Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Содержание и фракционный состав сывороточных гликозаминогликанов при заболеваниях околосуставных мягких тканей и их повреждении в эксперименте

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Содержание и фракционный состав сывороточных гликозаминогликанов при заболеваниях околосуставных мягких тканей и их повреждении в эксперименте"

ПБ од

1 3 ^ г

На правах рукописи

МАКЕЕВА Елена Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ И ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ СЫВОРОТОЧНЫХ

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОКОЛОСУСТАВНЫХ МЯГКИХ ТКАНЕЙ Н ИХ ПОВРЕЖДЕНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

03.00.04 - биохимия

кандидата биологических наук

РОСТОВ-НА-ДОНУ - 1996

Работа выполнена в Волгоградской медицинской Академии и филиале Института ревматологии РЙШ1.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор ГАЛАКВ Ю.В.

Научный консультант; академик ¡РАМН

ЗБОРОВСКИЙ А.Б.

Официальные- оппоненты.-

доктор биологических наук, профессор Храмов В.А. доктор биологических наук Иикашинович З.И.

Ведущая организация: Ростовский ордена Трудового Красного Знамени Государственный университет,

Защита состоится " ___1896г. в часов на

заседании Диссертационного Совета Д 084.53.01. при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г.Ростов-на-Дону, пер.На хичеван ский, 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета. Автореферат разослан

УчеяыЯ секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я.Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность теми. Важность изучения метаболизма соединительной ткани (СТ) при ревматических заболеваниях подчеркивалась разными авторани на протяжении последних 40-50 лет {Насонова В.А., Астапенко И.Г., 1989). В связи с этим, наибольший интерес вызывало состояние основного вещества СТ (экстрацеллилярного матрикса), главным компонентом которого являются протеогликановые комплексы.

Воспалительные и дегенеративные процессы, происходящие при том или ином ревматическом заболевании, приводит к дезорганизации протеогликановых комплексов с последующим накоплением входящих в их состав гликозаминогликанов (ГАГ) в тканях и, соответственно, с повышением их содержания в биологических жидкостях, прежде всего, в сыворотке крови {Астахова Т.Д. и соавт., 1987; Зборовский А.В. и соавт., 1987; Карякина Е.В. и соавт., 1982, 1983, 1987).

В последние годы предложены различные высокочувствительные и специфичные методы определения углеводных и белковых компонентов протеогликанов {ПГ) (Chun, 1988; Delpeeh. еЪ а!., 1985; Hodson, 1991), обнаружение которых в крови рассматривается как свидетельство повреждения СТ при ревматических заболеваниях.

Наряду с этим, по-прежнему малоизученным оставался вопрос о характере и степени нарушения метаболизма ГАГ при в не суставных пораженках ревматического характера, несмотря на то, что эта патология, называемая за рубежом "внесуставным ревматизмом," занимает первое место в структуре временной нетрудоспособности среди ревматических заболеваниях.

НЕДЬЮ настоящего исследования явилась оценка изменений в содержании сывороточных ГАГ и соотношения их Фракций при различных Формах заболеваний внесуставных мягких тканей (ЗВМТ) и при повреждении околосуставных мягких тканей (ОМТ) в эксперименте с последуицей разработкой на основании полученных данных методов лабораторной диагностики ЗВМТ.

ЗАПАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Разработка метода повреждения ОМТ в эксперименте (создание модели повреждения ОМТ у лабораторных животных).

2. Идентификация полученных с помочью ЭФ в 11ААГ фракций ГАГ сыворотки крови экспериментальных животных (крыс) и здоровых яиц.

3. Оценка характера и степени количественных изменений сывороточных ГАГ при экспериментальном повреждении ОМТ.

4. Определение и сравнение общего содержания ГАГ в сыворотке крови больных ЗВМТ с больными остеоартрозом (Ой), ревматоидным артритом (РА) й здоровых лиц (ЗЛ).

5. Определение и сравнение фракций ГАГ в сыворотке крови больных ЗВМТ с больными ОА, Рй и ЗЛ.

6. Анализ уровня суммарных ГАГ и соотношения отдельных фракций при различных клинических формах ЗВМТ.

7. Оценка динамики уровня ГАГ и их фракций' при ЗВМТ под воздействием лечения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые с помощь» введения папаина в периартикулярные ткани получена 1 модель повреждения ОМТ дегенеративно-дистрофического характера, а также исследован уровень и Фракционный состав ГАГ при этом состоянии. Выявлено нарастание сывороточных ГАГ преимущественно за счет глюкуронсодержащих Форм и нарушение фракционного соотношения ГАГ при повреждении ОМТ в эксперименте, характеризующееся

увеличением процентного содержания 4-й Фракции при снижении 3-й Фракции.

Впервые в настоящей работе результаты эксперимента позволили поставить задачу исследования ГАГ сыворотки крови при ЗВМТ, причем проведено определение не только суммарных ГАГ, но и их отдельных фракций, полученных с помощью ЭФ в ПААГ. Проведено сравнение исследованных показателей между группами больных ЗВНГ, ОА, РА и ЗЛ. Проведен анализ выраженности изменений сывороточных ГАГ при различных формах поражения ОПТ, а также в результате проведенного лечения.

Обнаружено повышение уровня суммарных ГАГ в сыворотке крови больных с ЗВМТ. Изменение Фракционного состава характеризовалось увеличением 2-й и 4-й Фракций при уменьшении 3-й. Показана прямая связь между уровнем сывороточных ГАГ и тяжестью, а также распространенность!) поражения ОМТ. Установлено, что под воздействием комбинированной терапии наблюдается тенденция к нормализации исследуемых показателей.

ирдктичкскпя_тонкость _ Усовершенствован метод

электрофоретического разделения ГАГ сыворотки крови с идентификацией основных Фракций ГАГ, что позволяет рекомендовать ЭФ в ПААГ для оценки соотношения различных Фракций ГАГ в биологических жидкостях.

Обнаруженное повышение общего содержания ГАГ в сыворотке крови больных, изменение. Фракционного состава ГАГ за счет повышения Фракций, представленных преимущественно

хондроитинсульФотом (ХС), а также дерматансульфатом (ДС) и гепараисульфатом СГС), свидетельствует о нарушении метаболизма СТ при указанной патологии и дает основание для использования методов количественного определения ГАГ в диагностических целях. Учитывая тот факт, что уровень сывороточных ГАГ и их

отдельных фракций отражает степень тяжести патологического процесса, а также положительный эффект проводимой терапии, применение указанных методов позволит дать объективную оценку состояния больного, контролировать адекватность лечебных мероприятий, определить срок лечения.

ВНЕПРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Методы диагностики поражения ОМТ, базирующиеся на определении суммарных ГАГ и их фракций внедрены в МСЧ п/о "Баррикады"г.Волгоград. Додана заявка на выдачу патента на способ моделирования повреждения ОМТ.

ОСНОВНОЕ ПОЛОЖЕНИЕ. ВЫЯОСИМОВ Ш ЗАЩИТУ: о Значении определения суммарных ГАГ и ик Фракций в сыворотке крови для оценки степени и характера повреждения ОМТ, а также для контроля за эффективностью лечения.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из ни* 5 в местной печати и 4 в центральных сборниках.

дпрояяпия раеотн. Основные положения работы доложены на годичных научных сессиях Волгоградской медицинской Академии (1992-1995гг,), ХШ Конференции молодых ученых Волгоградской медицинской Академии (1993г.), XV съезде ревматологов СССР (Минск, 18Э1г.), I съезде ревматолог» России (Оренбург, 1993г.), на ; I Пленуме республиканского научно-медицинского общества ревматологов Украины (1991г.).

ОБЪЕМ и СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЙ. Диссертация изложена на 123 страницах малинописного текста. Состоит из введения, части I обзора литературы, представленной одной главой; части II -собственны* исследований, состоящей из 6 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Указатель литературы содержит 249 источников, из них 81 отечественных и 168 зарубежных авторов. Диссертация илвстрирована 11 таблицами, 12 рисунками и 3 схемами. *

иатЕРналы и методы исследования

Модеяь_дегекератиано-дистрофического_порядения_от

вызывали у 34 крыс Wistar 3-4 месячного возраста весом 300-350Г путем введения 1мг папаина под кожу в средней трети хвоста. Животные получали 8 инъекций папаина в течение 4-х недель. 18 Эконтрольных крыс получали инъекции Физиологического раствора по той же схеме. Через 3 недели с момента последней инъекции у крыс забирали кровь и в полученной сыворотке определяли общее содержание и Фракционный состав ГАГ описанными ниже способами. Участки тканей в месте введения папаина иссекали и заливали 10% раствором Формалина. Из образцов тканей готовили срезы для световой микроскопии, окрашивали их гематоксилинэозином и пирофуксином по Ван Гизону.

Морфологические исследования проводили в отделении патологической анатомии городской клинической больницы скорой медицинской помощи (ГКБСМП) г.Волгоград.

Клинический материал. В работе использованы образцы сывороток крови 166 больных с различными Формами поражения ЗВМТ, 76 больных с заболеваниями суставов: РА - 35, OA - 41, а также 45 ЗЛ.

Набор клинического материала проводили совместно с сотрудниками лаборатории методов лечения и профилактики заболеваний мягких тканей Филиала Института ревматологии РАМН на базе МСЧ п/о "Баррикады", ревматологического отделения и отделения переливания крови ГКБСМП.

В группе больных с ЗВМТ преобладали женщины (63%), возраст больных колебался от 25 до 63 лет, средний возраст составил 44 года. В структуре ЗВМТ преобладали периартриты (41,6%), затем по частоте следовали поражения мышц (8,4%) и тендиниты (9,6%), лигаментитв в виде тунелышх синдромов различной локализации

наблюдались в 9% случаев, контрактура ладонного апоневроза диагностировалась у 10,8% больных. У 13,9% обследованных наблюдались сочетания различных Форм поражений ОПТ. В группе больных Рй женщины составляли Ь7%, возраст больных колебался от 23 до 60 лет, средний возраст составил 43 года. Группа бальных Oß также характеризовалась преобладанием женщин (73%), возраст больных - от 25 до 60 лет, средний возраст составил 46 лет.

Б группу ЗЛ включены доноры отделения переливания крови ГКБСШ, прошедшие клиническое и лабораторное обследование, у которых были исключены заболевания внутренних органов и опорно-двигательного аппарата. Среди них было 30 женщин, 15 мужчин, средний возраст 38 лет,

Выделение ГЙГ из сыворотки крови проводили по методу Е.В.Карякиной (1882} в навей модификации. Принцип метода состоит в растворении ГЙГ и отделении их от белков при воздействии хлорной кислоты с последующим осаждением ГЙГ фосфорно-вольфрамовой кислотой и очисткой последовательным осаждением этанолом и цетилпирндиния хлоридом.

Определение уровня ГДГ_Щ2_СОД.еРДаНИЮ_УРРКОВНД_КИСЛОТ ■

Количественное определение ГАГ проводили по входящим в их состав уроновым кислотам карбазолоаым методом (Косягин Д.В. и соавт.,1988). Содержание ГЙГ определяли в соответствии с калибровочным графиком, построенным по глюкуроновой кислоте, а также в соответствии с калибровочным графиком, построенным по ХС.

Определение уровня ГЙГ в сыворотке крови по_содержанию

гексоз. связанных , с серонукоидом проводили орцмновым методом (Меньшиков В.В. и соавт., 1987).

Содержание ГЙГ определяли по калибровочному графику, построенному в соответствии с разведениями стандартного раствора, содержащего 0,5Н маннозы и 0,5М галактозы.

Дда_разделения аывррохочныа_гаг использовали метод

лискэлвктроаосеза в ППЯГ. В качестве концентрирующего носителя готовили 5Х ПААГ, а в качестве разделяющего - 10% ПААГ. Полимеризацию геля проводили в стеклянных трубках размером 75Х5мм. Сухие образцы ГАГ, полученные, как было описано выше, растворяли в 0,2мл О,01М трис-глицинового буфера рН 8,3 и вносили в трубки. ЭФ проводили при начальной силе тока 1мА на трубку в течение 10-15мин, а затем при 2мА на трубку в течение 50-бОмин. Для окрашивания фракций кислых мукополисахаридов использовали 1% раствор алцианового синего.

Для определения соотношения разных Фракций ГАГ проводили сканирование злектрофореграмм с помощью денситометра "Chromoscan 3" {"Joyce ЬоеЫ", Англия}. Расчет производили по отношению площади пика каждой Фракции на денситограмме к общей площади всех пиков и выражали в процентах.

Для идентификации_фракций гаг анализировали

электрофоретическу» подвижность и разделение на фракции коммерческих препаратов индивидуальных ГАГ (ГК, ХС, Г) и комплексных Фармакологических препаратов ГАГ (артепарон, стекловидное тело, хонсурид). Наряду с этим в работе использовали препаративный ЭФ в ПААГ с последующим количественным определением уроновых ' кислот и гексоз в элюированиых фракциях.

Ферментный гидролиз препарата сывороточных ГАГ проводили с помощью обработки стрептококковой гиалуронидазой по методике Lindahl et al. (1973). Гидролиз гепарансульфатов проводили при помощи азотистой кислоты по методике В.И.Рыковой (1Э83).

Статистическую гичряботст полученных результатов проводили на персональном компьютере IBM с использованием программы "SuperCalc-4". Достоверность различий между сравниваемыми

группами оценивали по критерию Стьюдеита.

еезульмш. исследования и ик орстпкиик

ЭлектроФоретическим разделением препаратов суммарных ГйГ было получено не менее 5 фракций, даюцих четкое окракивание с алциановнм синим. Сравнение Фореграмм экстрактов ГйГ,полученных из сыворотки крови человека и крысы, с результатами ЗФ коммерческих препаратов ГАГ: ГК, ХС, Г, артепарона, хонсурида и стекловидного тела позволили сделать предварительные заключения о составе Фракций сывороточных ГйГ.

Препарат ГК давал одну фракцию, расположенную у старта, препарат ХС - 2-е фракции, соответствующие по, подвижности 2-й, 3-й и 4-й фракциям сывороточных ГАГ, а Г несколько сливающихся Фракций, подвижность которых приближалась к таковой в препарате ХС, определялась и дополнительная. - наиболее "быстрая" фракция, расположенная на наибольшем расстоянии от старта.

Анализ денситограмн этих веществ показа» (рис. 1), что ГК представлена, в основном, одним мощным пиком, непосредственно у старта. ХС давал два пика поглощения, а Г соответствовали несколько пиков, причем, позиция последнего пика была максимально удаленной от старта.

Аптечные препараты комплексных ГАГ артепарона и хонсурида давали сходную картину при электрофоретическом разделении: преобладали фракции с выраженной и умеренной подвижностью, тогда как "медленные" фракции практически ; не определялись. Денситогранма артепарона в большей .. степени, чем хонсурида, соответствовала картине, полученной при сканировании препарата чистого КС. Препарат стекловидного тела давал наибольшее: число Фракций (5-6), причем определялась достаточно четкая фракция на

Рис. 1-Денситограммы коммерческих препаратов ГАГ в 10* ПЛАТ: а - гиалуроновой кислоты; 6 - хондроитинсульфата; в - гепарина;г - хонсурида; д - артепарона; е - стекловидного тела.

старте, соответствующая таковой в препарате ГК.

Последующий анализ полученных с помощью препаративного ЭФ элюатов Фракций на содержание гексоэ и глюкуроновой кислоты показал, что глюкурон-содерлащие ГЙГ преобладают в 1-й, 2-й, 3-й и 5-й Фракциях, в 4-й Фракции присутствуют идуронсодержащие ГЙГ (ДС) или ГАГ, в состав которых не входят ггроновые кислоты (КС). Учитывая, что, согласно данным литературы (Rosenberg, 1985) количественное содержание ДС в сыворотке крови значительно выше, чем КС, можно предположить, что в 4-й Фракции присутствует ДС.

Использование методов ферментного и кислотного гидрохнза позволило уточнить распределение основных .видов сывороточных ГАГ в электрофоретических Фракциях. Обработка экстракта ГАГ гиалуронйдазой, разрушающей структуру ГК и ХС, приводила к исчезновению 5-й фракции и уменьшению 2-й, 3-й и 4-й фракций. Воздействие азотистой кислоты, разрушающей ГС, приводило к исчезновению 1-й фракции и- некоторому уменьшению 2-й и 4-й фракций, что говорит о том, что 1-я Фракция представлена преимущественно ГС, а во 2-й и 4-й Фракциях ГС присутствует в меньшем количестве, чем ХС. '

Последовательное проведение Ферментативного и кислотного гидролиза привело к исчезновению всех Фракций, за исключением 4-й, интенсивность которой при этом значительно снизилась, что свидетельствует о присутствии ДС в 4-й фракции.

Полученные нами результаты \ говорят о количественном преобладании. ХС в сыворотке крови. Эти полисахариды являются основными во 2-й, 3-й и 4-й фракциях ГАГ. Наряду с этим, во 2-й и 4-й фракциях определяются ГС, а в ,4-й еще и ДС. 1*-я и 5-я фракции более однородны, они содержат ГС (1-я) и ГК (5-я).

Следует подчеркнуть, что представленные результаты

согласуются с данными литературы, в которых указывалось на сходное распределение ГАГ, выделенных из сыворотки крови и тканей, при проведении ЭФ на бумаге и в ПААГ (Меркурьева Р.В., 1975; Рыкова В.И., 1983; Hlenegard et al., 1985; Show, 1985), В указанных работах отмечалось, что наименьшей

электрофоретической подвижность» обладает ГК, в то время как ХС и ГС характеризуются значительно большей подвижностью, которая во многом зависит от способа выделения ГАГ из тканей и биологических жидкостей, а также от методики проведения ЭФ. .

При сравнении результатов идентификации фракций ГАГ, полученных из сыворотки крови человека и крысы, нами не было обнаружено существенных различий в распределении индивидуальных ГАГ в электрофорегических фракциях. Однако, что касается процентного соотношения Фракций сывороточных ГАГ, то в человеческих и крысиных образцах эти показатели различались (табл. 1). Преобладание 3-й Фракции, представленной ХС, над другими Фракциями в крови человека оказалось более выраженным, чем в крови крысы. В человеческих образцах 2-я фракция преобладает над 4-й, тогда как в крысиных отмечено двухкратное преобладание 4-й фракции над 2-й. Уровень 5-й Фракции в крови крысы оказался ниже, чем в крови человека.

Таблица 1

Фракционный состав ГАГ в сыворотке крови здоровых лиц и интактных крыс

Группа ! обследуемых! ! ! N ! ! И ■ Ф Р А К ц И и (*)

1 | ! П ! 1 ! 2 i 3 1 4 ! 5

Здоровые лица 45 М m 13, 1, 46 07 + 18,72 1,21 + 43,91 t 2,19 12, 1, ,10 t ,26 11,78 0,94 ±

Ннтактные крысы 18 М га 15, 1. 64 87 ± 13,97 1,31 t 36,72 ± 3,15 26, 1, ,52 ± ,34 7,07 1,49 ±

Полученные результаты говорят о различном соотношении ХС и ГС, а также ДС в образцах крови здоровых людей и интактных

крыс.

При количественном определении суммарных ГАГ обнаружено более высокое содержание этих веществ в крови крысы по сравнению с человеческими образцами (табл. 2). В пересчете на ХС эта разница оказалась почти двухкратной. Оценка количественных и качественных различий в исходном уровне сывороточных ГАГ в образцах крови человека и крысы была необходима для правильного анализа характера изменений, возникающих как при экспериментальном повреждении ОПТ, так и при периартикулгрных заболеваниях у людей.

Таблица 2

Уровень ГАГ в сыворотке крови здоровых лиц и интактных крыс

Группа обследуемых N ! М ± а Орцпновая проба! Карбазоловая проба

i ; (г х 10' гексозы ! 5/л) ХС ! уроновые кислоты

Здоровые лица 45 М т 46,08 ± 3,42 46,15 ± 2,64 5,43 ± 0,39

йнтактные крысы 18 И а. 54,00 ± 3,06 79,05 ± 5,78 9,51 ± 0,97

Что касается экспериментального воспроизведения поражения ОМТ, то в доступной литературе мы не обнаружили описание модели периартикулярного воспалительного или дегенеративно-дистрофического процесса. Вместе с тем, как зарубежными, так и отечественными исследователями использовались различные модели поражения суставов.

Поскольку патогенетические механизмы развития наиболее часто встречавшихся ЗВМТ сходны с таковыми при ОА, мы уделили большее внимание анализу имеющихся способов воспроизведения дегенеративно-дистрофического процесса в суставе (Удод В.Н. и со-авт., 1983; Иацкевичус З.К. и соавт., 1987; Gruz et al., 1989) В целом все способы воздействия могут быть разделены на

две группы: • хирургическое вмешательство и воздействие химических веществ. Первая группа методов приводит к нарушения конгруэнтности суставных поверхностей, биомеханики сустава и соответственно - к развитию обменно-дистрофических нарушений в хряще. Вторая группа методов, основанная на применении протеолитяческих Ферментов, направлена непосредственно на метаболические процессы в хряще. Среди этих методов наиболее адекватным, по нашему мнению, можно считать внутрисуставное введение папаина, гидролизующего пептидные связи в структуре ПГ-комплекса. Указанный метод предпочтителен и в связи с его воспроизводимостью в плане поражения периартикулярных структур.

Результаты гистологического контроля показали, что в участках введения папаина наблюдается утолщение фиброзно-волокнистого слоя, дезорганизация основного вещества, проявляющаяся разволокнением. Фрагментацией фибриллярных структур, нарушением их правильной ориентации. При этом в препаратах обнаружено появление созревающих Фибробластических элементов, что свидетельствует об усилении продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса.

Аналогичная картина обнаружена и в участках мышечной ткани: на фоне дистрофических изменений миофибрилл, отмечалось периваскулярная инфильтрация межмышечной СТ, очаги фиброза.

Несмотря на то, что под воздействием папаина наблюдалось ' увеличение фиброзно-волокнистого слоя и разрастание межнышечной ' СТ, гистохимическими методами установлена убыль кислых нукополисахаридов в Фиброзно-вояокнистом и мниечном слоях; Следует отметить, эти результаты морфологических исследований согласуется с данными литературы и Могут рассматриваться как" доказательство возникновения дегенеративно-дистрофического процесса в ОМТ.

Исследование образцов сывороток крови опытной и контрольной группы животных показало нарастание общего содержания ГАГ в первой группе по сравнению со второй (табл. 3). Вместе с тем, результаты двух параллельно используемых проб оказались неодинаковыми: достоверное увеличение уровня ГАГ отмечено по данным карбазоховой реакции, что может говорить о преимущественном нарастании глюкуронсодержащих ГАГ. Кроме того, обнаруженные отличия свидетельствуют о большей информативности карбазоловой пробы, отражающей уровень ГАГ но специфическим моносахаридам, входящим в их состав.

Таблица 3

Уровень ГАГ в сыворотке крови экспериментальных животных (крыс)

N ! М !Орциновая проба! Карбазоловая проба

Группа

1 1 т ! (г X гекеозы ! ХС ! уроновые кислоты

Опытная группа 34 И т. 57,6 + 2,16 108,63 ± 8,95 12,61 ± 0,97

Контрольная группа 18 н т 54,00 + 3,06 79,05 ± 5,78 9,51 + 0,97

Экспериментальное повреждение ОНТ характеризовалось не только увеличением общего содержания ГАГ, но и изменением их фракционного состава (табл. 4, рис. 2). По сравнению с контрольной группой в группе животных с поражение ОМТ наблюдалось достоверное увеличение 4-й фракции и тенденция к нарастанию 2-й фракции при снижении 3-й. Бели в крови интактных животных преобладающей фракцией была 3-я, то в опытной группе 4-я Фракция оказалась самой выраженной. Как следует из результатов ЭФ, изменения касаются указанных трех Фракций, главным компонентом которых являются хондроитинсульФаты: происходит увеличение ХС с более низкой электрофоретической подвижностью, что может говорить о структурных изменениях этих

похисахаридов, приводящих либо к увеличению их молекулярной массы, либо - к уменьиенню числа анионных групп, определяющих величину отрицательного заряда макромолекулы ГАГ. Необходимо учесть и тот Факт, что 2-я и особенно, 4-я фракция неоднородны по составу ГАГ. В каждой из них присутствует ГС, а в 4-й еще и ДС, но в количестве значительно меньшем, чем КС. Тем не менее, нарастание 4-й Фракции при папаиновой модели поражения ОНТ может быть обусловлено и увеличением содержания ДС и ГС в сыворотке крови.

Табица 4

Фракционный состав ГАГ в сыворотке крови экспериментальных животных (крыс)

Группа ! N 1 ! М 1 * РАК Ц И И (*)

животных '"!• 1 ! т ! 1 ! 2 ! 3 1 4 1 5

Опытная 32 М 10,91 1 18. 23 ± 25,39 ± 36, ,81 + 7, 21 ±

группа о 1,07 1, 45 1,18 2, ,24 0, 198

Контрольная 17 М 15,64 ± 13, 97 ± 36,72 ± 26, ,52 ± 7, 07 +

группа а 1,93 1, 35 3,25 1, ,ЗЬ 1, ,ЬЗ

Рис. 2. Денситограммы экстрактов ГАГ из сыворотки крови крыс в ,, 10% ПААГ: а - контрольная группа; б - опытная группа.

Следовательно, экспериментальное повреждение

периартикулярных тканей приводит к нарастании глюкурон-

содержащих ГАГ, прежде всего, КС, а также ДС и ГС, что, повидимому, связано с дезорганизацией тканевых ПГ и резорбцией продуктов распада.

В связи с данными эксперимента большой интерес представлял анализ клинического материала, представленного образцами сывороток крови больных ЗВМТ и контрольных групп.

В общей группе больных ЗВМТ обнаружено почти двухкратное увеличение общего содержания ГАГ по сравнению с группой ЗЛ, причем наибольшие изменения обнаружены по данным карбазоловой реакции (табл. 5)

Таблица 5

Уровень ГАГ в сыворотке крови больных ЗВМТ, ЕА, ОА и ЗЛ

N ! М !Орциновая проба.! Карбазоловая проба

. ± .---------------. ------------------------

! ! (г х 10 Ул)

! т ! гексозы ! ХС ! уроновые кислоты

Больные ЗВМТ

до лечения 166 М 70,20 + 82,57 + 8,89 +

т 2,52 2,19 0,39

после 105 М 61,38 ± 71,73 ± 8,34 +

лечения m 3,85 3,41 0,40

Вольные РА 35 М 209,52 ± 123,72 ± 14,74 ±

ш 10,26 10,75 1,36

Больные ОА 41 М 172,26 + 99,42 ± 11,83 ±

а 4,68 3,32 0,39

Здоровые 45 К 46,08 46,15 ± 5,43 ±

лица т 3,42 2,64 0,391

Степень нарастания уровня ГйГ при ЗВМТ оказалась достоверно ниже, чем при ОА. Особенно значительной была разница между показателями орциновой пробы в указанных группах. Возможно, это связано с тем, что в обследованной группе больных ОА, процесс носил распространенный характер (полиостеоартроз). Как известно, поражения суставов, как воспалительные, так и дегенеративные, сопровождаются нарастанием уровня ГДГ в крови,

Группа обследуемых

причем, для ОД характерно увеличение содержания КС. Более высокие показатели орциновой пробы у больных Oft могут быть обусловлены нарастанием этого вида ГАГ.

При РА-содержание ГАГ в крови оказалось значительно выше, чем при ОА и ЭБМГ, что можно рассматривать как следствие более глубокого и распространенного поражения CT при этом заболевании, а также как результат активного воспалительного процесса.

Различия между ЗВМТ и указанными заболеваниями суставов касались не только количества суммарных ГАГ, но и соотноиения их |)>ракци0 в сыворотке креви. Для ЗВМТ характерно увеличение 1-й и 4-й фракций и снижение 3-й Фракции ГАГ (табл. 6, рис. Э).

Таблица 6

Фракционный состав ГАГ в сыворотке крови обследуемых больных и ЗЛ

группа ! N ! М ! ФРАКЦИИ (%)

обеде- ! ! + !-------------------------------------------

дуемых ! !m! 1! 2! 3! 4! 5

Больные ЗВМТ ДО лечения 166 М m 13, 0, 63 ,91 + 24,02 0,95 + 26, 1, ,61 12 + 23,99 1,17 + 11, 0, 72 8 ±

после лечения 105 М m 14, 0, ,60 ,89 + 22,60 1,04 + 29, 1, ,33 37 i 22,65 1,37 X 10, 0, 75 87 +

Больные РА 35 М га 12, 1, ,06 29 + 33,67 1,79 ± 19, 1, 75 25 £ 23,87 1,82 ± 11, 0, 56 99 ±

Больные ОА 41 М ш 15, 1. 11 47 + 10,52 1,38 + 26, 2, 43 74 + 34,76 2,51 ± 13, 1, 13 54 +

Здоровые 45 М 13, 46 + 18,72 + 43, 91 + 12,10 ± 11, 78 +

Эти сдвиги установлены, исходя из соотноиения фракций ГАГ в образцах крови ЗЛ и больных ЗВМТ. При ОД н РА фракционный спектр ГЙГ изменялся, но степень . , этих нарушений была неодинаковой. Следует отметить, что-, наиболее выраженные,, сдвиги характерны для РА. При этом заболевании обнаружен самый высокий

Рис. 3. Денситограюш экстракта ГАГ в 10« ПААГ из сыворотки крови здоровых лиц, больных ОА и РА: а - здоровый донор; больной периартритои: б - до лечения, в - после лечения; г - больной ОА; д - больной РА.

уровень 2-й фракции и нарастание 4-й Фракции при самом низком по сравнению с другими заболеваниями;- значении 3-й фракции. ОД характеризовался максимальным уровнем 4-й фракции и снижением 3-й фракции; тогда как содержание 2-й фракции не отличалось от нормальных значений. : 'г •

Таким обрапом, при ЗВМТ нарастают 2-я и 4-я фракции ГАГ, а

3-я фракция уменьшается, но при этом увеличение 2-й Фракции оказалось значительно меньшим, чем при РА, а 4-й фракции -

меньшим, чем при ОА. . , '

■ ■ 1'

Исходя из результатов идентификации фракций ГАГ, можно судить об соотношении отдельных их видов при ЗВМТ. Значительное увеличение 2-й фракции может быть обусловлено нарастанием сывороточных ХС и ГС Преобладание 4-й фракции свидетельствует о снижении подвижности ХС и нарастании не только ГС, но и ДС.

Анализ исследованных показателей в зависимости от формы поражения ОМТ показал, что каждое из этих заболеваний характеризовалось повышением общего содержания ГАГ (табл. 7) и изменением соотношения 2-й, 3-й и 4-й фракций (табл. 8). Нарастание уровня суммарных ГАГ оказалось самым выраженным при сочетаниях различных форм ЗВМТ, а также при КД. В этих группах, как и в группе больных "Т, наблюдалось значительное нарастание

4-й фрак-ции и снижение 3-й. Периартриты характеризовались увеличением не только 4-й, но и 2-й фракции при уменьшении 3-й Фракции, тогда как поражение мышц и туннельные синдромы сопровождались нарастанием 2-й фракции и снижением 3-й.

Сравнение клинических и экспериментальных данных дает основание утверждать, что повреждение ОМТ приводит к увеличению содержания ГАГ в сыворотке крови, преимущественно за счет Фракций ХС, а также ДС и в меньшей степени - ГС.

Серьезным аспектом работы явился анализ динамики

Таблица 7

Уровень ГАГ в сыворотке крови больных ЗВМТ и ЗЛ

Группа ! N ! М !Орциновая проба! Карбазоловая проба

обследуемых ! ! ± !---------------!-¿------------------------

! ! ! (г х 10 7л)

! ! ш ! гексозыпо ! ХС ! уроновые кислоты

Периартриты 69 М т 71,28 3,06 + 87,01 2,96 + 10,28 0,39 +

Контрактура Дюпюитрена 18 М т 94,32 4,92 ± 94,05 2,36 + 11,25 0,27 +

Лигаментиты 15 И т 82,26 5,95 + 90,01 6,46 + 10,67 0,80 +

Миозиты 14 М ш 81,18 6,42 + 87,45 6,26 + 10,48 1,07

Тендовагиниты 16 М т 81,18 5,70 + 72,36 7,41 + 8,54 1,07 +

Первичная Фибромиалгия 11 М т 93,24 9,02 + 77,03 5,05 + 9,12 1,11 ±

Сочетание различных форм ЗВМТ 23 М т 81,18 5,40 + 101,91 9,77 ± 12,03 1,16 ±

Здоровые лица 45 М ш 46.08 3.42 + 46,15 2,64 ± 5,43 0,39 +

Таблица 8

Фракционный состав ГАГ в сыворотке крови больных с ЗВМТ и ЗЛ

Группа ! [ I ! Н ! | ! ! М 1 + ! т 1 Ф Р А К Д И Н СХ)

обследуемых ! 1 1 ! 2 ! 3 ! 4 1 5

1 ! ! 2 ! ! 3 1 4 ! 5 ! 6 ! 7 ! 8

Периартриты 69 М т 15 1 ,68 ± ,18 24,30 + 1.18 27.50 1.39 + 19,85 1,50 + 12,63 0,65 +

Контрактура Дюпюитрена 18 Н т 12 0 ,27 ± .88 19.81 ± 2.46 25,84 3,33 + 30,67 3,88 ± 11,35 1,33 +

Лигиментиты 15 М т 11 1 ,07 + ,94 37,43 ± 2.69 25,53 1,39 + 14,75 0,91 ± 11,15 1.23 +

Продолжение таблицы 8

1 !2!3! 4! 5 ! 6 ! 7 ! 8

Миозиты 14 М 15,00 ± 27,48 ± 28,67 + 14,50 ± 14,32*

га 3,78 2,63 3,30 2,46 2,71

Тендовагиаитн 16 Н 14,81 + 21,02 ± 21,44 1 27,32 ± 14,88 ±

п 1,72 2,08 2,95 2,19 4,31

Первичная 11 И 9,44 ± 28,39 ± 28,63 ± 26,65 + 6,87 ±

фибромиглгия га 1,21 1,В1 3,70 4,09 1,85

Сочетание' 23

различных М 13,25 ± 20,91 ± 2Э,30 ± 25,26 ± 11,12 ±

форм 30НТ т 1,55 1,89 2,85 2,63 1,76

Здоровые 45 И 13,46 + 18,72 ± 43,91 ± 12,10 ± 11,78 +

лица а 1,07 1,21 2,19 1,26 0,94

исследованных показателей под воздействием проведенного лечений. Установлено достоверное снижение уровня суммарных ГАГ за счет глюкуронсодержащих Форм при повторном исследовании. Несмотря на то, что уровень гексоз снижался недостоверно и соотношение фракций ГАГ не достигало нормальных значений, набяюдалася явная тенденция к увеличению 3-й фракции и снижению 2-й и 4-й Фракций (табл. 5, 6).

Таким образом, можно сделать заключение, что уровень сывороточных ГАГ и их Фракций адекватно отражает процесс повреждения ОНТ, его тяжесть и распространенность, а также в определенной степени коррелирует с положительной динамикой клинических проявлений ЗВНТ под воздействием комбинированной терапии.

В связи с этим разработайте методы определения суммарных ГАГ и их фракций могут быть использованы для лабораторией диагностики ЗВ1ГГ и контроля за эффективностью их лечения.

'■'-'выводы

1. С помощью метода электрофоретнческого разделения сывороточных ГАГ человека и крысы в ПААГ установлено количественное преобладание ХС над другими видами ГАГ, а также

их преимущественное распределение во 2-й, 3-й и 4-й Фракциях. Гепарансульфаты неоднородны по своей электрофоретической подвижности и могут быть обнаружены в 1-й, 2-й и 4-й Фракциях. ДС присутствует в 4-й фракции. ГК является основным компонентом 5-й Фракции.

2. При экспериментальном повреждении ОЫТ возрастает общее количество ГАГ крови, а также изменяется соотношение их Фракций в сторону резкого увеличения 4-й Фракции и снижения 3-й Фракции при тенденции к нарастанию 2-й Фракции.

3. Б крови больных ЗВИТ обнаружено достоверное увеличение общего содержания ГАГ по сравнению с образцами крови здоровых лиц. Степень возрастания суммарных ГАГ при ЗВИТ оказалась меньшей, чей при РА и ОА.

4. Соотношение фракций ГАГ в крови больных ЗЗМТ характеризовалось увеличением 2-й и особенно 4-й фракции при существенной снижении 3-й Фракции. В крови больных РА обнаружено более выраженное по сравнению с ЗВНТ нарастание 2-й Фракции, а ОА характеризовался большим увеличением 4-й Фракции.

6. Увеличение общего содержания ГАГ и изменение их Фракционного состава обнаружено при всех включенных в исследование Формах поражения ОНТ. Степень и характер обнаруженных сдвигов зависели от распространенности и формы поражения.

6. После проведенного лечения в сыворотке крови больных ЗВМТ обнаружено снижение глюкурон-содержащих ГАГ и тенденция к нормализации соотношения их Фракций под воздействием лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для воспроизведения модели поражения ОМТ дегенеративно-дистрофического характера может быть использован метод периартикулярного введения протеолитического Фермента папаина.

2. Исследование уровня суммарных .ГАГ и соотношения их Фракций в сыворотке крови с помощь» ЭФ в ПААГ могут быть использованы для., объективизации характера и степени поражения соединительнотканкцх структур при ЗБМТ.

3. Определение уровня глюкурон-содержащих ГАГ по данным карбаэодрвой пробы и определение фракционного состава ГАГ могут быть использованы для контроля за качеством лечения больных с указанной патологией.

4. Метод электрофоретического разделения сыворточных ГАГ может быть рекомендован для широкого применения на практике в диагностических целях.

ПШШШШ

1. Заболевания внесуставных мягких тканей у работников машиностроительного предприятия (А.Б.Зборовский, А.Р.Бабаева, В.И.Кузнецов и др.). - // Тез. докл. ГУ съезда ревматологов СССР. - Минск, 1991.- С. .84.

2,0 Уровень сывороточных гликозаминогликанов и антител к ним у больных с заболеваниями околосуставных мягких тканей (А.Б.Зборовский, В.Ю.Крюков, А.Р.Бабаева). - /J Современные проблемы ревматологии. Тез. докл. 1 съезда ревматологов России.. - Оренбург, 1993. - С. 100-101.

3. Гликозаминогликаны сыворотки крови при заболеваниях околосуставных мягких тканей, ревматоидном артрите и деформирующем .остеоартрозе // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической медицины. ХШ Конференция, молодых ученых. - Волгоград, 1993, - С. 64-55. .

4. Оценка сывороточных гликозаминогликанов при экспериментальном повреждении околосуставных мягких тканей (А.П.Левина, Е.П.Гичкун). - // Актуальные вопросы

теоретической, экспериментальной и клинической медицины. ЯШ Конференция молодых учены*. - Волгоград, 1993. - С. 55-56.

5. Клиническое значение исследования сывороточных г лик озамин огдиканов и антител к ним при заболеваниях внесуставных мягких тканей (Б.А.Покрова). - // Актуальные вопросы медицины. 49-я научная сессия. - Волгоград, 1994. С. 51-52.

6. Содержание сывороточных гликозаминогликанов при повреждении околосуставных мягких тканей в клинике и эксперименте (А.П.Левина, А.Р.Бабаева). - // Крово-, лимфообращение и иммунокомпетентные органы. Сборник научных статей. - Т. 47, вып.1. - Волгоград, 1994. - С. 86-89.

7. Диагностическое значение определения сывороточных гликозаминогликанов и антител к ним при заболеваниях внесуставных мягких тканей (Е.А.Нокрова, А.Р.Бабаева). - // Научно-практический сборник. - 1995. - С. 154

8. Биохимические и иммунологические маркеры поражения соединительной ткани при периартикуляных дегенеративно-дистрофических процессах (А.Р.Бабаева, I.A.Покрова, А.П.Левина). - // Тез. док», конференции "Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов". - Рязань, 1995. - С. 24.

9. Клиническая и иммунобиохимическая характеристика заболеваний внесуставных мягких тканей (А.Р.Бабаева, Е.А.Нокрова, в.П.Левина и др.). - // Тез. Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика А.И.Нестерова. - И., 1995. - С. 57-58.