Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НАСЕКОМЫХ НА МОДЕЛИ КОМНАТНОЙ МУХИ MUSCA DOMESTICA.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НАСЕКОМЫХ НА МОДЕЛИ КОМНАТНОЙ МУХИ MUSCA DOMESTICA."

л- ъгбб &

На правах рукописи

7^55"

КОСОРУКОВ Вячеслав Станиславович

Создание эффективных векторных систем для трансформации насекомых на модели комнатной мухи Musca domestica.

(специальность 03. 00.23. - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Московская область, п/о Горки Ленинские 2001.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Научно-производственного биотехнологического центра по животноводству РАСХН (Биотехцентр)

Научные руководители - доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН ■ Эрнст Л.К.

- доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Прокофьев М.И.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Евгеньев М.Б.

кандидат биологических наук Симонова О.Б,

Ведущая организация - Всероссийский институт животноводства.

Зашита диссертации состоится "_"_

2001 г. в __ часов на заседании Диссертационного

Света Д.006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ ссдьскохозяУ^Ткет'Ой биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан _"_2001 г.

Ученый секретарь . ■ - "•' . -■

Диссертационного совета! - - у—

кандидат биологачес^у ^ауу—н ков а С.А.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1 . ; г ^ -v

Актуальность темы " ' ' ' !' ' "л- ■ *;> '' ..

. Получение трансгенных организмов имеет большое'значение'для; фундаментальных исследований и практическшГ" целей.''* Получение5 биологически, активных веществ с использованием трансгенных насекомых представляет одно из наиболее привлекательных применений таких технологий на практике.' : Примером такого 1 использования технологии может служить получение трансгенных линий Ceratitíscapitatá • вредителя плодоовощных культур в северной и центральной'Америке (Loukeris T.G. eta)., 1995).: : ^ - ; '^ ;-

Разработка технологии генетической трансформации Насекомых для-" нужд ^медицины - и сельского" хозяйства ' является важной неразрешенной проблемой1 в* энтомологии. Несмотря на интерес к этой технологии и значительные усилия, потраченные на его разработку," был достигнут только незначительный прогресс. _ ■ < 3 ■ , ' ,{

Объектом ^ исследований данной диссертации является разработка эффективного метода трансформации комнатной мухи Musca domestica как одного ^ из наиболее перспективных' в ■ плане г биотехнологиивида насекомых.;Состояниеизученности М. domestica как объекта для трансформации очень незначительно.' Мы предположили,!что мобильные генетические элементы, выделенные 'ю "генома" Mdomestíca,'■ должны достаточно1 эфф'еетивно работать* * в составе1 интегратнвных;' векторов^ Исходя из этого предположения нами была начата работа по получению "систем векторов на основе мобильного элементаТ/етел, выделенного из - генома комнатной мухи."' V.-: * Ч;*1' '*•

Предпосыл кой" удачного осуществления' этих'' и следований было

. клонирование мобильного элементi'Hermes из* Musca doméstica (Warren

W.D.et al.,1994; O'BrochtáD^A et al., 1996). Этот мобильныйэлемент был

успешно опробование*- качестве^ вектора; на' D.J'mslanogaster; ' И.

следовательно, может использоваться на широком круге хозяев (OUfochta

D.AetaI.;1996).' : ' -- vhc.i

. ; ~ Одной из причин повышенного интереса к комнатной мухе как к

биотехнологическому .. объекту ^' "является ^" развитая '^-технология

культивирования - бол ьш их '" ^количеств ,', "личинок*'' наг отходах

сельскохозяйственного производства." 'Данная'-' технология' 5 позволяет

получать большие объемы биомассы при'достаточно небольших затратах

(Колтыпин ЮА. Ерофеева.Т.В., 1977). ^ - J .^Ч.'-:-¡ ■ V.1" i-í-í'-'.; i-% е.. i r;».'/"^!- у.«ч: г:,1 '""jfL'ilü't .......

Цели и зажачн исследовании ^ .-. - -л " :

Целью настоя1Йего" исследования' былоизучение эффективности использования мобпл» i i'sro' т л r'iíüirstíífermes для! получения трансгенных ' насекомых. В' чаетнбети^еидк^комйашой m\íxiíГ* Musca 'domestica, и I .¡мУЧНАН б'-СДИПТР^А ■ Л, ■. : •

( .1МУЧНАН БИ

f-IOCK.

Ш. К. Йнв. UQJÜ^

.БИБЛИОТЕКА ачадэмни

:1и)иио£

: получение опытных линий .трансгенных , мух. V с,; использованием гэтой технологии. ■ • '■■;' ~ ■/, ' У.^.,

■;ЧгДня ' достижения этих целей нами были-,,сформулированы .J;

■ следующие задачи:.....:, хи1'.*-..*'.."• " .' Í К Изуяить эффективность, транспозиции мобильного элемента Hermes, в

.'^эмбрионах Musca domestica. \ ''j-'."'.. ,; . j г:, ,<>-■.■■ - Vi.

2. ..Изучить^ возможность^ использования ^/V**. -трансформации .Musca ^ .r , V

¡domestica различных маркерных генов, j/,,,.^! „ '*„'.",' ...'.,-. - •

3.. Раз;и6о^ать-и,соэдать ве1а»р>"'несущийд"однов^ маркерный и ,

'.'. структурный , гены, " и определить ■ .эффективность/*' экспрессии'/ " струюгурного гена. ' V . ■.".,'

4. Создать - оптимальную векторную систему»; способную эффективно .' трансформировать Musca domestica, ' • , -V/'Íj г' .• í ' "

; 5.; Поручить ^"^ансгс^иые''линии Musca ^ domestica с .-

.конструкциями. " „'".' . .: . ' " ' . '"-" ''„' I' ' - :: ■

. „ ' ■"■" ■--. i^-'i-i1 ¿rái- v >

Научная новизна работы v .'• • . ' J,;. -. ■ ■ '

В результате ^. проведенных ^исследований впервые',созданы' ■

эффективные , генетические системы ' . векторов; для ^трансформации "' <

комнатной муки. а в перспективе и других видов насекомых.' Впервые * ',' Í'

получены трансгенные линии комнатной мухи Musca domestica. Показана , ' -

возможность достаточно. эффективного экспрессирования чужеродных • *

■ генов в организме личинок и имаго комнатной мухи. В частности, ;, >

; Практическая значимость ра&оты .. " , •..".■ i . ., ■ '

;; Полнена экспрессиия генов .устойчивости кг неомицину neo' и , зеленого флуоресцентного белка EGFP. и на этой основе разработана . система"с^е'кцни. .трансгенных личинок Musca domestica. Создана универсальная; вектор-кассета ' для быстрого ¿ .введения д- чужертдных ' ' последовательностей в геном комнатной мухи, а в перспективе' и других ' . видов-насекомых. - Благодаря разработанной системе/, стало.; возможно-О получатьтрансгенныхкомнатныхмух для биотехнологических целей.' V , . ,

Основные положения, выносимыс на эашнту . „ . ,.

. .,, ,На защиту выносятся следующие.нрложения: > . / : ( ■ t ; * ■ /pl. .Мобияьныйэлемект Heimes является подходящей основой /для ; ' /^и построения ';^ интарттевньи , векэт^в ^ д^/ ^ .''. domestica.S-'- ^¡.ч, ;, • ■■f'w-'' "■' ■ ' : * ■."■

,2. Созданы интегративные вектора для трансформации Musca domestica: ^ Ч 8 3. Получены - траяегенные nymnu Musca ¡¿¿domestica со . всеми ■ разработанными генетическими конструкциями. * , ' . . <. ' ^ - ^ . f , Наследование^ вставки - в . трансгенной л Михса domestica

^ . проявляется по меньшей мере'^^лротяжении б поколенйй. ^л . . .

J.-.-.v* - . . * T ' - t ■ Л' ^ .'■ " ■ : ■■■" ■ ' T'V1. ■ V L ■ - " : ^ Л v

•• - *'. < : гг-^■ .. ___■* __1________________■■ - ''i '.

r^'. í: • Объем диссертации , 115страниц машинописи, включая 15 рисунков н Ю -.'^

Л; * ^ ; ■ . работе - not созданию; генетических ; конструкций использовали ; -,; . ж

«;\ штамм КсоН DH5a.' Из бактериальных сред использовали LBj 2YT> SOB, í-,

, - SOC. При необходимости в среды добавлн ампициллин до концентрации'- * í^ ^V'llOO мг/л или хлорамфеникол - 25мг/л.Твердая средасодержит1%агара. /г* . 'V - ^ п 1 Среда *для ■• культивирования Musca domestica , содержала 40%' .

комбикорма,1 (наг основе отрубей илиотруби)Лостаяьное При

Л^ • необходимости в среду добавли 1 мяг/мл G418. s - '• .*• ..." ;;

• - i С ñ работе испод^^ов'али спелую i пне • плаз^иды; pEGFPr : pUC 19Г

' pTZ19R, pBlueScript KS+-, pHSBJ, pHSHHl .9, 'pBS//enrn«Wt.,Í;; ; i-, т ^

^''^.-^.'^'^'-...-^'^'Вадмение.геиЬмяой ДНК из личинок к имаго.Musca domestica\J; ? ; ' ''.'.i'**-фенол-хлороформным^методом,'-'(Трансформацию ; компетентных^клеток - ;■;

Д ■ ~^E.coii, ~ выделение > плазмидной ' ДНК^,из_ ,E.coii,?, калыдай-фосфатную :;' , " / "трансфекцию, культурыдэмбриональных' клеток: Drcaophila^^троъотлн^ •;* i.-"; согласно рекомендациям Current Protocola, 1987.;,; ^ ' ■

i ; jv ^весторной í ДНК^ для .;микронньекции 5 эмбрионы í

. ■ ■ nrvinniTuitH ' л urnnni.inMHiipu гнтя ппя лцигтга ГП-ГК" . Липии > '

: - <А5/мм//сд проводнли; по адаптированной методике в синхронизированные' ? ^ яйца ка стадии ^сннцитналькой бластодермы в период 45-90 мнвут после ;

яйцекладки. В св*щ с регидностью. хорион а не проводили его удалние. Их > , ; ; ^•-'jr'^- располагали на^яокровном.стекле в рядегенеративным полюсом',к краю

7- -т 'л..-'-' V":;"/-;' Л Г1 у?.1*.' С^'-,1

' ;*.' '. V-'» _ ' •.1:.'Л.'.-.' V. -'■ у- I ~ >.'• -•Л^'-;

_ инъецировали-^ с Л помощью микроикъектора стекляннымиигламив .' ^ ' •"'/генеративный конец эмбриона. Далее яйца на покровном стекпе'поме1цаян ;*'^ С;;- 7 в чашки Петри на фильтровальную бумагу, пропитанную смесью молока с ' •'*' •• У- дрожжами, (160. г/л сух.- молока .,: 50г/л дрожжей), Ч^шки помещают. в : ~ й- А' полиэтиленовый пакет е темное место и культивируют эмбрионы при 25°С ^ ; * достадин куколки.'Через сутки' смотрят отрожденне личинок." В качестве ^ " контроля используютнеинъецироваиныё эмбрионы, также помещенные 'На -' ; / /: У С", покровное "^стекло;' ид! культивируемые /при. аналогичных .усповияхЛ'^ . /

- - '; А>т«/«;<з /в' эксперименте* по"1' измерению ' эффективности * мобильного4-

элемента Негтез проводили по адаптироваиной методике. После инъекции./.'.с.,. эмбрионы/течение' 1 -2^.часа прогревали,'вь термостате/при-42'>С, эат«м ' 'Л■'-У*1 ■.Г- -инкубировали до выделения ДНК прн комнатной температуре в течение2-г-'-*/-

; /' Л Выдеяенне тогальной' ДНК тЪмбрионов; в' эксперименте ^Л/дал/ '' ' "" "

' ^ задач/выданной * работе"1 было ":исследованне активности ./ . ,■'

^" ^эидопенной ■ траспозйзы нэ актнвных :элёментов'уже' присутствующих" в/'' --/-г/ ■ ^ , / Высокая активность'эндогенной транспозазы может ; ^

Л?:. \ привести к потере траснсгена в'трансформированных'линиях. Дпя этого";.'. /;/ был ^сконструирован /: вектор - р1гм ~ (рисунок ' .'■ ]),' .- несущий<: между /

- инвертированными ■1 повторами,^, врезультате V транспозиции ' колонии ~ . V бактерий,' несущих-этот вектор/ будут и меть'белую окрЙЯсу наередес Х- .*•'•':.••,

. - tv.

... -x Л

V- -.(.-

;;:-,' * - • i '. '. v.4'' *••• - ' •."*> ""'■<. ^- ,..-„-■"-• .....'•.•"•:"

^фрагментом ппазмиды pTZ 18,f сожержащим ген'lacZ Полученный вектор . был "назван pIZM (рис. 1).' " ' ■; NЛ " '•.' -':;•.

'. jДальнейший экспериме^г бьиГразбит>на^три логических этапа. На г>- i' ^первомэтапе производили ;мнкроинъецироваиие^ контрольного вектора.J7 ^' pTZI8,'-содержащего / мармч^ый ген; lacZi но/_не' содержащего ;V специфических * инвертированных повторов ^"элемента j' Hermes - и,' соответственно, не способного в транспозиции. После инъецирования из"3 *. Л эмбрионов выделяли тотальную ДНК ^фенол-хлороформным методом и^-'-Ч •. Л трансформировали в КсоН. Бактерии высевали на твердую среду 2YT с Х- r.i.i '■•■ Gal/Полученные колонии подсчитывали'и:фиксировали цвет.'Наличиеv~ белых' колоний означало отсутствие в < них "активности' гена; taeZ.1 Было ■ v'* * ? проинъецировано р 708 эмбрионов. - ; из которых ' ' после ; ^ проведения. i t ~ ^ экстракции ДНК ¿трансформации Е.соН было получено 1327 колоний. ^

колониибылиголубойокраски(табл/1)."-',■ ;

'Д втором этапе проводил ими кроинъецироваиие вектора pIZM без , ' ^

плЪмиды-помощника pHSHHI,9. Из проинъецированных 1130 эмбрионов ;; "

- ■ :>"-.

''.^i.y:

было получено 3695 колоний КсоИ: Все колонии имели только голубую': • ' ■ > окраску г ■

..ч На .третьем^эгапе "проводили микроиньецироаание' вектор« рКМ г ^

совместно с плазмидой-помощником рН8НН1,9. Было^ проинъецировано г;: ^Х::'. 2660 эмбрионов. Из 9764 'полученных колоний 21 оказались белого' цвета — г

^ /Г; Как видно из приведенных данных нарушение активности гена^/<зс2 ' ^ ' ■ .; происходилоЧолько в случае, совместного мнкроинъецирования вектора" ? '

р!2Мн плазмнды помощника.'' Т * " '' " „• " '

- •■. . ••!■;■ •:. '"л ..-.. . ; ^ : \ " • " ' . •

^ ; - ^ЛУКт^лпвд»

. -* ■ V- :» Muscadomestica: J - ■ ^ - ^r -

параметр контроль i PTZ18 " ^ г опыт; 7„ -"pIZM'-hetper ^ опыт . v • • pIZM +helper ; Всего *

Проинъецировано -эмбрионов --- ' 708 - - ' .•• 1327 -i , . 4-JV 2660 , - 4695 '

Получено всех ^ колоний - " 01327 v .3695 • ^ 1 i '1 » 4"-> 9764 > • 14786. 'fi":'* -

из них белых * ** ; . о - • ■ о -21

Частота нарушения гена£л'е2% " ., о • г tfL^ " / v'^P .' - Ov-6-^ х- • ч oav

. л ~' ^ . . 1 ^ _ ' .- и ... ^ "i ' - V. v ч i л *

■, pFtap fragment

^Rght arm inner part.: :, '

, -1-- -T : " ', j1 ^ V -i ■ . : V .Right «mi :

" .-''-■ 1 ■■ '■ ' ' ■; , ■ ■ ■ . ■-"" ■..■'". .'■'" - - ■' '> • • - • j ■=. :. V-; 1 ■ - ->... ;• r . ! /• • • •• ■ , . •. • .< ', ' ■■■-"■■"'." ...■

v Pncynoic№ 1 ■ i-yir'. ..'•iaiKHMn^l'-r^v'v-'.ii.-O. '-^fv i--?: :

- • CxeMa KOBcrpyicmn* pIZM. (h»pti> I I ■-,'.■:*■; ' C

., . - ■ ; , . . ; «ml KMIWWl1

; Fa 1 (IMM)

■ ' ■ ■■ ~ ■ A • ". «XV A ,.'.■■ 1 «■ . . ■. V jrial(1<---

-:■* --T. V CUI<)«»JD|

t j ' ' \ i *rh- i " L

ro^A^nali

: MiAwMO \' " . ' ■' "i ■ : ■ (BNAiijutl

; ' ' r i'^T'M- V

t *■■.'.■'■ "'■.■-■'"."■nixam "i ■ . -- ■ ^^ - .. * ~ - - mwiniia

»«•Ht(tMS) ,-»«1(11111.; _ firliuntt'. y

■ - ivpgf^nl. ; -

CxeMa Beicropa pHermlNcoR] lAP<

f«>Rl(Ml]>

>J/I(3M$> V.

Lvfllrrn rr Vipiiiartt '.:

: -s ■■

■: >'Ч Из.,7 белых^,колонийбыла- выделена !. плазмидная.^ДНК. лНа"; .-• V'' : электрофорезе было показано.'^что все^плазмиды имеют, размер ¡меньше/ ^ 1 'У 5 : исходной плазмидьгр17М (около 10.т.п.н.). и1-сходный с контрольной ■

плазмидой ^рЯор^ удаленным, фратоентом.между^инвертированнымиг .'V; повторами элемента Негтез,(около.7,"1(т.п.н.), что говорит,' чтоучасток^ V". С*. . о '•■>■ - ограниченный инвертированными повторами ■ и, содержащий маркерный **г*.'- ^ ~ • .". •. ген Азс2был ими утерянЛ^--,^: ¿У:' "'Г 'Д:." ,••..*

": * Описанные результатысвидетельствуют о , наличии апнвностн , 7-'Л-■.:'.• ' тракспозазы, мобильного ¡.элемента ^Негтея ^ при *совмёстном;введении Г - вектора и ш1азмнды помощника вэмбрионы МЫотюНса. Это позволяёт ; ; испОльз°вать данную" комби нацию векторов для трансформации этого вида:: " V.'',-т '.насекомых/^' V '.'; С-.--Л".> . 1Ь - 4 •

* '.'." . 'V4,--.

V.;: '• 3.2. Создание вектора рПегтЦЧ'еок) для трансформации Л/. <1отеШса>' .,?..

выживаниеклетокэукарнот» среде, ;шокаиспользовали;плазмндурН5Ш, которая содержит промотор'белка'

" - - качестве дополнительного маркера было решено использовать ген; . : :

; " "зеленого ^ флус>ресцентного - белка"(ЕОРР)"Этот'; белок ^ обладает ^Л-';- ; - 'способностью светиться светом зеленого спектра при облучении темно-' 'Л>^; ! V ¿. синим светом:(480км). В случае эффективной экспрессии гена СГР мы ' > рассчитывали использовать его вместо или параллельно селекции на среде"'

■ г . "; . . Из вектора рЕвРР (фирма С1оп1есЬ) по рестриктному сайту ХЪа 1.-', . ' ; был:' вырезан фрагмент," содержащий открытую кодирующую рашеу^ .^. ' '; * ^считывания гена ЕОРР. . Фрагмент, был клонирован^ в вектор рНБВГ под'^.^' ^ .контроль промотора белка теплового шока (ар70 и последовательностн у^', * полиаденилирования. Затем • фрагмент '.,. Ь5р70-ЕСРР-ро1уА\^к был

* ■ г - > • Г " X'' . ■■ - -

Л- : V1"...... ■ ■"■■> .. , .'V % ¿■-■> "■ '-■*-

-„У-У / .4 — ^'у. . У ' . ? ;'У'У-'т

- ^ : ^ >." ' • Г у '"•'У Х-;

уУ-- пёреклонирован*' в вектор " рНегт£ЫеоН.]г в;! сайт" Хта *.1У Полученная '-'¿УУУ Г" - - конструкция была'названа рНегтпрЧеоК.СРР] (ряс. 3).У '-'П-.'!1'1; Т" Ч

-У : У. ЗЖ"' У г Получение У трансге нн ЫЖ*У'.; М:! ^ ¿отеШса! У -- методом ^ Я ~' - ммкроикъецировання конструкций рНепп^еоК! и рНегт^еФ!^ вРР]А < 5 ■';

,-У;- * .-У -. 'г • .У У. У У^^-К* У» ■V*р..V. ; 1 V*1*'У Конструкций были очищ^иы^ссютмтст^тста^ 'н ■ У 1,У ;

у'- Д,'подготовЛены'для ми»^ин1лкштоГПребластодермальныеэмбрионы*ЛЛ«со , ? ¿отезИса, были микроинъсцированы согласно разработанной гметодике.^ ' V

" -> селективной среды с генетицнном

»•V 4 * ^--'Г т; Показатели ? ^м^л'.^'Л'Г^И'г^ 1 ; Ал • -V1 -1 г-',' • Число : . V. ': Процент

V Микроинъецировано эмбрионов ^ ' - 15262^ ' '-100'-*

.2" Развились до стадии куколки 220 > 1.44 '

. ц . • _ Развились ао стадии имаго'' ■ " * *"'- - *ъ - ^ 189 ' ^ 1.24

4: Заложеяолиний ■ -' ' - 6Г V". " 100 ■

'. г ь 5 Из них рали потомство нз селективной среде - 19 - 30,6 -

6; - • Исследовано линий и.5 на наличие; ,-у; интегратявной вставки методом ПЦР ■ " ' ' 7.л " - *-V»,,'г' ' 100 ;

•7 Обнаружена интеграция в линиях п.6 " ; . ' ■■"- 100

' V

*-■. > ; Согласно ^ ■' полученным ^ данным . "после микроинъецирования < конструкции рНегтрЧеоК] до стадии^ имаго развилось 189 эмбрионов из .15262 (таблица 2). Процет выживаемостн • эмбрионов после инъекции , составил 1,44%. По'данным литературы у ОгояоркИа те1апо£аз1ег этот - у процентварьируетот 15 до45 .-Л.'

г?

л : V* Л*" . >1

л . - микроинъецировании, ;что; позволяет, снизить ^травмирование. эмбрионов ..Х: : * "'/иглой^ В случае Мшса сЬтезМса это невозможно сделать,'т.к. эмбрионы. >/,"

*- отличаются налич11ем,непроннцаемого^ри1^ного"хорион^ который.не 7*^ ^ ". ] ^может быть'отделен без потери жизнеспособности. Из 189 мух, выживших/*';/V1// * ; •{' послё микроинъекцни, были открыты 62. садка, в которых одна из особей

прогревании было получено потомство в 19 садках и? 62г В процентном // -Т. .', V" //■ соотношении это составляет; - 30,6% . сгг количествадоткрытых садков,/ -// ■ ■» л - // Выжившее на селективной среде потомство можно считать потенциально /' - /;

I 1 . . « * . Ы* " 4# 4 Ат *>ПЪ Л ПI |>| 1А Ь »11*1 »• 114 или Л Я ■ В^ П п ЛЛ ЯАШ*»* й*»Л -Г

Л* ,> ■ />> селективной среде потомства!« каждого садка анализировали/методом

; // . _ • //"■ V/ В нашем эксперименте мы получили 30,6% трансформантов из числа -*/ " •••» " " * проверенных'на'наличие^ интеграции линий. Исходя из 'представленных "Д^;-;

/ ' В результате микроинъецирования конструкции рНегш[ЫеоЯ, СГР] в '

получены '

- - V'1 „ ■ ■ * J :

Таблица

: Эффективность трансформации и селекцин эмбрнонов комнатиой'

ГТГУ'.С'.

Л

*

л* —1 л (^г'^ Показатели ^^ :■■- ' г :!;!■:■■ / Число Процент. У -Ч" ' /Л*, -'-

Микрошгьецировано эмбрионов ■-"■>-- - 4170 - 100 '

Развились до стадии куколки -' ~:; <■ > - 70 - • 1,68 ■

Развились до стадии имаго -■;'->. 36 • А 0,86

- 4 Заложено линий -">■■'■-:.■ ■ ■■ 23 10011■'

5 Из них дали потомство на селективной сре^е г.-".- * 30.4

б; Исследовано линий п.5 на наличие. . интегративиой вставки'методом ПЦР <"- /1Ч< ^ , , 100. :

7 Обнаружена интеграция в линиях п.6 ^ Л*" 80 - -

■ Л* I "(■

/гТД^Х'//.* 1 Обнаружена интеграция в линиях п.6 ' - ^ ГУ" 80 1

И j 23' открытых' садков мухи! в ¡.7: дали; потомство "на селективной i;

Л : ' ".'3 ■' _____.___:___ лл ла/ ..тт_~..__^___ л -1-е __.__J—. ....

V комнатной • мухн, трансформированных'конструкцией.рНегп^Гч'еоН,' '-'/■'- С

'".--/ ' Ввиду того,'1 что* интегрируемая конструкция кроме'селективного ■К. ■ V './г , ;гена пео'~ содержала маркерный ген зеленого белка,' то была' предпринята * . • '".//V ^ попытка обнаружить его экспрессию/¡^'" ? -1' Ч-1'''' ' Г' * ^-

. Предварительные ^исследования/ /экспрессии -4флуоресцентного^ ' *.;

: ( "зеленого флуоресцентного! белка". 'Di качестве: визуального /контроля , <" ; /;\ испольэовали суспензию кпеток^£со/^.трансф0рмированную' плазмидой• ; . '"-,1. j pEGFP, иллинию '.трансгенных по' гену ¡ EGFP/D.melanogaster. !J3"обоих t

/• v С ^^ ^случаях ; можно ■ было^ беэ Ъомех_наб^дать ; !характерное 'ярксоеленое^ ,* "//■;,;■// /'.свечение продукта réiia МРР/ Однако_наблюдения1Трансгенных особей Ч, >-; . . V-*' - i Musca domestica не потволили выявйть'свечение маркёрного -j" Л yv^

v-vT-Также'" был/^ испробован^ более""точный » метод исследования \ v/ . •, флуоресцентных ^белков ¡ при'., помощи' спектрофотометра/" Исследование ,;

л./;"; Наследование траясгена Негт[№оК] было прослежено.вплоть до б-I. -л, • го* поколения.. Каждое новое ^поколение, перевивали, на свежую ср»еду ; с~ '*. ! -/ ; ^ антибиотиком С418. 0днако было замечено, что в каждом поколении часть

^'/¡особей не несла трансген. Этот факт, возможно, объясняется способностью "О %

15

'cfeinMBii ""

' V <*ктя>д - ч т "

-.....■*-—-V1 ы-.-'Л-::*

■ " tO.I4

■ ' г - ^ .''г" - , ■■ - ч- . 0»J(llf7()l

"L . L: „ ° х - ^ ,,

-1

immAiiH 1 '

. - ■'■ WV IK рМ>Д

Г . . : - ^ , '"

' г

-■ ' , ■- . ■ - . - -

' ■-V iv--' i : ■■■--v'1Ví:-' •-' ...• :«.l(t3Cj'n

' ! ' ! '"Л" *. • "'«»MTITJ)

- ' ' tí Л , ' . . .

' . . ; { . ; • • . ' • »«»Ml («M»

■ ',.. '.: ¡V ...'•! .,<'.-•. a»»**«»*';

'-l*1-, W««Su«**Han

; ' Рисунок : ;„"> Г--Г*.'" ■.','. «»«Wl« :¡.-; ,|;т П\(^»|(И(И) ./ >

: J'.:,- СхемаicoHCTyKpyKHHHpMercury[EGFPJ ; . , \ J'^mwij». ... .. !.. "

■"■"■ -■'■ -: V I \с»кил) ■" [■ ~>" ■

ftgrwl . ^ ; . ': lM.íllt(54|J) .

'иммунологическом; окрашивании^форезной^: пластины . с^нанесенным; ;

^/.лнзатом трансгённой по . инсулину человека личинке, ,кроме инсулина • • V

виден еще большой пул различных более тяжелых неспецифичных белков.^.;, - ¿л' •/' У "*, Во-вторых, ¿.^ биомасса^'. из ^/.насекомыхв значительной /¿степени .. - / ^ ^ ¡Г „

^ ; ; ^ I^Впервые показана -^возможностью.трансформации --*, насекомык :' ^; ¿~ ^~'■кедрозофилиной^ фу ичы'путем нснользоиания различных' диетически*.;¡. > ^ '>.' ^

Клонирован и апробирован новый промотор белка теплового шока

V'V V -с-*-'* , Д*

«•• ■'■ ¡ч- 'V '.'<— .'18 '•,•• • . .■-■'-"-■--Х

'л :-г Использование созданной в данной работе технологии возможно в . • ; •> -• , ! нескольких областях, ' ' «'

' с ». - . : ' V ¿Как ■ и в случае с £> те1апозШе'г '< трансформирование комнатной ^ , ' ■ • / -*«•, • - мухи можно использовать для проведения генетических,'молекулярных и ■ - У _ Л ^ ^ ■ \ других экспериментов; расширяющих наши знания а этих областях науки. '; Т...;■ Г':

ь '' Л ' 11 и(1'1шии*1м илп/чл 1_4лв 4и и А <г*¥ЬпяптГи ■нЪа гпниатилН 4

Например,^теоретически возможна экспрессия' какого-либо белка1 в г» :у ■

Кроме того, активность0мобильного^'элеме»^'//<ег;пе1 не' является >

.-. Д -■■ - Опубликованные работы: ■■ - Д"'_- -Д- ;■■- .Д.ДД.Д \Ч.-

1. V.S. Kosorukov, Т.A. Antipova, M.I. Prokofiev and L.K. Ernst. Transgenic • '

■i' House Fly Musca domestica with Neomycin Resistance. SSR 33rd Annual О .-'Д."" Meeting, July 15 - 18, -2000, Madison; Biology : of . Reproduction V.62

Д:-.'Д ~ Supplement 1.,p.227 ; Д" Д.;-Д С V 'i, '" ■ :"r.<■:

- Д.;Д 2. Jl.K. Эрнст, B.C. Косоруков, T.A. Антипова, lO.M." Чупина, A.B. Тулин,' .." Д ' ■ С.А. Лавров, B.H. Башкиров, В.А. Гвоздев," Г- Брем, Л.И. Корочкин, М.И. " .;

; - ' Прокофьев. ^ Получение .трансгенных комнатных' мух Musca domestica.: Д'Д-' : Даклады Академии Наук, 1998, т. 367, Ж}. . Д- ;Д Д '-" i " Д Д:;

"Д- Да 3. Косоруков B.C.; Антипова Т.А., Прокофьев М.И., Эрнст Л.К. Получение '. . . ..*. трансгенной комнатной мухи Musca - domestica. Третья международная v т _ * : конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" 6-8 . ДДД-.■ сент.2000г.Боровск. :Д' ^ "Д Д Д Д-;' 'г,Д;-„-/'• "Д" ' '■,;■'.*.'.■.■'■ Д.' Д'

Д1 Д-Д 4. Косорукое B.C., Антипова Т.А., Прокофьев М.И., Эрнст ЛХ ■Д." ■ Трансгенные комнатные ■ мухи ; Musca domesticá, '.; экспрессирующие Д о V Д - маркерные белки. II международная научная конференция "Биотехнология Д ДД-.,:Д-

- -Д ■" в растениеводстве, животноводстве н ветеринарии", Москва, 2000г. -- /

\ 5. Косоруков B.C., Антилова Т.А., Прокофьев М.И., Эрнст Л.К. Получение. .Д ;■ . трансгенной комнатной мухи Musca domestica. Конференция посвященная Д Д"Д . памяти ак. В.К. Милованова, В1ШИС,2000г. : ■ -'.:*.■>'Д - : V Д

, 5 6. Патент РФ'№2137362 от 16.09.98 Способ получения трансгенных : :Д--Д.- Д. ■■Д.; домашних; мух Musca domesticaЛ.К. Эрнст, М.И. Прокофьев, ВЛ. ; ,

Башкиров, В.С.Косоруков, Т.А. Антипова, А.В. Тулин, С.А. Лавров, В.А. .._■.."

Д Гвоздев. , ' Д. . ';- ' . . Д'Д;'",.- Д/'Д'ЦД. ,"Д'

' Д. Д 7. Патент РФ,№ 214119$ от 16.09.98 Среда для обеспечения введения - . . . ■ различных веществ в личинки домашней мухи Musca domestica. Л.К. . • Эрнст, М.И. Прокофьев, В.Н. Башкиров, В.С.Косоруков,* Т.А. Антипова,

V:''; - ;■^ А.В. Тулин, С.А. Лавров, В.А. Гвоздев. Д. ;.■!•."■ Д. í . V"'"Д.Д ■ Д ;Д Д Д -"

Д'ДД - 8.. Патент РФ №99102416 от12.02.99 "Способ получения биологически Д .- Д. активных веществ промышленного и медицинского назначения из '„ • биологического сырья". Эрнст Л. К., М.И. Прокофьев, В.С.Косоруков, ; ; !■ - ~ .VЧерных В.' Я.,* Корочкин Л; И., Гвоздев В. А. — - - ... -^..Д...,'

Объем /,2Гпъч. я;

г Тираж 100 экз.

- • АНО «Издательство МСХА» .'* „ ■ * : V , .127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 ■':■ ' -