M. L., Siemer A. B., Liihrs T., Ernst M., Meier B. H., Saupe S. J., Riek R. (2005) Correlation of structural elements and infectivity of the HET-s prion. Nature 435: 844-848.

195. Romero, Obradovic, Dunker K. (1997) Sequence Data Analysis for Long Disordered Regions Prediction in the Calcineurin Family. Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform. 8: 110-124.

196. Ruiz-Sanz J., Simoncsits A., Toro I., Pongor S., Mateo P. L., Filimonov V. V. (1999) A thermodynamic study of the 434-repressor N-terminal domain and of its covalently linked dimers. Eur. J. Biochem. 263: 246-253.

197. Rush J, Moritz A, Lee K. A, Guo A, Goss V. L, Spek E. J, Zhang H, Zha X. M, Polakiewicz R. D., Comb M. J. (2005) Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nat. Biotechnol. 23: 94-101.

198. Ruzanov P. V, Evdokimova V. M, Korneeva N. L, Hershey J. W, Ovchinnikov L. P. (1999) Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments. J. Cell Sci. 112 ( Pt 20): 3487-3496.

199. Safak M., Gallia G. L, Ansari S. A, Khalili K. (1999a) Physical and functional interaction between the Y-box binding protein YB-1 and human polyomavirus JC virus large T antigen. J. Virol. 73: 10146-10157.

200. Safak M, Gallia G. L, Khalili K. (1999b) Reciprocal interaction between two cellular proteins, Рига and YB-1, modulates transcriptional activity of JCVcy in glial cells. Mol. Cell. Biol. 19: 2712-2723.

201. Saji H, Toi M, Saji S, Koike M, Kohno K, Kuwano M. (2003) Nuclear expression of YB-1 protein correlates with P-glycoprotein expression in human breast carcinoma. Cancer Lett. 190: 191-197.

202. Sakono M, Zako T. (2010) Amyloid oligomers: formation and toxicity of AD oligomers. FEBS J. 277: 1348-1358.

203. Sambashivan S, Liu Y, Sawaya M. R, Gingery M, Eisenberg D. (2005) Amyloid-like fibrils of ribonuclease A with three-dimensional domain-swapped and native-like structure. Nature 437: 266-269.

204. Sandal M, Valle F, Tessari I, Mammi S, Bergantino E, Musiani F, Brucale M, Bubacco L, Samori B. (2008) Conformational equilibria in monomeric а-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biol. 6: e6.

205. Schuck P. (2000) Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling. Biophys. J. 78: 1606-1619.

206. Schweers O, Schonbrunn-Hanebeck E, Marx A, Mandelkow E. (1994) Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for ^-structure. J. Biol. Chem. 269: 24290-24297.

207. Seeger M. A, Zhang Y, Rice S. E. (2012) Kinesin tail domains are intrinsically disordered. Proteins, in press.

208. Serber Z., Selenko P., Hansel R., Reckel S., Lohr F., Ferrell J. E., Jr., Wagner G., Dotsch V. (2006) Investigating macromolecules inside cultured and injected cells by in-cell NMR spectroscopy. Nat. Protoc. 1: 2701-2709.

209. Serdyuk I. N., Zaccai N. R., Zaccai J. (2007) Methods in Molecular Biophysics. Structure, Dynamics, Function, Cambridge: Cambridge University Press.

210. Serpell L. C., Fraser P. E., Sunde M. (1999) X-ray fiber diffraction of amyloid fibrils. Methods Enzymol. 309: 526-536.

211. Shewmaker F., McGlinchey R. P., Thurber K. R., McPhie P., Dyda F., Tycko R., Wickner R. B. (2009) The functional curli amyloid is not based on inregister parallel /?-sheet structure. J. Biol. Chem. 284: 25065-25076.

212. Shewmaker F., McGlinchey R. P., Wickner R. B. (2011) Structural insights into functional and pathological amyloid. J. Biol. Chem. 286: 16533-16540.

213. Shibao K., Takano H., Nakayama Y., Okazaki K., Nagata N., Izumi H., Uchiumi T., Kuwano M., Kohno K., Itoh H. (1999) Enhanced coexpression of YB-1 and DNA topoisomerase Ila genes in human colorectal carcinomas. Int. J. Cancer 83: 732-737.

214. Shiota M., Yokomizo A., Itsumi M., Uchiumi T., Tada Y., Song Y., Kashiwagi E., Masubuchi D., Naito S. (2011) Twistl and Y-box-binding protein-1 promote malignant potential in bladder cancer cells. BJU Int. 108: El 42-149.

215. Shirahama T., Cohen A. S. (1965) Structure of amyloid fibrils after negative staining and high-resolution electron microscopy. Nature 206: 737-738.

216. Shnyreva M., Schullery D. S., Suzuki H., Higaki Y., Bomsztyk K. (2000) Interaction of two multifunctional proteins. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and Y-box-binding protein. J. Biol. Chem. 275: 1549815503.

217. Si K., Choi Y. B., White-Grindley E., Majumdar A., Kandel E. R. (2010) Aplysia CPEB can form prion-like multimers in sensory neurons that contribute to long-term facilitation. Cell 140: 421-435.

218. Si K., Lindquist S., Kandel E. R. (2003) A neuronal isoform of the Aplysia CPEB has prion-like properties. Cell 115: 879-891.

219. Sidote D. J., Hoffman D. W. (2003) NMR structure of an archaeal homologue of ribonuclease P protein Rpp29. Biochemistry 42: 13541-13550.

220. Sikorski P., Atkins E. (2005) New model for crystalline polyglutamine assemblies and their connection with amyloid fibrils. Biomacromolecules 6: 425-432.

221. Skabkin M. A., Evdokimova V., Thomas A. A., Ovchinnikov L. P. (2001) The major messenger ribonucleoprotein particle protein p50 (YB-l) promotes nucleic acid strand annealing. J. Biol. Chem. 276: 44841-44847.

222. Skabkin M. A., Kiselyova O. I., Chernov K. G., Sorokin A. V., Dubrovin E. V., Yaminsky I. V., Vasiliev V. D., Ovchinnikov L. P. (2004) Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1. Nucleic Acids Res. 32: 5621-5635.

223. Skabkina O. V., Lyabin D. N., Skabkin M. A., Ovchinnikov L. P. (2005) YB-1 autoregulates translation of its own mRNA at or prior to the step of 40S ribosomal subunit joining. Mol. Cell. Biol. 25: 3317-3323.

224. Skabkina O. V., Skabkin M. A., Popova N. V., Lyabin D. N., Penalva L. O., Ovchinnikov L. P. (2003) Poly(A)-binding protein positively affects YB-1 mRNA translation through specific interaction with YB-1 mRNA. J. Biol. Chem. 278: 18191-18198.

225. Skalweit A., Doller A., Huth A., Kähne T., Persson P. B., Thiele B. J. (2003) Posttranscriptional control of renin synthesis: identification of proteins interacting with renin mRNA 3'-untranslated region. Circ. Res. 92: 419-427.

226. Skoko N., Baralle M., Buratti E., Baralle F. E. (2008) The pathological splicing mutation c.6792C>G in NF1 exon 37 causes a change of tenancy between antagonistic splicing factors. FEBS Lett. 582: 2231-2236.

227. Sreerama N., Woody R. W. (1994) Poly(Pro)II helices in globular proteins: identification and circular dichroic analysis. Biochemistry 33: 10022-10025.

228. Stein U., Bergmann S., Scheffer G. L., Scheper R. J., Royer H. D., Schlag P. M., Walther W. (2005) YB-1 facilitates basal and 5-fluorouracil-inducible expression of the human major vault protein (MVP) gene. Oncogene 24: 3606-3618.

229. Stellwagen E., Rysavy R., Babul G. (1972) The conformation of horse heart apocytochrome c. J. Biol. Chem. 247: 8074-8077.

230. Stenina O. I., Shaneyfelt K. M., DiCorleto P. E. (2001) Thrombin induces the release of the Y-box protein dbpB from mRNA: a mechanism of transcriptional activation. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98: 7277-7282.

231. Stickeler E., Fraser S. D., Honig A., Chen A. L., Berget S. M., Cooper T. A.2001) The RNA binding protein YB-1 binds A/C-rich exon enhancers and stimulates splicing of the CD44 alternative exon v4. EMBO J. 20: 3821-3830.

232. Studier F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41: 207-234.

233. Swamynathan S. K., Nambiar A., Guntaka R. V. (2000) Chicken Y-box proteins chk-YB-lb and chk-YB-2 repress translation by sequence-specific interaction with single-stranded RNA. Biochem. J. 348 Pt 2: 297-305.

234. Tacke F., Kanig N., En-Nia A., Kaehne T., Eberhardt C. S., Shpacovitch V., Trautwein C., Mertens P. R. (2011) Y-box protein-l/pl8 fragment identifies malignancies in patients with chronic liver disease. BMC Cancer 11: 185.

235. Tafuri S. R., Wolffe A. P. (1992) DNA binding, multimerization, and transcription stimulation by the Xenopus Y box proteins in vitro. New Biol 4: 349-359.

236. Tanaka T., Kondo S., Iwasa Y., Hiai H., Toyokuni S. (2000) Expression of stress-response and cell proliferation genes in renal cell carcinoma induced by oxidative stress. Am. J. Pathol. 156: 2149-2157.

237. Tokuriki N., Oldfield C. J., Uversky V. N., Berezovsky I. N., Tawfik D. S. (2009) Do viral proteins possess unique biophysical features? Trends Biochem. Sci. 34: 53-59.

238. Tompa P. (2002) Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem. Sci. 27: 527-533.

239. Tompa P., Csermely P. (2004) The role of structural disorder in the function of RNA and protein chaperones. FASEB J. 18: 1169-1175.

240. Torok M., Milton S., Kayed R., Wu P., Mclntire T., Glabe C. G., Langen R.2002) Structural and dynamic features of Alzheimer's A|3 peptide in amyloid fibrils studied by site-directed spin labeling. J. Biol. Chem. 277: 4081040815.

241. Toyama B. H., Weissman J. S. (2011) Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annu. Rev. Biochem. 80: 557-585.

242. True H. L., Lindquist S. L. (2000) A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature 407: 477-483.

243. Uversky V. N. (2003) Protein folding revisited. A polypeptide chain at the folding-misfolding-nonfolding cross-roads: which way to go? Cell. Mol. Life Sci. 60: 1852-1871.

244. Uversky V. N. (2008) Amyloidogenesis of natively unfolded proteins. Curr. Alzheimer Res. 5: 260-287.

245. Uversky V. N. (2009) Intrinsically disordered proteins and their environment: effects of strong dénaturants, temperature, pH, counter ions, membranes, binding partners, osmolytes, and macromolecular crowding. Protein J. 28: 305-325.

246. Uversky V. N. (2010) Mysterious oligomerization of the amyloidogenic proteins. FEBS J. 277: 2940-2953.

247. Uversky V. N., Dunker A. K. (2010) Understanding protein non-folding. Biochim. Biophys. Acta 1804: 1231-1264.

248. Uversky V. N., Gillespie J. R., Fink A. L. (2000) Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins 41: 415-427.

249. Venyaminov S. Y., Gogia Z. V. (1982) Optical characteristics of all individual proteins from the small subunit of Escherichia coli ribosomes. Eur. J. Biochem. 126: 299-309.

250. Wasmer C., Lange A., Van Melckebeke H., Siemer A. B., Riek R., Meier B. H. (2008) Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a |3 solenoid with a triangular hydrophobic core. Science 319: 1523-1526.

251. Wassenberg D., Welker C., Jaenicke R. (1999) Thermodynamics of the unfolding of the cold-shock protein from Thermotoga maritima. J. Mol. Biol. 289: 187-193.

252. Weinreb P. H., Zhen W., Poon A. W., Conway K. A., Lansbury P. T., Jr. (1996) NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry 35: 13709-13715.

253. Westermark P. (2008) Amyloidosis and Amyloid Proteins: Brief History and Definitions. In Amyloid Proteins, pp 2-27. Wiley-VCH Verlag GmbH.

254. Wistow G. (1990) Cold shock and DNA binding. Nature 344: 823-824.

255. Woody R. W. (1995) Circular dichroism. Methods Enzymol. 246: 34-71.

256. Wright P. E., Dyson H. J. (1999) Intrinsically unstructured proteins: reassessing the protein structure-function paradigm. J. Mol. Biol. 293: 321-331.

257. Xu M., Ermolenkov V. V., He W., Uversky V. N., Fredriksen L., Lednev I. K. (2005) Lysozyme fibrillation: deep UV Raman spectroscopic characterization of protein structural transformation. Biopolymers 79: 58-61.

258. Xu W., Zhou L., Qin R., Tang H., Shen H. (2009) Nuclear expression of YB-1 in diffuse large B-cell lymphoma: correlation with disease activity and patient outcome. Eur. J. Haematol. 83: 313-319.

259. Yahata H., Kobayashi H., Kamura T., Amada S., Hirakawa T., Kohno K., Kuwano M., Nakano H. (2002) Increased nuclear localization of transcription factor YB-1 in acquired cisplatin-resistant ovarian cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 621-626.

260. Yang W. H., Bloch D. B. (2007) Probing the mRNA processing body using protein macroarrays and "autoantigenomics". RNA 13: 704-712.

261. Zamyatnin A. A. (1984) Amino acid, peptide, and protein volume in solution. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 13: 145-165.

262. Zeeb M., Balbach J. (2003) Single-stranded DNA binding of the cold-shock protein CspB from Bacillus subtilis: NMR mapping and mutational characterization. Protein Sci. 12: 112-123.

263. Zhang Y. F., Homer C., Edwards S. J., Hananeia L., Lasham A., Royds J., Sheard P., Braithwaite A. W. (2003) Nuclear localization of Y-box factor YB1 requires wild-type p53. Oncogene 22: 2782-2794.

264. Zou Y., Evans S., Chen J., Kuo H. C., Harvey R. P., Chien K. R. (1997) CARP, a cardiac ankyrin repeat protein, is downstream in the Nkx2-5 homeobox gene pathway. Development 124: 793-804.

Информация о работе

Гурьянов, Сергей Георгиевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Структурная характеристика белка YB-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы