Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Сравнительное изучение способов оздоровления картофеля от вирусов в культуре ткани

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение способов оздоровления картофеля от вирусов в культуре ткани"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА им. Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

РОГОЗИНА

Елена Вячеславовна

УДК 581.143.5:632.911.2

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБОВ ОЗДОРОВЛЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ ОТ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ

Специальность: 06.01.05 — Селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена во Всесоюзном НИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Научный руководитель: кандидат с.-х. наук Трускинов Э. В.

Официальные оппоненты — доктор с.-х. наук, профессор А. Г. Зыкин; кандидат биол. наук Э. И. Ларина.

Ведущая организация — НИИКХ РСФСР, Коренево, Московской области.

седании Специализнро: ... .,020.18.01 при Всесоюзном НИИ ра-

стениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, г. Ленинград, ул. Герцена, 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИР.

Защита состоится

часов на за-

Автореферат разослан «

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор с.-х. наук

Мажоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Вирусная инфекция d среднем вызывает снижение урохал карго^ ел я на 13-2 0.5, при этом особую опасность она представляет из-за вегетативного размножения этой культуры. Основой для создания сортов, обладающих комплексной устойчивостью к возможно большему числу вирусов является мировая коллекция диких и культур них видов, сортов, селекционных клонов и гибридов картофеля ВНИИР им. Н.И. Вавилова. Однако, сана коллекция в значительной степени подвержена вирусному вырождению. Задача сохранения и изучения коллекционного генофонда картофеля с целью обеспечения селекционеров разнообразии'-! исходник материалом становится трудновыполни-мок, ввиду появления в результате вирусной инфекции различных морфо-фнзиологических отклонений, затрудняющих таксоно-" мическую идентификацию растений. В дальнейшем происходит явное вырождение и возникает угроза полной утраты образцов.' Проблема вирусных болезней картофеля требует одновременного проведения мероприятий, как по защите растений от вирусов, так и по оздоровления, лечению уже пораженных образцов. В случае полного поражения того или иного образца единственно . приемлемым становится в настоящее время широко•используемый метод культуры меристемной ткани, на основе которого ведется также современное безвирусное ^семеноводство картофеля. _

Метод культуры меристемной ткани с целью оздоровления существует более 30 лет, но и сейчас имеются определенные сложности при его применении. Главные из них: весьма низка регенерационная способность меристемных изолятов - 20а> рас-тений-регенерантов получают в среднем в культуре ia vitro; невысок, выход безвирусных растений - в среднем около полученных регенерантрв (Трофимец JI.H., 1981). Поэтому необходимо использование специальных вспомогательных приемов -термотерапии и хемотерапии, способствующих улучшению конечных результатов.

• Цель и задачи исследований заключались в изучении следующих вопросов:

I. Изучении влияния генотипических особенностей растений- ' хозяев и характера исходной вирусной инфекции на регенерацию и оздоровление коллекционных образцов картофеля методом культуры меристемной ткани.

2. Изучении влияния размеров меристемных иэолятов на виход растений-регенерантов и освобождение их от вирусов.

3. Сравнении различных методов ранней диагностики виру- ' сов в культуре ткани картофеля.

4. Исследовании влияния термотерапии в сочетании с культурой ткани, а также разных способов ее применения на развитие и эффективность оздоровления меристемных растений по сравнению с одной культурой меристем.

5. Испытании хемотерапевтических методов борьбы с вирусной инфекцией в сочетании о культурой ткани, определении их роли в развитии меристем и.элиминации вирусов. .

Научная новизна и практическая ценность работы состоит в использовании нетрадиционных способов термотерапии и ап- . робации ряда химических соединений, включая и новые, в качестве ингибиторов вирусной инфекции непосредственно в культуре меристемной ткани. Установлены оптимальные размеры меристемных изолятов в куль,туре ткани в сочетании с термообра-" Соткой или хемотерапией. Оздоровлено'.20 коллекционных образцов картофеля, полностью пораженных' мозаичными вирусами. По-т лученные в итоге безвирусные растения включены в состав коллекции картофеля in vitro, а таеде послужат источником выращивания здоровых клубневых репродукций коллекционных образцов картофеля в полевых условиях, с дальнейшим использованием их в селекционной "работе. Безвирусные клубни сорта [Мурманский переданы-для первичного семеноводства на Полярную опытную станцию ВИР и в Целиноградский сельскохозяйственный институт. ' ...

Апробация работы. Материалы диссертационной' работы доложены на научно-технической конференции молодых ученых в НИИКХ (Коренева, 1967); на научно-практических конференциях аспирантов и молодых научных сотрудников ВИР (Ленинград, I988-1989 гг.) на Всесоюзной научно-практической конференций "Основные направления, научно-технического прогресса в картофелеводстве, плодоводстве и овощеводстве" (Самохваловичи, 1989).

Публикация результатов исследований. Материалы Диссертации опубликованы в 5 работах.

Объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах

И . .

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, экспериментальной части, выводов и списка использованной литературы. В работа приведено 17 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 153 источника, в том числе - 50 иностранных авторов.

Материал и методика исследований

Экспериментальная работа проводилась с IS66 по 1969 год в Пуккинских лабораториях Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И.Вавилова. Было испытано 20 коллекционных образцов картофеля, включающих селекционные сорта Мурманский, Antares, British Queen, Dextra, Drum-mond Castle, Frau; селекционный гибрид ВИР-I; ди-

гаплоиды сортов Katahdin, Spartaan; подвид чилийского картофеля Solanum tuberosura subsp. chiloense; примитивные ВИДЫ S.curtilobum, S.tr.ammilliferum, ß.phureja, S.rybiiiii,

s.stenotomum. Методами И$А и серодиагностики било

установлено, что-изучаемый материал заражен мозаичными вирусами X, s, М, У и их комбинациями.

Работа состояла из двух разделов: опытов по термотерапии и хемотерап.ии в сочетании с культурой апикальных (Фристем картофеля. При термотерапии было испробовано воздействие повышенных температур (36-38°С) на черенки пробирочных растений и меристемные иэоляты в условиях in vitro, а также использование периода предварительной адаптации меристемных изолятов к прогреванию, В опытах по хемотерапии изучали действенность применения 13 препаратов, известных как ингибиторы вирусной инфекции. Это рибонуклеаза, ИВР, интерферон, рео-ферон, рибавирин и стероидные гликозиды: капсикозид, мелон-гозид, -никотианозид, пурпуреагитозид, сомелонгозид, солано-зид, томатозид, фитоник. В качестве контрольного варианта осуществляли культивирование меристемных изолятов на модифицированной среде Цурасиге-Скуга без термо- или хемотерапев-тических воздействий.

■ Операции по вычленение апикальных меристем проводили в ' ' ламинар-боксе КПГ-IM, под бинокулярным микроскопом МВС-2* ис—; пользуя 32-кратное увеличение и окуляр-микрометр. При выращивании меристемных изолятов.соблюдали температурный режим 20-25°С, влажность воздуха 70-8$, фотопериод 16 часов, интенсивность света 4000-6000 лк. Каждые 1-1,5 месяца осуществляли

5

пассирование меристемной культуры на свежую питательную среду.

Бр^мл получе¡iiui растений-регенерантои составляло от '1-8 до 40-!i8 педель и более б зависимости от образца. Пробирочные растения диагностировали на присутствие в них вирусной инфекции методами электронной микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА), а в условиях оранжереи - методами .серадиагностики и растений-индикаторов.

Для электронного микроскопирования готовили формваровуи? .пленку по методу Л.С.Гольдина (1953) и препараты методом погружения (Bokx de J.А., • 1972). Их просматривали под электронным микроскопом " Jam -. IüO" при увеличении в 2CQ0-3000 раз.

Для ИФА использовали наборы диагностикумов [СИИ и Института химической и биологической физики АН ЗССР. Анализ проводили в модификации "двойной сэндвич".

Серологический анализ оранжерейных растений проводили методом микрореакций (Slogteren E.van, Slogteren D.U.M.van,1957), для чего использовали наборы диагностических сывороток 1ШКХ и Украинского НИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Индикаторную диагностику УВК осуществляли механической инокуляцией соком отделенных листьев гибрида А-б и молодых растений Nicotiaim tabacua.

. Полученные б опытах результаты обрабатывали методом математической статистики'для сравнения выборочных показателей по качественному признаку методом У (Ф'О по критерию Фишера (11л охн но кия H.A., 1970).

Результаты 'экспериментальных исследований ■

I. Оздоровление коллекционных образцов картофеля методом культуры меристемноп ткани .

При выращивании в пробирочной культуре без дополнительных термо- и хемотерапевтических воздействии ¿реди коллекционных образцов картофеля наблюдались отличия по приживаемости, характеру и интенсивности развития мернстемних изолятов, выхо-■ ду растенлй-регенерантов, количеству среди них безвирусных. Результаты оздоровления некоторых коллекционных образцов Представлены в таблице I. '

Статистически достоверные отличия по выходу растений-ре-генерантов и безвирусных растений установлены как для образ-

цов разных таксономических групп (селекционные сорта и виды картофеля), так и для образцов из одной группы (между сортами, между видами, между коллекционными образцами одного вида). Полученные результаты согласуются с представленными ранее данными о различной реакции генетически разнородных коллекционных образцов картофеля на условия культуры меристем-ной ткани (Трускинов Э.В., 1978).

Изучение влияния типа вирусной инфекции на эффективность оздоровления картофеля показало, что SBK не всегда является наиболее сложным для элиминации в культуре меристе-мной ткани, как это следует Из ряда работ ( Morel G., '1968; Харченко Л.Т., 1971; Кук И.П., Горбаренко Н.И., 1971). У селекционных сортов картофеля, инфицированных вирусом S, отмечено наряду о его сохранением у всех полученных растений-регенерантов ( Drummond Castle ), освобождение 25$ растений ( British Queen ), 60$ растений (Мурманский) и полная элиминация ( Dextra ). По-видимому успех освобождения от SBK зависит как от инфекции, так и от генотипа коллекционного образца, их взаимодействия.

Вместе с тем, на основе полученных в экспериментальной работе данных выявлен факт заметно большей трудности освобождения от БЕК, чем от его комплекса с другими вирусами. У сорта Мурманский получено 60,¡5 безвирусных растений от материала, первоначально инфицированного БВК,. и 100$ - от инфицированного комплексом вирусов X +S + М; У дигаплоида сорта Gpartasn эти показатели соответственно равны 1% и, 57/2. Таким образом, традиционная точка зрения о более трудном освобождении от нескольких вирусов, чем от одного, нашими данными не подтверждается.

До 'настоящего времени нет единого мнения о том, каковы оптимальные размеры мёристемных изолятов для успешного прохождения процессов регенерации и оздоровления,' Ряд исследо- . ватйлей используют изоляты размером 0,1-0,3 ми (Трофимец JI.H.; I960; Борисенок В.Г., Адамова А.И., 1985), другие добиваются освобождения от X и У вирусов без дополнительной термо- или хемооброботки при размерах меристемнчх изолятов 0,2-0,5 мм И более (Яук И.П., 1979; Meyer К., Foroughi-•Wehr В., 1907).' Нами был.проведен анализ зависимости регенерации и оздоровления от размеров вычленяемых мёристемных изолятов, результаты которого представлены в таблице 2.

' - Таблица I

Регенерация и оздоровление .коллекционных образцов картофеля в культуре меристемной ткани

Ш Сорт, вид п/п В по ката- Вирусная инфекция Число изолятов (шт.) -Прилилось изолятов Получено растений-регене-рантов

логу всего из них безвирусных

' % % %

I. Мурмански;? 15553 X+S+M+y 43* 30 • 23 -100

S 25 72 28 60

м 27 .81 " 59 92

2. British Queen 2384 S 48 77 35 23 .

3. Dextra I048I s 23 ' 60 43 100

4. ■'Drummond Castle 278 S - 50 78 61- 0

5, Fram- 1952 х+м 49 73 • 16 33

6. Гибрид ВИР-1 s +М • 37 ' 73 37 30

7. Solanum tubero'. *sum subsp.chi- loenae 8. Дигаг лоид 7509 16777 X+S ' S 52 •• 18 . 61 83 53 100 18 7

Spartaan —П — -Х+ s 13 92 58 57

9. S.pitureja .• .15877 S +М 60* ' .86 ' ' 88 24

7928 — 24 92 54 25 -

10. S.rybinii 12703 х+м- 15 ' 93 43 17

I689I- — 32 ' - 53 ' 59 60

II. S.ßtenotomum 12962 '. • м 35 ■ 83 . 38 100... .. .

- 15824 х+м 27 85 . 30 42

* - меркстемные изоляты выделены из тепличных растений

Таблица 2

Выход растений-регенерантов и безвирусных растений из меристемных изолятов определенного размера в культуре in vitro

Размер изолятов ( мм)

Число

изолятов

(шт.)

Прижилось

И|ОЛЯТОВ

Получено растений-ре-генерант^в_

Всего СО

В т.ч. бед-вирусних(>)

0,10-0,15 227 63 52 40

0,15-0,20 220 ' 73 52 38

0,20-0,25 381 75 55 35

0,25-0,30 214 78 56 ' 45

более 0,30 105 68 46 21

Как следует из данных таблицы 2, приживаемость изолятов с увеличением их размера от 0,1 до 0,3 мм возрастает на 15%, что является статистически достоверным. Определенной зависимости между испытанными размерами изолятов и выходом растений-регенерантов, который незначительно изменяется в пределах 46-56?, установить не удалось. Выход безвирусицх растений при вычленении изолятов размером от 0,1 до О, У мм также ' изменяется несущественно,(от 35 до 45*), однако, от изолятов размером более 0,3 мм получено заметно меньие безвирусных растений. Сокращение почти вдвое выхода безвирусных растения от изолятов размером более 0,3 мм по сравнению с таковым от изолятов размером 0,10-0,15 мм и 0,25-0,30 мм статистически достоверно.

2. Термотерапия в сочетании с культурой меристемной .ткани коллекционных образцов картофеля

Традиционно используемая в сочетании с культурой ткани методика.термотерапии, заключающаяся з предварительном прогревании при температуре +36° - +38°С боЛьных растений или их органов, неприемлема для коллекционного материала, который часто представлен единичными экземплярами и может быть " утерян после термообработки. Поэтому в данной работе испытаны щадящие режимы прогревания, а в качестве объекта термотерапии использована пробирочная культура картофеля.

Прогревание черенков пробирочных растений на питательной среде 1фрасиге-Скуга не позволило получить ни одного расте-

ния-регенеранта у коллекционных образцов, участвовавших в опыте. Другой способ термотерапии - прогревание непосредственно меристемнцх изолятов на питательной среде - бил более результативным. В этом случае из 16 коллекционных образцов меристемные изолдаы 8 развились до растений, при этом у 7 увеличился по сравнению с контролем выход безвирусных растений. результаты оздоровления этим способом представлены в таблице 3. ,

Прогревание меристемнцх изолятов тормозило их дальнейшее развитие, что отражает снижение выхода растений-регенерантов у испытуемых коллекционных образцов, за исключением сорта iram, у которого установлено статистически достоверное возрастание этого показателя. Для получения растений от прогретых меристемнцх изолятов потребовалось проводить более частое (через 2-3 недели) пассирование-их. Сочетание данного способа термотерапии с культурой меристемной ткани позволило у 5 коллекционных образцов получить только безви-•русные растения-регенеранты. Разница о контролем по выходу безвирусных растений статистически достоверна для сорта Fram И образца вида B.phureja (к-15877)..

Прогревание почек больных растений в культуре .in vitro впервые предложил A.Thomson (1958), а затем использовали B.Permazio и M.Veechiati (1979). Основное отличие предлагаемого теперь опособа состоит в меньших размерах прогреваемых изолятов (от 0,1 до 0,5 мм) по сравнению с таковыми в предшествующих работах, (от 0,5 мм до 2 см), что Позволило значительно улучшить результаты оздоровления (табл.3).

Кроме этого, в результате опытов установлен положительный эффект от проведения поэтапной термотерапий. Чтобы опре- . делить оптимальный уровень начальной температуры (+30° или +33°) для термообработки были взяты два коллекционных образца: сорт Pram и подвид чилийского картофеля (К-7509). "" Эксперимент показал, что хотя этим образцам свойственна различная термовыносливость, прогревание их меристемных' изолятов при температуре, постепенно возрастающей от +33°С до +36° - +38°С и две последующие недели в таком режиме являет-ея оптимальным. ' '

Анализ зависимости выхода растений-регенерантов и безвирусных растений от размеров прогретых изолятов показал, что 10

. Таблица 3

ч Термотерапия коллекционных образцов картофеля в сочетании с культурой меристемной ткани

№№ Сорт, вид п/п картофеля Год Вариант опыта Число изоля-тов (шт.) Получе "всего % :но_£астений из них безвирусных %■

I. Германский 1906 К 16 25 75

С К—15553) Т 20 5 . iüo

1987 К ' 13 8 100.

Т 20 5 100

2. Fram 1988 ■ К 49 12 33

(K-I952) Т 35 28 .100

3. ВИР-1 1986 К 26 23 33

Т 20 10 50 .

4. Solanum tubero-

sum subsp.ohi- 1988 К ' 52 33 18

(К-7509) loense Т 48 ю ' 60

5. B.phureja 1986. К 34 20 . 28"

(K-I5877) Т 20 Ю 100

1987 к 20 50 30

Т '18' 5 100

б. S.phureja 1987 К ■ 24 50 25'

' (К-7928) Т - 24 4 100

7. ß.stenotomum 1986 к 15 40 33

(K-I5824) . т 20 5 • 100

8. S.curtilobum 1986 к 15 42 57

(K-IQ472) Т 19 26 60

К - контроль без прогревания меристем

Т -термотерапия

следует подвергать термообработке изоляты величиной 0,2-0,4 мм. Прогревание более крупных изолятов оказалось безрезультатным, т.к. при этом не было получено ни одного беззирусно-го растения.

3. Хемотерапия в сочетании с культурой меристемной ткани картофеля

Из ингибиторов вирусной инфекции, использованных в культуре меристем коллекционных образцов картофеля, некоторые • уже о успехом применялись для целей оздоровления. К их числу относятся: РНК-аза (Бойко В.В., Зейрук Т.В., 1984), рибавирин (Cassels A.C., Long R.D., '■ 1982). Антивирусные, свойства интерферона посазаны-против ХВК, УВК, FBX, МБК на листовых дисках картофеля и. против ВТМ в клетках табака (Атабеков И.Г., Тальянский М.Э., 1987). О действии э^ого вещества, а также реоферона и препарата ИВР в культуре меристемной ткани картофеля сведений нет. Установлены антимикробные, антиоксидан»-ные и фунгицидные свойства стероидных гликозидов (Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., 1979), их способность стимулировать приживаемость и скорость развития 'меристемных изолятов (Звездина Т.Н., Косова А.И., Кинтя П.К., 1988). О влиянии этих веществ на освобождение от вирусов в культуре меристем авторы не сообщают. ', .

Действенность использования РНК-азы изучали на 13 коллекционных образцах картофеля, препарата ИВР - на 4.

Применение РНК-азы вызывало как увеличзние, так и уменьшение приживаемости меристемных изолятов, выхода растений-рега-нерантов и безвирусных среди них по сравнению с контрольными вариантами. РНК-аза (О,Otó) в составе питательной среды улучшала приживаемость изолятов на 10-38$ и выход растений-рзгене-рантов на 24-32í у 5 образцов, выход безвирусных растений на 25-45$ у 3 образцов из 13, участвовавших в опытах. Статистичес--ки достоверно увеличение по сравнении с контролем выхода расте-.ний-регенерантов у сорта .Мурманский и выхода безвирусных растений у гибрида ВИР-I и вида S.stenotonum.

Препарату ИВР свойственна большая антивирусная активность, •чем РНК-азе. У всех 4 коллекционных образцов, на которых изучали его действие, в 2-3 раза возрастал выход безвирусных растений по сравнению с контрольными вариантами. Получены здо-12 •

ровце растения сорта Drummond Castle, что было невозможно без хемотерапевтического воздействия. Из 3 использованных ■концентраций препарата: 0,001;?, 0,002$ и 0,005$, оптимальной видимо является концентрация 0,002$ ИВР.

Эффект применения интерферона (0,01$ и 0,1$) изучали в культуре меристем II коллекционных образцов картофеля.

Положительное влияние интерферона на регенерацию, которая возрастала на I8-4Q?, от мечено у 5 образцов, на освобождение от вирусо,' увеличенное на 22-60$ - у 7 образцов. При этом статистически достоверны результаты регенерации вида ß.phureja (K-I5877) и оздоровления видов S.curtilobuK (К-Ю472) и S.3tonotoEiui (K-I5824). Регенеративные процессы в большей степени выражены в присутствии 0,1$ интерферона, что касается инактивации вирусной инфекции, лучшие результаты у отдельных образцов были получены при той или другой концентрациях этого'вещества.

Рекомбинантный интерферон (реоферон) в составе питательной среды для меристемных изолятов чилийского подвида картофеля обнаружил большую антивирусную активность, чем натив-ный интерферон. Кроме этого, раствором реоферона (10000 ед/ мл) проводили вакуум-инфильтрации почек тепличных растений 4 коллекционных образцов картофеля. Такая обработка увеличивала выход безвирусных растений у 2 коллекционных образцов.

В состав питательной среды для изолятов образца 3.tuberosum subsp.chilocnse (К-7509) помимо вышеназванных соединений бил включен импортный синтетический рибозид - рибави-рин, действенность, применения которого отражают данные таблицы . ,

Как показал опит, рибавирин'из всех изученных соединений обладает наибольшим антивирусным действием. В концентрации 0,001$ он обеспечивал 100$ выход безвирусных растений-реге-нерангов. В то же время рио'авирину свойственна высокая токсичность, он ингибирует регенерацию меристемных изолятов тем ■значительнее, чем больше его концентрация в питательной среде. Данные по регенерации и оздоровлению при использовании рибавирина статистически достоверны.

В опнти по изучению влияния стероидных гликозидов на регенерацию и оздоровление в культуре мериотемной ткани картофеля было включено ') коллекционных образца. Первоначально, для оп-

13

Таблица 4

Оздоровление образца подвида чилийского картофеля (К-7509) методом культуры ткани и хемотерапии

Вариант опыта

Конценг- Число Прижи-рация ин- изоля- лось . гибитора, тов, изоля-% шт. тов, %

Получено расте-ний-pereнерантов

^сего,

из них безвирусных, %

Контроль : ■ 52- 62 53 18

Рибавирин 0,001 52 92 21- 100

—11— 0,002 53 70 19 71

0,005 ' 56 70 2 ■ 100

ределепия оптимальной концентрации этих веществ, шесть стероидных гликозидов: капсикозид, ме^онгозид, никотианозид, пурпуреагитозид, сомслонгозид, томатозид в концентрациях 0,05% и 0,005$ добавляли в питательную среду для изолятов поДвида чилийского картофеля.' При-этом установлено, что приживаемость изолятов и их регенерация лучше на среде.с меньшим количеством гликозидов (0,005$). Существенных отличий по выходу безвирусных растений между двумя используемыми концентрациями ингибиторов не обнаружено. В отношении антивирусных свойств изученные стероидные гликозиды представляют собой, крайне неоднородный ряд от полного отсутствия способности к инактивации вирусной инфекции (пурпуреагитозид) до возможности значительно подавлять патоген (сомелонгозид, мелонгозид). .

Как следует из данных таблицы 5, применение 0,005/3 мелонгозида, сомелонгозида, томатозида и'фитоника в культуре ме-ристемной ткани А коллекционных образцов картофеля способствовало повышению эффективности процесса оздоровления. Но степень выраженности ингибирующего действия гликозидов на вирусную инфекцию изменялась в зависимости от конкретного, коллекционного образца. В целом, при использовании мелонгозида, сомелонгозида, томатозида и фитоника установлено увеличение в 1,5-10 раз выхода здоровых растений. При этом статистически достоверны результаты у сорта Drummond Castle в присутствии мелонгозида и томатозида, у сорти Pram з присутствии сомелонгозида, у образцов вида- S.phureja С К—15877) в присутствии фптопшеа и подвида чилийского картофеля (К-7509) в присутствии всех стероидных гликозидов. " ' .

I'f

Таблица 5

• Влияние стероидных гликоэидов (0,üü5,í>) на регенерацию и оздоровление коллекционных образцов картофеля

Сорт, вид Ингибитор Число Прижи- Получено р.чс-

изолятов (итО лось изолятов со тении всего' ш в т.ч. безвинных

Drummond. отсутствует 50 78 54 0

G33tle мелонгозид 49 84 59 21

С ¡C-278) сомелонгозид 44 82 50 5

томагозид 51 76 23 22

фи тоник • 47 83 55 5

i'ran отсутствует 48 57 28 33

(K-I952) иелонгозид 50 98 8 75

сомелонгозид 51 94 12. 66 '

томатозид 52 09 25 • 33

фитоник 52 81 ' 40 47

Bolán игл отсутствует 50 82 48 8

tuberocua мелонгозид 48 60 45 38

subap.chiloenstí сомелонгозид 49 61 47 86

' (K-7509) то::атозид , 50 86 74 50

ч ¡'.ТОНИК 50 90 71 56

S.phuiá.ia отсутствует 46 83 ' 68 15

(K-7926) . иелонгозид 52 ' 08 78 ■ 25

сомелонгсвид 53 87 54 32

то .чат озид 52 73- .97 22 ■

фитоник 51 90 54 64 .

При анализе влияния размеров вычленяемых мерпстемннх изо. лйтоз на npiiaiEae.iOCTb, регенерацию и оздоровление коллекционных образцов в onutax по хемотерьпнк подтвердились в основном ••закономерности, установленные ранее на питательной среде Мура-сиге-Скуга в отсутствии ингибиторов вирусов. Тенденция увели- чении приживаемости изолятов о возрастанием их размеров сохранялась в присутствии всех ингибиторов кроме фитоника. Отличия rio приживаемости изолятов величиной О, IG-Ú, 15 .мм и более 0,30 мм статистически достоверны. Использование фитоника обуфлавли-

вало достаточно высокую приживаемость изолятов всех размеров (81-88$)•

Не установлено существование зависимости между размерами меристемных изолятс/в и выходом из них растений-регенерантов. Исключение составил опыт с мелонгозидом, в котором статистически достоверно уменьшается выход растений-регенерантов с увеличением размеров изолятов.

При вычленений изолятов размером более.0,3 мм в присутствии всех ингибиторов вирусов, кроме сомелонгозида, как й в контрольных вариантах, происходило резкое падение доли безвирусных растений от общего числа растений-регенерантов. На питательной среде с сомелонгозидом выход безвирусных растений от изолятов размером 0,1-0,3 мм равен 39-45$, а при вычленении изолятов более 0,3 мм он возрастал до 50$. По-видимому, высокие антивирусные свойства оомелонгозида достаточно эффективно стимулируют процесс оздоровления и у крупных изолятов.

ШВОЛЫ:

1. Использование метода культуры меристемной ткани с целью освобождения коллекционных образцов картофеля от вирусной инфекции выявило их обширную генетическую гетерогенность по реакции на условия in vitro. 1 испытанных образцов'получены растения-регенеранты от 16 до 100$ меристемных изолятов, от 0 до 100$ растений свободных от вирусов. Сроки регенерации составляли 6-64 недели.

2. Из испытанных способов термотерапии в культуре in vitro более результативным оказалось прогревание непосредственно меристемных изолятов на питательной среде при температуре +36° - +38°С. При этом получены растения-регенеранты от

О до 50$ меристемных изолятов, из них 18-100$ растений были свободны от вирусов. Сроки регенерации 6-24 недели.

Для уменьшения шокового воздействия повышенных температур на регенерацию меристемных изолятов целесообразна двуэтапная термотерапия: увеличение в течение первой недели температуры от 33° до 36-38°С и сохранение такого режима последующие 2-3 недели.

3. Результативность хемотерапии в культуре меристемной" ткани картофеля определяется как генотипическими особенностями оздоравливаемого коллекционного образца, так и химическими своГютвамн применяемого ингибитора вирусов. В проведенных

опытах получены растения-реге не ранты от 2 до 1СО,2 меристемных изолятов, от 3 до 100$ полученных растений били свободны от вирусов. Сроки регенерации составляли 3-43 недель.

4. Лз всех химических веществ, испытанных в культуре ме-ристемиой ткани картофеля наибольшей антивирусной активностью - 100$ выход безвирусных растений - отличался рибавирин (0,001?). Достоверно увеличивали по сравнении с контролен выход безвирусных растений в 2-3 раза ИВР (0,002$) и стероидные гликозиды (0,005^): сомелонгозид в 2-Ю раз, .фитоник в 1,5-7 раз, мело'нгозид в 1,5-4 раза. •

5. Размеры меристемных изолятов в проведенных опытах влияли в основном на их приживаемость и выход безвирусных растений, но не на общий выход растений-регенерантов.

Приживаемость меристемных изолятов при увеличении их размера возрастала. Выход безвирусных растений был, как правило, в пределах недостоверных различий при использовании изолятов 0,1-0,3 мм, но существенно снижался при вычленении более крупных. Включение в состав питательной среды сомелонгозида увеличивало выход безвирусных растений из меристемных изолятов свыше 0,3 мм. • '

При термотерапии меристемных изолятов наилучшие результат ■ тц по выходу растений-регенерантов и безвирусных растений из них были при прогревании изолятов размером 0,2-0,4 мм.

6. При сравнении трех методов диагностики вирусов: !!М, 'СА и ЭМ, совпадение их результатов составило не более 68,1 от

общего числа проведенных анализов. При сравнении двух методов иммунодиагностики: ИМ и СА, отмечена вдвое более- высокая определяемость вирусных растений методом ИМ.

Рекомендации для практической работы по оздоровлению картофеля от вирусной инфекции методом культуры церис-темной ткани

1.-Для повышения эффекта оздоровления следует включать в состав питательной среды для меристемных изолятов рибавирин (0,001$) или сомелонгозид (0,005$).

2. При термотерапии коллекционных образцов с ограничен, ным числом растения и клубней следует проводить прогревание

непосредственно меристемных изолятов размером 0,2-0,'» мм на питательноЛ среде при температуре +35° - +39° в течение 2-3 недель. • •

Для уменьшения шокового действия повышенных температур при термотерапии меристемных изолятов целесообразно использовать период предварительной термической адаптации с постепенным увеличением температура в течение первой недели прогревания от +33° до +Зб°С.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

I. Рогозина Е.В. "Использование хемотерапии для оздоровления картофеля от вирусных болезней в культуре ткани" 12 стр. депонирована во ВШИТЭИагропром под № 585/28 ВС-63 Деп. .. 2. Рогозина Е.В. "Использование ингибиторов вирусной инфекции в культуре .ткани картофеля"//Егаллетень ВИР. Вып. 108. 0.49-50. (

3. Рогозина Е.В. "Хемотерапия.в сочетании с культурой ■ ткани как способ оздоровления образцов картофеля от вирусной инфекции" //Бюллетень ВИР. Вып.197. С.65-67.

4.. Трускиноз Э.В., Рогозина Е.В. "Влияние некоторых ингибиторов вирусов на регенерацию картофеля в культуре ткани". //Тезисы докладов международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - Новосибирск, август 1938 г. - Новосибирск. 1988. С.340-341. ' "

5. Рогозина Е.В. "Сравнительная эффективность некоторых . ингибиторов вирусов.при оздоровлении картофеля методом культуры ткани"//Тез.докл. Всесоюзной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов.Самохваловичи, де- ■ кабрь, 1989 г. - Самохваловичи. 1989. С.45.

Р