Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функции цитокининов пурпурной несерной бактерии PHODOSPIRILLUM RUBRUM

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и функции цитокининов пурпурной несерной бактерии PHODOSPIRILLUM RUBRUM"

О".

о>

О- |

со 35 ' На правах рукописи

05 УДК 576.851, 541.144.4 , 577.15/17

СШЛЫГИНА ЛИДИЯ ДМИТРИЕВНА

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ЦИТОКИНИНОВ ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ

шяхБРтиш иивям

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Путцино - 1997

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук

/

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Музафаров Евгений Назибович Сердюк Ольга Петровна

Троцето Юрий Александрович Прохоренко Изабелла Рувимовна

Ведущая организация: Филиал Института биоорганической химии РАН им. акад. М.М. Шемякина и акад. Ю.А. Овчинникова , г. Пущино

ИЮНЯ 196? Г.- в '/ ч

Защита диссертации состоится июня 195? г.- в '/^час.

на заседании Диссертационного совета Д 200.29.01 в Инотитуте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, г. Пущино, Московской обл. Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН

Автореферат разослан мая 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук у/ Г.Н. Назарова

Актуальность проблемы. Растительные гормоны цитокинины - ши-зоко распространенный класс природных соединений, представляющих :о6ой производные аденина изопентенилированного в N-6 положении ароматического кольца. Первый природный цитокинин зеатин был вы-;елен Д. Летамом (Letham, 1964). В дальнейшем из природных источ-1иков были выделены обладавшие цитокининовой активностью зеатин-эибозид, изопентениладенга. дигидрозеатин и ряд других цитокини-1ов. Основная функция цитокининов заключается в стимуляции деле-1ия растительных клеток как in vivo, так и in vitro. Однако цито-ошины полифункциональны и регулируют в клетке такие процессы, так биосинтез хлорофилла (Jelie, Bogdanovich, 1989), формирование <лоропластов на "ранних стадиях развития листа (Курсанов и др., t964), клеточную диф$еренцировку и органогенез растительных тканей (Skoog, Miller, 195V), задержку старения срезанных листьев (Кулаева, 1973) и многие другие. Цитокинины занимают уникальное юложение среди других растительных гормонов в связи с тем, что некоторые из них, например зеатинрибозид или изопентениладенин, лэгут входить в состав тРНК. В настоящее время показано, что модифицированные таким образом адениновые основания, входящие в зостав тРНК, играют большую роль в регуляции биосинтеза белка (Bjórk, 1992). В литературе имеются сведения о наличии цитокини-¡говой активности у соединений, не относящихся к классу аминопури-яов, например, у производных мочевины (Takahashi et al., 1978). Эднако только одно из них, а именно дифенилмочевина является природным соединением (Shantz, Steward, 19S5). Мочевина и ее производные регулируют некоторые физиологические процессы в клетке подобно цитокининaw пуринового ряда, что позволило Летаму причислить производные мочевины к цитокининам. Цитокинины широко распространены не только в растительном мире, включая низшие и высшие растения, но также и у микроорганизмов, в основном симбиотических или паразитических. Исключением считались фототрофные бактерии, осуществляющие фотосинтез по аноксигенному типу, т.е. без выделения кислорода, и которые на наличие в них фитогормонов до настоящего времени не исследовались. Структура и функции цитокининов высших растений, в отличие от бактерий, изучены достаточно хорошо. Однозначных данных о непосредственном участии фитогормонов в метаболизме микроорганизмов не имеется и считается общепринятым, что биосинтез у них носит приспособительный характер. Не состав-

ляют, по-видимому, исключения и фототрофные пурпурные бактерии, у которых цитокинявы были обнаружены недавно (Serdyuk et al., 1993).

Однако наличие у них, по сравнению с нефототрофными микроорганизмами. новой функции - фотосингезирующей, могло повлечь появление дополнительной регуляторной функции и у присутствующих в них гормонов. В связи со всем вышеизложенным, исследование структуры и функции фитогормонов у фототрофных бактерий актуально.

Цеди и задачи работа. Целью данной работы было изучение способности фотогрофной пурпурной несерной бактерии Rhodosplrll-lum rubrum 1R к биосинтезу фитогормонов. Конкретные задачи своди-„ч лись к следующему:

1. Разработать методику выделения, очистки и идентификации фитогормонов.

2. Изучить состав и биологическую активность цитокининов пу-ринового ряда, как основного класса фитогормонов этой бактерии.

3. Изучить структуру и ее взаимосвязь с биологической активностью соединения фенольной природы, проявляющего цитокининовую активность и обнаруженного в культурадьной »едкости.

4. Исследовать зависимость состава и уровня классических цитокининов и цитокинин-подобного соединения фенольной природы, а также их распределение между клетками бактерий и культуральной жидкостью в зависимости от условий выращивания.

Научная новизна. 1) Впервые на примере фоготрофной пурпурной бактерии R. rubrum показана способность микроорганизмов с фотосинтезом по аноксигенному типу к биосинтезу фитогормонов, а именно цитокининов пуринового ряда, один из которых идентифицирован как зеатинрибозид. 2) Обнаружена высокая цитокининовая активность у экзоыетаболита R. rubrum фенольной природы, сравнимая по уровню с таковой у классических цитокининов пуриновой природы. 3) Определена структура этого фенольного соединения, позволившая идентифицировать его как 2-(п-оксифенил)-этанол, 4) Показано, что биологическая активность 2-(п-оксифенил)-этанола в значительной степени зависит от положения гидроксильной группы в бензольном кольце и максимально проявляется при наличии ее в пара - положении. 5) Установлена зависимость биосинтеза цитокининов пуринового и непуринового ряда от условий выращивания культуры и показана максимальная способность к их биосинтезу в фотоавтотрофных условиях

юста R. rubrum.

Практическая ценность работы. Выявление нового таксона мик-юорганизмов, способных к биосинтезу цитокининов, расширяет [редставления о распространении фитогормонов в природе и дает юзможность использовать их в качестве новых источников для полу-шния биологически активных соединений. Обнаружение нового класса юединений, проявляющих цитокининовую активность, открывает перс-¡ективу дальнейших исследований механизмов их действия и взаимос-)язи цитокининовой активности со структурами, отличными от пури-ювых.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладыва-шсь : на 9-ом конгрессе FESPP (Brno, Czech.Rebublic), 1994; LO-ом конгрессе FESPP (Italy), 1996; 18-ой конференции "Polyphe-lols", (Bordeaux,France), 1996, а также на конференциях в России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 13 них - 1 статья в отечественном и 3 - в зарубежных журналах и :борниках.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного эбзора, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследований.

В качестве объекта исследования была использована пурпурная несерная бактерия Rhodosplrlllum rubrum 1R из коллекции культур кафедры микробиологии МГУ (Москва). Культуру выращивали при pH 3.8, освещенности 2000 лк, при 30° С, в микробиологических матрацах емкостью 1,6 л в стерильных анаэробных условиях, на среде Ор-меруда (Ormerod et al., 1961). Биомассу собирали в стационарной $азе роста. Непрерывное культивирование R. rubrum осуществляли на программно- управляемом комплексе в фотогетеротрофных условиях в режиме турбидостата при содержании 0,2% лактата и 10 мкг/л биотина, или в режиме хемостата при содержании последнего в среде 2,5 мМ. В качестве газовой фазы использовали 987. аргона и 2% углекислоты. В фотоавтотрофных условиях выращивания в режиме турбидостата в среду добавляли только биотин в указанной выше концентрации, а в качестве газовой фазы использовали 75% Нг и 25% СОг-

При изучении действия экзогенных фитогормонов на R. rubrum, культуру выращивали в пенициллиновых флакончиках диаметром 20 мм на среде Ормеруда (Ormerod et al.. 1961), содержащей 0.4% лакта-та. при освещенности 2000 ж. Оптическую плотность суспензии клеток при 650 нм оценивали непосредственно в пенициллиновых флакончиках. Фитогормоны добавляли в виде водно-спиртовых растворов непосредственно перед посевом культуры. Начальная концентрация этанола составляла 0,001%.

Экстракцию фитогормонов проводили метанолом с конечной концентрацией 80%, при 4°С, в течение 16 часов из клеток, разрушенных ультразвуком. После упаривания метанола водный остаток подкисляли до pH 2,5-2,8 и проводили последовательную экстракцию (ауксинов - эфиром и гиббереллинов - этилацетатом), а при pH 7,5 цитокининов - водонасыщенным (1:1) н-бутанолом. Эфирный, этилаце-татный и бутанодьный экстракты упаривали, сухие остатки растворяли в 80%-ном этиловом спирте (Yokota et al.. 1980).

Экстракцию цитокининов из культуральной жидкости R. rubrum проводили по методике, описанной выше для биомассы.

Разделение суммарных фракций ауксинов, гиббереллинов и цитокининов проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силуфоловых пластинах F-254 (Czech. Resp.) в системе изопропа-нол:бензол:аммиак = 4:1:1 (об/об)(Cohen. 1982). После хроматогра-фирования флуоресцирующие зоны элюировали 80%-ним этанолом. В качестве метчиков использовали зеатин, зеатинрибозид, бензиламино-пурин, изопентениладенин (Sigma). 4-гидроксибензиловый спирт (Fluka), 2-(п-оксифенил)-этанол (Aldrich), ß-индолилуксусную кислоту (Fluka), гибберелловую кислоту (Fluka).

Для проведения высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) цитокининов использовали автоматизированную систему с контроллером Data Master G21 фирмы Gllson (Франция). Образцы для анализа растворяли в 60%-ном метаноле и фильтровали на микропористом фильтре Nylon - 66 ( 0.45-мкм) фирмы Filter Rainin, (США). Для анализа использовали колонки Zorbax G-18 (4.6 х 150 mm) фирмы Dupont (Франция). Элюцио осуществляли 60% метанолом со скоростью 0.4 мл/мин. Обнаружение образцов проводили с помощью детектора 115 UV фирмы Gilson (Франция) при 254 нм. В качестве метчиков использовали те же цитокинины, что и в ТСХ. Очистку фенольного соединения проводили методом ВЭЯХ в автоматической системе фирмы i

Pharmacia LKB Biotechnology (Швеция). Для анализа использовали колонку Sepharon SGX С18 (2.8 х 14 мм). Образец растворяли в 10% этаноле и регистрировали при 254 нм.

Специфическое окрашивание на ауксины проводили 1%-ным п-ди-метиламинобензальдегидом в 25%-ой HCl и 96% этаноле, на гибберел-лины - 5%-ной H2SO4 в 96%-ом этаноле (Муромцев, 1984), на феноль-ные соединения - 1%-ным FeCl3 в 96%-оы этаноле(Харборн, 1968).

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Spe-cord М-40 (ФРГ), спектры флуоресценции на спектрофотометре Hitachi 850 (Япония), масс-спектры на высоко-разрешающем масс-спектрометре Рlnnlgan MAP 8430 (ФРГ). ЯМР спектры регистрировали на высокоразрешающем спектрометре WM 400 Bruker (США), при Т=Э0?° К.

Активность индивидуальных цитокининов и фенольного соединения определяли в биотесте на Amaranthus cautfatus (Clzkova, 1990). Статистическую обработку данных проводили с использованием коэффициента Стьюдента для первого порога вероятности 0.95.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Выделение и идентификация цитокининов пуринового ряда из биомассы и кудьтуральной жидкости R. rubrum. Выделение ауксинов, гиббереллинов и цитокининов из биомассы R. rubrum осложнялось тем, что в органические растворители, обычно используемые при экстракции фитогормонов, могут переходить практически все пигменты, некоторые липиды и другие соединения, мешающие их экстракции и дальнейшему разделению. Чтобы избежать этого, подкисленный водный остаток частично очищали от пигментов и липидов предварительной экстракцией неполярными растворителями, и затем проводили их экстракцию растворителями, соответствующими для каждого класса фитогормонов (схема 1).

Хроматографический анализ экстрактов серного эфира и этила-цетата из биомассы R. rubrum показал отсутствие в них полос, специфически окрашивающихся на ауксины и гиббередлины, из чего был сделан вывод об их отсутствии в данных условиях выделения. Хроматографирование бутанольного экстракта показало наличие трех флуоресцирующих зон со значениями Rf 0.36, Rf 0.44 и Rf 0.52. Спектры поглощения образцов в 50% этаноле имели вид и максимумы, характерные для аминопуринов (рис. 1). При регистрации спектров в присутствии NH4OH характер спектра поглощения и максимумы сохранялись для образцов с Rf 0.44 и Rf 0.52, а для образца с Rf 0.36

Схема 1. Экстракция фитагорыанав ю биомассы R. rubrum

1-1

Клетки К. тЬпт |

1-1-1

I разрушение ультразвуком

I Разрушенные клетки I

I экстракция этанолом, I центрифугирование

I Водно-этаноль ньш экстракт |

I упаривание этанола I

I Водный экстракт I

I подкисление |подщелачивалие

|до pH 2.S-Z.B |до pH 7.5

Кислый водный I | Щелочной водный | экстракт | | экстракт |

I-'-Ii-1-Ii-1-1 I-'-1

IЭкстра» ]|Экстрак||Зкстрак-1 {Экстракция |

I ция II ция || ция | |водонасыщенным |

I неполяр. ||серным ||этилаце-| |бутанолои (1:1)|

I растворит.11эфиром || татои | | |

IПигменты!IАуксины||Гиббереллины||Цитокинины|

|_11___11_11_I

максимум смещался в длнноволновую область. Сдвиг или сохранение максимума при добавлении аммиака к спиртовому раствору цитокини-нов использовали в качестве теста на наличие или отсутствие заместителей в N^-положении аденина, которыми, как правило, являются остатки Сахаров (Blum, 1989). Использование этого подхода по-, казало, что образец с наименьшей подвижностью является однозаме-щенным N6-аминопуриноы, а два других могут быть рибозидами или глюкозидами. Методами ТСХ и ВЗЖХ при использовании в качестве стандарта зеатинрибозида была показана идентичность его значе-

о

1.0

0.8 0.6 0.4 0.2 0

1а,2а,б

260

280

300

220 240

Рис.1. Спектры поглощения цитоюпооюв кз й. тиЬгип в 502 этаноле.

1 - !?г 0.36, 2- Йг 0.44, 3- Кг 0.52; а - без аммиака, б - с 0.02 М аммиака.

20 О

240

280

320

нм

Рис.2. Спектри поглощения цитокинин-подобиого соединения из К. гиЬгш и стандартов.

1 - непуршювое соединение с 1?г 0.8;

2 - 2-(п-оксифенил)-этаиол (А1<1г1с(1);

3 - 1-фенил-1.2-этандиол (Пика).

ний Rf и времени выхода с колонки (4.5 мин.) и соединения с Rf 0.52. Таким образом, данные хроматографических анализов показали присутствие среди исследуемых цитокининов именно зеатинрибозида. Совпадения значений Rf, указанных выше двух других цитокининов из биомассы R. rubrum, с таковыми у остальных использованных метчиков не наблюдали (табл. 1).

Таблица 1

Хроматографическая подвижность (ТСХ) и время выхода с колонки (ВЗЖХ) природных цитокининов R. rubrum и стандартов.

Вещество Подвижность (Rf) Время выхода (мин)

П РИРОДНЫЕ

Цитокинин 1 0.36 3,78

Цитокинин 2 0.44 4.00

Цитокинин 3 0.52 4.50

С ТАНДАРТЫ

Зеатинрибозид 0.52 4.50

Зеатин 0.61 5.15

1*)6-бензиладенин 0.73 8.40

М6-изопентениладенин 0.90 9.45

М6-изопентениладенозин 0.65 11.00

При хроматографировании бутанольного экстракта полученного из культуральной жидкости R. rubrum, выращенной в матрацах, обнаружены три флуоресцирующие зоны со значениями Rf 0.36, Rf 0.52 и Rf 0.8, которые проявляли высокую цитокининовую активность в биотесте на Amaranthus caudatus. По спектрам поглощения, значениям Rf_и уровню биологической активности два цитокинина были идентичны выделенным из биомассы R. rubrum и один из них соответствовал идентифицированному нами ранее зеатинрибозиду (Serdyuk et al., 1993). Третье соединение с Rf 0.8 имело спектр поглощения, не типичный для аминопуринов (рис. 2).

2. Определение структуры экзометабодита непуринового ряда R. rubrum с цитокининовой активностью . Выяснение структуры экзометабодита фототрофа проводилось с помощью масс-спектрометрического анализа и изучения спектров поглощения в УФ-области. В соот-

ветствии с масс-спектрометрическими данными, обнаруженное соединение имело молекулярную массу равную 138 и элементный состав СвНюОг (рис. 3). По данным библиотеки масс-спектров, это соеди-

си2сн£он

107

77

) ii|li ii. iiiiJii.jin.Miiii.il,, 11,1,1,1,1. f. i... 1.1. i,i .л L

40 60 80 100 120

140

Рнс.З. Масс-спектр цитокинин-падобного соединения с Rf 0.8 из R.

rubrum.

Интенсивный ион при m/z 138 с элементным составом СдНюОг;

потеря С1130-^-С7Н70 (m/z 107); потеря СНгО-^С6Н5 (т/2 77).

нение могло соответствовать одной из следующих химических структур: 2-, 3-, 4-НО(С6Н4)СНг-СНгОН (оксифенилэтанолу с одним из возможных замещений) или (СбН5)СНОНСНгОН т.е. 1-фенил-1.2-этанди-олу, который не имел свободной гидроксильной группы в бензольном кольце. В спектре 1-фенил-1,2-этандиола наблюдали полосы поглощения, характерные для'бензольного хромофора (209 нм и 257 нм), а спектр поглощения экзометаболита с Rf 0.8 имел максимумы поглощения при 227 нм, 277 нм и плечо при 285 нм (рис 2). Из литературных источников известно, что характер спектра поглощения и положение максимумов, наблюдаемых у соединения с Rf 0.8, являются типичными для простых фенольных спиртов (Zeikel, 1967). Дополнительным подтверждением правильности отнесения данного соединения к фенодьным соединениям явилось окрашивание его в голубовато-зеленый цвет на хроматограмме раствором хлорного железа. Эта реакция используется при идентификации фенолов со свободными гидрок-сигруппами (Харборн, 1968). Таким образом, после отнесения экзометаболита с Rf 0,8 к фенолспиртаы оставалось выяснить положе-

3 8

ние гидронсигруппы в ароматическом кольце. УФ-спектры поглощения фенольного соединения из 1?. гиЬгит существенно отличались от таковых для соединения с мета-замещенной гидроксильной группой, и были сходны для орто-замещенного фенолспирта (табл. 2). Сравнение спектров поглощения природного соединения из

Таблица 2

Максимумы в спектрах поглощения соединения с Rf0.8 из R.rubrum и стандартов.

N | Вещество п\п| 1 I Максимумы погл. |в этаноле Максимумы погл. в 0.01 N КОН

1. 1 IПриродное с Rf0.8 I 225. 277. 285* 241. 296

2. I2-(п-оксифенил)-этанол 1 225. 278. 285* 242. 296

3. I2-(о-оксифенил)-этанол | 215. 274. 280* 241. 292

4. |3-(м-оксибензойн.) кислота | 226. 277. 283* 247. 292

5. I1-фенил-1.2-этандиол • | 208. 232. 297 210. 243* .314

* Плечо

R. rubrum, коммерческого 2-(п-оксифенял)-этанола, а также ор-то-замещенного фенолспирта. зарегистрированных в щелочных условиях. выявило батохромный сдвиг Ez~ и В-полос на 16-19 нм. Однако оптическая плотность основных полос поглощения ^zazAzqg увеличивалась для пара-замещенных фенолспиртов и уменьшалась для орто-замещенного фенолспирта. на основании чего это вещество скорее можно было отнести к пара-замещенному фенолспирту. Для подтверждения положения гидроксильной группы в бензольном кольце были получены ЯМР-спектры, которые позволили окончательно идентифицировать его как 2-(п-оксифенил)-этанол.

3. Флуоресценция и биологическая активность 2-(п-оксифе-нил)-этанола. Еще одним свойством соединения 2-(п-оксифенил)-этанола. отличающим его от цитокининов пуриновой природы, является высокий уровень флуоресценции, что характерно для некоторых классов фенольных соединений (Запрометов, 1974). Сравнительное изучение флуоресценции природных цитокининов пуриновой и непуриновой природы из R. rubrum, а также синтетических коммерческих препаратов аминопуринов и фенольных соединений показало различия как по

уровню, так и по значениям максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции у разных классов соединений (табл. 3).

Таблица 3

Максимумы возбуждения и испускания флуоресценции цитокининов из R. rubrum и стандартов.

Вещество 1 Возбуждение | Испускание

1 максимум! 1 уровень | максимум 1 | уровень

(нм) | | (отн. ед.)| I (нм) |(отн. ед.) 1

Природ н ы е

Непуриновый с Rf 0.8 245 | 1.5 | 306 I 1.7

280 | 12.0 | 306 I 120.0

Пуриновый с Rf 0.52 240 | 1.2 | 390 | 10.8

280 | 0.6 | 306 | 2.6

Я6-бензи1аденин (ВАЛ) С т а н д а рты

245 | 10.0 | 394 I 10.4

280 | 0.5 | 306 | 1.5

2-(п-оксифенил)-этанол 245 | 7.0 | SÖ6 | 24.5

280 | 16.5 | 306 I 140.0

2-(п-оксибензил)-этанол 240 | 37.0 | 309 | 47.0

280 | | 103.0 | I 309 | 127.0 I

Известно, что фенольные соединения с высоким уровнем флуоресценции играют большую роль при защите растений от патогенных микроорганизмов. Показано, что у растений в зоне поражения количество простых фенодьных соединений, имеющих высокий уровень флуоресценции, увеличивалось в 10-20 раз, в то время как содержание соединений с низкой флуоресценцией - всего в 2-3 раза (НагЬогпе, 1988).

2-(п-оксифенил)-этанол, выделенный из Я. гиЬгит.проявлял высокую цитокининовую активность в биотесте на АтагапЬЬиз саис/аСиз, на высечках из листьев редиса, а также вызывал специфический для ВАЛ органогенез в эксплантатах виши, земляники и актинидии. Коммерческие аналоги с орто- замещенной гидроксильной группой в бензольном кольце или без нее, цитокнниновой активностью не обладали (табл. 4). На основании данных по цитокнниновой активности

2-(п-оксифенил)-этанола во всех указанных биотестах, это соединение было отнесено нами к классу цитокинин-подобных. Известно, что

Таблица 4

Биологическая активность цитокининов из R. rubrum и стандартов.

Вещество Активность в биотесте (%)

Контроль* 100

Природные 2-(п-оксифенил)-этанол 350

Зеатинрибозид 330

Цитокинин с Rf 0.36 300

Цитокинин с Rf 0.44 300

Стандарты Бензиладенин (ВАЛ) 280

1-Фенил-1,2-этавдиол

2-(о-оксифенил)-этанол

2-(п-оксифенил)-этанол 175

* В качестве контроля использовали проростки АтагапЦшз саийаЬиБ без добавления цитокининов.

гидроксильные группы являются основными функциональными группами, определяющими химическую и биологическую активность фенольных соединений (Барабой, 1976), что также справедливо и для цитокининов пуриновой природы (Кулаева, 1973). Так, введение гидроксильной группы в мета - и особенно пара-положение у БАП приводило к снижению цитокининовой активности, а замещение в орто-положении к ее увеличению. Такую же роль в механизме действия 2-(п-оксифенил) -этанола может играть структура алифатического заместителя, которая также определяет уровень биологической активности у классических цитокининов (Кулаева. 1973; Муромцев и др. 1987; Мишке, 1988).

4. Влияние условий культивирования на биосинтез цитокининов пурпурной бактерией R. rubrum. Исследования цитокининов R. rubrum, выращенной фотогетеротрофно в режиме турбвдостата. показали наличие только зеатинрибозида ( Rf 0.52) в культуральной жидкости (табл. 5). В режиме хемостата с лимитированием среды выращивания

по лактату помимо зеатинрибозида был обнаружен 2-(п-оксифе-яил)-этанол (Rf 0.8) и соединение с Rf 0*.36. Однако у последнего, из-за небольшой концентрации, биологическую активность зафиксировать не удалось. В этих условиях роста цитокинины в биомассе обнаружены не были.

Таблица 5

Содержание цитокининов в культуральной жидкости и биомассе R. rubrum при различных условиях выращивания.

Условия роста 1 1 1 1 IПодвижность(Максимум 1 1 |Относительное i 1 (Активность

|цитокининов|поглощения|содержание |в биотесте

1 (Rf) 1 1 (нм) I 1 (o.e.) 1 ! I

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ Ж И л К 0 С Т Ь

ЮТогетеротрофные:| 1 1 1

турбидостат | 0.52 | 263 I 1.30 1 +

D = 0.08 ч"1 1 1 1 1 1

хемостат с лимит . | 0.36 | 260 I 0.48 1

по лактату | 0.52 1 263 i 1.00 1 +

D = 0.017 ч"1 | 0.80 | 278 | 1.00 1 +

Фотоавтотрофные: 1 1 1 1

турбидостат | О.Зб | 260 | 0.95 1 +

D = 0.012 ч"1 I 0.52 | 263 | 1.00 1 +

I 0.80 1 | 278 г | 1.60 i 1 + I

Б И 0 М А С С А

Фотоавтотрофные: ! 1 1 1

турбидостат I 0.44 | 260 | 1.1 1 +

D = 0.012 ч"1 | 0.52 1 | 263 1 | 0.5 i I + |

При выращивании бактерий в фотоавтотрофных условиях в режиме турбидостата цитокинины были обнаружены как в культуральной жидкости, так и в биомассе (табл. 5). В культуральной жидкости присутствовали зеатинрибозвд. 2-(п-оксифенил)-этанол и цитокинин с Кг 0.36. В биомассе помимо зеатинрибозида обнаруживался также цитокинин с 0.44. Таким образом, исследование относительного содержания цитокининов показало, что зеатинрибозид синтезировался

)

приблизительно в одноы и том же количестве во всех условиях выращивания, о чем судили по значению оптической плотности в полосе максимума поглощения УФ-спектра. Цитокинины пуринового ряда с Rf 0.36 и Rf 0.44 синтезировались в измеряемых количествах только при фотоавтотрофном росте культуры. При переходе от фотогетеротрофных условий роста к фотоавтотрофным, содержание 2-(п-оксифе-нил)-этанола постепенно увеличивалось, достигая своего максимума. Увеличение уровня биосинтеза цитокининов и их секреции в культу-ральную жидкость в условиях лимитирования по органическому субстрату позволяет, по-видимому, сделать вывод о роли цитокининов в качестве сигнальных веществ при их взаимодействии с другими организмами в природных условиях. Так, при недостатке органического соединения в среде обитания бактерии могут секретировать повышенное количество фитогормонов для инициации выброса органических соединений растениями, что и наблюдается у нефототрофных микроорганизмов (Green, 1980).

С целью выяснения возможной роли фитогормонов в регуляции внутриклеточных процессов в R. rubrum было исследовано влияние некоторых синтетических цитокининов на рост этой бактерии. Кине-тин и б-бензиламинопурин при концентрации 1-100 мМ не влияли на скорость роста и конечный выход биомассы R. rubrum. Это, по-види-мойу, объясняется наличием цитокининов в культуральной жидкости, синтезируемых самой бактерией. Однако эти данные не исключаеют возможности регуляции внутриклеточных процессов цитокининами у R. rubrum. Предпосылкой этого предположения может служить наличие в клетках фототрофа зеатинрибозида, который присутствуя в тРНК, принимает участие в регуляции биосинтеза белков (BJork, 1992).

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена способность к биосинтезу фитогормонов; а именно цитокининов. у фототрофной пурпурной несерной бактерии ИЬобоз-р1г111ит гиЬгит

2. В клетках и культуральной жидкости фототрофа найдены классические цитокинины пуринового ряда, один из которых идентифицирован как зеатинрибозид.

3. Выявлена цитокининовая активность у соединений, относящихся к классу простых фенолспиртов на примере экзометаболита R.

(

rubrum. идентифицированного как 2-(п-оксифенил)-этанол.

4. Показано, что биологическая активность 2-(п-оксифе-нил)-этанола зависит от положения гидроксильной группы в бензольном кольце и максимально проявляется при ее наличии в пара-положении.

5. Установлено, что уровень биосинтеза цитокининов и их секреция в культуральную жидкость увеличиваются при фотоавтотрофном росте культуры, что предполагает их возможную функцию в качестве сигнальных соединений при взаимодействии с другими организмами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Serdyuk О.Р., Smolygina L.D., Kobzar E.F and Gogotov I.N. Occurence of plant hormones In cells of the phototrophic purple bacterium Rhodosplrlllum rubrum 1R // FEMS Microbiology Letters, 1993, 109, p. 113-116.

2. Serdyuk O.P., Smolygina L.D., Laurlnavlchene T.Y. and Tsygankov A. A. Plant hormones of the phototrophic non-sulfur bacterium Rhodosplrlllum rubrum // Abstr. 9th congr., Brno, Czech Republic. Suppl to Blologla Plantarum. 1994, v 36. p. 35.

3. Smolygina L.D., Serdyuk 0.P.. Laurlnavlchene T.V. The influence of cultivation conditions of cytoklnlns by the purple non-sulfur bacterium Rhodosplrlllum rubrum // Abstr. 9th FESPP congr., Brno, Czech Republic. Suppl.to Blologla Plantarum, 1994, v 36, p. 37.

4. Serdyuk O.P., Smolygina L.D., Muzafarov E.N., Adanln V.M., Arlnbasarov M.U. 4-Hydroxyphenethyl alcohol - anew cytokl-nln-llke substance from the phototrophic purple bacterium Rhodosplrlllum rubrum 1R // FEBS Letters. 1995, 363, p. 10-12.

5. Сердюк O.P., Смолыгина Л.Д. Экзометаболиты с цитокинино-вой активностью, секретируемые фототрофной пурпурной бактерией Rhodosplrlllum rubrum // ДАН. 1995, т 345, N 1. с. 116-118.

6. Serdyuk 0., Smolygina L.. Rabaja N.. Adanin V., Muzafarov E. Exometabolltes with phytohormonal activities synthesized by phototrophic purple bacterium Rhodosplrlllum rubrum. //Abstr. 10th FESPP congr., 1996, Florence, Italy. PPB, 1996, spec. Issue, p. 199.

7. Ivanova E.. Serdyuk 0., Muzafarov E., Ivanov A., Smolygl-

na L. Shiklmate pathway of biosynthesis of an exometabollte with cytokinin activity from Rhodosplrlllum rubrum.// Abstr. 10th FESPP congr., 1996, Florence, Italy. PPB, 1996, spec. Issue, p. 198.

8. Serdyuk 0., Smolygina L., Ivanova E., Muzafarov E. Simple phenolic compound with cytoklnln-llke activity Isolated from pho-totrophic purple bacterium Rhodosplrlllum rubrum. //Polyphenols coirmunications 96, (Vercauteren J., Cheze C., Dumon M.C., Weber J.F., eds.), Bordeaux (France). 1996, v.1, p. 161-162.

Научное издание Автореферат Смолыгиной Л.Д.

Налоговая льгота-общероссийский классификатор продукции 0К-005-93,том 2; 953000 - книги,брошюры

22.04.97 г. Зак.7530Р. Тир.125 экз. Усл.печ.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТК ПНЦ РАН