Стрессовый ответ Hordeum vulgare в условиях космического полета

Шагимарданова, Елена Ильясовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стрессовый ответ Hordeum vulgare в условиях космического полета
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Стрессовый ответ Hordeum vulgare в условиях космического полета"

На правах рукописи УДК 577.29

ШАГИМАРДАНОВА ЕЛЕНА ИЛЬЯСОВНА

СТРЕССОВЫЙ ОТВЕТ HORDEUM VULGARE В УСЛОВИЯХ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА

03.01.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН ?ою

Казань-2010

004609074

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет".

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Доктор биологических наук, профессор Багаева Татьяна Вадимовна (КФУ, Казань)

Доктор биологических наук, в.н.с. Чернова Ольга Александровна (КИББ РАН, Казань)

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), (г. Москва)

Защита диссертации состоится 30 сентября 2010 г. в /4-30 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете, 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете

Автореферат разослан 25~аЯц>с/пеь 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Актуальность проблемы. Успехи в области культивирования высших растений на борту космических летательных аппаратов стали основой разработок по внедрению живых растительных организмов в качестве компонентов систем жизнеобеспечения (СЖО) космических кораблей. Биологические СЖО будут основаны на биолого-физико-химическом круговороте веществ, что обеспечит автономность и относительную •независимость от продолжительности космических миссий при освоении дальнего космоса. Для создания биологических СЖО необходима всесторонняя комплексная оценка реакций живых растений - будущих компонентов СЖО в условиях реального космического полета.

За последние 15 лет на борту орбитального комплекса (OK) «Мир» и на борту Международной космической станции (МКС) проведено более 20 экспериментов по изучению роста и развития высших растений. Показано, что при использовании технологии, позволяющей максимально обеспечить потребности исследуемых организмов при выращивании в космической •оранжерее, длительность цикла онтогенетического развития растений не зависит от условий космического полета. Морфологические и биометрические показатели высших растений в космическом полете не отличаются от таковых в наземных контрольных экспериментах. Однако, механизмы, лежащие в основе адаптации к столь нетипичной среде до сих пор неясны. Данные, полученные различными исследователями, варьируют. С одной стороны, они свидетельствуют об Изменениях морфологии организмов растений и их свойств, нарушении организации некоторых биологических молекул (Paul et al., 2005; Cai et al., 2007). С другой стороны, •многие исследователи заявляют о полном отсутствии изменений (Sychev et al., 2007; Zelenin et al., 2010). Таким образом, вопрос о стрессовом ответе растений и его природе в условиях космического полета остается открытым.

Целью работы явилось выяснение закономерностей экспрессии генов стрессового ответа ячменя Hordeum vulgare в условиях Международной

•Космической Станции (МКС) и исследование ДНК повреждающего действия открытого космоса на покоящиеся формы высших растений.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать транскриптом H.vulgare сорта Haruno Nijo в условиях выращивания растений на борту МКС.

2. Провести анализ экспрессии генов стрессового ответа H.vulgare сорта Haruno Nijo, выращенного на борту МКС в 2006 г.

3. Выявить уровень экспрессии генов стрессового ответа H.vulgare карликового сорта Akashinriki, после культивирования на борту МКС в 2008 г.

4. Выяснить воздействие открытого космоса на жизнеспособность покоящихся форм и стабильность генома растений.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в качественно новом уровне исследований геномного ответа растений на условия космического полета. Получены приоритетные данные об увеличении уровня транскрипции генов белков, участвующих в элиминации АФК из клеток растений ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo в условиях реального космического полета. Методами ДНК-микрочипов и биоинформатики впервые проведен системный анализ генов ячменя, экспрессия которых изменяется в ответ на условия космического полета. В ходе сходного эксперимента по культивированию карликового сорта Akashinriki показано отсутствие значимых изменений в экспрессии генов стрессового ответа. Впервые исследована выживаемость семян ячменя после экспозиции на внешней поверхности космической станции в условиях открытого космоса и показано отсутствие мутационных изменений в растениях первого поколения, полученных из этих семян. Полученные данные вносят вклад в понимание реакций живых организмов в ответ на условия космического полета.

развития окислительного стресса у растений на борту МКС. Отсутствие изменений в экспрессии генов стрессового ответа ячменя сорта Akashinriki делают его перспективным для дальнейшего использования в биологических .экспериментах в космосе, включая разработку систем жизнеобеспечения. Высокая выживаемость покоящихся семян ячменя и отсутствие наследуемых мутационных изменений в условиях длительного экспонирования в открытом космическом пространстве делают растения ^ ячменя потенциальными кандидатами в будущих полетах на дальние расстояния.

Положения, выносимые на защиту.

1. В условиях космического полета изменяется экспрессия более 1000 генов, вовлеченных в метаболизм аминокислот, ДНК репликацию, биосинтез белков, энергетический обмен, фотосинтез, транспорт, передачу сигналов и ответ на стресс у ячменя Я. vulgare.

2. Культивирование ячменя Я. vulgare сорта Нашпо Nijo на борту МКС в 2006 г. привело к усилению транскрипции генов, отвечающих за элиминацию активных форм кислорода (АФК) в клетках растений.

3. Культивирование растений ячменя Я. vulgare карликового сорта Akashinriki в 2008 г. не оказывало значительного влияния на экспрессию генов стрессового ответа.

4. Длительное экспонирование в условиях открытого космоса не вызывает генетических и фенотипических изменений растений при их долговременной экспозиции на стадии покоящихся семян.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 37-ой Международной научной конференции "Cospar"(Montreal, Canada, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), XII Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2008), XVII Международном симпозиуме "Humans in Space" (Moscow, 2009), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между

Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Kazan, 2009), XXIII Международной конференции «Японского общества биологических наук в космосе» (Тсукуба, Япония, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), конференциях НОЦ КГУ Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2008,2009), итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2009,203 0).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четырнадцать работ [1-14], в том числе две статьи в международных журналах [2, 4] и две статьи в российских журналах [1, 3]. Три работы удовлетворяют требованиям .ВАК [1-3].

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. зав. лабораторией "Биологические системы жизнеобеспечения человека" В.Н. Сычеву и д.б.н., с.н.с М.А. Левинских за предоставление возможности проведения экспериментов на борту МКС; к.б.н. O.A. Гусеву за постоянную помощь в проведении экспериментов; профессору М. Сугимото (Исследовательский институт биоресурсов, Курашики, Япония) за предоставление биологических материалов для исследования и научные консультации, космонавтам П.В. Виноградову, О.Д. Кононенко, Ф.Н. .Юрчихину, О.В. Котову, С. А. Волкову за превосходную работу на борту МКС, а также всему коллективу кафедры микробиологии КФУ.

Искреннюю признательность автор выражает научному руководителю профессору М.Р. Шариповой за внимательное отношение к работе и поддержку при написании диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 19 .рисунков. Библиография содержит 239 наименования российских и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Материалы и условия культивирования

В экспериментах использовали растения ячменя Hordeum vulgare L. двух сортов: Haruno Nijo и Akashinriki.

Семена ячменя Я vulgare сорта Haruno Nijo, размещенные в полиэтиленовом пакете, доставляли на PC МКС на борту грузового корабля «Прогресс-М56» 24 апреля 2006 г. После доставки на борт PC МКС укладка была размещена около оранжереи «Лада» в служебном модуле МКС. 31 августа 2006 года командир 13-й основной экспедиции на МКС П.В. •Виноградов посадил семена ячменя в корневой модуль оранжереи «Лада». Рост и развитие растений проходили при круглосуточном освещении, колебаниях температуры 22-27 °С и относительной влажности 40-60 %. Через 26 дней культивирования проростки срезали, помещали в раствор RNAlater RNA stabilization reagent (Qiagen, USA), предотвращающий деградацию мРНК в образцах, и спускали на Землю на борту транспортного корабля «Союз-ТМА-8», Через сутки после срезки растения доставляли в лабораторию на Земле и помещали в холодильник при -80 °С. Контрольные растения культивировали на Земле в аналогичных условиях температуры, •влажности и освещения.

Во втором эксперименте использовали семена ячменя Я. vulgare карликового сорта Akashinriki. Семена доставили на МКС на борту транспортного корабля «Союз ТМА-12» 08 апреля 2008 г. 24 июля 2008 г. борт-инженер 17-й основной экспедиции на МКС О.Д. Кононенко посадил семена ячменя в корневой модуль оранжереи «Лада». Рост и развитие растений проходили при круглосуточном освещении, колебаниях температуры 21-26 °С и относительной влажности 40-65 %. 25 августа 2008 г. проростки срезали и зафиксировали на борту МКС в холодильнике MELFI ■при -80 °С. Замороженные растения доставили на Землю на борту космического корабля «Спей Шаттл» 12 декабря 2008 г. В качестве контроля

использовали растения того же сорта Akashinriki, выращенные в лаборатории на Земле.

Экспонирование семян

Для исследования способности к выживанию в условиях открытого космоса семян растений использовали аппаратуру «Биориск-МСН» (рис. 7), которая представляет собой контейнер, содержащий 24 пластиковые чашки Петри диаметром 65 мм. В чашках размещали семена в хлопчатобумажных мешочках. На крышке каждой чашки имелись отверстия диаметром 10 мм, на которые наложен пористый фторлоновый фильтр, пропускающий воздух, но обеспечивающий стерильность образцов. 16 февраля 2007 г. было произведено снаряжение тест-объектами контейнеров аппаратуры «Биориск-МСН». Оборудование «Биориск-МСН» было доставлено на борт PC МКС 15 ■апреля 2007 г. на космическом корабле «Союз-ТМА-10». 06 июня 2007 г. во время внекорабельной деятельности (ВКД) российские космонавты Ф.Н. Юрчихин и О.В. Котов установили аппаратуру «Биориск-МСН» на внешней стороне МКС. Контейнеры были закреплены на специальной платформе, на внешней оболочке стыковочного узла «Пирс» (рис. 7). Перед закреплением у каждого контейнера открывалась крышка. Съем первого контейнера был осуществлен через 13 мес. - 15 июля 2008 г. космонавтами 17-ой основной экспедиции С.А. Волковым и О.Д. Кононенко. На Землю контейнер был спущен 24 октября 2008 г. Дальнейший анализ проводили в лаборатории на ■Земле.

Метод ДНК-микрочипов

Микрочипирование проводили с использованием ДНК-микрочипа Affymetrix, который содержит 23000 олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям генов ячменя, в соответствии со стандартным протоколом (www.affvmetrix.comV Полный профиль экспрессии расположен на http.7/proteogenornics.musc.edu/ma/uAnDB_download.php?u=%28owner%29 %20Shagimardanova&ín=AnaIysisDatá_BarIey.xls&p=uArrDB_2/Shagimardanov a/spacebarley/052107/AnalysisData_Barley.xls.

11ЦР-РВ

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили с использованием реакционной смеси SYBR premix Taq (Takara Bio, Япония) на амплификаторе LightCycler 2.0 (Roche Applied Science). Смесь для ПЦР-РВ, общим объемом 20 мкл, содержала 2 мкл одноцепочечной кДНК, 10 мкл SYBR premix Taq (Takara Bio, Japan) и 0,2 мкМ каждого праймера. ПЦР-РВ проводили при .следующих условиях: начальная денатурация при 95 °С, 10с, 40 циклов, включающих 20с при 95 °С и 20с при 60 °С. Оценивали уровень мРНК и количество копий генов в режиме относительных измерений (ДДСКметод) [Cantero et al., 2006]. Нормирование данных выполняли относительно гена а-тубулина. Для подтверждения уникальности обнаруженных продуктов амплификации, по окончании каждой реакции анализировали кривую плавления продукта ПЦР.

Праймеры подбирали с помощью програмного обеспечения LightCycler 4.0 Software (Roche Applied Science). Праймеры выбирали так, что они .соответствовали кодирующим областям генов.

Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов ресктрикции (ПДАФ)

ПДАФ проводили как описано Vos et al., 1995. Продукты амплификации разделялись с помощью денатурирующего ПААГ -электрофореза с использованием ExcelGel DNA Analysis Kit (GE Healthcare, Sweden) на Multiphor П Electrophoresis Unit (GE Healthcare, Sweden). Для визуализации фингерпринта использовали серебряный краситель PlusOne DNA Silver Staining kit (GE Healthcare, Sweden) согласно инструкции.

Математическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ LightCycler 4.0 Software (Roche Applied Science) путем расчета среднеквадратичного отклонения (о). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а<10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.

Результаты и их обсуждение 1. Особенности роста и экспрессии генов ячменя сорта Haruno Nijo в условиях космического полета

Более 90% семян сорта Haruno Nijo, отправленных на МКС в 2006 году, проросли через 3 дня после посадки и увлажнения корнеобитаемой среды, что указывает на сохранение высокой жизнеспособности семян этого сорта, несмотря на 4-х месячное нахождение на орбите. Рост и развитие растений ячменя в условиях космического полета (рис. 1) и на Земле не отличались. Прорастание семян в обоих случаях зарегистрировано на 3-й сутки после посадки. Высота побегов в космических и земных условиях достигала 50-60 см, кроющий лист открылся на 26 день. Таким образом, развитие растений ячменя в космосе проходило идентично развитию в нормальных земных условиях. Многие другие виды растений, с которыми проводились эксперименты по выращиванию в условиях невесомости в оранжерее «Лада», демонстрировали сходные результаты (Гостимский с соавт, 2007; Левине ких с соавт, 2005, Левинских, 2002).

Отсутствие регистрируемых фенотипических изменений говорит об эффективной адаптации растительных организмов к условиям космческого полета. С целью выяснения механизмов адаптации провели анализ полного транскриптома растений ячменя с использованием ДНК-микрочипов. Обнаружено более 1000 генов, экспрессия которых изменилась более чем в два раза в условиях МКС. С учетом вовлечения каждого гена в определенный

биологический процесс они были подразделены на Рис. 1. Рост ячменя Я. vulgare

сорта Нашпо Nijo в оранжерее 8 групп: гены, участвующие в метаболизме ■ «Лада» на борту МКС.

аминокислот, ДНК репликации, биосинтезе и созревании белков, энергетическом обмене, фотосинтезе, транспорте, передаче сигналов и ответе на стресс. Причем, значительно снижалась

транскрипция генов белков, вовлеченных в процесс фотосинтеза. Среди них, гены хлорофилл-связывающих белков, компонентов фотосистемы I и фотосистемы П, гены хлорофиллсинтазы и хлорофиллредуктазы. Кроме того, •уменьшалось количество транскриптов генов белков, связанных с переносом электронов, а именно цитохромов, ферредоксинов, ферредоксиноксидоредуктаз, рибулозобисфосфаткарбоксилазы. Полученное уменьшение экспрессии генов белков, участвующих в фотосинтезе коррелирует с результатами экспериментов по выращиванию арабидопсиса в условиях космического полета на космическом корабле "Columbia" в 1999г., в которых было показано значительное уменьшение экспрессии генов фотосистемы II (Paul et al., 2005). В нашем эксперименте обнаружено накопление транскриптов генов факторов сплайсинга, пептидазы, ■участвующей в процессинге митохондриальных белков-предшественников, факторов элонгации трансляции. Напротив, в растениях арабидопсиса описано понижение экспрессии потенциального гена фактора элонгации пептидов eF-1 (Paul et al., 2005). Наблюдаемое изменение экспрессии генов белков, участвующих в передаче сигналов, также согласуется с данными литературы. В растениях арабидопсиса показано уменьшение синтеза мРНК факторов транскрипции, включая белки, регулируемые этиленом, а также белки, вовлеченные в процессы старения. При этом в растениях индуцировалась транскрипция генов, вовлеченных в передачу сигналов при •помощи ионов Са2У (Paul et al., 2005).

В нашей работе обнаружено значительное накопление транскриптов белков стрессового ответа. Среди них выделили три группы генов, а именно гены белков теплового шока (БТШ), гены белков, нейтрализующих активные формы кислорода (АФК) и гены патогенез-связанных (PR - от англ. Pathogenesis Related) белков.

Для корректного и точного исследования изменений в уровне экспрессии генов провели анализ транскрипции с помощью ПЦР в реальном времени. В ячмене сорта Haruno Nijo, культивировавшемся на борту МКС, при анализе

методом ПЦР-РВ не выявили увеличенной экспрессии генов БТШ: hsp 17, hspl8 и hsp 26. Такие же результаты получены относительно растений, подвергшихся действию солевого стресса. Напротив, после воздействия повышенных температур биосинтез мРНК этих генов увеличился в сотни раз (рис. 2).

tap17 hsp18 hsp2S

U .«SO .

Ii - i ■ i - ■ л

l» г I I I

s ■« H H ™ В

■ "II

°i::____________I ________1_____ —■ -

1234 1234 1234

Рис. 2. Изменение уровня мРНК генов, кодирующих низкомолекулярные БТШ при различных условиях стресса по сравнению с уровнем мРНК при нормальных земных условиях роста ячменя Я. vulgare сорта Haruno Nijo. ¡-Контроль, 2 - Космическая среда, 3 -Тепловой шок, 4 - Солевой стресс. Hsp 17 — белок теплового шока 17, Hsp 18 - белок теплового шока 18, Hsp26 - белок теплового шока 26

Таким образом, показано, что космический полет не влияет на биосинтез малых БТШ в ячмене. Ранее показано, что гены, кодирующие некоторые БТШ, индуцируются в культуре клеток животных (Hammond et al., 2000) и растениях 'А. thaliana (Paul et al., 2005) в условиях космического полета. Анализ методом ПЦР-РВ позволил выявить индукцию 11 генов БИЛ в растениях арабидопсиса после полета на космическом корабле «Columbia» (Paul et al, 2005). ...

Существуют работы, подтверждающие изменение профиля экспрессии генов БТШ в условиях искусственной гипогравитации (Martzivanou et al., 2003). В экспериментах с использованием одноклеточной системы - семени папоротника, методом ДНК-микрочипов получен эффект как индукции, так и репрессии генов БТШ. Авторы предположили, что наблюдаемые изменения в экспрессии могут указывать на возможную роль БТШ в восприятии гравитационного сигнала (Saimi et al., 2008).

Белки Hsp70 и Hsp90 выполняют ряд важных функций, как при развитии растений в нормальных условиях, так и в стрессовых ситуациях (Väsquez-Robinet et al., 2010). В наших экспериментах при воздействии всех трех видов стресса (космический полет, тепловой шок, солевой стресс) уровень экспрессии этих генов увеличился. Причем, минимальное увеличение наблюдалось в случае

космического стресса (рис. 3) Обнаруженное накопление транскриптов генов hsp70 и hsp90, скорее всего, не является результатом специфического ответа на влияние факторов космического полета, а указывает на наличие общего стрессового состояния организма и мобилизацию его внутренних ресурсов. Ранее показано накопление стрессового белка Hsp72 в тканях золотой рыбки в

условиях космического полета

hspTO hsp9C

'5 (Ohnisi et al., 1998).

| j ^ И Расхождение полученных данных

_ _ _ _

и данных литературы может быть объяснено использованием

Jjl'JJIL

Рис. 3. Изменение уровня мРНК генов, разного оборудования и, кодирующих белки теплового шока hsp70 и hsp90

по сравнению с уровнем мРНК при нормальных соответственно, различии в

земных условиях роста ячменя Я vulgare сорта сдо№ях и продолжительности Haruno Nijo. 1-Контроль, 2 - Космическая среда, 3 - Тепловой шок, 4 - Солевой стресс. культивирования.

Количество PR-белков увеличивается в растениях в ответ на атаку патогенов. В последние годы стали появляться доказательства того, что белки этого семейства также участвуют в ответе на различные виды стресса, в частности, на присутствие тяжелых металлов, повышение концентрации Сахаров в среде, засуху (Yun et al., 1999; Pääkkönen et al., 1998). В нашем исследовании не выявлено индукции экспрессии генов PR-белков в условиях космического полета, за исключением гена PR2 (рис. 4). PR2 белок относится к ß-1,3-эндоглюканазам, катализирующим гидролитическое расщепление ß-1,3-глюканов, представленных в клеточных стенках многих грибов (Rop et al., 2009). Показано, что экспрессия гена PR2 индуцируется некоторыми видами стресса абиотической природы, в т.ч. повышенными концентрациями озона в среде (Eckey-Kaltenbach et al., 1992, Grimmig, 2003 Thalmair et al., 1996). Возможно, усиление транскрипции гена PR2 ячменя сорта Haruno Nijo связано с индукцией окислительного стресса на борту МКС.

Показано значительное увеличение количества мРНК PÄ-генов при повышении концентрации соли в среде, что может указывать на их участие в

регуляция ответов на солевой или осмотический стрессы, связанные с оттоком воды из клеток (рис. 4). Недавно, индукция генов PR-белков PR3, PR4 и PR5 была обнаружена в растениях A. thalicma под воздействием солевого стресса ■(Seo et al, 2008).

Следует отметить, что исследования экспрессии генов в растениях, культивировавшихся в условиях космического полета, как длительного, так и кратковременного, никогда не затрагивали анализа группы PR-белков. Таким образом, полученные данные являются приоритетными в мировой науке.

i¿ х

cu s

а 3 X

2 3

ИВ

■ > I

Uli

И И Я И

IUI

Рис. 4. Изменение уровня мРНК генов, кодирующих патогенез-связанные белки (PR1-PRI3), при различных условиях стресса (космическая среда, тепловой шок, солевой Gtpecc) по сравнению с уровнем мРНК при земных условиях (Контроль) роста ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo. 1-Контроль, 2 - Космическая среда, 3 -Тепловой шок, 4 - Солевой стресс.

Неотъемлемой частью космических полетов является воздействие повышенных доз радиации на живые организмы. Одним из наиболее опасных воздействий радиации является продукция АФК, включая супероксиданион 02", гидроксил радикал'ОН и пероксид водорода Н202. (Fang et al., 1991). Такое накопление АФК может вызывать разрывы ДНК, инактивацию некоторых ферментов, перекисное окисление липидов. Накопление АФК в

клетках растений приводит к мобилизации защитных сил организма путем повышения синтеза белков, способных инактивировать АФК.

В листьях ячменя, который культивировался на борту МКС, мы обнаружили повышенный уровень транскрипции генов, кодирующих основные белковые компоненты системы антиоксидантной защиты клеток. Уровень мРНК гена супероксиддисмутазы (sod) был в 6 раз выше в космической среде по сравнению с земными условиями. Экспрессия гена глутамшттрансферазы (gst) увеличилась в космосе в 24 раза. Транскрипция гена каталазы (cat) увеличилась в 18 раз, гена аскорбатпероксидазы (арх) в 3 раза в космических условиях по сравнению с земным контролем. Даже солевой стресс, как известный индуктор увеличения биосинтеза антиоксидантных ферментов, привел к значительно меньшему накоплению этих транскриптов (рис. 5). Ранее показано, что продукция АФК и активность ферментов-антиоксидантов увеличивается в условиях искусственной микрогравитации в клиностате (Li et al, 2004).

а. s

p. «

cat

Рис. 5. Изменение уровня мРНК генов, кодирующих белки, нейтрализующие АФК, при различных условиях стресса по сравнению с уровнем мРНК при нормальных земных условиях (Контроль) роста ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo. 1-Контроль, 2 - Космическая среда, 3 - Тепловой шок, 4 - Солевой стресс, gst - ген глутамилтрансферазы, sod - ген супероксиддисмутазы, cat ~ ген каталазы, арх - ген 4 аскорбатпероксидазы.

Вероятность наличия окислительного стресса на борту космических летательных аппаратов неоднократно высказывалась многими исследователями (Ногпеск б. 1992). В нашем исследовании впервые показано увеличение

транскрипции генов белков, участвующих в элиминации АФК из клеток растений в условиях реального космического полета. Это может служить косвенным доказательством наличия факторов, вызывающих окислительный стресс у растений на борту МКС. Вопрос о природе этого компонента космического полета остается открытым. Наиболее вероятной причиной является космическая радиация и микрогравитация. Также, следует отметить, что космическая станция является закрытой системой с постоянно меняющимся газовым составом среды, коррелирующим с частотой пристыковок транспортных и грузовых кораблей к МКС. Полученные данные вносят вклад в понимание реакций живых организмов в ответ на космический стресс

Таким образом, результаты, представленные в работе, выявили изменение экспрессии части генов ячменя сорта Haruno Nijo в ответ на факторы космического полета.

II. Закономерности экспрессии генов ячменя сорта Akashinriki в условиях космического полета

В 2008 году мы проводили эксперимент по выращиванию ячменя Н. vulgare карликового сорта Akashinriki в оранжерее «Лада» на борту PC МКС. Растения культивировали в оранжерее в течение 32-х суток. Высота ячменя достигала 30 см, как в случае полетных растений, так и в контрольном варианте. Количество биомассы экспериментальных и контрольных растений было сопоставимо. Никаких видимых отличий растений, выращенных в невесомости и на Земле, обнаружено не было. Таким образом, эксперимент 2008 года подтверждает ранее полученные данные об отсутствии влияния факторов космического полета на рост и развитие ячменя Я. vulgare.

Растения ячменя были заморожены при -80 °С непосредственно после их срезки на борту МКС. Транспортировка на Землю также осуществлялась при -80 "С на борту КК «Спейс Шаттл». Благодаря этому, в данном эксперименте удалось устранить факторы, которые потенциально влияли на результаты исследований при анализе экспрессии генов. К ним, в первую очередь, относятся

прижизненные изменения после извлечения растений из оранжереи, а также перегрузки при приземлении, длительность транспортировки. Улучшение технической оснащенности позволило исследовать реакцию растений на условия культивирования на борту РС МКС. Был проведен анализ экспрессии генов стрессового ответа методом ПЦР-РВ. Количество транскриптов генов теплового шока не изменялось по сравнению с контрольными растениями (рис. 6а). Условия космического полета не оказали влияния на транскрипцию генов большинства РК-белков (рис. 66). Как и в эксперименте с использованием в качестве тест-объекта растений ячменя сорта Нагшй Муо, экспрессия гена РК2 была увеличена в ячмене сорта АкавЫппЫ в условиях МКС. Учитывая тот факт, что в ячмене сорта АкавЫппИ не обнаружено индукции белков-антиоксидантов, можно предположить, что ген РЯ2 индуцируется условиями космического полета. С другой стороны, ген РК2 относится к группе индуцибельных генов и повышение уровня экспрессии только в 13 раз не является значительным. Среди белков, нейтрализующих активные формы кислорода, наблюдалось только увеличение экспрессии гена gst в 3 раза по сравнению с контролем (рис. 6в). В предыдущем эксперименте уровень транскрипции gst увеличивался в 24 раза в ответ на условия космического полета (рис. 5). При анализе экспрессии генов супероксидцисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы не получено статистически достовеоных отличий опытных и контрольных растений (рис бв).

3 а ,5' б

.от сжлгж ои

о hsp!7 hsplS hsp26 tisp70 hsp90

PRla PRlb PR2 PR3 PR5 PR10 PR13

Рис. 6. Изменение уровня мРНК генов белков теплового шока (а), генов патогенез-связанных белков (б), генов белков, нейтрализующих активные формы кислорода (в) условиях космического полета (серые столбцы) по сравнению с уровнем мРНК при нормальньге земных условиях роста (белые столбцы) ячменя Я vulgare сорта Akasßinrikü

gst sod cat

арх 1?

Результаты данного эксперимента можно рассматривать, как впервые полученные данные по оценке реального состояния организма растений ячменя, выращенных в космической оранжерее на борту орбитальной станции.

Наши результаты согласуются с данными, полученными Stutte et al (2006). Среди 820 генов растений карликовой пшеницы, культивировавшейся на борту МКС в 2002 г. в оранжерее «Biomass production system» не было обнаружено ■дифференциальной экспрессии определенного гена или группы генов. Таким образом, условия космического полета, а также специфические условия замкнутого гермообъема, не вызывали увеличения экспрессии генов стрессового ответа у растений ячменя сорта Akashinriki, Эти результаты показывают, что условия космического полета и, в частности, отсутствие гравитационного стимула не являются стрессовыми факторами для растительного организма в случае обеспечения его всем необходимым для роста и развития. III. ДНК-повреждающее действие факторов открытого космического пространства на покоящиеся формы высших растений

Для определения границ выживаемости и установления мутагенного эффекта факторов открытого космического пространства проводили эксперимент «Биориск». В рамках эксперимента семена растений ячменя и риса подвергали экспозиции в течение 13 месяцев на внешней поверхности PC МКС в аппаратуре «Биориск-МСН» (рис. 7).

Рис. 7. Аппаратура «Биориск-МСН» и ее расположение (указано стрелкой) на стыковочном узле «Пирс».

Показано, что семена высших растений сохранили

жизнеспособность после 13 мес. экспозиции в космическом пространстве. Всхожесть семян составила 82% (41/50) для семян ячменя Haruno Nijo и 98% (49/50) для семян ячменя Akashinriki. 41 растение Haruno Nijo и 49 растений Akashinriki развивались нормально и не имели отклонений

в морфологических и физиологических свойствах растений в сравнении с растениями, выросшими из контрольных семян (рис, 8).

Всхожесть семян риса составляла 44 % (22/50) для сорта риса SAS и 44% (23/50) для сорта KAS. Однако только 9 проросших семян сорта SAS оказались жизнеспособны и в дальнейшем развились в нормальные растения, все остальные проростки погибли, как и все проросшие семена сорта KAS. При сравнительном анализе выживших растений риса, как и в случае с ячменем, статистически

Рис. 8. Растения ячменя сорта Достоверных отклонений в морфологических и

Нагцпо Nijo первого поколения физиологических свойствах растений из из семян, экспонированных в

условиях открытого космоса в космического эксперимента и контроля течение 13ти месяцев (слева) и

контрольные растения (справа), обнаружено не было.

Подход, при котором оценивается прорастание семян, экспонировавшихся в открытом космосе, выживаемость изменение морфологии проростков не применим для определения потенциальных механизмов повреждения. Для выявления ДНК-повреждающего действия космического пространства, мы провели оценку мутационных изменений методом ПДАФ. Данный подход позволяет одновременно проводить анализ большого числа генетических локусов в одном эксперименте и обеспечивает высокую стабильность и воспроизводимость характера распределения полос в ПААГ геле. 16 различных пар праймеров использовали для анализа полиморфизма у растений ячменя и 8 пар праймеров для анализа полиморфизма растений риса. В общем около 140 полос было получено для растений ячменя (рис. 9) и 135 для растений риса (рис. 10), ни одна из которых не выявила полиморфизма между экспонированными в космосе и контрольными вариантами растений.

М 1 2 3 4 1234 12341234 123412341234 1234М

I ' 1^111111111

вттщ

ЙЙ *

% «¡ИйШ да

а бвгдежз

м .1 23_4__и_3.1 .1 2 3 4 1.214 1 2 3 4 1 ¿34^1 2 3 4 1 2 3 4 М

— в*

"III 111111111И1||111а ¿«11111^« -

■ г-«»* •: * -

11111111л

... ' ' ' ■" ¡йж. ' '

Рис. 9. Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) растений первого поколения из семян ячменя, экспонировавшихся на внешней поверхности МКС в аппаратуре «Биориск» в условиях открытого космического пространства, «а-р» различные пары праймеров, используемые для амплификации. 1- ДНК контрольного «земного» растения, 2-4 - ДНК «космических растений», М - маркеры.

Полученные данные подтверждают, что условия космического пространства не оказывают генотоксического эффекта и не вызывают ДНК мутаций в сухих семенах ячменя и риса.

Таким образом, можно заключить, что летальный эффект космического пространства на некоторые семена объясняется не накоплением мутаций в геноме, а критическим действием температуры, вызванной солнечным излучением. Среди выживших семян, наследуемых мутаций не обнаружено.

Анализируя условия экспонирования на внешней стороне РС МКС в данном эксперименте, следует констатировать, что нагрев контейнеров во время экспозиции был высок. На основании косвенных данных можно предположить, что нагрев пластиковых чашек достигал 95 "С, т.к. именно при этой температуре в модельном эксперименте отмечена их деформация

(Новикова с соавт., 2009), имеющая место в нашем эксперименте. В вакууме передача тепла осуществляется при контакте материалов, которые обладают различной теплопроводностью. В данном случае можно предположить, что пакеты из хлопчатобумажной ткани оказались хорошим теплоизолятором и нагрев тест-объектов, находящихся внутри пакетов, не был столь высоким. В работе показано, что семена ячменя способны сохранять высокую жизнеспособность после 13ти месяцев экспонирования на внешней поверхности МКС, несмотря на избыточную температуру и другие факторы космического пространства. Этот показатель для семян риса был значительно ниже, однако выжившие семена прорастали и давали растения по генетическим и морфологическим свойствам не отличающиеся от контрольных растений.

м i 2 3 4 5 6 7 8 9 10 123456789 10 123456789 10 123456789 юм " ------ ;

. С.йй-.!-,' С. яв. ...... -л-:........... >...........-А -С-; • _ ***

- - — - -- 'Л.

..." 54 ......__________ __________ __________

Г 2 5 л«» -ч*.

а;

авзяв^1^' . л..

а 6 в г

м123456789 10 12 3456739 10 123456789 10 123456789 юм

~ К 3 в»»" * я **<Щ # к & Щ « Щ » а # - « : - ^ 21 ® 515 2 3 - 5 ^ -

»**< Мб «в -V сг Ы*-^ Д. -у- V«- »V «и

- : ... ; — — . • _ ** да^жг^ 48» л -Игр;?*: Щ Цм щ м Ц*

. " ■у»' • ¡¡л»

,..... • • ' ^ *

Щ •> ■- - 1 г" '■■

' в* ц & г $ • : 32 г:

* «в* ** г.. .Яг ., .......- _ .: ■• .»х.

в <!•'"< «Ля ■

д е ж з

Рис. 10. Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) растений первого поколения из семян риса после экспозиции на внешней поверхности МКС в аппаратуре «Биориск» в условиях открытого космического пространства, «а-з» различные пары праймеров. используемые для амплификации. 1- ДНК контрольного «земного» растения, 2-9 - ДНК «космических растений», М - маркеры.

Таким образом, показано, что культивирование растений ячменя на борту МКС вызывает изменение экспрессии многих генов. В ячмене сорта Haruno Nijo показано значительное увеличение транскрипции генов, элиминирующих АФК из клеток. По-ввдимому, включаются защитные механизмы от воздействия факторов, сопутствующих космическому полету, в частности радиации и газовому составу замкнутого объема орбитальной станции. В растениях ячменя сорта Akashinriki накопления транскриптов генов-антиоксидантов, как и других генов стрессового ответа не обнаружено. Таким образом, данный сорт может быть рекомендован для дальнейшего использования в оранжереях на борту летательных аппаратов. Длительное экспонирование семян ячменя на внешней поверхности PC МКС не привело к накоплению мутационных изменений ' И значительному снижению жизнеспособности потомства первого поколения. У растений риса не обнаружено полиморфизма, однако жизнеспособность растений снижена более чем в два раза. Таким образом, согласно полученным нами данным, растения ячменя являются перспективными и обладают потенциалом использования в качестве компонентов жизнеобеспечения для полетов на дальние расстояния.

ВЫВОДЫ

1. Растения ячменя Н. vulgare не подвержены фенотипическим изменениям при культивировании на борту МКС. Установлено, что у них модулируется экспрессия более 1000 генов, вовлеченных в метаболизм аминокислот, ДНК репликацию, биосинтез и созревание белков, энергетический обмен, фотосинтез, транспорт, передачу сигналов и ответ на стресс.

2. Условия космического полета на борту МКС в 2006 году привели к индукции транскрипции генов ферментов-антиоксидантов: глутамилтрансферазы, супероксидцисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы - в 24, 6, 18 и 3 раза, соответственно в растениях ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo.

3. Экспрессия генов стрессового ответа ячменя Н. vulgare карликового сорта Akashinriki значимо не изменяется в ответ на воздействие факторов окружающей среды на МКС в 2008 г. •4. 13-ти месячное экспонирование покоящихся форм растений в условиях открытого космического пространства не приводит к изменению фенотипа растений и не влияет на степень полиморфизма ДНК. 5. Ячмень Я. vulgare является высокоперспективным для использования на борту космических летательных аппаратов в качестве компонента систем жизнеобеспечения.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Шагимарданова Е.И. Анализ экспрессии генов стрессового ответа ячменя Hordeum vulgare в условиях космического полета / Е.И. Шагимарданова, О.А. Гусев, В.Н. Сычев, М.А. Левинских, М.Р. Шарипова, О.Н. Ильинская, Г. Бингхэм, М. Сугимото // Молекулярная Биология. - 2010. - Т. 44 (5). - С. 1-9.

2. Shagimardanova E.I. Oxidative stress and antioxidant capacity in barley grown under space environment / E.I. Shagimardanova, O.A. Gusev, G. Bingham, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev, Z. Tiansu, M. Kihara, K. Ito, M. Sugimoto // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. - 2010. - V. 74 (7).-P. 1479-1482.

3. Шагимарданова Е.И. Экспрессия генов стрессового ответа ячменя Hordeum vulgare выросшего на борту международной космической станции / Е.И. Шагимарданова, О.А. Гусев, В.Н. Сычев, М.А. Левинских, М.Р. Шарипова, М. Сугимото // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия «Естественные науки».-2010.-Т. 152(1).-С. 166-173.

4. Sugimoto М. Gene expression of barley grown in space. M. Sugimoto, E.I. Shagimardanova, O.A. Gusev, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev, A.V. Grigoriev // Space Utilization Research. - 2008. - V. 24. - P. 412-414.

5. Shagimardanova E.I. Expression of stress/defense-related genes in barley grown under space environment / E.I. Shagimardanova, O.A. Gusev, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev, M. Sugimoto //14th international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine". Abstract book. -Kazan. - Russia. - 2009. - P. 116-117.

6. Шагимарданова Е.И. Протеом ячменя Hordeum vulgare в условиях космического полета на МКС / Е.И. Шагимарданова, О.А. Гусев, В.Н. Сычев, М.А. Левинских, М.Р, Шарипова, М. Сугимото // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Сборник тезисов. - Казань. - Россия. -2009.-С. 113

7. . Shagimardanova E.I. Space environment in international space station is not stressful for barley. E.I. Shagimardanova, O.A. Gusev, G. Bingham, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev, I. Podolsky, M. Sugimoto // 17th IAA Human in Space Symposium. Abstract book. - Moscow. - Russia. - 2009. -P. 114-115.

8. Шагимарданова Е.И. Влияние открытого космического пространства на выживаемость семян ячменя / Е.И. Шагимарданова, О.А. Гусев, В.Н. Сычев, М.А. Левинских, М. Сугимото, М.Р. Шарипова / IX Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". Сбоник тезисов. - Казань. -Россия.-2009.-С. 94.

9. Шагимарданова Е.И.' Экспрессия генов белков-антиоксидантов ячменя Hordeum vulgare под воздействием солевого стресса / Е.И. Шагимарданова, М. Сугимото, О.А. Гусев, М.Р. Шарипова // XXII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биолошя наука XXI века». Сборник тезисов. - Пущино. - Россия. -2008.-С. 61-62.

10. Шагимарданова Е.И. Экспрессия генов теплового шока ячменя Hordeum vulgare в условиях роста на международной космической станции / Е.И. Шагимарданова, М. Сугимото, О.А. Гусев, В.Н. Сычев, М.А. Левинских, М.Р. Шарипова // II Международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Сборник тезисов. - Казань. - Россия. - 2008. - С. 144145.

11. Шагимарданова Е.И. Экспрессия hsps - генов ячменя Hordeum vulgare под воздействием солевого стресса / Е.И. Шагимарданова, М. Сугимото, О.А. Гусев, М.Р. Шарипова //Конференция НОЦ КГУ Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века». Сборник тезисов. - Казань. - Россия. - 2008. - С. 96.

12 Sugimoto М. Expression of stress/defense-related genes in barley grown under space environment. M. Sugimoto, E.I. Shagimardanova, O.A. Gusev, G. Bingham, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev // 37th COSPAR Scientific Assembly. Abstract book - Montreal. - Canada. - 2008. - P. 46.

13. Sugimoto M. Growth and stress on barley in space environment / M. Sugimoto, E.I. Shagimardanova, O.A, Gusev, G. Bingham, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev It 22th Annual meeting of Japanese Society for Biological Science in Space. Abstract book. - Nara. - Japan. - 2008. - P. 78-79.

14. Shagimardanova E.I. Expression of stress/defense-related genes in barley grown under space environment / E.I. Shagimardanova, M. Sugimoto, O.A. Gusev, G. Bingham, M.A. Levinskikh, V.N. Sychev // 114th Annual Meeting of Japanese Society of Breeding. Abstract book. - Shiga. - Japan. - 2008. -P. 112.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД №-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать10.08.2010 г. Печ.л.1,5 Заказ № К-6912. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шагимарданова, Елена Ильясовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Влияние факторов космического полета на организмы высших растений.

1. Биологические эффекты условий космического полета на покоящиеся формы растений.

2. Действие факторов космоса на вегетирующие формы растений

2.1. Исследование процессов прорастания, роста и развития в .условиях космического полета.

2.2. Изучение процесса клеточного деления в условиях космического полета.

2.3. Исследование физиолого-биохимических процессов живых организмов в космосе.

2.4. Исследование стабильности генома после экспозиции организмов в космосе.

II. Основы молекулярного ответа растений на стрессовые условия окружающей среды.

2. Белки теплового шока.

1.1. Белки теплового шока 60.

1.1. Белки теплового шока 70.

1.3. Белки теплового шока 90.

1.4. Белки теплового шока 100.

1.5. Низкомолекулярные Белки теплового шока.

2. Патогенез-связанные белки.

2.1. Общая характеристика и основы классификации.

2.1.1. Семейство РШ -белков.

2.1.2. Семейство РЫ2.

2.1.3. Другие PR- белки.

3. Белки, нейтрализующие активные формы кислорода.

3.1. Основы механизмов элиминации АФК из клеток.

3.2. Супероксиддисмутаза.

3.3. Каталаза.

3.4. Пероксидазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стрессовый ответ Hordeum vulgare в условиях космического полета"

•Актуальность проблемы. Успехи в области культивирования высших растений на борту космических летательных аппаратов стали основой разработок по внедрению живых растительных организмов в качестве компонентов Систем жизнеобеспечения (СЖО) космических кораблей. Биологические СЖО будут основаны на биолого-физико-химическом круговороте веществ, что обеспечит автономность и относительную независимость от продолжительности космических миссий при освоении дальнего космоса. Для создания биологических СЖО необходима всесторонняя комплексная оценка реакций живых растений - будущих 'компонентов СЖО в условиях реального космического полета.

За последние 15 лет на борту орбитального комплекса (OK) «Мир» и на борту Международной космической станции (МКС) проведено более 20 экспериментов по изучению роста и развития высших растений. Показано, что при использовании технологии, позволяющей максимально обеспечить потребности исследуемых организмов при выращивании в космической оранжерее, длительность цикла онтогенетического развития растений не зависит от условий космического полета. Морфологические и биометрические показатели высших растений в космическом полете не •отличаются от таковых в наземных контрольных экспериментах. Однако, механизмы, лежащие в основе адаптации к столь нетипичной среде до сих пор неясны. Данные, полученные различными исследователями, варьируют. С одной стороны, они свидетельствуют об изменениях морфологии организмов растений и их свойств, нарушении организации некоторых биологических молекул (Paul et al., 2005; Cai et al., 2007). С другой стороны, многие исследователи заявляют о полном отсутствии изменений (Sychev et al., 2007; Zelenin et al., 2010). Таким образом, вопрос о стрессовом ответе растений и его природе в условиях космического полета остается открытым.

Целью работы явилось выяснение закономерностей экспрессии генов стрессового ответа ячменя Hordeum vulgare в условиях Международной 7

Космической Станции (МКС) и исследование ДНК повреждающего действия открытого космоса на покоящиеся формы высших растений. В работе решались следующие задачи:

1. Исследовать транскриптом H.vulgare сорта Haruno Nijo в условиях выращивания растений на борту МКС.

2. Провести анализ экспрессии генов стрессового ответа H.vulgare сорта Haruno Nijo, выращенного на борту МКС в 2006 г.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в качественно новом уровне исследований геномного ответа растений на условия космического полета. Получены приоритетные данные об увеличении уровня транскрипции генов белков, участвующих в элиминации активных форм кислорода АФК из клеток растений ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo в условиях реального космического полета. Методами ДНК-микрочипов и биоинформатики впервые проведен системный анализ генов, экспрессия которых изменяется в ответ на условия космического полета. В ходе сходного эксперимента по культивированию карликового сорта Akashinriki показано отсутствие значимых изменений в экспрессии генов стрессового ответа. Впервые исследована выживаемость семян ячменя и риса после 'длительной экспозиции на внешней поверхности космической станции в условиях открытого космоса и показано отсутствие мутационных изменений в растениях первого поколения, полученных из этих семян. Полученные данные вносят вклад в понимание реакций живых организмов в ответ на условия космического полета.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования являются основой для практического выращивания высших растений на борту космических кораблей. Получены приоритетные данные об индукции 8 развития окислительного стресса у растений на борту МКС. Отсутствие изменений в экспрессии генов стрессового ответа ячменя сорта Akashinriki делают его перспективным для дальнейшего использования в биологических экспериментах в космосе, включая разработку систем жизнеобеспечения. Высокая выживаемость покоящихся семян ячменя и отсутствие наследуемых мутационных изменений в условиях длительного экспонирования в открытом космическом пространстве делают растения ячменя потенциальными кандидатами в будущих полетах на дальние расстояния. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 37-ой Международной научной конференции "Cospar"(Montreal, Canada, 2008), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), XII Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2008), XVII Международном симпозиуме "Humans in Space" (Moscow, 2009), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Kazan, 2009), XXIII Международной конференции «Японского общества биологических наук в космосе» (Тсукуба, ~ Япония, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), конференциях НОЦ КГУ Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2008, 2009), итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2009, 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Влияние факторов космического полета на организмы высших растений

Фундаментальным вопросом ранней космической биологии был вопрос о способности растений к нормальному росту и развитию в условиях космического полета. С развитием космических технологий множество видов растений было выращено на космических станциях, семена этих растений экспонировались в космическом пространстве на биоспутниках (Souza et al., 2010). Некоторые виды растений, такие как Arabidopsis thaliana, Brassica rapa, Triticum aestivum и Pisum sativum культивировали на космических 'станциях в течении полного цикла онтогенеза от семени до семени (Merkys et al., 1983, Levinskikh et al., 2000; Musgrave and Kuang, 2003; Sychev et al., 2007). Первоначально очевидными факторами космического полета, которые отличаются от условий на Земле, были микрогравитация и космическая радиация. Считается, что микрогравитация оказывает непосредственное влияние на тропизмы у растений, однако до сих пор нет доказательств, что отсутствие земной гравитации влияет на метаболизм растений (Stutte et al., 2006). Побочные эффекты микрогравитации, такие как пониженная циркуляция воздуха, могут повлиять на рост растений (Musgrave and Kuang, '2003). Множество ранних работ на орбите показали строгую необходимость контроля окружающей микросреды, включая температуру, влажность, освещение, доставку питательных веществ и состав воздуха (Stankovic, 2001). Успешные эксперименты по культивированию высших растений на борту космических кораблей показали, что если устранить непрямые эффекты микрогравитации и закрытой микросреды, то микросреда орбитального полета не оказывает вредного влияния на рост, развитие и формирование жизнеспособных спор у высших растений.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шагимарданова, Елена Ильясовна

выводы

2. Условия космического полета на борту МКС в 2006 году привели к индукции транскрипции генов ферментов-антиоксидантов: глутамилтрансферазы, супероксиддисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы - в 24, 6, 18 и 3 раза, соответственно в растениях ячменя Н. vulgare сорта Haruno Nijo

3. Экспрессия генов стрессового ответа ячменя Н. vulgare карликового сорта Akashinriki не изменялась в ответ на воздействие факторов окружающей среды на МКС в 2008 г.

4. 13-ти месячное экспонирование покоящихся форм растений в условиях открытого космического пространства не приводит к изменению фенотипа растений и не влияет на степень полиморфизма ДНК.

5. Ячмень Н. vulgare является высокоперспективным для использования на борту космических летательных аппаратов в качестве компонента систем жизнеобеспечения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Космические корабли на низкой околоземной орбите служат «лабораторией микрогравитации» для изучения фундаментальных процессов, лежащих в основе восприятия сигналов гравитации живыми организмами. Освоение человечеством околоземного пространства и возможность длительных по времени и расстоянию космических полетов привели ученых ■к идее практического использования растений в составе систем жизнеобеспечения в качестве дополнительного источника питания космонавтов, способа регенерации кислорода и очистки воды. Для осуществления этой идеи требуется всесторонняя оценка различных аспектов роста и развития растений в течение полного цикла онтогенеза, характеристика механизмов адаптации к условиям, сопутствующим космическому полету и выяснение границ выживаемости видов в экстремальных условиях открытого космического пространства.

Накопленные научные данные позволяют успешно культивировать •высшие растения, в т.ч. пригодные для питания человека, в специально-оборудованных оранжереях. При соблюдении оптимальных условий морфологические и биометрические показатели «космических» не отличаются от таковых наземных контрольных растений. Установлено, что растения способны к быстрой адаптации к невесомости и другим условиям космического полета. Однако, попытки установить механизмы адаптации не увенчались успехом. Ограниченное число возможностей проведения космических опытов, сложности с транспортировкой биологических объектов значительно затрудняют систематизацию накопленных результатов •экспериментов и интерпретацию данных об изменении биохимических, цитологических и генетических параметров растительных организмов в космосе. В противоречии находятся данные экспериментов по оценке мутагенного влияния космоса на живые организмы, в т.ч. на покоящиеся формы высших растений.

Развитие молекулярно-генетических методов анализа и накопленные данные об ответе растений на другие виды стресса, возникающие на Земле,

53 определили новый вектор исследований. Идентификация генов, экспрессия которых модулируется в условиях космического полета и оценка специфичности ответа, а следовательно, и установление механизмов адаптации растений к новым меняющимся условиям является новым перспективным направлением космической биологии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и условия культивирования

Материал для исследований получен из Учреждения российской академии наук Государственного научного центра Российской Федерации -Института медико-биологических проблем лаборатории "Биологические системы жизнеобеспечения человека", постановщика экспериментов "Растения-2/Лада" с высшими растениями на борту Российского сегмента (PC) Международной космической станции (МКС) ("Долгосрочная программа научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых на PC МКС). Научный руководитель программы экспериментов "Растениям/Лада" д.б.н. В.Н.Сычев, ответственный исполнитель д.б.н. М.А.Левинских. В экспериментах использовали растения ячменя Hordeum vulgarе L. двух сортов: Haruno Nijo и Alcashinriki.

Семена ячменя Н. vulgarе сорта Haruno Nijo, размещенные в полиэтиленовом пакете, доставляли на PC МКС на борту грузового корабля

ГК) «Прогресс-М56» 24 апреля 2006 года в составе укладки '«РАСТЕНИЯ-2

13. После доставки на борт PC МКС укладка была размещена около оранжереи «Лада» в Служебном модуле МКС. 31 августа 2006 года командир

13-й основной экспедиции на МКС П.В. Виноградов посадил семена ячменя

•в корневой модуль оранжереи «Лада». Рост и развитие растений проходили при круглосуточном освещении, колебаниях температуры 22-27 °С и относительной влажности 40-60 %. Через 26 дней культивирования проростки были срезаны, помещены в раствор «RNAlater RNA stabilization reagent» (Qiagen, USA), предотвращающий деградацию мРНК в образцах, и спущены на Землю на борту транспортного корабля (ТК) «Союз-ТМА-8».

Через сутки после срезки растения были доставлены в лабораторию

Института медико-биологических проблем РАН и помещены в холодильник при -80 °С. Контрольные растения культивировали на Земле в аналогичных условиях температуры, влажности и освещения. Растения срезали на 26 день

55 культивирования и выдерживали в «RNAlater RNA stabilization reagent» (Qiagen, USA) такой же период времени, что и опытные образцы перед помещением в холодильник при -80 °С.

Во втором эксперименте использовали семена ячменя Н. vulgare карликового сорта Akashinriki. Семена доставляли на МКС на борту ТК «Союз ТМА-12» 08 апреля 2008 года в составе укладки «РАСТЕНИЯ-2 №13». 24 июля 2008 года борт-инженер 17-й основной экспедиции на МКС О.Д. Кононенко посадил семена ячменя в корневой модуль оранжереи «Лада». Рост и развитие растений проходили при круглосуточном освещении, колебаниях температуры 21-26 °С и относительной влажности 40-65 %. 25 августа 2008 года проростки срезали и зафиксировали на борту МКС в холодильнике MELFI при -80 °С. Замороженные растения доставляли на Землю на борту космического корабля «Спей Шаттл» 12 декабря 2008 года. В качестве контроля использовали растения того же сорта Akashinriki, выращенные в лаборатории на Земле.

Воздействие высокой температуры и соли

25 дневные проростки ячменя сорта Haruno Nijo были помещены в инкубатор при 40 °С на 2 часа. Затем листья срезаны и заморожены при -80 °С. В почву 25 дневных проростков ячменя сорта Haruno Nijo была добавлена соль NaCl в конечной концентрации 0.5М. Растения культивировали в соленой почве в течение двух дней. Затем листья были срезаны и заморожены при -80°С.

Экспонирование семян

Материал для исследований получен из Учреждения российской академии наук Государственного научного центра Российской Федерации -Института медико-биологических проблем лаборатории "Микробиология среды обитания и противомикробная защита", постановщика экспериментов "Биориск-МСН" с покоящимися формами организмов на борту Российского сегмента (PC) Международной космической станции (МКС) ("Долгосрочная

56 программа научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых 'на PC МКС). Научный руководитель программы экспериментов "Биориск-МСН" - д.б.н. Н.Д.Новикова, ответственный исполнитель - к.б.н. Н.А.Поликарпов. Для исследования способности к выживанию в условиях открытого космоса семян растений проводили эксперимент «Биориск-МСН-2» (рис. 15-16). Аппаратура «Биориск-МСН» представляет собой контейнер, содержащий внутри 24 пластиковые чашки Петри диаметром 65 мм, в которых в хлопчатобумажных мешочках размещали исследуемые организмы. На крышке каждой чашки имелись отверстия диаметром 10 мм, на которые наложен пористый фторлоновый фильтр, пропускающий воздух, но 'обеспечивающий стерильность образцов. Габаритные размеры каждого контейнера составляли 390 мм х 100 мм х 90 мм, а масса - 2.3 кг. 16 февраля 2007 года было произведено снаряжение тест-объектами контейнеров аппаратуры «Биориск-МСН-2». После снаряжения оборудование «Биориск-МСН» было передано в РКК «Энергия» и доставлено на борт PC МКС 15 апреля 2007 года на космическом корабле «Союз-ТМА-10». 06 июня 2007 года во время внекорабельной деятельности (ВКД) российские космонавты Ф. Юрчихин и О.Котов установили аппаратуру «Биориск-МСН» на внешней стороне МКС. Контейнеры были закреплены на специальной платформе, на 'внешней оболочке стыковочного узла «Пирс» (рис. 15). Перед закреплением у каждого контейнера открывалась крышка. Съем первого контейнера был осуществлен через 13 месяцев - 15 июля 2008 года космонавтами 17-ой основной экспедиции С.Волковым и О.Кононенко. На Землю первый контейнер был спущен 24 октября 2008 года. Сразу после получения в лаборатории были проведены работы по извлечению чашек Петри с тест-объектами из металлического контейнера. Дальнейший анализ проводили в лаборатории на Земле.

Выделение общей РНК

РНК выделяли с помощью RNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Maryland, USA) с небольшими изменениями в инструкции. 1 мл раствора «RLT»,

57 содержащего тиоционат гуанидина, добавляли к 100 мг растительной ткани листа. Для разрушения клеток образцы помещали в пластиковые пробирки, содержащие шарики (lysing matrix D, FastRNA Pro Green Kit, Obiogene, Inc., CA) и подвергали их гомогенизации в течение 40 секунд при силе в 6 единиц в гомогенизаторе FastPrep Instrument (Qbiogene, Inc, CA). Образцы охлаждали во льду 2 минуты для предотвращения перегревания и возможной деградации РНК и повторяли процедуру гомогенизации второй раз. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин, супернатант переносили в колонки «QIAshredder» и центрифугировали 2 мин при 13000 об/мин для удаления не растворившегося материала и уменьшения вязкости лизата за счет растворения желатиновых компонентов, образующихся в растительных лизатах. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 0,5 объема 98% этанола для обеспечения избирательного связывания РНК с мембраной «RNAeasy» колонки. Супернатант, помещенный в колонку, центрифугировали 15 сек при 10000 об/мин. Далее колонку последовательно промывали 700 мкл буфера «RW1» и дважды 500 мкл буфера «RPE» центрифугированием 15 секунд при 10000 об/мин. РНК элюировали 30 мкл воды при центрифугировании в течение 1 минуты при 10000 об/мин.

Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре SmartSpec 3000 (BioRad).

Целостность РНК подтверждали при помощи биоанализатора Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies) и электрофорезом в агарозном геле.

Формальдегид-денатурирующий гель-электрофорез РНК

Растворы

1. Диэтилпирокарбонат (DEPC) - дистиллированная вода

Для приготовления DEPC-дистиллированной воды 1мл диэтилпирокарбоната добавляли к 1 л высокоочищенной воды (Milli-Q).

Инкубировали при комнатной температуре 3 часа при слабом помешивании для всасывания DEPC в раствор. Автоклавировали 20 мин при 121 °С для разрушения DEPC до С02 и этилового спирта. Инкубировали при комнатной температуре при слабом помешивании с открытой крышкой минимум 3 часа. Раствор хранили при комнатной температуре.

2. 3-[Н-Мор,фолино]пропансульфоиовая кислота (MOPS)

C7H15N04S 4.18 г

DEPC-вода 80 мл рН 7 (доводили NaOH, или АсОН)

ЗМ AcONa (рН 5.3) 1.66 мл

0.5 M ЭДТА (рН 8.0) 2 мл

Доводилось до 100 мл DEPC-дистиллированной водой и хранилось в темноте при комнатной температуре.

3. Краситель для электрофореза РНК

DEPC-дистиллированная вода 0.5 M ЭДТА (рН 8.0) Глицерол

Бромфеноловый синий Хранили при 4 °С

4. Зх-кратный Стоковый раствор (2мкг\мл)

Акридиновый оранжевый 20 мкг

DEPC-дистиллированная вода 10 мл

5. ТЕ-буфер

1М Трис-HCl (рН 8.0) 1мл

0.5. M ЭДТА (рН 8.0) 0.2. мл

5 мл 20 мкл 5 мл 25 мг акридинового оранжевого

Доводили объем до 100 мл дистиллированной водой, стерилизовали автоклавированием в течение 20 мин при 121 °С, хранили при 4 °С.

Приготовление агарозного геля

10х MOPS

DEPC-дистиллированной воды агароза

73 мл

10 мл

1.2 г

Нагревали раствор в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Остужали до 60°С и добавляли 12 мл 37%формальдегида. Перемешивали и заливали гель. Оставляли полимеризоваться на один час.

Приготовление РНК

1. 30 мкг общей РНК высушивали в вакууме.

2. добавляли 5 мкл DEPC-дистиллированной воды, перемешивали.

3. инкубировали 20 мин на льду для растворения РНК

4. добавляли 12.5 мкл формамида и 2.5 мкл 10х MOPS

5. инкубировали 15 мин при 55°С

6. остужали на льду 5 мин и центрифугировали при 10000 об/мин

7. добавляли 5 мкл красителя для электрофореза РНК к каждому образцу, перемешивали и загружали образцы в гель.

Электрофорез проводили в lxMOPS - буфере при 50 Вольтах. После окончания электрофореза, слегка подсушенный гель дважды промывали 20 мМ фосфатным буфером (pH 7.0) в течение 5 мин. Затем гель окрашивали акридиновым оранжевым в течение 7 мин. Далее трижды промывали в фосфатном буфере 5, 15 и 30 мин последовательно.

Очистка мРНК

Очистку мРНК проводили в соответствии со стандартным протоколом Poly(A) Purist MAG kit (Ambion Inc, Austin, USA), начиная с 20 мкг общей

РНК.

Микрочипирование

Комплементарную ДНК синтезировали из 3 мкг общей РНК с Т7-Oligo(dT)- праймером и очищали при помощи GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix). Синтезированная кДНК транскрибировалась в присутствии Т7 РНК полимеразы и биотин-меченных аналогов нуклеотидов с образованием биотин-меченной кРНК. Биотин-меченную кРНК очищали и фрагментировали при помощи GeneChip Sample Cleanup Module. Фрагментированную кРНК гибридизовали с GeneChip Barley Genome Array (Affymetrix) при 45 °C в течение 16 часов. Затем чип промывали, окрашивали и анализировали в соответствии со стандартным протоколом Affymetrix GeneChip Expression Analysis. ДНК-микрочип Affymetrix, содержит 23000 олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям генов ячменя.

Полный профиль экспрессии можно получить на http://proteogenomics.musc.edu/ma/uArrDB download.php?u=%28owner%29%2 OShagimardanova&fh=AnalysisData Barley.xls&p=uArrDB 2/Shagimardanova/s pacebarley/052107/AnalysisDataBarley.xls.

Синтез первой цепи кДНК

Синтез одноцепочечной кДНК проводили в соответствии со стандартным протоколом PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit (Takara Bio, Япония) из 1.5 мкг мРНК. Обратную транскриптазу инактивировали нагреванием при 95°С в течение 5 мин.

ПЦР с обратной транскрипцией

ПЦР с обратной транскрипцией проводили в смеси, содержащей 1 мкл одноцепочечной кДНК, 0,4мМ dNTP, 1хПЦР буфер, 2.5 ед ExTaq ДНК-полимеразы и 10 пмоль каждой комбинации праймеров (Табл. 1) на амплификаторе iCycler (BioRad). ПЦР проводили по следующей программе 94 °С 1 мин 1 цикл

94 °С -15 сек 60 °С -15 сек

68 °С -1 мин (до 30 циклов в зависимости от гена (Табл. 1)). Таблица 1. Праймеры для ПЦР-ОТ, количество циклов ПЦР и размер целевых генов

Целевой ген Последовательность праймеров Количество циклов ПЦР Размер продукта (и.о.) а-тубулин 5'-ATCACCAACAGTGCATTCGAGCCTTCC-3' 5 '-CCATCGTCG AACTCAGCACCAACTTCT-3' 28 457

GST 5 '-AAGCAGCCATGGTGGACGTATGGACGGA-3' 5'-ACTGCACGCTGGTGCAATCCCAGCCGCG-3' 28 502

SOD 5 '-ATGGTGAAGGCTGTTGCTGTGC-3' 5 '-TCAGCCTTGAAGTCCGATGATCCC-3' 28 459

CAT 5 '-TGCAGGAGTACTGGCGCGTCTTCGACTT-3' 5 '-AGATCCCGGGCACGACGAGGCCGGGGCC-3' 28 504

APX 5'-GGAGTTGTCGCCGTGGAGGTGTCCGGTG-3' 5 '-CAAGATCACCCTGGTCGCGCATAGTAGC-3' 33 502

PAL 5 '-GCAGTTCTCAGAGCTCGTGGAT-3' 5'-GGCAATCTCGATGCCTTTGA-3' 33 352

Для гель-электрофореза использовали 4 мкл реакционной смеси, добавляли 3 мкл ТЕ-буфера и 1 мкл красителя. В лунки геля загружали 5 мкл .получившейся смеси. Амплифицированные фрагменты детектировали при помощи окрашивания в этидиум бромиде. Концентрацию одноцепочечной кДНК для каждого образца уравнивали после подсчета экспрессии гена а-тубулина.

ПЦР-РВ

ПЦР-РВ проводили с использованием реакционной смеси SYBR premix Taq (Takara Bio, Япония) на амплификаторе LightCycler 2.0 (Roche Applied Science). Реакцию повторяли трижды в каждом опыте. Смесь для ПЦР-РВ, .общим объемом 20 мкл, содержала 2 мкл одноцепочечной кДНК, 10 мкл SYBR premix Taq (Takara Bio, Japan) и 0.2 мкМ каждого праймера (Табл. 2). ПЦР-РВ проводили при следующих условиях: начальная денатурация при 95 °С, 10 с, 40 циклов, включающих 20 с при 95 °С и 20 с при 60 °С. Оценивали уровень мРНК и количество копий генов в режиме относительных измерений (AACt-метод). Данный подход позволил провести двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в контрольном и экспериментальном образцах [Cantero et al., 2006]. Нормирование данных выполняли относительно гена а-тубулина. Для подтверждения уникальности обнаруженных продуктов амплификации, по окончании каждой реакции анализировали кривую плавления продукта ПЦР.

Праймеры подбирали с помощью програмного обеспечения LightCycler 4.0 Software (Roche Applied Science). Праймеры выбирали так, что они соответствовали кодирующим областям генов (Табл.2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шагимарданова, Елена Ильясовна, Казань

1. Дешевая, Е.А. Основные итоги космического эксперимента «Биориск» и его перспективы Текст. / Е.А. Дешевая, Н.Д. Новикова, H.A. Поликарпов, Ю.В. Свистунова, А.Л. Ермак, Т.Е. Самосадная // Космонавтика и ракетостроение. -2007. Т. 4. - С. 64-70.

2. Евдонин, А.Л. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции /

3. A.Л. Евдонин, Н.Д. Медведева Текст. //Цитология. 2009. - Т. 51. - С. 130-137.

4. Калинина, Е.В. Современный взгляд на антиокислительную активность глутатиона и глутатион-зависимых белков Текст. / Е.В. Калинина, H.H. Чернов, М.Д. Новичкова, А.Н. Саприн, Т.Т. Березов // Вестник РАМН. 2010. - Т. 3. - С. 46-54.

5. Камин, А. "Оазис" снова на орбите Текст. / А. Камин // Техника молодежи. 1977. - Т. 4. - С. 25-27.

6. Левинских, М.А. Некоторые характеристики сформировавшихся в условиях микрогравитации семян растений Текст. / М.А. Левинских,

7. B.Н. Сычев, О.Б. Сигналова, Т.А. Дерендяева, Е.Л. Нефедова, М.Е. Масгрейв, У.Ф. Кэмпбелл, Д. Конлин, Г.Е. Бингхейм // Авиакосм. Экол. Мед. 2002. - Т. 36. - С. 62-64.

8. Нечитайло, Г.С. Космическая биология Текст. / Г.С. Нечитайло, A.JI. Машинский. Москва. : Мир, 1993. - С. 141.

9. Ю.Новикова, Н.Д. Результаты исследований по длительному экспонированию покоящихся форм организмов в космическом пространстве Текст. /Н.Д. Новикова, Н.А. Поликарпов, Е.А. Дешевая, М.А. Левинских, В.Р. Алексеев, Т. Окуда, М. Сугимото, О.А. Гусев,

10. Abreu, I.A. Superoxide dismutases-a review of the metal-associated mechanistic variations Text. / I.A. Abreu, D.E. Cabelli // Biochim Biophys Acta. 2010. - V. 1804. - P. 263-74.

11. Alston, J.A. Seeds in space environment Text. / J.A. Alston // LDEF: 69months in space. First postretrieval symposium / A.S. Levine (ed); National112

12. Aeronautics and Space Administration, Langley Research Center, 2001. P. 63-78.

13. Aoki, K. A subclass of plant heat shock cognate 70 chaperones caries a motif that facilitates trafficking through plasmodesmata Text. / K. Aoki, F. Kragler, B. Xoconostle-Cazares, W.J. Lucas // Proc. Nat. Acad. Sci. 2002. -V. 10.-P. 16342-16347.

14. Barondeau, D.P. Nickel superoxide dismutase structure and mechanism Text. / D.P. Barondeau, CJ. Kassmann, C.K. Bruns, J.A. Tainer, E.D. Getzoff// Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 8038-8047:

15. Basha, E. Mechanistic differences between two conserved classes of small heat shock proteins found in the plant cytosol Text. / E. Basha, C. Jones, V.- Wysocki, E. Vierling // J Biol Chem. 2010. - V. 285. - P. 11489-11497.

16. Bayonove, J.F. Investigation on rice embryos and seeds after the LDEF flight: electronic spin resonance identification Text. / J.F. Bayonove, J.J. Raffi, J.P. Angel // Adv Space Res. 1994. - V. 14. - P. 53-57.

17. Bekesiova, B. Heavy-metal stress induced accumulation of chitinase isoforms in plants Text. / B. Bekesiova, S. Hraska, J. Libantova, J. Moravcikova, I. Matusikova // Mol Biol Rep. 2008. - V. 35. - P. 579-588.

18. Benton, E.R. Dosimetric results from the Mir orbital station Text. / E.R. Benton, E.V. Benton, A.L. Frank, A. Leonov, J. Gaskin // Radiat. Prot. Dosimetry. 2002. - V. 100. - P. 489-494.

19. Benton, E.R. Space radiation dosimetry in low-Earth orbit and beyond / E.R. Benton, E.V. Benton Text. // Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. B. 2001. -V. 184.-P. 255-294.

20. Bernier, F. Germins and germin-like proteins: plant do-all proteins. But what do they do exactly? Text. / F. Bernier, A. Berna // Plant Physiol. Biochem. 2001. - V. 39. - P. 545-554.

21. Biemelt, S. Expresion and activity of isoenzymes of superoxide dismutase in wheat roots in response to hypoxia and anoxia Text. / S. Biemelt, U.

22. Keetman, H-P. Mock, B. Grimm // Plant Cell and Environment. 2000. - V. 23.-P. 135-144.

23. Blokhina, O. Reactive oxygen species and nitric oxide in plant mitochondria: origin and redundant regulatory systems Text. /0. Blokhina, K.V. Fagerstedt // Physiol Plant. 2010. - V. 138. - P. 447-462.

24. Boo, Y.C. Water deficit-induced oxidative stress and antioxidative defenses in rice plants Text. / Y.C. Boo, J. Jung // J. Plant Physiol. 1999. - V. - P. 255-261

25. Boston, R.S. Molecular chaperones and protein folding in plants Text. / R.S. Boston, P.V. Viitanen, E. Vierling // Plant Mol. Biol. 1996. - V. 32. -P. 191-222.

26. Broekaert, W.F. Induced and performed antimicrobial proteins Text. / W.F. Broekaert, F.R. Terras, B.P. Cammue // Mechanisms of resistance to plant diseases / A.J. Slusarenko, R.S. Fräser, L.C. Van Loon (eds); Dordrecht, Kluwer, 2000. P. 371-477.

27. Brugna, M. In vivo production of catalase containing haem analogues Text. / M. Brugna, L. Tasse, L. Hederstedt // FEBS Journal. 2010. - V. 277. - P. 2663-2672.

28. Bucker, H. The Biostack Experiments I and II aboard Apollo 15 and 17 Text. / H. Bucker // Life Sei. Space Res. 1974. - V. 12. - P: 43-50.

29. Bucker, H. The role of HZE particles in space flight: results from spaceflight and ground-based experiments Text. / H. Bucker, R. Facius // Acta Astronaut.-1981.-V. 8.-P. 1099-1107.

30. Buhtz, A. Xylem sap protein composition is conserved among different plant species Text. / A. Buhtz, A. Kolasa, K. Arlt, C. Walz, J. Kehr // Planta. -2004.-V.-219.-P. 610-618.

31. Bursey, E.H. Two substrate binding sites in ascorbate peroxidase: the role of arginine 172 Text. / E.H. Bursey, T.L. Poulos // Biochemistry. 2000. -V. 27.-P. 7374-7378.

32. Cai L.T. A crinkly leaf and delay flowering mutant of tobacco obtained from recoverable satellite-flown seeds Text. / L.T. Cai, S.Q. Zheng, X. L. Huang // Adv Space Res. 2007. - V. 40. - P. 1689-1693.

33. Campbell, W.F. Comparative floral development on Mir-grown and • ethylene-treated, earth-grown super dwarf wheat Text. / W.F. Campbell,

34. F.B. Salisbury, B. Bugbee, S. Klassen, E. Naegle, D.T. Strickland // J. Plant Physiol.-2001.-V. 158.-P. 1051-1060.

35. Cappello, F. Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy Text. / F. Cappello, E. Conway de Macario, L. Marasá, G. Zummo, A.J. Macario // Cancer Biol Ther. 2008. -V. 7.-P. 801-809.

36. Castro, H. Peroxidases of trypanosomatids Text. /H. Castro, A.M. Tomás // Antioxid Redox Signal. 2008. - V. 10. - P. 1593-606.

37. Celic, A. Engineering the active site of ascorbate peroxidase Text. / A. Celic, P.M. Cullis, M.J. Suteliffe, R. Sangar, E.L. Raven // European J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 78-85.

38. Chassot, C. Cuticular defects lead to full immunity to a major plant pathogen Text. / C. Chassot, C. Nawrath, J.P. Metraux // Plant J. 2007. -V. 49. - P. 972-980.

39. Chen, Z.J. Roles of dynamic and reversible histone acetylation in plant development and polyploidy Text. / Z J. Chen, L. Tian // Biochem. Biophys. Acta. 2007. - V. 1769. - P. 295-307.

40. Cheng, Z. Transcriptomic analyses of space-induced rice mutants with enhanced susceptibility to rice blast Text. / Z. Cheng, M. Liu, M. Zhang, X. Hang, C. Lei, Y. Sun // Adv Space Res. 2007. - V. 40. - P. 540-549.

41. Choi, C.S. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of a gene encoding a glycerophosphsdiesterase-like protein in tobacco plants Text. / C.S. Choi, H. Sano // Mol. Genet. Genomics. 2007. -V. 277.-P. 589-600.

42. Colin et, H. Temporal expression of heat shock genes during cold stress and recovery from chill coma in adult Drosophila melanogaster Text. / H. Colinet, S.F. Lee, A. Hoffmann // FEBS J. 2010. - V. 277. - P. 174-185.

43. Ding, X. Z. Overexpression of HSP-70 inhibits the phosphorylation of HSF1 by activating protein phosphatase and inhibiting protein kinase C activity Text. / X.Z. Ding, G.C. Tsokos, J.G. Kiang // The FASEB Journal. 1998.-V. 12.-P. 451-459.

44. Doxey, A.C. Structural motif screening reveals a novel, conserved carbohydrate-binding surface in the pathogenesis-related protein PR-5d Text. / A.C. Doxey, Z. Cheng, B.A. Moffatt, B.J. McConkey // BMC Struct Biol.-2010.-V. 10.-P. 23

45. Dubcovsky, J. Genome plasticity a key factor in the success of polyploidy wheat under domestication Text. / J. Dubcovsky, J. Dvorak // Science. -2007.-V. 316.-P. 1862-1866.

46. Facius, R. Space weather impact on Space radiation protection Text. / R. Facius, G. Reitz // Space Space weather Physics and Effects / V. Bothmer, I.A. Daglis (eds); Springer, Heidelberg, 2006. - P. 289-353.

47. Fang Y.Z. Effect of ionizing radiation on superoxide dismutase in vitro and in vivo Text. / Y.Z. Fang // Advances in free radical biology and medicine. Y.Z. Fang (ed). Beijing: Atomic Enegry Press. - 1991. - V. 1. - P. 1-7.

48. Feldman, L. J. Root gravitropism Text. / L.J. Feldman // Physiol Plant. -1985.-V. 65.-P. 341-344.

49. Ferreira, R.B. The role of plant defense proteins in fungal pathogenesis Text. / R.B. Ferreira, S. Monteiro, R. Freitas, C.N. Santos, Z. Chen, L.M. Batista, J. Duarte, A. Borges, A.R. Teixeira // Mol. Plant Pathol. 2007. - V. 8.-P. 677-700.

50. Foyer, C.H. Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implications Text. / C.H. Foyer, G. Noctor // Antioxid Redox Signal. 2009. V. 4. - P. 861-905.

51. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones Text. / J. Frydman // Ann. Rev. Biochem. 2001. - V. 70. - P. 603-647.

52. Fujii, M. Identification of genes that affect sensitivity to 5-bromodeoxyuridine in the yeast Saccharomyces cerevisiae Text. / M. Fujii, K. Miki, S. Takayama, D. Ayusawa // Mol Genet Genomics. 2010. - V. 283.-P. 461-468.

53. Gianinnazzi, S. b-protein as a constitutive component in highly (TMV) resistant interspecific hybrids of Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi Text. / S. Gianinnazzi // Plant Sei Lett. 1982. - V. 26. - P. 17-181.

54. Gorbunova, V. Non-gomologous DNA end joining in plant cells is associated with deletions and filler DNA insertions Text./ V. Gorbunova, A.A. Levy // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4650-4657.

55. Grover, A. Strategies for development of fungus-resistant transgenic plants Text. / A. Grover, R. Gowthaman // Curr Sei. 2003. - V. 84. - P. 330-340.

56. Gupta, S.C. Heat shock proteins in toxicology: how close and how far? Text. / S.C. Gupta, A. Sharma, M. Mishra, R.K. Mishra, D.K. Chowdhuri // Life Sei. 2010. - V. 86. - P. 377-384.

57. Hadrami, A. Chitosan in plant protection Text. / A. Hadrami, L.R. Adam, I. Hadrami, F. Daayf// Mar Drugs. 2010. - V. 8. - P. 968-987.

58. Hahn, J.S. The Hsp90 chaperone machinery: from structure to drug development Text. / J.S. Hahn // BMB Rep. 2009. - V. 42. - P. 623-630.

59. Halstead, T.W. Experiments on plants grown in space. Status and prospects Text. / T.W. Halstead, F.R. Dutcher // Ann Bot. 1984. - V. 54. - P. 3-18.

60. Hammond, E.C. Germination, growth rate and electron microscope analysis of tomato seeds flown on the LDEF Text. / E.C. Hammond, K. Bridgers, F.D. Berry // Radiation measurement. 1996. - V. 26. - P. 851-861.

61. Harada, E. Expression Profiling of Tobacco Leaf Trichomes Identifies Genes for Biotic and Abiotic Stresses Text. / E. Harada, J.A. Kim, A.J.

62. Meyer, R. Hell, S. Clemens, Y.E. Choi // Plant Cell Physiol. 2010. - Epub.t

63. Hassane, S. Structure and mechanism of protein stability sensors: The chaperone activity of small heat-shock proteins Text. / S. Hassane, J. Mchaourab, A. Godar, L. Phoebe, S. Stewart // Biochemistry. 2009. - V. 48.-P. 3828-3837.

64. Henderson, I.R. Epigenetic inheritance in plants Text. / I.R. Henderson, S.E. Jacobsen // Nature. 2007. - V. 447. - P. 418-424.

65. Hiilovaara-Teijo, M. Snow-mold-induced apoplastic proteins in winter rye leaves lack antifreeze activity Text. / M. Hiilovaara-Teijo, A. Hannukkala, M. Griffith, X.M. Yu, K. Pihakaski-Maunsbach // Plant Physiol. 1999. - V. 121.-P. 665-674.

66. Hill, J.E. Arabidopsis thaliana type I and II chaperonins Text. / J.E. Hill, S.M. Hemmingsen // Cell Stress Chaperones. 2001. - V. 6. - P. 190-200.

67. Hoegen, E. Primary structure and tissue-specific expression of the pathogenesis-related protein PR-lb in potato Text. / E. Hoegen, A.

68. Stromberg, U. Pihglgren, E. Kombrink // Mol Plant Pathol. 2002. - V. 3. -P. 329-245.

69. Horneck, G. Radiobiological experiments in space: a review Text. / G. Horneck // Int. J. Radiat. Appl. Instrum. 1992. - V. 20. P. 185-205.

70. Jaspers, P. Reactive oxygen species in abiotic stress signaling Text. / P. Jaspers, J. Kangasjarvi // Physiologia Plantarum. 2010. - V. 138. - P. 405413.

71. Jorda, L. Characterization of P69E and P69F, two differentially regulated genes encoding new members of the subtilisin-like proteinase family from tomato plants Text. / J. Jorda, V. Conejero, P. Vera // Plant Physiol. 2000. -V. 122.-P. 67-73.

72. Jwa, N.S. Role of defense/stress-related marker genes, proteins and secondary metabolites in defining rice self-defense mechanisms Text. /N.S.

73. Jwa, G.K. Agrawal, S. Tamogami, M. Yonekura, O. Han, H. Iwahashi, R. Rakwal // Plant Physiol Biochem. 2006. - V. 44. - 261-273.

74. Kampinga, H.H. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity Text. / H.H. Kampinga, E.A. Craig // Nat Rev Mol Cell Biol.-2010.-V. 11.-P. 579-92.

75. Katz, R. Track structure model of cell damage in space flight NASA TP3235 Text. / R. Katz, F.A. Cucinotta, J.F. Wilson, J.L. Shinn, D.M. Ngo. Washington, DC : National Aeronautic and Space Administration, 1992.

76. Kaufman R.J. Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum: coordination of gene transcriptional and translational controls Text. / R.J. Kaufman // Genes and development. 1999. - V. 13. - P. 1211-1233.

77. Kehr, J. Analysis of xylem sap protein from Brassica napus Text. / J. Kehr, A. Buhtz, P. Giavalisco // BMC Plant Biol. 2005. - V. 5. - P. 11.

78. Kiefer, J. Mutagenic effects of heavy charged particles Text. / J. Kiefer // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2002. - V. 43. - P. 21-25.

79. Kim, B.H. and Schoffl F. Interactions between Arabidopsis heat shock transcription factor 1 nd 70 kDa heat shock proteins Text. / B.M. Kim // J. Experim. Bot. 2002. - V. 53. - P. 371-375.

80. Kirstein, J. Adapting the machine: adaptor proteins for Hspl00/Clp and AAA+ proteases Text. / J. Kirstein, N. Molière, D.A. Dougan, K. Turgay // Nat Rev Microbiol. 2009. - V. 7. - P. 589-599.

81. Kiss, J.Z. Mechanisms of the early phases of plant gravitropism Text. / J.Z. Kiss // Critical review of plant science. 2000. - V. 19. - P. 551-573.

82. Kitajima, S. Plant pathogenesis-related proteins: molecular mechanisms of gene expression and protein function Text. / S. Kitajima, F. Sato // J. Biochem. 1999. - V. 125. - P. 1-8.

83. Kitajima, S. Two chitinase-like proteins abundantly accumulated in latex of mulberry show insecticidal activity Text. / S. Kitajima, K. Kamei, S. Taketani, M. Yamaguchi, F. Kawai, A. Komatsu, Y. Inukai // BMC Biochem. 2010. - V. 28. - P. 6.

84. Kordyum, E.L. Influence of orbital flight conditions on formation of genitals in Muscari racemosum and Anethum graveolens Text. / E.L. Kordyum, A.F. Popova, A.L. Mashinsky // Life Sei. Space Res. 1979. - V. 17.-P. 301-304.

85. Kovalchuk, I. Molecular aspects of plant adaptation to life in the Chernobyl zone Text. / I. Kovalchuk, V. Abramov, I. Pogribny, O. Kovalchuk // Plant Physiol. 2004. - V. 135. - P. 357-363.

86. Kozeko, L. Effect of Hypergravity on the Level of Heat Shock Proteins 70 and 90 in Pea Seedlings Text. / L. Kozeko, E. Kordyum // Microgravity Science and Technology. 2008. - Epub.

87. Krikorian, A.D. Morphogenetic responses of cultured totipotent cells of carrot (Daucus carota var. carota) at zero gravity Text. / A.D. Krikorian, F.D. Steward // Science. 1978. - V. 200. - P. 67-68.

88. Krishna, P. The Hsp90 family of protein in Arabidopsis thaliana Text. / P. Krishna, G. Gloor // Cell Stress Chaperones. 2001. - V. 6. - P. 238-246.

89. Kurepa, J. Proteasome regulation, plant growth and stress tolerance Text. / J. Kurepa, S. Wang, Y. Li, J Smalle // Plant Signal Behav. 2009. -V. 4.-P. 924-927.

90. Langridge, P. Functional genomics of abiotic stress tolerance in cereals Text. / P. Langridge, N. Paltridge, G. Fincher // Brief Funct Genomic Proteomic. 2006. - V. 4. - P. 343-354.

91. Lanneau, D. Heat Shock Proteins: Cell Protection through Protein Triage Text. / D. Lanneau, G. Wettstein, P. Bonniaud, C. Garrido // ScientificWorld J. -2010. V. 10.-P. 1543-1552.

92. Latijnhouwers, M. Arabidopsis stromal 70-kDa heat shock proteins are essential for chloroplast development Text. / M. Latijnhouwers, X.M. Xu, S.G. M0ller // Planta. 2010. - V. 232. - P. 567-578.

93. Lay, F.T. Defensins components of the innate system in plants Text. / F.T. Lay, M.A. Anderson // Curr Protein Pept Sci. - 2005. - V. 6. - P. 85-101.

94. Leborgne-Castel, N. Overexpression of BiP in tobacco alleviates endoplasmic reticulum stress Text. / N. Leborgne-Castel, E.P. Jelitto-Van Dooren, A.J. Crofts, J. Denecke // Plant Cell. 1999. - V. 11. - P. 459-470.

95. Lee, S.C. Induction of ascorbate peroxidase by ethylene and hydrogen peroxidase during growth of cultured soybean cells Text. / S.C. Lee, B.G. Kang, S.E. Oh // Molecular Cells. 1999. - V. 9. - P. 166-171.

96. Lee, Y.P. Tobacco seeds simultaneously over-expressing Cu/Zn-superoxide dismutase and ascorbate peroxidase display enhanced seed longevity and germination rates under stress conditions Text. / Y.P. Lee,

97. K.H. Baek, H.S. Lee, S.S. Kwak, J.W. Bang, S.Y. Kwon // J Exp Bot. -2010.-V. 61.-P. 2499-2506.

98. Leitch, J.M. The right to choose: multiple pathways for activating copper,zinc superoxide dismutase Text. / J.M. Leitch, P.J. Yick, V.C. Culotta // J Biol Chem. 2009. - V. 284. - P. - 24679-24683

99. Leonardis, S.D. Purification ans characterization of an ascorbate peroxidase from potato tuber mitochondria Text. / S.D. Leonardis, N. Dipierro, S. Dipierro // Plant Physiol. Biochem. 2000. - V. 38. - P. 773779.

100. Levine, H.G. Growth pattern for etiolated soybeans germinated under spaceflight conditions Text. / H.G. Levine, W.C. Piastuch // Adv Space Res. 2005. - V. 36.-P. 1237-1243.

101. Levy-Rimler, G. Type I chaperonins: not all are created equal Text. / G. Levy-Rimler, R.E. Bell, N. Ben-Tal, A. Azem // FEBS letters. 2002. -V. 529. - P. 1-5.

102. Li, G. Reactive oxygen species and antioxidant enzymes activity of Anabaena sp. PCC 7120 (Cyanobacterium) under simulated microgravity. Text. / G. Li, Y. Liu, G. Wang, L. Song'// Acta Astronáutica. 2004. - V. 55.-P. 953-957.

103. Liberek, K. Chaperones in control of protein disaggregation Text. / K. Liberek, A. Lewandowska, S. Zietkiewicz // EMBO J. 2008. - V. 27. -P. 328-335.

104. Lin, K.H. Cloning, expression and physiological analysis of broccoli catalase gene and Chinese cabbage ascorbate peroxidase gene under heat stress Text. / K.H. Lin, H.C. Huang, C.Y. Lin // Plant Cell Rep. 2010. - V. 29.-P. 575-593.

105. Liochev, S.I. Mechanism of the peroxidase activity of Cu, Zn superoxide dismutase Text. / S.I. Liochev, I. Fridovich // Free Radic Biol Med. 2010. - V. 48. - C. 1565-1569.

106. Liu, J.J. The superfamily of thaumatin-like proteins: its origin, evolution, and expression towards biological function Text. / J. Liu, R. Sturrock, A.K. Ekramoddoullah // Plant Cell Rep. 2010. - V. 29. - P. 419436.

107. Mandelman, D. Identification of two electron-transfer sited in ascorbate peroxidase using chemical modification, enzyme kinetics and crystallography Text. / D. Mandelman, J. Jamal, T.L. Poulos // Biochemistry. 1998. V. 37. - P. 17610-17617.

108. Margis, R. Glutathione peroxidase family an evolutionary overview Text. / R. Margis, C. Dundand, F.K. Teixeira, M. Margis- Pinheirol // FEBS J. - 2008. - V. 275. - P. 3959-3970

109. Martzivanou, M. Hyper-gravity effects on the Arabidopsis transcriptome Text. / M. Martzivanou, R. Hampp // Physiologia. Plantarum. -2003. -V. 118.-P. 221-231.

110. Matia, I. Plant cell proliferation and growth are altered by microgravity conditions in spaceflight Text. / I. Matia, F. Gonzalez

111. Camacho, R. Herranz, J. Kiss, G. Gasset, J. van Loon, R. Marco, F.J. Medina //J. Plant. Physiol.-2010. V. 167.-P. 184-193.

112. May, T. 14-3-3 proteins form a guidance complex with chloroplast precursor proteins in plants Text. / T. May, J. Soil // Plant cell. 2000. - V. 12.-P. 53-64.

113. Mayer, M. P. Gymnastics of Molecular Chaperones Text. / M.P. Mayer // Mol Cell. 2010. - V. - 39. - P. 321-331.

114. Mei, M. Mutational effects of space flight on Zea mays seeds Text. / M. Mei, Y. Qiu, Y. He, H. Bucker, C.H. Yang // Adv Space Res. 1994. -V. 14.-P. 33-39.

115. Merkys, A.J. Gravity as an obligatory factor in normal higher plants growth and development Text. / A.J. Merkys, R.S. Laurinavichyus, O.Y. Rupainene, D.V. Shvegzhdene, A.V. Yaroshius // Adv Space Res. 1981. -V. l.-P. 109-116.

116. Merkys, A. J. The development of seedlings shoots under space flight conditions Text. / A.J. Merkys, A.L. Mashinsky, R.S. Laurinavichyus, A. Nechitailo, A.V. Yaroshius, E.A. Izupak // Life Science Space Res. 1975. -V. 13.-P. 53-57.

117. Mubarakshina, M.M. Production and diffusion of chloroplastic H202 and its implication to signaling Text. / M.M. Mubarakshina, B.N. Ivanov, I.A. Naydov, W. Hillier, M.R. Badger, A. Krieger-Liszkay // J. Experim. Botany. 2010. V. 61. - P. 3577-3587.

118. Munis, M.F. A thaumatin-like protein gene involved in cotton fiber secondary cell wall development enhances resistance against Verticillium dahliae and other stresses in transgenic tobacco Text. / M.F. Munis, L. Tu,

119. F. Deng, J. Tan, L. Xu, S. Xu, L. Long, X. Zhang // Biochem Biophys Res Commun. 2010. - V. 393. - P. 38-44.

120. Musgrave M.E. Seeds in space Text. / M.E. Musgrave // Seed Science Research. 2002. - V. 12. - P. 1-16.

121. Musgrave, M.E. Plant reproductive development during spaceflight Text. / M.E. Musgrave, A. Kuang // Adv Space Biol Med. 2003. - V. 9. -P. 1-23.

122. Nanda, A.K. Reactive Oxygen Species during Plant-microorganism Early Interactions Journal of Integrative Plant Biology Text. / A.K. Nanda, E. Andrio, D. Marino, N. Pauly, C. Dunand // J. Intégrât. Plant Biol. 2010. -V. 52.-P. 195-204.

123. Neighart F.C. Escherichia coli and Salmonella Text. / F.C. Neighart // Cellular and Molecular Biology. Washington. ASM Press., 1996.

124. Nevzgodina, L.V. Effect of prolonged exposure of lettuce seeds to HZE particles on orbital stations Text. / L.V. Nevzgodina, E.N. Maksimova, E.V. Kaminskaya // Adv. Space Res. 1989. - V. 9. - 53-58.

125. Nikjoo, H. RBE-LET relationships in mutagenesis by ionizing radiation Text. / H. Nikjoo, R.J. Munson, B.A. Bridges // J. Radiat. Res. (Tokyo). 1999. - V. 40. - P. 85-105.

126. Nover, L. Heat stress proteins and transcription factors Text. / L. Nover, K.D. Scharf// Cell Mol Life Science. 1997. - V. 53. - P. 80-103.

127. Ose, D.E. Superoxide dismutase. Reversible removal of manganese and its substitution by cobalt, nickel or zinc Text. / D.E. Ose, I. Fridovich // J Biol Chem. 1976. -V. 251. -P. 1217-1218.

128. Ou, X. Spaceflight-induced genetic and epigenetic changes in the rice (Oryza sativa L.) genome are independent of each other Text. / X. Ou, L. Long, Y. Wu, Y. Yu, X. Lin, X. Qi, B. Liu // Genome. 2010. - V. 53. - P. 524-532.

129. Parfenov, G.P. Blossoming and maturation of Arabidopsis seed: Experiment on biosatellite Kosmos 1129 Text. / G.P. Parfenov, V.N. Abramova // Dokladi Akademii Nauk SSR. 1981. - V. 256. - P. 254. English translation NASA Technical memorandum 77576.

130. Park, C.J. Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway Text. / C.J. Park, K.J. Kim, R. Shin, J.M. Park, Y.C. Shin, K.H. Paek // Plant J. 2004. - V. 37. - P. 186-198.

131. Passardi, F. Performing the paradoxical: How plant peroxidases modify the call wall Text. / F. Passardi, C. Penel, C. Dunand // Trends Plant Sci. 2004. - V. 9. - P. 534-540.

132. Paul, A-L. Arabidopsis gene expression patterns are altered during spaceflight Text. / A-L. Paul, M.P. Popp, W.B. Gurley, C. Guy, K.L. Norwood R.J. Ferl // Adv. Space. Res. 2005. - V. 36. - P. 1175-1181.

133. Perbal, G. The role of gravity in plant development Text. / G. Perbal // A world without gravity / G. Seibert (ed); Noordwijk. The Netherlands.: ESA Publication division, 2002. - P. 121-136.

134. Perbal, G. Graviperseption of lentil roots grownt in space (spacelab D1 Mission) Text. / G. Perbal, D. Driss-Ecole, G. Rutin, G. Salle // Physiology of plants. 1987. - V. 70. - P. 119-126.

135. Perry, J.J. The structural biochemistry of the superoxide dismutases Text. / J.J. Perry, D.S. Shin, E.D. Getzoff, J.A. Tainer // Biochim Biophys Acta.-2010.-V. 1804.-P. 45-62.

136. Poulain, P. Detection and architecture of small heat shock protein monomers Text. / P. Poulain, J.C. Gelly, D. Flatters // PLoS One. 2010. -V. 5. - Epub (e 9990).

137. Razavizadeh, R. Proteome analysis of tobacco leaves under salt stress Text. / R. Razavizadeh, A.A. Ehsanpour, N. Ahsan, S. Komatsu // Peptides. 2009. - V. 30. - P. 1651-1659.

138. Rop, O. Beta-glucans in higher fungi and their health effects Text. / O. Rop, J. Mlcek, T. Jurikova // Nutr Rev. 2009. - V. 67. - P. 624-631.

139. Rutherford, S.L. Hsp90 as a capacitor for morphological evolution Text. / S.L. Rutherford, S. Lindquist // Nature. 1998. - V. 396. - P. 336342.

140. Saibii, H.R. Chaperone machines in action Text. / H.R. Saibil // Curr Opin Struct Biol. 2008. - V. 18. - P. 35-42.

141. Salmi, M L. Gene expression changes induced by space flight in single-cells of the fern Ceratopteris richardii Text. / S.J. Roux // Planta. 2008. - V. 229.-P. 151-159.

142. Schmidt, P. Deletion-pattern analysis of alpha-particle and X-ray induced mutations at the HPRT locus of V. 79 Chinese hamster cells Text. / P. Schmidt, J. Kiefer // Mutat. Res. 1998. - V. 421. - P. 149-161.

143. Schultheiss, H. Functional assessment of the pathogenesis-related protein PR-lb in barley Text. / H. Schultheiss, C. Dechert, L. Kiraly, J. Fodor, K. Michel, K.H. Kogel; R. Huckelhoven // Plant Science. 2003. - V. 165.-P. 1275-1280.

144. Secenji, M. Transcriptional differences in gene families of the ascorbate-glutathione cycle in wheat during mild water deficit Text. / M. Secenji, E. Hideg, A. Bebes, J. Györgyey // Plant Cell Reports. 2010. - V. 29.-P. 37-50.

145. Selote, D.S. Antioxidant response of wheat roots to drought acclimation Text. / D.S. Selote, R. Khanna-Chopra // Protoplasma. 2010. - Epub

146. Sels, J. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: a focus on PR peptides Text. / J. Sels, J. Mathys, B.M. De Coninck, B.P. Cammue, M.F. De Bolle // Plant Physiol Biochem. 2008. - V. 46. - P. 941-950.

147. Semov, A. Alterations in TNF- and IL- related gene expression in space-flown WI38 human fibroblasts Text. / A. Semov, N. Semova, C. Lacelle, R. Marcotte, E. Petroulakis, G. Proestou, E. Wang // Faseb J. 2002. -V. 16.-P. 899-901.

148. Shao, H.B. Primary antioxidant free scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells Text. / H.B. Shao, L.Y. Chu, Z.H. Lu, C.M. Kang // Int J. Biol. Sei. 2007. - V. 4. - P. 8-14.

149. Skagen, E.B. Effect of simulated and real weightlessness on early regeneration stages of Brassica napus protoplasts Text. / E.B. Skagen, T.N. Iversen // In vitro cell dev Biol Plant. 2000. - V. 36. - P. 312-318.

150. Stankovic, B. 2001: a plant space Odyssey Text. / B. Stankovic // Trends Plant Sei.-2001.-V. 12.-P. 591-593.

151. Stutte, G.W. Micrograviry effects on leaf morphology, cell structure, carbon metabolism and mRNA expression of dwarf wheat Text. / G.W. Stutte, O. Monje, R.D. Hatfield, A-L. Paul, R.J. Ferl, C.G. Simone // Planta. 2006. -V. 224.-P. 1038-1049.

152. Summerlin, L.B. Skylab. Classroom in space Text. / L.B. Summerlin. Washington D.C.: NASA Special Publication, 1977. - V. 401. - P. 342-349.

153. Sung, D.Y. Comprehensive expression profile analysis of the Arabidopsis Hsp70 gene family Text. / D.Y. Sung, E. Vierling, C.L. Guy // Plant Physiology. 2001b. - V. 126. - P. 789-800.

154. Sung, D.Y. Plant Hsp70 molecular chaperones: protein structure, gene family, expression and function Text. / D.Y. Sung, F. Kaplan and C.L. Guy // Physiologia Plantarum. 2001a. - V. 113. - P. 443-451

155. Swanson, S. ROS in plant development Text. / S. Swanson, S. Gilroy// Physiol Plant.-2010.-V. 138.-P. 384-392.

156. Taipale, M. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights Text. / M. Taipale, D.F. Jarosz, S. Lindquist // Nature Reviwes Mol. Cell Biology.-2010.-V. 11.-P. 515-528.

157. Tairbekov, M.G. Biological research in space Text. / M.G. Tairbekov, G.P. Parfenov // Space Biology and Aerospace medicine. 1981. -V. 15.-P. 61-71.

158. Tairbekov, M.G. Some physiological and biochemical features of cells of carrot gall developed in weightlessness Text. / M.G. Tairbekov, L.A. Voronkov, N.A. Guzhova // Space Biology and Aerospace medicine. -1982.-V. 16.-P. 62-67.

159. Takeda, S. DNA methylation and epigenetic inheritance during plant gametogenesis Text. / S. Takeda, J. Paszkowsky // Chromosoma. 2006. -V. 115.-P. 27-35.

160. Taylor, W.E. Alteration of gene expression profiles in skeletal muscle of rats exposed to microgravity during spaceflight Text. / W.E.

161. Taylor, S. Bhasin, R. Lalani, A. Datta, N.F. Gonzalez-Cadavid // Journal of Gravit. Physiol. 2002. - V. 9. - P. 61-70.

162. Teale, W.D. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development Text. / W.D. Teale, I.A. Paponov, K. Palme // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. - V. 7. - P. 847-859.

163. Thalmair, M. Ozone and ultraviolet B effects on the defense-related proteins (3-1,3-glucanase and chitinase in tobacco Text. / M. Thalmair, G. Bauw, S. Thiel, T. Dohring, C. Langebartels, H. Sandermann // J.Plant Physiol. 1996. - V. 148. - P. 222-228.

164. Thomma, B.P. Plant defensins Text. / B.P. Thomma, H.J. Cammue, A.K. Thevissen // Planta. 2002. - V. 216. - P. 193-202.V

165. Tiroli-Cepeda, A.O. Heat causes oligomeric disassembly and increases the chaperone activity of small heat shock proteins from sugarcane Text. / A.O. Tiroli-Cepeda, C.H. Ramos // Plant Physiol Biochem. 2010. -V. 48.-P. 108-116.

166. Torres, M.A. ROS in biotic interactions Text. / M.A. Torres // Physiol Plant. 2010. -V. 138. - P. - 414-429.

167. Tsai, Y.L. The small heat-shock protein HspL Is a VirB8 chaperone promoting type IV secretion-mediated DNA transfer Text. / Y.L. Tsai, Y. R. Chiang, F. Narberhaus, C. Baron, E.M. Lai // J. Biological chemistry. 2010. -V. 285.-P. 19757-19766.

168. Vance, C.K. Spectroscopic comparisons of the pH dependencies of Fe-substituted (Mn)superoxide dismutase and Fe-superoxide dismutase Text. / C.K. Vance, A.F. Miller // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 5518-5527.

169. Vasquez-Robinet, C. Differential expression of heat shock protein genes in preconditioning for photosynthetic acclimation in water-stressed loblolly pine Text. / C. Vasquez-Robinet, J.I. Watkinson, A.A. Sioson, N.

170. Ramakrishnan, L.S. Heath, R. Grene // Plant Physiol Biochem. 2010. - V. 48.-P. 256-264.

171. Veronese, P. In defense against pathogens. Both plant sentinels and foot soldiers need to know the enemy Text. / P. Veronese, M.T. Ruiz, M.A. Coca, A. Hernandez-Lopez, H. Lee // Plant Physiol. 2003. - V. 131. - P. 1580-1590.

172. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting Text. / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. P. 4407—4414.

173. Walliwalagedara, C. Differential expression of proteins induced by lead in the Dwarf Sunflower Helianthus annuus Text. / C. Walliwalagedara, I. Atkinson, H. van Keulen, T. Cutright, R. Wei // Phytochemistry. 2010. -V. 71. - P. 1460-1465.

174. Wandinger, S.K. The Hsp90 chaperone machinery / S.K. Wandinger, K. Richter, J. Buchner Text. // J. Biological chemistry. 2008. - V. 283. - P. 18473-18477.

175. Wang, W. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response Text. / W. Wang, B. Vinocur, O. Shoseyov, A. Altaian // Trends in Plant Science. 2004. - V. 9. - P. 244252.

176. Ward, E.R. Differential regulation of ß-l,3-glucanase messenger RNAs in response to pathogen infection Text. / E.R. Ward, G.B. Payne, M.B. Moyer, S.C. Williams, S.S. Dincher, K.C. Sharkey, J.J. Beck, H.P.

177. Taylor, P. Ahl-Goy, F. Meyns, J.A. Ryals // Plant physiology. 1991. - V. 96. - P. 390-397.

178. Wei, L.J. Analysis of cytogenetic damage in rice seeds induced by energetic heavy ions on-ground and after spaceflight Text. / L.J. Wei, Q. Yang, H.M. Xia, Y. Furusawa, S.H. Guan, P. Xin, Y.Q. Sun // J Radiat Res (Tokyo). 2006. - V. 47. - P. 273-278.

179. Wrobel-Kwiatkowska, M. Expression of p-1,3- glucanase in flax causes increased resistance to fungi Text. / M. Wrobel-Kwiatkowska, K. Lorenc-Kukula, M. Starzycki, J. Oszmianski, E. Kepczynska // Physiol. Mol Plant Pathol. 2004. - V. 65. - P. 245-256.

180. Wuerges, J. Crystal structure of nickel-containing superoxide dismutase reveals another type of active site Text. / J. Wuerges, J.W. Lee, Y.I. Yim, H.S. Yim, S.O. Kang, K. Djinovic-Carugo // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. -2004.- V. 101.-P. 8569-8574.

181. Yamakura, F. Post-translational modifications of superoxide dismutase Text. / F. Yamakura, H. Kawasaki // Biochim Biophys Acta. -2010.-V. 1804.-P. 318-325.

182. Yan, B. Flooding-induces membrane damage, lipid oxidation and activated oxygen generation in com leaves Text. / B. Yan, Q. Dai, X. Liu, S. Huang, Z. Wang // Plant and Soil. 1996. - V. 179. - P. 261-268.

183. Yoshimura, K. Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stress Text. / K. Yoshimura, Y. Yabuta, T. Ishikawa, S. Shigeoka // Plant Physiology. 2000. - V. 123. - P. 223-234.

184. Zamocky, M. Evolution of catalases from bacteria to humans Text. / M. Zamocky, P.G. Furtmüller, C. Obinger // Antioxid Redox Signal. 2008. -V. 9.-P. 1527-1548.

185. Zeng, L. Small heat shock proteins: recent advances in neuropathy / L. Zeng, Z. Hu, W. Lu, X Tang, J. Zhang, T. Li, B. Yang Text. // Curr Neurovasc Res. 2010. - V. 7. - P. 155-166.

186. Zhang, X. Up-regulating arginase contributes to amelioration of chilling stress and the antioxidant system in cherry tomato fruits Text. / X. Zhang, L. Shen, F. Li, Y. Zhang, D. Meng, J. Sheng / J Sci Food Agric. -2010.-Epub.

187. Zhang, X.P. Interactions of plant mitochondrial and chloroplast signal peptides with the Hsp70 molecular chaperone Text. / X.P. Zhang, E. Glaser // Trends in plant science. 2002. - V. 7. - P. 14-21.

188. Zimmermann, M.W. First radiobiological results of LDEF-1 experiment A0015 with Arabidopsis seed embryos and Sordaria fungus spores Text. / M.W. Zimmermann, K.E. Gartenbach, A.R. Kanz // Adv. Space Res.-1994.-V. 14.-P. 47-51.

189. Zou, J. Expression analysis of nine rice heat shock protein genes under abiotic stresses and ABA treatment Text. / J. Zou, A. Liu, X. Chen, X. Zhou, G. Gao, W. Wang, X. Zhang // J Plant Physiol. 2009. - V. 166. - P. 851-861.

Информация о работе

Шагимарданова, Елена Ильясовна
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Стрессовый ответ Hordeum vulgare в условиях космического полета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы