Создание препарата для сельскохозяйственных животных на основе штамма термостойких целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus ь1-85

Проворов, Евгений Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание препарата для сельскохозяйственных животных на основе штамма термостойких целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus ь1-85
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание препарата для сельскохозяйственных животных на основе штамма термостойких целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus ь1-85"

На правах рукописи

ПРОБОРОВ

Евгений Леонидович

СОЗДАНИЕ ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА ОСНОВЕ ШТАММА ТЕРМОСТОЙКИХ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ Bacillus pantothenticus №1-85

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 2004

Диссертационная работа выполнена в группе зоотехнической микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Лаптев Георгий Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Смирнов Олег Всеволодович,

кандидат биологических наук Зольникова Наталья Васильевна.

Ведущее учреждение: отдел прикладной микробиологии ФГУП

ГосНИИ особо чистых биопрепаратов

Защита диссертации состоится 03 февраля 2005 г в 11 часов иа заседании диссертационного совета К.006.028.01 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, дЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «_»_2004 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

toos-ч # p ^cpff 3

iLGGm Актуальность темы. Животные с момента их рождения вступают в сложные симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами, населяющими их пищеварительный тракт Кишечная микрофлора оказывает влияние на формирование иммунной системы молодых животных, участвует в инактивации некоторых продуктов распада и препятствует размножению в их кишечнике условно-патогенных бактерий (Fuller, 1989; Малик, 2002).

Для жвачных животных такой симбиоз является жизненно необходимым, так как микроорганизмы рубца используют свои ферментные системы для расщепления недоступных высшим организмам полимеров - например растительной клетчатки (Hungate, 1966; Пивняк и др., 1982; Rüssel et al., 2001).

Доказано, что химический состав пищи, потребляемой высшим организмом, оказывает непосредственное влияние на качественные и количественные характеристики микробного сообщества кишечника (Apajalahti et al., 2004). Следовательно, неправильное кормление животных приводит к нежелательной сукцессии микробиоценоза их желудочно-кишечного тракта, что является причиной снижения продуктивности и возникновения ряда заболеваний (Rüssel et al., 1996; Nagaraja et al., 1998).

Рацион сельскохозяйственных животных включает большое количество растительных компонентов. У крупного рогатого скота и других видов жвачных в процессе эволюции сформировался мощный аппарат, состоящий из специальных отделов пищеварительного тракта и населяющих их микроорганизмов, позволяющий им эффективно использовать растительную клетчатку. Животные с однокамерным желудком и птицы лишены такой возможности. В связи с этим сформировался ряд подходов, направленных на стабилизацию их продуктивности при повышении в рационе доли труднопереваримых растительных полимеров.

Во-первых, практикуется использование кормовых ферментов. Чаще всего применяют ферменты, действие которых направлено на расщепление целлюлозы, промежуточных продуктов её гидролиза, а также на ряд гемицеллюлоз и фитин. При включении ферментных препаратов в низкопитательные рационы сельскохозяйственных животных и птицы удаётся добиться повышения их продуктивности и снижения затрат корма (Околелова и др., 2001; Пирс, 2002).

Второе, не менее важное направление - использование пробиотиков -препаратов на основе штаммов полезных микроорганизмов, чаще всего изолированных из желудочно-кишечного тракта животных или человека. Занимая свободные экологические ниши в кишечнике животных, и продуцируя ряд биологически активных веществ, они оказывают положительное воздействие на здоровье животных и их продуктивность (Малик, 2001; Guarner, 2003). Область знаний о механизмах взаимодействия пробиотических бактерий с организмом-хозяином постоянно расширяется.

И наконец, среди микробиологических добавок есть препараты, сочетающие в себе свойства, как кормовых ферментов так и пробиотиков (Эрнст, 1991; Тараканов, 1998; Лаптев и др., 2003). Микроорганизмы, входящие в их состав, продуцируют ферменты, отсутствующие у высших животных. Одним из таких препаратов является целлобактерин, разработанный- коллективом ученых. Всероссийского

научно-исследовательского института сель<

^биологии.

Большая часть комбикормов для сельскохозяйственных животных выпускается в форме гранул. В связи с этим невозможно равномерно распределить мелкодисперсный препарат в готовом корме. Следовательно, оптимальный путь использования кормовых добавок заключается во внесении их в комбикорм во время его изготовления, до стадии гранулирования. Однако в результате термообработки происходит инактивация многих биологически активных веществ и гибель полезных микроорганизмов. Перспективным представляется поиск штаммов бактерий, обладающих полезными свойствами, в совокупности с механизмами защиты от неблагоприятных условий внешней среды.

Целью работы являлось выделение штаммов термостойких целлюлозо-литических бактерий и создание на их основе препарата, способного повышать продуктивность сельскохозяйственных животных.

В задачи исследований входило:

1. Изучить влияние температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата Целлобактерин в лабораторных и производственных экспериментах.

2 Провести отбор среди штаммов целлюлозолитических бактерий, из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, по критериям ферментативной активности и термоустойчивости.

3 Изучить культурально - биохимические свойства наиболее активного штамма и отработать технологию его выращивания в производственных условиях, с последующим высушиванием на твердом носителе.

4 Изучить воздействие термообработки на жизнеспособность отобранного штамма и проанализировать его влияние на продуктивность цыплят-бройлеров в промышленных условиях.

Научная новизна

1. Впервые был проведён направленный отбор среди изолятов целлюлозолитических микроорганизмов коллекции ГНУ ВНИИСХМ, завершившийся выделением наиболее активных и термостойких штаммов.

2. Впервые изучено влияние целлюлозолитических бактерий рода Bacillus на продуктивность сельскохозяйственной птицы.

3. Отработана методика лабораторного и промышленного культивирования штамма Bacillus pantothenticus №1-85, с последующей их иммобилизацией и включением в состав гранулированных комбикормов.

4. В результате выполненной работы получены данные по влиянию термообработки комбикорма на сохранность в нём целлюлозолитических и молочнокислых бактерий. Установлены температурные пороги производственных процессов, превышение которых делает использование препарата Целлобактерин неэффективным.

Практическое применение результатов. Результаты выполненной работы использованы для-разработки технологического регламента на производство препарата целлобагте^^^'^А^^ошел регистрацию в Министерстве сельского хо-

L I

« »nun I Ц—ПК

зяйства и продовольствия Российской Федерации и в настоящее время находится в стадии широких производственных испытаний.

Целлобактерин-Т пригоден для включения в комбикорма, подвергающиеся экспандированию и гранулированию, его использование позволяет удешевить рацион за счёт увеличения в нём количества растительных компонентов без снижения продуктивности животных и птицы. Изобретение «Штамм бактерий Bacillus pantothenticus 1-85 для использования в гранулированных кормах» защищено патентом №2235772 от 10.09.2004 г.

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены: на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке" (г. Санкт-Петербург, 30 окт. 2001 г).

на региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (г.Саратов, 26-27 марта 2002 г), на II международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубровицы, 29 сентября 2003 г).

на III научно-практической конференции «Перспективные направления в производстве и использовании комбикормов и балансирующих добавок» (Дубровицы, 17 декабря 2003 г).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 9 печатных трудах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 8 рисунков и 27 таблиц. Библиография включает 137 ссылок наименований работ, из них 89 зарубежных авторов.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

Работа была выполнена в период с 2000 по 2004 г в группе зоотехнической микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ РАСХН); лаборатории нормирования кормления и комбикормов Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ГНУ ВНИТИП); на базе ООО «Биотроф»; Санкт-Петербургском мукомольном комбинате АО «Невская Мельница», ЗАО «Белгородский экспериментальный завод рыбных комбикормов» Белгородской области, АО «ГППЗ Большевик» Ленинградской области.

Объекты исследования - штаммы целлюлозолитических бактерий выделенные из рубца домашних и диких жвачных животных, полученные из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, ассоциация микроорганизмов препарата целлобактерин.

В работе были использованы белые мыши массой 16-18 г, приобретённые в питомнике РЛМН «Рапполово» Ленинградской области, цыплята-бройлеры кросса «Барос» селекции АО «ГППЗ Большевик» 28-42 суточного возраста, цыплята-бройлеры кросса «Конкурент-2» 1 -49 суточного возраста.

Питательные среды. Коллекционные штаммы бактерий сохранялись и культивировались на жидкой целлюлозосодержащей питательной среде Омелян-ского. Морфологию колоний изучали на таких средах как мясопептонный бульон, мясопептонный агар, целлюлозный агар Для изучения способности микроорганизмов ферментировать сахара диагностического ряда использовали жидкие среды Гисса с добавлением индикатора бромтимолового синего.

Количественный учёт целлюлозолитических микроорганизмов проводили путём высева серийных разведений материала (10*2- 10*8) на целлюлозный агар. В случае определения молочнокислых бактерий использовали сусло-агар с мелом.

Морфологию бактерий изолята №1-85 изучали в суточной культуре, на жидкой среде Омелянского, при помощи светового микроскопа, в препарате «раздавленная капля», определяя при этом подвижность микроорганизмов, и их размеры. Кроме этого проводили окрашивание фиксированных нагреванием мазков по Граму. Для электронного микроскопирования каплю бактериальной суспензии наносили на медные сетки, покрытые формваровой плёнкой-подложкой, и окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК) в концентрациях от 0,1 до 1% в течение различных промежутков времени. Затем изучали образцы в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 70 кВ. Наиболее удачные результаты удалось получить при окрашивании культуры 0,1% раствором ФВК в течение 15 секунд.

При идентификации отобранного штамма пользовались определителем бактерий Берги (9-е изд., 1997). Вид бактерий определяли, руководствуясь частотной матрицей и методикой, предложенными Беркли с соавт. (Berkeley et al., 1984).

Целлюлозолитическую активность штаммов, отобранных из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, определяли по методу Хендерсона, Хорвата и Блока в модификации Чюрлиса (Чюрлис, 1958; Тараканов, 1977).

Устойчивость микроорганизмов к нагреванию изучали либо моделируя необходимые условия в лаборатории, либо на производстве, включая штаммы в состав кормовых смесей, подвергаемых термообработке. В обоих случаях определяли численность жизнеспособных бактерий до и после температурного воздействия.

Изучение влияния микроорганизмов на здоровье животных проводили на лабораторных белых мышах массой 16-18 г. Для определения патогенности бактерий, одной группе животных выпаивали штамм Bacillus pantothenticus №1-85 в дозе 5 млн. микробных тел, а животным из других опытных групп инъецировали его внутрибрюшинно в количестве 300, 30 и 3 тыс. м.т. В контрольных группах мыши получали стерильные питательную среду и физиологический раствор. С целью определения способности микроорганизмов продуцировать токсины осуществляли подкожные и внутрибрюшинные инъекции фильтрата двухнедельной культуры белым мышам (Лабинская, 1972). За животными устанавливали наблюдение в течение 10 дней. На 1, 3 и 5 сутки у них отбирали кровь для определения морфологических показателей, по общепринятым методикам.

Технологические аспекты культивирования штамма Bacillus pantothenticus №1-85 изучали на жидкой целлюлозосодержащей среде Омелянского и производственных средах, различного состава: минерально-шротовой и минерально-пшеничной. Численность бактерий в культуральной жидкости определяли путём подсчёта клеток микроорганизмов на фиксированных окрашенных мазках по методу Виноградского - Шульгиной - Брида («Практикум по микробиологии», 1972). Мазки при этом окрашивали по Смирнову.

Определение оптической плотности культуральной жидкости проводили на спектрофотометре LKB Biochrom Ultrospec, в кюветах с длиной оптического пу-тиЮ мм, при длине волны 540 нм, относительно стерильной питательной среды.

Технологические аспекты высушивания суточной культуры Bacillus pantothenticus №1-85 изучали на трёх твёрдых носителях растительного происхождения, при разных температурных режимах, в сушилках конвекционного типа и кипящего слоя «СП-30» (ЗАО «Фарммедоборудование»), Влажность конечного продукта определяли в соответствие с ГОСТ Р 51850.

Влияние штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивные качества птицы оценивали в опытах по кормлению цыплят-бройлеров кроссов «Барос» и «Конкурент-2» низкопитательными рационами.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1980).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение влияния процессов термообработки комбикорма на сохранность микроорганизмов препарата целлобактерин

Первоначально было изучено воздействие температуры на жизнеспособность бактерий в лабораторных условиях. Установлено, что прогревание бактериальной ассоциации №1-33 в течение 1 минуты при температуре 70°С приводит к значительному снижению числа жизнеспособных молочнокислых бактерий (с 8,53 до 3,24 lgKOE/r), количество целлюлозолитических микроорганизмов при этом снижается в пределах одного порядка (с 8,67 до 7,32 lgKOE/r). Дальнейшее повышение температуры, а также увеличение экспозиции приводит к более заметным количественным потерям жизнеспособных бактерий. Так уже после воздействия 80°С, в течение 1 минуты, из исследуемого образца не удавалось выделить молочнокислых, а при двухминутной экспозиции также и целлюлозолитических бактерий. Принимая во внимание то, что при промышленной обработке комбикорма (экспандирование и гранулирование) его температура может достигать 105°С, можно сделать вывод о нецелесообразности использования целлобактери-на в подобных условиях.

Для подтверждения полученных данных провели ряд экспериментов на Белгородском экспериментальном заводе рыбных комбикормов (БЭЗРК), направленных на исследование сохранности целлобактерина в ходе промышленной термообработки кормовых смесей (табл. 1).

При исследовании комбикорма без добавок, оказалось, что в нём присутствует посторонняя целлюлозолитическая микрофлора в количестве 0,33 lgKOE/rp. Эти микроорганизмы не способны выдерживать высокую температуру и уже при

нагревании до 70°С их количество снижается вдвое, а при дальнейшем повышении температуры выделить их из комбикорма не удавалось Молочнокислых бак-1ерий из комбикорма изолировано не было.

При микробиологическом анализе проб комбикорма с целлобактерином, отобранных из смесителя, достоверное количество целлголозолитических микроорганизмов составило 4,6410,15 ^КОЕ/г, а молочнокислых соответственно 4,61 ±0,27 ^КОЕ/г. Эти данные подтверждают равномерность смешивания компонентов перед их дальнейшей обработкой. После достижения смесью в экспандере температуры в 70°С количество целлюлозолитиков снизилось незначительно - в пределах одного порядка, а число лактобацилл составило 3,27±0,25 ^КОЕ/г.

Таблица

Жизнеспособность бактерий препарата целлобактерин в комбикорме при его промышленной термообработке

Образцы

Комбикорм без добавок (контроль)

Комбикорм с целлобактерино _(1000 1)_

Определяемые микроорганизмы

Целлюл бакт., IgKOE/r

Молочнокисл. бакт., ^КОЕ/г

Целлюл. бакт., IgKOE/r

Молочнокисл, бакт., IgKOE/r

До термооб-

_ работки

Температура в 70

экспандере, °С ^q 105

0,33±0,08

0,18+0,06 0,0 0,0

0,0

0,0 0,0 0,0

4,64±0,15

4,22+0,06 0,56±0,37 0,0

4,61+0,27

3,27±0,25 0,0 0,0

Дальнейшее увеличение температуры в интервалах 70 - 90 - 105°С резко отразилось на сохранности определяемых групп микроорганизмов. На всех последующих этапах исследования из комбикорма не удавалось выделить молочнокислых бактерий, что же касается целлюлозолитиков, то их следовые количества 0,56±0,37 ^КОЕ/г были обнаружены в комбикорме, экспандированном при 90°С.

2.2.2. Отбор наиболее активных изолятов целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ

Во ВНИИСХМ поддерживается коллекция штаммов целлюлозолитических микроорганизмов, выделенных из рубца крупного рогатого скота и диких жвачных животных. В неё входит около 200 изолятов, различающихся по условиям роста и активности разложения натуральной целлюлозы. После анализа имеющейся информации, было отобрано 6 изолятов, сходных по характеру роста и отличающихся наиболее высокой целлюлозолитической активностью. С ними проводили дальнейшую работу.

2.2.2.1. Сравнительная характеристика целлюлозолитической активности отобранных штаммов

Прямой метод учёта убыли натуральной целлюлозы, в процессе культивирования микроорганизмов на минимальной питательной среде, позволил проследить изменение интересующего нас показателя в течение трёх суток (табл. 2).

Таблица 2 Расщепление натуральной целлюлозы штаммами микроорганизмов, отобранными из коллекции ГНУ ВНИИСХМ

Номер штамма

24 часа

48 часов

72 часа

Убыль целлюлозы, г

% от исх. веса

Убыль целлюлозы, г

%от исх. веса

Убыль целлю- % от исх. лозы, г веса

Контроль №1 (среда без 0,000 0 0,000 0 0,000 0

инокул.) Ь-27 0,012±0,004 3,63 0,030±0,003 8,42 0,067±0,006 19,08

1-85 0,005±0,003 1,62 0,013±0,004 3,59 0,069±0,006 19,01

Контроль №2 (1-33) 2280 0,007±0,004 0,001±0,001 2,74 0,33 0,011±0,004 0,004±0,003 4,21 1,12 0,048±0,006 0,03 9±0,002 18,53 10,23

1599 0,002±0,001 0,71 0,009±0,003 2,50 0,034±0,005 9,55

2888 0,005±0,004 1,43 0,019±0,005 5,23 0,021 ±0,006 5,58

2916 0,004±0,003 1,22 0,008±0,002 2,23 0,017±0,004 5,05

При анализе данных обращали внимание на скорость инициации расщепления целлюлозы бактериями, а также на его конечный результат. Из шести штаммов на первые сутки культивирования наиболее активными оказались штамм Ь-27, выделенный из рубца лося и ассоциация № 1-33, использованная в качестве контрольного варианта: убыль субстрата составила 3,63% и 2,74% соответственно. Уровень расщепления целлюлозы остальными штаммами был низок и имел высокую среднестатистическую ошибку. К 48 часам наблюдения для Ь-27 снова был зафиксирован лучший результат (8,42%), за ним следовал штамм №2888 (5,23%), примерно на одном уровне клетчатку расщепляли ассоциация №1-33 и штамм №1-85 - 4,21% и 3,59% соответственно. К концу эксперимента (72 часа), на основании учёта суммарной убыли целлюлозы, стало возможно расположить штаммы в порядке убывания их активности следующим образом: Ь-27, 1-85, 1-33, 2280,1599,2888, 2916.

2.2.2.2. Изучение способности отобранных штаммов переносить нагревание Прогревание изучаемых культур целлюлозолитических бактерий при 80°С и 90°С в течение 1 минуты выявило их неодинаковую устойчивость к подобному воздействию (табл. 3).

Таблица 3. Устойчивость штаммов целлюлозолитических бактерий к нагреванию ... _Количество клеток, 1§КОЕ/мл_

При комнатной температуре_80°С_90°С

1-33 8,60±0,61 2,42±0,14 0,00

Ь-27 8,34±0.24 3,27±0,37 2.43±0,25

1-85 9,13+0,35 8,65+0,56 6.71 ±0,74

2280 7,89±0.67 3,33±0,45 0.36+0,27

1599 8,32±0,54 2,12±0,53 0.63±0,38

2888 7,24±0,76 6.77±0,64 6.21 ±0,65

2916 8,18±0,63 7,89±0,76 5.12+0,54

Штаммы микроорганизмов (№№ 1-33, L-27, 2280), обладающие высокой целлюлозолитической активностью, оказались слабоустойчивыми к нагреванию -инкубирование при 90°С вызывало снижение титра их жизнеспособных клеток с 8,60; 8,34; 7,89 до 0,00; 2,43; 0,36 lgKOE/мл соответственно. Бактерии штамма №2916, не проявившие способности к интенсивному разрушению клетчатки, были более устойчивы к воздействию температуры, и после проведения обработки количество их клеток составляло около 5,12 lgKOE/мл.

Наилучшие результаты были получены для штамма №1-85. Наряду с высокой ферментативной активностью данные бактерии хорошо переносили повышение температуры - в результате прогревания при 90°С их количество снижалось с 9,13 до 6,71 lgKOE/мл. В связи с этим коллекционный штамм №1-85 был избран объектом для дальнейшего изучения.

2.2.3. Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штамма №1-85

Изучение суточной культуры бактерий штамма №1-85, при помощи светового микроскопа, показало, что их клетки подвижны и имеют форму палочек, различной длины. Установлено, что размеры вегетативных клеток лежат в пределах 1,8-2,0x5,0-9,0ц. При окраске по Граму клетки окрашивались положительно. При изучении более старых культур отмечено образование спор эллиптической формы. Спорангий располагается терминально (по плектридиальному типу). Споры термостойкие, что подтверждается их прорастанием после прогревания при 80°С в течение 10 минут. Совместно со световой была выполнена электронная микроскопия культуры бактерий. На рисунке № 1 представлена одна из терминальных стадий образования эндоспоры.

По отношению к кислороду микроорганизмы являются факультативными анаэробами. Температурный оптимум роста составляет 37-38°С. При культивировании штамма на мясопептонном бульоне в течение суток образуется стойкое помутнение среды. На мясопептонном агаре наблюдается рост в виде мелких круглых серовато-жёлтых колоний. Характерным признаком является рост на целлюлозном агаре Омелянского с добавлением рубцовой жидкости. На этой среде в течение 2-3 суток образуются поверхностные мелкие белые и глубокие чечевицеобразные колонии с зоной просветления (расщепления целлюлозы).

Изучение биохимической активности штамма №1-85 показало, что микроорганизмы , способны ферментировать глюкозу, арабинозу, сахарозу, маннит, галактозу, мальтозу, лактозу, раффиноз>. целлобиозу, целлюлозу, сорбит, рамнозу и д>льцит с образованием кислоты и газа Гакже, штамм № 1-85 восстанавливает лакмусовое молоко, гидролизует крахмал, образует каталазу.

Рис 1 Спорообразование Bacillus pantothenticus № 1-85

2.2.4. Идентификация бактерий штамма №1-85

В соответствии с определителем бактерий Берги, основываясь на морфологических и культурально-биохимических свойствах, штамм целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ был отнесён ко второй группе рода Bacillus Дальнейшую его идентификацию проводили с использованием частотной матрицы для определения видовой принадлежности микроорганизмов р. Bacillus (Berkeley et al., 1984). С долей вероятности 97% штамм №1-85 был идентифицирован как Bacillus pantothenticus.

2.2.5. Изучение безопасности штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на лабораторных животных

Не было установлено отрицательного влияния культуры Bacillus pantothenticus №1-85 на здоровье белых мышей при её выпаивании в дозе 5 млн. микробных тел, и при внутрибрюшинном введении в количестве 300,30 и 3 тыс. м.т. на одно животное. Подкожные и интраперитонеальные инъекции бесклеточного фильтрата двухнедельной культуры бактерий также не вызывали гибели или ухудшения состояния животных. Морфологические показатели крови мышей из опытных групп не отличались от таковых у контрольных животных и находились в пределах физиологической нормы. Следовательно, в испытанных дозировках штамм Bacillus pantothenticus №1-85 не является патогенным и не продуцирует токсинов.

2.2.6. Изучение влияния различных дозировок Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивность цыплят-бройлеров проводили в рамках селекционных испытаний птицы на АО «ГППЗ Большевик». Были использованы цыплята кросса «Ба-рос» 32 - 42-дневного возраста. Цыплята из опытных групп получали в составе комбикорма штамм Bacillus pantothenticus №1-85 в разных дозировках, птицы из контрольных групп получали комбикорм без добавок (табл. 4).

Таблица 4 Влияние различных дозировок культуры Bacillus pantothenticus №¡1-85 на продуктивность бройлеров кросса «Барос»

I-

с О

Группа

К-во бактерий в 1 г корма, IgKOE/r

Затраты корма,

г/кг привеса

Привес, г

Эффективность использования корма Со— хран-ность

птицы, %

Отношение затрат корма к привесам

Достоверная Коэффи-

прибавка к циент ва-

контролю, риации. % %

Контроль j Опытная №1 Опытная №2 Опытная №3

5.24+0,06 4,24±0,06 3,24±0.16

1083±2,9 1068±19,4 1078+8,5 1099+38,4

410+62,6 395+49,0 440+47,4 415±34,8

2,70±0,14 2,83+0,47 2,47+0,08 2,65±0,23

7,19

10,7+1,6 23,0+3 6* 4,3+0,6* 12,9±2,0

85 95 100 95

Контроль Опытная №1 Опытная №2 Опытная №3

5,24±0,06 4,24+0,06 3,24±0,16

1040±72,5 1069±24,1 1082+4 1 1083±2.8

430±92,6 470+68 0 540+48 490+63,4

2,59±0,20 2,38±0 41 2 02+0,05 2,34+0.19

22,0

19,2±3 0 15,1+2,3 2,0±0.3* 22,7±3.5

100 100 100 ¡00

Контроль Опытная №1 Опытная №2 Опытная №3

5 24±0 06 4,24±0,06 3,24±0,16

1075113 7 1081+7,6 1077+13 6 1115±6,4

460±354 490+60,9 510+46,5 500±43,8

2,36±0 08 2,25+0 11 2 17+0,06 2,27±0,14

8,05

2.5+0 4 7 1+1,1*

2 4±0,3 4,1 ±0,6**

90 95 100 90

Достоверность различий с соответствующим контрольным показателем - *р<0,01 **р<4) 05

Во всех опытных группах бройлеры, получавшие бактериальную культуру, имели живой вес, больший по сравнению с контрольными, однако эти различия были статистически недостоверны. Для адекватной оценки эффекта, полученного от включения штамма в рацион птиц, для каждой группы была рассчитана величина отношения затрат корма к привесам. Оказалось, что во всех трёх опытах наиболее полноценно усваивали корма цыплята, в рационе которых бактерии Bacillus pantothenticus №1-85 содержались в количестве 4,24±0,6 lgKOE/r (опытные группы №2). При этом эффективность использования кормов достоверно увеличивалась на 7,19 - 22,0% по сравнению с контролем при наиболее низкой вариабельности этого показателя. Сохранность поголовья птиц в опыте в учётный период была 100%, а в контрольных группах 91,6%.

2.2.7. Технологические аспекты культивирования штамма Bacillus pantothenticus №1-85

2.2.7.1. Изучение параметров роста культуры на лабораторной и производственных питательных средах

Были исследованы количественные показатели роста штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на лабораторной целлюлозосодержащей среде Омелянского и производственных средах: минерально-шротовой и минерально-пшеничной (рис. 2).

lgKOE/мл 10

"1-1-1-1—I-1-1-1-1-г—I-1-1-1 I

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

-ср. Омелянского -минерально-шротовая ср. -минерально-пшеничная ср.

Рис 2 Динамика изменения количества клеток Вас Шиз рстШкепИсш № 1-85 при культивировании на разных средах

Исходная концентрация микроорганизмов в начале опыта во всех трёх вариантах составляла 3,65±0,64 ^КОЕ/мл. При выращивании культуры на лабораторной среде Омелянского лаг-фаза была короткой, экспоненциальный рост начинался со 2 ч и заканчивался на 8 ч наблюдения. В этот момент количество клеток в культуральной жидкости достигало 7,84^0,63 1§КОЕ/мл. Объяснить это

можно использованием питательной среды постоянного состава при пересеве культуры, и следовательно отсутствием периода адаптации ферментативных систем микроорганизмов. На минерально-шротовой среде лаг-фаза роста культуры составила 6 часов Экспоненциальная фаза, продолжительностью 6 часов, была чётко выражена. По её окончании концентрация клеток бактерий в культуральной жидкости составила 8,23±0,58 lgKOE/мл. Затем культура переходила в стационарную фазу Для роста Bacillus pantothenticus №1-85 на минерально-пшеничной среде была характерна более продолжительная лаг-фаза (12 ч). Экспоненциальная фаза также более продолжительна (14-16 ч). Титр клеток на момент её завершения составил 6,45±0,62 lgKOE/мл. Можно заключить, что среда не достаточно удовлетворяет потребности микроорганизмов для быстрого роста. Продолжительность лаг-фазы свидетельствует о перестройке метаболизма клеток, а относительно невысокая концентрация бактерий в начале стационарной фазы, возможно, является следствием лимитирования по какому-либо субстрату.

При культивировании штамма на разных питательных средах было зафиксировано достоверное изменение их кислотности. При росте бактерий на среде Омелянского, по сравнению с другими вариантами, pH снижался незначительно (с 6,87 до 5,88). Это можно объяснить невысоким содержанием легкогидролизуе-мых углеводов в составе среды. Минерально-шротовая среда, напротив, богата углеводными компонентами, что обуславливает значительное падение pH (6,174,61), совпадающее по времени с экспоненциальным ростом культуры. В дальнейшем, на обеих питательных средах, при переходе культуры в стационарную фазу роста показатель кислотности стабилизируется и даже отмечено некоторое его повышение. На минерально-пшеничной среде, в течение всего периода наблюдения, было отмечено постоянное снижение pH, что указывает на непрекращающуюся метаболическую активность микроорганизмов.

При изучении изменения оптической плотности питательных сред мы наблюдали достоверное увеличение этого показателя, начинающееся в конце экспоненциальной и достигающее оптимума к середине стационарной фазы, что наиболее наглядно на примере среды Омелянского и минерально-шротовой среды. (рис.3).

Таким образом, основываясь на количественных характеристиках роста бактерий, и принимая во внимание стоимость основных компонентов питательных сред, можно сделать вывод, что минерально-шротовая среда является наиболее подходящей для промышленного культивирования Bacillus pantothenticus №1-85.

2.2.7.2. Определение оптимальных условий для высушивания культуры Bacillus pantothenticus №1-85

В сравнительном аспекте была изучена эффективность разных методов высушивания суточной культуры Bacillus pantothenticus №1-85 на нескольких носителях растительного происхождения. Основными критериями, по которым производили оценку, являлись, количество жизнеспособных клеток бактерий в конечном продукте, время высыхания образцов и их консистенция. При конвекционной сушке среднее время достижения образцами влажности 7% составило 15-17 ч при 60°С и 12-14 ч при 65°С. Использование сушки в кипящем слое позволило сокра-

тить затраты времени в среднем на 13 часов в первом случае и на 11,3 ч во втором. Количество жизнеспособных бактерий колебалось в пределах 7,9 8,3 1§КОЕ в 1 г сухого продукта Подсолнечный шрот и пшеничные отруби по своим физическим параметрам наиболее отвечали требованиям, предъявляемым к субстрату для иммобилизации микроорганизмов.

ABS

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

-ср. Омелянского -минерально-шротовая ср. - минерально-пшеничная ср.

Рисунок 3. Изменение оптической плотности питательных сред при культивировании

Bacillus pantothenticus №l -85

2.2.7.3. Изучение сохранности Bacillus pantothenticus №1-85 в комбикормах, подвергающихся термообработке

В условиях БЭЗРК нами было изучено влияние экспандирования и гранулирования кормовых смесей на сохранность в них бактерий Bacillus pantothenticus №1-85 (рис. 4).

IgKOE/r

до

обработки

□ зкепандирование ■ гранулирование

110 120

температура обработки,С

Рис 4 Влияние термообработки комбикормов на сохранность в них Bacillus pantothenticus

№1-85

В исходном комбикорме присутствует спонтанная микрофлора, определяемая на дифференциальной питательной среде с целлюлозой в количестве 2,74 lgKOE/r. Она является чувствительной к температурному воздействию, так как после нагревания смеси до 70°С в ней было зафиксировано заметное падение численности бактерий Далее при последовательном повышении температуры экс-пандирования титр микроорганизмов снижается более плавно Таким образом, первоначальным повышением температуры были ликвидированы спонтанные не-спорообразуюшие штаммы, а также термолабильная часть клеток Bacillus pantothenticus №1-85.

Выше было показано, что для наиболее успешного влияния Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивность птицы, необходимо поддерживать концентрацию микроорганизмов в комбикорме около 4 IgKOE/r. Как следует из проведённого эксперимента, при смешивании высушенной культуры с комбикормом в соотношении 1:1000 и его дальнейшем экспандировании и гранулировании, сохранить оптимальный титр микроорганизмов удаётся при повышении температуры обработки до 105°С. При более высокой температуре необходимо увеличивать норму ввода микроорганизмов в комбикорм.

2.2.8. Сравнительное изучение влияния штамма Bacillus pantothenticus №185 и других добавок на зоотехнические показатели цыплят-бройлеров

Изучали влияние пробиотика целлобактерин, ферментного препарата цел-ловиридин Г20х и высушенной культуры Bacillus pantothenticus №1-85 на зоотехнические показатели цыплят-бройлеров кросса «Конкурент-2», получавших низкопитательный рацион (табл. 5).

Таблица 5 Влияние различных добавок на продуктивность и использование питательных веществ рациона цыплятами-бройлерами кросса «Конкурент-2»

Возраст ГГГИЦЫ, дни Группы

Контроль В pantothenticus Целлобактерин, №1-85, 1 кг/т 1кг/т Делловиридин Г20Х 100 г/г

49 дней 95,0 Сохранность. % 96,3 96,3 97,5

28 дней 42 дня 49 дней 1001,8113,1 1731,3126,7 2016,3129,3 Живая масса одной особи 1046,3115,3 1822,7133,1* 2136,0132,3* , г 1039,6115,9 1877,4126,9** 2086,2135,3 1046,9115,1 1931,8125,2** 2102,8+35,3

28 дней 42 дня 49 дней 1,87 2,15 2,23 Затраты корма на 1 кг привеса, кг 1,83 1,84 2,02 2,06 2,07 2,08 1,81 2,08 2,08

Сухого вещества Протеина Клетчатки 70,5 91,1 18,3 Переваримость. % 72,3 91,3 21,6 71,2 90,2 22,0 71,3 90,3 23,6

Азота Валовой энергии 51.2 67.3 Использован ие.% 52.6 69,9 52,7 68,5 53,7 69,7

Достоверность различий с соответствующим контрольным показателем - *р<0 05 **р<0,001

Была отмечена высокая сохранность поголовья во всех группах, однако, среди птиц, получавших микробиологические добавки этот показатель был на 1,3%, а в группе с ферментным препаратом на 2,5% выше контрольного. При взвешивании недельных цыплят достоверных различий между группами установлено не было. Самую высокую живую массу в конце опыта имели бройлеры, получавшие культуру Bacillus pantothenticus №1-85 (на 5,9% выше контроля). Вес птиц, получавших препараты целлобактерин и целловирвдин, превосходил массы контрольных вариантов на 3,4 и 4,2% соответственно. Что касается затрат корма, то этот показатель не имел существенных различий среди опытных групп, а относительно контроля был ниже на 6,8-7,2%. Наибольшая переваримость сухого вещества отмечена у птиц, получавших штамм №1-85. Переваримость протеина примерно одинакова в контроле и группах птиц, получавших штамм № 1-85, в двух других опытных группах она была ниже контрольной на 0,8-0,9%. По переваримости клетчатки рациона, лидировали птицы, получавшие ферментный препарат (23,6%), затем следуют группы, получавшие целлобактерин (22%) и культуру исследуемых микроорганизмов (21,6%), в среднем, во всех опытных группах этот показатель выше, чем в контрольной на 3,3-5,3%. По использованию азота опытные группы превосходят контроль на 1,4-2,5%. Валовая энергия лучше всего используется в группе, получавшей культуру штамма №1-85 и в группе, получавшей целловиридин. Интересен высокий показатель переваримости протеина, на фоне среднего значения переваримости клетчатки у птиц, получавших штамм микроорганизмов, по сравнению с другими группами.

Выводы

1.Из лабораторных и производственных экспериментов по изучению влияния температурного воздействия на сохранность препарата целлобактерин следует, что при повышении температуры обработки комбикорма выше 75°С гибель целлюлозолитических и молочнокислых бактерий достигает критических значений, а следовательно, использование препарата становится нецелесообразным.

2. В результате скрининга штаммов целлюлозолитических бактерий го коллекции ГНУ ВНИИСХМ, для дальнейшего изучения был отобран штамм под №185. Он показал наилучшую ферментативную активность - 19% убыли натуральной целлюлозы через 72 часа инкубирования и высокую сохранность жизнеспособных клеток после прогревании культуры на жидкой питательной среде до 90°С - 6,71 ±0,74 lgKOE/мл.

3. Изучена морфология клеток бактерий отобранного штамма, характер их роста на различных питательных средах, потребности в питательных веществах и биохимическая активность. По совокупности этих признаков штамм был идентифицирован как Bacillus pantothenticus №1-85. Путём постановки биологических проб на лабораторных животных не было выявлено патогенных и токсигенных свойств у изучаемого штамма.

мальной для выращивания данных микроорганизмов в промышленных условиях. Через 24 часа культивирования количество жизнеспособных термоустойчивых спор в 1 мл среды составляет 4,63±0,67 lgKOE/мл и в дальнейшем значительно не увеличивается.

5. Отработана технология высушивания культуры Bacillus pantothenticus №1-85 на разных носителях растительного происхождения. Высушивание в кипящем слое позволяет сократить продолжительность процесса в 7 - 10 раз по сравнению с конвекционной сушкой. Количество микроорганизмов перенёсших высушивание составляет 7,9 - 8,3 IgKOE/r. Не обнаружено достоверного влияния вида носителя, а также метода и температуры высушивания, на эту величину. Наиболее удобными в использовании оказались подсолнечниковый шрот и пшеничные отруби.

6. При включении в рацион цыплят-бройлеров культуры бактерий Bacillus pantothenticus №1-85, в дозе 4,24±0,07 IgKOE/r, снижение затрат корма на единицу привеса составило 7 - 22% по сравнению с контролем. При сравнении влияния пробиотика целлобактерин, ферментного препарата целловиридин Г20х и изучаемого штамма на зоотехнические показатели бройлеров, у птиц, получавших штамм Bacillus pantothenticus №1-85 была зафиксирована наибольшая живая масса в конце эксперимента (на 5,9% выше контрольной), а также наилучшие показатели переваримости протеина и сухого вещества рациона. При этом процент переваренной клетчатки был выше у цыплят, получавших ферментный препарат.

7. Выявлено, что экспандирование комбикорма, содержащего штамм Bacillus pantothenticus №1-85 в количестве около 4 IgKOE/r, в температурном диапазоне 70 - 105°С не приводит к заметному снижению численности бактерий. Последующее хранение комбикорма в течение 1 месяца (по ГОСТ Р 51850) не оказывает отрицательного воздействия на сохранность микроорганизмов.

Практические предложения

Данные, полученные в настоящей работе позволяют рекомендовать штамм Bacillus pantothenticus №1-85 для включения в состав низкопитательных рационов цыплят-бройлеров. Это позволит вводить в комбикорм более дешёвые растительные компоненты, без отрицательного влияния на продуктивность птицы.

Разработанный микробиологический препарат, может быть с успехом использован при производстве комбикормов, включающем стадии экспандирования и гранулирования

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В., Проворов Е.Л. Использование пробиотика «Целлобактерин» в птицеводстве// Мат. юбилейной межденар. конф. «Сельскохозяйственная микробиология на рубеже XX-XI вв » июнь 2001. - Пушкин, 2001.

2.Силкина В.А, Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В., Проворов Е.Л. Использование пробиотика Целлобактерин при кормлении кур несушек// Мат. III международной конф. по птицеводству. «Птах1внитсво» вып 51, 2001. С. 336.

3. Проворов Е.Л. Использование пробиотика «Целлобактерин» в промышленном птицеводстве// Мат. всероссийской науч.-практ. конф. мол. ученых "Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке" октябрь 2001. - Санкт-Петербург, 2001. С. 155.

4. Лаптев Г.Ю., Силкина В.А., Проворов Е.Л. Использование пробиотика Целлобактерин при низкоэнергетических рационах в кормлении кур несушек// Сб. научных трудов ВНИИГРЖ «Теория и практика селекции яичн. и мясн. кур». - Пушкин, 2002. С.304.

5. Проворов Е.Л., Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В. Введение в желудочно-кишечный тракт бройлеров ассоциаций целлюлозолитических бактерий// Мат. per. конф. мол. учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» март 2002 г. - Саратов, 2002. С.36.

6. Лаптев Г.Ю., Проворов Е.Л. Включение целлюлозолитических микроорганизмов в состав гранулированных комбикормов// Мат. II межд. науч.-практ. конференции «Научно-технич. прогресс в животноводстве России», сентябрь 2003 г. - Дубровицы, 2003. 4.1. С. 163.

7. Лаптев ГЮ., Проворов Е.Л. Использование спорообразующих целлюлозолитических бактерий в кормлении бройлеров// Мат. III науч.-практ. конф. «Перспективные направления в производстве и использовании комбикормов и балансирующих добавок», декабрь 2003 г. - Дубровицы, 2003. С. 16.

8. Лаптев Г.Ю., Проворов Е.Л., Головлёва Г.С. Ферментативный термостабильный пробиотик// Животновод для всех. - 2004. - №4. - С.78.

9. Грудинина Т.Н., Лаптев Г.Ю., Прокопьева В.И., Солдатова В.В., Проворов Е.Л. Штамм бактерий Bacillus pantothenticus 1 -85 для использования в гранулированных кормах// Патент на изобретение №2235772 от 10.09.2004 г.

Научное издание И170-печать ООО "ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ" Лицензия ПЛД № 69-253 Подписано к печати 22 декабря 2004 г., тир 100 экз

РНБ Русский фонд

2005-4 26671

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Проворов, Евгений Леонидович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Симбиоз организма и микрофлоры его пищеварительного тракта.

1.2. Пробиотические препараты. ч» 1.2.1. История становления предмета и термина.

1.2.2. Использование пробиотиков в сельском хозяйстве.

1.2.3. Механизмы действия пробиотиков.

1.3. Ферментные препараты.

1.3.1. Применение ферментов в кормлении сельскохозяйственной птицы: предпосылки, необходимость.

1.3.2. Разнообразие кормовых ферментных препаратов.

1.3.3. Влияние экзогенных ферментов на процессы пищеварения.

1.4. Микробиологические препараты с ферментативным эффектом.

1.5. Проблемы сохранности кормовых добавок и пути их решения.

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследований.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов.

2.1.2. Животные.

2.2. Питательные среды для хранения и культивирования микроорганизмов.

2.3. Методы изучения культурально-морфологических свойств целлюлозолитических бактерий.

2.4. Методы изучения целлюлозолитической активности микроорганизмов.

2.5. Методы определения количества микробных клеток в разных субстратах.

2.6. Методы изучения устойчивости микроорганизмов к термообработке в лабораторных и промышленных условиях.

2.7. Тестирование штамма Bacillus pantothenticus №1на наличие патогенности и токсигенности.

2.8. Методы изучения технологических аспектов культивирования Bacillus pantothenticus №1-85.

2.9. Изучение влияния Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивные качества цыплят-бройлеров.

3. Экспериментальная часть. Результаты исследований.

3.1. Изучение влияния температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных условиях. ф 3.2. Изучение влияния гранулирования и экспандирования на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в условиях производственного эксперимента.

3.3. Отбор наиболее активных изолятов целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ.

3.4. Изучение свойств отобранного штамма целлюлозолитических бактерий.

3.5. Тестирование штамма Bacillus pantothenticus №1на наличие патогенности и способность образовывать токсины.

3.6. Изучение параметров роста и отработка технологии высушивания культуры Bacillus pantothenticus №1-85.

3.7. Изучение влияния штамма Bacillus pantothenticus №1на продуктивность цыплят-бройлеров.

3.8. Изучение сохранности

Bacillus pantothenticus №1-85 в кормовых смесях при экспандировании и гранулировании.

3.9. Сохранность бактерий штамма № 1-85 в комбикорме в течение срока его хранения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание препарата для сельскохозяйственных животных на основе штамма термостойких целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus ь1-85"

Животные с момента их рождения вступают в сложные симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами, населяющими их пищеварительный тракт. Нормальная кишечная микрофлора оказывает влияние на формирование иммунной системы молодых животных, участвует в инактивации некоторых продуктов распада и препятствует размножению в их кишечнике условно-патогенных бактерий (Чахава, 1972; Малик, 2002).

В некоторых случаях такой симбиоз является жизненно необходимым, так как микроорганизмы предоставляют свои ферментные системы для расщепления недоступных высшим организмам полимеров - например растительной клетчатки (Hungate, 1966; Пивняк и др., 1982; Russel et al., 2001).

Доказано, что химический состав пищи, потребляемой высшим организмом, оказывает непосредственное влияние на качественные и количественные характеристики микробного сообщества кишечника (Любянскене и др., 1989). Следовательно, неправильное кормление животных приводит к нежелательной сукцессии микробиоценоза их желудочно-кишечного тракта, что является причиной снижения продуктивности и возникновения ряда заболеваний (Russel et al., 1996; Nagaraja et al., 1998).

Рацион сельскохозяйственных животных и птицы включает большое количество растительных компонентов. У крупного рогатого скота и других видов жвачных в процессе эволюции сформировался мощный аппарат, состоящий из специальных отделов пищеварительного тракта и населяющих их микроорганизмов, позволяющий им эффективно использовать растительную клетчатку.

Животные с однокамерным желудком и птицы лишены такой возможности. Существует ряд подходов корректирующих процессы пищеварения и направленных на стабилизацию продуктивности при повышении в рационе доли труднопереваримых растительных полимеров.

Во-первых, практикуется использование сухих стабилизированных форм ферментов, получаемых при культивировании естественных продуцентов (грибов, бактерий). Существуют разные препараты из этой серии, отличающиеся, как по ферментативному спектру, так и по активности входящих в них компонентов. Чаще всего применяют ферменты, действие которых направлено на целлюлозу, промежуточные продукты её гидролиза, а также на некрахмальные полисахариды и фитин. При включении ферментных препаратов в низкопитательные рационы сельскохозяйственных животных и птицы удаётся добиться повышения их продуктивности и снижения затрат корма (Околелова и др., 2001; Пирс, 2002).

Второе, не менее крупное направление - использование пробиотиков - препаратов на основе штаммов полезных микроорганизмов, чаще всего изолированных из желудочно-кишечного тракта животных или человека. Подавляющее число добавок этой группы создано на основе классических пробиотических бактерий (pp. Lactobacillus, Bifidobacterium). Занимая свободные экологические ниши в кишечнике животных, и продуцируя, ряд биологически активных веществ, они оказывают положительное воздействие на здоровье животных (Малик, 2001; Guarner, 2003). Основной эффект от их использования, складывается из повышения сохранности поголовья, а также получения экологически чистой продукции.

И наконец, среди микробиологических добавок есть препараты, способные заменить в рационах животных как кормовые ферменты так и пробиотики (Эрнст, 1991; Тараканов, 1998; Лаптев и др., 2003). Микроорганизмы, входящие в их состав продуцируют ряд ферментов, отсутствующих у высших животных.

Одним из таких препаратов является целлобактерин, созданный коллективом учёных Всероссийского научно - исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, на основе ассоциации целлюлозолитических и молочнокислых бактерий.

Для наиболее полноценного использования той или иной добавки необходимо найти оптимальный путь включения её в состав комбикорма. Как правило, он заключается во внесении дополнительных компонентов в комбикорм во время его изготовления. Это позволяет применить более точную дозировку, добиться равномерного распределения добавки в комбикорме и снизить затраты труда. Особенно важен такой подход при использовании хозяйством гранулированных кормов, так как равномерное смешивание мелкодисперсных препаратов с готовыми гранулами практически невозможно.

На сегодня существует проблема сохранности добавок в комбикормах, подвергающихся различным видам термообработки. Многие производители комбикормов используют процессы экспандирования и экструдирования для повышения переваримости растительных компонентов рациона и снижения контаминации конечного продукта. При этом становится невозможным включение термолабильных добавок в состав комбикорма при его изготовлении.

В связи с этим основной целью нашей работы являлось выделение штаммов термостойких целлюлозолитических бактерий и создание на их основе препарата, способного повышать продуктивность сельскохозяйственных животных и птицы.

В задачи исследований входило:

1 Изучить влияние температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных и производственных экспериментах.

3 Изучить культурально - морфологические свойства наиболее активного изолята и отработать технологию его выращивания в производственных условиях, с последующим высушиванием на твёрдом носителе.

4 Изучить воздействие термообработки комбикорма на жизнеспособность отобранного штамма и проанализировать его влияние на продуктивность цыплят-бройлеров в промышленных условиях.

Научная новизна

1. В результате выполненной работы впервые получены данные по влиянию различных процессов термообработки комбикорма на сохранность в нём полезных микроорганизмов. Установлены пороговые значения температуры производственных процессов, превышение которых делает использование препарата целлобактерин неэффективным.

Впервые был проведён направленный отбор среди изолятов целлюлозолитических микроорганизмов коллекции ГНУ

ВНИИСХМ, завершившийся выделением наиболее ферментативно-активных и термостойких штаммов. 3. Впервые изучено влияние целлюлозолитических бактерий рода Bacillus на продуктивность сельскохозяйственной птицы.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены:

• на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке" (г. Санкт-Петербург, 30 окт. 2001 г);

• на региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (г. Саратов, 26-27 марта 2002 г);

• на II международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России — ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубровицы, 29 сентября 2003 г);

• на III научно-практической конференции «Перспективные 0 направления в производстве и использовании комбикормов и балансирующих добавок» (Дубровицы, 17 декабря 2003 г);

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 9 печатных работах.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения,

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Проворов, Евгений Леонидович

Выводы

1. Из лабораторных и производственных экспериментов по изучению влияния температурного воздействия на сохранность препарата целлобактернн следует, что при повышении температуры обработки комбикорма выше 75°С гибель целлюлозолитических и молочнокислых бактерий достигает критических значений, а следовательно, использование препарата становится нецелесообразным.

2. В результате скрининга штаммов целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, для дальнейшего изучения был отобран штамм под №1-85. Он показал наилучшую ферментативную активность — 19% убыли натуральной целлюлозы через 72 часа инкубирования и высокую сохранность жизнеспособных клеток при прогревании культуры на жидкой питательной среде до 90°С - 6,71 ±0,74 lgKOE/мл.

3. Изучена морфология клеток бактерий отобранного штамма, характер их роста на различных питательных средах, потребности в питательных веществах и биохимическая активность. По совокупности этих признаков штамм был идентифицирован как Bacillus pantothenticus №1-85. Путём постановки биологических проб на лабораторных животных не было выявлено патогенных и токсинпродуцирующих свойств у изучаемого штамма.

4. Изучены технологические аспекты культивирования Bacillus pantothenticus №1-85 на лабораторной и производственных питательных средах различного состава. Показано, что минерально-шротовая среда является оптимальной для выращивания данных микроорганизмов в промышленных условиях. Через 24 часа культивирования количество жизнеспособных термоустойчивых спор в 1 мл среды составляет 4,63±0,67 lgKOE/мл и в дальнейшем значительно не увеличивается.

5. Отработана технология высушивания культуры Bacillus pantothenticus №1-85 на разных носителях растительного происхождения. Высушивание в кипящем слое позволяет сократить продолжительность процесса в 7 - 10 раз по сравнению с конвекционной сушкой. Количество микроорганизмов перенёсших высушивание составляет 7,9 — 8,3 IgKOE/r. Не обнаружено достоверного влияния вида носителя, а также метода, температуры и продолжительности высушивания, на эту величину. Наиболее удобными в использовании оказались подсолнечниковый шрот и пшеничные отруби.

6. При включении в рацион цыплят-бройлеров культуры бактерий Bacillus pantothenticus №1-85, в дозе 4,24±0,07 IgKOE/r, снижение затрат корма на единицу привеса варьировало в пределах 7 - 22% по сравнению с контролем. При сравнении влияния пробиотика целлобактерин, ферментного препарата целловиридин Г20х и изучаемого штамма на зоотехнические показатели бройлеров, у птиц, получавших штамм Bacillus pantothenticus №1-85 была зафиксирована наибольшая живая масса в конце эксперимента (на 5,9% выше контрольной), а также наилучшие показатели переваримости протеина и сухого вещества рациона. При этом процент переваренной клетчатки был выше у цыплят, получавших ферментный препарат.

7. Выявлено, что экспандирование комбикорма, содержащего штамм Bacillus pantothenticus №1-85 в количестве около 4 IgKOE/r, в температурном диапазоне 70° - 105°С не приводит к заметному снижению численности бактерий. Последующее хранение комбикорма в течение 1 месяца (по ГОСТ Р 51850) не оказывает отрицательного воздействия на сохранность микроорганизмов.

Практические предложения:

Использование препарата целлобактерин-Т, созданного на основе целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus №1-85 позволяет сохранять продуктивность бройлеров на высоком уровне при кормлении их низкопитательным рационом.

Возможность включения препарата в состав гранулированных комбикормов, непосредственно на комбикормовом заводе, позволит заранее корректировать их состав, снижать затраты труда и повышать рентабельность производства.

Заключение

С момента рождения желудочно-кишечный тракт животных и птиц заселяется различными микроорганизмами. Постепенно между ними складываются сложные симбиотические взаимодействия. Нормальная кишечная микрофлора оказывает влияние на активность физиологических процессов животного - хозяина, регулирует его взаимоотношения с окружающей средой. В зависимости от типа питания макроорганизма меняется качественный и количественный состав его микрофлоры.

В условиях интенсивного промышленного содержания животные и птицы подвергаются систематическим стрессовым воздействиям. Это отрицательно сказывается на их здоровье и продуктивности. Рациональное кормление является одним из ведущих факторов на пути к получению качественных и недорогих продуктов животноводства. Использование рационов, содержащих большое количество легкодоступных питательных веществ, экономически неоправданно, а также приводит к нежелательным сдвигам в составе микробного населения кишечника, что может явиться причиной высокой заболеваемости поголовья. С другой стороны, кормление животных и птицы кормами, богатыми клетчаткой и другими труднопереваримыми растительными полимерами не позволяет получить от них достаточного количества продукции.

Основным подходом, направленным на решение возникающих противоречий является использование разнообразных добавок, корректирующих процессы пищеварения.

Наша работа была направлена на создание микробного препарата на основе целлюлозолитических микроорганизмов, предназначенного для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта животных.

В связи с тем, что большинство кормов в настоящее время подвергается различным видам термообработки (экспандированию) и выпускается в форме гранул, основным требованием, предъявляемым к целлюлозолитическим бактериям, наряду с высокой ферментативной активностью, была их способность выдерживать нагревание. Такие биологические особенности штамма позволят включать его в состав комбикормов при их изготовлении и тем самым оптимизировать процесс дозировки препарата и снизить затраты труда на производстве.

В кормлении животных и птицы применяется препарат пробиотик целлобактерин, созданный сотрудниками ГНУ ВНИИСХМ, на основе ассоциации целлюлозолитических бактерий, выделенных из рубца жвачных животных. На первом этапе работы в лабораторных и производственных экспериментах была изучена способность препарата переносить нагревание. Полученные данные показали, что его использование оправдано в тех случаях, когда температура кормовой смеси не превышает 75°С. При дальнейшем нагревании была отмечена массовая гибель микроорганизмов. В производственных условиях корма чаще всего экспандируются при 90° и 105°С, а следовательно, включение в их состав целлобактерина не представляется нам целесообразным.

Полученные данные явились предпосылкой для поиска целлюлозолитических бактерий, обладающих высокой ферментативной активностью и способных выдерживать значительное повышение температуры. Нами был проведён анализ имеющихся в лаборатории сведений об активности изолятов целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ. На его основе было отобрано 6 наиболее активных штаммов и проведена сравнительная характеристика их способности лизировать натуральную целлюлозу, а также переносить нагревание. По совокупности этих свойств лучшим был признан штамм под №1-85, выделенный из рубца крупного рогатого скота.

Следующий этап работы был посвящён изучению культурально-морфологических свойств бактерий штамма №1-85. По их совокупности, при помощи определителя бактерий Берги («Определитель бактерий Берги», 1997) и частотной матрицы, предложенной Беркли с соавт. (Berkeley et al., 1984), исследуемый штамм с вероятностью 97% был идентифицирован как Bacillus pantothenticus №1-85.

Итак, был отобран штамм, по ряду признаков перспективный для дальнейшей работы. Однако прежде чем изучать технологические аспекты его культивирования, необходимо было убедиться в отсутствии у него патогенности и способности к образованию токсинов. С этой целью был проведён ряд экспериментов на табельных лабораторных животных — белых мышах. Суть их заключалась в подкожном и внутрибрюшинном заражении мышей разными количествами микробных тел штамма №1-85, а также в парентеральном введении им бесклеточного фильтрата 2-х недельной бульонной культуры Bacillus pantothenticus №1-85. В результате опытов не было обнаружено патогенности штамма Bacillus pantothenticus №1-85, и его способности продуцировать токсины.

Для того чтобы включать заданное количество бактерий в рацион бройлеров, необходимо было отработать технологию культивирования штамма на дешёвой питательной среде, а затем перевести микробные клетки в состояние, обеспечивающее сохранение их жизнеспособности в течение определённого времени. Нами были изучены параметры роста Bacillus pantothenticus №1-85 на лабораторной и производственных питательных средах и составлены кривые роста штамма. Наиболее приемлемой для культивирования бактерий в промышленных условиях оказалась минерально-шротовая производственная среда. Такие моменты, как непродолжительная лаг-фаза, последующий затем интенсивный рост, обеспечивающий высокий титр бактерий в начале стационарной фазы, делают её наиболее привлекательной для использования. Показано, что временем культивирования штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на этой среде, необходимым для начала спорообразования, является 18 часов, а уже к 24 часам количество термостойких спор составляет 4,63 lgKOE/мл. Дальнейшее продолжение инкубирования представляется нам нецелесообразным, так как заметного увеличения количества термостабильных спор при этом не происходит.

При изучении особенностей высушивания 24-часовой культуры Bacillus pantothenticus №1-85, на трёх субстратах растительного происхождения, наиболее подходящими были признаны подсолнечниковый шрот и пшеничные отруби. Независимо от метода сушки (конвекционная или сушка в кипящем слое) удавалось добиться высокого содержания жизнеспособных спор в конечном продукте — около 8 lgKOE/r, что сопоставимо с титром культуральной жидкости. В то же время её десятиминутное прогревание показало, что к 24 часам термостойкие споры составляют лишь 4,63 lgKOE/мл от общего количества клеток. Следовательно, вторую половину клеточного урожая составляют незрелые и неустойчивые к нагреванию споры и вегетативные клетки на разных стадиях дифференцировки. Однако процессы сушки не оказывали на них губительного воздействия.

Сведения о параметрах культивирования и высушивания штамма Bacillus pantothenticus №1-85 легли в основу разработки технического регламента на производство нового препарата.

Научно-производственные эксперименты, выполненные на цыплятах-бройлерах, получавших низкопитательный рацион с повышенным содержанием растительной клетчатки, позволили выявить положительное влияние изучаемого штамма на показатели продуктивности птицы. Оказалось, что наиболее эффективно усваивают корма цыплята, в рационе которых содержатся бактерии штамма Bacillus pantothenticus №1-85 в количестве 4,24 lgKOE/r. Статистически достоверное увеличение эффективности использования кормов в таких опытных группах по сравнению с контрольными колеблется от 7 до 22%.

Отмечено также, что такие группы птиц отличаются набольшей сохранностью поголовья (100%).

В эксперименте на бройлерах кросса «Конкурент-2» провели сравнительную оценку влияния Bacillus pantothenticus №1-85, ферментного и микробиологического препаратов на показатели переваримости и использования питательных веществ рациона. Птицы, получавшие в качестве добавки бактерии штамма №1-85 лучше всего переваривали протеин и сухое вещество, а кроме того, имели самую высокую живую массу в конце опыта, что говорит об эффективном использовании валовой энергии. Интересно, что высокие показатели переваримости протеина, зафиксированы у них на фоне среднего значения переваримости клетчатки, по сравнению с другими группами. Возможно, наряду с целлюлазами Bacillus pantothenticus №1-85 продуцирует ряд ферментов вторичного метаболизма, способствующих повышению доступности питательных веществ рациона для животных с однокамерным желудком.

Изначально при скрининге штаммов целлюлозолитических бактерий учитывали их способность переносить нагревание. Такое свойство некоторых микроорганизмов приобретает значение при необходимости их использования в условиях связанных со значительным повышением температуры окружающей среды. В нашем случае необходимо было изучить выживаемость Bacillus pantothenticus №1-85 при их включении в состав кормовых смесей, подвергаемых различным видам термообработки. Ряд опытов, проведённых на Белгородском экспериментальном заводе рыбных комбикормов показал, что при экспандировании и гранулировании кормов, проводимом в температурном диапазоне от 70° до 105°С, количество Bacillus pantothenticus №1-85 не опускается ниже 4 IgKOE/r. Такие потери являются вполне приемлемыми с точки зрения обеспечения оптимального содержания микроорганизмов в рационе птицы, и позволяют использовать штамм в производстве гранулированных кормовых смесей.

За месячный период хранения комбикорма, регламентируемый ГОСТ Р 51850, численность бактерий штамма №1-85 снижается относительно исходной величины в пределах среднестатистической ошибки, следовательно хранение кормов не оказывает отрицательного воздействия на сохранность в них бактерий штамма №1-85.

Результаты настоящей работы легли в основу разработки технологии производства и применения ферментативного пробиотика целлобактерин-Т, повышающего продуктивность бройлеров и пригодного для включения в состав гранулированных кормовых смесей. Новый препарат прошёл этап регистрации в Департаменте Ветеринарии при Министерстве сельского хозяйства Российской Федерации и находится в стадии широких производственных испытаний.

На изобретение «Штамм бактерий Bacillus pantothenticus 1-85 для использования в гранулированных кормах» получен патент №2235772 от 10 сентября 2004 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Проворов, Евгений Леонидович, Санкт-Петербург

1. Аджигирова Е.В. Использование кормовых ферментных препаратов при выращивании цыплят-бройлеров: Автореф. на соиск. уч. степ, к.с.х. наук.- Краснодар, 2001. - 20 с.

2. Актуальные проблемы применения биологически активных веществ и производства премиксов/ Околелова Т.М., Кулаков А.В., Молоскин С.А., Грачёв Д.М. Сергиев Посад. 2002 -282 с.

3. Ветеринарная лабораторная практика/ Под ред. И.Г.Усачёва и А.М.Ярных, Том 1. М. 1963 - С.567.

4. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и сообщества. М. 1989 248 с.

5. Доусон Карл А., Трикарико X. Живая дрожжевая культура И-САК1026™ краеугольный камень успешного использования культурных рас дрожжей в качестве усилителя рубцового пищеварения у жвачных// Сб. трудов 19-го ежегодного лекц. тура комп. Оллтек, 2002. - С.52.

6. Киселёва Н., Лаптев Г., Солдатова В. Использование Целлобактерина в птицеводстве// Комбикорма. 2000. - №5. — С.39.

7. Киселёва Н., Лаптев Г., My дрова Ю. Подсолнечниковый шрот в кормлении бройлеров// Животн. России. 2001. - №9. — С.43.

8. Кичеева Т. Изучение действия стресс-фактора на организм молодняка кур// Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве.-1997.-№ 2. С.20.

9. Корма и ферменты/ Околелова Т.М., Кулаков А.В., Молоскин С.А., Грачёв Д.М. Сергиев Посад. 2001 - 111 с.

10. Кормление сельскохозяйственной птицы// Фисинин В.И., Егоров И.А., Околелова Т.М., Имангулов Ш.А. Сергиев Посад, 2001 - 360 с.

11. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника// Вестн. РАМН. — 1996.-№ 2. С.60.

12. Косолапое В.М., Косолапова В.Г., Мухамадьярова A.JL Переваримость питательных веществ при добавлении в рацион молодняка крупного рогатого скота пробиотика реалак// Сельскохозяйственная биология. 2003. - №2.

13. З.Костин А.П., Мещеряков Ф.А., Сысоев А. А. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: 1983 450 с.

14. Н.Коштоянц Х.С. Основы сравнительной физиологии. Л.: 1951 —420 с.

15. Краткий определитель бактерий Берги/ Под ред. Дж. Хоулта. М.: 1997-495 с.

16. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора. М.: Медицина, 1976-270 с.

17. Курцин И.Т. Механорецепторы желудка и работа пищеварительного аппарата. Л.: 1952 351 с.

18. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1972 310 с.

19. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. Школа, 1980-291 с.

20. Лаптев Г.Ю., Эрнст Л.К., Солдатова В.В. Интородукция целлюлолитичсеких бактерий в рубец крупного рогатого скота для повышения переваримости клетчатки// Сельскохоз. Биолог. 1994. -№4.- С.34.

21. Лаптев Г., Солдатова В., Баранихин А., Винокурова Т. Целлобактерин пробиотик, повышающий удои// Животноводство России. - 2003. - №10. - С.23.

22. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты// Ветеринария 2001. - № 1. - С.27.

23. Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. диссер. на соискание степени доктора б.н. -Москва, 2002. 28 с.

24. Мечников И.И. Сорок лет искания рационального мировоззрения // Акад. собр. соч. М.: Гос. изд.-во медицинской литературы. 1954. Т. 13.-С.7.

25. Микробные ферменты и биотехнология/ Под ред. В.М. Фогарти. -М. 1986 С.154.

26. Павлов И.П. Полное собрание сочинений. М.: 1951. Т.2. кн. 1-2. С.592.

27. Панин А.Н., Малик Н.И., Степаненко И.П. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Уралбиовет. 2002. - №2-3.

28. Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвачных. М.: 1982.

29. Пирс Дж. Ферменты в кормлении птицы// Сб. трудов 19-го ежегодного лекц. тура комп. Оллтек. 2002, С. 18.

30. Попова Т.С., Шрамко Л.У. Нутрицевтики и пробиотики в лечении синдрома кишечной недостаточности и нормализации микробиоценоза кишечника// Клин. мед. 2001. - №4. С.4.

31. Практикум по микробиологии/ Под ред. М.С. Егорова. М. 1976.

32. Проворов Е.Л., Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В. Введение в желудочно-кишечный тракт бройлеров ассоциаций целлюлолитических бактерий// Мат. 1-ой per. конф. мол.уч. «Стратегия взаимодействия микроорг. с окр. средой» февраль 2002 г. Саратов, 2002. С.36.

33. Рекомендации по кормлению сельскохозяйственной птицы// Ш.А. Имангулов и др. Сергиев Посад. 2000 - С. 19.

34. Родионова, Безбородов. О локализации систем ферментов// Прикл. Биохимия и микробиология. 1997. - №5 - С.467.

35. Саубенова М.Г. Использование целлюлолитических бактерий в кормопроизводстве// Прикл. Биохим. и Микроб. 1998. - №34(1). -С.91.

36. Смирнов В. В. Антибиотики и/или пробиотики: размышления и факты// Лкування та Д1 агностика. — 1998. №2. - С.8.

37. Смирнова И.Э., Саубенова М.Г. Целлюлозолитические азотфиксирующие бактерии для обогащения белком грубых кормов// Прикл. Биохим. и Микроб. 2001. - №37(1). С.86.

38. Сысоев А.А. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1980.

39. Тараканов Б.В. Использование пробиотиков в животноводстве. Калуга.: ВНИИФиП с/х животных, 1998.

40. Тихомиров Д.Ф., Фетисова В.В., Симанькова М.В., Клёсов А.А. Эндо-1,4,-Р-глюканаза анаэробной термофильной бактерии

41. Clostridium thermocellum в условиях распада мультиферментных кластеров// Биохимия. 1988. - №5. - С.758.

42. Уголев A.M., Иезуитова Н.Н., Тимофеева Н.М. Физиология мембранного (пристеночного) пищеварения. Физиология пищеварения. JL: 1974 С.542.

43. Ушакова Н.А., Белов Л.П., Варшавский А.А., Козлова А.А., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. Расщепление целлюлозы при дефиците азота бактериями, выделенными из кишечника растительноядных позвоночных// Микробиология. — 2003. -№3.-С.400.

44. Чахава О.В. Гнотобиология. М., 1972.

45. Челиева В.В., Манвелова М.А. Антиопухолевое и иммуномодулирующее действие бифидобактерий// Сб. н. тр.: «Мед. аспекты микробной экологии». М., 1994, С.82.

46. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты// Вопр.питания. 1999. - №2. - С.32.

47. Шендеров Б.А. Антибиотики и химиотер. 1990. - №35. С.2.

48. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Функциональное питание и пробиотики. М.: 1997.

49. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и её функции. М.: Грантъ, 1998.

50. Шубин А.А., Шубина Л.А. Бифилакт-А препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней телят и ягнят// Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук. - 1993. - №5. -С.53.

51. Эрнст Л.К., Лаптев Г.Ю., Солдатова В.В. Комплексный препарат -пробиотик для стимуляции процессов пищеварения// Мат. международной конф. «Биологические основы высокойпродуктивности сельскохозяйственных животных», 4.1. Боровск, 1991: С.137.

52. Apajalahti J., Bedford M.R. Improve bird performance by feeding its microflora// World Poultry-Elsevier. 1999.- Vol.15, №2. P.20.

53. Bayer E.A., Setter E., Lamed R. Organization and Distribution of the Cellulosome in Clostridium thermocellum// J. of Bact. 1985. - P.552.

54. Bedford MR, Classen HL, Campbell GL. The effect of pelleting, salt, and pentosanase on the viscosity of intestinal contents and the performance of broilers fed rye// Poult. Sci. 1991. - Vol.70, N7. P. 1571.

55. Bedford M.R. Interactions Between Ingested Feed and the Digestive System in Poultry// J. Appl. Poultry Res. 1996. - Vol.5, N86. P.95.

56. Bedford M.R. The Effect of Enzymes on Digestion// J. Appl. Poultry Res. 1996. Vol.5. P.370.

57. Beguin P. et al. Bacterial cellulaces// Biochem. Soc. Transact. 1992. Vol.20, N1.P.42.

58. Benemann J.R. Nitrogen fixation in termites// Science. 1973. Vol. 181. P.4095.

59. Berkeley R.C.W., Logan N.A., Shute L.A., Capey A.G. Identification of Bacillus species// Methods in Microbiol. 1984. Vol.16. P.291.

60. Blomberg L.A., Henriksson and P.L. Conway. Ingibition of adhesion of Escherihia coli K88 to piglet ileal mucus by Lactobacillus spp// App. Environ. Microbiol. Vol.59. P.34.

61. Bohnhoff N, Drake BL, Muller CP. Effect of streptomycin on susceptibility of the intestinal tract to experimental salmonella infection// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. Vol.86. P.132.

62. Breznak J.A., Brill W.J., Mertins J.W., Coppel H.C. Nitrogen fixation in termites// Nature 1973. - Vol.244, № 5418. P.577.

63. Bujnakova D, Kmet V. Aggregation of animal lactobacilli with 0157 enterohemorragic Esherichia coli// J. Vet. Med.B.Infect.Dis.Vet.Public Health. 2002. - Vol.49, N3. P.152.

64. Carr J.G. Microbes I have known: A study of those associated with fermented products// J. Appl. Bacteriol. 1983. - Vol.55. P.383.

65. Carre C. Ueber Antagonisten unter den Bacterien// Correspondenz-Blatt fuer Schweizer Aerzte. 1887. - Vol.17. P.385. (in German).

66. Coates M.E., Fuller R. Gnotobiotic animal. Microbial Ecology of the Gut/ Eds. R.T.J. Clarke, T. Bauchop. San Francisko, 1977. P.307.

67. Collins FM, Carter PB. Growth of salmonellae in orally infected germ free mice// Infect. Immun. 1978. - Vol.21. P.41.

68. Conly JM, Stein K. The production of menaquinones (vitamin K2) by intestinal bacteria and their role in maintaining coagulation homeostasis// Prog. Food Nutr. Sci. 1992. - Vol.16, N4. P.307.

69. Farmer RE. Inhibitory effect of yoghurt components upon to the proliferation of ascites tumor cells// J. Dairy Sci. 1987. - Vol.58. P.787.

70. Ferket P.R. Managing gut health in world without antibiotics// Proceedings from Altech's 17 th European, Middle Eastern and African Lecture Tour. -2003. P. 19.

71. Fuller R. Probiotics in man and animals// J. Appl. Bacteriol. 1989. -Vol.66. P.365.

72. Freter R. The fatal enteritic cholera infection in the guinea pig// Bacteriol. Proc.-1954.-Vol.56.

73. Freter R. Factors affecting the microecology of the gut. In: Probiotics, the scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992: P.l 11.

74. Goldin B.R., Gorbach S. Am. J. Clin. Nutr. M. 1984. P.756.

75. Green M., Starzl Т.Е., Reyes J., Fung J.J., Abu-Elmagd K., Cicalese L., Sileri P. Bacterial Translacation In Clinical Intestinal Transplantation// Transplantation Proceedings. 2000. - Vol.32, N6. P. 1210.

76. Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease// Lancet. -2003. Vol.8, N361(9356). P.512.

77. Hackstein J.H.P., Langer P., Rosenberg J. Genetic and evolutionary constraints for the symbiosys between animals and methanogenic bacteria// Environmental Monitoring and Assessment. — 1996. Vol.42. P.39.

78. Hara Т., Veda S. Regulation of polyglutamate production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of high PGA productivity// Agric. Biol. Chem. 1982. - Vol.46. P.2275.

79. Havenaar R, Huis In't Veld MJH. Probiotics: a general view. In: Lactic acid in health in disease. Vol 1. Amsterdam: Elsewier Applied Science Publichers, 1992.

80. Hollister,A.G., Corner D.E., Nisbet D.J. and J.R. DeLoach. Effects of chicken-derived caecal microorganisms maintained in continuous cultureon caecal colonization by Salmonella thyphumurium in turkey poults// Poultry Sci. Vol.78. P.546.

81. Hooper Lora V. and Gordon Jeffrey I. Commensal host-bacterial relationships in the Gut// Science. Vol.292. P.l 115.

82. Hungate R.E. The rumen and its microbes. New York, Academic press, ed.3., 1966.

83. Jadamus A, Vahjen W, Simon O. Growth behavior of a spore forming probiotic strain in the gastrointestinal tract of broiler chiken and piglets// Arch. Tierenahr. -2001. Vol.54, N.l. P.l.

84. Kindberg C, Suttie JW, Uchida K, Hirauchi K, Nakao H. Menaquinone production and utilization in germ-free rats after inoculation with specific organisms// J. Nutr. 1987. - Vol. 117, N6. P.l 032.

85. Kmet, V., M.L. Callegari, V. Bottazzi, and L. Morelli. Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains// Lett. Appl.Microbiol. 1995.- Vol.21. P.351.

86. Kmet, V., and F. Lucchini. Aggregation-promoting factor in human vaginal Lactobacillus strains// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. Vol. 19. P.l 11.

87. Kmet, V., F. Lucchini. Aggregation of sow lactobacilli with diarheagenic Echerichia coli// J. Vet. Med. 1999 - Vol.46. P.683.

88. Lamed R., Naimark J., Morgenstern E., Bayer E.A. Specialized cell Surface Structures in Cellulolytic Bacteria// J. of bact. 1987. - P.3792.

89. Lilly DM, Stillwell RH. Probiotics. Growth promoting factors produced by microorganisms// Science. 1965. - Vol.147. P.747.

90. McCroarty J. A., and Reid G. Detection of Lactobacillus substance that inhibits E.coli// Can.J. Microbiol. 1988. - Vol.34. P.974.

91. McDonald P., Edwards R.A., Greenhalgh J.F.D., Morgan C.A. Animal Nutrition. Fifth Edition. Longman, 1995. - P. 153,175.

92. Molin G. Probiotics in foods not containing milk or milk constituents, with special reference to Lactobacillus plantarum 299v// Am.J. Clin. Nutr.-2001.-Vol.73. P.380.

93. Nagaraja T.G., Chengappa M.M. J. Anim. Sci. 1998. - Vol.76. P.287.

94. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of use of Bacillus species in animal nutrition. SCAN report// Europ. Commission health & consum. protection direct.- 2000. (http://www.europa.eu.int/).

95. Owens F.D., Secrist D.S., Hill W.J., Gill D.R. J. Animal. Sci. -1998.-Vol.76. P.275.

96. Parker RB. Probiotics, the other half of the antibiotic story// Anim. Nutr. Health. 1974. - Vol.29. P.4.

97. Perdigon G., Alvarez S. and A. Pesce de Ruiz Holdago. Immunoadjuvant activity of oral Lactobacilus casei: influence of dose on the secretory immune response and protective capacity in intestinal infections//J. Dairy Res. 1991. - Vol.58. P.485.

98. Pestova M.I., Clift R.E.,Viskers R.J., Franklin M.A. and Mathew A.G. Effect of weaning and dietary galactose supplemenation on digesta glycoproteins in pigs// J.Sci.Food Agric. 2000. - V.80. P.1918.

99. Pouwels, P.H., Leer,R.J. Boersma, W.J. The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization: development and preliminary chara// J. Biotechnolog. 1996. - Vol.44. P. 183.

100. Prokesova L. Effect of Bacillus firmus on antibodi formation after mucosal and parenteral immunization in mice// Immunol. Lett. 1998. -Vol.64, N2. P. 161.

101. Procesova L. Immunostimulatory effect of Bacillus firmus on mouse lymphocytes// Folia Microbiol (Praha). 2002. - Vol.47, N2. P.193.

102. Puvadolpirod S, Thaxton JP. Model of physiological stress in chickens. Digestion and metabolism// Poult. Sci. — 2000. Vol.79, N3. P.383.

103. Ramotar K, Conly JM, Chubb H, Louie TJ. Production of menaquinones by intestinal anaerobes// J. Infect. Dis. 1984 - Vol.150, N2. P.213.

104. Ravindran V, Selle PH, Ravindran G, Morel PCH, Kies AK, Bryden WL. Microbial phytase improves performance, apparent metabolizable energy, and ileal amino acid digestibility of broilers fed a lysine-deficient diet//Poult. Sci.-2001.-Vol.80, N3. P.338.

105. Reid G., J.A. McCroarty, R. Amgotti, and R.L.Cook. Lactobacillus inhibitor production against E.coli and coaggregation ability with uropatogenes//Can. J. Microbiol. 1998. - Vol.138. P.763.

106. Renondo-Lopez. V., R.I. Cook, and J.D.Sobel. Emerging role of lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora// Rev. Infect. Dis. 1990 - Vol. 12. P.856.

107. Report the Scientific Committee on Animal Nutrition on product Bioplus 2B ® for use as feed additive. SCAN Report. Europ. Commission health & consum. protection direct. 2000. (http://www.europa.eu.int/).

108. Rettger LF, Cheplin HA. A treatise on the transformation of the intestinal flora with special reference to the implantation of bacillus acidophilus. London, 1921.

109. Rettger LF, Levi MN, Weinstein L. Lactobacillus acidophilus and its therapeutic application. London, 1935.

110. Roy, D., Chevalier P., Ward P. and Savoie L. Sugars fermented by Bifidobacterium infantis ATSS 27920 in relation to grow and alpha-galactosidase activity// Appl. Microbiol. Biotech. 1991. - Vol.34. P.653.

111. Russel J.B., Wilson D.B. J. Dairy Sci. 1996. - Vol.79. P. 1503.

112. Russel J.B., Rychlik J.L. Factors That Alter Rumen Microbial Ecology// Science. -2001. Vol.292. P.l 119.

113. Salminen S. Uniqueness of probiotic strains// IDF Nutr. News Lett. -1996.-Vol.5. P. 16.

114. Schaafsma G. State of art concerning probiotic strains in milk products// IDF Nutr. News. Lett. 1996.-Vol.5. P.23.

115. Shapiro F, Nir I. Stunting syndrome in broilers: effect of age and exogenous amylase and protease on performance, development of the digestive tract, digestive enzyme activity, and apparent digestibility// Poult. Sci. 1995. - Vol.74, N12. P.2019.

116. Shapiro F, Nir I. Stunting syndrome in broilers: physical, physiological, and behavioral aspects// Poult. Sci. 1995. - Vol.74, N1. P.33.

117. Shirakawa H, Komai M, Kimura S. Antibiotic-induced vitamin К deficiency and the role of the presence of intestinal flora. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1990. - Vol.60, N3. P.245.

118. Shrezenmeir J., M. de Verse. Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaching a definition// Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - Vol.73. P.361.

119. Sohail SS, Roland DA Sr. Influence of supplemental phytase on performance of broilers four to six weeks of age// Poult. Sci. 1999.-Vol.78, N4. P.550.

120. Sorokulova I.B. Effect of probiotics from bacilli on macrophage functional activity// Antibiot Khimioter. 1998.- Vol.43, N2. P.20.

121. Sperti GS. Probiotics. West point. Avi Publiching Co, 1971.

122. Stenback A, Meurling S, Lundholm M, Wallander J, Johnsson C. Bacterial translocation from defunctionalized rat small bowel// Clin. Exp. Med. 2001. - Vol. 1N2. P. 113.

123. Szabo J, Salyi G, Rudas P. Effect of malabsorption syndrome on pancreatic function in broilers// Poult. Sci. 1989. - Vol.68., N11. P.1553.

124. Tankson JD, Vizzier-Thaxton Y, Thaxton JP, May JD, Cameron JA. Stress and nutritional quality of broilers// Poult. Sci. 2001 - Vol.80., N9. P.1384.

125. Tannock G.W. Probiotics: A critical review Chapter Abstracts// Horizon Scientific Press, 1998. ('http://www.horizonpress.com4)

126. Tissier H. Taxonomy and ecology of bifidobacteria// Bifidobacteria Microflora. 1984. Vol.3., N11. P.28.

127. Tsujisaka, Y., Okumura, S. & Iwai, M. Biochimica et Biophysica Acta, 1977. в кн.: «Микробные ферменты и биотехнология» (под ред. В.М. Фогарти).М., 1986.

128. Vranjes Vukic М. & Wenk С. Influence of Trichoderma viridae Enzyme Complex on Nutrient Utilization and Performance of Laying Hens in Diets With and Without Antibiotic Supplementation// Poultry Science. 1996. -Vol.75. P.551.

129. Wood T. Microbial enzymes involved in the degradation of the cellulose component of plant cell walls// Annual report. The Rowett Research Institute, 1992.

130. Zanini SF, Sazzad MH. Effects of microbial phytase on growth and mineral utilisation in broilers fed on maize soyabean-based diets// Br. Poult. Sci. 1999. - Vol.40., N3. P.348.

131. Состав комбикорма ПК-5, использованного на АО «ГППЗ Большевик» для кормления бройлеров от 5 до 30 дней*1. Наименование %1. Кукуруза 20,001. Пшеница 42,81

132. Шрот подсолнечный 36-40% 6,801. Шрот соевый сп>46% 19,401. Мука рыбная 68% 6,001. Масло растительное 1,901. Лизин 78% 0,031. Метионин кормовой 0,161. Известняковая мука 0,101. Соль поваренная 0,10

133. Углеводно-минеральная добавка 1,001. Фосфат обесфторенный 1,201. Премикс П5-1 0,50

134. Показатели качества комбикорма ПК-5*

135. Наименование Единица измерения Значение

136. Данные приведены на основании удостоверения о качестве комбикорма ЗАО «Гатчинский ККЗ» от 16.10.2002

137. Состав комбикорма ПК-6, использованного на АО «ГППЗ Большевик» для кормления бройлеров от 31 до 56 дней**1. Наименование %1. Пшеница 52,391. Ячмень без плёнок 15,00

138. Шрот подсолнечный 36-40% 15,00

139. Шрот соевый сп>41-45% 4,001. Мука рыбная 68% 6,801. Масло растительное 4,501. Лизин 78% 0,161. Метионин кормовой 0,111. Известняковая мука 0,501. Соль поваренная 0,141. Фосфат обесфторенный 0,901. Премикс П6-1 0,50

140. Содержание витаминов и микроэлементов в 1 кг комбикорма ПК-6**

141. Показатели качества комбикорма ПК-6**

142. Наименование Единица измерения Значение

143. Данные приведены на основании удостоверения о качестве комбикорма ЗАО «Гатчинский ККЗ» от 03.12.2002

144. Компонентный состав и содержание питательных веществ в комбикорме, использованном для кормления бройлеров кросса1. Конкурент-2»***

145. Наименование, % 1-4 недели 5-7 недель1. Кукуруза 10,0 0,01. Пшеница 42,6 44,01. Ячмень 10,0 13,5

146. Жмых подсолнечный 15,0 25,01. Шрот соевый 6,0 0,01. Мука рыбная 68% 4,0 2,01. Мясокостная мука 2,0 2,01. Глютен кукурузный 5,0 4,0

147. Масло подсолнечное 3,0 6,01. Лизин HCL 0,33 0,601. Метионин DL 0,11 0,10

148. Известняковая мука 0,8 1,61. Соль поваренная 0,20 0,20

149. Трикальций фосфат 1,0 0,50

150. Премикс витаминно-минеральный 0,50 0,501. Итого 100,0 100,0

151. В 100 гр комбикорма содержится, %

152. Обменной энергии, Ккал 299,0 310,41. Сырого протеина 21,0 20,41. Сырой клетчатки 4,03 4,731. Кальция 1,04 1,091. Фосфора общего 0,76 0,711. Натрия 0,25 0,221. Лизина 1,12 1,08

153. Данные приведены на основании отчёта ГНУ ВНИИТИП

154. Открытое акционерное общество

155. Белгородский экспериментальный завод рыбных комбикормов »309300. РФ,Белгородская обл., Ракитянский р-н, п.Пролетарский, Борисовское шоссе, 1

156. Телефоны: (07245) 3-58-48 ; 3-50-19 ; 3-54-29 ; 3-53-24. Факс: 5-57-741. На №1. АКТо результатах производственного испытания препарата пробиотика1. Целлобактерин -Т"

157. Кормление птицы на мясном откорме рационами с вводом препарата "Целлобактерин -V приводило к улучшению экономических показателей: снижение конверсии корма, увеличению процента сохранности и росту среднесуточного привеса.

158. Можно рекомендовать использование пробиотика "Целлобактерин -Т" для ввода в рецепты в комбикорма, вырабатываемые методами гранулирования и экспандирования.

159. Заместитель генерального директорСП^П!/ по ресурсам1. О • JMjl1. Главный технолог 1

160. И.с. Вергун Г.С. Головлева

Информация о работе

Проворов, Евгений Леонидович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Создание препарата для сельскохозяйственных животных на основе штамма термостойких целлюлозолитических бактерий Bacillus pantothenticus ь1-85 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы