Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и анализ Pst I библиотеки ДНК для ПДРФ картирования генома ржи (Secale cereale L. )

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Создание и анализ Pst I библиотеки ДНК для ПДРФ картирования генома ржи (Secale cereale L. )"

r АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ' Институт генетики и цитологии

На правах рукописи

Корзун Виктор Николаевич

СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ Pst I БИБЛИОТЕКИ ДНК ДЛЯ ПДРФ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМА РКИ ( Socale coro al о L.)

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каук

Ыинск - 1994

Работа выполнена в Институте генетики и цитологии Академии наук Беларуси

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент АН Беларуси Е А. Картель

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук

С. С. Малюта

доктор биологических наук И. А. Гордей

Ведущее учреждение - Институт клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины, г. Киев

Защита диссертации состоится " Л " М-^У»1^ 1994 г. в " ¡У" часов на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика в Институте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу: 220734 г. Минск, ул Ф. Скорины, 27

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа АН Беларуси.

Автореферат разослан " ^ " 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат биологических наук ' Е. Е Лобанок

©

Институт генетики и цитологии АН Беларуси, 1994 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Мэлекулярный анализ структурной организации геномов эукариот уа® в течении многих лет является одним из основных направлений молекулярной генетики. Изучение генома с использованием современных методов генетической инженерии позволяет выявлять новые закономерности организации генетического материала, приводит к быстрому накоплению новых данных, способствующих ускоренному развитию исследований, результаты которых могут найти широкое применение в практике. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в совершенствовании методов клонирования и секвениро-вания оте льных фрагментов генома, полиморфизм длины рест-рикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) по-прежнему остается наиболее эффективным методом в изучении генетического полиморфизма. .

Первым и главным условием применения ПДРФ для генетического анализа генома и создания молекулярно-генетических карт растений является наличие гибридизационных зондов (определенных участков молекулы ДНК), которые могут быть получены на основе локусоспецифических последовательностей с низкой степенью повторяемости в геноме или однокопийных участков ДНК.

Необходимость создания библиотеки фрагментов ДНК для картирования генома ржи с помощью ПДРО-анализа вызвана рядом причин:

- ::о-первых, низкой степенью молекулярно-генетической изученности, отсутствием насыщений генетической карты, недостаточно исследованным характером наследования хозяис-твснно-ценных признаков;

- во-вторых, рожь представляет интерес как компонент тритшсале и как культура, обладающая комплексом ценных признаков (зимостойкость, устойчивость к засухе, нетребовательность к почвенным условиям);

- в-третьих, как культура, имеющая важное народно-хозяйственное значение для Восточной и Центральной Европы (особенно для Беларуси).

Цель и задачи исследования. Учитывая отсутствие достаточного количества информативных молекулярных маркеров для картирования генома ржи целью работы явилось создание и анализ геномной Pstl библиотеки ДНК ржи (Seeale cereale L. ) и отбор маркеров, пригодных для картирования геномов злаков.

Для реализации этой цели поставлены следующие задачи:

1. Создание геномной библиотеки ДНК ржи с помощью чувствительной к метилированию цитозина рестриктазы Pst I.

2. Скрининг полученной библиотеки с целью отбора низкокопийных последовательностей ДНК ржи.

3. Хромосомная локализация, картирование и секвенирова-ние отдельных низкокопийных последовательностей ДНК ржи.

4. Использование низкокопийных последовательностей ДНК для молекулярно-генетического картирования генома ржи.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые создана и охарактеризована Pst I геномная библиотека ДНК ржи. Получено более 830 рекомбинантных клонов, из них около 188 проанализировано. Установлено, что 82 (43.6%) клона содержат низкокопийные последовательности ДНК ржи, в т. ч. 10 таких последовательностей локализованы на хромосомах ржи и пшеницы, 2 - картированы на генетической карте генома ржи.

Получена новая информация о структуре и организации отдельных низкокопийных последовательностей ДНК ржи.

Впервые с помощью ПДРФ-зондов пшеницы и ржи картирован ген карликовости ржи ctl.

Отобранные низкокопийные последовательности ДНК ржи могут бьпь использованы для картирования генома Triticlnae.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были прех тавлены на Всесоюзной конференции "Современные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений", Одесса,1991; на IY съезде Белорусского Общества генетиков и селекционеров. Горки, 1992; на YIII Мевдународном Симпозиуме "Генетика пше: ицы", Пекин, 1993; на XVII Международном генетическом конгрессе, Бирмингем, Великобритания, 1993; на международном совещании "Уточнение и дополнение генетической карты ржи", Грос-Люэовиц, Германия, 1993.

По темэ диссертации опубликовано 10 работ (статей и те-Г'.и?оь научных докладов).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, заключения и выбодов, списка литературы; включает 13 таблиц, 22 рисунка. Список литературы содержит 138 библиографических наименований, из них 129 иностранные.

МАТЕРИАЛЫ И 1.3ТОДИ

Объектами исследования в данной работе являлись различные сорта и линии озимой ржи ("Поликроссная-1","Imperial", "Garo Kurz". "Petka","Gülzow Kurz", PC943, PC952, PC361), мутант "Московский карлик"; нулли-тетрзсоьные линии пшеницы "Chinese Spring" (Sears, 1954) и пшеница/рожь дополненные линии "Chinese Spring"/"Imperial" (Driscoll and Sears, 1971), сорта ячменя KM 1192 и E 2009 из коллекций Института генетики и цитологии AHB (Минск, Беларусь) и Института Генетики растений (Гатерслебен, Германия).

Для картирования гена карликовости ctl на 7-ой хромосоме ржи использовали зонд ScBll, отобранный из созданной нами Pstl библиотеки фрагментов ДНК ржи и PSR зонды пшеницы (Chao et al. ,1989; Devos et al., 1992), полученные из JI Centre, Cambridge Laboratory (Norwich, England).

ДНК для ПДРФ анализа выделяли из 4-6 недельных растений с помоеью. фенольного метода в модификации (Sharp et al. 1988). Ферментативную обработку ДНК осуществляли в соответствии с прописями фирм-поставщиков. Клонирование Фрагментов ДНК рг-, бактериальную трансформацию проводили по 1/аниатису (Vanlatis et al., 1982). Отбор малокопийных последовательностей ДНК ржи выполняли после дот-гибридизации с обким ,.рэ-паратом ДНК ржи. Электрофоретическое Фракционирование, перенос ДНК на капроновые фильтры и гибридизацию с 32р - меченным зондом проводили согласно Sharp et al.(19S8). Для получения радиоактивной пробы с высокой удельной активностью использовался метод гекеануклеотидного праймера (Fomberff and Vogelstein, 1983, 1984). Выделение плазмндной ДНК осуществляли методом, основанным на применении СТАВ бу£х?ра (Del Sal G et al., 1988) и целочным методом (Birnboim and Doly,1979). Обработку результатов гибридкзацпонного анализа по картированию генома ржи проводили с помощью программы

"MAPMAKER " (E. S. Lander). Определение первичной нуклеотид-ной последовательности выполняли на автоматическом лазерном секвенаторе (ALF) с помощью М13 универсального и оОратного . праймеров на матрице плазмиды pUC 19 согласно протокола изготовителя секвенатора (Pharmacia LKB). Для обработки результатов секвенирования использовалась программа PC gene. Бэиск гомологичных последовательностей осуществлялся из банка данных CDEM 43 IN (Heidelberg, Germany, 1093 г.)

ЭШШРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУНД0МЕ 1. Создание и анализ геномной Pst I библиотеки ДНК ржи (Secale cerealе)

Одним из важнейших требований ЕДРФ-анализа является наличие низкокопийных ДНК проб, что особенно важно для генетического картирования растений, имеющих большие размеры генома, таких как пшеница, рожь и ячмень, где приблизительно 802 генома состоит из повторяющихся последовательностей ДНК. Выделение клонов, не содержащих повторяющихся последовательностей, может быть проведено путем селективного клонирования и (или) скрининга рекомбинантных ДНК клонов. В нас-' тоящее время в литературе описаны два таких метода:

1) создание кДНК библиотеки;

2) отбор низкокопийных гДНК последовательностей путем пре- и постклональной селекции.

В данном исследовании с помощью чувствительного к метилированию фермента Pst I была создана .и охарактеризована геномная библиотека фрагментов ДНК ржи.

1.1.Цитозин-метилирование ДНК ржи

Рестри\'шя эквивалентных количеств ДНК ржи сорта "Поли-кроссная -1" ферментами Pst I и Eco RI сравнивалась при помогал гель-электрофореза с окрашиванием бромистым этидием. Оба фермента являются шесть-нуклеотид сайг-узнающими и, следовательно, рестрикциогме профили ДНК ржи должны бьггь подобными, за исключением чувствительности к метилированию. Норестриктированная ДНК использовалась как контроль. В результате гидролиза с EcoRI ферментом после электрофореза Сил получен протяженный "шмир" фрагментов ДНК, приблизительно одинаковой интенсивности окрашивания с бромистым

этидием (рис.1, линия 4), в то время как рестрикция с Pst I (рис. 1, линия 3) выявляла профиль, не очень отличающийся от нерестриктированной ДНК, т. е. высокомолекулярный "шмир". Это свидетельствует о том, что большинство последовательностей ДНК ржи цитозин-метилированы и лишь небольшое количество геномной ДНК гидролизует-ся ферментом Pst I. Действительно, у высших растений ДНК метилирована в сайтах CG и CxG и свыше 707. Pst I сайтов должны быть цитозин-метилированы (Gruenbaum et al., 1981).

V

Рис. 1. Ферментативная обработка ДНК ржи: 1 - маркер-Hind III; 2 - нерестриктированная ДНК ржи контроль); 3 - Pst I, 4 - EcoRI - рестриктированная ДНК ржи.

1.2. Общая характеристика клонов ДНК ржи Используя компетентные клетки Е. coli (штамм JM 103) был подучен 831 рекомбинантный клон. Плазмидпая ДНК выделялась и рестриктировалась Pst I ферментом для определения размеров инсерции ДНК ржи. Клоны, содержащие ржаную последовательность менее 500 п.н. не использовались, т.к. их небольшие размеры препятствовали бы эффективному использованию в качестве гибридизационных зондов из-за длительного времени экспозиции гибридизационного ф льтра. Оставшиеся клоны анализировались для определения копийности последовательностей методом дот-гибридизации с ^Р- меченными препаратами геномной, хлоропластной и митохондриальной ДНК ржи. Из проанализированных 188 клонов - 60 (31.9Z) показали сильный гибри-дизационный сигнал с суммарным препаратом ДНК ржи, более 15 ( 8. ОХ) гибридизовадись с хпДНК и 9 ( 4.8£) - с мтДНК.

Позитивные клоны, содержащие хлоропластные, митохондри-альные и высокоповторякщиеся последовательности ДНК, были идентифицированы и отобраны. Оставшиеся клоны (43.67.) названы ScB (Seeale cereale Belarus) и использовались для дальнейшего анализа.

Из 124 предположительно одно/низкокопийных последовательностей, отобранных методом дот-гибридизации, 5 (2.7%) последовательностей оказались высокоповторяювдмися и 17 (3.0%) - умеренными повторами при анализе методом Саузерн-гибридизации. Происхождение таких высокоповторяющихся последовательностей неизвестно. Предположительно, это могут быть рпбосомальные, митохондриальные или ядерные повторяющиеся последовательности. Так, в результате секвенирования одной из таких последовательностей (клон ScB77) удалось установить высокую степень гомологии (80.9%) с последовательностью 4.5S( I) малой субъединицы ядерной РНК бобов.

Таким образом, полученная Pst I библиотека ДНК ржи была представлена 34.6% повторяющихся,9.0% умеренно повторяющихся и 43.6% низкокопийных последовательностей ДНК (табл.1). Это согласуется с результатами,полученными Devos (1992) при создании Pbt I библиотеки ДНК пшеницы, где 49.9% последовательностей ДНК было представлено низкокопийными. Сопоставляя с данными аналогичного анализа EcoRI геномной библиотеки ДНК пшеницы (Harcourt, 1992), где только 15% последовательностей было низкокопийными, можно заключить, что Pst I библиотеки являются высокообогащэнными низкокопийными последовательностями.

Классификация кленов из геномной Pst I библиотеки ржи

Таблица 1

Класс клонов

I Количество! В % от общего к-ва

Хлоропластные Млтсхондр.-лльные Еысокоповторяющпеся последовательности ( дот-блот ) Еисоксповторяющюся последо-Еатолт мости ( Сауэерн-блох1) Умеренные повторы Кпзкокспийныо и уникальные последовательности 05щ?е количество

15 9

8.0 4.8

60

31.9

5

17

2.7 9.0

82 188

43.6 100.0

1.3. Характеристика клонов по размерам инсерции ДНК ржи

Одним из важнейших преимуществ геномной библиотеки над кДНК библиотекой является дополнительный контроль размеров клонируемой ДНК в рекомбинантных клонах. кДНК клоны содержат кодирующий регион транскрибируемых генов и поэтому их инсерции обычно меньше, чем 1000 п. н. Это в свою очередь обуславливает длительное время экспозиции при гибридизации в качестве пробы, лимитируя их применение. Поэтому было решено удалить все клоны, содержащие инсерции ДНК ржи менее, чем 500 п. н. из геномной библиотеки. Таким образом, болыгин -ство отобранных низкокопийных последовательностей было представлено размерами 1000-1500 п. н., при этом клоны, содержащие низкокопийныэ инсерции более, чем 2000 п. н. были редки.

Большинство изученных проб ДНК ржи гибридизовались с ДНК пшеницы и ячменя, что свидетельствует о том, что низко-копийные РэЪ I клоны представляют собой эволюционно консервативную фракцию ДНК. Кроме этого, больше клонов гибридизо-валось с ДНК пшеницы, чем с ДНК ячменя. Аналогичное взаимоотношение повторяющихся последовательностей ДНК ржи и пшеницы (Пауе11 еЬ а1. ,1980) является подтверждением большей эволюционной близости последних по отношению к ячменю и, основываясь на гомеологии хромосом данных видов, допускает использование полученных низкокопийных последовательностей ДНК ржи для изучения геномов пшеницы и ячменя.

2. Анализ хромэсо^специфических последовательностей ДНК ржи (5. сегеа1е Ь.)

Отдельные низкокопийныэ 5ср клоны дополнялись информацией об их хромосомной локализации в геномах ржи и пшеницы, позиции на генетической карте хромосом ржи и в некоторых случаях секвенировались для изучения молекулярной структуры и поиска гомологии к последовательностям ДНК растений из банка данных СОЕМ 34 Ш (1993г.).

БсВЗб

Клон ЭсВЗб имеет инсерцию ДНК ржи 1500 п. н. и по результатам гибридизации с ДНК пшеница/рожь дополненных линий и нулли-тетрасомных линий пшеницы локализован на 5К хромосоме ржи и 5А, 5В и 50 гомеологичной группе хромосом пшеницы. БсВЗб последовательность ДНК ржи является низкошпийнсй,

т. к. имеет не более 3-4 копий на геном и может использоваться в качестве зонда для генетического картирования 5R хромосомы ржи и гомеологичных хромосом пшеницы и ячменя.

В результате гибридизации с рестриктированной ДНК ржи и ячменя зонд ScB35 оказался высокоинформативным, т. к. выявлял полиморфизм в комбинациях ферментов рестрикции EcoRV, Dra I и Hind III для ржи и EcoRI, Pst I, Xba I и Hind III для ячменя. При использовании ферментов Bgl II и EcoRI полимор-r физма среди растений F3 популяции ржи не обнаружено. Это убедительно указывает на фермент/зонд зависимую комбинацию при выявлении полиморфизма и картировании генома растений.

Используя F3 популяцию скрещивания ржи "Petka"x"MDC-ковский карлик",последовательность ДНК ScB35 картирована на хромосоме 5R. Для этого Hlnd III рестриктированная ДНК 137 растений, иммобилизованная на фильтре, гибридизовалась с зондом ScB35. Как и следовало ожидать, в F3 потомстве наблюдается три варианта сочетания гибридизационных фрагментов : два фрагмента одновременно (гетерозигота) и по одному, но от разных родителей (гомозиготы) (рис.2).

Рис. 2. Гибридизация зонда ScB35 с Hlnd III - рестриктированной ДНК растений F3 популяции ржи

А - материнский алле ь ( сорт "Petka" ); В - отцовский аллель ( мутант "Московский карлик"); Н - гетерозигота

Данные радиоавтографии после математической обработки с помощью программы "MAPMAKER" обобщены в виде таблицы 2.

- ff- 1 ^ «WTy«а»«» <

9

НА В HAB Н ff ННН А А В

Таблица 2

Щюцент рекомбинации при двухточечном и мультиточечном анализе для вонда БсВ35

зонд(ген)-зонд(ген) I процент рекомбинации

комбинация I--------------------------------------

I двухточ. анализ I мультиточ. анализ

5р1 - РБ1?42б 6.1 6.-8

РЗК426 - БсВЗо 18.8 17.7

5сВ35 - РЯИ.45 5.6 5.9

РБйиб - Р5К79 1.0 1.2

РЗК79 - сЬ2 13.7 13.8

Таким образом, локус зонда БсВ35 был расположен на расстоянии 21 сМ от гена карликовости сЬ2 (картирован Р1азсЬке еЪ а1., 1993) и имел тесное сцепление с локусом Хрпг145 (рис.3). _______ . . .

83®

<о

04 ■ч-

t а-

ср- *

8 8.8. ><X,>Í

CJ у

а: ш

N. «Э из г- 'Т

•W—

Рис. 3. Частичная генетическая карта хромосомы 5R ржи. Цифрами указано генетическое расстояние в сМ, локус, детектируемый зондом ScB35, выделен Зонд ScB35 использовался для обнаружения полиморфизма между ДНК индивидуальных растений двух инбредных линий ржи РС943, PCS52 и сорта "Саго Kurz", рестриктированной Hind III ферментом. Анализ результатов гибридизации позволяет обнаружить 7 типов гибридизационных полос (обозначены *), в то время как использование зонда ScBll для гибридизации с этим же материалом ДНК обнаруживает только два типа (рис 4.). Очевидно, что зонд ScB35 является в данном случае более информативным при установлении степени гомозиготности инбредных линий.

А) х х---х---- хх х -----х

*»»>»»» »»sswis--* w «к is

v> ш t í w w V u V w w «» V «» V ü и о

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 II 12 14 16 18 20 22

' « .

4. — — vrWWV~—w"» — íí w « W } !

Б)

Рис. 4. Определение полиморфизма среди индивидуальных растений инбредных линий РС943 (1-4), РС952 (5-13) и сорта "Саго Kurz" (14-22) с помощью зондов: А) - ScB35, Б) -ScBll ScB21/l

Клон ScB2l содержит две различные последовательности ДНК ржи размером 1600 п. н. и 600 п. н. Последовательность 1600 п. н. была обозначена как ScB21/l. Она локализована на 6R хромосоме ржи и гомеологичной группе 6А, 6В, 6D хромосом пшеницы и является низкокопийной. Установить гомологию сек-венированной последовательности SoB21/l из банка данных CDEM 34IN с уже известными последовательностями ДНК растений как и в случаях с ScB35 и ScB17 не удалось. ScB22

Клон ScB22 представлен уникальной последовательностью ДНК ржи размерами 1500 п. н., локализованной на 3R хромосоме ржи и гомеологичной группе хромосом ЗА, ЗВ и 3D пшеницы. Данная последовательность является информативным зондом для анализа полиморфизма ДНК растений F2 популяции скрещивания "Halo"x"Gulzow Kurz". В то же время она не обнаруживает полиморфизма в F3 популяции от скрещивания "Petka"x"bi0CKQBC-кий карлик". Так как ДНК растений двух популяций гидролизо-вана ферментом Hind III, отсутствие полиморфизма в F3 может быть объяснено совпадением гибридизациснных полос в детектируемых зондом SoB22 локусах родительских растений "Petka" и "Московский карлик", что подтверждено повторной гибридизацией с Hind III рестриктированной ДНК родительских форм. ЗсБЗЗ

ЗсВЗЗ-уникальная последовательность ДНК ржи размером 1200 п. н. Локализована на хромосоме 3R ржи и гомеологичной гру..ле хромосом ЗА, ЗВ, 3D пшеницы.

ScBll

ScBll последовательность ДНК ржи, размером 1300 п. н. и имеющая более одной копии на гаплоидный геном. Данная последовательность локализована на 7R хромосоме ржи и гомеоло-гичной группе 7А, 7В, 7D хромосом пшеницы. Использовалась для картирования гена карликовости ctl на 7R хромосоме ржи.

ScB85

Клон ScB85 содержит инсерцию ДНК ржи около 1000 п. н., локализованную на хромосомах 5А, 4В, 4D пшеницы, что позволяет, основываясь на присутствии гомеологичной транслокации в геноме ржи относительно генома пшеницы (Devos et al.1953), локализовать данную последовательность на 5R хромосоме ржи.

ScB190

Уникг~л>ная последовательность ДЕК ржи ScB190 (1400 п. н.) локализована на 1R хромосоме ржи и гомеологичной группе 1 хромосом пшеницы. Для 1R хромосомы ржи характерен дополнительный фрагмент гибридизации (рис. 5А). Отсутствие фрагмента гибридизации у нулли-10-тетра-1А (N1DT1A) свидетельствует о локализации данной последовательности на хромосоме 1D (рис. 5В, линия 3). Аналогичные результаты получены для хромосом 1А и 13.

г - .....— Рис. 5. Хромосомная ло-

кализация зонда ЗсВ190. Саузерн-гибридизация зонда ScB190 А) с Hind III-рестрик-тированной ДНК рожь/ пшеница дополненных линий (1-7), В) нул-литетрасомных линий пшеницы (1-3) и пшеницы сорта "Chinese Spring"(4).

Таким образом, из геномной Pst I библиотеки ДНК ржи отобранно и частично охарактеризовано 10 хромосом-специфи-ческих низкокопийных последовательностей ДНК ржи. Обобщенные результаты хромосомной локализации низкокопийных Pst I клонов представлены в таблице 3.

..I 2.3__4 5.6 7

W V* tu» — w -V

А)

IB IA

ID Б)

12 3 4

О W w

Таблица 3

Хромосомная локализация у ржи и пшеницы низкокопийных Pst 1 клонов

Цроба I рожь I пшеница I 1 I А I В I D I

ScBll 7 7 7 7

ScB17 5 н/д н/д Н/Д

ScB21/l 6 6 6 6

ScB22 3 3 3 3

ScB33 3 3 3 3

ScB35 5 5 б 5

ScB52 7 4 4 4

ScB85 5 . 6 4 . 4

ScB169 н/д - 7 -

ScBIQO 1 1 1 1

н/д - гибридизационный фрагмент не детектируется. 3. Картирование гена карликовости ctl

Данная глава выполнена в рамках совместного проекта "Молекулярная и цитологическая характеристика генома ржи и выявление практически значимых генов для селекции" в Институте Генетики растений (ГатерслеСеи, Германия).

Ген карликовости ct2 был ранее генетически картирован на 5R хромосоме ржи (Plaschke et al., 1993а).С помощью три-сомного и транслокационного анализа другой ген карликовости otl был предварительно локализован на длинном плече хромосомы 7R ржи (Sturm and Muller. 1982; De Vries and Sybenga, 1S84; Welz et al., 1989, 19Q2). Для картирования данного гена была создана F2 популяция скрещивания сорта "Halo" (Ctl/Ctl) и формы "Gülzow Kurz" (ctl/ctl). 3.1,- Результаты картирования 'гена ctl Выло использовано 17 ДНК 8ондов, в т.ч. SoBll, отобранный из созданной нами Pst *1 библиотеки фрагментов ДНК ржи. Данные зонды гибридизовалксь в различной степени с ДНК растений F2 популяции скрещивания "Halo"x"Gulzov Kurz", десять из и их детектировало полиморфизм внутри F2 популяции.

Семь полиморфных локусов расщеплялись как 1:2:1, четыре (включая otl) - как 3:1.,/ -тест показал, что фактическое расщепление для локусов Xpsr 580, Xpsr 115, otl, X Embp 7R, Xscb 11 (3) и Xpsr 928 (при P>0.05) соответствует ожидаемому. Для локусов Xpsr 163, Xpsr 59, ХЛ-Ашу-2, Xpsr 56 и Xpsr 649(1) фактическое значение расщепления не соответствует ожидаемому. Это отклонение свойственно почти для половины всех картируемых локусов, локализованных в центромерной области и расщепляющихся как 1:2:1, и свидетельствует о значительной сегрегации в центромерной области.

Карта хромосомы 7R (рис. б) содержит 11 маркеров, которые охватывают 112 см и относительно равномерно распределяются на хромосомных плечах (короткое плечо - 4 локуса, длинное - б локусов). В центромерной области б маркеров находятся на расстоянии 13.5 сМ (55Z локусов на 12Х генетического расстояния)

о

X •в и ч

Ol

А

<Jj

X •в

и

Ч

«>

to

- 05

XXX vX

■ом» «-d

«3t и и

Ч V > о 2 ч

04 I н<л ¥

-4 W и *

я * *

X •в

и ч

X ■в

и ч сл со

о

» г* 0* со о |-> А А и ю F- 41 w сл и л

Рис. б. Генетическая карта хромосомы 7 ржи (включая ген си)

Локус для гена си был картирован между маркерами Хо<-Ату2 и Хрэг 163 и находился на расстоянии 1 сЫ от последнего. Так как Х<х-Ашу2 расположен на длинном плече хромосомы 7й, а Хрэг 163 - на коротком, точное расположение гена си относительно центромеры определить не удалось. Однако, исходя из литературных данных известно, что этот ген находится на длинном плече хромосомы 7Я (Ме1г et а1.. 1992).

Таким образом, в данном исследовании на примере гена карликовости си продемонстрирована возможность использования молекулярных маркеров для картирования хозяйственно-ценных генов ржи.-

выводы

1. Показана эффективность использования чувствительных к »..¿тилированию ДНК эндонуклеаз для конструкции геномных библиотек с высоким содержанием низкокопийных последовательностей ДНК растений.

2. С помощью чувствительной к метилированию Pst I рест-риктазы создана библиотека фрагментов ДНК ржи. Более 43.6% полученных рекомбинантных клонов содержат уникальные и ма-локопийные последовательности ДНК ржи.

3. Отобрано и локализовано на хромосомах ржи и пшеницы с помощью рож! ' пшеница дополненных линий и нулли-тетрасом-ных линий пшеницы 10 малокопийных Pst I последовательностей ДНК ржи (ScBll, ScB17, ScB21/l, SoB22, ScB33, ScB35, SoB52, ScB85, ScB169, ScBlSO). Показана гомология данных последовательностей с ДНК пшеницы и ячменя.

4. В результате определения и сравнения нуклеотидных последовательностей клонов ScB17, ScE21/l, ScB35 не найдено гомологии с известными последовательностями растений из банка данных CDEM 34IN (Heidelberg, Germany). Вместе с тем, для повторяющейся последовательности ржи ScB77 выявлена высокая степень гомологии (80.0%) с последовательностью 4. б S (I) малой субъедкницы ядерной РНК бобов (Vicia faba).

Б. Изученные хромосом-специфические последовательности ДНК ржи выявляют полиморфизм на уровне линий и сортов ржи, пшеницы и ячменя, что позволяет использовать эти последовательности в качестве маркеров для ПДРФ-анализа и картирования геномов злаков.

6. Для последовательностей ScB35 и ScBll определены локусы на генетической карте 5-ой и 7-ой хромосом ржи.

7. Впервые с помощью молекулярных зондов пшеницы и ржи картирован ген карликовости ржи ctl. По результатам исследований высказано предположение об отсутствии гомеологии мевду генами короткостебельности Rht пшеницы и et - ржи.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Корзун Е Е, Божок Г. В., Картель Е А., Колчинский А. М. Создание клонотеки однокопийных последовательностей ДНК ржи

с помощью цепной полимеразной реакции// Современные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений. Одесса, 1991.- С. 129.

2. Корзун Е Е , Божок Г. Е , Картель Е А. Использование фрагментов ДНК ржи в качестве молекулярно-генетических маркеров// Тез. докл. конф. мол. ученых Изучение, охрана И рациональное использование природных ресурсов. Уфа, 1991. - С. 4.

3. Корзун Я Е , Божок Г. В. Клонирование последовательностей ДНК ржи (S. csreale)// IY съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров. Горки, 1992.- С. 11.

4. Бо..лк Г. В., Корзун Е Е Создание клонотеки, содержащей однокопийные последовательности ДНК ржи// YI съезд общества генетиков и селекционеров им. Е И. Вавилова. Минск, 1992.- С. 6.

5. Корзун Е Е , Картель Е А. Изучение межсортового полиморфизма генов 5S РНК (рДНК) у ржи с помощью цепной поли-меразчой реакции// Докл. АНБ. - 1993,- Т. 37, N 1.- С. 62-64.

6. Корзун Е Е , Картель Е А. Получение молекулярных маркеров для картирования генома ржи (S. cereals L.) методом амплификации ДНК с помощью случайных праймеров// Вест АНВ.

- 1993.- N 2.- С. 106-109.

7. Plaschke J., Korzun V. , Koebner R. M. D. and Borner A. Homoeologous relationships of GA3-Insensitive dwarfing genes in wheat and rye// Proc. YIII Int. Wheat Symp., China

- 1993. - (in press).

8. Korzun V. , Kartel N., Plaschke J. and Borner A. Development of low copy sequences of rye DNA// Abstr. Workshop Revision and Completion of the Genetic Map of Rye, Gross Lusewitz. - 1993. - P. 5.

9. Kartel N. , Bozhok G. , Korzun V. Probes for RFLP mapping of rye// Abstr. 17th Int. Genet. Cong. , Birmingham.

- 1993.- P. 190.

10. Божок Г.В., Корзун ЕЕ . Проскяк М.И., Картель Е А. Получение клонотеки малокопийных последовательностей ДНК ржи // Докл. АНВ. - 1993.'- Т. 37, N5.- С. 66-68.