Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние мембран и антиоксидантных систем эритроцитов человека при лазерном облучении

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Состояние мембран и антиоксидантных систем эритроцитов человека при лазерном облучении"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

РГБ ОЛ

11 СЕН 1395

На правах рукописи УДК 616.127-005.3-07: 612.121.2+612. Ш

ВАСИЛЬЕВА ИРША ФЕДОРОВНА

СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН И АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ ЭРИТРОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЛАЗЕРНОМ ОБЛУЧЕНИИ

03.00Л3 - ф:-:з;!слсг1!л человека и животных

-Автореферат диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре пропедевтики внутренних болезней Самарскогс государственного медицинского университета.

Научйый руководитель доктор медицинских наук, профессор В.Н. Фатенков

Научный консультант кандидат медицинских наук P.A. Тимирбулатов

Официальные оппоненты : доктор физико-математических наук,профессор о.В. Бецкий кандидат биологических наук И.Б. Лапрун

Ведущая организация: Медицинский радиологический центр РАМН

Защита состоится " " 1995 г. на заседании специализирован -ного совета Д 003.10:02 Института вьказй нервной деятельности : нейрофизиологии РАН по адресу:117865. г. Москва, ул. Бутлерова.5-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института выс нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Автореферет разослан ■" " 1995 г.

Ученый секгчтарь специализированного Совета •

доктор биологических наук • Н.Н Лебедева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время низкоинтенсивное лазерное излучение становится важным компонентом лечения самых различных заболеваний. чаще всего связанных с ишемией и гипоксией /Горбатенко-ва Е. А. с соавт..1989/. Для лечебных воздействий достатотао широко применяется гелий-неоновый лазер /Крюк A.C. с соавт. 1986, Brunner R. 1986, Bas ford J. R. 1989/. Этот вчд изучения стимулирует активность важнейших биоэнергетических энзимов, каталазы /Бобров В.А. с соавт..1988, Коновалов Е.П. с соавт., 1991/, реактивирует супероксиддисмутазу /Горбатенкова Е. А. с соавт., 1989, Чижов Г. К., 1991/, влияет на лигодаь* компоненты мембран эритроцитов /Бабушкина Т.В. с соавт.1989/. Монохроматический красный свет, излучаемый ГНЛ, получил иярокое распространенение и при лечении ишемической болезни сердца /ИБС/ /Агов Б.С. с соавт., 1982,1985, Корочкин И.М. с соавт. 1988,1990/. Тем не менее сведения о влиянии ГШ! на антиокси-дантные системы в зависимости от клинического течения заболевания недостаточны.

Важную роль' в патогенезе ИБС играет интенсифшсация сво-боднорадикальных процессов,приводящих к накопление продуктов перекисного окисления липидов /ПОЛ/ /Негреску Е.В., Лебедев A.B.,1992, Джандатава Т.Т., 1991/. Работами ряда авторов убедительно показано, что-ПОЛ, протекающее по свободноради-кальному пути, является причиной нестабильности клеточных мембран /Абрамова Я.И.. 1985, Барабой В.А. 1991, Владиу.-рое Ю.А., Арчаков А.И.,1972/. Отражением общей струк-

турно-функционапьной характеристики клеточных мембран могут служить "ембраны эритроцитов /Брюгер А.Ф. 1986/. Именно эритроциты обеспечивают антиокислительный потенциал,снижают* интенсивность процессов свободнорадикального окисления /СРО/ липидов, участвуют в уменьшении накопления перекисей различного строения /Журавлев А.И.» 1975, Дубинина Е. С. с соавт.,1984, Suruki Т..1985. Hebbel R..1986 /.

Антиокислительная функция эритроцитов при ИБС приобретает особое значение, поскольку все ее формы характеризуются активацией ПОЛ, а образующиеся в этих условиях перекиси липидов являются факторами, повреждающими биомембраны и другие клеточные структуры /Чуракова £ Д. с соавт.1988, Кацерович З.Р. с соавт., 1982, Шалхарова Ж. Н., 1986, Мс. Cord J., 1985, Hess М., 1985/.

Ферментативная система антиоксидантной защиты чаще всего определяется функционированием супероксиддисмутазы /СОД/, глу-татионпероксидазы /ГП/ и каталазы. При ИБС происходит снижение активности ГП и СОД /Ланкин В.3. с соавт.,1979/. Усиление СРО липидов у больных ИБС по мере прогрессировавши стенокардии способствует нарушению свойств липидной части мембраны эритроцитов и снижению уровня электрической стабильности мембран /Калинина Л. И.,1991/. При этом наблюдается увеличение соотношения холестерин/фосфолипиды (ХЛ/ФЛ), отражающее повышение жесткости мембран /Коро-чкин И.М. с соавт.,1988/. Эти изменения в эритроцитах мигу^ иметь важное патогенетическое значение. Вместе с тем, возможности лазерного излучения воздействовать на регуляцию этих процессов изучены еще недостаточно.

Равную информации может дать изучение взаимосвязи между

активностью ПОЛ и уровнем антиоксидантной защиты, которая в эритроцитах, как и в других клетках, представлена системами ферментативной и неферментативной природы.

Изучение процессов антиоксидантной защиты, в которых участвуют эритроциты, может расширить представления о конкретных механизмах нарушения различных функций красной клетки крови при ИБС и выявить возможную роль лазерного излучения в регуляции.

На основе вышеизложенного были поставлены, следующие цель и>задачи настоящего исследования.

Цель исследования. Выявить особенности регуляции ПОЛ у больных ИБС с различным соотношением ХЛ/ФЛ в мембране эритроцитов и возможность коррекции процессов ПОЛ низкоинтенсивным лазерным излучением.

Основные задачи работы.

1. Изучить функциональное состояние антиоксидантной системы и процессы ПОЛ в эритроцитах у больных ИБС, перенесших инфаркт миокарда, имеющих различное соотношение ХЛ/ФЛ.

2. Выявить особенности влияния низкоэнергетического лазерного облучения на активности антиоксидантных ферментов и показатели ПОЛ эритроцитов больных ИБС при условиях воздействия In vitro и In vivo-,

3. Выявить дифференциально-диагностическую информативность изучаемых показателей и возможность их применения в оценке эффективности внутрисосудистого лазерного облучения при лечении больных ИБС. 1

Научная новизна работы.

В ходи исследований впервые проведено комплексное изучение состояния антиоксидантной системы и интенсивности ПОЛ в эритроцитах здоровых людей и больных стенокардией различной степени тяжести. Установлено, что по мере прогрессирования заболевания происходит снижение активности антиоксидантной системы и увеличение интенсивности ПОЛ. что приводит к нарушению структурной организации мембран.

Показано, что одним из механизмов действия ГНЛ является изменение антирадикальной активности, сопровождающееся реактивацией антиоксидантных систем.

Впервые в сравнительном аспекте исследовано влияние лазерного излучения на регуляцию свободнорадикальных процессов при облучении в условиях In vitro цельной крови, эритроцитов и модельных систем. При этом установлена роль различных белков плазмы, исходного соотношения ХЛ/ФЛ в мембранах эритроцитов в

реализации антиоксидантного эффекта лазерного облучения. • »

Впервые показано,что регуляция системы ПОЛ в эритроцитах низкоэнергетическим лазерным излучением обусловлена прежде всего изменением, активности ферментов супероксиддисмутазы /СОД/ и глутатионпероксидазы /ГП/, а его антиоксидантный эф фекг сопряжен с повышением электрической стабильности мембран эритроцитов как r условиях облучения in vitro, так и при пиутриоппудистом облучении крови больных ИБС.

Научно - практическое значение работы.

Полученные данные показывают целесообразность использова- .

ния показателей активности антиоксидшп'ных ферментов СОД и ГП, а такие величины ЭДП. мембран в качество дополнительных критериев при оценке степени тяжести стенокардии. Поскольку они являются достаточно информативными, то их мо.адо применять в качестве критерия контроля за эффективностью лечения больных ИБС о помощью гелий-неонового лазера,

.Предложенный показатель характерней" и электрической стабильности мембран - ЭДП был использован для диаг остик. степени тяжести стенокардии в кардиологическом отделении МСЧ Ц 2 г. Самары.

Положения, выносимые на защиту.

1. Эритроциты' 'больных постинфарктным шехп? 1 досклерозом характеризуется достоверным повышением ПОЛ на фене снижения активности ферментативных и нефериентативных лнтиоксидантных систем, падения электрической стабильности мембраны и увеличения соотношения ХЛ/ФЛ.

2. Лазерное воздействие на кровь при облучении In vitro и in vivo является эффективным способом рвактивзации ан^юкси-дантных систем эритроцита, рзгуляцик ПОЛ ц нормализации коэффициента ХЛ/ФЛ вв мембранах, что наиболее выражено после внутрисосудистого облучения.

3. Окисленные производные холестерина при инкубации с эритроцитами оказывают ирооксидантное действие, активируя перекисные реакции к ингибируя■ активность антиоксидаитных ферментов при этом наблюдается увеличение соотношения ХЛЛЛ, которое восстанавливается после лазерного воздействия.

и

Объем 1 структура диссертации.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, включающих обзор литературы, методику, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводов. Работа иллюстрирована 28 таблицами, список литературы содержит .206 отечественных и иностранных источников.

Апробация работы. и

Результаты исследований доложены на итоговой конференции ЦНИЛ (1993 г.), ХХУ конференции преподавателей и сотрудников Самарского государственного университета (1994 г.). на научно-практической конференции, посвященной 91-годовщине со дня рождения профессора .С.В.Шестакова (1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы были положены результаты исследования 149 больных стабильной стенокардией напряжения II и III ФК. пере-несчих инфаркт миокарда, возраст которых составил от 40 до 69 лет. Ь контрольную группу- вошли 48 практически здоровых лиц ?ПЗЛ/, у которых при исследовании не выявлялась патология со стороны жизненна важных органов и систем.

Все больные находились на обследовании и лечении в кардиологическом отделении МСЧ N2 г. Самары. Из числа обследуемых

И -

,по общепринятой методике по-Сгьюденгу. Изменения исследуемых показателей считались статистически значимыми при Р < 0, 05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

• У больных ПИМ были выявлены зависимые от тяжести ССН изменения ПО/7 и системы антиоксидантов. Исследования индукции ПОЛ в эритроцитах проводили в ферментативной и к-зфермгмтатив-ной системах переокисления. Оказалось, что при НАДФН - зависима индукции МДА в эритроцитах образуется больше /4,87±с,53 здоровые люди. 6,75 + 0,69 Р > 0,05 ССН II ф. класс и 7,12 ± 0,33 Р < 0,01 ССН III Ф.класс/, чем при индукции аскорбиновой кислотой /«С, 43 ±0,29 здоровые люди. 2.95 ±0,29 Р > 0, 05 ССН II ф.класса, 4,32 ± 0.27.РЧ 0.01 ССН III ф. класса/. Это свидетельствует о тон, что в эритроцитах имеет место преимущественная"активация липопероксидации по ферментативному /НАДФН - зависимому/. Таким образом, это может указывать на существование различных центров радикалообразовашш з реакциях ферментативного /НАДФН - зависимого/ и неферментативнг v/ac-корбатзависимого/ перео"исления фосфолигшдов в эритроцитах. Достоверное увеличение интенсивности ПОЛ по всем исследуемым показателям выявляется лишь у больных III ф.класса. У больчых II и III группы достоверные различи наблюдаются лияь при индукции ПОЛ аскорбиновой кисЛотой.

Регуляция липоперекисных реакций реализуется различными системами как ферментативной так и неферкентапгоной npi-pc ;;й /Прайор У.1979/. снижение которых наблюдали у больных ¡ЕС /Ллсов В. И: с соавт. .1982, Грицюк A.il. 1934/. Причем У б о-лшг

[1ИМ снижение активности антаоксидантной системы связано со степенью т-.жести заболевания, если у больных ССН II ф. класса актив )сть антиоксидантных ферментов СОД, ГР и каталазы имела лишь тенденцию к снижению /достоверно снижалась только активность ГП/, на 30.9% /Р < 0,01/, то в группе больных ССН III ф.класса все показатели системы антаоксидантной защиты достоверно снижены, т.е. уровень изменений нарастал соответственно тяжести ССН.

Снижение количества восстановленного глутатиона, отличительной особенностью строе :ия которого является наличие суль-фгидрильных групп /Соколовский В.В., 1979. Починок Т.В., 1985/ у больных ПИМ на 28,67% /И< 0.05/ ' ч 44.24% /Р < 0,01/ соответственно во II и III грушах может такие способствовать увеличению интенсивности ПОЛ, особенно в III группе. Вторым компонентом неферментативной системы антиоксидантной защиты является витамин Е /жирорастворимый антиоксидант/ значения которого таете достоверно снижены на 19,84Ж /Р < 0, 05/ и 30,90% /Р < 0,01/ во II и III группах. Таким образом, у больных ПИМ выявляется снижение показателей и неферментативной системы антиоксидантной защиты, что также наиболее значительно проявляется у больных III группы.

При пзерном облучении суспензии эритроцитов реактивации антиоксидантных систем во II и III группах не происходило, наблюдалась даже тенденция к снижению активности ферментов, а активность ГП снизилась F" 21,11% /Р < 0,05/ во II группа и на 28. Oft /Р < 0,0V в III, что выразилось в интенслфикации про-пег зд'ПОЛ. Использование лазерного облучения для коррекции этих процессов при обличении цельной крови и отмытых эритроци-

тов вызывало неоднозначные изменения в интенсивности ПОЛ. При облучении как эритроцитов так и цельной крози здоровых людей не наблюдалось достоверных изменений в накоплении МДА после лазерного воздействия, что согласуется с данными Горбатенковой Е.А. с соавт..1988, о том , что на нормально функционирующие клетки лазерное излучение не оказывает существенного влияния.

При облучении эритроцитов и цельной крови больных людей выявлена различная концентрация МДА при отсутствии или наличии плазмы. При 10 - минутном облучении суспензии эритроцитов больных ■ II группы концентрация МДА при НАДФН - зависимой индукции увеличилась на 20,89% /Р > 0,05/, а при индукции аскорбиновой кислотой на 52,88% /Р < 0,05/ и на 35,11% /Р < 0,01/, 34,49% /Р < 0,05/ соответственно у больных III грутпы. Таким образом, в данном случае наблюдается достоверное усиление процессов ПОЛ у больных III группы, что можно объяснить превышением дозы лазерного' облучения эритроцитов в. отсутствии плазмы. Доза лазерного излучения вычисляется по формуле Е = W* t, где Е и W - соответственно доза в джоулях /да/ и мощность в ваттах /вт/ лазерного излучения, t - время воздействия в секундах.

При облучении цельной крови в аналогичных дозах у больных II группы выявлялась тенденция в снижении неферментативного ПОЛ на 14,24% /Р > 0,05/ и возрастание ферментативного на 17,78% /Р > 0, 05/ И соответственно на 5,52% /Р > 0,05/, 29,49% /Р < 0,01/ в III группе. Полученные результаты могут свидетельствовать о том. что лазерное излучение оказывает 7првде-ленное влияние на функциональные группы мембрэчных белков,1 то-кализованных в гидрофобной зоне мембран, т.к. они служат

центрами инициирования в аскорбатзависимом липопереокислении /Козлов Ю.П.. 1976/.

При облучениии эритроц"тов с добавлением альбумина и фибриногена эффект лазерного воздействий был неоднозначным. После облучзния эритроцитов с 2,5% раствором альбумина выявлено снижение на 31,19% /Р < 0,05/ концентрации МДА при не-фермен/ативной инициации и на 14. 52% /Р > G, 05/ при ферментативной у больных II группы, на 26.16% /Р < 0,05/ и на 11,80% /Р > 0,05/ сооизетственно у больных III группы. При добавлении фибриногена в аналогичной концентрации не выявлено достоверного ингибирования ПОЛ во II и III группах в ходе лазерного воз-действимк. Полученные данные согласуются с данными Заводкина И.Б. с соавт., 1991 о том, что именно' раствор сывороточного альбумина оказывает наибольшее влияние*на мембраны эритроцитов.

'Учитывая возможный фототоксический эффект лазерного излучения в случае облучения суспензии эритроцитов, для внутрисосудистой лазеротерапии" была использована меньшая мощность до 5 мвт на выходе. Тем не менее. Именно внутрисосу- . дистле облучение выявило наибольший эффект на ингибирование ПОЛ. Наиболее выраженное снижение количества МДА было отмечено В' спонтанном-ПОЛ На 41,0655 /Р < 0,05/ , 35,6555 /Р < 0,05/и Ш'орбатзаЕНсийом как во II так и III группе. При ферментативной инициации пронзилась лишь тенденция к снижению ПОЛ в этих ' группах:-" "

ТакШ образом, '"в • эритроцитах больных ССН найдено досто-• кёриЬа' урел1ченяе интенсивности ПОЛ ho"всем иса.здуемым пок?-' 'гатлЬги' - лишь в III группе: Эритроцитах здорсвых и больных

наблюдалось резкое снижение активности всех ферментов анти-оксидантной защиты которое составило 30 - 40%. Уровень неферментативной систему антиоксидантной защиты снизился менее значительно. Это сопровождалось увеличением мольного соотношения ХЛ/ФЛ на 40,27% /Р <0,001/, которое составило 1.15 + 0. 05,., что согласуется с данными /Вольновой Т.В. с соавт.1D88/. При этом наблюдалось снижение электрической стабильности мембраны, уровня ЭДП на 17,89% /Р < 0,05/, что сопровождалось активацией °процессов ПОЛ - как исходного, так и инициированного. Лазерное излучение оказало нормализующее влияние на антиоксидантную систему и процессы ПОЛ. Так активность основных антиоксидант-ных ферментов > восстанавливалась до исходного уровня, что не происходило с компонентами неферментативной системы. Одновременно с этим наблюдается достоверное снижение мольного соотношения ХЛ/ФЛ на 21,74% /Р < 0,05/, что сопровождалось снижением уровгя холестерина на 16,86% /Р < 0,05/ и восстановлением электрической стабильности мембраны. Эти процессы сопровождались достоверным снижением иницированного ПОЛ.

Таким образом, полученные в эксперименте результаты с облучением эритроцитов после инкубации свидетельствуют о неоднозначном влиянии лазерного излучения на восстановительные процессы. Наиболее эффективно эти процессы происходят в эритроцитах с соотношением ХЛ/ФЛ > 1. что сопоставимо с полученными результатами о более значительном воздействии лазерного излучения на эритроциты больных ССН III ф. класса.

ВЫВОДЫ

1. У больных с постинфарктнам миокарЛиосклерозом выявлено

снижение активности ферментативных и неферментативлых анти-

оксидантных систем эритроцитов, сопровождающееся интенскфика-

с

цией ■ процессов перекисного окисления липидов, падением электрической стабильности и перестройкой > структуры их мембран. 0

2. Тяжесть течения стенокардии напряжения у больных постинфарктным шокардиосклерозом сопряжена со степенью и характером изменений ангиокислительиых и структурных свойств эритроцитов. При стабильной стенокардии напряжения II ф.класса снижена активность глутатионпероксидазк, концентрация восстановленного глутатиона и витамина Е, у больных стабильной стенокардией напряжения III ф.класса падает активность всех анти-оксидантных ферментов, уровня восстановленного глутатиона и витамина Е, при возрастании соотношения холестерин/фосфолипи-да.

3. Лазерное воздействие на кровь при облучении in vitro и In vivo являются эффективным способом реактивации антиокси-дантных систем эритроцита, регуляции перекисного окисления липидов j нормализащи коэффициента холестерин/фосфолипиды в мембранах. Оптимальными параметрами лазерного излучения является доза 3-6 Д&.

4. Ьнутрисбсудистое лазерное воздействие на кровь является -эффективным способом нефармякологическо^о влияния на ■состояние ее антиоксидантной 'системы и может бытт. использовано

для лечения больных стабильной стенокардией напряжения, перенесших инфаркт миокарда.

5. Инкубация эритроцитов с окисленными производными холестерина приводит к увеличению соотношения холестерин/фосфо-липиды, которое восстанавливается после лазерного облучения. .

6. Данные о состоянии активности глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и электричской стабильности мембраны эритроцита могут быть использованы как дополнительные лаборатор-но-биохимические критерии при оценке эффективности лазеротерапии.

Практические рекомендации

1. Для повышения диагностических критериев степени тяжести стенокардии рекомендуется определение активности СОД и ГП, а также величины ЭДП в качестве маркера функционального состояния мембран эритроцитов.

2. Показана целесообразность использования этих показателей в качестве критерия контроля за эффективностью лечения больных ИБС гелий-неоновым лазером.

Список печатных работ по теме диссертации

1. Кленова H.A., Васильева И.Ф. Механизм воздействия уни-тиола на мембраны эритроцитов больных, перенесших инфаркт, мио карда //В сб. Совершенствование диагностики и оптимизация лечения в'кардиологии. Куйбышев, 1989,с.78-84.

2. Фатенков' В. Р., Васильева И. Ф. Тимирбулатов Р А.. Кириллов В.И. Влияние лазерного облучения крови на состояние ли-тиоксидантннх ферментов у больных стенокардией. - Куйбышеа,

1991,- 5 е.- Деп.В ВНИИМИ 21.03.1991 N Д-21148.

3. Фатенков В. Ii., Васильева И.Ф.Давыдкин И. Л., Васильев А.Ю. Особенности изменений антиоксидаитных систем эритроцитов у больных стабильной стенокардией при;лазерном облучении.-Самара.-199^. - 7 с.-Деп.В ВНИЮТ 29.10.93 N Д-23772.

4. Селезнев Е.И., Васильева И.Ф.. Давыдкин И.Л. Состояние перекпного окисления липидов и активность антиоксидантной системы эритроцитов при внутрисосудистом лазэрном облучении. //Сб. тезисов i< научно-практической конференции Самарскому государственному институту-университету-75.-1994.-с.30-31.

5. Фатенков В.Н., Селезнев Е.И., .Васильева И.Ф.. Давыдкин И.Л. Влияние внутрисосудистого лазерного облучения на состояние антиокислительных ферментов эритроцитов и функциональные свойства их мембран при лечении. ИБС. //Тезисы доклада на симпозиуме "Клинико-инструментальная диагностика в хирургии"/. Москва, 1994,с.220.

6. Васильева И.Ф. Влияние внутрисосудистом лазеротерапии на активность антиоксидангных ферментов и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в^эритроцитах больных стабильной стенокардией напряжения. //Тезисы доклада на научно-практической* конференции, посвященной 91-й годовщине со дня рождения профессора С.В. Шестакова/. Самара, 1994,с.22-24.