Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное исследование химерных, мутантных и TAG-форм нуклеозиддифосфаткиназы крысы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование химерных, мутантных и TAG-форм нуклеозиддифосфаткиназы крысы"
На правах рукописи
ОРЛОВ Денис Николаевич
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМЕРНЫХ, МУТАНТНЫХ И TAG-ФОРМ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ КРЫСЫ
(03.00.02 - биофизика)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино- 2004
Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН (Пущино)
Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник, Орлов Николай Яковлевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович
доктор биологических наук, профессор Лебедев Олег Евгеньевич
Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.ВЛомоносова
Зашита диссертации состоится "_"_2004 г. в_часов на заседании
диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области., ул. Институтская, 3 ИТЭБ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290 гЛущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН
Автореферат разослан "_"_2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат физико-математических наук
Панина Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Работа посвящена сравнительному исследованию рекомбинантных форм нуклеозиддифосфаткиназы (NDP киназа) млекопитающих -одного из первых известных к настоящему времени супрессоров метастаз при канцерогенезе.
В последнее десятилетие исследования NDP киназ - семейства ферментов, основной функцией которых, как считалось ранее [Park and Agarval, 1973], является синтез нуклеозидтрифосфатов из нуклеозиддифосфатов за счет АТФ, привлекают дополнительное внимание. В начале 90-х годов неожиданно выяснилось, что ряд генов (Nm23), нарушение работы которых ведет к увеличению метастатического потенциала раковых клеток, кодируют субъединицы NDP киназы. Это положило начало новому этапу исследований NDP киназы, в результате которого было показало, что NDP киназы могут играть роль регуляторов транскрипции онкогенов и участвуют во многих клеточных процессах, таких, например, как дифференцировка клеток, метастазирование и апоптоз, причем эти функции NDP киназы не всегда связаны с ее активностью как фермента. Совокупность этих неожиданных данных привела к предположению о том, что NDP киназа является мультифункциональным белком и стимулировала всесторонние исследования представителей этого семейства.
В ходе этих исследований особый интерес вызвали данные, согласно которым reKcaMepbiNDP киназы млекопитающих, в отличие от ферментов низших организмов, состоят из двух типов низкомолекулярных (А/г~ 17000) предельно консервативных и близких по первичной структуре (степень гомологии 90%, основные различия локализованы в вариабельных областях VI и V2 (остатки 37-50 и 131-150, соответственно)) субъединиц и, таким образом, представлены в клетке набором изоформ. Оказалось также, что каждый из видов тканей млекопитающих характеризуется своим набором изоформ. Исследования рекомбинантных белков, состоящих из субъединиц только одного типа, показали, что такие изоформы практически неразличимыми по своим ферментативным характеристикам и трехмерной структуре в кристалле. Функциональный смысл присутствия в клетке изоформ NDP киназы с одинаковыми каталитическими и структурными свойствами несмотря на усилия многих лабораторий долгое время оставался принципиально неясным. Одпако наше недавнее исследование рекомбинантных крысиных NDP киназ содержащих
только один тип субъединиц неожиданно показало, что изоформа в
отличие от изоформы способна взаимодействовать с локализованным в мембранах наружных сегментов палочек (НСП) сетчатки комплексом между фотоактивированным рецептором света родопсином (R*) и G-белком трансдуцином (Gt) [Orlov et al., 1996]. Такое взаимодействие высокоспецифично, поскольку связанная NDP киназа высвобождается в присутствии GTP, индуцирующего, как известно [Kfihn, 1980], процесс диссоциации комплекса Эти результаты явились одним из первых
прямых экспериментальных подтверждений точки зрения (см. напр. [Kimura, 1993]), согласно которой регуляторное действие NDP киназ может опосредоваться через гетеротримерные GTP-связывающие белки (G-белки), являющиеся ключевыми компонентами систем клеточной трапсдукции.
В целях выяснения молекулярной природы различий между изоформами, определяющих их различное сродство к комплексу, в последующей работе было выполнено сравнительное исследование рекомбинантных NDP киназ крысы
методом собственной белковой флуоресценции [Orlov et al., 1999]. Обе изоформы содержат остатки триптофана и тирозина в одинаковых позициях, но проявляют ярко выраженные различия в положении максимума спектра флуоресценции, форме спектров и значениях квантового выхода (q) при рН 8. Более того, NDP киназа а подвергается структурным изменениям
NDP киназа p не претерпевает струкгурпых перестроек. Подобие рН-зависимостей q флуоресценции NDP киназы а и процесса связывания этого фермента с R*-Gt комплексом позволило предположить, что различия между NDP киназами а и р в конформационной лабильности и различия в связывании с комплексом R*-Gt могут иметь ту же самую физическую основу, которая, в свою очередь, и определяет функциональные различия изоформ в клетке.
В независимых работах было также показано [Postel et al., 2000], что NDP киназа также взаимодействует с определенными сайтами (NHE) промоторных участков гена с-тус и генов факторов роста. Данный тип DNA-связывающей активности, как и обнаруженная недавно неожиданная способность NDP киназы осуществлять процессинг и репарацию DNA, также являются изоформ-слецифичными [Agou et al., 1999, 2000; Postel et al., 2000; Postel, 2003]. Все эти данные дали начало сравнительным исследованиям рекомбинантных изоформ NDP киназы и их производных для определения физико-химических основ их функциональных различий. Очевидно, что подобный подход является необходимым этапом при выяснении молекулярных механизмов мультифункциональной активности этих белков в клетке в норме и патологии.
Цели и задачи работы. Основной задачей работы являлось выяснение структурной основы различий между изоформами NDP киназы, возможно определяющей все последующие функциональные различия изоформ в клетках млекопитающих. Для этого были использованы рекомбинантные изоформы NDP киназы крысы и различные типы их генноинженерных производных для исследования (1) характеристик белковой флуоресценции этих белков в широком диапазоне условий, (2) параметров их взаимодействия с родопсин-трансдуциновым комплексом, (3) сравнительной термостабильности методом остаточной ферментативной активности, и (4) стабильности NDP киназ как гексамеров.
Научная новизна. Впервые показано, что различия в вариабельной области V1 NDP киназы млекопитающих определяют различия физико-химических характеристик изоформ фермента. Результаты настоящей работы дают основания считать, что способность NDP киназ млекопитающих взаимодействовать с G-белком палочек сетчатки трансдуцином определяется вариабельной областью V1, тогда как вариабельный участок V2 не участвует во взаимодействии. Получены данные, свидетельствующие о высокой стабильности гексамерной структуры NDP киназ млекопитающих. Рассмотрен вопрос о функциональной роли взаимодействия между NDP киназой и комплексом родопсин-трансдуцин.
Практическая ценность. Исследованные в настоящей работе химерные и tag производные изоформ NDP киназы могут быть рекомендованы для использования в физиологических опытах, связанных с экспрессией генов производных в различных линиях культур раковых клеток с целью выяснения роли различных участков фермента в подавлении метастатического потенциала раковых клеток. Полученные нами данные также необходимо учитывать при экспрессии генов мутантных форм NDP киназы, не имеющих ферментативной активности, в различных линиях культур клеток. Эксперименты по трансфекции раковых клеток генами производных NDP киназы являются одним из современных подходов к поиску новых путей терапии злокачественных опухолей.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения. Работа завершается выводами и списком цитированной литературы ссылок). Работа
иллюстрирована_рисунками и_таблицами. Общий объем диссертации_
страниц.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на IV Международном конгрессе по генетике, биохимии и физиологии NDPK/NM23/AWD (Japan, Tokyo, November 2001), V Международном конгрессе по генетике, биохимии и физиологии NDPK/NM23/AWD (USA, Lexington, October 2003), 45 Конгрессе американского биофизического общества (USA, Boston, February 2001), международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, сентябрь 1998, июнь 2003), международной конференции "Биологическая подвижность: новые направления в исследованиях" (Пущино, август 2001). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Основными объектами исследования являлись рекомбинантные гомогексамсрные а- и ß-изоформы NDP киназы крысы (NDP киназа а и NDP-киназЭ, соответственно). Первичные структуры субъедшшц (152 остатка) этих ферментов различаются 16 остатками. Основные различия локализованы в вариабельных областях VI (остатки 37-50, 7 замен) и V2 (остатки 131-150, 6 замен). Использованная в исследованиях химерная форма NDP киназы (NDP киназа состояла из N-концевой части (остатки 1-118) изоформы а и С-концевого участка (остатки 118-152) изоформы ß, тогда как химера NDP киназа ßa содержала N-концевую часть (остатки 1-118) изоформы ß и С-концевую часть (остатки 118-152) изоформы Исследование этих белков дает принципиальную возможность выяснить важность вариабельных участков VI и V2. В работе также исследовали tag-формы (НА-NDP киназа ß, HA-NDP киназа aß н HA-NDP киназа ßa), которые содержали иммунологически уникальный гемагглютшшновый (НА) эпитоп (YPYDVPDYA) между А1а2 и Asp3. Исследование tag-производных позволяет выявить роль N-концевой области молекулы. Дополнительными объектами исследований являлись мутантные формы NDP киназ а и ß и их tag-производные (M-NDP юшаза a, M-NDP кип аза ß, IIA-M-NDP киназа и IIA-M-NDP киназа соответственно), которые не обладали ферментативной активностью вследствие замены His 118 в активном центре на остаток аланина. Субъединицы всех исследованных белков содержали по 3 триптофановых (Тгр78,133 и 149) и 4 тирозиновых (Туг52, 67, 147 и 151) остатка. Гены изоформ аир NDP киназы крысы и их производных были сконструированы и экспрессированы в Е. coli в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Института Геронтологии. Получение и очистка производных рекомбинантных изоформ и NDP киназы крысы. В работе использовались плазмиды pBluesciipt KS(+), содержащих cDNA изоформ аир NDP киназы крысы, сконструированные ранее [Fukuchi et al., 1994]. cDNA, кодирующие производные изоформ и NDP киназы крысы были сконструированы с использованием техники PCR из плазмид pBluescript KS(+), содержащих cDNA изоформ аи ß NDP киназы крысы [Ishijima et al., 1999]. Данная часть работы была выполнена в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Столичного Института Геронтологии доктором Н. Ишикавой (N. Ishikawa) и доктором Ю. Ишиимой (Y. Ishijima) под руководством проф. Н. Кимуры (N. Kimura). cDNA изоформ и NDP киназы крысы и cDNA производных были субклонированы в векторах рЕТЗЬ и pET17b (Novagen), соответственно. Данные векторы использовались для трансформации линии клеток Е. coli BL21(D3)pLysS.
Рекомбинантные NDP киназы были очищены сотрудниками нашей лаборатории по несколько модифицированному методу Кима и соавт. [Kim et al., 1997] в результате
аффинной хроматографии супернатантов лизатов К coli на АТР-агарозс ("Sigma", USA). Белки элюировали буфером, содержащим 10 мМ АТР. По данным, полученным методом гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата патрия [Laemmli, 1970; Fukuchi et al., 1994] и изоэлектрического фокусирования чистота полученных белков составляла не менее 98-99%. Результаты анализа белков методом гельфильтрации на калиброванной колонке (1x40 см) с Сефакрилом S-200 или Сефакрилом S-200 HR (Ameisham Bioscienses) дали основания считать, что они все являются гексамерами.
Концентрацию ферментов в подавляющем количестве случаев измеряли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм [Orlov ct al., 1999]. Молярный коэффициент экстинкции гексамеров NDP киназ а и р и их мутантньж, не обладающих ферментативной активностью форм, а также химерных белков ар и Ра при 280 и 296.7 нм принимали равными 130 000 М"'см"' and 39 000 М"'см"', соответственно. Молярный коэффициент экстинкции tag-форм (HA-NDP киназа Р, HA-NDP киназа оф, HA-NDP киназа Pa, HA-M-NDP киназа а и HA-M-NDP киназа Р) при 280 пм бьш несколько выше (130 000 M"W).
Определение ферментативной активности препаратов NDP киназ. Активность NDP киназ измеряли при 30°С и рН 7.5, определяя скорость образования ADP из АТР при фосфорилировании TDP NDP киназой с помощью системы сопряженных ферментов пируваткиназы и лактатдегидрогеназы [Park and Agarval, 1973; Fukuchi et al., 1994]. Формирующийся ADP фосфорилировался пируваткиназой в присутствии фосфоснолпирувата до АТР, а образующийся из фосфоенолпирувата пируват превращался в лактат лактатдегидрогеназой в присутствии NADH. Скорость расхода NADH в этой реакции измерялась на работающих в режиме измерения кинетики спектрофотометрах Gilford-260 (Gilford Instruments, США), Beckman DU 650 (Beckman, USA) или Specord UV-VIS (Карл Цейсе, Иена, ГДР) по скорости уменьшения поглощения при 340 нм в результате его перехода в NAD+. Буферные среды, соли или пуклеотиды (гуанозин 5'-О-(3-тио)трифосфат (GTP[S]) - негидролизуемый аналог GTP), присутствующие в измеряемых образцах, не влияли на систему измерения активности NDP киназы. Полученные данные могли быть выражены в цифровом виде и отображены графически с помощью программы "Microcal Origin 4.0".
Получение препаратов мембран НСП сетчатки быка. Препараты НСП сетчатки крупного рогатого скота получали при слабом красном свете и 4°С как описано ранее [Тищенков, Орлов, 1983; Orlov et al., 1988]. Трансдуцин-содсржащие фоторецепторные мембраны, свободные от эндогенной NDP киназы (N-мембраны) и мембраны, не содержащие транедуцина и эндогенной NDP киназы (W-мембраны) получали по описанному ранее методу [Orlov, Kimura, 1998]. НСП и мембраны хранили в темноте при -20°С и концентрации зрительного пигмента около 5 мг/мл. Перед опытом мембраны размораживали при 4-10°С, полностью обесцвечивали желтым светом и хранили на льду в темноте в ходе проведения экспериментов.
Связывание HA-NDP киназ ар и Ра с фоторецепторными N- и W-мембранами.
Эксперименты по связыванию рекомбинантных NDP киназ крысы с родопсин-трансдуциновым комплексом в фоторецепторных мембранах НСП сетчатки быка (N-мембраны) или W-мембранами выполняли по описанному ранее методу [Orlov et al., 1996] при стандартной низкой концентрации фоторецепторных мембран ([R*]=l-2 цМ], используя для разделения свободной и связанной форм NDP киназы метод высокоскоростного центрифугирования. N-мембраны или W-мембраны смешивали с HA-NDP киназой ар или Ра при различных рН в соответствующем буфере (5 мМ HEPES-NaOH или MES-NaOH), содержащем 0.25 мМ MgCb и инкубировали 5 мин при 0-5°С. Полученные образцы (50-200 мкл) центрифугировали 10 мин при 50000xg (ультрацентрифуга TL-100, Beckman, USA) при 2°С. Полученные супернатанты и осадки использовали для определения активности свободного и связанного фермента соответственно. Поскольку активность свободной и связанной форм фермента была
равна активности NDP киназы, добавляемой к мембранам, обычно измеряли только ферментативную активность супернатантов. Ферментативная активность супсрнатантов и осадков соответствует содержанию белка NDP киназы, определенного иммунологически [Orlov et al., 1996]. В отсутствии мембран ферментативная активность супернатантов, полученных в результате центрифугирования при всех используемых значениях рН, составляла не менее 90-95% от величины активности образцов до центрифугирования. Активность ферментов, измеряемая описанным выше методом, не претерпевала необратимых изменений после их преинкубации в использованных в работе буферных растворах, солях и нуклеотидах (GTP[S], GTP). Измерения собственной белковой флуоресценции. Флуоресцентные измерения выполняли на сконструированном в лаборатории спектрофлуориметре, принципиальная конструкция которого описана ранее [Burstein et al., 1973]. Флуоресценция возбуждалась светом с длиной волны 296,7 нм. Спектральная ширина щелей регистрирующего монохроматора не превышала 2 нм. Измерения вели в диапазоне длин волн 320-3 80 нм с шагом 1-2 нм и временем накопления 1-10 с. После поправки на спектральную чувствительность прибора [Burstein and Emelyanenko, 1996] интенсивности были пропорциональны числу фотонов, излучаемых в единичном интервале длин волн. Для разложение экспериментальных спектров на спектральные лог-нормальные компоненты использовали описанные ранее алгоритмы [Аборнев и Бурштейн, 1992; Burstein et al., 2000], позволяющие выявить до трех индивидуальных компонент, характеризующихся положением их максимумов и относительными значениями вкладов.
Измерения выполняли при температуре образцов 20°С. Квантовый выход флуоресценции (q) рассчитывали, сравнивая полную площадь S под спектрами ферментов с площадью под спектром водных растворов триптофана, оптическая плотность которых при длине волны возбуждения была равна оптической плотности исследуемых растворов белков (обычно не более 0,03). Квантовый выход триптофана при 20°С принимали равным 0,14. Данные по тушению анализировали в соответствии с выражением:
(W?) - 1 =Ksv[C],
где q - квантовый выход флуоресценции при концентрации тушителя С. Ввиду использования в экспериментах по тушению нейтрального тушителя акриламида, раствор которого при 296,7 нм имеет заметное собственное поглощение (0,15 при концентрации 1М) значения q корректировали как это было предложено ранее [Бурштейн, 1977]. Доступность L хромофоров тушителю расчитывали по формуле: L = [Ksv(pr)/Ksv(trp)] [q (trp)/?(pr)]
где Ksv(pr), Ksv(trp), q(pl) и q (Ир) означают значения Ksv и q для белка (рг) и триптофана (trp), соответственно. Значение Ksv(trp) при тушении акриламидом принимали равным 18 М"1
Исследование термостабяльности NDP киназ. Термостабильность препаратов NDP киназ определяли в принципиальном согласии с методом, описанным ранее [Erent et al., 2001, Орлов и соавт., 1983], определяя остаточную ферментативную активность образцов фермента после их инкубации в течение 15 мин при определенной температуре. Исследования проводили при концентрации ферментов 5 мкг/мл в 5 мМ HEPES-NaOH буфере, рН 8.1, содержащем 0.5 мМ MgCh и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (квалификация "ХЧ", Реахим). Инкубацию вели в специально изготовленной тонкостенной герметизированной пробирке диаметром около 3 мм и рабочим объемом около 0.1 мл, помещенной в камеру жидкостного термостата U-1 (ГДР). Объем пробы составлял 40 мкл. Время достижения необходимой температуры не превышало 15 с. Немедленно после окончания инкубации пробирку с образцом охлаждали на ледяной бане в течении 15 с, а затем отбирали контрольные
пробы объемом 1-5 мкл для измерения остаточной ферментативной активности препарата. Активность ферментов в преинкубированных образцах была постоянна в течение всего последующего времени измерений (3-10 мин).
Изоэлектрическое фокусирование. Эксперименты по изоэлектрическому фокусированию (ИЭФ) изоформ NDP киназы, их производных и смесей этих белков в диапазоне рН 3-10 проводили на стандартном аппарате для диск-электрофореза фирмы "Reanal" (Венгрия). Разделение вели в 7% полиакриламидном геле, содержащем амфолиты-носители (1% v/v) (Pharmacia, Швеция). Для формирования гелей по стандартному методу использовали реактивы фирм "Sigma" (USA) и "Reanal" (Венгрия). Препараты наносили в 0.2 мл 20% (w/v) раствора сахарозы, содержащего амфолиты (1% по объему). Нагрузка по белку составляла 0.01-0.03 мг/гель. Контроль за ходом разделения осуществляли, наблюдая за фокусированием в отдельных гелях миоглобина кашалота, гемоглобина человека и красителя бромфенолового красного. Гели фиксировали в течение суток в 10% растворе трихлоруксусной кислоты, а затем 2-3 раза в течение 6-10 ч отмывали раствором, содержащим 25% (v/v) этанол и 7% (v/v) уксусную кислоту. Для окрашивания использовали 0.1% раствор Кумасси G-250. Дополнительные методы. Спектры поглощения регистрировали па спетрофотометрах Beckman DU 650 (Beckman, USA) или Specord UV-VIS (Карл Цейсе, Иена, ГДР). Концентрацию белка измеряли с помощью стандартного набора реактивов ВСА Protein Assay Kit (Pearce, USA), используя в качестве стандарта бычий сыворочный альбумин или овальбумин (Реахим). Концентрацию родопсина определяли по изменению поглощению препаратов, солюбилизированных 0,5% водным раствором Тритона Х-100 при 500 нм, до и после их обесцвечивания желтым светом в присутствии гидроксиламина [Тищенков, Орлов, 1983].
Данные, полученные в экспериментах по исследованию влияния рН, концентрации солей, нуклеотида GTP[S] и температуры на квантовый выход флуоресценции NDP киназ в растворе и ферментативную активность (опыты по взаимодействию ферментов с фоторецепторными мембранами и температурной инактивации ферментов) описывали с помощью модифицированных форм выражения Хилла [Orlov et al., 1996; 1997]. Исходная форма уравнения Хилла имеет вид
У=Ушах/[1+(К1/2/Х)Ь] (1)
где X - параметр, варируемый в ходе опыта, Kia - значение вариабельного параметра X, при котором амплитуда эффекта составляет половину от максимальной, a h -коэффициент Хилла. Компьютерную обработку данных и их представление в графическом виде проводили с помощью программы "Microcal Origin 4.0".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Ферментативная активность МОР киназ а и р и их производных.
Поскольку объектом наших исследований являются ферменты, прежде всего мы проверили, насколько сделанные модификации изменили их активность по сравнению с активностью исходных КБР киназ аир. Полученные данные (Табл. Г) свидетельствуют о том, что вес произведенные замены лишь незначительно влияют на активность активность. Мутантные формы не активны (указанные значения характеризуют предел чувствительности использованного метода измерений).
Табл. I. Ферментативная активность NDP киназ -а и р и их производных. В таблицах использованы сокращенные обозначения изофррм N1)1' к^азы и их производных.
Фермент а «Р НА-аР М-а НА-М-а
Активность (цто! АОР/тш рег т£) 6000 3800 2500 <100 <100
Фермент Р Ра НА-Р НА-Ра м-р НА-М-Р
Активность (цло! АОР/ш'ш рег Ш£) 3000 2100 1800 1700 <100 <100
2. Исследование химерных, мутантных и tag-форм NDP киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции. Флуоресцентные свойства производных NDP киназы а. В серии ранних исследований, выполненных совместно с Токийским Столичным Институтом Геронтологии, было обнаружено [Ойоу й а1.,1997, 1999], что по ряду своих спектральных свойств N0? киназа а является уникальным белком и принципиально отличается от N0? киназы р. (1) Спектр флуоресценции N0? киназы а при рН 8.0 монокомпонентен и имеет максимум в районе 341 им. (2) Квантовый выход q флуоресценции N0? киназы а достигает уникальной величины 0.42, что в три раза выше значения q для триптофана в воде. (3) Доступность флуорофоров, локализованных, судя по положению ¿щ» на поверхности белка, тушителю акриламиду оказалась аномально низкой.
В настоящей работе показано, что форма и положение максимума спектра флуоресценции производных N0? киназы а (N0? киназа «(НА-МБР киназа ар, М-N0? киназа а, НА-М^П? киназа а) в описанных выше условиях практически подобны спектральным характеристикам для N0? киназы а (Табл. II, Рис 1). Значения квантового выхода флуоресценции производных N0? киназы а были также необычно высоки и практически не отличались от величины, полученной ранее для N0? киназы а [Ойоу е! а1., 1999]. Доступность флуорофоров в производных N0? киназы а тушителю акриламиду, как и в исходном белке, оставалась предельно низкой (Табл. IV).
Табл. П. Флуоресцентные свойства NDP киназы а н ее производных.
(*) Данные, представленные в таблице для МБР киназы а, получены в ходе настоящей работы. рН1 и рНг - значения рН, при которых изменения q составляют половину от максимальных изменений, наблюдаемых при кислом или щелочном титровании белка, соответственно.
Фермент л«(нм) Ч Р^ рН,
№)Ркнназаа(*) 340»9±0,4 0,42±0,02 6Д±0,1 10,8±0,1
Ш>Р киназа ар 341,3+0,2 0,43±0,02 6,1±0Д 10,8±0,1
НА-ТЧПР киназа ар 341Д±0у4 0,41±0,02 6,4±0,13 10,8±0,1
М-РТОР киназа а 3423±0Д 0,42±0,02 б,05±0,1 10,7±0,1
НА-М-РТОР киназа а 342,7±0,1 0,43±0,02 6,43±0,1 1035±0,1
Рис. 1. Пример типичных результатов, полученных при исследовании производных NDP киназы а. и NDP киназы р. Представлены данные для HA-NDP киназы оф (НА-сф) и HA-NDP киназы Ра (НА-ар). Верхние рисунки: спектры флуоресценции (•) при рН 8.0 и их описание с помощью лог-нормального распределения (-). Средние и нижние рисунки: зависимости q н Л am ОТ pli, соответственно.
Понижение рН от 7.0 до 4.0 приводило к понижению q флуоресценции NDP киназы а от 0.42 до са. 0.32, эффект был полумаксимален при рН са. 6.2 и сопровождался сдвигом Лла от са. 341 до 336-337 нм [Oriov et al., 1997, 1999]. Совокупность этих данных позволила предположить наличие зависимых от рН обратимых структурных изменений в молекуле NDP киназы a [Orlov et al., 1997,1999 ]. Более того, были основания считать, что такой структурный переход может играть важную функциональную роль [Orlov et al., 1997, 1999]. Близкие результаты были получены и при исследовании производных NDP киназы а (Табл. II, Рис. 1): закисление среды понижало q на 40-50% при положении точки полуперехода при рН 6.1-6.4, причем этот процесс сопровождался сдвигом Дщ« до 336-337 нм. Это означает, что все производные NDP киназы а, как и сама NDP киназа О, могут существовать в
равновесии между двумя структурными состояниями, одно из которых, по-видимому, является функционально важным.
Флуоресцентные свойства производных NDP киназы р. Несмотря на высокую степень гомологии (89%), идентичное положение ароматических аминокислотных остатков, близкие каталитические свойства [Fukuchi et al., 1994] и подобие трехмерных структур NDP киназ a and р [Padmanabhan et al., 1996], характеристики собственной белковой флуоресценции изоформы принципиально отличны от флуоресцентных свойств NDP киназы a [Orlov et al., 1999]. В стандартных условиях (рН 8.0), NDP киназа Р имеет Ядщ при 335.4 нм, что на 5 нм меньше, чем значение Хщш NDP киназы а . Величина q для NDP киназы р (0.21) вдвое меньше величины квантового выхода флуоресценции NDP киназы а.
В настоящей работе показано, что в стандартных условиях вес исследованные производныеМБРкиназы Р (HA-NDP киназа Р, МБРкиназа Pa, HA-NDP киназа pa, М-NDP киназа Р, HA-M-NDP киназа р) имеют практически те же значения Лща и q, что и NDPкиназа Р (Табл. III, Рис. 1).
Табл. III. Флуоресцентные свойства NDP киназы ß и ее производных (*) Данные, представленные в таблице для NDP киназы ß, получены в ходе настоящей работы при исследовании высокоочищенных препаратов этого белка.
Фермент Хф«1 (им) Я pH, pH2 Сi (нм) S(0, %
NDP киназа Р 335,4 0,21 - - CI C2 339" 322" 77o 23"
HA-NDP киназа ß 336,0 0,22 635 10,85 CI C2 3383 322,4 78 22
NDP киназа pa 336,0 0,24 73 10,6 CI C2 3393 325,8 72 28
HA-NDP киваза ßa 336,2 0,24 63 10,9 CI C2 338,9 322,0 79 21
M-NDP киназа ß 336,8 0,28 63 9,7 CI C2 340,6 327,9 66 34
HA-M-NDP киназа ß 337,2 0,21 53 10,6 CI C2 3393 320,0 83 17
Спектры флуоресценции высокоочшценной (>98%) NDP киназы Р при pH 8 могут быть представлены в виде суммы двух компонент: основной компоненты С1 («Зтя - 339 щи, S = 77.0%) и минорной С2 (Л^ = 322 nm, S= 23.0%) (Table III). Спектры пронзводньж NDP киназы Р также состоят из двух компонент с практически теми же характеристиками как для C1 (<i,o«ofabout 339 nm, S=66-83%) так и для С2(Лт« = 320327 nm, S = 17-34%) (Табл. III). Таким образом, в рамках точности анализа, можно заключить, что по своим основным флуоресцентным свойствам производные NDP киназы р практически подобны исходной NDP киназе р.
В отличие от NDP киназы а, квантовый выход флуоресценции NDP киназы Р постоянен в диапазоне рН 5,5-9,5, значение -inn« для NDP киназы Р мало изменяется (<1.5 нм) в пределах всей изученной области рН (рН 3.5-11) [Orlov et al., 1999]. Небольшое падение квантового выхода в кислой зоне рН, скорее всего, обусловлено нейтрализацией карбоксилатов в окрестностях излучающих остатков триптофана [Orlov
et al., 1999; Burstein, 1977]. Поскольку поведение NDP киназы p при кислом титрование резко отличалось от поведения NDP киназы а, предполагалось [Orlov et al., 1999], что в исследованном диапазоне рН NDP киназа р более стабильный белок, чем NDP киназа а.
Квантовый выход флуоресценции производных NDP киназы р был относительно постоянен (в пределах 10-20%) диапазоне рН 5.0-10 (Табл. III, Рис. 1). При кислом титровании величина q NDP киназы pa, HA-NDP киназы pa and nA-NDP киназы p уменьшалась на 10-25% причем эффекты были полумаксимальны при рН 6.3-7.0 (Табл. III, Рис. 1). Такое уменьшение либо не сопровождалось спектральным сдвигом (НА-NDPiaiHa3a Ра), либо сдвиг был мал (<2 нм) и наблюдался при рН менее 5-6 для NDP киназ Ра и HA-NDP киназы р. Очевидно, что полученные данные не дают оснований считать, что все перечисленные производные являются более лабильными белками, чем NDP киназа и способны к заметным структурным изменениям при рН титровании. Такое заключение не противоречит результатам, полученным в экспериментах по тушению флуоресценции этих белков акриламидом (Табл. ИГ).
Значительно большие флуоресцентные изменения наблюдались при кислом титровании мутантных форм NDP киназы Р (M-NDP киназа Р, HA-M-NDP киназа Р): уменьшение q флуоресценции этих белков достигало 50-60%, а сдвиг Дпих составлял 57 нм. При рН 8 значения Кур и доступности L для мутантов превышали величины, полученные для NDP киназы в 1.5-2 раза (Табл. IV). Такие данные дают основания предполагать, что мутантные формы обладают большей структурной лабильностью, чем исходный фермент.
Табл. ГУ. Тушение флуоресценции NDP киназ а и Р и их производных акриламидом (рН 8)
а ар НА-аЗ М-а НА-М-а Р ра НА-Ра IIA-P м-р нл-м-р
Ктк 2.4 3.6 3.8 43 5.0 3.0 3.5 2.8 3J 5.0 4.1
L 0.044 0.07 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11 0.09 0.12 0.14 0.15
3. Взаимодействие химерных производных NDP киназы крысы (HA-NDP киназы ар и HA-NDP киназы ра) с фоторецепторными мембранами НСП сетчатки быка.
Ранее было обнаружено [Ог1оу е! а!., 1996], что ОТР-зависимое взаимодействие МБР киназы крысы с комплексом фоторсцепторных мембран является
специфичным к изоформам фермента. Связывание КБР киназы а было полумаксимальным при рН 6.3 и близким к максимальному при рН 5.5. В отличие от этого, не более 10-20% изоформы Р участвовало во взаимодействии с мембранами при рН 5.5. Наличие вариабельных областей У1 и У2 в составе ферментов позволило предположить, что различия в связывающих свойствах изоформ КБР киназ аир могут быть обусловлены различиями в одной из вариабельных областей.
В настоящей части работы предпринята попытка проверить такое предположение, используя химерные белки - НЛ-КБР киназу ар и НЛ-КБР киназу ра. На первом этапе работы эксперименты по связыванию проводили при рН 8 и рН 5.5 (Рис. 2). Было показано, что (1) при стандартных условиях и рН 8 химерная форма КБР киназы а находится в супернатанте, но (2) при рН 5.5 основная часть фермента связана с мембранами и (3) СГРуЗ индуцирует высвобождение связанной НЛ-КБР киназы ар (Рис. 2). Химерная форма КБР киназы р (НЛ-КБР киназа Ра) находится в свободном
Рис. 2. Взаимодействие НА-МБР киназы аР (НА-аР) и НА-МБР киназы Ра (НА-ра) с мембранами НС11 сетчатки быка (М-мембраны) при рН 8,1 и 5,5. Конечные концентрации Л* и ферментов составляли 2 цМ и 20-40 нМ, соответсвенно. 1 - активность суспензий при рН 8,1 до центрифугирования (100%); 2,3 - активность супернатантов, полученных при разделении свободной и связанной формы фермента
центрифугированием при рН 8,1 и 5,5, соответственно; 4-активность
супернатантов, полученных при рН 5,5 и 5 цМ СГР^]
состоянии при рН 8 и при рН 5.5 проявляет только слабое связывание (Рис. 2). Таким образом, в этих экспериментах поведение НА-МБР киназы ар и НА-МБР киназы Ра практически не отличается от поведения исходных изоформ
На следующем этапе была детально исследована рН-зависимость процесса связывания ферментов с М-мсмбранами в диапазоне рН от 5.5 до 8.5 (Рис. 3). Связывание химерной формы МБР киназы а было полумаксимальным при рН 6,0-6,1, а при рН 5,5 было близким к максимальному. Таким образом, поведение НА-МБР киназы аР практически полностью совпадало с поведением МБР киназы а. Связывание химерной формы МБР киназы Р было также рН-зависимым, но при рН 5,5 лишь 30-40% фермента находилось в связанном состоянии. Таким образом, поведение химерной формы МБР киназы Р в значительной степени напоминало поведение исходной р-формы. Совокупность этих данных подтверждает предположение о том, что именно участок У1 обеспечивает эффективность процесса взаимодействия МБР киназы а с фоторецепторными мембранами.
Рис. 3. Связывание химерных производных рекомбинантной МБР киназы крысы НА-МБР киназы ар (НА-аР) и НА-МБР киназы (За(НА-ра) с мембранами НСП сетчатки быка (М-мембраны) в диапазоне рН 5,5-8,3. Конечные концентрации Я* и ферментов составляли 2 цМи 20-40 нМ, соответственно. На левом рисунке представлены результаты двух независимых экспериментов (■,□) Величины ферментативной активности супернатантов нормировали к величине активности препаратов при рН 8,1 до их центрифугирования Полученные данные затем описывали с помощью выражения (1) как указано в методической части работы (сплошные кривые) Теоретические кривые построены при значениях коэффициента Хилла 2 и 1 для верхней и нижней кривых соответственно. Согласно данных анализа, связывание НА-МБР киназы аР и НА-МБР киназы Ра было полумаксимально при рН 6,0 и 5,3 соответственно.
Как и можно было бы ожидать на основании данных ^г^ et в1., 1996, 1997], полученных при исследовании взаимодействия между фоторецепторной мембраной и NDP киназой а, GTP[S], индуцирующий диссоциацию комплексов R*Gt и снижающий концентрацию таких комплексов в мембране, сдвигал равновесие между свободной и связанной формами фермента в пользу свободной HA-NDP киназы аР (Рис. 4). Как и в случае исследования связывания в аналогичных экспериментальных условиях ^г^ et э1., 1996, 1997], эффект действия GTP[S] был полумаксимален при концентрации нуклеотида около 200 нМ. Такие результаты дают основания предполагать, что в описанных экспериментальных условиях сродство МБР киназы Ци ее производного HA-NDP киназы сф близки между собой. Связывание было минимальным (<10%) при использовании свободных от трансдуцина обесцвеченных фоторецепторных мембран (^-мембраны).
Как показано ранее, МБР киназа а при кислых значениях рН обладает повышенным сродством к комплексу R*Gt Это же состояние способно взаимодействовать с ионами щелочных (Ка+, К4) и щелочноземельных металлов, причем такое взаимодействие ведет к потере сродства NDP киназы к родопсин-трансдуциновому комплексу. Мы также исследовали влияние и КО на
взаимодействие между HA-NDP киназой а|$ и родопсин-трансдуциновым комплексом в составе фоторецепторных мембран при рН 5.5. Оказалось, что и КО сдвигают
равновесие в пользу свободного фермента и практически одинаковы по эффективности (Рис. 4). В выбранных условиях концентрации свободного и связанного фермента были равны при концентрации солей около 38 мМ. Влияние солей носило кооперативный характер и характеризовалось значением коэффициента Хилла равным 3. Таким образом, действие указанных солей на процесс взаимодействия между HA-NDP киназой и родопсин-транедуциновым комплексом по всем исследованным
характеристикам полностью аналогично параметрам, полученным ранее при использовании в экспериментах по связыванию NDP киназы a ^г^ et al, 1997].
1Е-3 0.01 0.1 1 10 100 1 10 100 1000
кьнцмпрщм нушмгчп. Концентрация солей, мМ
Рис. 4. Влияние GTP[S] (левая панель), №0 ( ■) или КО ( □) (правая панель) на взаимодействие НА-МБР киназы ар с комплексом в фоторецепторных мембранах НСП. М-мембраны
суспендировали в кислом буфере (10 мМ Mes-NaOH, рН 5 5, 0,01 мМ М(5С1г) в конечной концентрации по белку 200 мкг/мл и добавляли HA-NDP киназу аР Пробы (объем 100 мкл) такой суспензии смешивали с 10 мкл растворов нуклеотида или солей и центрифугировали. Полученные супернатанты использовали для измерения ферментативной активности. Теоретические кривые рассчитаны в согласии с уравнением (1) при К1/2 = 200 нМ и h — 12 (левая панель) и при К]/2 =38 мМ и h = 3 (правая панель) Максимальный уровень активности HA-NDP киназы аР в супернатантах составлял 60-70% от активности фермента в суспензии до центрифугирования.
Исследование температурной стабильности МБР кнназ а и р и их производных
В настоящей работе исследовалась температурная стабильность МБР киназы а и МБР киназы Р, а также их химерных и НА-производных методом - остаточной ферментативной активности. Экспериментальные данные частично представлены на Рис. 5, результаты всех опытов суммированы в Табл. У. Семейство теоретических кривых, построенных на основании экспериментальных данных, полученных для каждого из белков, показано на Рис. 6.
20 30 40 50 ' 00 70 00 20 ' 30 40 50 60 70 «0
Темпер»7>р» («С} Темвервтурв («С)
Рис. 5. Зависимость остаточной ферментативной активности активности МБР киназ аиР и их химерных производных ар и ра от температуры преинкубации. Образцы преинкубировали при указанных температурах в течении 15 мин и затем измеряли их остаточную ферментативную активность. Активность выражена в процентах от значения активности при 20°С. Теоретические кривые, описывающие экспериментальные данные, были получены как описано в методической части работы.
Замена С-концевой части в МБР киназе а на С-концевую область МБР киназы (МБР киназа ) не меняет значение температуры инактивации (МБР киназа и ее химерная форма МБР киназа ар инактивировались в диапазоне температур 60-61.5°С) (Табл. У, рис. 5,6). Введение НА-последовательности в М-концевую часть МБР киназы аР (НА-МБР киназа аР) приводило лишь к небольшим увеличениям температуры инактивации (Табл. У, рис. 5). Замены также несколько увеличивали крутизну переходов.
Аналогичная тенденция наблюдалась и при исследовании термоинактивации МБРкиназы р и ее производных. Исходная Р изоформаМБР киназы инактивировалась при температуре 50°С. Параметры инактивации химерного белка (МБР киназа Ра) были
очень близки параметрам инактивации самой NDP киназы р. Включение НА-эпитопа в обоих белках несколько увеличивало температурную стабильность (Табл. V, рис. 6). Все сделанные замены в той или иной степени увеличивали крутизну переходов.
Табл. V. Характеристики процесса температурной инактивации NDP киназ аир крысы и их производных. Значения ^я и h получены из теоретической зависимости (1), использованной для описания экспериментальных данных, полученных для NDP киназ а, Р, ар, Ра и НA-NDP киназ Р, ар, Ра, обозначенных в таблице как а, Р, ар, ра и соответственно)
Рис. 6. Сравнение теоретических кривых, описывающих процессы термоинактивации NDP киназ а и Р и их производных. Обозначения белков аналогичны использованным в Табл.У.
Сравнение теоретических кривых, описывающих процессы термоинактивации МВР киназ а и р и их производных, наглядно оказывает, что изоформа а и все ее производные значительно отличаются от NDP киназы Р и ее производных по температурам инактивации. Полученные результаты указывают на то, что различия в температурной стабильности рекомбинантных NDP киназ аир практически полностью обусловлены их различиями в вариабельной VI области, тогда как влияние различий С-концевой вариабельной области У2 на температурную стабильность, по-видимому, незначителен.
Исследование стабильности N0? киназ как гексамеров.
Широкий спектр физиологического действия N0? киназы в клетках млекопитающих может быть связан с наличием набора изоформ этого фермента. Существование такого набора, возникающего вследствие ассоциации двух типов субъединиц (а И (5) в различные гексамерные структуры (щ, С^Рь ОЦ^ь ЯзР.1» ОгР*. СС1Р5, Рб)» может определять их различное сродство по отношению к клеточным мишеням и, как следствие, обеспечивать различную регуляторную роль фермента в разных типах клеток [ЬаБси Й а1., 2000]. Механизмы формирования и регуляции набора изоформ в клетке пока неясны. Эти вопросы приобретают особый интерес, особенно если учесть, что распределение изоформ специфично для каждого из типов тканей, неоднородно внутри клеток, меняется в зависимости от функционального состояния клетки [ЭаЬегпа! й а1., 1999; Лгпаид-ЭаЪеша1 е1 а1., 2003] и различно в норме и патологии. Поиск ответов на все эти вопросы требует специальных исследований с использованием многих методов и подходов. В настоящей работе мы попытались найти ответ лишь на один из таких вопросов: насколько стабильна N0? киназа как гексамерная структура.
Стабильность гексамеров N0? киназы предполагали определять, сравнивая характеристики смеси гомогексамеров двух типов с характеристиками индивидуальных гомогексамеров. Такой подход был использован ранее [БикисЫ е1 а1., 1994] при исследовании стабильности гексамеров N0? киназы к действию умеренных, не вызывающих денатурации субъединиц, концентраций мочевины. Было показано, что в результате инкубации смеси двух типов гомогексамеров с мочевиной и ее последующем удалении диализом формируется набор гетерогексамеров. В настоящей работе мы проводили аналогичные эксперименты, используя гомогексамеры, обладающие различными спектральными характеристиками и изоэлектрическими точками, и инкубируя их смеси в течение длительного времени в различных условиях а отсутствие денатурирующих воздействий.
Первоначально был использован метод собственной белковой флуоресценции. Как показано выше, флуоресценция использованных в опытах белков (N0? киназ а и ра) принципиально отличается как по положению максимума спектра, так и по величине квантового выхода. Было показано, что флуоресцентные спектры эквимолярной смеси N0? киназ а и Ра (концентрация белка 0.1 мг/мл), записанные как непосредственно после смешивания, так и после длительной инкубации (10-12 ч) при комнатной температуре и рН 8 (10 мМ НЕ?Е8-№ОН буфер, 0.5 мМ MgCl2) равны половине арифметической суммы спектров индивидуальных ферментов до смешивания. Ферментативная активность такой смеси также оставалась стабильной в течение всего хода эксперимента.
Дальнейшие эксперименты были выполнены методом изоэлектрического фокусирования. Для исследований использовали N0? киназу а, N0? киназу ра, НА^0? киназу ар и НА-М^0? киназу а. Предварительные опыты показали, что все эти белки фокусируются в виде единственной узкой полосы при значениях рН около 7.8, 7.0,6.0 и 6.5, соответственно. В последующих опытах анализировали смеси N0? киназы а с каждым из отмеченных белков. Концентрации белков в смеси были одинаковы и составляли около 0.1 мг/мл. Смеси инкубировали в 0.5 мМ НЕ?Е8-№ОН буфере (рН 8) при 4-6°С в течение 1-10 дней без заметного изменения их ферментативной активности. Последующий анализ этих смесей показал, что анализируемые белки фокусируются при тех же значениях рН, которые были получены ранее при их индивидуальном анализе. Каких либо новых полос, которые, как ожидалось, должны были бы локализоваться в геле между позициями исходных компонентов в случае формирования гетерогексамеров [Бикиёа е1 а1., 1994], не наблюдалось даже при максимальном времени инкубации.
Инкубация смесей при комнатной температуре в течение 24 ч перед их анализом дала аналогичные результаты. Рад контрольных опытов, связанных с определением ферментативной активности белковых полос в геле (ферментативной активностью обладает лишь гексамерные структуры [Lascu et al., 2000]) дали основания считать, что фокусирующиеся белки являются именно гексамерами.
Полученные данные, свидетельствующие об отсутствии обмена субьединицами между гексамерами фермента в широком диапазоне условий, означают, что NDP киназа млекопитающих как гексамерная структура очень стабильна. Время жизни гексамеров очень велико (не менее десятков-сотен часов) и, таким образом, сравнимо со временем жизни белка в клетке. Такие результаты позволяют до известпой степени уменьшить число возможных теоретических моделей формирования и регуляции набора изоформ NDP киназы in vivo.
Заключительное обсуждение. Возможная функциональная роль NDP киназы в
клетке
В ходе предыдущих исследований нашей лаборатории совместно с Отделом Молекулярной Биологии Токийского столичного Института Геронтологии было обнаружено [Orlov et al., 1996] специфичное для а изоформы фермента GTP-зависимое взаимодействие между NDP кяназой и R*-Gt комплексом, который, как известно [Kuhn, 1980; Stayer, 1991], образуется в мембранах дисков НСП при активации родопсина и является одним из ключевых промежуточных состояний в процессе быстрого формирования (<1 с) значительного количества (>1000) активных молекул трансдуцина в ответ на фотолиз молекулы родопсина [Uhl et al., 1990; Pugh, Lamb, 1993; Helmreich, Hofmann, 1996]. В настоящей работе мы дополнительно подтвердили специфичность такого взаимодействия, показав, что конформационная лабильность NDP киназы а и ее способность взаимодействовать с R*-Gt комплексом, т.е. свойствами, принципиально отличающими ее от гомологичной NDP киназы р, скорее всего, обусловлена структурой и свойствами вариабельного участка V1. Значительная часть данных о взаимодействии между NDP киназой (использовалась NDP киназа В человека (Nm23-H2), являющаяся аналогом NDP киназы крысы) и Gt была недавно подтверждена работами немецких исследователей [Cuello et al., 2003; Нippe et al., 2003], применявших независимые методы и подходы. Совокупность изложенных данных ставит вопрос о функциональном смысле такого взаимодействия в клетке. Дополнительным основанием для анализа этого вопроса являются изложенные в литературном обзоре диссертации многочисленные, в том числе и появившиеся уже в ходе выполнения нашей работы данные, которые свидетельствуют о наличии взаимодействия между NDP киназой и различными представителями семейства GTP- связывающих белков.
По нашему мнения, изложенные данные, в том числе и результаты настоящей работы, могут свидетельствовать в пользу того, что NDP киназа участвует в процессе активации гетеротримерных GTP-связывающих белков (G-белки), фосфорилируя в ответ на специфическое для тех или иных систем клеточной транедукции связанный в активном центре G-белка GDP. В общем виде такая гипотеза была высказана достаточно давно (см. напр. [Kimura, Nagata, 1979; Тищенков и соавт., 1982]), но до недавнего времени не получала прямых подтверждений в связи трудностями, возникающими при попытке однозначно доказать, что фосфорилированию NDP киназой подвергается именно связанный, а не диссоциировавший из активного центра G-белка GDP (см. напр. [Тищенков и соавт., 1982; Lacombe et al., 2000; Kimura et al., 2003]). В связи с этим одним из дополнительных веских аргументов в пользу такой гипотезы могут считаться полученные недавно результаты [Zhu et al., 1999; Otsuki et al., 2001], согласно которым NDP киназа способна фосфорилировать GDP, ковалентно связанный в активном центре GTP-связывающих белков Rad, Racl, Cdc42Hs и RhoA
(гомологичен Ct-субъединице G-белков) в результате их предварительного УФ-облучения в присутствия GDP.
По нашему мнению, было бы также весьма плодотворным применение этой гипотезы для объяснения молекулярного механизма быстрой активации трансдуцина в фоторецепторах сетчатки позвоночных. По многим данным (см. напр. [Vuong et al., 1984; Uhl et al., 1990; Pugh, Lamb, 1993; Lamb, 1994,1996; Helmreich, Hofmann, 1996]), в том числе и теоретическим оценкам, выполненным в рамках настоящей работы для ситуации, близкой к in vivo [Фрейдин и соавт., 1998; Орлов и соавт., 1998], начальная скорость активации транедуцина при поглощении фоторецепторами сетчатки одиночных фотонов очень велика и достигает íoMo4 молекул Gt в секунду. Обычно подразумевается, что активация Gt происходит в результате индуцируемого молекулой R* обмена связанного GDP на свободный GTP [Fung et al., 1981; Stryer, 1991]. Такой процесс действительно имеет место in vitro, однако пока неясно, способен ли он обеспечить требуемую высокую скорость активации Gt in vivo, тем более что время жизни неактивного комплекса Gt-GDP в отсутствие очень велико и составляет десятки часов [Fawzi, Northup, 1990]. Более того, прямые экспериментальные данные, полученные методом быстрой фильтрации, свидетельствуют о том, что индуцируемая молекулой диссоциация комплекса Gt-GDP (лимитирующая стадия процесса активации Gt) происходит в секундном диапазоне времен [Орлов и соавт., 1998]. Наши результаты подтверждают наличие взаимодействия между Gt и NDP киназой в присутствии которое могло бы быть молекулярной основой участия NDP киназы в активации Gt Участие в процессе активации GtNDP киназы, взаимодействующей с Gt именно в процессе его взаимодействия с и обладающей огромной каталитической активностью (103-104 циклов в секунду) потенциально могло бы обеспечить требуемую скорость формирования активного состояния транедуцина в фоторецепторной клетке.
В заключение интересно отметить, что в последние годы появилось большое количество работ, аналитически рассмотренных в обзоре литературы и достаточно убедительно свидетельствующих о наличии взаимодействия между NDP киназой и так называемыми трштерными GTP- и АТР-связывающими белками, функциональное состояние которых определяется наличием соответствующего ди- или трифосфата в активном центре. В рамках рассмотренной выше точки зрения такие результаты могут означать, что NDP киназа может быть непосредственным участником процесса активации этих белков.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. Результаты исследования рекомбинантных NDP киназ а и крысы Р и их химерных, мутантных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства NDP киназы а и ее способность к копформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы определяются свойствами вариабельного участка VI. Возможно, что различия в структуре и свойствах этого участка и определяют функциональные различия изоформ
и в клетке.
2. Данные, полученные в ходе опытов по связыванию рекомбинантных HA-NDP киназ
ар и ра крысы с комплексом К*-О^ являющимся одним одним из ключевых промежуточных состояний системы фототрансдукции палочек сетчатки позвоночных, свидетельствуют в пользу того, что способность NDP киназы а взаимодействовать с О-белками определяется вариабельной областью VI, тогда как вклад С-концевой вариабельной области V2 и начального участка ^концевой области мал.
3.Результаты экспериментов по исследованию сравпительной термостабильности рекомбинантных изоформ МБР киназы крысы и их производных показали, что стабильность а формы выше, чем стабильность формы, а различия в их температурах инактивации обусловлены вариабельными остатками, преимущественно локализованными в вариабельном участке VI.
4. Сделан вывод о том, что дальнейшие исследования по выявлению основ функциональных различий между изоформами МБР киназы млекопитающих должны сводиться к изучению точечных мутантных форм МБР киназы по вариабельным аминокислотным остаткам участка У1. Наиболее вероятными заменами, определяющими функциональные различия изоформ и крысы, являются замены А^42О1п, Шз47Ьеи и Asn69His. В дальнейших исследованиях эти аминокислотные остатки должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.
5. Использован метод изоэлектрического фокусирования для анализа смесей различных гомогексамеров МБР киназы крысы, состоящих из субъединиц, значительно различающихся значением р1. Результаты, полученные с помощью такого подхода, свидетельствуют о высокой стабильности МБР киназы как гексамера.
6.Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл подтвержденного результатами настоящей работы специфического взаимодействия между МБР киназой и
комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации О-белка палочек сетчатки. Рассмотрены преимущества схемы активации трансдуцина с участием МБР киназы.
Список цитированной литературы
Бурштейн, Е.А. (1977) Собственная флуоресценция белка. Природа и применение.
Итоги науки и техники (серия Биофизика) т.7, ВИНИТИ, М. Орлов Н.Я., Тищенков В.Г., Багиров И.Г., Шныров ВЛ. (1983) GTP-связывающий белковый комплекс в препаратах наружный сегментов палочек сетчатки лягушки. Биофизика 28,793-799.
Тищенков В.Г., Грумбкова Л., Орлов НЛ. (1982) Фосфорилирование связанного [14C]GDP в препаратах наружных сегентов палочек сетчатки лягушки. Докл.АН СССР, 268,735-738.
Тищенков В.Г., Орлов НЛ. (1983) Взаимодействие гуаниновых нуклеотидов с наружными сегментами палочек сетчатки лягушки. Биофизика, т.28,274-279 Abornev, S.M. and Е.А. Burstein (1992) Resolution of tryptophan fluorescence spectra into elementary components. Molecular Biology, 26,1350-1361 [Engl. Transl.]. Arnaud-Dabernat S, Bourbon PM, Dierich A, Le Meur M, Daniel JY. (2003) Knockout mice as model systems for studying nm23/NDP kinase gene functions. Application to the nm23-Ml gene. J Bioenerg Biomembr. 2003 Feb;35(l): 19-30. Review. Chen RF. (1967) AnalyL Letts. 1,35-42
Dabernat S, Larou M, Masse K, Dobremez E, Landry M, Mathieu C, Daniel JY. (1999) Organization and expression of mouse nm23-Ml gene. Comparison with nm23-M2 expression-Gene. Aug 20;236(2):221-30.
Erent M., Golin P., Cherfils J., Tissier P., Raschella G., Giartosio A., Agou F., Sanger C, Lacombe M.-L., Konrad M., Lascu I. (2001) Structural and catalytic properties and homology
modelling ofthe human nucleoside diphosphate kinase C, product ofthe DRnm23 gene. Eur. J.Biochem. 268,1972-1981.
Fukuchi T, Shimada N, Hanai N, Ishikawa N, Watanabe K, Kimura N. (1994). Recombinant rat nucleoside diphosphate kinase isoforms (a and B):; Purification, properties and application to immunological detection of native isoforms in rat tissues. Biochcm. Biophys. Acta 1265: 113-122.
Fung B.B-K., Hurley J.B., Strycr L. (1981) Flow of information in the light triggered cyclic nucleotide cascade ofvision. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,152-56.
Ishijima Y, Shimada N, Fukuda M, Miyazaki H, Orlov NY, Orlova TG, Yamada T, Kimura N. (1999). Overexpression of nucleoside diphosphate kinases induces neurite outgrowth and their substitution to inactive forms leads to suppression of nerve growth factor- and dibutyryl cyclic AMP-induced effects in PC12D cells. FEBS Lett Feb 19;445(l): 155-9.
Kim SY, Chang KH, Doh m, Jung JA, Kim E, Sim CJ, Lee KJ. (1997) Rapid purification and characterization of nucleoside diphosphate kinase isoforms using ATP-sepharose affinity column chromatography. Mol Cells. Oct 31;7(5):630-4.
Kimura N., Nagata N. (1979) Mechanism of glucagon stimulation of adenylate cyclase in the presence ofGDP in rat liver plasma membranes. J. Biol. Chem. 254,3451 - 3457. Kuhn IL (1980) Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283,587-589.
Lamb T.D. (1994) Stochastic simulation of activation in the G-protein cascade of phototransduction. Biophys. J. 67,1439-1454.
Lamb T.D. (1996) Gain and kinetics of activation in the G-protein cascade of phototransduction. Proc. Natl. Acad. Ssi. USA, 93,566-570.
Orlov NYa, Kalinin EV, Orlova TG, Freidin AA. (1988) Properties and content of cyclic nucleotide phosphodiesterase in photoreceptor outer segments of ground squirrel retina. Biochim Biophys Acta. Jun 13;954(3):325-35.
Orlov N.Ya., Kimura N. (1998) Interaction ofnucleoside diphosphate kinase with membranes of bleached bovine retinal rod outer segments. Effects of pH, salts, and guanine nucleotides. Biochemistry (Moscow) 63,171-179
Orlov N.Ya., Orlova T.G., Nomura K., Hanai N., Kimura N. (1996) Transducin-mediated,
isoforms-specific interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases with bleached
bovine retinal rod outer segments membranes. FEBS Lett, 389,186-190
Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K., Burstein E.A., Kimura N. (1997) Interaction of
rat recombinant nucleoside diphosphate kinase a with bleached bovine photoreceptor
membranes. The possible mode ofpH and cation effects. Biochem. & Mol. Biol. Intemat, 41,
189-198
Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K., Burstein E.A., Kimura N. (1999) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and P by intrinsic protein fluorescence. J.Biomol. Struct & Dynamics 16,955-968
Parks, R.E., Jr., Agarwal, R.P. (1973) In The Enzymes, Vol. 8, Academic Press, New-York, pp. 307-334
Pugh E.N., Jr, Lamb TJ). (1993) Amplification and kinetics of the activation steps in phototransduction. Biochim.Biophys.Acta, 1141,111-149.
Tatischeff I, Klein R, Duquesne M. (1976) A new fluorescent photoproduct of tryptophan evidenced by long wavelength excitation of fluorescence. Photochem Photobiol. 1976 Nov,24(5):413-6.
Uhl R., Wagner R., Ryba N. (1990) Watching G proteins at work. Trends Nerosci. 13,64-70. Vuong R.M., Chabre M., Stryer L. (1984) Millisecond activation oftransducin in the cyclic nucleotide cascade ofvision. Nature 311,659-661.
Список публикаций
1. Орлов H-Я., Фрейдин А.А., Орлов Д.Н., Бепнетт Н. (1998) Измерения скорости родопсин-индуцированной диссоциации комплексов трансдуцин-ГДФ в наружных сегментах палочек сетчатки быка. - Междунар. конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998) стр. 108-110.
2. Фрейдин А.А., Орлов Д.Н., Орлов Н.Я. (1998) Активация сГМФ-специфичной фосфодиэстеразы наружных сегментов палочек сетчатки быка G-белком трансдуцином в присутствии ГТФ и ею негидратизуемых аналогов. - Междунар. конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998) стр. 127-128.
3. Orlov N.Ya., Freidin А.А., Orlov D.N., Kimura N. (2001) Interaction between recombinant rat nucleoside diphosphate (NDP) kinase a and rhodopsin/G-protein transducin complex in bovine retinal membranes provides a novel possible mechanism of extremely rapid transducin activation in living rods. - International Symposium "Biological Motility: New Trends in Research ", (Pushchino, Russia, 2001), 107-108.
4. Orlov N.Ya., Reshetnyak Ya.K., Orlova T.G., Orlov D.N., Burstcin ЕЛ., Ishijima Y, Kimura N. (2001) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinase and and their tagged, mutant and chimeras forms by protein fluorescence. - International Symposium "Biological Motility: New Trends in Research" (Pushchmo, Russia, 2001), p.109-110
5. Orlov N.Ya., Reshetnyak Ya.K., Orlova T.G., Orlov D.N., Burstein E.A., Ishijima Y., Kimura N. (2001) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases (NDPK) a and p and their chimeras by protein fluorescence. - 45th Annual Meeting of the American Biophysical Society (Boston, USA, February21-25,2001), Biophys. J, v. 82, Abst584.
6. Orlov N.Ya., Freidin A.A., Orlov D.N., Kimura N. (2001) Is nucleoside diphosphate kinase involved in rapid activation of retinal rod G-protein transducin? - Fourth International Congress ofthe Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/NM23/Awd (Tokyo, Japan, November 6-8, 2001)v1,P.8.
7. Orlov N.Ya., Reshetnyak Ya.K., Orlova T.G., Orlov D.N., Burstein EA., Ishijima Y., Kimura N. (2001) Structural and enzyme properties of recombinant rat nucleoside diphosphate kinase
and their tagged, mutant and chimeras forms. Protein fluorescence study. - Fourth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/NM23/Awd (Tokyo, Japan, November 6-8, 2001) v.l, P.2
8. Орлов Д.Н., Ишиджима Ю., Орлов H^., Кимура Н. (2003) Исследование химерных и tag-форм нуклеозидифосфаткиназ крысы. Связывание с родопсин-транедуциновым комплексом и термостабильность. - Междунар. Конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", (Пущино, 1998)стр. 106-108
9. Orlov D.N., Ishijima Y., Orlov N.Ya., Kimura N. (2003) Thermal stability and binding properties of chimeric and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p. - 5th International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kmase/NW3/Awd (Lexington, Kentucky, USA, 13-16October2003) v.l, P.7.
10. Orlov N.Ya-, Freidin А.А„ Orlov D.N., Kimura N. (2003) Interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate (NDP) kinase with rhodopsin/G-protein transducin complex in the bleached bovine retinal rod outer segment membranes. Possible mechanism of extremely rapid transducin activation. -Biol. Membranes (Moscow) 20(1), 46-52.
11. Orlov N.Ya., Reshetnyak Ya.K., Orlova T.G., Orlov D.N., Burstein E.A., Ishijima Y., Kimura N. (2003) Protein fluorescence study of chimeras and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p. - Biol. Membranes (Moscow) 20(1), 53-59.
12. Orlov D.N., Ishijima Y., Orlov N.Ya., Kimura N. (2004) Investigation of chimeric and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p. Interaction with rhodopsin-transducin complex, thermal stability of the enzymes and hexamer stability. • X Международный Симпозиум "Биологическая подвижность"памятиГ.М Франка (Пущино, 2004)
13. Орлов Д.Н., Ишиджима Ю., Орлов Н.Я., Кимура Н. (2004) Исследование химерных и tag-форм нуклеозидифосфаткиназ аир крысы. Связывание с родопсин-трансдуциновым комплексом и термостабильность. - III съезд биофизиков России (Воронеж, 2004)
Принято к исполнению 06/05/2004 Заказ № 181
Исполнено 07/05/2004 Тираж: 100 экз.
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autorefeiat.ru
10782
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлов, Денис Николаевич
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общие представления о свойствах и функции нуклеозиддифосфаткиназы. Особенности нуклеозиддифосфаткиназы в клетках млекопитающих.
2. Трехмерная структура NDP киназы.
2.1. Пространственная структура субъединицы NDP киназы.
2.2. Структура гексамера NDP киназы.
3. Мультифункциональная роль NDP киназ в клетке.
4. Возможные молекулярные механизмы участия NDP киназ в регуляторных процессах.
4.1. Протеинкиназная активность NDP киназы.
4.2. NM23 как регулятор транскрипции онкогенов.
4.3. Белки, взаимодействующие с NDP киназой.
4.4. NDP киназа как возможный активатор GTP-связывающих белков.
5. Взаимодействие NDP киназ с комплексом родопсин-трансдуцин в фоторецепторных мембранах наружных сегментов палочек сетчатки быка.
6. Исследование изоформ NDP киназы млекопитающих методом собственной белковой флуоресценции.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование химерных, мутантных и TAG-форм нуклеозиддифосфаткиназы крысы"
Актуальность темы. Работа посвящена сравнительному исследованию рекомбинантных форм нуклеозиддифосфаткиназы (NDP киназа) млекопитающих - одного из первых известных к настоящему времени супрессоров метастаз при канцерогенезе.
В последнее десятилетие исследования NDP киназ - семейства ферментов, основной функцией которых, как считалось ранее [Park and Agarval, 1973], является синтез нуклеозидтрифосфатов из нуклеозиддифосфатов за счет АТФ, привлекают дополнительное внимание. В начале 90-х годов неожиданно выяснилось, что ряд генов (Nm23), нарушение работы которых ведет к увеличению метастатического потенциала раковых клеток, кодируют субъединицы NDP киназы. Это положило начало новому этапу исследований NDP киназы, в результате которого было показано, что NDP киназы могут играть роль регуляторов транскрипции онкогенов и участвуют во многих клеточных процессах, таких, например, как дифференцировка клеток, метастазирование и апоптоз, причем эти функции NDP киназы не всегда связаны с ее активностью как фермента. Совокупность этих неожиданных данных привела к предположению о том, что NDP киназа является мультифункциональным белком и стимулировала всесторонние исследования представителей этого семейства
В ходе этих исследований особый интерес вызвали данные, согласно которым гексамеры NDP киназы млекопитающих, в отличие от ферментов низших организмов, состоят из двух типов низкомолекулярных (Мт ~ 17000) предельно консервативных и близких по первичной структуре (степень гомологии 90%, основные различия локализованы в вариабельных областях VI и V2 (остатки 37-50 и 131-150, соответственно)) субъединиц и, таким образом, представлены в клетке набором изоформ. Оказалось также, что каждый из видов тканей млекопитающих характеризуется своим набором изоформ. Исследования рекомбинантных белков, состоящих из субъединиц только одного типа, показали, что такие изоформы практически неразличимы по своим ферментативным характеристикам и трехмерной структуре в кристалле. Функциональный смысл присутствия в клетке изоформ NDP киназы с одинаковыми каталитическими и структурными свойствами несмотря на усилия многих лабораторий долгое время оставался принципиально неясным. Однако наше недавнее исследование рекомбинантных крысиных NDP киназ а и Р, содержащих только один тип субъединиц (а или Р), неожиданно показало, что изоформа а, в отличие от изоформы р, способна взаимодействовать с локализованным в мембранах наружных сегментов палочек (НСП) сетчатки комплексом между фотоактивированным рецептором света родопсином (R*) и
G-белком трансдуцином (Gt) [Orlov et al., 1996]. Такое взаимодействие высокоспецифично, поскольку связанная NDP киназа высвобождается в присутствии GTP, индуцирующего, как известно [Kiihn, 1980], процесс диссоциации комплекса R*-Gt. Эти результаты явились одним из первых прямых экспериментальных подтверждений точки зрения (см. напр. [Kimura, 1993]), согласно которой регуляторное действие NDP киназ может опосредоваться через гетеротримерные GTP-связывающие белки (G-белки), являющиеся ключевыми компонентами систем клеточной трансдукции.
В целях выяснения молекулярной природы различий между изоформами, определяющих их различное сродство к R*-Gt комплексу, в последующей работе было выполнено сравнительное исследование рекомбинантных NDP киназ а и Р крысы методом собственной белковой флуоресценции [Orlov et al., 1999]. Обе изоформы содержат остатки триптофана и тирозина в одинаковых позициях, но проявляют ярко выраженные различия в положении максимума спектра флуоресценции, форме спектров и значениях квантового выхода (q) при рН 8. Более того, NDP киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне рН 5-8, тогда как в тех же условиях NDP киназа р не претерпевает структурных перестроек. Подобие рН-зависимостей q флуоресценции NDP киназы а и процесса связывания этого фермента с R*-Gt комплексом позволило предположить, что различия между NDP киназами а и р в конформационной лабильности и различия в связывании с комплексом R*-Gt могут иметь ту же самую физическую основу, которая, в свою очередь, и определяет функциональные различия изоформ в клетке.
В независимых работах было также показано [Postel et aL, 2000], что NDP киназа также взаимодействует с определенными сайтами (NHE) промоторных участков гена с-тус и генов факторов роста. Данный тип DNA-связывающей активности, как и обнаруженная недавно неожиданная способность NDP киназы осуществлять процессинг и репарацию DNA, также являются изоформ-специфичными [Agou et al., 1999, 2000; Postel et al., 2000; Postel, 2003]. Все эти данные дали начало сравнительным исследованиям рекомбинантных изоформ NDP киназы и их производных для определения физико-химических основ их функциональных различий. Очевидно, что подобный подход является необходимым этапом при выяснении молекулярных механизмов мультифункциональной активности этих белков в клетке в норме и патологии.
Цели и задачи работы. Основной задачей работы являлось выяснение структурной основы различий между изоформами NDP киназы, возможно определяющей все последующие функциональные различия изоформ в клетках млекопитающих. Для этого были использованы рекомбинантные а и Р изоформы NDP киназы крысы и различные типы их генноинженерных производных для исследования (1) характеристик белковой флуоресценции этих белков в широком диапазоне условий, (2) параметров их взаимодействия с родопсин-трансдуциновым комплексом, (3) сравнительной термостабильности методом остаточной ферментативной активности, и (4) стабильности NDP киназ как гексамеров.
Научная новизна. Впервые показано, что различия в вариабельной области VI NDP киназы млекопитающих определяют различия физико-химических характеристик изоформ фермента. Результаты настоящей работы дают основания считать, что способность NDP киназ млекопитающих взаимодействовать с G-белком палочек сетчатки трансдуцином определяется вариабельной областью VI, тогда как вариабельный участок V2 не участвует во взаимодействии. Получены данные, свидетельствующие о высокой стабильности гексамерной структуры NDP киназ млекопитающих. Рассмотрен вопрос о функциональной роли взаимодействия между NDP киназой и комплексом родопсин-трансдуцин.
Практическая ценность. Исследованные в настоящей работе химерные и tag-производные изоформ NDP киназы могут быть рекомендованы для использования в физиологических опытах, связанных с экспрессией генов производных в различных линиях культур раковых клеток с целью выяснения роли различных участков фермента в подавлении метастатического потенциала раковых клеток. Полученные нами данные также необходимо учитывать при экспрессии генов мутантных форм NDP киназы, не имеющих ферментативной активности, в различных линиях. культур клеток. Эксперименты по трансфекции раковых клеток генами производных NDP киназы являются одним, из современных подходов к поиску новых путей терапии злокачественных опухолей
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Орлов, Денис Николаевич
1. Результаты исследования рекомбинантных NDP киназ а и Р крысы и их химерных, мутантных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства NDP киназы а и ее способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы р, определяются свойствами вариабельного участка VI. Возможно, что различия в структуре и свойствах этого участка и определяют функциональные различия изоформ а и р в клетке.
2. Данные, полученные в ходе опытов по связыванию рекомбинантных HA-NDP киназ ар и Ра крысы с комплексом R*-Gt, являющимся одним из ключевых промежуточных состояний системы фототрансдукции палочек сетчатки позвоночных, свидетельствуют в пользу того, что способность NDP киназы а взаимодействовать с G-белками определяется вариабельной областью VI, тогда как вклад С-концевой вариабельной области V2 и начального участка N-концевой области мал.
3. Результаты экспериментов по исследованию сравнительной термостабильности рекомбинантных изоформ NDP киназы крысы и их производных показали, что стабильность а формы выше, чем стабильность Р формы, а различия в их температурах инактивации обусловлены вариабельными остатками, преимущественно локализованными в вариабельном участке V1.
4. Сделан вывод о том, что дальнейшие исследования по выявлению основ функциональных различий между изоформами NDP киназы млекопитающих должны сводиться к изучению точечных мутантных форм NDP киназы по вариабельным аминокислотным остаткам участка VI. Наиболее вероятными заменами, определяющими функциональные различия изоформ аир крысы, являются замены Arg42Gln, His47Leu и Asn69His. В дальнейших исследованиях эти аминокислотные остатки должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.
5. Использован метод изоэлектрического фокусирования для анализа смесей различных гомогексамеров NDP киназы крысы, состоящих из субъединиц, значительно различающихся значением pi. Результаты, полученные с помощью такого подхода, свидетельствуют о высокой стабильности NDP киназы как гексамера.
6. Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл подтвержденного результатами настоящей работы специфического взаимодействия между NDP киназой и R*-Gt комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации G-белка палочек сетчатки. Рассмотрены преимущества схемы активации трансдуцина с участием NDP киназы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлов, Денис Николаевич, Пущино
1. Бурштейн, Е.А. (1977) Собственная флуоресценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники (серия Биофизика) т.7, ВИНИТИ, М.
2. Орлов Н.Я., Тищенков В.Г., Багиров И.Г., Шныров В Л. (1983) GTP-связывающий белковый комплекс в препаратах наружный сегментов палочек сетчатки лягушки. Биофизика 28,793-799.
3. Тищенков В.Г., Грумбкова Л.,Орлов Н.Я. (1982) Фосфорилирование связанного 14C.GDP в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Докл.АН СССР, 268, 735-738.
4. Тищенков В.Г., Орлов Н.Я. (1983) Взаимодействие гуаниновых нуклеотидов с наружными сегментами палочек сетчатки лягушки. Биофизика, т.28,274-279
5. Тищенков В.Г., Орлов Н.Я. (1984) Аденилаткиназная и GDP киназная активность препаратов наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Возможная функциональная роль р-субъединицы трансдуцина. Молекулярная биология 18, 776-785
6. Abdulaev NG, Kakuev DL, Ridge KD. (2000) Bovine retinal nucleoside diphosphate kinase: biochemistry and molecular cloning. Methods Enzymol. 316, 87-100.
7. Abornev, S.M. and E.A. Burstein (1992) Resolution of tryptophan fluorescence spectra into elementary components. Molecular Biology, 26,1350-1361 EngL Transl..
8. Agou F., Raven S., Veron M. (2000) The binding mode of human nucleoside diphoshate kinase В to single-strand DNA. J. Bioenerg. Biomembranes 32 (3) 285-292.
9. Arnaud-Dabernat S, Bourbon PM, Dierich A, Le Meur M, Daniel JY. (2003) Knockout mice as model systems for studying nm23/NDP kinase gene functions. Application to the nm23-M1 gene. J Bioenerg Biomembr. 2003 Feb;35(l):19-30. Review.
10. Arshavsky V. Yu., Lamb T.D., Pugh E.N., Jr. (2002) G-proteins and Phototransduction. Ann. Rev. PhysioL 64, 153-187.
11. Baillat G., Gaillard S., Castets F., Monneron A. (2002) Interactions of phocein with nucleoside-diphosphate kinase, Epsl5, and Dynamin I. J. Biol. Chem. 277(21), 18961-18966.
12. Baillat, G., Moqrich, A., Castets, F., Baude, Bailly, Y., Benmerah, A., and Monneron, A. (2001) Molecular cloning and characterization of phocein, a protein found from the Golgi complex to dendritic spines. Mol. Biol. Cell 12,663-673.
13. Barthel, Т.К., Waler, G.C. (1999). Inferences concerning the ATPase properties of DnaK and other HSP70s are affected by the ADP kinase activity of copurifying nucleoside-diphosphate kinase. J. Biol. Chem. 274,36670-36678.
14. Bennett N. (1982) Light-induced interaction between rhodopsin and the GTP-binding protein. Relation with phosphodiesterase activation.- Eur. J. Biochem.123,133-139.
15. Bennett N., Michel Villaz M., Kuhn H.(1982) Light-induced interaction between rhodopsin and GTP-binding protein. Metarhodopsin II is the major photoproduct involved.- Eur. J. Biochem. 127, 97-103.
16. Berberich S.J., Postel E.H. (1995) PuF/NM23-H2/NDPK-B transactivates a human c-myc promoter-CAT gene via a functional nuclease hypersensitive element. Oncogene 10,2343-2347.
17. Biggs J., Hersperger E., Steeg P., Liotta L.A., Shearn A. (1990) A gene that is homologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for nucleoside diphosphate kinase. Cell 63, 933-940
18. Biggs J., Tripoulas N., Hersperger E., Dearolf C., Shearn A. (1988) Analysis of the lethal interaction between the prune and Killer of prune mutations of Drosophila. Genes and Dev. 2, 1333-1343.
19. Bilan P.J,. Moyers J.S., Kahn C.R. (1998) The ras-related protein rad associates with the cytoskeleton in a non-lipid-dependent manner. Exp. Cell Res. 242(2), 391-400.
20. Bominaar A.A., Tepper A.D., Veron M. (1994) Autophosphorylation of nucleoside diphosphate kinase on non-histidine residues. FEBS Lett. 353(1), 5-8
21. Brune Corrie J.E., Webb M.R. (2001) A fluorescent sensor of the phosphorylation state of nucleoside diphosphate kinase and its use to monitor nucleoside diphosphate concentrations in real time. Biochemistry 40(16), 5087-5094.
22. Cervoni L., Lascu I., Xu Y., Gonin P., Morr M., Merouani M., Janin J., Giartosio A.2001) Binding of nucleotides to nucleoside diphosphate kinase: a calorimetric study. Biochemistry 40(15),4583-4589.
23. Chen RF. (1967) Analyt. Letts. 1,35-42
24. Cheng S., Alfonso-Jaume M.A., Mertens P.R., Lovett D.H. (2002) Tumour metastasis suppressor, nm23-beta, inhibits gelatinase A transcription by interference with transactivator Y-box protein-1 (YB-1). Biochem. J. 366(Pt3), 807-816.
25. Chiadmi M., Morera S., Lascu I., Dumas C., Le Bras G., Veron M., Janin J. (1993) Crystal structure of the Awd nucleotide diphosphate kinase from Drosophila. Structure. Dec 15;1(4): 283-293.
26. Cho S.J., Lee N.S., Jung Y.S., Lee IL, Lee K.J., Kim E., Chae S.K. (2001) Identification of structural domains affecting transactivation potential of Nm23. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(3), 738-743.
27. Cohen L., Mohr R., Chen Y.Y., Huang M., Kato R., Dorin D., Tamanoi F., Goga A., Afar D., Rosenberg N., Witte O. (1994) Transcriptional activation of a ras-like gene (kir) by oncogenic tyrosine kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 91(26), 12448-12452.
28. Cox R., Mirkin S.M. (1997) Proc.Natl. Acad. ScL USA 94, 5237-5242.
29. Dabernat S, Larou M, Masse K, Dobremez E, Landry M, Mathieu C, Daniel JY. (1999) Organization and expression of mouse nm23-Ml gene. Comparison with nm23-M2 expression. Gene. Aug 20;236(2):221-30.
30. De la Rosa A., Williams R.L., Steeg P.S. (1995) Nm23/nucleoside diphosphate kinase: toward a structural and biochemical understanding of its biological functions. Bioessays 17(1), 53-62
31. Dearolf C.R., Hersperger E., Sbearn A. (1988) Developmental consequences of awdb3, a cell-autonomous lethal mutation of Drosophila induced by hybrid dysgenesis. Dev. Biol. 129(1), 159-168
32. Dearolf CR, Tripoulas N, Biggs J, Shearn A. (1988) Molecular consequences of awdb3, a cell-autonomous lethal mutation of Drosophila induced by hybrid dysgenesis. Dev. Biol. 129(1):169-178
33. Debies M.T., Welch D.R. (2001) Genetic basis of human breast cancer metastasis. J. Mammary Gland BioL Neoplasia 6(4), 441-451
34. Deitcher D. (2001) shibire's enhancer is cancer's suppressor. Trends NeuroscL 24(11):625-626.
35. Du J., Hannon G.J. (2002) The centrosomal kinase Aurora-A/STK15 interacts with a putative tumor suppressor NM23-H1. Nucleic Acids Res. 30(24),5465-5475
36. Dumas, С., I. Lascu, S. Morera, F. Glaser, R. Fourme, V. Wallet, M.-L.Lacombe, M. Veron, and J. Janin (1992) X-rays structure of nucleoside diphosphate kinase. EMBO J., 11, 3203-3208.
37. DuPont Y. (1984) A rapid-filtration technique for membrane fragments or immobilized enzymes: measurements of substrate binding or ion fluxes with a few-millisecond time resolution. Analytical Biochem., 142, 504-510.
38. Engel M., Veron M., Theisinger В., Lacombe M.L., Seib Т., Dooley S., Welter C.(1995) A novel serine/threonine-specific protein phosphotransferase activity of Nm23/nucleoside-diphosphate kinase. Eur J Biochem 234(1), 200-207.
39. Escobar Gatvis M.L., Marttila S., Hakansson G., Forsberg J., Knorpp C. (2001) Heat stress response in pea involves interaction of mitochondrial nucleoside diphosphate kinase with a novel 86-kilodalton protein. Plant Physiol 26(1), 69-77.
40. Fan Z, Beresford PJ, Oh DY, Zhang D, Lieberman J. (2003) Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor. Cell 112(5):659-72.
41. Felber S., Breuer H.P., Petruccione F., Honerkamp J., Hofmann K.P. (1996) Stochastic simulation of the transducin GTPase cycle. Biophys. J., 71,3051-3063.
42. Finlin B.S., Andres D.A. (1997) Rem is a new member of the Rad- and Gem/Kir Ras-related GTP-binding protein family repressed by lipopolysaccharide stimulation. J. BioL Chem. 272(35), 21982-21988.
43. Freije JM, MacDonald NJ, Steeg PS. (1998) Nm23 and tumor metastasis: basic and translational advances. Biochem. Soc. Symp. 63:261-271
44. Fung B.B-K., Hurley J.B., Stryer L. (1981) Flow of information in the light triggered cyclic nucleotide cascade of vision. Proc. NatL Acad. Sci. USA 78, 152-56.
45. Giartosio A., Erent M., Cervoni L., Morera S., Janin J., Konrad M., Lascu I. (1996) Thermal stability of hexameric and tetrameric nucleoside diphosphate kinases. Effect of subunit interaction. J. BioL Chem. 271(30), 17845-17851
46. Hartsough MT, Morrison DK, Salerno M, Palmieri D, Ouatas T, Mair M, Patrick J, Steeg PS. (2002) Nm23-Hl metastasis suppressor phosphorylation of kinase suppressor of Ras via a histidine protein kinase pathway. J. BioL Chem. 277(35), 32389-32399
47. Hartsough M.T., Steeg P.S. (2000) Nm23/nucleoside diphosphate kinase in human cancers. J. Bioenerg. Biomembr. 32(3), 301-308
48. Hay N., Bishop J.M., Levens D. (1987) Regulatory elements that modulate expression of human c-myc. Genes Develop. 1,659-671.
49. Heck M., Hofmann K.P. (2001) Maximal rate and nucleotide dependence of rhodopsin-catalyzed transducin activation initial rate analysis based on a double displacement mechanism. J. BioL Chem. 276,10000-10009.
50. Helmreich E.J., Hofmann K.P. (1996) Structure and function of proteins in G-protein-coupled signal transfer. Biochim.Biophys.Acta, 1286(3), 285-322.
51. IIeo Y. J., Kim S. Y., Kim E., Lee K.-J. (1997) Quantemary structural analysis of nucleoside diphosphate kinases using capillary electrophoresis. J. Chromatography 781, 251-261
52. Huitorel P, Simon C, Pantaloni D. (1984) Nucleoside diphosphate kinase from brain. Purification and effect on microtubule assembly in vitro. Eur J Biochem. Oct 15;144(2):233-4l.
53. Hwang КС, Ok DW, Hong JC, Kim MO, Kim JH. (2003) Cloning, sequencing, and characterization of the murine nm23-M5 gene during mouse spermatogenesis and spermiogenesis. Biochem Biophys Res Commun. Jun 20;306(l):198-207.
54. Jacobs M, Huitorel P. (1979) Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase. Eur J Biochem. Sep;99(3):613-22.
55. Jacobs M, Smith H, Taylor EW. (1974) Tubulin: nucleotide binding and enzymic activity. J Mol BioL Nov 5;89(3):455-68.
56. Janin J., Dumas C., Morera S., Xu Y., Meyer P., Chiadmi M., Chefils J. (2000) Three-Dimentional Structure of Nucleoside Diphospate Kinase. J. Bioenerg. Biomembranes 32(3), 215225.
57. Ji L., Arcinas M., Boxer M.L. (1995) The transcription factor, Nm23H2, binds to and activates the translocated c-myc allele in Burkitt's lymphoma. J. BioL Chem. 270, 13392-13398.
58. Karlsson A., Mesnildrey S., Xu Y., Morera S., Janin J., Veron M. (1996) Nucleoside diphosphate kinase. Investigation of the intersubunit contacts by site-directed mutagenesis and crystallography. J. BioL Chem. 271(33), 19928-19934
59. Kauffman EC, Robinson VL, Stadler WM, Sokoloff MH, Rinker-Schaeffer CW. (2003) Metastasis suppression: the evolving role of metastasis suppressor genes for regulating cancer cell growth at the secondary site. J. UroL 169(3), 1122-1133
60. Kim SY, Chang KH, Doh HJ, Jung JA, Kim E, Sim CJ, Lee KJ. (1997) Rapid purification and characterization of nucleoside diphosphate kinase isoforms using ATP-sepharose affinity column chromatography. Mol Cells. Oct 31;7(5):630-4.
61. Kimura, N. (1993) Role of nucleoside diphosphate kinase in G-protein action, in: GTPases in Biology, Handbook of Experimental Pharmacology, VoL 108/11 (Dickey, B.F., and Birnbaumer, L., eds ) Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, pp. 485-498.
62. Kimura N., Nagata N. (1979) Mechanism of glucagon stimulation of adenylate cyclase in the presence of GDP in rat liver plasma membranes. J. BioL Chem. 254, 3451 3457.
63. Kimura N., Shimada N., Fukuda M., Ishijima Y., Miyazaki II., Ishii A., Takagi Y., Ishikawa N. (2000) Regulation of cellular functions by nucleoside diphosphate kinases in mammals. J. Bioenerg. Biomembr. 32(3), 309-315.
64. Kowluru A. (2002) Identification and characterization of a novel protein histidine kinase in the islet beta cell: evidence for its regulation by mastoparan, an activator of G-proteins and insulin secretion. Biochem. Pharmacol 63(12), 2091-2100.
65. Krishnan KS, Rikhy R, Rao S, Shivalkar M, Mosko M, Narayanan R, Etter P, Estes PS, Ramaswami M. (2001) Nucleoside diphosphate kinase, a source of GTP, is required for dynamin-dependent synaptic vesicle recycling. Neuron 30(1), 197-210.
66. Kuhn H. (1980) Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.
67. Kuhn II. (1980) Light-induced, reversible binding of proteins to bovine photoreceptor membranes. Influence of nucleotides. Neurochemistry, v.2, p. 269-285
68. Kuhn H., Bennett N., Michel-Villaz M., Chabre M. (1981) Interactions between photoexcited rhodopsin and GTP-binding protein: kinetic and stoichiometric analyses from light-scattering changes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, 6873-6877.
69. Lacombe M.L. (1993) Nucleoside diphosphate kinase/Nm23 and metastatic potency. Bull. Cancer 80(8), 717-722
70. Lacombe, M.L., Jakobs K.H. (1992) Nucleoside diphosphate kinases as potential new target for control of development and cancer. Trends Pharmacol Sci., 13,46-48.
71. Lacombe M.L., Milon L., Munier A., Mehus J.G., Lambeth D.O. (2000) The human Nm23/nucleoside diphosphate kinases. J. Bioenerg. Biomembr. 32(3), 247-58
72. Ladner JE, Abdulaev NG, Kakuev DL, Tordova M, Ridge KD, Gilliland GL. (1999) The three-dimensional structures of two iso forms of nucleoside diphosphate kinase from bovine retina. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr Jun;55 ( Pt 6): 1127-35
73. Lamb T.D. (1994) Stochastic simulation of activation in the G-protein cascade of phototransduction. Biophys. J. 67, 1439-1454.
74. Lamb T.D. (1996) Gain and kinetics of activation in the G-protein cascade of phototransduction. Proc. Natl. Acad. ScL USA, 93, 566-570.
75. Langlios G., Chen C.-K., Palczewski K., Hurley J.B., Vuong T.M. (1996) Responses of the phototransduction cascade to dim light. Proc. Natl. Acad. Ssi. USA, 93,4677-4682.
76. Lascu I., Deville-Bonne D., Glaser P., Veron M. (1993) Equilibrium dissociation and unfolding of nucleoside diphosphate kinase from Dictyostelium discoideum. Role of proline 100 in the stability of the hexameric enzyme. J. BioL Chem. 268,2026758-202.
77. Lascu I., Giartosio A., Ransac S., Erent M. (2000) Quaternary structure of nucleoside diphosphate kinases. J. of Bioenergetics and Biomembranes 32(3), 227-236
78. Leung S.-M., Hightower L.E. (1997) A 16-kDa protein functions as a new regulatory protein for Hsc70 molecular chaperone and is identified as a member of the Nm23/nucleoside diphosphate kinase family. J. BioL Chem. 272(5), 2607-2614.
79. Levit M.N., Abramczyk B.M., Stock J.B., Postel E.H. (2002) Interactions between Escherichia coli nucleoside-diphosphate kinase and DNA. J. BioL Chem. 277(7):5163-5167.
80. Lieberman J, Fan Z. (2003) Nuclear war: the granzyme A-bomb. Curr Opin Immunol. Oct;15(5):553-9.
81. Lombardi D, Lacombe ML, Paggi MG. (2000) nm23: unraveling its biological function in cell differentiation. J. Cell. Physiol. 182(2), 144-149
82. Lombardi D, Sacchi A, D'Agostino G, Tibursi G. (1995) The association of the Nm23-Ml protein and beta-tubulin correlates with cell differentiation. Exp Cell Res. Apr;217(2):267-71.
83. Lu Q., Park H., Egger L.A., Inouye M. (1996) Nucleoside-diphosphate kinase-mediated signal transduction via histidyl-aspartyl phosphorelay systems in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 271,32886-32893.
84. Maguire J., Santoro Т., Jensen P., Siebenlist U., Yewdell J., Kelly K. (1994) Gem: an induced, immediate early protein belonging to the Ras family. Science 265 (5169), 241-244.
85. Martin К. K, Pilkington G. J. (1998) Nm23: an invasion suppressor gene in CNS tumours? Anticancer Res. 18(2A), 919-926
86. Mesnildrey S., Agou F., Karlsson A., Bonne D.D., Veron M. (1998) Coupling between catalysis and oligomeric structure in nucleoside diphosphate kinase. J. BioL Chem. 273(8), 44364442.
87. Mesnildrey S, Agou F, Veron M. (1997) The in vitro DNA binding properties of NDP kinase are related to its oligomeric state. FEBS Lett 418(1-2), 53-57
88. Michelotti E.F., San ford S., Freije J.M., MacDonald N.J., Steeg PS., Levens D.(1997) Nm23/PuF does not directly stimulate transcription through the CT element in vivo. J. BioL Chem. 272(36), 22526-22530.
89. Milon L., Meyer P., Chiadmi M., Munier A., Johansson M., Karlsson A., Lascu I., Capeau J., Janin J., Lacombe M.L. (2000) The human nm23-H4 gene product is a mitochondrial nucleoside diphosphate kinase. J. BioL Chem. 275(19), 14264-14272.
90. Milon, L., Rousseau-Merck, M., Munier, A., Erent, M4 Lascu, I., Capeau, J., and Lacombe, M. L. (1997) nm23-H4, a new member of the family of human nm23/nucleoside diphosphate kinase genes localised on chromosome 16pl3. Hum. Genet. 99, 550-557
91. Min К, Song HK, Chang С, Kim SY, Lee К J, Suh SW. (2002) Crystal structure of human nucleoside diphosphate kinase A, a metastasis suppressor. Proteins 2002 Feb 15;46(3):340-2
92. Mirkin S.M., Lyamichev V.I., Drushlyak K.N., Dobrynin V.N., Filipov S.A., Frank-Kamenetskii M.D. (1987) Nature 330,495.
93. Morera S, Lacombe ML, Xu Y, LeBras G, Janin J. (1995) X-ray structure of human nucleoside diphosphate kinase В complexed with GDP at 2 A resolution. Structure Dec 15;3(12):1307-14i
94. Morera, S., G. LeBras, I. Lascu, M.-L. Lacombe, M. Veron and J. Janin (1994) Refined X-ray structure of Dictyostelium discoideum nucleoside diphosphate kinase at 1.8 A resolutioa J. MolBiol., 243, 873-890.
95. Moyers J.S., Bilan P.J., Reynet C., Kahn C.R. (1996) Overexpression of Rad inhibits glucose uptake in cultured muscle and fat cells. J. Biol. Chem. 271(38):23111-23116
96. Moyers J. S., Bilan P.J., Zhu J., Kahn C.R. (1999) Rad and Rad-related GTPases interact with calmodulin and calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem. 272(18), 1183211839.
97. Munier A, Serres C, Kann ML, Boissan M, Lesaffre C, Capeau J, Fouquet JP, Lacombe ML.(2003) Nm23/NDP kinases in human male germ cells: role in spermiogenesis and sperm motility? Exp Cell Res. Oct 1 ;289(2):295-306.
98. Munoz-Dorado J., Almaula N., Inouye S., Inouye M. (1993) Autophosphorylation of nucleoside diphosphate kinase from Myxococcus xanthus. BacterioL 175(4), 1176-1181
99. Narayanan R, Ramaswami M. (2003) Regulation of dynamin by nucleoside diphosphate kinase. J Bioenerg Biomembr. 35(l):49-55.
100. Nosaka K, Kawahara M, Masuda M, Satomi Y, Nishino H. (1998) Association of nucleoside diphosphate kinase nm23-H2 with human telomeres. Biochem Biophys Res Commun. Feb 13;243(2):342-8.
101. Ogawa K, Takai H, Ogiwara A, Yokota Ё, Shimizu T, Inaba K, Mohri H. (1996) Is outer arm dynein intermediate chain 1 multifunctional? Mol Biol Cell. Dec;7(12):1895-907
102. Ohtsuki K., Ikeuchi Т., Yokoyama M. (1986) Characterization of nucleoside-diphosphate kinase-associated guanine nucleotide-binding proteins from HeLa S3 cells. Biochim. Biophys. Acta 882(3), 322-330
103. Orlov NYa, Kalinin EV, Orlova TG, Freidin AA. (1988) Properties and content of cyclic nucleotide phosphodiesterase in photoreceptor outer segments of ground squirrel retina. Biochim Biophys Acta. Jun 13;954(3):325-35.
104. Orlov N.Ya., Kimura N. (1998) Interaction of nucleoside diphosphate kinase with membranes of bleached bovine retinal rod outer segments. Effects of pH, salts, and guanine nucleotides. Biochemistry (Moscow) 63,171-179
105. Orlov N.Ya., Orlova T.G., Nomura K., Hanai N., Kimura N. (1996) Transducin-mediated, iso forms-specific interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases with bleached bovine retinal rod outer segments membranes. FEBS Lett., 389, 186-190
106. Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K., Burstein E.A., Kimura N. (1999) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p by intrinsic protein fluorescence. J.Biomol. Struct. & Dynamics 16, 955-968
107. Otsuki Y., Tanaka M., Yoshii S., Kawagoe N., Nakaya Sugimura H. (2001) Tumor metastasis suppressor nm23-Hl regulates Racl GTPase by interaction with Tiaml. Proc. NatL Acad. Sci. 98(8), 4385-4390.
108. Otero, A.S. (1990) Transphosphorylation and G protein activation. Biochem. Pharmacol., 39,1399-1404.
109. Otero A. (1997) Copurification of vimentin, energy metabolism enzymes, and a MER5 homo log with nucleoside diphosphate kinase. J. BioL Chem. 272(23), 14690-14694.
110. Otero A.S. (2000) NM23/nucleoside diphosphate kinase and signal transduction. J. Bioenerg. Biomembr. 32(3), 269-275.
111. Otero A.S., Doyle M.B., Hartsough M.T., Steeg P.S. (1999) Wild-type NM23-H1, but not its SI 20 mutants, suppresses desensitization of muscarinic potassium current. Biochim. Biophys. Acta 1449(2), 157-168
112. Padma P., Hozumi A., Ogawa K., Inaba K. (2001) Molecular cloning and characterization of a thioredoxin/nucleoside diphosphate kinase related dynein intermediate chain from the ascidian, Ciona intestinalis. Gene 275(1), 177-183
113. Padmanabham В., Pahler A., Katayanagi К., Miyagawa M., Watanabe К., Kimura N., Matsuzaki T. (1996) 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (December 9-20), http://www.3iwc.riken.go.ip/CONGRESS/SYMPO/SBC0203/AG0107/TIT.bfTM
114. Palacios F, Schweitzer JK, Boshans RL, D'Souza-Schorey C. (2002) ARF6-GTP recruits Nm23-Hl to facilitate dynamin-mediated endocytosis during adherens junctions disassembly. Nat Cell Biol. 4(12):929-36.
115. Pan J.Y., Fieles W.E., White A.M., Egerton M.M., Silberstein D.S. (2000) Ges, A human GTPase of the Rad/Gem/Kir family, promotes endothelial cell sprouting and cytoskeleton reorganization. J. Cell Biol. 149(5), 1107-1116.
116. Parks, R.E., Jr., Agarwal, R.P. (1973) In The Enzymes, Vol. 8, Academic Press, New-York, pp. 307-334
117. Patel-King R.S., Benashski S.E., King S.M. (2002) A bipartite CaZT-reguIated nucleoside-diphosphate kinase system within the Chlamydomonas flagellum. The regulatory subunit p72. J. Biol. Chem. 277(37), 34271-34279.
118. Penningroth SM, Kirschner MW. (1977) Nucleotide binding and phosphorylation in microtubule assembly in vitro. J Mol BioL Oct 5;115(4):643-73.
119. Postel E.H. (1992) Modulation of c-myc transcription by triple helix formation. Ann. N Y Acad. Sci. 660, 57-63.
120. Postel E. H. (1998) NM23-NDP kinase. Intern. J. Biochem. Cell BioL 30,1291-1295.
121. Postel E.H. (1999) Cleavage of DNA by human NM23-H2/nucleoside diphosphate kinase involves formation of a covalent protein-DNA complex. J Biol Chem 274(32), 22821-22829
122. Postel E.H., Abramczyk B.A., Gursky S.K., Xu Y. (2002) Structure-based mutational and functional analysis identify human NM23-H2 as a multifunctional enzyme. Biochemistry 41(20), 6330-6337
123. Postel E.II., Berberich S.J., Flint S.J., Ferrone C.A. (1993) Human c-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate suppressor of tumor metastasis. Science 261(5120), 478-480.
124. Postel E.H., Berberich S.J., Rooney J.W., Kaetzel D.M. (2000) Human NM23/Nucleoside diphosphate kinase regulates gene expression through DNA binding to nuclease-hypersensitive transcriptional elements. J. Bioenerg. Biomembranes 32 (3) 277-284.
125. Postel E.II., Ferrone C.A. (1994) Nucleoside diphosphate kinase enzyme activity of NM23-H2/PuF is not required for its DNA binding and in vitro transcriptional functions. J. Biol. Chem. 269, 8627-8630.
126. Postel E.H., Mango S.E., Flint S.J. (1989) A nuclease-hypersensitive element of the human c-myc promoter interacts with a transcription initiation factor. MoL Cell. Biol. 9(11), 5123-5133.
127. Postel E.H., Weiss V.H., Beneken J., Kirtane A. (1996) Mutational analysis of NM23-H2/NDP kinase identifies the structural domains critical to recognition of a c-myc regulatory element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6892-6897.
128. Prendergast G.C.(1997) Oncogenes Transcript. Reg. 1,1-28.
129. Presecan E., Vonica A., Lascu I. (1989) Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes: purification, molecular mass and subunit structure. FEBS Lett. 250(2), 629-632
130. Pugh E.N., Jr, Lamb T.D. (1993) Amplification and kinetics of the activation steps in phototransduction. Biochim.Biophys.Acta, 1141,111-149.
131. Raveh S, Vinh J, Rossier J, Agou F, Veron M. (2001) Peptidic determinants and structural model of human NDP kinase В (Nm23-H2) bound to single-stranded DNA. Biochemistry 40(20), 5882-5893.
132. Reynet C., Kahn C.R. (1993) Rad: a member of the Ras family overexpressed in muscle of type II diabetic humans. Science 262(5138), 1441-1444
133. Rosengard A.M., Krutzsch II.C., Shearn A., Biggs J.R., Barker E., Margulies I.M., King C.R., Liotta L.A., Steeg P.S. (1989) Reduced Nm23/Awd protein in tumour metastasis and aberrant Drosophila development. Nature 342(6246), 177-180
134. Salerno M., Ouatas Т., Palmieri D., Steeg P.S. (2003) Inhibition of signal transduction by the nm23 metastasis suppressor: possible mechanisms. Clin. Exp. Metastasis 20(1), 3-10.
135. Schneider В., Babolat M., Xu Y.W., Jan in J., Veron M., Deville-Bonne D. (2001) Mechanism of phosphoryl transfer by nucleoside diphoshate kinase. pH dependence and role of the active site Lysl5 and Tyr56 residues. Eur. J. Biochem. 268, 1964-1971.
136. Schneider В., Biondi R., Sarfati R., Agou F., Guerreiro C., Deville-Bonne D., Veron M.2000) The mechanism of phosphorylation of anti-IIIV D4T by nucleoside diphosphate kinase. Mol. Pharmacol. 57(5), 958-953.
137. Schneider В., Norda A., Karlsson A., Veron M., Deville-Bonne D. (2002) Nucleotide affinity for a stable phosphorylated intermediate of nucleoside diphosphate kinase. Protein Sci. 11(7), 1648-1656.
138. Shankar S., Hershberger C.D., Chakrabarty A.M. (1997) The nucleoside diphosphate kinase of Mycobacterium smegmatis: identification of proteins that modulate specificity of nucleoside triphosphate synthesis by the enzyme. MoL Microbiol. 24(3):477-487.
139. Simonsson TM Pecinka P., Kubista M. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 1167-1172.
140. Stahl J.A., Leone A., Rosengard A.M., Porter L., King C.R., Steeg P.S. (1991) Identification of a second human nm23 gene, nm23-112. Cancer Res. 51(1), 445-449
141. Steeg PS, de la Rosa A, Flatow U, MacDonald NJ, Benedict M, Leone A. (1993) Nm23 and breast cancer metastasis. Breast Cancer Res Treat 1993£5(2): 175-87
142. Steeg P.S., Palmieri D., Ouatas Т., Salerno M. (2003) Histidine kinases and histidine phosphorylated proteins in mammalian cell biology, signal transduction and cancer. Cancer Lett. 190(1), 1-12
143. Sturtevant A.H. (1956) A highly specific complementary lethal system in Drosophila melanogaster Genetics 41, 118-123
144. Tatischeff I, Klein R, Duquesne M. (1976) A new fluorescent photoproduct of tryptophan evidenced by long wavelength excitation of fluorescence. Photochem PhotobioL 1976 Nov,24(5):413-6.
145. Tepper AD, Dammann H, Bominaar AA, Veron M. (1994) Investigation of the active site and the conformational stability of nucleoside diphosphate kinase by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. Dec 23£69(51):32175-80.
146. Timmons L., Shearn A. (2000) Role of AWD/nucleoside diphosphate kinase in Drosophila development. J. Bioenerg Biomembr. 32(3), 293-300
147. Uhl R., Wagner R. Rvba N. (19901 Watchina G Droteins at work. Trends Nerosci. i.- -70.
148. Vuong R.M., Chabre M., Stryer L. (1984) Millisecond activation of transducin in the cyclic nucleotide cascade of vision. Nature 311,659-661.
149. Wagner P.D., Steeg P.S., Vu N.D. (1997) Two-component kinase-like activity of nm23 correlates with its motility-suppressing activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,9000-9005
150. Wagner P.D., Vu N.-D. (1995) Phosphorylation of ATP-citrate lyase by nucleoside diphosphate kinase. J. BioL Chem. 270,21758-21764
151. Wagner P.D., Vu N.-D. (2000) Histidine to aspartate phosphotransferase activity of nm23 proteins: phosphorylation of aldolase С on Asp-319. Biochem. J. 346,623-630.
152. Webb PA, Perisic O, Mendola CE, Backer JM, WiUiams RL. (1995) The crystal structure of a human nucleoside diphosphate kinase, NM23-H2. J Mol Biol Aug 25^251 (4):574-87
153. Wieland Т., Jakobs K.H. (1989) Receptor-regulated formation of GTPyS with subsequent persistent Gs-protein activation in membrane of human platalets. FEBS Lett. 245,189-193.
154. Wieland Т., Ulibarri I., Cierschik P., Hall A., Aktories K., Jakobs K.H. (1990) Interaction of recombinant rho A GTP-binding proteins with photoexcited rhodopsin. FEBS Lett. 274(1-2), 111-114
155. Xu, J., Liu, L.Z., Deng, X.F., Timmons, L., Hersperger, E., Steeg, P.S., Veron, M., Shearn, A. (1996). The Enzymatic Activity of Drosophila AWD/NDP Kinase Is Necessary but Not Sufficient for Its Biological Function Develop. BioL 177, 544-557
156. Yaguchi H., Ohkura N., Tsukada Т., Yamaguchi K. (2002) Menin, the Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 Gene Product, Exhibits GTP-hydrolyzing Activity in the Presence of the Tumor Metastasis Suppressor nm23 . J. Biol. Chem., 277 (41), 38197-38204.
157. Yano M. (2000) Intrinsic nucleoside diphosphate kinase-type activity is a novel function of the molecular chaperone and protease. Seikagaku 72(1), 41-45
158. Yokoyama M., Uesaka H., Ohtsuki K. (1986) Complete recovery of the phosphoenzyme-forming activity of nucleoside-diphosphate kinases after reconstitution of their subunits. FEBS Lett. 206(2), 287-291
159. Zhu J., Bilan P.J., Moyers J.S., Antonetti D.A., Kahn C.R. (1996) Rad, a novel Ras-related GTPase, interacts with skeletal muscle beta-tropomyosin. J. BioL Chem. 271(2),768-73.
-
Орлов, Денис Николаевич
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2004
-
ВАК 03.00.02
- Нуклеозиддифосфаткиназа
- СОЗДАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
- Направленная реконструкция ДНК. Исследование структурно-функциональной организации альфа2-интерферона человека и уридинфосфорилазы из Escherichia coli
- Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины
- Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином
