Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стрессиндуцируемое изменение активности инвертазы и превращения растворимых углеводв в злаковых растениях : возможные причины и фириологическая роль

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Стрессиндуцируемое изменение активности инвертазы и превращения растворимых углеводв в злаковых растениях : возможные причины и фириологическая роль"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОЮ 8НА1ЛЕШ ИНС'ШГУТ МЗШЛОГЛИ РАСТЕНИИ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

КСИШЕВ Юрий Евгеньевич

СТРЕССМЩУЦЯРУШОЕ ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИНЬЕРТАЗЫ И ПРЕВРАЩЕНИЕ РАСТВОРИМА УГЛЕВОДОВ В ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЯХ: ВОШШНЬЕ ПРИЧИНИ

и даюлогачадая роль

(03.СО.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата (1ио логически: наук.

йооква - 1992

работа вншлнона в Харьковском ордопа Трудового Красного Знамени государственной аграрном университете имени В.В.Докучаева

Научные рую водители - доктор биологических наук Т.И.Трунова,

кандидат химических наук Л.А.Сысоев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Н.Юевякова,

кандидат биологических наук Ы. VI.ru баш ва

Ведущая организация - Сельскохозяйственная академия

имени К. А. Тимирязева (г.Москва)

Защита состоится " [С' "//.(' Г /)/(. 1992 г. в "/Р" чаео* на ааседании Сяециалниированного совета К 002.45.01 по нрисувде-нии ученой Степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений ¿н,К.А.Тимирязева Российской АН по адресу: .127276, Мооква ..Ботаническая ул., 35.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Автореферат разослан " " <'■-4' Ху>9£ г.

Ученый секретарь Специализированного

совета,кандидат биолошческих наук ' Л.И.Сергеева

ГйГ'.М i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА FAEuTíl

Актуальность проблема. Изучение ибвдх (неспецифических) механизмов адаптации растений к экстремальны факторам среды представляет большой практический и теоретический интерес. Озииые злаки вые кул'ьтури могут подвергаться экологический стрессам различной природы -холодояому, тепловому, водному, солевому и др. Для разработки прие;.юв и методов попциения устойчивости зерновых культур к неблагоприятна факторам среди, а также для диагностики устойчивости к отреас-:''(1ак,юрам необходимо знание механизмов резистентности растении на молекулярное и клеточном уровннх,

Ыолекуляршй уровень адаптации растгний является определяющий, поскольку он в наибольшей степени генетически детерминирован и находится в меншей степени зависимости от влияния услоьий среди. В последнее время все большее внимание исследователей привлекает идея существования общих (йеспецирческих) первичных реакций ¡истеки! на экстремальные воздействия. К таким реакциям относятся; синтез ьокових белков ( irover at al., 1984; Buxdon, 1965, Вой-ников, I9P9), усиление гидрлнтического распада биода; имеров и накопление низкомо^.зкулярных протегторпых соединении (Трунова, 1979, Шевякова, 1983, Блехиан, IS85, lazo et ai.'.» 1969, Jas et al., 1990), изменение гормонального баланса в пользуторыоноъ-ш:гибитеров, замедление ochjbhux анаболических процессов и роста ( Qixarrle, I96t, Мелехов, 1965,. Щели и др., 1969).

Если изменение, экспрессии генома, синтеза стрессовцх белков, преобрааование гормонального статуса рассматриваются как зажине признаки адаптации ( llover et al.» 1984, Кешре! et 41984, Война-ков, 1969, АЯтхояин л до,, 1£В9, Дианова, Салганик, ЬБ9), то накоплению низ ко м о ле лу л лр ни х соединений в ответ на стрессы отвода тоя как 6ir вспомогательная роль. Однако в настоящее вромя трансформируется взгляд на низкомолекуллрнне 'соединения; как на субстанцию, выполняющую лиыь осмотические и пластичеокиа фуиюшч, появляются сведения, о протекторно« (¡Пешкова, I£33, atrás, нияезг, 1986, Oaífery ut nl.»IS8S, Schvab.dAÍi, 1990 ) й регулярной руг ли этих cjединений, их влиянии на метаболизм в целой (Зйдуо, 1977, Трупов«, 1979, ЭльЗерохеш, Дарвелл; 1965). £С числу ризшмелекут лярних соединений, накг.пдкващихоя при стрессах, оьноснтся сво-

бодние аминокислота, пролин, низкошлокулярные пептиды, рибооомо-нонуклеоовди, растворимые углевода. п?и это»: накопление растворимых углеводов имеет две характерные особенности: оно является крайни неапецифическим, т.е. индуцируется стрессами самой различи ной природы и М0К31 достигать огромных количеств, в ноюторнх случаях до 60 £ массы сухих вешеств растения (Трунова, 1979). Однако кисмотря на го, что связь ыьнду накоплением Сахаров, адапта-цизй и устойчивость» растений изучается в течение ыногъх десятилетий (Туманов, 1&40Д979; Максимов, 1952; Трунозз, 1&79), представления с функциональном■ значении гидролиза полимерных углеводов и накопления низко молекулярных их уорм при отрессовых воздействиях различной природы до сих пор носят дискуссионный характер, так, известно, что степень «о ро зо ус тойчив о ста растений не всегда коррелирует о содержанием в них рестлоршшх углеводов (Ли, Палта, 1583, Каоперока-Шиач, 1983), остается неясным фигиологическия смысл накопления сахароь при стрес<®х, не соггроюкдаведхся осмотическими эффектами - тепловых воздействиях, заражении патогенной микрофлорой, гипоксии, поранении и да. Существуют точки зрения, ооглаоно которым активация гидролаз, в т.ч. кг та лизирующих,распад .углеводов, является результатом нчрушедая структурной организации клеток (Блехман, 1985; 5раун, Ыокенок, 1967)* Для оценки физиологической роли стрессиндуцируемого гидролиза полимерных углеводов и. накопления простых Сахаров необходимы сведения об особенностях проявления активности соответотвуидих, ферментов и механизмах их регуляции. -

Ключевым-гидролитичпекы/ ферментом углеводного комплекса тканей озимых элаюв являетоя иньертьза (^ - О - фруктофурано-зид-фруктогидролаза, К.Ф, 3.2.1.26). Однако сведений о проявлении активности инаедеазы в условиях стрессов различной природы, механизмах ее регуляцш! и вкладе в гидролитический рассад олигосахари-дов, которые ба позволяли оценить физиологическую роль стрессин-дуцируешх преобразований в углеводном комплексе, недостаточно.

Цель, и задачи работы> Цель настоящей работа состояла в сравнительно-) изучении особени.оотей проявления активности инвертазьг, превращония растворимых углвьодов а оценке апологической роли . этих преобразований в озлмнх злаковых растениях (пэеняца, рожь) в условиях холодового и солевого Ьтрсосой. В овязи с этим были поставлены с^духщае тадачк:,-

- установить пределы и вреыеыше параметр« изменения активное™ инвертазн и содержания'растворимых углеводов в тканях ко-леоптилей и узлов курения озимнх злаков а зависимости от напряженности холодового и солевого сгрессов; *

- изучить вклад процесса новообразования ферментного белка

и систем юдуляции существующих молекул энзиьл в изменение актив -ности шгаертазы с условиях гипотермии к засолешя среды;

- изучить зависимость мекду морозостойкостью озших культур и особенностями проявления активности кнвертаэа;

- исследовать влияние экзогенных Сахаров г.а устойчивость растительных тканей к солевому стрессу в связи с активностью инвертазы.

№.учная новизна, Проведенные исследования позволяй установить, что увеличение активности инвертазы в тканях злаковых растении (кол^опгали пшеницы, узли кущения пшышщ и ржи) и накопление растворимых углеводов (в основном редуцирующих Сахаров) в ответ на ходадозой и солевой стресси происходит только при суб-летальнлх (не. вызывающих видимых повреждений) воздействиях и но является отражением деструктивных процессов метаболического са-мопевревденкя, а имеет,- вероятно, эацитно-адаптационное значение,

Ингнбиторн ш анализ, .а такае изучение динамики и особенностей проявления активности инвертазн позволили сделать заключение о том, что изменение активности этого фермента в отвзт на гипо-трешш и солевой стресс в тканях колеоптилеи и узлов кущения происходит независимо от работы белоксинтезнруыцего аппарата клетки,

установлено, что для морозостойких сортов озимых илаков характерен низ^ил уровень активности инвертазн в период закаливали л низкими полокителышми температурами и резкое его повышение в отзет на действие отрицательных температур. Впервые'проведено специальное исследование действия'отрицательных температур на температурное характеристики инвертазы (онергид активации, фоуиа кривых Аррешуса, териоатабнльиость) и установлено наличие адаптивных изменений фермента, приводящих к повышению его активности в низкотемпературной .зоне.

Вшдлзнние высокая скорость акт ива ци» ииьиртазц а ответ т неблагоприятные воздействия, защитное влияние.Экзогенных сэх&ров при солевой, холодовом ¡1 других стрессовых воздействиях являитдя доводом в пользу йродиодокеккя о лилвдунадиощлымй роля рас»?»-

- ч -

р:шых углеводов.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования позволяли сделать заключение о нэлн'пц; определенной связи ыекд;- активностью йнвертазы, ее т№пературтми характеристиками к процессом за.:ал!гьания растений к холоду. Динамика активности ншчртаэи в фактораетлткых условиях закаливания и. при крконагру-згах определенные офаэом коррелирует с морозостойкость» растений и может быть использована как доголнигелышй био-химичес»;!* критерий для характеристика устойчивости озимых злаков к наэкпы отрицательно температурам.

При изучении влияния со левого стресса на активность йнвертазы и превращение растворимых углеводов в колеопталях поенида установлено» что дозовий эффект ИеОЬ в среде на эти показатели метаболизма растворимых углвводов юке т. служить маркером действия солевого стресса.

Активность иквортаэн и превращение растворимых углеводов в ■тканях злаков когут быть использованы как дополнительна'! 'критерий" оценки р#ектавиости агротехнических способов, повышения морозо-и оолйустойчивости растений.

Дпообация работы. Основные результата исследований были доложены на 17 Респуоликанокой конференции молодых ученых "Интен-сийя кавдя агропромышленного производства на современном этапе" (Баку,; 19£б), П съезде ЗО&Р (Шнек, 1У90), Всесоюзном совздании "Клеточкие Мзханиз>ш адаптации" (Чернигов, 1991), конференции молодых ученых "Изучение и рациональное использование природных ресурсов" (УЧ^:, 1991), отчм.ных научных конференциях г.рофессор-ско-прсподавате л ьско г о состава Карьковского госагчоуниверсиаета (1986-Г9Г1 кг,)* Б. законченном виде работа доложена и обсуждена на расширенном^ езшшрв'лаборатории ; эимостсйкости № РАН (19Ь2).

Публикатш,т Но теме диссертации оаубликовано 14 печатных работ. ... V; , , '

Структура и обьзм работа. Диссертация и зло гена из 146 стра-ннках машпнопиоао/о текста к состоит из введения, обзора' литера-^ тури, описания объектов а ыетидэв исследования, изложения поду-ченяюс результатов и их обсукдення, выводов к списка яоюльзован-ной литерьтуры. Работа содержи« 29 рисунков и 5 таблиц. Список 1 цнтлруемой литература вклечппт 220 нгтпйиовакнй, из которых 99 на иностранных яадо®к. . -

- 5 - "

ОВяЕШ И НЕВДУ ДОСЛВДОВАйИЯ

Э исследованиях использовали отрезки колеоптилей озимой ше-ницц. Ответные реакции этой растительной модели на стрессы определяются преимущественна меточными механизмами реьлстентности (Мелехов и др., 1983), Ряд серий опито! проводили о этиолированными проростками пшеницы-и взросл цеш (¿сза курения) растениями пшеницы и рки, используя сорта, различающиеся по морозостойкости.

Гипот-рция. Холодовое закаливание кол=оптилей осуществляли при температуре 2 °0 на 12^-ном растворе сахарозы Станов, 1972) с добавлением даницьллина (100 тио ед/л) в течение 7 сут. После закаливания колеопглли оялыва.и хододноД дистиллированной водой от инкубационного растъора и поиещали в шлеру о отрицательной тенперач'урой, которую сникали отунечаго. Ингибитор биосинтеза белка вдклогексимид вводили в холе опили путец добавления в раствор сахароз:-;, на котором осуществляли йакалшзаниз, В р„де опытов .использовали 1,5-меоячние взрослые растения озимой теииде, выращенные и почве ади температура 18 °С (днем) и 13 °С (ночью). Накаливание интактных растений проводили па водб или раотворз циклогексимида при температуре 2 на с^ету в кондлционированней камере ШТ-1 в течение 7 сут, ж ела чего помещали в камеру с заданной отрицательной температурой.

Солвеои стресс. Предварительно отрезки колеопгилей по из щади во влажную камеру на .¿ильтроЕальную бумагу, увлажненную средой инкубации, состоящей из ^юсфатно-цитратнош буфера (К^Ю^ -1»764 г/л, лкмоиная кислота - 1,019 г/л (рН 4,9), сахарозы - от О, до 2 I и пеннцклчшш - 100 тыо, ед/л (МЛаеЪ, ПНесй, 15 56) и ввдерюгаали на среде 1$ ч. Солевой стресс создавали путем введения в среду инкубации хлорида натрия в определенной концентрации, Контроль - среда без наСО.'« В опытах по изучению действия ингаби-родания биосинтеза белка на активность инзертазц в среду инку^а-ции колеоцтилей добавляли цимо^ехедаид (г мг/л).

Степень поврекдения юлеоптилей после холодоього и солевого стрессовых но здействий определяли по возникновению г.ег.ротических участков (Мельхов, 1983), повроадешд ингактных йзрослых райтшмй оценивали по прекращена» способности к росту , в поете'фес оовнй период (Полгарев и др., 1386)/ :. , ' '

Определение активности.ццце^ааан. содйвжвнзя Сахаров и белая.

- 6 -

ткана колеопгилей или узлов /.учения гомогенизировали на холоду в средо следуюцаго состава (KrtaVuai etolí&BS): 20 мМ .¿юсфатньм буфер (рн 6,lj), I i:H ЭДТА, I мМ дигиотреитол, 0,1 мМ феиилметил-сульфо;:и&рлюорид.'Операции по разделению растворимой. и связанной инвертазн, определение активности фермента, 'содержания раствори-ммх углеводов и слигосахадаов проводили по методикам, описанным рснее (Арасимспич, 1972; Кол/пгиз и др., IScS; Иолупаев, Сиооев, 1990).

Суммарны.! растворимый белок экстрагирсв? ли из тканей колеоп-тилей .трис-глициновьи буфером (рН 8,3) и определяли с помощь» мембранных фильтров "Б^тцюг-б" (Чехосло^кия) с последующим окрашиванием амидмзарцо« ( Schaffnor, Tfotвстал, 1973).

Статистическая обработка результатов опытов. Вое представ-, ленные в работе опыш проводили в необходимой пэвторности. Различия ме),;ду вариаптпм;!, кроне специально оговоренных, достоверны при 5>%~нои уровне значимости. Ся^гисгическую обработку результатов проводя ля но стандартны«! методикам (Лапш, 1973).

рвапь^ш и обсухдеше ■

Гидролитическое расщепление полимерны): углеводов и накопление их pncTBopiraaz форм в ответ на стрессовые воздействия по феноменологии находится в одном ряду с такими событиями как накопление свободных аминокислот, яролина, рибозомононуклеозидов и других низкомолехулярных соединений. В то ив время содеркаилв растворимых углеводов.в растениях при стрессах и адаптации к ним достигает значительно больших количеств по сравнению с дугами соединения»« (Трунова, 1979).

Накопление углеводов в растениях, их превращение я образование осмотически активных форм зависит не только от интенсивности (Jo то синтеза, ко и от активности .ферментов углевидного обмена, в том числе ключевого гидролитического фермента - инвертаэы & фруктофуракозид-фруктогидролаз^). Основываясь на сведениях об участии Сахаров в стабилизации белково-липндних компонентов при стресса*, .соцровоедвдихсц Дегидратацией клеток, ыогшо полагать, что увеличение сктйвностк иивертазц и гидролитическое растепление углеводов имеют зачитно-в&агдаци онное значение (Тумаков, 1979; Трунова, 1979; ?аэтгвв,Ш.евД983; ArkavB.Etmaahaice, 1982; Bc£*sib,erxíXr 1990). В то ко Броня биологический емьгсл увеличения активности инвертазн при стрессах, первичное действие кото-

' - 7 --

рых но связано ó шчзреидоашл белгд>зих иомяоквитов клеток (I!atErt>;..bitae Tíritani» ÍS7^; long ctdei975), остается hüíWüuh, Трудно интерперо'д.ровать и дачнис o ron, что активация подола э (в т.ч. угли годного комплекса) зопровожается нарушением стоук-турнои организации клеток (Блехиан, 1985).

Еслн увеличение активности инверт&эн и усиление гидролиза олп го саха рндоа действительно я/ляетея не специей час ко и защитной реакцией, то логично окадать, что указанные измене гад должна проявляться лишь при строссових воздействиях, не аызивдвцих глубоких повреждений, характеризоваться высоко« скоростью проявления и стабилизироваться по мере адаптации к неблагоприятный условиям. Подтверждении,! этому предположению могут стать результата опчтов :ю иЕуЧешно динашим активности инвертази и сэслаьа раст-Bupiiu jx углеводов в растительных тканях в ответ на стресси различной природц (холодовой, солевой) к силы (сублчтальшш, потенциально летальной), а также зависимости преобразовании акиганос-ти фермента от белкового синтеза.

Рлпотсрмая. Из да иных рис.1 видно, ч™о холодоме закаливайте при температуре 2 °С приводило к сяикьшю активное?':) растворимой инвертази в колеоптчлях. Активность инвертази, связанной с клеточными сиен каик - несколько увеличивалась. Последнее связано, по-аидимоиу, с индукцией инвертази клеточннх стенок оахарогой, поскольку эта форма .¡¡рршвд участвует в гидролизе экзогенной сахарозы, на которой-закаливались колеоптилц, в свободном пространстве тканей и "подготовке" ее к поступлению .з клетки (Курсашв, IS76). В целом se получешше данше согласуются с классическими представлениями о накоплении. олигоеахаридоь злаковыми растениями при за кыш ваши (Тум? но и, 1979; Трунова, 1??9).

В пачальний ыомрнт (первге б-'¿Ч ч) действия отрица ильной температуры (-5 °С) наблюдалось'резкое увеличение активности ливер гази, а затем, в процессе адаптации к аошм'температурным условий, активность фермента стабилизировалась (рюД). даиныз об активности инвертаз,* согласуйся с.результатами определения содержания растворимух углеводов. Так, при воздсйстдад тецперату-14 -5 °с, несмотря на отсутствие екуогенного поступления сахаррв, с увелнчечием актллюотя иньертаэц возлегало и содержание раду-цкруищих сахароь (и-видаоку лреимугцевтззейно ионосахаридов) (рис. I). • ' ' •

Рис.1. Динэ.'Ш:а активности ккЕзртазы в колеоптмлях пшеницы в уоловйях гипотермии I и 2 - соответственно растворимая и связанная иввертаза (Е), 3 - редуцирующие , оахара (иг/г)

Аналогичные данные бнли получены и при изучении динамики активности инвертази в узла!* кушэ ни я озимой пшеницы:, в процессе ¡закаливания ьизкиыи,по;:омтеяьшми темюратургши аначител'ььт снь-жалаоь активность расгро^шой ишертазы и слабо изменялась аив-ность связанной форма г^ериенга. Снижение температуры до.отрицательных значений (-5 °С) вызывало,резкое (уже "в первые часа) повышение активности ьбеи* {ю^ы ичвертазы. .

Известно, что пра тирладпптеции раса'вний может иаиенятьон температурная вавиоишоть .активности ферментов (воЪсгйе, 1967; Александров, 1985$ Хочачка, Соеерб, 1983). ..

',:•'• Для изучения во аыохных «дативных ивнеьений инвертаза бала исследоюнд «емиературшя аамркдооть аьтовиостк фермента в ин-. тервале температур ¿-36 °С, что поз-эолило построить кригце Арре-' няува и реосчитаяь тоипературныехарактерютики. феуцпататавной

реакции, на кривой Арр«ни:/са (рис.2) для кив'ертззы неаакялеккых ., проростков были Шййяона три точки перетек: пс-ряёя при .13 С, .

У го-

Рис .2. Кривив температурно» зависимости акяиности рь смори-мой инаертазы (1$ ) колзоптилей пшеницы (в координатах А^скиуса); К - контроль, незакаленные проростки; I - после 7 сут. закаливания; Ц - после I сут воздействия температуры -Ч...-5 °0 '

вторая при 32 °0, третья совпадает с температурным максимушм (36 °С), шеле «ьирого начинается т&цловая денатурация фераен-та. После закаливания пологеьио точек перегиба почти не изменялось, хоъ-я угол наклона низко температурного участка криво,' уменьшался, что свидетельствует о спшеи.ш анергии актиъащш (¿а) и •температурного коэффициента (&-эд) реакции (таблица). Через I сут по оде действия температуры -5 °С исчезала '¿очка перегиба при температуре 12-13 °С,наблюдалось дальнейыеь-оииаешш'Еа и О. ю реакции на киз/огч ипературизм участке кривой Аррениуса.

Перегибы на аррениусовских кршшх является внеинил проявлением гемпературно зависимых кооперативных шнуормаииошщх изменений Оелдал (Конев и др., 1970; Блшепфельд, 197 /). Цо-аидиио-му, инкертаза «□леоги'алец, подверцчихся действию отрицательной температуры, не претерпеъаег перехода в информационное состоя-Ш1Э,характеризуйся повышеннай Еа в зоне.тэмперьтур <¿-12 °0, в отличие от фермента из колеоптидей, ае испытавши действия отрицательны:. температур, Следовательно, есть озкованца рол? г;:гь.Ч^и особенности конфврм'ацноншх перестроек расгзор«1'3" иншртазы ко-леоптилей, подпершими дейртаиц отрицательной темпер? т^ри, та^ам,

Влияние гипотермии на теипзрагурные хариктерютики растворимой инвергэзн колёоптилей пшеницы

Варианты о.чнта участки кривой Аррениуса

г - хг °с 12 - 22 °0

Е* ' %0 %0

До закаливания - - 10,7-1,2 1,90*3,14

После 6 сут закалива-

ния при 2 °С 12,6*1,8 2,26*3,29 5,£6*1,43 1,42-0,12

После 1.сут воздейст-'

вин температуры -5 °С 5,63-1,90 1,54-0,28 3,98*3,79 1,27*3,06

кккал -тль-*

что обеспечивают вне окуй активность фермента в низкотемпературной зоне.

К?к показала специальные эксперименты, в ответ на гипотермию изменялась и температурная завксимость-.ак лгвности инвертазы, связанной г. клеточнши стещяш: фермент приобретал способность сохранять высокую активность при низких полокителышх (2 °0) и отрицательных (-3...-5 °С) температурах, повивалась устойчивость к холодовой денатурации.

В связи с обнаруженными закономерностям! изменения активно о гн инвертазы в кс.леоптилях и узлах кущения пшеницы морозостойкого оо^та Альйидум НА в ответ на закаливаний и действие отрицательных температур представляло интерес изучение динамки активности фермента у сортов, различающихся, по морозостойкости. Как видно из рис.3, в от^ет на действие низких поло»!тельных температур у иорозостопкогз сорта Альбидум Цч происходило закономернее снижение суммарной активности инвертазы ь. колеоп'.:илях, в то время как у малоисрозостойких. Киминевокан 4 и Безостая I, активность фермента в процессе закаливания -практически не изменялась. Б момент окончания закаливания активность фермента у юро-эосгойкого сорта Альйидум ц4 -быль значительно ним, чей у мало-цорозосгоиких Киииневскэя 1 и Беээ.отан I.

Таким образом, при закаливании низкими полокигелгаши температурами проявилась обратная зависимость между активность* инвер-

Рис.3. Активность ин^ортазы в колеонтилях озимом пшеницы в условиях закаливания и действия отрицательных температур

тазы и шрозоого-кости) сортов. Однако при онииении температуры до отрицательшх значений наблюдалась противоположная картина» у морозостойкого сорта происходило повьшенио активно о ш фермента, в то время как у маломорозостойкнх она не изменялась и ни дяке стаилась (рис.З), Эти данные иошю рассматривать как подтверждение необходииосги динамического подход? при •исследоЕЭкчи связи мзду активность«) ^еоментов и морозоустойчиаэстьи <№ыых злаков. Следует о ты )Т1.гь, что в условиях -тИхо при огридателыых температурах реакционной среды инмертаза морозостойких сортов обладает способностью сохранить достаточно' вчеокую активность.

Мольвой отрезе. В литературе шеются'введения о павыиешш.. . иодер&анья эндогенных' Сахаров в отвег на обжоак отреое (Ка1у-эем;о а 1Э8б;г^Лав1х,гха№ара.зеп,7Уе9). "Зьесте о тру, действие экзогенных сахара на солеустоичивость множительных клеток спецааиьно практически не-исмедоаалось, несмотря ьз очедааднум

простоту и информативность этого приема. Специальное изучение слияния прелинкуйции колеоптилий. на буфере, содержащем различные концентрации сахарозы на их устойчивость к по'от едущему засолению показала, что пре;.;ыикубащш колеопгилей на.сахарозе покшала их вышшлдие в условиях потенциально летального солевого, стресса Н&01 ) (рисЛ).

^оо-

69

ао

0,9 г,о

Q

45" £0

Кснцешчрециа слгхг/jcjfte, '/„

Рис.Влияние предынкубации на растворе сахароза на устойчивость колеоптиле!! к посакдуоцему засолении: .А и Б соответственно воздействие 2 и 3>-нэго BaOl.

В дальнейшем, при изучении действия солевого стресса на активность июзэрпзы сравнивали ответную реакцию голооптилек пред-ынкубицыавшхся соответственно га буфере с сахарозой или без нее.

Изучение действия засоления на активность инпертазы показало различный характер изменения актквдасти фермента в завгсимостц от концентрацик ггаЯ. в среде инкубация юлеоптилеч (рис.5). Так, после 2ч-часового воздай от ей я солк без предварительно;" инкубации колзоптчлtîî на буфере, содеря?цем -сахарозу, активность инвертазы в варианте с HatJl бала значительно пыюе, чем в контроле.

В то же зремя такое же по ■ продолжительности воздействие З3-кого Bad , назшшщее пэвреждёние час'тч ко.геоптилей (потенциально летальный сгреао)»сопрсвимдало'сь решил падением активности $ермеп-

- 13 -

та, которое наблюдалось задолго (за 10-14 ч) до появления видимых повреждений.

В другой рерии опытов изучали действие Ие.01 на активность инвертаяы в колеоптилях, прошедших 16-часовую предынкубещш ка буфере, содержащем сахарозу.. Через б ч инкубации на растворах, содержащих как 0,5, так и 3$ КаО! отмечалось значительное увеличение активности растворимой инвергазы. При это« в варианте о ВаСЯ. активность была-вьше. Через 24 ч воздействия' З^-ного раствора ИгС1 колеоптили, прошедшие яредынкубацию па буфере с сахарозой, не имели видимых повреждений, однако активность янвертазы в них была на' уровне: контроля или несколько ниже. В варианте с 0,51-ным .активность инвертаэы (особенно вне-

клеточной формы) была выше, чей в контроле (рис.5), следовательно,

Рис.5. Действие засоления среды инкубации на активность инвертазы в колеоптилях-шеници (с.Альбидум П^). А,Е - активность инв&ртаза в условиях воздействия . солевого стресса соотвезртвенио без предынкубации и после 16 ч прздыккубацяи га буферной среде: 1, (1- определение активности через 6 и 2И инку-бапии на засоленнрй среде ооогаегствзнно. Светлее столбики - растворимая иквертаза, темные - связанная инвертаза. ,

- в -

активность инвертазы в ответ на солевой стресс может изменяться как в направлении увеличения (при относительно слабом сублеталоном стрессе), так и в направлении уменьшения (при потенциально летальном стрессе).

Таким образок, результаты изучения действия разных доз солевого стресса мо1уг служить аргументом в пользу предположения о той, что увеличение инвертазной активности не является о траке щей деструктивных процессов, сопровождающих гибель тканей, а выступает,вероятно, как одна из составляющих комплекса защитных реакций. В связи с этим следует заметить, что в умовиях 1» Tri.tr«) как показали специальные опыты, хлорид натрия практически не действует на инвертазу из колеоптилай пшеницы, ...

Рис.6. Действие сублетального и потенциального летального стресса на содержание., (иг/г сухой массы) Сахаров в колеоптидях пшениаи ! - моносахариды, 2 *-\олигоса-хариды, 3 - суммарное содеркание растворимых углеводов,.

Сопоставление содержания олаго- и моносахаридов в колеопти-лах* подвергнутых стресс'аи разной силы показало, что в условиях относительно слабого, солевого стресса (0,5^-ный Нас1 ) юли-Честао моносахаридов было! выше', чем при воздействии потенциально

■ 500

и - ■ V»*'

Концентрация %

- 15 -

летального стресса (3^-нын НеОХ ). Содержание олигосахаридов оказалось более высоким в варианте о потенциально летальным, стрессом (рис.6). Полученные результата, по всей вероятности, свидетельствуют о том, что в условиях потенциально летального стресса нарушаются системы метаболизации олигосахаридов, в том числе экзогенные поступающей сахарозы. По-зидимому, для положительного действия Сахаров на солеустойчивос^ь необходим не столько их наличие . в клетках, сколько достаточно интенсивная метаболизация.

Возможяне механизмы изменения активности иивертазы в растениях пшеницы в условиях стрессов.

Общие положения-о типах механизмов регуляции обмена (Юровиц-кий, Мильман, 1976), а также сведения об изменении активности ин-вертазы у ряда растений при охлаждении .(2гвввуг 1966; ¿ofcerts, I&75,' 1981), освещении (КгЬзЬпав et pi., 1985) и под влиянием, других факторов (Дубинина, 1982) позволяв? предполагать следующие пути регуляции активности; I) изменение количества фермента в ткани и преобразование иэоферыентного состава; 2) регуляция каталитической активности ухе -существующих• молекул фермента; 3) изме- . яение активности фермента вследствие взаимных переходов его растворимой и связанной с клеточными стенками форм, -

Для изучения причин изменения активности инвертазы в колеоп-талях паегаца и в интактних растениях в процессе криоадаптации и действия отрицательных температур, а также при-солевом стрессе, использовали ингибйторныЙ метод. В качестве ингибитора белкового синтеза применяли циклогекскнид (ЦТ)» . • ,

Гипотермия. Опыта о применением ЦТ пока.затм.чго ингибитор несколько замедлял скорость снижения, активности растворимой ин-вэртай в начале закаливания полоеттедьнымл температурами, однако, практически- т влиял на'величины активности этой формы фермента, наблюдаемые в конце, периода закаливания, а также на.динамику активности инвертазы клеточных стён'ок в процессе закаливания на растворе сахарозы (рис.-;7), ЦГ существенно не влиял й'на повышение уровня активности растворимой а связанной форм инвертазы в начальный момент действия отрицательных температур. Вместес тем, после 3 сут действия отрицательной температуры в отдельных опытах серии на фоне обработки иолвопгалей антибиотиком наблода-лись более низкие, чем в контрольном варианте, значения активное-' ти обеих $«рм инвертазы-(рис. 7). ■ ■'-.'

Рис, 7,Изменение активности (Е.ык моль сахарозы сухой

наосы «мин-*) растворимой (1,2) и связанной (Э,Ч) форм инвертазы колеоптидей озимо!! пшеницы в процессе закаливания: А - опцг I, Б - опыт 2:1- закаливание при 2 °С, П - воздействие - 4...-5 °С; а,б - контроль (без ЦГ), в, г - опит (ЦТ, 2 мг/л).

Подученные результаты дают основание полагать, что резкое увеличение активности инвертазы, которое наблюдалось в ответ иа действие отрицательной температуры (рис, 7), может происходить независимо от новообразования белка. Однако для поддержания активности ферме нза на оптимальном уровне в течете длительного времени, по-видимому, необходимо образование ферментного белка, которое, хотя и медленно, ио может происходить пр;* отрицательных температурах (Петрова, 1984; Бочарова и др., 1987). Необходимо отметить, что ЦГ, оущеотвенно не действуя «а характер изменения активности инвертазы в шлвоитклях при закаливании и охлаждении до отрицательных температур, оказывал замег-ное ннгибируодее влияние на накопление белка и развитие морозостойкости.

Опыты о интсхтныыи раотешями, находящимися в фазе кущения, показали анадогичныз результаты: наличие ингибитора практически не .влияло на характер изменения активности растворимой и связан-

- 17 -

ной инвертазы в тканях узлов кущения, как в процессе закаливания, так и в ответ на действие отрицательных температур. После Э-сугоч-ного воздействия температуры -3 °С активность растворимой инвертазы в варианте о ЦГ была несколько ниже , чем в контроле; активность связанной формы фермента в контроле и в варианте о ЦГ су- • . щественно из различалась.

Следовательно, можно полагать, что в узлах кущения озимой пшеница регуляция активности инвзртазн в ответ на низкотемпературные воздействия осуществляется -незавиоимо от работа белоксинте-зируюяего аппарата. При длительном ке действии гипотермии в поддержании активности на. оптимально« уровне, по-видимому, шгуг • участвовать механизмы, связанные,с новообразование»! ферментного белка.

Солевой стресс. Обработка колеопгилей ЦГ за б ч'до'солевого стресса и последующая инкубация на растворе ангабиотшса во время стрел са практически не влияли на уровень янвертазаой активное та, наблюдаемый через 5 ч действия Жа01 (рю.8). В *о же время через 21 ч солевого стресса активность инвертазы в обработанных ЦГ ■ колсоптилях была ниже,- чш в контрольных (рте.8),

Ю

50,

50

т

I

ш

Рис.н. Влияние ЦГ на обцув активность инвертазы (К) в. колеоп-тилях шеиицы в условиях оолевогострессз: I - контроль (до стресса); П.-,5 ч воздействие 0,5?~ного Яв01; И - 24 ч воздействие 0,5&-к>п> УейХ > Светлые стояби-мк - без ЦГ» ааштряховашшв (ЦГ 2 мг/я)

- -18 -

Таким образом, характер ответив реакции фермента на обработку ЦГ при солевом стрессе во многой годе бек реакции на действие антибиотика при гипотермии:'обработка ЦТ ш сказывалась на увеличении активности инвертазы в оавет на. стресс (в первые часы), но приводила к некоторому снижению активности фермента по сравнению с контролем после более длительного воздействия солевого стресса (24 ч). Можно полагать, что в колеопмлях пшеницы регуляция активности инвертазы в ответ та засоление, происходит за счет механизмов, не зависимых от-работы белоксинтезирущ'ей системы, поддержание ке активности, фермента при длительном действий солевого стресса на определенная уровне осуществляется о участием мехашз--нов, связанных с ново обра зо вашем молекул .¿зрмента.

Возможность независимого от белкового синтеза увеличения активности инвертазы в ответ на стрессовые воздействия различной природы (холодовой и солевой стрессы) дает некоторые основания предполагать существование специального (специальных) механизма быстрого "аварийного" ответа углеводного комплекса на стресс. Природа этого механизма пока не ясна. С достаточной определенностью мокко говорить о том, что указанные айекгц не могут быть только резулыатом перераспределения растворимой и связанной с клеточными стенками форм инвертазы, поскольку при стрессовых воздействиях'* одновременно повышается активность обеих форм фермента. По-видимому, изменения активности инвертазы при хол'одовых воздействиях могут происходить за счет перехода латентных форм фермента, сведения о наличии которых получены для ряда растеши, включая злаковые (1адев,.1Ге1а<т , 1971; Бурахаиша и др., 1967.), а активное состояние или изменения каталитической активности уие существующих молекул фермента в результате их информационных перестроек (ва1хаег, • 197*»;' Александров, 3985).

Таким образом, можно полагать,'что стрессиндуцируемое увеличение активности инвертазы, будучи не зависимым от работы бе-локсинтезирующей система, по-видимому, не требует серьезных энергетических затрат клетки, характеризуется высокой скоростью актлва-ции и стабилизируется; по мере адаптации к стрессу, т.е. соответствует прпзнакам цереотроек метабо; лзма, выполняющих защитную-роль (Мелехов, 1985).

; " . . ЗАКЛЮЧЕН^

'•".'• Обнаруженное увеличение активности и не ер та зн в раем тельных клетка?, которое происходит в начальный момент стрессовых воздей-

- 19 -

отвий и сопровождается накоплением проегах Сахаров, находится, по-видимому, в одном ряду оо стрессиндуцируешм распадом биоголи-иерсв различной природы (крахмал, белки, нуклеиновые кислоты) и накоплением соответствующих, ннзкоиолекулярннх соедииеняй. увеличение активности ишзертазц в колеоптилях и интактных растениях в ответ ¡и стрессовые,воздействия (отрицательные температуры, засоление) характеризуется высокой скоростью проявления и происходит,, очевидно, независимо от'функционирования болокеннтезирующзго аппарата. Слздует отметить, что, и другие аналогичные процессы-гидролиз крахмала (leer , 1973), деполимеризация РЖ (Блехман, 1979), гидролитический распад белков (Вовчук и др,,1991) могут, . 1эк свидетельствуют лигерагурные; данные, происходить за счет изменения активности, а не синтеза соответствующих ферлентов. В связи с этим мокио полагать, что высокая скорость активации гидролитических ферментов углеводного обмена имеет глубокий физиологический смысл, поскольку обеспечивает быстрое накопление растворимых углеводов в "аваришшх" ситуациях, когда еще не произошло развертывание глубоких адаптивных преобразований, связанных с (уункциопальной активностью генома. ■ ' ■

Вероятней ход событий в. клетках, в которых принимают участие гидролитические, фермента, шкет быть следующим. Одной из раншх реакций клеток на стресс является гидролитический распад биополимеров, который приводит к накоплен!» в клетках соответствующих ннзкомолекулярннх соединений - простых Сахаров, аминокислот, про-линэ, ¡шзкомолекулярных пептидов и т.п. Физиологическая роль эткх соединений, m-видимому, по лифу 1шци ora льна. Бо-першх, все эти вещества вносят определенный вклад в осиорегуляций (предотвращение чрезмерного обезвоживания) при ртрессах, сопровождающихся дегидратацией клеток. Простые сахара, го-видимому, вносят наибольший вклад в водоудериивающу» способнойть клеток, поскольку их концентрация монет на порядок превышать содержание других ннзкомолекулярннх соединений (Трунова, 1979; Рощупкин, .1991).'"Наряду с другими низкомо-лекулярныни соединениями, в частности о пролиноы, растворимые углеводы оказывают нряаое протекторное действие на белково-липидные компоненты клеток,аанещая воду в этУк структурах в условиях потери гидратного округ,® гая при стресса х, оопроволдаоцихся обезвокизанием ( S'tras, навек , 1986; Cafferr etalv»: 1988). Протекторное действие на белки, в частности на 'фермента, по всей вероятности, сопрс-

- го -

вождается стабилизацией их конфорызвд и, как следствие, неюто-рш снижением их активности ( сао ¿и, 1970). Такое стабилизирующее действие Сахаров на ферменты, по-видимому, шьет приводить к замедлению метаболизма клеток в целом. В атом мокет заключаться одна-из ре гуля торных функций растворимых углеводов. Кроме того, стабилизирующее действие Сахаров, вероятно, несколько сникает дыхание и интенсивность энергетического обмена клеток (Шлотковсклй, Жесткова, 19б1»), По-видиноиу, виитактной клетке сахара в комплексе с другими низкомодакулярнши соединениями (пролин, свободные аминокислоты) илут*прямо-влиять на ..синтез белка путем стабилизации (ограни чеыня) активности соответствующих ферментов и а перге ти-•чео'кого о&ена, а теине опосредованно,- путем изменения гориональ-, но го баланса, ¡Сак из^еотио сахара способны изменять бала но фато- , гормонов в пользу ингибиторов (Ильянук,. Лихолат, 1988), сникать количество свободных ауксинов (Туманов, Трунова, 1958) и других активаторов в кдетках, образовывать ксиыргаты о ИУК (Полевой, Саламат ова, 1991). Вое перечисленные преобразования, по-видимому, приводят к замедлению ключевых анаболических реакции , и как следствие, ростовых процессов, соцровоадашцемуся повышением устойчивости, что и наблюдается при закаливании и адаптации растений к различным стрессовый воздействиям.

. ; ВЫВОДЫ .

I. В тканях, озимых адаков (колеопгили, узлы куцения) в процессе" закаливания положительныш температурами происходит снижение активности инаертазы, а в ответ на действие отрицательных тецпера-тур отмечается резкое повышение активности растворимой и связанной форм фермента я накопление растворимых углеводов, Зти явления имеют иеото уже в первые часы действия, низких температур.

, 2, £ период закаливания « действия отрицательных температур в растениях пшеницы происходит преобразование температурных характеристик растворимой иквертазы (унёщиение величины энергиь активации, изменение формы кривых Арреаиуса, вкииенш тестабильности ), что приводит ж увеличении каталитической активности фермента в низкотемпературной зоне.

3.Уйблмете актавцосзя инвертазл связанной с клеточными стенки Ш1 В: коле он тилях пшеннци в-ответ на действие отрицательной температуры сопровождается повышена ей стабильности фермента к хо-лодовоИ. денатурации и изменением температурной зависимости актив- .

ности фермента.

Для морозостойких сортов озимых злаков характерен низкий уровень активности инвертазы в период закаливания низкими положительными температурами и резкое повышение активности фермента в ответ на действие отрицательных температур. При этом инвертаза морозостойких сортов обладает способности^ сохранять In. -тИ» активность при низких отрицательных температурах.

5. Умеренный солевой стресо,'.как и действие отрицательных температур, приводит к повышению активности инвертазы в колеопти-лях пиеницы й усилению шлролиза ди-и олигосахаридов. Изменения . активности инвертазы наблюдаются уже в первые часы действия Kaöi. Потенциально летальный солевой cjpecc приводит к падению актив- • ности фермента. В условия* Iä-vt-tro хлорид натрия не оказывает существенного влияния на активность инвертазы пшеница. •

,6. Изменение активности инвертазы и преобразование углеводного состава в ответ на холодов ой и солевой стрессы происходят, по-видимо иу, независимо от синтеза белка, поскольку, не подавляются циклогексимидом. В то же время в условиях длительных стрессовых воздействий для поддержания активности.<|ерыента на оптимальном •уровне необходимо функционирование белоксинтезидеющего аппарата.

7. Высокая скорость активаций инвертазы. и гидролиза полимерных углеводов в ответ на неблагоприятные воздействия, защитное ■ влияние Сахаров при хододовои, солевом и других стрессовых воздействиях являются доводом в пользу предположения о полифу'нкцио-наяьной защитно-адаптационной роли растворимых- углеводов, аакап^ лияае»нх . nj» стрессах. .

СГИООК РАБОТ, ОПУБЖЮ ВАННЫХ ПО ШЕЕШ1ДО.ДИССЕРТАШИ

1. Снсоев Д.А., КолупаевО.Е. ДйнаниКа активности f> -фрукта-фуранозвдазы при криоадаптации сортов озимойпшегащы, различающихся по морозостойкости. - Харьков, 1986. - 17 о. Деп. в ЗШИТЭИагроярома 31.12.86. й ИП В0-8б:Деп.

2. Колупаев D.E., Иванова Б.Н. Возмовные механизмы язмэнвния акчявнооти и температурных параметровраотворимойиквертазы озимой пшеницы при закаливай;™ и хрюсдеессах // Тез.докл.цг Респ. конференции молодых ученых "Инйясифякашм агропромышленного производства на современном &тапви. - Баку. 19(38.-Ч.!.1-®.128-129;

3. Сысоев J. Л., Колу паев Йанойло Т.А. Влияние хотодово-

- 22 -

го закаливания на терырстабильнос ть, в температурную зависимость активности растворимой инвертазы озимой пшеницы. - Харьков,1938.-Деп, в ВИНИТИ 22.03,88. JS 2213. - В 68.■

4. Сысоев Л.А., Колупаев Ю.Е., Цанойло Т,А- Температурные характеристики растворимой инвертазы озимой пшеницы в процессе хо ледового закаливания // Физиология и .биохимия культ .растений .-■ 1989, - Т.21, й 2; - C.I78-I82.

5. Борисенко Л.Р., Рябчун H.H., Колупаев 1).Е, Активность и температурные характеристики инвертазы узлов кущения озимых культур в период закаливания' и перезимовки // Селекция и семеноводство. (Киев), -. Ь989. JS67, -С.56-61.

6. Колупаев D.E., Сысое? Л.А. О возможной физиологической роли я причинах изменения активности инвертазы колеоптилей пшеницы при действии низких температур. - Харьков, 1909. - 32 с. Деп.

' в ВИНИТИ 15.08.89. й'5497.' - В 89. ■

7. Колупаев Ю.Е., Сысоев Л.А.. Ыанойло Т.А., Костенко И.В.

О возможных механизмах изменения активности инвертазы колеоптилей пшеницы при холодовш закаливании // физиология и биохимия культ, растений. - 1989. - T.2I, й 6. - С.560-566,

8. Виленский O.A., Колупаев Ю.Е., Сйсоев л.А. "Пградоксаль-ное" действие ингибиторов биосинтеза белка на устойчивость колеоптилей пшеницы к потенциально летальным осмотическому и тепловому стрессам. - Харьков, 3990, - 22 с. Деп. в ВИШИ 22.07.90J2 3900. В 90. .

9. Колупаев Ю.В. О возможных причинах изменения активности . инвертазы колеоптилей пшеницы в условиях гипотермии // Второй съезд Всес, общ-ва физиологов растений (24-29 сентября 1990 г., Минск)! Тез.докл. - М., t990. - С.45,

10.- Колупаев Ю.Е., Сысоев Л.А. Действие гипотермии и агентов солюбилизации белков на внеклеточную инвертазу колеоптилей пшеницы // Физиология к биохимия культ.растений. - 1990. Т.22. й 6. -С.566-572. ■ /.

11. Борисенко 31.Р.,' Колупаев d.E., Рябчун Н.И., Полтарев E.U. Независимое от биосинтеза белка изменение активности инвертазы в узлах кущения озимой пшеницы в условг .х гипотермии // Физиология

и биохимия кудьт.растений. - 1991. Т.23, ii I. - С,Ь8-64.

. " 12. Колупа&в.Ю.Е, Ослаблзние потенциально леталышх поврежде-гай. ¡растительной клетки при действии ja нее циклогекецшда и .хло-рамфе'никола: Теа.докд.и сообц. Всеоогз .совещания "Кльточцис аеха-

- 23 .

ниэмц адаптации" // Цитология. - 1991. Т.ЗЗ, » 5. - C.I08.

13. Колупаев Ю.Е., Виленский. С.А., Сысоев л.А. Действие солевого отресса на активность инвертазн и содержание растворимых углеводов в колеоптияях пшеницы // Физиология и биохимия культ, растений. - 1991. - Т.23,'ЯЗ. - С.267-274.

14. Колупаев D.E., Виленский G.A., Сысоев Л.А- Защитное действие ингибиторов биосинтеза белка на растительные клетки при потенциально легальном осмотическомjotpecce // Физиология и биохимия ■кульг.растешй. - 1991. Т.23, Ä - С .375-381.'

Яодтсано к печати 17.07.92. Формат 60x8^Vl6. Объем: 1,0 уч.-изд.л. Тираж 100. Заказ 18? ...

участок оперативной печати Харьковом)го государственного аграрного университета и«. В.В.Докучаева. 2I£I3I, Харьков,, п/о "Коммунист-!".