Сравнительное изучение дозовых зависимостей частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro

Семенов, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение дозовых зависимостей частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение дозовых зависимостей частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro"

На правах рукописи

СЕМЁНОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДОЗОВЫХ ЗАВИСИМОСТЕЙ ЧАСТОТЫ НЕСТАБИЛЬНЫХ ХРОМОСОМНЫХ ОБМЕНОВ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VIVO И IN VITRO.

Специальность 03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 2003

Работа выполнена в лаборатории радиационной генетики Центрального научно-исследовательского рентгенорадиологического института МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Воробцова И.Е. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михельсон В.М. доктор биологических наук Гильяно Н.Я.

Ведущее научное учреждение: Медицинский радиологический научный центр РАМН г. Обнинск

Защита состоится 5 июня 2003 г в II00 на заседании Диссертационного совета КР 208.116.07 в Центральном научно-исследовательском рентгенорадиологическом институте МЗ РФ (Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, 70/2)

Отзывы просим направлять по адресу: 197758, Санкт-Петербург, Песочный, Ленинградская ул., 70/4, ЦНИРРИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНИРРИ Автореферат разослан « 2-9» 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Кованько Е.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ускорившееся с конца 40-х годов загрязнение человеком среды обитания, вызванное бурным ростом промышленности, испытанием ядерного оружия и использованием ядерной энергии, обусловило необходимость разработки биологических тестов, позволяющих оценивать генотоксичность различных факторов химической и физической природы, в первую очередь - ионизирующего излучения. Известно, что степень клинического проявления последствий облучения зависит от уровня поглощённой дозы, характера облучения и времени экспозиции. В тех случаях, когда эти параметры известны, можно с большой степенью вероятности прогнозировать ранние и отдаленные реакции организма на облучение. Однако в случаях неконтролируемого облучения при аварийных ситуациях, когда данные физической дозиметрии неполны или отсутствуют, для оценки поглощённой организмом дозы используются биологические маркеры радиационного воздействия. Межиндивидуальная вариабельность в радиочувствительности людей усиливает значимость биологических критериев оценки радиационного воздействия, поскольку в клиническом отношении важнее установить реакцию конкретного человека на облучение, чем достоверно рассчитать поглощённую им физическую дозу. Поэтому биологическая дозиметрия часто оказывается предпочтительнее физической.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИ8ТЕКА I С. Петербург л л/ » < 9Э f

здравоохранения (WHO) в качестве тест-системы для оценки мутагенности различных факторов окружающей среды.

Существует достаточно много работ, в которых по частоте нестабильных хромосомных обменов (НХО) - дицентриков и центромерных колец - в лимфоцитах осуществляется восстановление как индивидуальных, так и коллективных доз в случаях неконтролируемого облучения людей (Lloyd et al., 1992). Для этого используются калибровочные кривые, полученные при облучении лимфоцитов in vitro (Lloyd et al., 1986). В случае однократного лучевого воздействия на человека использование in vitro калибровочных кривых, полученных в режиме однократных облучений лимфоцитов, представляется вполне оправданным. Однако, при фракционированном (пролонгированном) характере лучевого воздействия, имевшем место при радиационных авариях, испытаниях ядерного оружия и профессиональном облучении, использование таких калибровочных кривых может приводить к искажённым оценкам поглощённых доз. Поэтому представляется важным и актуальным построение калибровочных кривых для фракционированного облучения клеток крови. Из-за ограниченной жизнеспособности лимфоцитов в культуре фракционированное облучение этих клеток in vitro затруднено. В то же время существует возможность получения кривых доза-частота НХО при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo. Это можно осуществить на онкологических пациентах, в схему противоопухолевого лечения которых включено тотальное фракционированное облучение в малых дозах, осуществляемое до начала локального облучения в больших дозах.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось построение дозовой зависимости частоты нестабильных хромосомных обменов в лимфоцитах периферической крови при тотальном фракционированном облучении человека в малых дозах и сравнение её с зависимостью доза-эффект при однократном облучении лимфоцитов этих же пациентов in vitro.

Данная цель предопределила постановку следующих задач:

1. Изучить характер индивидуальных зависимостей от дозы частоты дицентриков и центромерных колец в лимфоцитах периферической крови при общем фракционированном облучении онкологических пациентов в диапазоне доз от 0 до 57,5 сГр.

2. Изучить характер индивидуальных зависимостей от дозы частоты дицентриков и центромерных колец в лимфоцитах при однократном облучении крови тех же пациентов in vitro в том же дозовом интервале.

3. На основании индивидуальных данных построить суммарные модели дозовой зависимости частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo.

4. Сравнить зависимости доза-эффект при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo и остром in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у одних и тех же людей изучены дозовые зависимости выхода нестабильных хромосомных обменов при низкодозовом фракционированном облучении лимфоцитов in vivo и остром in vitro. Впервые установлена бблыпая эффективность острого облучения лимфоцитов in vitro в сравнении с фракционированным in vivo, что на практике может приводить к занижению значений поглощенных человеком доз при их реконструкции с помощью in vitro калибровочных кривых. Полученная в работе калибровочная кривая доза-частота клеток с НХО для фракционированного облучения лимфоцитов in vivo может быть использована для биологической дозиметрии при аналогичном характере неконтролируемого облучения людей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Дозовые зависимости частоты нестабильных хромосомных обменов в диапазоне от 0 до 57,5 сГр при облучении лимфоцитов как in vitro, так и in vivo удовлетворительно описываются линейными моделями.

2. Эффективность однократного облучения лимфоцитов in vitro по тесту образования клеток с дицентриками и центромерными кольцами достоверно

превышает эффективность фракционированного облучения лимфоцитов in vivo.

3. Межиндивидуальные различия в радиочувствительности разных доноров более выражены при фракционированном облучении in vivo, чем при остром in vitro.

4. Полученная при общем облучении человека калибровочная кривая дозовой зависимости нестабильных хромосомных обменов может быть использована для восстановления поглощённых доз в случаях неконтролируемого фракционированного облучения.

Апробация работы. Предварительная защита диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии отдела клинической радиобиологии ЦНИРРИ МЗ РФ. Основные положения диссертации доложены на 28-ой ежегодной конференции Европейского Общества мутагенов окружающей среды (Зальцбург, 1998), на Международной конференции по биодозиметрии и 5-ом Международном симпозиуме по ЭПР дозиметрии (Обнинск, 1998), на 29-ой ежегодной конференции Европейского Общества мутагенов окружающей среды и 16-ой ежегодной конференции Скандинавского Общества мутагенов окружающей среды (Вильнюс, 1999), на конференции "Новые технологии в медицинской радиологии" (Санкт-Петербург, 2001), на IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 10 публикациях: 3 статьях и 7 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и литературного обзора, методической части, результатов исследования и обсуждения, выводов, приложения и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста, в число которых входит 41 таблица, 19 рисунков и 13 таблиц «Приложения». Список цитированной литературы включает 153 источника, из них 102 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Характеристика пациентов -доноров крови.

Цитогенетическое исследование было проведено на 11 пациентах клиники ЦНИРРИ МЗ РФ в возрасте от 23 до 75 лет (2 женщины и 9 мужчин) с различными видами опухолей и метастазами в кости и другие органы. На каждого пациента заполнялась анкета, включающая, кроме паспортных данных, диагноз, краткую историю болезни, проводившееся лечение и протокол общего облучения. Некоторые характеристики пациентов представлены в таблице 1. До поступления в клинику больные не подвергались терапевтическому воздействию радиации или цитостатиков.

Тотальное облучение пациентов и дозиметрия.

До начала локальной лучевой и/или химиотерапии больные подвергались фракционированному общему облучению в разовой дозе 11,5 сГр до суммарной дозы 57,5 сГр. Интервалы между сеансами облучения варьировали от 1 до 3 суток. Облучение осуществлялось на аппарате РОКУС-91М (НПО «Равенство», Россия) с мощностью дозы 0,95-1,23 сГр/мин (источник у-излучения - Со60). После каждого сеанса тотального облучения у пациентов забирали венозную кровь (10 мл) в гепаринизированные стерильные вакутейнеры (Dicfon) для цитогенетического анализа. Облучение пациентов проводилось с применением фигурных парафиновых блоков, используемых для уменьшения неравномерности облучения, связанной с рельефностью тела и разной плотностью тканей, а также для компенсации спада дозного распределения по краям поля (Ermakov et al., 1987). Для определения средних доз в теле пациента был использован антропоморфный фантом стандартного человека, представленный в компьютерной программе в виде контура тела из 20-ти точек на каждое поперечное сечение. Оценка поглощённых доз производилась для 5800-6000 точек. Расчёты, проделанные Червяковым А.М. в физическом

отделе института, показали, что дозы общего облучения пациентов варьировали в зависимости от антропометрических данных человека в узком интервале от 11,3 до 11,6 сГр, составляя в среднем 11,5±0,2 сГр.

Таблица 1. Характеристика обследованных пациентов.

№ Код паци ента Возраст, годы Пол Диагноз Терапия (до облучения) Терапия (во время облучения)

1 БЗ 47 м Аденокарцинома желудка IV ст., метастазы в печень Резекция желудка, химиоэмболизация печени Глюкоза, аскорбиновая кислота, эссенциале

2 Б5 58 ж Рак яичника, метастазы в печень и поджел. железу Анальгетики, барамин, Анальгетики, валокордин, рибоксин, но-шпа

3 Б7 75 ж Рак почки, метастазы в легкие Дезинтоксикация: ИаС19%, глюкоза Глюкоза, эуфиллин, анальгин, димедрол

4 Б9 75 м Рак простаты, метастазы в кость Галокамера, флюципон Нет

5 Б10 43 ж Опухоль забрюшинного пространства, метастазы в почку Удаление опухоли левой почки с надпочечником и селезенки Эритроцитарная масса, глюкоза

б Б14 49 м Рак сигмовидной кишки и яичника, метастазы в лёгкие и печень Резекция сигмов. кишки, ампутация матки с придатками Нет

7 Б15 56 м Рак почки, метастазы в легкие Но-шпа Анальгетики

8 Б16 59 м Рак почки, метастазы в кости Эмболизация левой почки Навиган, баралгин

9 Б17 52 м Рак предстательной железы, метастазы в кости скелета Нет Анальгетики, промедол, реланит

10 Б18 23 м Плоскоклеточный рак Удаление почки, томоксифен Аскорбиновая кислота

И Б19 74 м Бластома предстательной железы Синестрол, хлортрианизин Ферроплекс, поливитамины, рибоксин, панондин

Облучение лимфоцитов in vitro и дозиметрия.

Кровь, взятую у пациентов до общего облучения, разливали в стерильных условиях в 2 мл пластиковые пробирки с завинчивающейся пробкой и помещали в специальный парафиновый контейнер размером 8x15 см. Контейнер устанавливали позади экранирующего блока на том же столе, где проводилось облучение пациентов, и облучали в дозах 8, 16, 24, 32, 40 сГр (Б5, Б9, Б10, Б14, Б15, Б16, Б17) и 10, 20, 30,40, 50 сГр (Б18), вынимая из контейнера после каждой фракции отпущенной дозы (8 или 10 сГр) соответствующие пробирки. Измерение мощности дозы облучения лимфоцитов in vitro было произведено прибором UNIDOS 1001-0576, камерой 30001-1402 (Германия) (погрешность измерения не превышала 5%).

Приготовление цитогенетичесшх препаратов.

Цельную кровь (0,5 мл) культивировали в стерильных пластиковых бакпечатках в течение 48-50 часов при температуре 37°С в 4,5 мл среды RPMI-1640 (Gibco, Германия), содержащей 15% эмбриональной сыворотки (Gibco, Германия), 2,5% ФГА (Murex, Англия), антибиотики, L-глутамин и BrdU (9,3 мкг/мл). За 3 часа до снятия в культуры добавляли колцемид (Boehringer Mannheim) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Гипотоническую обработку производили 0,075М раствором KCl при температуре 37°С в течение 14 минут; фиксацию — свежеприготовленной охлаждённой смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), центрифугируя суспензию в течение 5 минут при 1200 об/мин несколько раз до получения светлого осадка. Осадок ресуспендировали, суспензию раскапывали на влажные охлаждённые предметные стёкла и высушивали на воздухе. Окраску проводили с помощью FPG-техники (Wagner et al., 1983), позволяющей отличать первые и вторые митозы.

Микроскопический анализ препаратов.

Анализ препаратов проводили на световых микроскопах «Axioplan» (Carl Zeiss, Германия) и «БИМАМ» (JIOMO, Россия) под масляной иммерсией

при увеличении xlOOO. В метафазах 1-го митоза, содержащих 46±1 центромер, регистрировали следующие типы аберраций: дицентрики, центромерные и ацентрические кольца, двойные и одиночные фрагменты, хромосомо-хроматидные обмены, пробелы, а также геномные аберрации (анеу- и полиплоидия). В представленной работе приведены данные по нестабильным хромосомным обменам. Всего в процессе исследования было проанализировано более 60000 метафаз.

Статистическая обработка результатов.

При регрессионном анализе данных подбор уравнений, наиболее точно описывающих зависимости доза-эффект, производили с использованием компьютерной программы Poisson Iteratively Reweighted Least Squares (Peterson, 1997). 95%-ные доверительные интервалы оценок определения находили с помощью электронной матрицы критерия Фишера - "Counting a confidence intervals for percentages". Для оценки достоверности различий между частотами НХО при разных дозах использовали Точный критерий Фишера (Agresti, 1992), а для оценки достоверности различий между коэффициентами регрессионных уравнений - t-критерий Стьюдента. При анализе выборок на гомогенность использовали критерий х2-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ индивидуальных зависимостей доза-частота клеток с нестабильными хромосомными обменами.

Результаты регрессионного анализа полученных индивидуальных данных представлены в таблице 2. Во всех случаях как in vitro, так и in vivo линейная модель удовлетворительно описывает зависимость доза-частота клеток с НХО, за исключением одного пациента (Б 10, in vivo). Аппроксимация полученных данных более сложными моделями (линейно-квадратичной и полиномом 3-ей степени) выявила, что при облучении лимфоцитов in vitro у большинства пациентов значимость линейных моделей более высокая (выделены

жирным шрифтом). Однако у Б-9 и Б-16 более достоверными оказались линейно-

квадратичные зависимости, а у Б-18 наилучшим образом описывал результаты

полином третьей степени с отрицательными значениями линейного и

кубического коэффициентов. При облучении лимфоцитов in vivo в 3-х случаях

(Б-5, Б-15 и Б-18) значимость линейных моделей была наибольшей, а в 4 случаях

- Б-9, Б-10, Б-14 и Б-16 - экспериментальные данные лучше соответствовали

полиному третьей степени с отрицательным квадратичным коэффициентом. В

одном случае (Б-17) зависимость частоты клеток с НХО от дозы наилучшим

образом описывалась линейно-квадратичной моделью.

Таблица 2. Индивидуальные коэффициенты уравнений линейной регрессии частоты клеток с НХО на дозу при разных режимах облучения лимфоцитов.

Коды пациенте в IN VITRO IN VIVO Различия между "а"

(a±SE)xl0"2 df х2 Р (otfcSE)xlO'2 df х2 Р t

Б-5 5,69±0,55 4 0,20 0,99 5,03±0,85 2 0,26 0,88 0,65

Б-9 5,73±1,42 4 5,03 0,28 3,34±1,31 3 3,4 0,33 1,24

Б-10 7,78±2,24 3 4,45 0,22 2,99±1,17 3 12 0,006 1,90

Б-14 6,28±1,89 3 0,5 0,92 3,87±0,97 4 2 0,73 1,18

Б-15 5,82±1,36 4 1,94 0,75 1,64±0,81 4 2,7 0,60 2,64*

Б-16 5,54±0,85 6 5,87 0,44 3,04±0,61 5 3,2 0,66 2,39*

Б-17 4,78±0,97 4 1,6 0,81 5,65±0,95 3 4,8 0,19 -0,64

Б-18 4,86±0,73 4 4,17 0,38 2,51±0,54 4 3 0,57 2,5 9*

Примечание: * - различия между a-коэффициентами при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo достоверны (р<0,05, t-критерий Стьюдента),

Коэффициенты а линейных уравнений доза-эффект in vitro у шести пациентов превышали а коэффициенты в "уравнениях in vivo", то есть облучение лимфоцитов in vivo оказалось мене эффективно, чем облучение in

vitro. У трёх человек (Б-15, Б-16 и Б-18) это различие было статистически достоверно. У остальных (Б-9, Б-10 и Б-14) более чем 2-х кратное превышение а коэффициентов in vitro над in vivo оказалось недостоверным, что, по-видимому, связано с недостаточным количеством проанализированных клеток. У двух пациентов (Б-5 и Б-17) величины а коэффициентов in vitro и in vivo практически совпадают. Следует отметить, однако, что в случае пациента Б-5 общее количество проанализированных метафаз было невелико, а в случае Б-17 при построении in vivo модели были использованы только 5 дозовых точек.

Факт меньшей эффективности фракционированного облучения лимфоцитов in vivo в сравнении с острым in vitro в ряде случаев подтверждается при попарном сравнении частоты клеток с НХО между близкими поглощёнными дозами при разных режимах облучения. В таблице 3 приведены случаи, в которых частота хромосомных обменов при меньших дозах in vitro оказалась достоверно выше их частоты при бблыпих дозах in vivo.

Таблица 3. Значения доз, при которых частота клеток с НХО была достоверно выше при облучении лимфоцитов in vitro, чем in vivo.

Код пациента Доза in vitro Клеток с НХО, M±SE Доза in vivo Клеток с НХО, M±SE Достоверность различий, р

Б10 24 сГр 2,81±0,84 34,5 сГр 1,21±0,32 0,04

Б10 40 сГр 3,55±0,64 46 сГр 1,27±0,35 0,002

Б15 40 сГр 3,21±0,72 46 сГр 0,88±0,39 0,007

Б16 57,3 сГр 4,38±0,89 57,5 сГр 1,71±0,51 0,01

Б18 40 сГр 2,66±0,60 46 сГр 1,13±0,37 0,04

Анализ суммарных данных по зависимости доза-частота клеток с НХО при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo. До построения суммарной зависимости доза-эффект при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo индивидуальные результаты были объединены в выборки в пределах одинаковых доз и режимов облучения для получения средних значений по каждой дозе.

Следует отметить, что спонтанная частота НХО в исследованной группе пациентов (0,35+0,07) существенно превышает как среднепопуляционный уровень - 0,05-0,15% (Bender et al., 1988), так и внутрилабораторный контроль по здоровым донорам - 0,08±0,03% (Воробцова и др., 1994), что согласуется с литературными данными, полученными на аналогичных больных (Venkatachalam et al., 1999). Это могло быть связано с возрастом пациентов (в исследованной нами группе все пациенты за исключением Б-18 были людьми пожилого возраста - от 43 до 74 лет), хромосомной нестабильностью опухолевых больных, применением ими до лечения в клинике лекарственных препаратов, обладавших генотоксическим эффектом (не выявленным при заполнении анкет).

Сравнить реакцию лимфоцитов на однократное лучевое воздействие было возможно только при минимальных дозах облучения - первой фракции 11,5 сГр in vivo и 8-10 сГр in vitro. Анализ выборок на гомогенность показал, что каждая из них однородна и не содержит выпадающих значений. Это позволило объединить данные разных пациентов и получить средние значения частот клеток с НХО, которые составили 0,71+0,11% для дозы 8,3 сГр in vitro и 0,88+0,12% для 11,5 сГр in vivo (см. таблицу 4) и не отличались достоверно друг от друга (точный критерий Фишера, р=0,34). В то же время они достоверно отличались от спонтанной частоты этих аберраций. Таким образом, не наблюдается разницы в цитогенетической реакции лимфоцитов при однократном облучении в близких дозах in vitro и in vivo.

Предварительный анализ данных по частоте клеток с НХО на однородность с применением критерия показал гомогенность результатов при всех дозах облучения лимфоцитов in vitro и при трёх дозах in vivo (11,5; 23 и 34,5 сГр) (таблица 4). Это позволяет сделать вывод, что в дозовом диапазоне от 0 до 50 сГр радиочувствительность к облучению in vitro лимфоцитов исследованных онкологических пациентов практически одинакова. При облучении лимфоцитов in vivo в дозах 46 и 57,5 сГр появляются такие значения частот аберраций, вклад

которых в суммарную величину %2 приводит к достоверной неоднородности

выборок (р<0,01). Для дозы 46 сГр in vivo таким значением является частота

клеток с НХО у донора Б-17. Зарегистрированная величина эффекта -

3,86+0,73% достоверно превышает среднее по группе, а значение этой

экспериментальной точки (17,2) составляет 70% от его суммарной величины.

Для дозы 57,5 сГр in vivo, где также наблюдалась гетерогенность результатов

(%2=15,8; df=5, р<0,01), значением, вносящим наибольший вклад (60%) в общую

сумму отклонений эмпирических частот от теоретических, является величина

эффекта у пациента Б-10 - 3,72±0,63. Можно видеть, что и в данном случае речь

идет о превышении среднегрухшового значения.

Таблица 4. Результаты анализа данных по частоте клеток с НХО на

гомогенность.

Доза, Количество M±SE Разница Критерий х2

сГр пациентов клеток с НХО с дозой 0 X2 df Р

0 10 6619 23 0,35±0,07 - 4,5 9 >0,75

8,3 8 5390 38 0,71±0,11 0,36 5,5 7 >0,50

9 16,6 7 3784 40 1,06±0,17 0,68 2,5 6 >0,75

24,2 7 3013 56 1,86±0,25 1,4 3,9 6 >0,50

> 32,0 8 5015 100 1,99±0,20 1,62 3,6 7 >0,75

Ä 40,3 8 4291 115 2,68±0,25 2,30 7,9 7 >0,25

50,0 2 2255 58 2,57±0,33 2,23 0,74 1 >0,25

11,5 10 5799 51 0,88±0,12 0,53 9,3 9 >0,25

о > 23,0 8 6028 75 1,24±0,14 0,87 4,9 7 >0,50

< > 34,5 9 6517 94 1,44±0,15 1,09 2,8 8 >0,90

S 46,0 7 4305 76 1,77±0,20 1,38 25,2 6 <0,01

57,5 6 5392 120 2,23±0,20 1,80 15,8 5 <0,01

Данные о гиперчувствительности к облучению отдельных онкологических пациентов имеются в литературе (West et al., 1995; Dunst et al., 1995). У них наблюдались острые и хронические побочные клинические последствия облучения, а также повышенный уровень АХ при облучении лимфоцитов in vitro. Авторы связывают это с возможной гетерозиготностью этих

пациентов по гену атаксии телеангиэктазии (АТ) либо по другим генам, имеющим отношение к репарации ДНК. По-видимому, в исследованной нами выборке к гиперчувствительным пациентам можно отнести Б-17, облучение которого было прекращено после дозы 46 сГр из-за ухудшения самочувствия. Более высокая радиочувствительность этого пациента в сравнении со средней по группе также может объясняться снижением эффективности систем репарации ДНК.

Таблица 5. Попарное сравнение цитогенетического эффекта при разных дозах

облучения лимфоцитов.

Доза 0 vt 8 w 11,5 vt 16 vv 23 vt 24 vt 32 vv 34,5 vt 40 w 46 vt 50

vt 8 0,009

w 11,5 2Б-04 0,3

vt 16 2E-05 0,08 0,4

w 23 9E-09 0,004 0,048 0,4

vt24 8E-13 4E-06 1E-4 0,007 0,02

vt 32 9E-18 1E-08 1E-6 0,001 0,002 0,7

w 34,5 1E-11 1E-04 0,004 0,1 0,4 0,2 0,03

vt40 8E-11 3E-14 6E-12 3E-07 2E-07 0,03 0,03 1E-05

w 46 7E-14 2E-06 1E-04 0,009 0,03 0,8 0,4 0,2 0,005

vt 50 6E-18 6E-10 4E-08 2E-05 5E-05 0,09 0,1 0,001 0,9 одзИИ

w 57,5 1E-21 6E-11 1E-08 3E-05 6E-05 0,3 0,5 0,002 0,2 0,1 0,4 |

Примечания: vt - облучение in vitro, w - облучение in vivo,

жирным шрифтом выделены достоверные различия,

Суммарные данные по каждой дозе были подвергнуты попарному сравнению с применением точного критерия Фишера. Результаты представлены в таблице 5, оформленной по шахматному типу: в каждой клетке указаны значения достоверности различий (р) между соответствующими значениями.

Случаи, когда частота клеток с НХО при ббльших дозах облучения in vivo оказалась достоверно ниже таковой при меньших дозах in vitro подчёркнуты.

Из таблицы видно, что спонтанная частота клеток с НХО достоверно отличается от таковой даже при наименьших дозах, использованных в исследовании. В интервале от 8 до 16 сГр не наблюдается достоверных различий в частоте клеток с НХО, что вполне может рассматриваться как дозонезависимый порог, а в интервалах 16-24 сГр и 32-40 сГр in vitro наблюдается достоверное нарастание эффекта. В тоже время между дозами 24-32 сГр и 40-50 сГр in vitro достоверных различий также не установлено. Если в первом случае (интервал от 24 до 32 сГр in vitro) количество пациентов (7 и 8) и число проанализированных метафаз (3013 и 5015) было достаточным для утверждения об отсутствии прироста НХО в этом дозовом интервале, то во втором случае вопрос о дозонезависимом пороге остаётся открытым, поскольку для дозы 50 сГр данные были получены только по 2 пациентам.

При анализе дозозависимого нарастания эффекта in vivo можно видеть, что достоверный прирост клеток с НХО наблюдается только после первых двух фракций облучения - между дозами 0-11,5 и 11,5-23 сГр. Начиная с третьей фракции (34,5 сГр), различия в величине эффекта между последующими фракциями недостоверны. Поскольку проанализированных клеток во всех выборках достаточно много, это вряд ли может быть статистическим артефактом. Следовательно, после второй фракции (23 сГр) скорость накопления асимметричных обменов при облучении лимфоцитов in vivo снижается.

Сравнение между собой разных условий облучения обнаруживает, что достоверное превышение частоты клеток с НХО при облучении in vitro над таковой in vivo наблюдается уже между дозами 24 сГр и 23 сГр соответственно. При дальнейшем увеличении доз это различие нарастает, приводя к тому, что бблыпие поглощённые дозы при облучении in vivo дают меньшие значения эффекта, чем более низкие дозы при in vitro облучении (34,5 сГр in vivo vs. 32 сГр in vitro и 46 сГр in vivo vs. 40 сГр in vitro). Это подтверждает бблыпую

эффективность облучения in vitro над in vivo.

Полученные данные по отдельным больным были использованы для

построения общей и усреднённой моделей дозовой зависимости частоты клеток с

НХО. Общая модель строилась на основе всех индивидуальных данных (вариант

А), усреднённая - по суммарным данным для каждой дозы (вариант Б).

Сопоставлялись линейное, линейно-квадратичное уравнение и полином 3-ей

степени. В таблице 6 приведены результаты, из которых видно, что при

облучении лимфоцитов in vitro экспериментальные данные наилучшим образом

аппроксимируются линейной моделью доза-эффект для обоих вариантов.

Таблица 6. Коэффициенты регрессии частоты клеток с НХО на дозу при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo.

Тип модели (C±SE)*10"2 (a±SE)*10"2 (P±SE)*102 (y±SE)*10'2 df x2 P

Y=C+a*D 0,35±0,07 5,28±0,39 47 34,3 0,92

vitro -A Y=C+a*D+P*D2 0,36±0,08 4,67±1,17 1,59±2,80 46 34,2 0,90

Y=C+a*D+P*D2 +y*D3 0,37±0,08 3,44±2,22 9,37±12,51 11,22±17,78 45 33,9 0,89

Y=C+a*D 0,32±0,06 5,38±0,38 6 5,81 0,44

vitro -R Y=C+a*D+p*D2 0,33±0,07 4,89±1,13 1,26±2,76 5 5,55 0,35

Y=C+a*D+p*D2 +y*D3 0,34±0,07 3,87±2,16 7,84±12,35 -9,55± 17,65 4 5,35 0,25

Y=C+a*D 0,40±0,07 3,20±0,28 48 63,6 0,07

vivo -A Y=C+a*D+p*D2 0,37±0,07 3,98±0,86 -1,59±1,70 47 63,1 0,06

Y=C+a*D+P*D2 +y*D3 0,35±0,07 6,06±1,95 -13,22±9,82 14,53±12,05 46 61,7 0,06

Y=C+a*D 0,40±0,07 3,20±0,28 4 2,45 0,65

vivo -Б Y=C+a*D+p*D2 0,37±0,07 3,98±0,86 -1,59±1,70 3 1,53 0,68

Y=C+a*D+P*D2 0,35±0,07 6,06±1,95 -13,22±9,82 14,53±12,05 2 0,06 0,97

При облучении лимфоцитов in vivo для варианта А все три модели имеют очень низкую достоверность (р=0,06-0,07). Это обусловлено гетерогенностью результатов, отмеченной ранее, и, в первую очередь, частотой клеток с НХО у пациента Б-17 после дозы 46 сГр. Квадрат отклонения Пирсона этой точки составляет более 23% от общего %2 пуассоновской регрессии (14,7 из 63,6). Исключение этой точки приводит к значительному повышению достоверности линейной модели (х2=49,7; df=47; р=0,37), при несущественном изменении коэффициентов. Для варианта Б как линейная, так и линейно-квадратичная модели хорошо описывают соотношение доза-частота НХО (р=0,65 и 0,68 соответственно). Однако полином 3-ей степени с отрицательным квадратичным коэффициентом наилучшим образом описывает экспериментальные данные (р=0,97). Эта модель отражает некоторое замедление прироста величины эффекта с увеличением дозы, наступающее после второй фракции облучения. Сравнение коэффициентов из уравнений линейной регрессии при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo показывает, что свободные члены уравнений не отличаются друг от друга. Угол же наклона прямой (коэффициент а) при облучении in vitro достоверно выше, чем in vivo (t=4,33; р<0,001). Ha рисунке 1 графически продемонстрированы различия линейных моделей доэа-эффект при облучении лимфоцитов in vivo и in vitro, полученные на основе усреднённых по одинаковым дозам данных (вариант Б).

Анализ индивидуальных и объединённых цитогенетических данных показывает, что реакция лимфоцитов на облучение in vivo и in vitro неодинакова. Это выражается в том, что частоты клеток с НХО, индуцируемых одинаковыми дозами при разных режимах облучения лимфоцитов, достоверно различаются, в результате чего прямая доза-эффект при облучении лимфоцитов in vitro имеет достоверно больший угол наклона к оси X, чем прямая in vivo, то есть облучение лимфоцитов in vivo менее эффективно, чем in vitro. Кроме того, при облучении лимфоцитов in vivo наблюдается бблыпая гетерогенность индивидуальных результатов, чем при облучении in vitro. Оказалось также, что при облучении

лимфоцитов in vitro линейные функции зависимости доза-эффект наилучшим

образом описывали имеющиеся результаты как индивидуальные, так и

суммарные. В то же время при облучении лимфоцитов in vivo, хотя линейные

модели в большинстве случаев также были достоверны, предпочтительнее

оказывались нелинейные зависимости.

Рисунок 1. Зависимости доза-эффект для частоты клеток с НХО при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo (усреднённая модель).

4fl g 3,5 I 3,0

I »

S 2.0

« 1,5 И ^

I "

0,5 0,0

Доза, сГр

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Можно предположить несколько причин, по которым фракционированное облучение лимфоцитов in vivo оказалось менее эффективным, чем острое in vitro:

1. Эффект фракционирования дозы и особенности механизма образования нестабильных хромосомных обменов.

2. Отбор повреждённых клеток в процессе пролиферации предшественников лимфоцитов in vivo и по механизму интерфазной гибели.

3. Проявление реакции адаптивного ответа при облучении лимфоцитов in vivo.

Как правило, эффект фракционирования дозы, выражающийся в снижении количества повреждений по сравнению с однократным воздействием, связывают с процессом репарации. В случае интерфазных клеток (лимфоциты, находящиеся в стадии GO) эффект фракционирования дозы не может объясняться репарацией первичных повреждений в процессе редупликации ДНК. Поэтому наиболее логичным объяснением могли бы быть особенности механизма образования хромосомных обменов, предполагающего пространственное и временное совпадение двух двойных разрывов ДНК. Меньшую эффективность фракционированного облучения по сравнению с острым в рамках классической фрагментационной теории можно объяснить ограниченным временем существования первичных двойных разрывов цепи ДНК и необходимостью для образования межхромосомного обмена стереометрического совпадения двух таких разрывов. Согласно альтернативной "обменной" гипотезе, образование хромосомных обменов происходит по рекомбинационному механизму и определяется не столько зависящим от мощности дозы количеством одновременно возникающих двойных разрывов ДНК, сколько характером протекания процессов репарации, эффективность которых увеличивается при фракционировании дозы.

Против объяснения наблюдаемых различий в выходе НХО при остром (in vitro) и фракционированном (in vivo) облучении лимфоцитов с позиции фрагментационной теории образования хромосомных обменов свидетельствует данные по in vivo и in vitro дозовой зависимости стабильных хромосомных обменов - транслокаций, полученные в нашей лаборатории (Воробцова и др., 2002) при исследовании лимфоцитов периферической крови тех же доноров

методом FISH (рисунок 2). Как видно из рисунка, зависимости частоты транслокаций от дозы при остром облучении лимфоцитов in vitro и фракционированном in vivo не различаются. В этом случае различие в режимах облучения не оказало влияния на выход аберраций, являющихся, как и НХО, аберрациями "двуразрывного" типа. Возможно, разница в ответах на облучение лимфоцитов in vivo и in vitro по тестам транслокаций и дицентриков связана с различием механизмов их образования (Natarajan et al., 1994). Таким образом, сам факт «растяжения» дозы во времени, обусловленный её фракционированием, по-видимому, вряд ли может быть объяснением наблюдаемых нами различий в частоте НХО, индуцируемых облучением лимфоцитов in vivo и in vitro.

Рис.2. Зависимость доза-эффект для частоты транслокаций при облучении лимфоцитов in vivo и in vitro.

А А

Доза, сГр

Другим возможным объяснением уменьшения цитогенетического эффекта при общем облучении пациентов по сравнению с облучением их крови in vitro может быть отбор аберрантных клеток в процессе пролиферации и

дифференцировки предшественников лимфопоэза, ускорение которого показано при облучении в малых дозах (Жербин и Чухловин, 1989). Однако, согласно расчётам, даже двукратное усиление пролиферативной активности приведёт к обновлению не более чем 1% от общей популяции, поскольку в норме у здоровых доноров среднего возраста в кровь ежесуточно поступает от 30 до 50 лимфоцитов на 1 мл3 (Begeman et al., 1978). С учётом того, что способность клеток к делению с возрастом снижается, а все обследованные пациенты были пожилыми людьми, вклад прошедших митотический отбор клеток за время облучения больного (5-7 дней) не может быть столь существенным, чтобы объяснить наблюдаемое снижение частоты НХО при облучении лимфоцитов in vivo по сравнению с in vitro. Эффект фракционирования дозы, выражающийся в снижении частоты ХА в лимфоцитах, облучённых in vivo, возможно связан с гибелью фракции радиочувствительных клеток по интерфазному механизму и задержкой продвижения других, несущих повреждения, клеток по циклу (Никольский и Котеров, 1999). Более повреждённые клетки могут быстрее элиминировать из кровяного русла также в связи с обусловленной облучением ускоренной терминальной дифференцировкой (Хансон и Комар, 1985), либо под действием глюкокортикоидов и других цитотоксических продуктов, выделяемых в кровь при облучении in vivo и способных вызывать интерфазную гибель тех же самых популяций клеток, которые являются радиопоражаемыми (Жербин и Чухловин, 1989).

И, наконец, ещё одним фактором, влияние которого могло привести к уменьшению эффективности облучения лимфоцитов in vivo по сравнению с облучением in vitro, является комплекс компенсаторных механизмов, объединяемых понятием адаптивного ответа (АО). Первая фракция общего облучения пациентов (11,5 сГр) может рассматриваться как адаптирующая, поскольку она удовлетворяет необходимым критериям (мощность и величина дозы). В отличие от стандартных условий, в которых проявляется АО, в нашем случае повреждающие ("разрешающие") дозы были небольшими. Это, однако,

вряд ли могло быть причиной, препятствующей запуску механизмов, подготавливающих клетки к более эффективной репарации после первой фракции облучения.

Считается (Рябченко и др., 1996), что стимуляция механизмов адаптивного ответа в первую очередь приводит к репарации клеток с одиночными первичными повреждениями и в меньшей степени - со множественными. В результате, наряду с уменьшением относительного числа клеток с аберрациями, отмечается повышенное количество клеток, несущих более чем одну аберрацию. Чем значительнее роль систем восстановления, тем больше распределение онтогенетических повреждений будет отличаться от пуассоновского (Гераськин и соавт., 1999). Проверка экспериментальных данных, полученных в нашей работе, на их соответствие пуассоновскому распределению показала, что при облучении лимфоцитов in vivo наблюдаемое количество клеток с более чем одним нестабильным обменом более существенно превышает теоретически предсказываемое, чем при облучении лимфоцитов in vitro (таблица 7).

Несмотря на то, что влияние каждого из перечисленных факторов на цитогенетический ответ лимфоцитов при тотальном облучении пациентов, по-видимому, невелико, однако совместное их однонаправленное воздействие может обусловить менее выраженный эффект in vivo облучения лимфоцитов.

Таблица 7. Проверка экспериментальных данных на соответствие

распределению Пуассона.

IN VIVO IN VITRO

Теор. Экспер. х2 Теор. Экспер. х2

Клеток без НХО 27628 27647 0,01 23847 23859 0,01

Клеток с 1 НХО 409,9 382 1,90 422,4 405 0,72

Клеток с >1 НХО 3,1 12 26,18 3,8 9 7,28

Суммарно 28,09 8,01

Полученные в настоящей работе результаты дают возможность проанализировать характер кривых доза-эффект в диапазоне малых доз. Этот вопрос активно обсуждается в литературе последнего времени (Спитковский, 1992, Гераськин, 1995, 1998, Эйдус, 1999). Сопоставление индивидуальных кривых дозовой зависимости частоты клеток с НХО при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo показывает, что в диапазоне доз от 20 до 50 сГр у некоторых пациентов имеется дозонезависимое плато, которое чаще наблюдается при облучении лимфоцитов in vivo. Межиндивидуальные различия, возможно, являются следствием модифицирующего влияния на цитогенетическую реакцию клеток совокупности различных эндогенных факторов, разных у разных пациентов и приводящих либо к появлению дозонезависимого плато (не наблюдавшемуся в условиях in vitro), либо к увеличению его протяжённости и смещению его начальной границы в диапазон более низких доз.

Таблица 8. Прирост частоты клеток с НХО с увеличением дозы при облучении лимфоцитов in vivo (объединённые данные по всем пациентам).

Дозы, сГр Прирост частоты клеток с НХО, %

0-11,5 0,53

11,5-23 0,36

23-34,5 0,20

34,5-46 0,32

46-57,5 0,46

Отмеченная у отдельных пациентов нелинейность зависимости эффекта от дозы нивелируется при объединении данных. Это наиболее очевидно для условий облучения лимфоцитов in vitro, когда линейные модели, безусловно, предпочтительнее. В случае облучения лимфоцитов in vivo, хотя при суммировании данных линейные модели были также достоверны, нелинейные зависимости доза-эффект оказались более значимыми. В таблице 8 приведены

усреднённые значения прироста частоты клеток с НХО с дозой при облучении лимфоцитов in vivo.

Рис.3. 95% доверительный интервал оценки дозы при частоте клеток с НХО, равной 1,4% (с учётом ошибки определения).

Видно, что максимальный, отмеченный после первой фракции облучения прирост эффекта снижается вплоть до третьей фракции, а затем вновь нарастает. Это осложняет верификацию поглощённых человеком доз на участке кривой дозовой зависимости между дозами 23 и 46 сГр. Однако ни на одном участке не было обнаружено полного отсутствия прироста, что свидетельствует о принципиальной возможности достаточно точной идентификации дозы общего облучения при статистической обеспеченности цитогенетического анализа. Рисунок 3 иллюстрирует величину 95% доверительного интервала оценки дозы на наиболее пологом участке кривой. Например, видно, что величина эффекта 1,4%, соответствующая точке 30 сГр на дозиметрической кривой, при 3000 проанализированных метафазах может быть обнаружена после общего

облучения в дозах от 12 до 52 сГр. Доверительный интервал оценки можно уменьшить за счёт увеличения количества анализируемых клеток (на рисунке отмечен пунктиром), однако, это уменьшение имеет свой предел, обусловленный 95%-ным интервалом самой модели.

На практике для верификации поглощённых человеком доз используют калибровочные кривые, полученные при остром облучении лимфоцитов in vitro. В случаях острого и относительно равномерного аварийного облучения оценка поглощённой дозы, как правило, производится с использованием уравнений линейно-квадратичной зависимости частоты клеток с НХО. При этом учитывается вклад двух регрессионных коэффициентов - линейного и квадратичного (а+р). В случаях же хронического и фракционированного облучения для реконструкции дозы используют только линейный коэффициент, что на наш взгляд представляется недостаточно корректным. Поскольку получение калибровочной кривой при фракционированном облучении лимфоцитов in vitro технически затруднительно, удобной моделью, позволяющей построить калибровочную кривую доза-эффект для фракционированного облучения лимфоцитов, является тотальное облучение онкологических пациентов во фракционированном режиме.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что при биодозиметрии, основанной на частоте дицентриков, использование in vitro калибровочных кривых может приводить к тому, что реальная поглощенная человеком доза окажется заниженной. Наличие калибровочной кривой доза-частота НХО в лимфоцитах, полученной в условиях фракционированного общего облучения человека, позволит избежать этого недостатка и получать более точные оценки поглощённых человеком доз. В то же время возможное существование дозонезависимого плато на in vivo кривой доза-эффект (см. рис.3) может вносить некоторую неопределённость в оценке доз в интервале от 20 до 40 сГр.

ВЫВОДЫ.

1. Цитогенетические реакции лимфоцитов на фракционированное тотальное облучение онкологических пациентов и острое облучение лимфоцитов тех же больных in vitro в диапазоне доз от 0 до 57,5 сГр достоверно различаются.

2. При облучении лимфоцитов in vitro как индивидуальные, так и суммарные дозовые зависимости частоты клеток с НХО в исследованном диапазоне доз удовлетворительно описываются линейными моделями. При облучении лимфоцитов in vivo суммарные дозовые зависимости частоты клеток с НХО удовлетворительно описываются линейными моделями, однако в ряде индивидуальных случаев эти модели достоверно нелинейны.

3. Прямая доза-эффект in vitro имеет достоверно больший угол наклона к оси X, чем соответствующая прямая in vivo, что свидетельствует о большей эффективности облучения лимфоцитов in vitro, чем in vivo.

4. Межиндивидуальные различия в радиочувствительности лимфоцитов более выражены при их облучении in vivo, чем in vitro.

5. Использование in vitro калибровочных кривых при биологической дозиметрии по частоте НХО, может приводить к занижению реально поглощенной человеком дозы.

6. Полученная в данном исследовании кривая доза-частота НХО при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo может быть рекомендована для реконструкции доз в случае фракционированного облучения человека.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Vorobtsova I.E., Darroudi F., Tymofeyeva N.M., Semyonov A.V., Kanayeva A.J. and Natarajan A.T. The use of fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect chromosome aberrations in lymphocytes of patients under radiotherapy regimen, after in vivo and in vitro irradiation. // Abstracts of 28thAnnual Meeting EEMS. - Salzburg. - 1998. - P. 108-109.

2. Vorobtsova I.E. Bogomasova A.N., Tymofeyeva N.M. and Semyonov A.V. Dose and age-response of stable chromosome aberrations frequency in human peripheral lymphocytes detected by FISH. // Abstracts of International Conference on Biodosimetry and 5Л International Symposium on ESR Dosimeter and Applications. -Moscow/Obninsk. - June 22-26. - 1998. - P.82.

3. Kanayeva A.J., Vorobtsova I.E., Tymofeyeva N.M., Semyonov A.V., Darroudi F. and Natarajan A.T. Dose-response of stable chromosome aberrations detected by FISH in human lymphocytes irradiated in vivo and in vitro. II Abstracts of Satellite Meeting to 29th Annual Meeting of EEMS and 16th Annual Meeting of NordEMS. - Vilnius. Lithuania. Vilnius University. - 30 June-3 July 1999. - P.71-72.

4. Воробцова И.Е., Семёнов A.B., Канаева А.Ю., Тимофеева Н.М., Яковлева Т.К. и Жаринов Г.М. Сравнение онтогенетической реакции лимфоцитов человека на облучение в малых дозах у-излучения in vivo и in vitro. Нестабильные хромосомные обмены, определяемые FPG-методом. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - Т.40. - №6. - С.645-650.

5.1. Vorobtsova, F. Darroudi, A. Semyonov, A. Kanayeva, N. Tymofeyeva, Т. Yakovleva, G. Zharinov and A.T. Natarajan Analysis of chromosome aberrations by FISH and Giemsa assays in lymphocytes of cancer patients undergoing whole-body irradiation: comparison of in vivo and in vitro irradiation. // International Journal Radiation Biology. - 2001. - V.77. -№11. - P.l 123-1131.

6. Канаева А.Ю., Воробцова И.Е., Семёнов A.B., Тимофеева Н.М. и Жаринов Г.М. Сравнение дозовых зависимостей выхода дицентриков и транслокаций от дозы облучения лимфоцитов человека in vivo и in vitro методом FISH. // Тезисы докладов конференции "Новые технологии в медицинской радиологии." - 2001. - Санкт-Петербург. - С.115.

7. Семёнов A.B., Воробцова И.Е., Канаева А.Ю. и Зверева И.А. Сравнение дозовых зависимостей выхода нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro. // Тезисы докладов конференции "Новые технологии в медицинской радиологии." - 2001. - Санкт-Петербург. - С.116.

8. Семёнов A.B., Воробцова И.Е., Канаева А.Ю. и Зверева И.А. Анализ индивидуальных зависимостей от дозы частоты дицентриков при у облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro. // Тезисы докладов IV съезда по радиационным исследованиям. - 2001. - Москва. - Т. 1. - С. 107.

9. Воробцова И.Е., Канаева А.Ю., Тимофеева Н.М., Семёнов A.B., Жаринов Г.М., Дарруди Ф. и Натараджан А.Т. Сравнение цитогенетической реакции лимфоцитов человека на облучение в малых дозах у-из лучения in vivo и in vitro. Транслокации и дицентрики, определяемые FISH-методом. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2002. - Т.42. - №2. - С.117-123.

10. Воробцова И.Е., Семёнов A.B., Канаева А.Ю. и Петрова И.А. Применение метода "CHROMOSOME PAITING" в области геронтологии, оценки радиационной генотоксичности и биодозиметрии. // Цитология. - 2002. -Т.44. - С.867.

QUsûj'/l W - 9 1 4 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенов, Алексей Владимирович

0 ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Спонтанный уровень нестабильных хромосомных обменов в лимфоцитах периферической крови человека.

1.2 Зависимость частоты нестабильных хромосомных обменов от дозы при облучении лимфоцитов человека in vitro.

1.3 Особенности дозовой зависимости неста бильных хромосомных обменов в диапазоне малых доз облучения.

1.4 Зависимость частоты нестабильных хромосомных обменов от дозы при облучении лимфоцитов in vivo.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Характеристика пациентов -доноров крови.

2.2 Методика тотального облучения пациентов и дозиметрия.

2.3 Облучение лимфоцитов in vitro и дозиметрия.

2.4 Приготовление цитогенетическихпрепара тов.

2.5 Микроскопический анализ препара тов.

2.6 Статистическая обработка результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Индивидуальные зависимости доза-частота клеток с нестабильными хромосомными обменами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение дозовых зависимостей частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro"

Актуальность проблемы. Ускорившееся с конца 40-х годов загрязнение человеком среды обитания, вызванное бурным ростом промышленности, испытанием ядерного оружия и использованием ядерной энергии, обусловило необходимость разработки биологических тестов, позволяющих оценивать генотоксичность различных факторов химической и физической природы, в первую очередь - ионизирующего излучения. Известно, что степень клинического проявления последствий облучения зависит от уровня поглощённой дозы, характера облучения и времени экспозиции. В тех случаях, когда эти параметры известны, можно с большой степенью вероятности прогнозировать ранние и отдалённые реакции организма на облучение. Однако в случаях неконтролируемого облучения при аварийных ситуациях, когда данные физической дозиметрии неполны или отсутствуют, для оценки поглощённой организмом дозы используются биологические маркеры радиационного воздействия. Другой областью применения биологических маркеров действия ИИ является оценка индивидуальной радиочувствительности при терапевтическом облучении онкологических пациентов. Она необходима для прогнозирования как общей клинической реакции организма на облучение, так и эффективности самой радиотерапии. Межиндивидуальная вариабельность в радиочувствительности людей усиливает значимость биологических критериев оценки радиационного воздействия, поскольку в клиническом отношении важнее установить реакцию конкретного человека на облучение, чем достоверно рассчитать поглощённую им физическую дозу. Поэтому биологическая дозиметрия часто оказывается предпочтительнее физической.

Среди существующих в настоящее время многочисленных способов биодозиметрии наиболее точным и информативным является метод классического анализа аберраций хромосом (АХ) в метафазах культивируемых лимфоцитов крови человека (Севанькаев и Деденков, 1990). Первыми этот метод использовали Bender and Gooh (1962) для исследования индуцируемых радиацией АХ уже через два года после разработки Moorhead et al. (1960) способа культивирования лимфоцитов периферической крови путём стимуляции их к делению фитогемагглютинином (ФГА). В 1966 году те же авторы впервые применили этот метод для оценки доз у трёх человек, пострадавших от воздействия смешанного у-нейтронного излучения в дозах — по данным физической дозиметрии - 12, 22,5 и 47 рад. Метод получил широкое распространение и признание во всём мире и был рекомендован Всемирной Организацией по Атомной Энергии (IAEA, 1986) в качестве официального метода биологической дозиметрии и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве тест-системы для оценки мутагенности различных факторов окружающей среды, особенно антропогенного происхождения. По выражению Littlefield et al. (1991) он стал "признанным лидером" среди множества развивающихся методов биомаркерной индикации радиационного воздействия.

Преимущества этого метода определяет уникальное сочетание ряда особенностей экспериментального материала, а именно лимфоцитов периферической крови человека. Это: простота получения клеток и сравнительно несложная техника их культивирования; высокая концентрация лимфоцитов, способных к бласттрансформации (106/мл) и, в связи с этим, возможность использования микроколичеств крови; естественная синхронизация лимфоцитов периферической крови в стадии Go клеточного цикла; низкий спонтанный уровень АХ в лимфоцитах периферической крови у контрольных доноров; их высокая радиочувствительность по сравнению с клетками большинства других тканей. Возможность оценки действия радиации непосредственно на клетки человека снимает необходимость экстраполяции данных, полученных на животных.

Кроме того, ценным качеством цитогенетического метода является существование специфичных для радиационного воздействия хромосомных перестроек, именуемых нестабильными хромосомными обменами, а именно, дицентриков и кольцевых хромосом. Для этих обменных хромосомных аберраций характерен низкий спонтанный уровень, что позволяет достоверно улавливать изменения частоты дицентриков и центромерных колец при относительно невысоких дозах, и хорошо изучена дозовая зависимость их частоты при облучении лимфоцитов in vitro разными видами ионизирующих излучений.

Существует достаточно много работ, в которых по уровню АХ осуществляется восстановление как индивидуальных, так и коллективных доз в случаях неконтролируемого облучения людей. Процедура реконструкции поглощённой человеком дозы сводится к следующему. В ранние сроки после облучения частота индуцированных НХО оценивается путём прямого цитогенетического анализа, а в отдалённые сроки — по остаточной частоте дицентриков с использованием различных математических моделей, учитывающих продолжительность жизни лимфоцитов и скорость их элиминации. Измеренная или рассчитанная частота НХО затем сопоставляется с калибровочной кривой, полученной при облучении крови разными дозами in vitro. В случае однократного лучевого воздействия на человека использование in vitro калибровочных кривых, полученных также в режиме однократных облучений лимфоцитов, представляется вполне оправданным. Однако, при фракционированном / пролонгированном характере лучевого воздействия, имевшем место при радиационных авариях (Чернобыль, Маяк), испытаниях ядерного оружия (Семипалатинск), при профессиональном и терапевтическом облучении использование таких калибровочных кривых может приводить к искажённым оценкам поглощённых доз. В этом случае более корректным было бы использование калибровочных кривых, полученных в аналогичном (фракционированном) режиме облучения клеток крови. Однако, из-за ограниченной жизнеспособности лимфоцитов в культуре, получение таких кривых на лимфоцитах в экспериментах in vitro методически трудновыполнимо.

Обоснованием для использования in vitro-калибровочных кривых в целях реконструкции поглощённых человеком доз служат результаты экспериментов на животных, в подавляющем большинстве которых было показано, что при однократном остром облучении лимфоцитов in vitro и in vivo частоты НХО не различаются. Аналогичные работы по изучению дозовых зависимостей радиационных маркеров при разных условиях облучения лимфоцитов человека единичны, их результаты разноречивы и, как правило, статистически малообеспечены.

Поэтому представляется важным и актуальным сравнение частот НХО, индуцируемых радиацией в лимфоцитах человека, при облучении их в условиях in vitro и in vivo. Это можно осуществить на онкологических пациентах, в схему лучевого лечения которых включено тотальное фракционированное облучение в малых дозах, осуществляемое до начала локального облучения в больших дозах.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение дозовой зависимости частоты нестабильных хромосомных обменов в лимфоцитах периферической крови при тотальном облучении человека в малых дозах и сравнение её с зависимостью доза-эффект при облучении лимфоцитов in vitro.

Данная цель предопределила постановку следующих задач:

4. Сравнить эффективность образования дицентриков и центромерных колец при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo и остром in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в рамках одного исследования, у одних и тех же людей изучены нестабильные хромосомные обмены, индуцируемые малыми дозами ИИ при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo и остром in vitro. Охарактеризована межиндивидуальная вариабельность в радиочувствительности лимфоцитов при разных условиях облучения. Впервые установленная в работе большая эффективность острого облучения лимфоцитов in vitro в сравнении с фракционированным in vivo свидетельствует о возможности занижения поглощённых человеком доз при их оценке с использованием in vitro калибровочных кривых. Полученная в ходе работы калибровочная кривая доза-эффект для фракционированного облучения лимфоцитов in vivo может быть рекомендована для использования при восстановлении поглощённых доз в случаях неконтролируемого облучения человека.

Положения, выносимые на защиту.

1. Дозовые зависимости частоты нестабильных хромосомных обменов в диапазоне от 0 до 60 сГр при облучении лимфоцитов как in vitro, так и in vivo удовлетворительно описываются линейными моделями.

2. Эффективность однократного облучения лимфоцитов in vitro по частоте клеток с дицентриками и центромерными кольцами достоверно превышает эффективность фракционированного облучения in vivo.

3. Межиндивидуальные различия в радиочувствительности разных доноров более выражены при фракционированном облучении лимфоцитов in vivo, чем при остром in vitro.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 17 публикациях: 6 статьях и 11 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и литературного обзора, методической части, результатов исследования и обсуждения, выводов, приложения и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста, в число которых входит 41 таблицу, 19 рисунков и 13 таблиц «Приложения». Список цитированной литературы включает 153 источника.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенов, Алексей Владимирович, Санкт-Петербург

1. Ахматуллина Н.Б., Рыскулова СТ., Искандарова Т.А. и Чередниченко О.Г. К механизмам формирования адаптивного эффекта in vitro и in vivo. Тезисы Международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков". М. 2000. 74.

2. Бочков Н.П. Хромосомы человека и облучение. «Атомиздат». 168 с.

3. Бочков Н.П. Метод учёта хромосомных аберраций как биологический индикатор влияния факторов внешней среды. 1974. М. 32 с.

4. Бурлакова Е.Б. с соавт. Особенности биологического действия малых доз облучения. Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т.Зб. ВЫП.4.-С.610-631.

5. Виленчик М.М. Нестабильность ДНК и отдалённые последствия 1971. М.: воздействия излучений. 1987. М. 192 с.

6. Возилова А.В. Отдалённые цитогенетические эффекты хронического облучения населения Южного Урала. Автореферат на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Москва. 1997. 24 с.

7. Воробцова И.Е., Михельсон В.М., Воробьёва М.В., Плескач Н.М., Богомазова А.Н., Прокофьева В.В. и Пюккенен А.Ю. Результаты цитогенетического обследования ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, проведённого в разные годы. Радиационная Радиоэкология. 1994. Т.34. Вып.6. 798-804. биология.

8. Воробцова И.Е., Воробьёва М.В., Богомазова А.Н., Пюккенен А.Ю. и Архангельская Т.Б. Цитогенетическое обследование детей Санкт- Петербургского региона, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС. Частота нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т.35. Вып.5. 630-635.

9. Гераськин А. Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения. Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т.35. Вып.5. 798804.

10. Гераськин А. Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения. Автореферат на соискание учёной степени доктора биологических наук. Обнинск. 1998. 5 0 с.

11. Гераськин СЛ. и Севанькаев А.В. Универсальный характер закономерностей индукции цитогенетических повреждений низкодозовым облучением и проблема оценки генетического риска. Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т.39. №1. 35-40.

12. Гончарова Р.И. Отдаленные последствия Чернобыльской катастрофы: оценка через двенадцать лет. Экология. Геология. Водопользование. 1999. Т.1. Вып.7. 4-15.

13. Горбунова И.Н., Иванов К.Ю., Нагиба В.Н., Никанорова Е.А., Профе О.С., Хаймович Т.И, Акаева Э.А., Елисова Т.В., Иофа Э.Л., Нилова И.Н., Костина Л.Н., Рубанович А.В., Шевченко В.А., Богомазова А.Н., Вилкина Г.А., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д. и Снигирёва Г.П. Калибровочные кривые "доза-эффект" для хромосомных аберраций лимфоцитов периферической крови, облучённых у-излучением Со. Тезисы Международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков". М. 2000а. 257.

14. Горбунова И.Н., Иванов К.Ю., Нагиба В.Н., Никанорова Е.А., Профе О.С., Хаймович Т.И, Акаева Э.А., Елисова Т.В., Иофа Э.Л., Нилова И.Н., Костина Л.Н., Рубанович А.В., Шевченко В.А., Богомазова А.Н., Вилкина

15. Жербин Е.А. и Чухловин А.Б. Радиационная гематология. М.: «Медицина». 1989. 176 с.

16. Жестянников В.Д. Репарация ДЬЖ и её биологическое значение. 1979. Л.: «Наука». 1979. 288 с.

17. Жижина Г.П. Связь структурных характеристик ДНК эукариот и её чувствительности к действию малых доз ионизирующей радиации. Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т.39. №1. 10-20.

18. Заичкина СИ., Клоков Д.Ю., Розанова О.М. и др. Зависимость величины цитогенетического адаптивного ответа в клетках костного мозга крыс от дозы хронического у-облучения in vivo. Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т.39. №4. С373-383.

19. Ильичёв СВ., Кочетков О.А., Крючков В.П., Мазурик В.К., Носовский А.В., Павлов Д.А., Снисар И.Б. и Цовьянов А.Г. Ретроспективная дозиметрия участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Под редакцией В.П. Крючкова и А.В. Носовского. 1

20. Киев: «Седа-стиль». 256 с.

21. Колюбаева СН., Прокопчук Б.И., Ракецкая В.В., Мясникова Л.В., Комар В.Е. Сравнительное исследование микроядерного теста и хромосомных

22. Комар В.Е. Современное состояние проблемы биологической индукции лучевых поражений. Радиобиология. 1992. Т.32. Вып.1. 84-97.

23. Мазник Н.А. и Винников В.А. Динамика цитогенетических эффектов в лимфоцитах периферической крови у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС. Цитология и генетика. 1997. Т. 31. Н. 6. 41 47.

24. Мельнов СБ., Корытько С, Винник Л.М. и Исайкина Я.И. Динамическое изучение частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови ликвидаторов 1986-1987 гг. Сборник материалов IV международной конференции "Чернобыльская катастрофа: прогноз, профилактика, лечение и медико-психологическая реабилитация пострадавших." Минск. 1995. 259.

25. Мельнов СБ. Биологическая дозиметрия: теоретические и практические аспекты. 2000.- Минск. 226 с.

26. Неронова Е.Г. Цитогенетические показатели нестабильности генома у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленном периоде. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Санкт-Петербург. 1997.

27. Никольский А.В. и Котеров А.Н. Радиоадаптивный ответ клеток млекопитающих. Медицинская радиология и радиационная безопасность. 1999. Т.44. №6. 5-19.

28. Пилинская М.А., Шеметун A.M., Дыбский С., Редько Д.В. и Знаевская И.А. Цитогенетический мониторинг лиц, пострадавших от аварии на Чернобыльской АЭС. Цитология и генетика. 1994. Т. 28. №3. 18-24.

30. Пяткин Е.К., Нугис В.Ю., Чирков А.А. Оценка поглощенной дозы по результатам цитогенетических исследований культур лимфоцитов у пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС. Медицинская радиология. 1989. Т.34. -№6. 52-57.

31. Рождественский Л.М. Концепция биологического действия ионизирующей радиации низкого уровня (Анализ проблемы в аспектах пороговости эффектов и радиочувствительности/радиореактивности

32. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. 1

33. Минск: «Вышэйшая школа». 328 с.

34. Рябченко Н.И., Антошина М.М., Насонова В.А. и Фесенко Э.В. Радиационная Биология. Радиоэкология, 1996. Т.36. №6. 825-833.

35. Севанькаев А.В. и Насонов А.П. Калибровочные дозовые кривые хромосомных аберраций лимфоцитов человека. Медицинская радиология. 1978. Т.23. -№б. 26-33.

36. Севанькаев А.В. и Деденков А.Н. Актуальные проблемы современной радиобиологии в свете оценки и прогнозирования последствий анализа на Чернобыльской АЭС Радиобиология. 1990. Т.ЗО. Вьш.5. 579584.

37. Севанькаев А.В. Радиочувствительность хромосом лимфоцитов человека в митотическом цикле. 1987. М. «Энергоатомиздат». 160 с.

38. Севанькаев А.В., Потетня О.И., Жлоба А.А., Моисеенко В.В., Потетня В.И., Анкина М.А., Голуб Е.В., Епифанова Н.И., Завитаева Т.А., Козлов В.М., Михайлова Г.Ф., Поздышкина О.В. и Пятенко B.C. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживаюших в загрязнённых радионуклидами районах Калужской области. Радиационная биология. Радиоэкология. 1995а. Т.35. Вьш.5. 581587.

39. Снигирёва Г.П., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д. и Вилкина Г.А. Отдалённые цитогенетические эффекты у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Тезисы Международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков". М. 2000. 331.

40. Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и её возможные приложения к трактовке медикобиологических последствий. Радиобиология. 1992. Т.32. Вып.З. 382-400.

41. Спитковский Д.М. О некоторых новых биофизических и биологических аспектах механизмов при воздействии малых и близких к ним доз

42. Талызина и Спитковский Радиобиология. 1991. Т.31. Вып.4. 606-611.

43. Тимофеев-Ресовский Н.В., Иванов В.И., Корогодин В.И. Применение принципа попадания в радиобиологии. 1968. М. Атомиздат. 228 с.

44. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. М.: «Издательство Академии Наук СССР». 1963. 324 с.

45. Хандогина Е.К., Зверева СВ., Агейкин В.А., Марченко Л.Ф., Мутовин Г.Р., Снигирёва Г.П., Ленская Р.В., Буянкин В.М., Шахтарин В.В. и Акифьев А.П. Цитогенетическое обследование различных групп детей, проживающих в районах Брянской области, загрязнённых в результате Чернобыльской аварии. Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. -Т.35. ВЫП.5.-С. 618-625.

46. Шевченко В.А., Семов А.В., Акаева Е.А., Елисова Т.Н., Иофа Э.Л., Нилова И.Н., Стефан Г., Ромм X. И Буркарт В. Цитогенетические эффекты у лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС. Радиационная Биология. Радиоэкология. 1995а. Т.35. Вып.5. 646654.

47. Шевченко В.А., Снигирёва Г.П., Сусков И.И., Акаева Э.А., Елисова Т.Н., Иофа Э.Л., Нилова И.Н., Костина Л.Н., Новицкая Н.Н., Сидорова В.Ф. и Хазинс Б.Д. Цитогенетические эффекты у населения Алтайского края,

48. Эйдус Л.Х. О проблеме экстраполяции дозовой зависимости цитогенетических повреждений от больших доз к малым. Радиационная Биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. №1. 177-180.

49. Agresti А. А Survey of Exact Inference for Contegency Tables. Statistical Science.- 1992.-V.7.--P.131-153.

50. Anderson D., Jenkinson P.C, Dewdney R.S., Francis A.J., Goldbert P. and Butterworth K.R, Chromosome aberrations, mutagen-induced blastogenesis and prolipherative index in peripheral lymphocytes from 106 control individuals of the U.K. population. Mutation Research. 1988. V.204. P.407-420.

51. Anderson H.C. The spontaneous frequency of chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges in cultured peripheral lymphocytes of a single blood donor sampled more than 200 times. Mutation Research. 1993. V.286. P281-292.

52. Antonie J.L., Gerber G.B., Leonard A., Richard F. And Wambersie A. Chromosome aberration in patients treated with telecobalt therapy for mammary carcinoma. Radiation Research. 1981. V.86. P. 171-177. 56. Awa A.A., Sofuni Т., Honda Т., Itoh M., Neriishi S. and Otake M. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic

53. Bajerska A. and Liniecki J. The influence of X-ray dose and time of its delivery in vitro on the yield of chromosomal aberrations in the peripheral blood lymphocytes. International Journal Radiation Biology. 1969. V.16. №5. -P.467-481.

54. Bajerska A. and Liniecki J. The yield of chromosomal aberrations in rabbit lymphocytes after irradiation in vitro and in vivo. Mutation Research. 1975. -V.27.-P.271-284.

55. Barjaktarovic N. and Savage J.R.K. R.B.E. for d(42Mev)*Be neutrons based on chromosome-type aberrations induced in human lymphocytes and scored in cell at first division. International Journal Radiation Biology. 1980. V.37. p.667.

56. Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miro R., Ribas M., Subias A. and Egozcue J. Establishment and validation of a dose-effect curve for 7-rays by cytogenetic analysis. Mutation Research. 1995a. V.326. P.65-69.

57. Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miro R., Ribas M., Subias A. and Egozcue J. Occupational exposure to radiation induces an adaptive response in human lymphocytes. International Journal Radiation Biology. 1995b. V.67.-№2.-P.187-191.

58. Bauchinger М., Schmid Е. and Dresp J.. Calculation of dose-rate dependence of the dicentric yield after Co y-irradiation of human lymphocytes. International Joumal Radiation Biology. 1979. V.35. -p.229-233.

59. Bauchinger M., Schmid E., Braselmarm H. and Kulka U. Chromosome aberrations in peripheral lymphocytes from occupants of houses with elevated indoor radon concentrations. Mutation Research. 1994. V.310, P.135142.

60. Bauchinger M. Cytogenetic researches after accidental radiation exposure. Stem Cells.-1995.-V.13.-Suppl.l.-P.182-190.

61. Bender M.A. Chromosome aberrations in irradiated human subjects. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. V. 114. p.249-251.

62. Bender M.A. and Brewen J.G. Factors influencing chromosome aberration yields in the human peripheral leukocyte system. Mutation Research. 1969. -V.8.-P.383-399.

63. Bender M.A. and Gooch P.C. Types and rates of X-ray-induced chromosome aberrations in human blood irradiated in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) -1962.-V.48.-P.522-532.

64. Bender M.A. and Gooch P.C. Somatic chromosome aberrations induced by human whole-dose irradiation: The «Recuplex» Critically Accident. Radiation Research. 1966. V.29. P.568-582.

65. Bender M.A., Awa A.A., Brooks A.L., Evans H.J., Groer P.G., Littlefield L.G., Pereira C Preston R.J. and Wachholz B.W. Currents status of cytogenetic

66. Bender M.A., Preston R.J., Leonard R.C., Pyatt B.E., Gooh P.C. and Shelby M.D. Chromosomal aberrations and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample. Mutation Research. 1988b. V.204. P.421-433.

67. Bender M.A., Preston R.J., Leonard R.C., Pyatt B.E. and Gooh P.C. Chromosomal aberrations and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample. IL Extension of age range. Mutation Research. 1989. V.212. P. 149-154.

68. Bender M.A., Preston R.J., Leonard R.C., Pyatt B.E. and Gooh P.C. On the distributions of spontaneous chromosomal aberrations in human peripheral blood lymphocytes in culture. Mutation Research. 1990. V.244. P.215220.

69. Blackwell N., Stevenson A.C. and Wiemik G. Chromosomal findings in patients treated with small doses of iodine-

70. Mutation Research. 1974. V.25. p.397-402.

71. Brewen J.G. and Gengozian N. Radiation-induced human chromosome aberrations. II. Human in vitro irradiation compared to in vitro and in vivo irradiation of marmoset leukocytes. Mutation Research. 1971. V.13. №4.-P.383-391.

72. Brewen J.G. and Luippold H.E. Radiation-induced human chromosome aberrations: in vitro dose rate studies. Mutation Research. 1971. V. 12. p.305-314.

73. Brewen J.G., Preston R.J. and Littlefield L.G. Radiation-induced human chromosome aberration yields following an accidental whole-body exposure to Co Y-rays. Radiation Research. 1972. V.49. P.647-656.

74. Brown J.K. and McNeill J.R. Biological dosymetry in an industrial radiography accident.//Health Phys. 1971. V.21. P.519-522.

75. Buckton K.E., Brovra W.M.C., Smith P.G, Lymphocyte survival in Men treated with X-rays for ancylosing spondylitis. Nature. 1967. V.214.№87.-P.470-473.

76. Buckton K.E., Langlands A.O., Smith P.G., Woodcock G.E. and Looby P.C. Further studies on chromosome aberration production after whole-body irradiation in man. International Journal Radiation Biology. 1971. V. 19. №4.-p.369-378.

77. Carbonell E., Peris F., Xamena N., Creus A. and Marcos R. Chromosomal aberration analysis in 85 control individuals. Mutation Research. 1996. V.370. P.29-37.

78. Catcheside D.G., Lea D.E. and Thoday J.M. The production of chromosome structural changes in Tradescantia microspores in relation to dosage, intensity and temperature. Journal of Genetics. 1946. V.47- P.137-149.

79. Chung H.W., Ryu E.K., Kim Y.J. and Ha S.W. Chromosome aberrations in workers of nuclear-power plants. Mutation Research. 1996. V.350. P.307-314.

80. Clemenger J.F. and Scott D. In vitro and in vivo sensitivity of cultured blood lymphocytes to radiation induction of chromosome aberrations. Nature (London) New Biology. 1 9 7 1 V.234. p. 154.

81. Clemenger J.F.P. and Scott D. A comparison of chromosome aberration yields in rabbit blood lymphocytes irradiated in vitro and in vivo. International Journal Radiation Biology. 1973. -V.24. №5. P.487-496.

82. Cloos J., Braakhuis J.M., Steen I., Copper M.P., Vries N.D., Nauta J.J.P. and Snow G.B. Increased mutagen sensitivity in head-and-neck squamous-cell carcinoma patients, particularly those with multiple primary tumors. International Joumal of Cancer. 1994. V.56. P.816-819.

83. Dolphin G.W. A review of in vitro dose-effect relationship. In: Mutageninduced chromosome damage in man. Eds. Evans M. and Lloyd D. 1988. p.1-8.

84. Dunst J., Gebracht E. und Neubauer S. Kann man extrem erhohte Strahlensensitivitat von Patienten durch In-vitro-Testung von Lymphozyten erkennen? Strahlentherapie und Onkologie. 1995. -V. 171. №10. P.581586.

85. Edwards A.A., Lloyd D.C. and Prosser J.S. The induction of chromosome aberrations in human lymphocytes by accelerated charged particles. Radiation Protection Dosimeter. 1985. V. 13. №1. P.205-209.

86. Edwards A.A. The use of chromosomal aberrations in human lymphocytes for biological dosimetry. Radiation Research. 1997. -V.

88. Ermakov I., Ranniko S. et al Calculation of the estimated collective effective dose equivalent (Se) due to x-Ray diagnostic examination-estimate of the Se in Finland. Health Physics. 1987. V.35. №1. P.31-36.

89. Ermakov I. and Cherviakov A. Representation of the Dose Field of Co-60 Therapy Units by Empirical Formulae. In: Clinical dosimetry. STL-25. 1

91. Ermakov I., Cherviakov A. et al. Computing patient doses of X-ray examination using a patient size- and sex- adjustable phantom. British Journal Radiology. 1997. V.70. P.708-718.

92. Ewans H.J., Buckton K.E., Hamilton G.E. and Carothers A. Radiation-induced chromosome aberrations in nuclear-dockyard workers. Nature (London). 1979.-V.277.-P.531-534. 94. Hsu Т.е., Cherry L.M. and Samaan N.A. Differential mutagen susceptibility in cultured lymphocytes of normal individuals and cancer patients. Cancer Genetics and Cytogenetics. 1985. V. 17. P.307-313.

93. Galloway S.M., Berry P.K., Nichols W.W., Wolman S.R., Soper K.A., Stolley P.D. and Archer P. Chromosome aberrations in individuals occupationally exposed to ethylene oxide, and in a large control population. Mutation Research. 1986. V.170. p.55-74.

94. Ganguly B.B. Cell division, chromosomal damage and micronucleus formation in peripheral lymphocytes of healthy donors: related to donors age. Mutation Research. 1993. V 2 9 5 P 135-148.

95. Gundy S. and Varga L.P. Chromosomal aberrations in healthy persons. Mutation Research. 1983. V. 120. P. 187-191.

96. Holdsworth D., Tawn E.J. and Lawson A.W. Young people in Seascale cytogenetic survey. Journal Radiology Protection. 1990. V.IO. №1. P. 155-156.

97. Ivanov В., Praskova L., Mileva M., Bulanova M. and Georgieva I. Spontaneous chromosomal aberration level in human peripheral lymphocytes. Mutation Research. 1978. V.52. p.421 -426.

98. International Atomic Energy Agency (IAEA). Biological dosimetry: blood Chromosomal aberration analysis for the dose assessment. Technical Report Series №260. 1

100. Jong G., Van Sittert N.J. and Natarajan A.T. Cytogenetic monitoring of industrial populations potentially exposed to genotoxic chemicals and of control populations. Mutation Research. 1988. V.204. p.451-464.

101. Kandar M.Z. and Bahari LB. Radiation-induced chromosomal aberrations among TENORM workers: amang- and ilmenite-processing-workers of Malaysia. Mutation Research. 1995. V.351. p.157-161.

102. Kasuba V. Sentija K., Garaj-Vrhovac V. and Fucic A. Chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from control individuals. Mutation Research. 1995. V.346. P. 187-193.

103. Koksal G., Pala F.S. and Dalci D.O. In vitro dose-response curve for chromosome aberrations induced in human lymphocytes by Co y-radiation. Mutation Research. 1995. V.329. P.57-61.

104. Kucerova M., Anderson A.J.B., Buckton K.E. and Evans H.J. X-ray-induced chromosome aberrations in human peripheral blood leucocytes: the low levels of exposure in vitro. International Journal Radiation Biology. 1972. V.21. №4.-P.389-396.

105. Langlands A.O., Smith P.G., Buckton K.E., Woodcock G.E. and McLelland J. Chromosome damage induced by radiation. Nature (London). 1968. V.218.-P.133-1135.

106. Lazutka J.R., Lekevicius R., Dedonyte V., Maciuleviciute-Gervers L., Mierauskiene J., Rudaitiene S. and Slapsyte G. Chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges in Lithuanian populations: effects of occupational and environmental exposures. Mutation Research. 1999. V.445. P.225239.

107. Leonard A., Decat G., Leonard E.D. and Mortelmans J. The chromosomal radiosensitivity of lymphocytes from the chimpanzee (Pan troglodytes). II Mutation Research. 1977. V.45. p.69.

108. Leonard A., Deknudt Gh., Leonard E.D. and Decat G. Chromosome aberrations in employees from fossil-fueled and nuclear-power plants. Mutation Research. 1984. V.138. P.205-212.

109. Leonard A,, Baltus L., Leonard E.D., Gerber G.B., Richard F. and Wambersie A. Dose-effect relationship for in vivo and in vitro induction of dicentric aberrations in blood lymphocytes of children. Radiation Research. 1995. V.141.-P.95-98.

110. Littlefield L.G., Kleinerman R.A., Sayer A.M. et al. Chromosome aberrations in lymphocytes biomonitors of radiations exposure. New Horizons in Biological Dosimetry. 1991.- Wiley-Liss. P.3 87-397.

111. Lloyd D.C., Purrott R.J, Dolphin G.W., Bolton D., Edwards A.A. and С о ф M.J. The relationship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes. International Journal Radiation Biology. 1975. -V.28.-№l.-P.75-90.

112. Lloyd D.C., Purrot R.J. and Reader E.J. The incidence of unstable chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradiated and

113. Lloyd D.C, Edwards A.A. and Prosser J.S. Chromosome aberrations induced in human lymphocytes by in vitro acute X and у radiation. Radiation Protection Dosimetry. 1986. V.15. №2. P.83-88.

114. Lloyd D.C, Edwards A.A., Leonard A., Deknudt Gh., Natarajan A., Obe G., Palitti F., Tanzarella С and Tawn E.J. Frequencies of chromosomal aberrations induced in human lymphocytes by low doses X-rays. International Journal Radiation Biology. 1988. -V.

116. Lloyd D.C, Edwards A.A., Leonard A., et al. Chromosomal aberrations in human lymphocytes induced in vivo by very low doses of X-rays. International Journal Radiation Biology. 1992. -V.61. J23. -P.335-343.

117. Lloyd D.C and Sevankaev A.V. Biological dosimetry for persons irradiated by the Chemobyl accident. Experimental collaboration project №

118. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities. 1996.

119. Maznik N.A., Vinnikov V.A., Lloyd D.C. and Edwards A.A. Chromosomal dosimetry for some groups of evacuees from Prypiat and Ukrainian liquidators at Chemobyl, Radiation Protection Dosimetry. 1997. V.74 №1. P.5-11.

120. Mikhalevich L.S. Monitoring of Cytogenetic Damages in Peripheral Lymphocytes of Children Living in Radiocontaminated Areas of Belarus. Research Activities about the Radiological Consequences of the Chemobyl NPS

122. Moorhead P.S., Nowell P.C, Mellman W.J., et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Experimental Cell Research.- I960.-V.20.-P.613-616. 122, Muramatsu S. and Maruyama T. Chromosome aberrations in human lymphocytes after irradiation with NIRS-Cyclotron fast neutrons in vitro. Nippon Acta Radiology. 1977. V.37. p.995-997. 123-Natarajan A.T., Balajee A.S., Boei J.J.W.A. et al. International Journal Radiation Biology. 1994. V.66. 5. P.615-623.

123. Norman A., Ottoman R.E., Sasaki M.S. and Veomett A.B. The frequency of dicentrics in human leukocytes irradiated in vivo and in vitro. Radiology. 1964.-V.83.-P.108-110.

124. Norman A. and Sasaki M.S. Chromosome aberrations in human lymphocytes. International Journal Radiation Biology. 1966. V.U. P.321-328.

125. Perry P. and Wolf S. New Giemsa method for differential staining of sister chromatids. //Nature. 1974. V.251. P.156-158.

126. Peterson E. PIRLS: Poisson Iteratively Reweighted Least Squares Computer Program for Additive, Multiplicative, Power and Non-linear Models. 1997. http:/www.stat.ucla.edu/joumals/jss/v02/i05.

127. Pohl-Ruling J.O., Haas A., Brogger G., Obe G., Lettner H., Daschil F., Atzmuller C, Lloyd D., Kubiak R. and Natarajan A.T. The effect on

128. Preston, R.L., Breven, J.G. and Jones, K.P. Radiation-induced chromosome aberrations in Chinese hamster leukocytes. A comparison of in vivo and in vitro exposures. International Journal of Radiation Biology. 1972. V.21. P.397-400.

129. Ramalho A.T., Costa M.L.P. and Oliveira S. Conventional radiationbiological dosimetry using frequencies of unstable chromosome aberrations. Mutation Research. 1998. V.404. P.97-100. 131. Roy L., Sorokine-Durm I. and Voisin P. Comparison between fluorescence in situ hybridization and conventional cytogenetic dicentric scoring: a first-step validation for the use of FISH in biological dosimetry. International Journal Radiation Biology. 1996. V.70. №6. P.665-669.

130. Sasaki M.S., Ottoman R.E. and Norman A. Radiation-induced chromosome aberrations in man. Radiology. 1963. V.81. P.652-656.

131. Sasaki M.S. and Miyata H. Biological dosimetry in atomic bomb survivors. Nature. 1968. V. 220.-№173.-P.l 189-1193.

132. Schneider G.J., Chone B. And Blonnigne T. Chromosomal aberrations in a radiation accident. Radiation Research. 1969. V.40. P.613-617.

133. Schmid E. and Bauchinger M. Comparison of the chromosome damage and its dose response after medical whole-body exposure to Co gamma rays and

134. Schmid E., Bauchinger M. and Hug O. Chromosome aberrationen menschlicher Lymphocyten nach Rontgenbestrahlung in vitro. Mutation Research.- 1972.-V.16.-P.307-317.

135. Schmid E., Bauchinger M. and Mergenthaler W. Analysis of the time relationship for the induction of X-ray induced primary breaks in the formation of dicentric chromosomes. International Journal Radiation Biology. 1976. V.30.-P.339-346.

136. Scott D. and Decat G. Relation between cell cycle and yield of aberration observed in irradiated human lymphocytes. Nature. 1979. V.21. №570. P.756-758.

137. Servomaa A., Ermakov I. et al. A topographically and anatomically unified phantom model for organ dose determination in radiation hygiene. STUKA87. 1

139. Sevankaev A.V., Lloyd D.C., Potetnya O.I. et al. Chromosomal aberrations in lymphocytes of residents of areas contaminated by radioactive discharges from the Chernobyl accident. Radiation Protection Dosimetry. 1995. V.58. -№4.-P.247-254.

140. Shadley J.D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiation Research Society. 1994. V. 138. P.9-12.

141. Shevchenko V.A., Snigiryova G.P. and Rubanovich A.V. Estimation of Absorbed Doses on the Basis of Cytogenetic Methods. Research Activities about the Radiological Consequences of the Chernobyl NFS Accident and Social Activities to Assist the Sufferers by the Accident. Eds. by T. Imanaka. 1988.-Kyoto.-P.216-222.

142. Silberstein E.B., Ewing C.J., Bahr G.K. and Kereiakes J.G. The human lymphocyte as a radiobiological dosimeter after total body irradiation. Radiation Research. 1974. V.59. P.658-664.

143. Stephan G. and Oestreicher U. An increased fi-equency of structural chromosome aberrations in person present in the vicinity of Chernobyl during and after reactor accident. Is this effect caused by Radiation exposure? Mutation Res. 1989. V.223. P.7-12.

144. Stephan G. and Oestreicher U. Chromosome investigation of individuals living in areas of Southern Germany contaminated by fallout from the Chernobyl reactor accident. Mutation. Res. 1993. V.319. P.189-196.

145. Thierens H., Vral A., De Ridder L., Touil N., Kirsch-Volders M., Lambert V. and Laurent C. Inter-laboratory comparison of cytogenetic endpoints for the biomonitoring of radiological workers. International Journal Radiation Biology. 1999. V.75. №1. P.23-34.

146. Tonomura A., Kishi K. and Saito F. Radiation-induced Chromosome Damage in Man. Eds. by T. Ishihara and M.S. Sasaki. 1

148. Venkatachalam P., Solomon F.D.P., Mohankumar M.N., Prabhu B.K., Gajendiran N., Kathiresan A. and Jeevanram R.K. Higher frequency of dicentrics and micronuclei in peripheral blood lymphocytes of cancer patients. Mutation Research. 1999a. V.425. p. 1-8.

149. Venkatachalam P., Solomon F.P.D., Prabhu B.K., Mohankumar M.N., Gajendiran N. and Jeevanram R.K, Estimation of dose in cancer patients treated with fractionated radiotherapy using translocation, dicentrics and micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes. Mutation Research. 1999b. V.429.-P.1-12.

150. Vulpis N., 8сафа G. and Tognacci L. Chromosome aberrations as a dosimetric technique for fission neutrons over the dose-range 0,2-50 Rad. International Journal Radiation Biology. 1978. V.33. p.301-306.

151. Wang Z., Boice J.D., Wei L., Beebe G.W., Zha Y., Kaplan M.M., Tao Z., Maxon III H.R., Zhang S., Schneider A.B., Tan В., Wesseler T.A., Chen D., Ershow A.G., Kleinerman R.A., Littlefield L.G. and Preston D. Thyroid nodularity and chromosome aberrations among women in areas of high background radiation in China. Journal National Cancer Institute. 1990. V.82.-Ko6.

152. West C M Invited review: Intrinsic radiosensitivity as a predictor of patient response to radiotherapy. The British Journal of Radiology. 1995. V.68. P.827-837.

153. Ziemba-Zoltowska В., Bocian E., Rosiek O. and Sablinski J. Chromosome aberrations induced by low doses X-rays in human lymphocytes in vitro. International Journal Radiation Biology. 1980. V.37. №2. P.231-236.

Информация о работе

Семенов, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.01

Диссертация

Сравнительное изучение дозовых зависимостей частоты нестабильных хромосомных обменов при облучении лимфоцитов человека in vivo и in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы