Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Сравнительная эффективность методов культуры тканей (IN VITRO) и индуцированного мутагенеза (IN VIVO) для расширения генетической изменчивости риса

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная эффективность методов культуры тканей (IN VITRO) и индуцированного мутагенеза (IN VIVO) для расширения генетической изменчивости риса"

р рс^осс^кий НАУЧЮ-ИССЛЕДОВА'ШЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ PÜCA

1 7 ОКТ J394 На правах рукописи

ДАВ'ДДЕНКО Елена Анатольевна

Уда: 631.527.8:633.18

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ ( Iff vitro ) И ИВДУЩРОВАННОГО ШАГЕНЕЗА ( IB viro) РАСШИРЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РИСА'

Специальность 06.01.05 - Селекция и семеноводство нолевых, включая кормовые, плодовые и овощные культуры

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар, 1994

дигсвртационная pu ста выполнена во Всероссийском научно-следовательском институте риса в 1991... 1994 годах.

Научный руководитель- член- корреспондент Академии технологических наук России АЛШШ U.E.

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук

ЬЕЛЕНСКИИ Г.Л., - кандидат биологических наук ТУМА1МН Н.Г.

Ведущее предприятие - Научно- технический Центр по рису / НТЦ"Рис"/ МСХ РФ.

з ащита диссертации состоится 1994 г..

в i(/_ часов на заседании специализированнопусовета К.020.66.01 при Всероссийском научно- исследовательском институте риса по адресу: 353204, г. Краснодар, пос. Белозёрный, Всероссийский НИИ риса.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно- исследовательского института риса.

Автореферат разослан ffi* 94 года.

Учёный секретарь специализиро-v

ванного совета, к.б.н. ^¿¿У1-3".М.С0Р0ЧИНСКАЯ

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Успешное решение современных селекционных программ во многой зависит от методов выведения и возделывания сельскохозяйственных растений.

Одним и,з классических научных методов селекции является Экспериментальный, ицдуцированныР мутагенез (Надсон, Филиппов, 1925).

У риса больше сортов, чем у других культур, создано с использованием мутационной селекции. Применение мутантов в качестве сортов начато около 30 лет назад и в настоящее время их число достигает I9B( Eut«er Heil> , 19^2). В последнее . время вопрос о необходимости использовать мутационную селекцию заменился вопросом, каким образом получить "наибольшее количество мутаций селекционно-важных признаков.

С разработкой метода культуры растительных тканей, культуры меристем ( Sautheret, White , 1932; Бутенко, 1970), получением сомаклональных вариантов исходных форм (Шамина, Загорска и др., 1971), открылись новые перспективы метода мутагенеза, появилась возможность использовать спонтанную и индуцированную вариабельность культивируемых in vitro рас_ тительных генотипов (диплоидных соматических тканей).

. Использование сомаклональных вариантов в селекции риса дает возможность сочетания нескольких измененных качественных и количественных признаков в одном генотипе, чего трудно добиться ■ обычным селекционным путем ( iexkiai et al t 1964).

Преимущества метода мутагенеза 1» обусловлены возможностью получения большего количества мутанткых растений из одного экспланта (зерновки), получения двух мутантпых поколений в.год, возможностью оценки некоторых технологических пока-

эателей на стадии проростков, сокращает время создания мутачт-ннх линий, значительно уменьшает объем изучаемого материала.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является.. получение мутантных линий из шести сортов риса/ladica/ методами химического цутагенеза 1» и ln vitro ? оценка их эффективности для расширения генетической изменчивости риса, получения исходного материала.

В связи с этим решались следующие задачи:

- установить оптимальные регенерационные дозы химического мутагена НММ для масоового получения регенерантов из соматических диплоидных тканей четырех сортов риса;

- изучить влияние исследуемых доз >1КН*ГЮз в составе культу-яя>кых питательных сред (регенерационных, субкультивационных)

та выход регенератов;

- изучить влияние химического мутагена .НШ на частоту и спектр изменчивости растений-в Ug по важнейшим морфобиологичес-ким признакам;.

- изучить норму реакции десяти количественных признаков мутантных линий (из сортов риса подвида indie» ** ) по результатам анализа их изменчивости (коэффициенту вариации);

- оценить эффективность использования исследуемых методов селекции для получения мутантных линий как основы .создания сортов с селекционно-ценными признаками.

Научная новизна. Впервые проведено изучение эффективности двух методических'подходов метода мутагенеза: химичесвого мутагенеза iriTO (на оеменах) и химического мутагенеза in Yitro л культуре соматических диплоидных тканей зрелых семян), получе-ш 32, мутантные линии с' комплексом селекционно-ценных признаков (методом мутагенеза in vitro ) и 104 мутантные линии (методом

мутагенеза ia vivo ).

Установлено, что для получения карликовых растений (доно-рор интенсивности) преимуцсственее использовать мутагенез in vitro (для ШМ), а не 1п vive; установлена сильная положительная корреляция между признаками,"частота каллусообразовалия" и "реге-нерационная способность каллуса", "количество белка" и "количество фотосинтетическ».х пигментов.

Установлено, что Ееличины отношения хлорофилла а.к хлорофиллу Ь и суммарное содержание фотосинтетических пигментов моЕЗТ слукить показателем, определяющим содержание белка в растении.

Проведено сравнительное изучение спектра и диапазона изменчивости (по коэффициенту вариации) мутантных и сомаклональ-ных линий.

Показано, что мутантные линии, полученные методом химичес-

V

кого мутагенеза in vitro , отличаются более широким спектром и диапазоном изменчивости, чем мутантные линии, полученные методом химического мутагенеза in vivo .

Практическая ценность работы. Методом химического мутагенеза in vitro получено 32 мутантные линии (229 растений из 2547 экс-плантов). Из них рекомендуется использовать в селекционных программах как доноры высокобелковости, раннеспелости: 3 лиши из сорта Краснодарский '424 , 3 лиши из сорта Дубовский 129; в селекции на комплекс признаков (короткостебельность.высокобелко-вость, длиннозерность, раннеспелость) 2 мутантные линии из сорта Славянец, в селекции на короткостебельность - 3 линии, 3 тании - "на высокобелковость (из сорта Лиман).

Кроме этого,выделены:

т карликовые и полукарликовые линии (38-70 см) из всех 4 исследуемых сортов;

- Мутантные лиши с измененной формой зерна (1/,<J -2,4-3,1)

- продолговатозерная, длинная формы зерновки;

- мутанткые линии с высоким содержаниемчбелка: от 11,7 % до 14,Ь8

- мутантная лигаш с весом 1000 зерен Ь8,1 г;

- мутантные линии с измененным вегетационным периодом: от 85 до 103 дней (раннеспелые). i

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международных конференциях молодых ученых рисоводов (г. Краснодар, I9S3), на конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Казахский НИИЗ им. В.Р.Вильямса, 1993), I статья отправлена на депонирование в вишеЬ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, экспериментальной части в 3-х главах, выводов, списка литературы из 142 наименований, из них 45 иностранных.

Работа изложена на НО страницах, содержит 18 таблиц, иллюстрирована 5 рисунками.

Материал и методы исследования. Материал, ¿эксперимент был осуществлен на чистосортном материале сортов риса Oryza 1. (подвида indica ): Краснодарский 424, Дубовский 129. Славянец, Лиман, Ломелло , ВНИИР 2471.

Методы исследований: ^Химический мутагенез (сулермутаген-1Но 300 штук (контроль - 100 штук) воздушно-сухих семян сортов ВНИИР 2471, Славянец, Лиман, Яомелло замачивали в кристаллизаторах в растворе НММ (раствор мутагена готомися непосредственно перед обработкой в дистиллированной воде, при экспозиции 24 часа, исследуемые концентрации - 0,0Ь; 0,1; 0,2%. После обработки мутагеном семена тщательно (в течении 30 минут) промывали проточной ррдоР y. р тот же день высевали.

Культивирование соматических длг.лсидних тканей in vi tro

6 I

Культивирование проводилось согласно "Технологии массо-

во* регенерации риса" (Кучеренко, 1990).

оксплакт - сухие ошелушенные семена, для культивирования использовали индукционную среду МС ( Мигев1^е апй Эквов ,1964) с 4 мг 2,4 Д + 20 мг/л сахарозы; субкультивационная среда - *С + 2 мг/л 2,4Д; регенерационная: Ь£ + 5 мг/л БАП; промежуточная -..¡0 (Сезгормональная) + АНУ (йидкая) (рИ - Ь,6-Ь,8). Индукция и с;-£культивация каллусов проводится в темноте, при комнатной температуре. Регенерация растений осуществляется на свету (достаточно? освещение - 2 тыс. лк.), при температуре 2Ь-30°С (до 32°С). ¿-с гекеранты в фазе 2-3 листьев (с, корнями) пересиливают на жид-куо питательную среду Иошида (р^ -Ь,0-Ь,4), а через Ь-7 дно" по— медагот в сосуды с землей в условиях КИК (12 ч - день; освещенность -Ют лк; 12 часов - ночь; мри температуре 28°С).

Химический мутагенез . Соматические каллусы 11 пае-

а:::а из сортов Краснодарский 424, Дубовский 12у, Славянец,* 1иман обрабатывали раствором мутагена НИМ 0,0Ь%; 0,3%; 0,<%>!£)',01% ПАБК) в течении 40» на качалке СегЬошгЛ и (100 об/мин), затем растворы фильтровали и обработанный каллус культивировали на регенерационной и промежуточной средах до Р0 .

Определение хлорофиллсодержащих пигментов (хлорофилла а , ь и каротиноидов) проводилось по методике Годнева, 1^63; белка -по Илешкову, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЦШ Изучение влияния на частоту и спектр изменчивости реге-нерантов обработки каллусов различными дозами НММ,и нв^нОз

Анализ эксперимента показывает, что оптимальной дозой мутагена для получения наибольшего количества взрослых растений 1ис-•лгчг;я коктрель) у сортов Краснодарский 4с4, Дубовский 12У, <.ииан, даяяЛся кенг.ентрация НИИ, равная 0 1ЛЬп, а для сорта

Славянец эта величина равна 0,01% НШ+0,01% ПАЬК (табл. I).

Остановлен "эволюционный ряд трудности" сортов риса по способности образовывать регенерационный каллус и формировать нормально развитые зеленые проростки без морфогенетических аномалиР: Краснодарский 424 ( 29 пр/10 кал) - Z%, Дубовсккй 129 ( 26 пр/Ю кал)-26%, Ъиман (20 пр/Ю кал) - 20%, Славянец (13 пр/Ю кал)- 13 Частоты каллусообразования: Краснодарский 424 - 76,3%, ^убовскиР-69,2%, Лиман - 66,6%, Славянец - Ь8,7%.

Корреляционный анализ силы связи между частотами каляусооб-разования и регенерационной способностью каллуса~ у различных сортов риса (подвида indica ) показал сильную положительную корреляцию этих признаков г =0,96За; Ъух ■ (коэффициент регрессии) - 0,9746*0,19053. ■

Проведено изучение влияния аммиачного азота (макроэлемента питательной среды - на увеличение регенерационной спо-

собности соматического каллуса изучаемых сортов (табл'. 2). ■

Как показали результаты опыта, модификация субкультивационной, регенерационной сред МС по содержанию'аммиачного-азота существенно не повлияла на регенерационную способность соматического каллуса исследуемых сортов. По-видимому, ири регенерации, in Titго соматического каллуса солевой состав питательной' среды не играет особой роли в отличие от гаплоидного каллуса, для успешной регенерации из которого, эффективно понижение в среде содержания аммиачного азота (среда Кб)" ( Cuch. Ch;Wang C.Ch ,1975). -

Косвенным показателем изменчивости является коэффициент вариации (V - стандартное. отклонение, выраженное в х к средней арифметической данной совокупности:, V* | Наг/и он выбран

в качестве маркера- изменчивости мутантных линий риса, полученных методом химического мутагенеза in vitro (табл. 3). .

Установлено, что наиболее вариабельной концентрацией для трех сортов - Краснодарский, Зубовский, ^икан является концентрация

Таблица!

Регенерация растений из каллусов, обработанных НЮй-пЛБК и без обработки мутагеном •

Донорный сорт

Вари ¡Обработка :По;: учено пророст-.'Получено

ант

.каллусов :НГ# +

ков,шт

всего :на 10 кал

30 , 28,5

27(Ь7) 28,5

6 13*0

ьш>

2 13,3

1(4)

11 13,1

10(21)

3 10,0

4(7)

3 8,5

3(6)

:взроаяых :растений, : шт

Краснодарский 424 Контроль

Славянец

р > р0,05Г

I

и

0,05+0,01 0,1+0,01

Контроль '

I 0,1+0,01

II

0,02+0,01

II 10(21) 3

2(5) 2

КЗ)

6 ■

2(П)

2(4)

3

2(5)

Таблица 2

Влияние различных доз НН*Н0$ на регенерационную способность каллусов различных сортов риса

Донорный сорт

Содержание доз :Получено пророст-:Получено : , ков :взрослых

-----»-растений

кол-во : г/л : всего :на10 кап :

Краснодарский 424

Славянец

V

Шо 2 4

¥ %

2

4 •

.1,650 0,825 0)212 0,165 3,300 6,600

1,650 0,825 0,212 0,165 3^300 6,600

7 10

11

12 .6

1

2 II 18 2 22

5,7 • . 7 6 7,3 1,1 3 8 , 0*7

2Д9

450 20 0 22^0

1

2 2 2

I 10 10

22

» > Р 0,0Ъ

Таблица-о

Коэффициенты вариации ( Т ) гс.гичестЕенных признаков мутантнкх г.инк!* четырех сортов риса, полученных при обработке соматического каллуса

Сорт, вариант опыта

растения-

Количественше признаки

длина ¡длина :% пусто-:масса:1:асса:длцна :пь]:ига:толцш-а главной¿флагово-: зернос-:эерна:1000 :зер- :зернов:зерков-метелки:гс. листа: ти ':с рас.'зеренисвки, :ки, : ки .

: :тения: : 1 а : т

1/&

Краснодарский, контроль

I Б

2В

Дубовский, контроль

1 В

2 В

3 В

25,78 11,16 41,32 -143,65

9,36 6,01 15,70 60,Ь

24.16 22,47 68,47 107,1Ь

7,06 8,37 14,86 98,П

2,08 15,97 10,64 ^¿,96

14.17 7,23 17,84 2,10 13,74 12,79 19,66 126,44

28,0 1ч,0 2,37 1,79 9,19 2,65

33,-5 20,90 - 21,7 1,38 39,7 16,70

77,38 Ь0,27 4,2Ъ 30,00 1С,со £7,20

60,25 55,97 131,56 13,93 7,36 15,39

27,73 35,и4 13,С8 5,25 11,02 80,64

60,61 3,65 6,15 1,94 Ю, £5 23,57

44,4 1,16 0,43 6,15 0,00 16,44

оо

Таблща 4

Морфологические и технологические показатели мутантнкх линий, полученных при

обработке соматического каллуса НММ

№ : Происхождение :Вегет. :Высо-:Длина:,Цлина:^пус-:1Ласса:1>1асса:Содер-:мЛИР а ли-: • период,:та :главн:флаго:тозер:зерна:1000 :жание

нии: :дкей :[>ас- :ыбтел:вого :носту,:с рас:зерен:белка,:fkh,

: ^ений^ки^мглиста; х :тения:г, х : : 1 ,

: :см,х : х :см,х : :г, х : : : с;/

' Л :и)яна, :ж,х : в ,

1/d

702 с.Краснодарский 424, 119

контроль 533 I В-0.05 % НММ 230

138 2В -0Л % НММ

112 Дубовский 129,

контроль 126 0,05 НММ 86 -"- Oll % НММ

76,9 16,6 22,0 12,3 2,1 2l,j

L,7k 0,39., ¿I 1Л

204 Славянец, контроль 87 0,01 % НММ 51 о;о2 % НММ

109 Лиман, контроль 247 0,05 % НММ 58 -"-> -"ПО

67 - 0,1 ЬШ V'l — И —

107 107 125

119 96

96

112

97 101

107

Sb IOC

Sb 9fc

Dt;

78,9 16,7 90 7 15 4 96,3 20,1

91,6 92,9

I03,2

74,9 57 3 54,6

69,4

55 7 Ь8,е 51,ö

52,9

21,0 19,9 18,5

17.3 10 Ь 11,0

12,0

11.4 11,2 j.0,2 18,7 12,9

14,1 17 2 22,8

25.1

22.2 24,1

16,5 15,5 13,1

15,4 15,1 16,1

15 7 2ü,li Ib,4

42.8 12*9 b,é

11,8 27,7 26,5

4Д9 20,3 37 ;e

10,2 49,1

46.9

j/.. --

2,6

1 93 4,1

3,9 6,0 1,7,

5,6

2 16 1,5

5,14 2 1 2 fc

г E

27.1

29.7

32 ,3

37,9

40.8 29)b

23,7 27 3 35,7

26.2 23,3 23 I 27 7

¿2,1

Ml

Ii л 10,2 II',7

ь,з 9 6 8 6

8,4

L 2

- ,73 С ,84 0,83

С, LI

Ob

0¡72

r t л v. , 1

0,77

c;?6

,7o L',9fc

С ,21 0,22

2 7 74

0,4 0,23 I.Ö

0,38 0,23 2,2

0,37 0¡22 2|¿

0,29 0,19 I,b

0 39 С 21 2 1

0,36 С,21 2, О

«oG kj ««ii X »fc

0,41 0,21 19

0,4 0,22 Г.9

U,3c 0,22 2,1

Э.-Й С',21 2,45

/- > fyO?

0,Obí НММ+0,01% ПАШ вызывающая значительную ( »~20 %) изменчивость большинства- изученных количественных признаков, для сорта Славянец -■ 0,02% ШМ-+0,01$ ПАЕК.

Изучая влияние наиболее вариабельных концентраций на выход карликовых растений,(доноров интенсивности), мы установили, что .

концентрации 0,05$ ШМ+0,01^ ПАЕК (для сортов Краснодарский 424,

i

Дубовский 129, Лиман) и 0,02% НЫМ+0,0И1АЕК - для сорта Славянец, обеспечивают максимальный выход карликовых растений у всех изучаемых сортов.

У сорта Краснодарский 424 количество карликов в I варианте составило (от всех измененных растений) - 48-53 см против 76,9 см в контроле); у сорта Дубовский - 4,1% (35-53 см против ' 91,6 см в контроле), у сорта Лиман - 6 % (38-48. см про'тив 69,4 сы в контроле. Суперкарликов (20-26 см) при обработке каллусов изученными концентрациями НММ не выявлено.

ТаКим образом, из 32-х изученных мутантных линий можно предложить в селекционное производство следующие мутантные линии: . (табл.' 4).

Изучение влияния различных доз НИМ на частоту и спектр изменчивости мутантных линий риса Чхимический мутагенез ln vivo ). Работами ученых ВИР (Будин, Зарубайло,1969) доказано, что сорта одного ввда, как ло чувствительности к мутагенам, так и по цута-. бильности могут отличаться друг от друга больше,.чем разные виды.

Известно (Енкен, 1966, 1967), что сорта и другие близкие ге-нотипические эколого-географкческие таксоны имеют сходство в ■частоте и наоборот, чем меньше они родственны, тем больше различаются по характеру .мутационной изменчивости.

• Морфологические и технологические характеристики мутантных линий'риса (подвида Indica ),полученных методом химического мутагенеза С in т!тсрбработка семян) из сортов представлены в

14

t

q сторону увеличения значения селекционного признака, так и в сторону его'уменьшения.

; Сравнительная эффективность химического мутагенеза_In vivo

и la vitro__для расши£§™^гежздч2ск0я_изменцм0сти_£иса.

Оценка сравнительной эффективности двух методических способов химического мутагенеза основана на оценке малых мутаций растений 6 сортов риса в Критерием оценки количественной изменчивости нами выбраны следующие статистические характеристики: коэффициент вариации признака (7 Д), диапазон изменчивости признака, частота, изменчивости (в % к числу изученных семей растений). .

Частота изменчивости мутантных линий у сорта Славянец в опыте с цутагеном In vitro составляет 71,4% (100% изменчивость, линий по 10 признакам из 14) против 61,9% (100%-ная изменчивость по 13 признакам) in vivo t Но диапазон изменчивости был шире в опыте с химическим мутагенезом In vitro по признакам "высота растения", "длина главной метелки", "длина флагового лист^", "масса зерна с растения".""масса 1000 зерен".

Частота изменчивости мутантных линий у сорта Лиман в опыте с химическим мутагенезом in vlvo составляет 38,1%, в опыте с химическим мутагенезом Iй vitro -52,9%, но диапазон изменчивости шире по половине, признаков в опыте с In vivo., (высота растения, длина главной метелки, масса 1000 зерен), по другой половине признаков - in vitro (длина флахового листа.пустозерность, касса зерна с растения). Следовательно, общего вывода на предмет обратной зависимости частоты изменчивости от диапазона сделать не представляется возможным.

, ' 4 Таг.лица б

КггчУ;ицирнты вариации ( "» * > количественных признаков мутантных линий риса, полученных методом химического мутагенеза 1п ▼!▼<>

Сорт, вариант признака

:Высота:Длита :Длина :% пус-:Масса :Масса:Длина ¡Ширина ¡Толщина: :расте-:главной:флагово:тозер-:зерна :1000 :зернов:зернов-:зернов-" ний :метелки:го лис-:ности :с рас-:зерен:ки •! :кц ¿1 :ки ,ж

1/4

:та • .: тения • : • •

ВНИИР 2171, контроль 3,06 3,32 18,48 37,87 6,55 30,39 3,7 8,5 15,1 * 0

0,05 г НММ+0,01% 11АБК и Б' 2,98 2,88 12,65 34,18 28,74 14,08 7,9 20,6 14,3 25,7

0.12- НШ+0,01, % ПАБК . 3,30 4,31 16,17 40,06 '13,23 10,03 9,6 0 14,3 14,4

0,2 $Ш+0,01 % ПАБК (4 В) 14,33 1,31 8,11 18,57 19,83 8.45 8,1 0 0 0

Славянец, контроль 5,25 9,55 15,42 38,01 35,47 7,24 1,29 3,31 3,18 3,49

♦ю.оь? нмм '(I В) 13,03 9,11 15,36 27,42 30,15 20,80 - - — -

0.1 % нмм (Л в) 9,20 28,73 10,09 46,52 52,07 30,05 4,3 7,1 13,7 5,3

0,2 % НММ (1д В) 13,26 9,49 10^03 42,77 20,66 5,64 2,9 ' 2,4 4,2 0

и

Таблица 5

Мор$об:'ологические и технологические показатели мутантных линий риса, полученных

мртсдок химического уутагеиега 111 vivo

; ¡г с:'с::стлсн:1£ :Бргет.: Б1- :Длина ¡Длина ¡Пусто- ¡.'Ласса ¡Масса :Содер- ¡Длина ¡Шири- :Тол-: ¡пери- :та . :метел:флаго:зер- :зерна:1000 :жание :зерщэ:на, d :щина: ¡од", :ki>,cm:pciv ¡г.сстъ, т<ас;ререн:белка, -.вки,1 :см ;см :

¡дне.-? :тешл: ¡листа: f ;текия: г : % : см : : : : , : ci" : см : : г : : : : : :

I BHIIilP, контроль 8 ¡ба и 12 -1,2? e-j ot Ж/ VL 95,9 Ь6,4 loo; 7 19,5 Id,6 Ifc.3 lb, 9 34.5 28.6 26,9 26,6 17,6 lb I 23,2 2017 2,1 6 4 7,3 9,2 25,0 30.5 31.6 30.7 8.48 10.34 8,6b 8|59 0,85 0,68 0,85 1,00 0,37 0 38 0,38 0,37 0,21 o;2i 0,21 0,21 2,3 2,3 2 3 2|7

26 Славянец. контроль 34 - 0,i % НММ 52 - 0,05 % 90* 90 90 74,9 63,4 62,9 26,2 II 7 I3|0 18,0 16,1 17,8 10,6 17 7 20|b i^.b 2b, 3 Ь8,1 26,4 7,63 0,75 0,73 0,4 0,39 0,21 0,23 1,9 £ 1,9

53 Хомилло, контроль 58 - 0)1 % нам 76 - 0,05 % 90 90 85 61,8 66 2 54,3 11,2 14 3 13,2 15,6' 19 3 16,9 II 7 16,2 2,5 61 4,2 29,1 32,3 31,6 8,15 9,18 0,79 0,81 0,39 0,38 0,23 0,23 2,0 2,1

78 Лиман, контроль ' 79 - ОД % 101 - 0*05 % 108 ПО ПО 103 103 83,9 17,2 97.2 16,8 I0&.2 17,0 98,6 16,2 25,2 22,6 30 9 26,7 10,5 27 0 25 !3 e.i 4,9 3,9 4 2 3,5 4i ;э 41 9 47,7 43,2 7,6 8 13 8 89 0,98 1,02 0 99 0,44 0 44 0 41 0,25 0 27 0 25 2,2 2 3 2 4

р7 Eo(ot>'

№ : л:*-: кии:

табл. 5, а коэффициенты вариации ( ▼ , /'■) количественных признаков мутантных линий риса представлены в табл. 6.

.Анализируя изменчивость мутантных линий в сравнении с контрольными, необходимо отметить,^ что универсальной вариабельной концентрации 1фгтагета для всех изучаемых сортов не выявлено, что вероятно, связано со степенью отдаленности происхождения генотипов. Для сорта ВНИИР 2471 наиболее вариабельными были концентрации НММ 0,05 % и 0,1 5?, которые индуцировали среднюю, значительную и незначительную изменчивость мутантных линий; для сорта Славянец наиболее вариабельной концентрацией оказалась 0,1 % НММ - наибольшая изменчивость у 8 количественных признаков из 10-ти исследуемых: для сорта Домелло - 0,02%, для Диман - в равной степени 0,05% и 0,2. $ НММ (по 4 признакам).

Мутационный процесс изученных сортов идет не только в стороцу улучшения полезных селекционно-ценных признаков, таких, как стерильность растений, пустозерность, остистость, хотя такие мутанты, обладая свойством генетической нестабильности используются как источники рекомбинативной изменчивости мутантно-сортовых . гибридов (Володин и др., 1990).

Наш исследованы корреляционные связи между количественными признаками "содержание белка" и "масса 1000 зерен", полученных мутантных линий. Положительная корреляция установлена для сорта ВНИИР 2471 (0,48+0,621), положительная корреляция для сорта Славянец (0,98*43,200), причем положительная слабая корреляция (0,34+0,666) отмечена у мутантшх линий этого сорта, выведенных химическим мутагенезом 1п у!*« . Ьтот факт, вероятно, объясни- . ется «генотипически родством полученных линий.

Изучая влияние НММ на частоту и спектр изменчивости сортов' ВНИИР 2471, Славянец, Домелло, Лиман, нами получены 104 мутант-ные дкнии, имеющие широки? спектр отличий от исходных сортов как

определения продуктивности рас-тений риса. Нами замечено, что отношение хлорофиллов "а/в" и содержание белка в зерне изученных мутантных линий - коррелирующие признаки (табл.7.8).

Корреляционный анализ силы связи между признаками показал различные виды зависимости, оцениваемые как слабые, средние, сильные (табл.9).

Физиолого-биохимической основой высказанных предположений может служить тот факт, что растения с высоким уровнем фотосинтетических пигментов характеризуются низким содержанием гибберел-ловой кислоты, т.к. ГК ингибирует различные, флавиновые оксидазы, • в т.ч. участвующие в синтезе хлорофиллов. Кроме того, избыток фитогормонов вызывает стерильность риса, сходную с молекулярно-биологической: природой стерильных форм риса с цмс, вызывающей деградацию нуклеопротеидов, обеспечивающих формирование фертиль-ной генеративной ткани ( А1уовЫп е± а1 ,1994).

Следовательно, мутантные линии с высоким уровнем 50, характеризуются низким уровнем ГК, что обеспечивает высокий уровень белковости растений в отсутствии основного ингибитора образования биологически активных белков.

Следовательно, подтверждается вывод ряда авторов (Карабаев, Сидоренко и др., 1990), что сомаклональная вариабельность сопровождается изменениями функциональной активности фотосинтеза и его первичных реакций. "

/

Таблица 7

Величины содержания Щ линий риса, полученных методой химического мутагенеза 10 .соотношения пиг-

ментов и содержания белка

№ пп

происхождение линии : st Ck xj

• n n n

I С.ВНИИР,контроль 8 -"- 0,1%НШ),01% ПАБК

12 -"- 0,2%НМЫ

13 -"18 -"- 0,05%НМЫ

26 Славянец,контроль 36 0,1%НММ+0;01% ПАШ

44 -"- 0,2%НМИ -"-

f TP/bos'

:Хло|)офЛп :Содер-: : %

2,235 1)470 0,791 0)420 1,113 1,010 2,287 3)500 8.»3 id, 34

1,565 1 238 2,242 2 174 2,089 1,275 0,874 0,789 0,930 1,103 1,298 I 193 1,407 I 426 1,064 1,227 1)416 2,842 2)338 1,894 8,59 8 37 7,6 7 6 7,4

1,726 0,489 1,119 3,529 8,69

Таблица 8

Величины содержания EI, соотношения пигментов, содержания белка мутантных линий риса, полученных методом химического

мутагенеза in vitro .

» пп

Происхождение линии

<Ъ Xj

я

:Хлороф.:Содер-

съ 53 : с k ij : "а_ _:кание 1 Я

702 Краснодарский 424, контроль 0,05% НШ 2.056 0,744 1,449. 2,800 8,3

230 2,608. 0,872 1,682 3,480 14,58

533 п 1,918 0,68? 0,368 2,605 10,9

138 -"- о.йнмм 2,484 0,784 1,565 3,268 . -10,4

204 Славянец, контроль 1,778 0,582 1,118 2,360 8,3

87 о,одам 2,022 0,604 1,г72 2,627 8,6

51 -"- 0,02% НММ 1,149 0,408 0,779 1,557 ■9,6

р > *

0,05-

Caxj, CbxJ, Ск xj n n n

F >Pof О 5"

-средние значения концентраций хлорофилла а , Ъ , каротинои-дов, мг/л.

Таблица 9

Уравнения и коэффициенты корреляции признаков (содержание ФИ, количество белка) мутантных линий риса

Сорт

: :Вид уравнения. :Критений существенности коэф-: "У* : :фицкента корреляции (tr )

1. ВНШР 2471

2. Славянец

3. Лиман

4. Ломелло

0,42 ±0,524 0,0 у=-1,234+0,4Ibx 0,800-* т 0,876 (корреляци-

онкая связь несущественна)

0,93 +0,930 10,2 у=-7,08+1,22х

O.bb +U.47I 1,2 y=j,V/b+0 ,ЗЬх -0,ЬЗ +0,577 0,1 у=8,96+0,197х

5. Краснодарский 424 0,65 +0,536- 1,2 у=1,ЗЬ+0,062х

6. Дубовский 129 0,79 +0,305 '2,6 у=0,38+0,18х

7. Славянец«

8. Лиман

0,46 +0,886 0,5 у—1,59+0,37х

?ф 1,010>*т 0,950 (корреляционная связь существенна)

1,234>*т 0,878 («орреляци-онная связь существенна

рф-0,93 0,878 корреляцион-

ная связь несущественна)

рф 1,87 > ¥ 0,950 (корреляционная сеязь существенная)

Ц 2,590>?т 0,7Ь4(к°РРе^яци-онная связь суцест&енна)

рф 0,Ы9<вт 0,997 корреляционная связь несущественна)

dyx-

- коэффициент корреляции; sr

0,26 +0,ЬЬ8 0,Ь у=0,2I1J-0,I66 х Рф 0,466<*т 0,878 (корреляци-— онная связь несущественна)

ошибка R ;

коэффициент детерминации.

18

ВЫБОДи

1. Установлены и апробированы регенерационные дозы химического мутагена нитрозометилмочевина (НМК), ярля-тциося оптимальными для максимального получения регенерантов из соматических тканей ркса (подвида ladica ): 0,05 % + 0,01 % liAB для сортов Краснодарский 424, Дубсвский 129, Лиман и 0,01 НММ +• 0,01 % 11АБК для сорта Славянец.

2. Установлено, что изученные дозы нитрата агаюния

(1,650; 0,82Ь; 0,412; 0,165; 3,300; 6,600 г/л), входящего в состав культивационных сред (субкультивационной, регенерационной) достоверно не влияют на увеличение выхода регенерантов.

3. Установлена сильная полокительная корреляция мезду признаками "частота каллусообразования" и "регенерационная способность каллуса".

4. Установлены вариабельный концентрации для поученных сортов, вызывающие значительную ( V«-' 20 %) игьч-нчивость бсль-шинстра изученшх количественных и качественных признаков: С,0Ь % ММ + 0,01 % МБК для сортов Краснодарский, ДубоЕский, Химан; 0,02 % iMvi + 0,01 % 11АБК для .cojn Славянец (в условиях применения метода "химического мутагенеза 111 vitro ) и 0,0b; 0,1 р НММ - для сорта ВНИИР 2471; 0,01 f !Ш - для сэрта Славянец; 0,2 % - для сорта Ломелло; 0,0Ь и 0,2 % НлМ - для, сорта Химак

'в условиях применення метода химического мутагенеза ^ vivo ).

5. Вццелеш морфологические мутации: .nigroapiculata, var.se_ . ravahanica, zebra etp ipe ,4faeite str ipe , рартекия с коричневым стеблем до основания флагового листа внутри мутнт.'-гых г.к-Huf. из сортов RHIitIP 2471, Сларянсц (гетсдёч химхчэского мутагенеза in vivo

ь. Уст&новденц положительные коррелятивные/свяг it между ксл'л— чественндо* признаками "содержание tsjка" и "мгсса I00C зетч;»-

мутантных линий, полученных методом химического мутагенеза для сортов ВНИИР 2471 и Славянец (также методсмхимического мутагенеза In vitro).

7. Установлено, что 0,05 % НММ + 0,01 % 11АБК и 0,1 % НММ + 0,01 % ПАЕК - наиболее аффективные дозы мутагена НММ, обуславливающие получение мутантных линий из сортов риса Краснодарский 424, Дубовский 129, Славянец, Лиман с высоким содержанием фотосинтетических пигментов и количеством белка в зерне.

8. Величины отношения хлорофилла а к хлорофиллу ъ и суммарное содержание хлорофилла а и Ь в растениях может служить показателем, определяпцим содержание белка "в растении, ото. дает возможность рассчитать коэффициент пересчета содержания ФП на количество белка, что позволит сократить производственные затраты на определение белковости линий и сортов.

В результате проведенных исследований получены: 32 мутант-ные линии методом химического мутагенеза в культуре соматических тканей ( 111 vitro) и 104 мутантные линии (методом химического »мутагенеза 111 ). Из'них вццелены:

- карликовые и полукарликовые линии: 48 см - из с. Краснодарский 424, 35 см - из с. Дубовский .129,- 38 см - из с. Лиман,

45 см - из с. Славянец (методом химического мутагенеза in vitro);

- мутантные линии с гродолговато-длинной, длинной формой зерновки: 1/d - 2,4-3,1 (метод химического мутагенеза la vitro );

-.мутанты с повышенным содержанием белка: от II,7 % до 14,58 ? (метод химического мутагенеза In vitro );

• - мутантные. линии с повышенным весом 1000 зерен - Ев,1 г (из е. Славянец, 0,1 % НЫМ), (химический »мутагенез In vivo);

- мутантные линии с измененным вегетационным периодом - раннеспелые: от 85 до 103 суток;

- мутантные линии с ловызенным -суммарным содержанием фотоскн-

тетических пигментов (4,065 -МГ//л).

10. Установлено, что для получения карликовых растений, (доно-. ров интенсивности) из сортов Краснодарский 424, Дубовский 129, Славянец, Лиман, преимущественнее-использовать метод химического; мутагенеза in vitro •

11. Метод химического мутагенеза в культуре соматических растительных тканей (in vitro^HMeeT ряд преимуществ перед методом классичесного мутагенеза ( in vivo^n может служить -существенным инструментом в создании исходного селекционного материала с комплексом селекционно-ценных признаков (повышенная белковость,1 длин-ноэерность, полукарликовость, раннеспелость). -

ФАКТИЧЕСКИЕ ВДЮМЕВДАЦИИ

1. Для получения нового исходного материала (доноров коротко-стебельности, высокобелковости, продуктивности) шире использовать метод химического мутагенеза in vitro (обработка соматического

, каллуса в концентрациях 0,05; 0,1 и 0,2 % НММ + 0,01 % ПАШ).

2. В селекционных программах использовать следующие мутантные линии: в селекции на раннеспелость, высокобелковость - 533, 230, 138, 126, 115, Ь-'З; в селекции на короткостебельность,"высокобел-

^ ковостьj длиннозеркость, раннеспелость - 87, 51, 247, 27, 110,

67, 62, !j4 (получены методом химического мутагенеза in vitro ' ); 27 , 32, 3--1, 37, 39, 40, '42, 4b (Ь8,3 см), .52, 62 (67,7 см), 76 (54,3 см) - в селекции на короткостебельность; 3, 4, 5, 8, 9, 10, 14 - р со,лекции на раннеспелость, 15-25; 61; 66 , 92-108. ,2, 8, II, 12, 14, 17, 20 - в селекции на продуктивность; 21, 24, 25, 27-30, 34 - на 25 % больше контрольной; 36, 37, 38-46, 49, 58, - 63 - ка Ь- г бельке контроля;70, 77, 89, 101, 103. 8, II, 12, 44, 76, 7J, с J, 90, 101 - в селекции на высокобелковость (линии получены методом химического мутагенеза in vivo ).

3. Рекомендуется использовать в генетических исследованиях как фенотипические маркеры следующие мутантные линии: 3 - var. seravshanica ; е, fc, 12, 13 -nigroapiculata ; б- "растение с коричневым стеблем до основания флагового листа"; 17 - »hite etr ip , 6, 27 - «вЪга stripe

Список работ, опубликованных по материала?.': диссертации

1. Дапиденко Е.А., Харченко П.Н. Изучение мутантных лини Г: риса, полученных методами химического мутагенеза и мутагенеза*«1 vitro К. "Рис России"; т. I, Г" I, Краснодар, 1991, с. 9.

2. Давидекко Е.А., Алешин Н.Е. Изучение чугантных линий ряса, полученных методами химического мутагенеза in vivo н in vitro _ конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", 1993 г.

3. Давиденко Е.А., Третьякова О.М. КорреляционшЯ анализ количества фотосинтетических пигментов и содержания болка в гаст':-ниях и мутанткых линияхриса, Рукопись депонирована в ¡МШ'«-!

в 1994 г.

ТИП ЛУБ ГАУ ЗАКАЗ 369 ТИРАЖ 100