Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спектрально-кинетические исследования прямой Pr - Pfr фототрансформации нативного фитохрома овса

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спектрально-кинетические исследования прямой Pr - Pfr фототрансформации нативного фитохрома овса"

Г", ^¡1

ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

УДК 581.1.03:543.42

КРЫЛОВ Андрей Борисошч

СПЕКТРАЛЬНО- КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЯМОЙ Рг-ЧРп~ ФОТОТРАНСФОР!ШЦШ НАТИВНОГО ФНТОХРОМА ОВСА

П1 п<

.00.02- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1995

Работа выполнена в лаборатории фоторегуляции клеточных процессов Института фотобиологии АНВ и лаборатории фотоники молекул Института молекулярной и атомной физики ЛНБ.

Научные руководители: академик АНБ, доктор биологических

наук, профессор ВОЛОТОВСКИЙ И.Д.

Оппонирующая организация: кафедра физико- химической биологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

фотобиологии АНБ по адресу: 220072, г.Минск, ул.Ф.Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ■фотобиологии "АН~Беларуси:

доктор физико- математических наук ДЖАГАРОВ Б.М.

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор, • ФРАДКИН Л.И.

доктор физико-математических наук, лауреат Государственной премии БССР БУШУК Б.А.

Защита состоится

Автореферат разослан

Учёный секретарь Совета по защите диссертаций к.б.н.

Л.Ф. Кабашникова

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ляпуалъноспь кеиы доссерпацци. Фоторецепторный белок фитох-ром встречается во всех высших растениях, а также во мхах, лишайниках и водорослях. С его помощью свет контролирует ряд биохимических и физиологических процессов у высших растений: биосинтез ферментов, Сахаров, нуклеиновых кислот, пигментов, клеточное дыхание и окислительное фосфорилирование, формирование пластид и мембранной структуры хлоропластов, деление и рост клеток, прорастание семян, индукцию зацветания и др.

Фитохром растений поглощает свет в синей (380-405 нм) и красной (>600 нм) областях спектрального диапазона и существует в двух относительно стабильных формах: красной Рг, поглощающей в основном 600-700 нм, и дальнекрасной Pfr (>700 нм). Физиологически активной формой фитохрома считается дальнекрасная форма Pfr. Образование Pfr является стартовым событием в цепи транс-дукции, завершающейся биологическим эффектом. Полного понимания механизмов транедукции до сих пор нет.

Выяснение механизма транедукции фитохромного сигнала невозможно бев детального изучения Pr-Pfr фототрансформации фитохрома, в результате которой образуется Pfr форма. Учитывая многочисленность и разнообразие фитохром- зависимых биохимических и физиологических ответов, высказываются также предположения о том, что фитохромная транедукдоя может запускаться некоторыми из долгоживущих промежуточных продуктов Pr-Pfr фототрансформации.

Изучение промежуточных стадий прямой Pr-*Pfr фототрансформации методами низкотемпературной абсорбционной и кинетической спектроскопии привели к появлению, по крайней мере, двух принципиально различных схем, описывающих, протекание этого процесса у нативного фитохрома. Первая из них, предложенная Эйлфелдом и По-дигером [Eilfeld, Rüdiger, 19853 и получившая развитие в их последующих работах [Eilfeld et al., 1986,.1987, 19893, предполагает протекание процесса через последовательную цепь интермедиа-тов. Вторая схема., предложенная и развиваемая Шаффнером и Брас-лавски с соавт. [Rißsicska et al., 1985; Aramendia et al., 1987; Brock et al., 1987; Schaffner et al., 1990; Scurlock et al., 1993], предполагает существование в цепи фототрансформации нескольких пулов спектральных форм и течение процесса по параллель-

- г -

ным путям между компонентами этих пулов. Однако ни одна из этих схем не получила всеобщего признания. Причина этого, по-видимому, связана с тем, что эти схемы созданы в условиях, когда ещё недостаточно были изучены интермедиаты заключительных этапов фототрансформации, время жизни которых находится в миллисекундном интервале. Более того, существуют также разногласия по количеству и последовательности превращений более ранних спектральных форм.

Связь с крупными научними программами, темами. Различные этапы этой работы выполнялись.в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по темам: "Исследование зависимости регуляторных свойств фитохромной системы от ее физико- химической организации"- 1987-1989 гг., N госрегистрации 01870037714; "Изучение взаимосвязи молекулярной организации и функционирования фитохромной системы в растительной клетке"- 1990-1994 гг., N госрегистрации 01900027723.

Цель и задачи исследования. В связи с вышесказанным представлялось актуальным уточнение количества и спектрально- кинетических характеристик промежуточных продуктов прямой фототрансформации нативного фитохрома овса и построение на основе этих данных схемы фототрансформации. Это и стало целью данной диссертационной работы.

8 диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Исследовать спектрально- кинетические свойства всех ин-термедиатов прямой фототрансформации фитохрома, уделив особое внимание исследованию менее изученных промежуточных продуктов на заключительных этапах;

2. Построить непротиворечивую схему прямой-Рг*Ргг фототрансформации фитохрома;.

3. Осуществить компьютерное моделирование на основе схемы и спектрально- кинетических данных, . полученных в эксперименте с целью проверки предположения об взаимопереходах интермедиатов в ходе прямой фототрансформации;

4. Проанализировать ьозможные взаимосвязи между наблюдаемыми спектральными изменениями и структурными перестройками апоп-ротеина в ходе прямой Рг^Ргг фототрансформации.

Научная новизна получению ревулылагсол. В работе впервые охарактеризованы интермедиаты с милллсёкундным временем жизни

1705. 12700 и i3700- Уточнены спектрально- кинетические характеристики более короткоживущих промежуточных спектральных форм. Построена полная схема прямой Pr-»Pfr фототрансформации фитохрома и рассмотрены взаимопереходы интермедиатов в ходе этого процесса. Предложена возможная взаимосвязь Спектральных изменений и структурных перестроек апобелка в ходе прямой фототрансформации фитохрома.

Ярактческое вначшюсаь получетшя результатов. Полученные результаты представляют интерес для специалистов, работающих в области биофизики и биохимии фотобиологических процессов и физиологии растений, поскольку дают исчерпывающую информацию о процессе Pr-Pfr фототрансформаиии фитохрома и могут оказаться полезными в установлении молекулярных механизмов реализации транс-дукции фитохромных сигналов от Pfr формы хромопротеина, проявляющихся в форме разнообразных биохимических и физиологических ответов растения. Кроме того, полученные данные могут быть использованы в курсах лекций по фотобиологии для студентов-биологов и биофизиков. Ряд результатов, полученных при выполнении диссертационной работы, вошел в монографии и обзорные статьи, посвященные фитохромной тематике.

Основные положения доссергаациа, виносиние на защиту.

1. Прямая Pr*Pfr фототрансформация протекает через три промежуточные стадии, каждой из которых соответствует пул спектральных форм, которые имеют близкие спектральные свойства и могут переходить друг в друга, а именно l^oo, 1ы» Iit-

2. Пул первичных фотопродуктов 117оо содержит 2 компонента Пбэ? и 1*700). существующих независимо друг от друга в микросекундном временном диапазоне. Наблюдаемые спектральные изменения после распада 1*700 объясняются образованием одного интермедиата 1ьъ Этот интермедиат трансформируется в продукт I705.. входящий в пул .111- В этом пуле идентифицированы и охарактеризованы 3 интермедиата: 1705.12700 и 13700, имеющие время жизни в миллисе-кундном временном интервале.

3. С позиции существования пулов в приведенном выше смысле построенная на основе полученных результатов и комтьютерного моделирования схема Pr^Pfr фототрансформации является последовательной. _ •

4. Сравнительный анализ, данных по фототрансформации натив-

ного и частично деградированного фитохромов указывает на существование связи между спектральными изменениями и структурными перестройками в апопротеине.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на XIV Международной конференции по когерентной и нелинейной, оптике (КиН0'91)(Ленинград, 1991), Первом Международном симпозиуме по зеленению (Пущино, 1992) и Первом съезде, белорусского общества фотобиологов и биофизиков (БОФБ) (Минск, 1994).

Опубликовапиоспь результатов. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы (два тезиса и две статьи).

Структура и объеы диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов. Список цити-туемой литературы включает 74 литературных источника. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста и проиллюстрирована двумя таблицами и 31 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ PAEOTU

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходным материалом для выделения фитохрома служили верхуш-

_ки_(2,5-3_см)_выращенных_в-темноте-4=хдневных-проростков-овса

(Avena sativa, L.). Выделение проводилось по методу, разработанному в Институте фотобиологии АНБ [Лапко, 1989], включающему ■ осаждение фитохрома сульфатом аммония и. гельфильтрацию на кальций- тартратном и TOYOPEARL HW-65 геле. Все процедуры выделения проводились при температуре 0°++3°С при тусклом зеленом свете.

Объектом исследования служил нативный фитохром овса (124 кДа). Соответствие белка этому критерию проверялось с, помощью SDS- гельэлектрофореза.Фитохром был растворен в 20 шМ калий-фосфатном буфере, содержащем 1мМ EDTA/2 мМ фенилметилсульфонилф-

торида (PMSF) и 14 мМ ß-меркаптоэтанола (МЭ), рН=7,8. Концентрация белка была равна 1.12х10~5 М, индекс чистоты белка- Абб7/Агао>0,9.

Эксперименты по изучению промежуточных продуктов прямой Pr-»Pfr фототрансформации проводились на установке лазерной кинетической абсорбционной спектроскопии. Для фотовозбуидения белка использовалось излучение второй гармоники (х=347 нм) рубинового лазера с модулированной добротностью (полуширина импульса 30 не и энергия 25 мДж). В ходе экспериментов измерялись изменения оптической плотности во времени после возбуждения образца лазерным импульсом.

Система регистрации включала источник зондирующего света (аргон-циркониевая лампа ДАЦ-50 (50 Вт)),' монохроматор, построенный на оптической схеме Черни-Тэрнера с двойной дисперсией бее промежуточной щели, и фотоприемника ФЭУ-83, сигнал с которого подавался на вход цифрового осциллографа С9-27. Дисперсия монох-роматора составляет 7,6 S/mm. Ширина входной и выходной щелей (0,5 мм) обеспечивала спектральное разрешение -1 нм.

Изменения оптической плотности фиксировались в виде кинетических кривых AD=f (t), где t- время'после вспышки. Полученные данные обрабатывались при помощи' специальных программ на IBM 386.' Диапазон измерений охватывал времена от 10 мке до 2 с. Таким образом, нижняя временная граница (10 икс) позволяла регистрировать первые промежуточные продукты фототрансформации фитох-рома, а верхняя (2 с) -стабильную Pfr-форму (Scurlock, et al.. 19931. Точность определения оптической плотности во всех экспериментах составляла IxlO"3.

При необходимости в процессе проведения экспериментов зондирующий луч ослаблялся при помощи нейтральных светофильтров. При работе в спектральных областях наведенного поглощения дополнительно на пути зондирующего луча помещались интерференционные светофильтры с известным пропусканием для тех длин волн, на которых проводились измерения. Дифференциальные спектры поглощения для промежуточных' продуктов Рг^Ргг и Pfr->Pr фототрансформаций рассчитывались на основании полученных в эксперименте кинетических кривых. Перевод белка в Рг форму осуществлялся облучением светом лампы ДАЦ-50 через светофильтр КС-19. в течение 3 минут. Комбинация ДАЦгбО и данного светофильтра позволяла облучать об-

- в -

разец светом с Х>710 нм. За указанное время 100% фитохрома переходило в Рг форму.

Температура образца поддерживалась на уровне б±1°С. При данной температуре фитохром сохранял нативность в течение всего эксперимента. Сохранность белка контролировалась спектрофотомет-рически. При этом фитохром анализировался на способность к фотообратимости и величину оптической плотности в максимуме Рг формы, что является спектральными показателями нативности белка. Измерения проводились сериями и охватывали весь диапазон временных задержек от 10 мкс до 2 с. Для каждой серии брался новый образец. Данные, полученные в различных сериях для разных образцов, усреднялись.

Спектры поглощения фитохрома записывались на спектрофотометрах "Beckman", СФ-10.

Для математического моделирования изменения оптической плотности при Pr-*Pfr фототрансформаций была написана программа на языке программирования PASCAL, которая на основании исходных времен жизни и относительных коэффициентов экстинкции интермеди-атов и заданной схемы взаимопереходов рассчитывала изменение оптической плотности (в относительных единицах) во времени после фотовозбуждения Рг. Диапазон расчетов охватывал времена от 10~° до 1с. Для наглядности результатов работы программы и с целью визуального ее контроля пользователем рассчитанная кинетическая кривая выводилась на монитор в графическом виде. Модельная кривая была построена в координатах ñD (относительные единицы) от lg(t,c), что позволяло одновременно наблюдать ее во всем анализируемом диапазоне. Расчетная кривая сравнивалась с эксперимен--тально-измеренной-и-в-результате-нескольких-итераций-рассчитыза--лись наиболее оптимальные параметры т и е для интермедиатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектрально- кинетические характеристики промежуточных продуктов, образующихся в процессе прямой Pr->Pfr фототрансформации фитохрома овса суммированы в таблице. Обпщй ход процесса прямой фототрансформации можно схематично описать следующим образом:

Рг- l'voo- 1ы- 1705*-* I2'3700- P1'Zfr.

За исключением 1*700, включающего в себя два интермедиата

Таблица

Спектрально- кинетические характеристики продуктов прямой Рг-Ргг фототрансформации фитохрома овса (124 кДа) при 1»+5°С

1 » 9 1 I Пул | n 1 Продукт J Время | жизни, 1 т *макс> ДИф.. нм 1 Время образования Предшественник 1 II 1 н

1 i 1 1 i ¥l 1697 |20±10мкс 697±1 100 пс+ Рг" II 1 1

М 7С0Г 1 1 1*700 |100±10мкс 700±1 100 пс+ Рг" 1 а

1 1 « 1ы 1 1 1 Ibi |800±50мкс 707±2 630±1 >10 мкс,но <100мкс 1 ¡697 И/ В ИЛИ 1*7008

1 1 1 1 1705 |1,3±0,3мс 705±1 800±50 1ы 1 и

1 г 1 1 1 1,. 1 12700 | 20±5мс 700±1 1 „3+0,3 мс 1705 к 1 «

I *11 г 1 .1 ii 1 13700 | 250±20мс 700±1 >1,3±0,3мс 1705 ИЛИ 12700 1 1 » ■1 1 и

I 1 1 1 1 р. Pfr6 J — ' 730 20*5мс 12700

I rfr г «. 1 «_ PfrM J____ 730 ,,—j 250±20мс ---—. 13700 __ II 1! л

^Примечание: основаваясь на литературных данных CShaffner et al., 1990]

1697 и I boo, все интермедиаты между возбуждающей форму FV фитохрома лазерной вспышкой и образованием Pfr формы являются продуктами последовательных темповых превращений. Ко времени 10 мкс после фотовозбуждения регистрируются образующиеся независимо друг от друга первичные фотопродукты leg? и 1*700 "рис.1а" с временами жизни ti=20±10 мкс и tz= 100±10мкс и максимумами наведенного поглощения 697+1 нм и 700±1 нм, соответственно. Согласно литературным данным эти интермедиа™ образуются за время

- в -

Длиац волны, им

Рис.1 Дифференциальные спектры поглощения промежуточных продуктов Рг*Ргг фототрансформации фитохрома, образующихся из Рг формы под влиянием возбуждающей лазерной вспышки (ХВОзб=347нм). Временные задержки после фотбвозбуждения составляли:

А:О-10 мкс;0 ~ 50 мке; *-.100 мкс;<?-200 мкс; е - 500 мкс. Б:в-1 мс;0-2 мс;0-10 мс;+-50 мс;л-200 мс;Д-500 мс.

Длина волны, им

Рис.2 Дифференциальные спектры поглощения интермедиатов фитохрома, характеризующее образование и распад 1705- Время после возбуждающей вспышки составляло:

О- 500 мкс; Л - 800 МК0;О-1 мс;.ф- 1,-6'мс;*-2 мс. .

порядка 100 по. Бри их распаде образуется интермедиат Ibi со временем жизни Гз=800±50 мкс. имеющий более низкий коэффициент экстинкции, чем 1*700. и максимумы в дифференциальном спектре поглощения при 707±2 нм и 630±1 нм "рио.1а". В свою очередь из него образуется интермедиат I705 "рис.2", поглощающая свет в интервале 690- 720 нм с Лмакс=705 нм. Данный продукт имеет время жизни t4=l,3±0,3 мс.

В мшшисекундном временном диапазоне в ходе Pr-»Pfr фототрансформации фитохрома . образуются три . интермедиата: I705 (Т4=1,3±0,3 мс), 12700 (т5=20±5 мс) и I3700 (t6=250±20 мс), а вслед за этим Pfr форма фитохрома "рис.16". Продукт I705 образуется из 1ы и переходит затем в 12700. и, по-видимому, также в 13700- Возможные взаимопревращения этих форм до начала образования Pfr формы остаются неясными. В связи с близостью между собой спектральных характеристик данных интермедиатов (различие в положении максимумов между I705 и I2,3?oo составляет всего б нм) представляются реальными термически активируемые переходы продуктов друг в друга, т.к. они требуют незначительных энергетических затрат (&Е< кТ). В этом случае возможен и обратный переход 12700 в I705 и существование всех трех форм одновременно. Таким образом, можно говорить о наличии единого пула долгоживу-щих интермедиатов прямой фототрансформации (миллисекундного диапазона временных задержек), названный нами In (от англ. "late"-поздний).

Следует отметить также, что пул lit объединяет интермедиа-ты, имеющие коэффициенты экстинкции, сравнимые по величине с коэффициентом экстинкции 1Ь1. В этом смысле это тоже "обесцвеченные" продукты, но их происхождение- образование из формы 1ы- не вызывает сомнения.

Анализ характера фронта нарастания стационарной спектральной формы с максимумом 730 нм, идентифицированной как Ргг, выявил наличие ее двух компонентов, различающихся по времени образования на порядок. Оба компонента наблюдаются во всем спектральном диапазоне 695-760'нм "рис.16", что говорит о спектральной близости образующихся продуктов. Это позволяет отнести их к Pfr форме фитохрома. Зарегистрированные компоненты Pfr формы были нами названы быстрообразующейся Pfr-формой (P6fr) и медленно-образующейся Pfr формой (P"fr) • В, спектральном диапазоне 730-760

нм, где в изменение оптической плотности не вносят свой вклад интермедиа™ 1705 и I2,37оо. кинетический компонент P6fr имеет время образования 20±5 мс, а компонент Рмгг- 250±20 мс. Некоторое увеличение в общем пуле доли компонента с более быстрым фронтом нарастания при переходе от 695 нм к 720 нм, скорее всего, является кажущимся, т.к. в длинноволновой области, где отсутствует поглощение более короткоживущих продуктов I705 и i2'3700. соотношение вкладов данных спектральных форм с *макс=730 нм в наблюдаемый спектр поглощения Pfr формы остается неизменным и равным 1,8. Таким образом, увеличение доли компонента Pfr6» который формируется быстрее, было обусловлено изменением разности коэффициентов экстинкции между образующейся формой и ее предшественником.

Таким образом, схема прямой фототрансформации является че-тырёхстадийной и последовательной, если оперировать терминами пулов спектральных форм "рис.3". Интермёдиаты внутри пула могут переходить друг в друга.

На основании этой схемы и полученных спектрально- кинетических данных по интермедиатам Pr-*Pfr фототрансформации фитохрома рассчитывалось изменение оптической плотности во времени после фотовозбуждения Рг формы. Рассчитанные кривые на различных длинах волн сравнивалась с экспериментально измеренными и в результате нескольких итераций рассчитывались наиболее оптимальные параметры т для интермедиатов. Наиболее характерные кинетические кривые приведены на рисунке 4. С учетом погрешности измерений рассчитанные модельные кривые находятся в хорошем соответствии с экспериментальными разультатами, что подтверждает правильность

.выбранной-нами-модели-ВзаимопереходоЕ_интермедиатов_в_ходе_пря^

мой фототрансформации Pr-*Pfr-

Для того, чтобы оценить возможное влияние интенсивности зондирующего света на спектральные параметры долгоживущих интермедиатов прямой Pr-*Pfr фототрансформации были - проведены дополнительные исследования, показавшие, что в рассматриваемом нами временном диапазоне после лазерной' вспышки обратная фототрансформация не оказывает никакого влияние на долгоживущие интерме-диаты прямой Pr-Pfr фототрансформации.- Попутно нам удалось изучить короткожив.ущие (до. 20. мс) интермедиаты обратной фототрансформации... Фитохром переводился в Pfг форму светом соответствую-

20±5 «о

-1,3±0,3 мс

I У? ' Т —Г * 1

■ К

800±50 икс

II

1м

1ц» I

250+20 мс |

1«

Рис.3 Схема прямой Рг->Ргг фототрансформации фитохрома овса, состоящая из трех пулов, последовательно образующихся промежуточных спектральных форм. Цифрами над/под обозначением интерме-диатов обозначены времена жизни соответствующих шгермедиатов.

ю в

м

• $ . X

2

0

.5 -4 -3 -2 -I 0

150» с)

Рис.4 Кинетика изменения экспериментально измеренного и рассчитанного наведенного поглощения Д0(Ъ) (в полулогарифмических координатах)' для длин волны 695, 705 и 750 нм. Соответствующие экспериментальные точки: О-695/км;^ 705 нм;О-750 нм.

щего спектрального состава, после чего инициировался процесс обратной Pfj-"»Pr фототрансформации. Полученные нами дифференциальные спектры поглощения продуктов обратной фототрансформации изображены на рис.5. Из представленных спектров видно, что во временном диапазоне до £0 мс присутствует два иитермедиата. Первый из них имеет изобестическую точку в спектре поглощения со спектром Pfг формы при ~700 нм, что хорошо согласуется с данными работы [Eilfeid, Rudiger, 19853, согласно которой подобные спектральные характеристики имеет luml-F.. Время жизни этого иитермедиата оценено нами как 5±3 мс. При увеличении временной задержки от 20 мкс до 10 мс изобестическая точка в дифференциальном спектре смещается от 700 к 680 нм. На временной задержке 10 мс . наблюдается максимум в кинетике образования следующего продукта с максимумом в дифференциальном спектре поглощения при 650 нм. Так как в данных экспериментах верхняя граница измерения временного диапазона составляла 20 мс, Нам удалось оценить нижнюю временную границу времени жизни данного продукта как -25+30 мс. Этот, интермедиа1! можно соотнести с продуктом meta-F CEil-feld, Rüdiger, 19851. В связи с меньшей стабильностью Pfr формы и невозможностью стопроцентного перевода фитохрома в эту форму, более точное и детальное описание спектрально-кинетических характеристик вышеперечисленных продуктов требует специальных исследований. •

На рисунке 6 представлены реконструированные спектры поглощения продуктов прямой фототрансформации во временном интервале 2 мс- 500 мс после фотовозбуждения. При реконструкции учитывалась величина квантового выхода прямой фототрансформации ф=0,15

[Kel ly et- al., 19851. _______

-Сравнение"данной схемы с предложенными в литературе [Eilfeld, Rudiger, 1985; Schaffner et al., 1990; Scurlock et al., 1993; Inoue et al., 1990; Zhang et al., 19921 свидетельствует о том, что предлагаемая нами схема прямой Pr-»Pfr фототрансформации нативного фитохрома • ближе всего к схеме Шаффнера с соавторами [Schaffner et al., 19901. Отличием является возможность переходов интермедиатов внутри пула спектральных форм, а также обнаружение и детальное изучение нами интермедиатов пула- lit, в то время как Шаффнер с соавторами всего лишь предполагали существование-пула долгоживущих интермедиатов- 1х, но не охарактеризовали

Длина полны, им

Рис.5

600 б» ТОО 750 1С0 Длина волны, им

РЙС. 6

Рис.5 Дифференциальные спектры поглощения промежуточных спектральных продуктов обратной Р{Г~*Рг фоготрансформации. Время После возбуждения Ргг формы составляло: в - 20 мкс;О - 10 мс.

Рис. б Рассчитанные спектры поглощения нативного фитбхрома, образующиеся в ходе прямой Рг-»Ргг фототрансформации; Время после возбуждающей вспышки составляло:

1- 2 мс; 2- 50 мс; -3- 200 мс;' 4- 500 мс.

их. Кроме информации о числе- промежуточных продуктов, схема, предложенная нами, содержит спектрально- кинетические характеристики всех интермедиатов этого процесса.

Сравнительный аналив спектрально- кинетических характеристик интермедиатов нативного и частично деградированного "малого" (60 кДа) и "большого" (114/118 кДа) фитохромов показал, что первичные интермедиаты у всех хромопротеинов имеют близкие спектрально- кинетические характеристики, так как в основе их образования лежит одна и та же фотохимическая реакция- Z-»E-изомеризации хромофора фитохромобилина. Более долгоживущие интермедиаты обнаруживают у частично деградированного белка тенденцию к - обесцвечиванию, видимому, в силу невозможности стабилизации хромофора в Е-конфорыации из-за отсутствия фрагментов полипептидной цепи, ответственных за данную стабилизацию. Речь идет прежде всего о N-концевом 6/10 кДа сегменте. Долгоживущие интермедиаты пула In характерны только для нативного фитохрома и у частично деградированного белка не образуются.

Сравнительный анализ, проведенный нами на основе изменений в спектрах наведенного поглощения нативного (наши данные) и частично деградированного (данные из литературы) фитохромов, а также соотнесение спектральных изменений и структурных перестроек (данные из литературы) в ходе прямой Pr-*Pfr фототрансформации, позволили описать последовательность молекулярных событий, имеющих место при Pr-Pfr. Мы полагаем, что структурные перестройки белка происходят в четыре этапа:

,1) цис-транс- изомеризация хромофора с последующим выходом пиррольного кольца D из плоскости кольца С,, в результате чего интенсивность взаимодействий между хромофором и близко расположенными аминокислотными остатками изменяется.__Это_проявляется-в образовании . первичных фотопродуктов 117оо ( 1б97 и 1г7оо);

2) сближение хромофора с 6-10 кДа N-концевым сегментом [Farrens et al., 1992], вызывающее а-спирализацию последнего [Parker et al., 1992]. Этот процесс проявляется в образовании интермедиата 1ы;

3) экранирующее действие N-терминального сегмента от влияния среды на хромофор, стабилизация новой конформации хромофора, следствием чего является образование интермедиата I705;

4J дальнейшие изменения структуры алопротеима, возможно,

связанные с С-концевым доменом, проявляющиеся в интермедиатах пула lit и сложной биэкспоненциальной кинетике образования формы Pfr.

Подобное рассмотрение структурных перестроек, их сложность и поэтапность, а также сильное, даже определяющее влияние апо-белковой части на свойства хромофора позволяют также объяснить, почему обратная Pfr-Pr фототрансформация идет через спектральные продукты, отличные от интермедиатов прямой Pr-*Pfr фототрансформации.

ВЫВОДЫ

1. Спектрально- кинетические исследования показали наличие в ходе прямой Pr*Pfr фототрансформации трех промежуточных стадий, каждой из которых соответствует пул интермедиатов, имеющих близкие спектральные свойства, а именно 1*700. 1ы• ht-'

2. Пул первичных фотопродуктов iSoo содержит 2 компонента (1бэ7 и 1*700). существующих независимо друг от друга в микросе-кунднсм временном диапазоне. Наблюдаемые спектральные изменения после распада 1*700 объясняются образованием одного интермедиата 1ы. Этот интермедиа? трансформируется в продукт I705, входящий в пул lit- В этом пуле идентифицированы и охарактеризованы 3 интермедиата: I?o5. IZ700 и 13700, имеющие времена жизни в миллисе-кундном интервале;

• 3. .С позиции существования пулов спектральных форм, внутри которых возможны переходы между интермедиатами, прямая PHPfr фототрансформация фитохрома представляет собой последовательную цепь темновых реакций.

4. Компьютерное моделирование спектральных изменений, наблюдаемых в ходе прямой Pr-Pfr фототрансформздии фитохрома подтвердили адекватность данной схемы фототрансформации.

5. На основе сравнительного анализа данных по фототрансформации нативного и частично деградированного фитохромов и структурных изменений апобелка в ходе этого процесса предлагается возможная взаимосвязь между спектральными изменениями и структурными перестройками • в апопротеине при Pr-»Pfr фототрансформа-

ции.

СПИСОК ОПУБЙЙЮВЛШЬК РАБОТ КО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крылов А.Б., Лапко В.Н.,. Волотовский И.Л., Ганжа В.А., Джагаров Б.М. Спектрально- кинетические исследования первичных продуктов фототрансформации фитохрома. // Тезисы на XIV Международной конференции по нелинейной и когерентной оптике.- 1991.-Ленинград.- €.72.

2. Крылов А.В., Крук Н.Н., Лапко В.Н., Ганжа В.А., Джагаров Б.М.. Волотовский И.Д. Спектрально- кинетическое исследование первичных продуктов фототрансформации фитохрома.// Изв.РАН.- Серия-физическая.- 1992.- Т.56.- Н.12.- С.161-167.

3. Крылов А.В., Крук Н.Н., Лапко В.Н., Джагаров Б.М., Волотовский И.Д. Лазерная кинетическая спектроскопия долгоживущих ' .интермедиатов прямой фототрансформации фитохрома.// Тезисы на I съезде Белорусского Общества Фотобиологов и Биофизиков (БОФБ).-1994.- Минск.- С: 93.'

4. Volotovski I.D., Sokolovski S.Q., Krylov. А.В. Phytochro-me transformation and possible involvement of ionic processes in the mechanism of its action.// Greening. Pushcheno.- 1994.-Р.39-Б9. • .

РЭЗВМЭ KFUtpy Андрзй Барисав1ч

Спектравъна- р1иетцчния даодадваин! ррамой Pr-*Pfr

:-— фотатрансфарнацы! натиунага ф 1тахрому а^са

Ключавыя словЦ: натыуны ф1тахром ауса, фотатрансфармацыя, лааерны флеш-фатол18, 1нтзрмедыяты.

3 дапамогай лазернай к!нетычНай спектраскапН праводз1лася вывучзнне прамежкавых стадый прамой Pr^Pfr фотатрансфармацы! фЬ тахрому- фотарэцэптарнага бялку расл!н- пры тзмпературы t=+5±l°C. Аб'ектам даследванняу быу натыуны высокаачышчаны фЬ тахром ауса (124 кДа). Канцэнтрацыя бялку- 1.12х10~5 М, вдзкс чысцШ- Ав57/Ageo^O >9. Дыяпазон вымярзнняу ахошпвау 1нтзрвал • ад 10' мкс да 2 с.

Спектральна- к!нетычныя даследванн! паказал1 наяунасць пры правой Pr-Pfr фотатрансфармацы1 трох прамежкавых стадий, кожнай в як!х адпавядае пул спектральных форм, як!я маюць бл1зк!я спектральная уласц!васц1: 147оо» 1ы. lit. Пул 1*700 першасных фотапрадукгау Pr-»Pfr уключае 2 кампаненты (1б97 1 I700). як1я 1снуюць незалежна адз1н ад аднаго у часавым м1красекундным дыя-пазоне. Спектрадъныя змяненн1 пасля распаду. 1 Soo тлумачадца ут-варэннем аднаго 1нтэрмедыяту 1ы. Тэты 1нтэрмедыят трансфармуец-ца у I705. як1 уваход81ць у пул lit, две 1дэнтыф1кайаны. 3 iHTsp-медыяты: I705.I2700 i 1Э700. як!я маюць час жыцця у мШсекунд-ным 1нтэрвале. Гзтыя 1нтэрмедыяты ахарактарызаваны упершьшю. Удакладнены таксама спектральна- к!н§тычныя характарыстык! Оольш кароткожывучых прамежкавых спектральных форм.

На падставе атрыманых даных пабудавана схема прамой Pr-Pfr фотатрансфармацы!, якую з паз!цы! 1снавання пулау можна назваць паслядоунай:

Рг- Il700-* Ibl-» lit- Pf Г- J

Мадэл1раванне спектральных змяненняу, наз1раемых пры прамой Pr-Pfr фотатрансфармацы1 ф!тахрому, падцвердз!ла адэкватнасць гзтай схемы. Прапануецца магчымая узаемасувязь спектральных змя-

•j j

ненняу i структурных перабудоу апабялку пры прамой фотатрансфармацы! ф!тахрому.

РЕЗЮМЕ КРЫЛОВ Андрей Борисович

Спектрально- кинетические исследования прямой Pr-*fr фототрансформации нативного фитохрома овса

Ключевые слова: нативный фитохром овса, фототрансформация, лазерный флеш-фотолиз, интермедиаты.

На установке лазерной кинетической спектроскопии проводилось изучение промежуточных стадий прямой Pr-Pfr фототрансформации фитохрома- фоторецепторного белка растений- при температуре t=+5±i°c. Объектом исследования служил нативный высокоочищенный фитохром овса (124 кДа). Концентрация белка- -1.12х10~5 М, индекс чистоты белка- Абб7/А280>0,9. Диапазон измерений охватывал времена от 10 мкс до 2 с после фотовозбуждения.

Спектрально- кинетические исследования показали наличие в ходе прямой Рг-Pfx фототрансформации трех промежуточных стадий, каждой из которых соответствует пул спектральных форм, имеющих близкие спектральные свойства, а именно 11?оо. 1ы. lit- Пул первичных фотопродуктов Pr-Pfr 14700 содержит 2 компонента (1б97 и 11700). существующих независимо друг от друга в микросекундном временном Диапазоне. Наблюдаемые спектральные изменения после распада 1*700 объясняются образованием одного интермедиата 1ь1• Этот интермедиат трансформируется в продукт I705. входящий в пул lit- В этом пуле идентифицированы 3 интермедиата: I705. 12?оо и 13700. имеющие время жизни в миллисекундном интервале. Эти интермедиаты охарактеризованы впервые. Уточнены также спектрально-кинетические характеристики . более короткоживущих промежуточных спектральных форм.

На основании полученных■ данных построена схема прямой Pr-Pfr фототрансформации, которую с позиции существования пулов можно назвать последовательной: РГ- 1*700"* 1ы— lit-.Pfr-Моделирование спектральных изменений, наблюдаемых в ходе прямой Pr-Pfr фототрансформации фитохрома. подтвердило адекватность данной схемы. • Предлагается возможная взаимосвязь спектральных. изменений и структурных перестроек апобелка в ходе прямой фототрансформации фитохрома.

SUMMARY

Krylov Androj Borisovich

_SPECTRAL- KIHETIC SUTOIES Iff THEOAT^HATIVE__

PHOTOCHROME FORWARD Rr-Pfr PHOTOTRANSFORMATION Keywords: native oat phytochrome (124 kDa), phototransformation, laser flash photolysis, intermediates.

Phytochrome was isolated and purified to Абб?/А280>0.9 from an extract of 4-5.day-old.etiolated oat seedlings. Native phytochrome samples concentration was 1.12xlO_sM. The time- resolved spectroscopy measurements were perfomed with help of a nanosecond flash-photolysis apparatus having second harmonic of a Q-switched ruby laser as photolytic .source and were done at de-

lay times between 10 i»s and 2 s at +5°±1C.

Transient spectra analysis was carried out and three groups of the intermediates, I boo. Ibi, I it, were identified. It was also shown that spectral pool I boo includes two intermdiates, 1697 and 1*700 but lit. is a sum of at least three different intermediates, I705, I27oo and l37oo- It was concluded that Pr-Pfr phytochrome phototransfornation Is consistent with the simplest model containing sequential chain of spectral form pools: Pr- I boo- Ibi- lit- Pfr-For the verification of the phytochrome phototransformation scheme the computer simulation was carried out and was shown that this scheme Is adequate one. A comparison of this scheme with those for forward photoconvertion proposed earlier was made. The possible relations between spectral changes and changes of apoprotein structure along Pr-Pfr were proposed.