Системные и клеточные механизмы пластичности скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности

Немировская, Татьяна Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Системные и клеточные механизмы пластичности скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Системные и клеточные механизмы пластичности скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности"

На правах рукописи

Немировская Татьяна Леонидовна

СИСТЕМНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЛАСТИЧНОСТИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ ИХ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

03.00.13-Физнологня 03.00.25- гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им.М.В.Ломоносова и ГНЦ РФ институте Медико-биологических проблем РАН

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ялен.корр. РАМН, профессор О.МЛоздняков

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится «2.Ъ> октября 2003 в ... ч на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Биологическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

Доктор биологических наук, профессор

В.Б.Кошелев

Доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Н.А.Медведева В.ИЛоршин

МГУ.

Автореферат разослан Яб. сентября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Умарова Б.А.

ibog-A "Г^Т^а

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Известно, что скелетная мышца обладает высокой степенью пластичности. Механо-зависимая пластичность скелетной мышцы - это ее фундаментальное свойство отвечать глубокой структурно-функциональной перестройкой на изменение режима сократительной активности.

Существенной перестройке подвергается микроциркуляторное русло мышцы при длительном изменении функциональной активности, что выражается в увеличении, или снижении капилляризации. Известно, что при длительной физической активности наблюдается рост капилляров. Существует 2 гипотезы относительно механизмов, инициирующих этот рост. Одна из них отдает преимущество метаболическим (Burton and Barclay, 1986) а другая рост (Hudlicka, 1990) - механическим факторам, детерминирующим этот процесс. Тот факт, что в работающих мышцах синтезируются ангиогенные вещества, не подвергается сомнениям. Однако вопрос о том, какие физиологические факторы запускают их синтез, остаётся открытым.

При длительных однонаправленных изменениях функциональной активности изменяются также и сами мышечные волокна. Наиболее важные изменения, обнаруживаемые в мышечных волокнах при повышенной или пониженной сократительной активности, сводятся к перестройке всех основных внутриклеточных систем, осуществляющих сократительную деятельность мышцы:

- функциональные изменения клеточной мембраны, приводящие к ускорению или замедлению проведения волны деполяризации (Христова и др., 1987), к снижению или повышению порогов возбуждения (De Luca, 2002);

- качественные и количественные изменения сократительных и цитоскелетных белков миофибрилл, определяющие сдвиги механических характеристик мышечного волокна (Рейе, 2001);

- изменения системы электромеханического сопряжения (включая изменения кальциевой чувствительности миофибрилл) (Stevens, Mounier,1990);

- увеличение или уменьшение окислительного потенциала мышечного волокна, определяемого качественной и количественной перестройкой митохондриальной системы (Shenkman et al, 2002);

В адаптацию скелетных мышц вовлечены вне- и внутриклеточные факторы. Изменения в мышце, вызванные повышенной, или пониженной сократительной активностью, могут быть обусловлены «■пмбигняти'й тлит фяугпрпи, и зависеть не только от одного механизма. Ранее многими механического

I оэ"'ffSgy}

напряжения мышечных волокон, как фактора, влияющего на соотношение анаболических и катаболических процессов в мышце. В последние годы исследования многих зарубежных и отечественных лабораторий были направлены на поиски молекулярных сенсоров, вовлеченных в систему внутриклеточной механо-зависимой сигнализации и механизмов селективной активации транскрипции мРНК ключевых сократительных, регуляторных и митохондриальных белков (Pette, 2001, Hoppeler and Fluck,2003). Вьивлен один из молекулярных сенсоров, контролирующих энергетический метаболизм в мышечном волокне: 5'-АМФ-зависимая протеинкяназа - АМПК. Но каковы метаболические и физиологические тригтерные факторы её регуляции при различных режимах сократительной активности? Не исключено, что пусковым механическим стимулом к активизации белок-синтезирующего аппарата может служить напряженное состояние эластических белков саркомерного цитоскелета (титина, небулина) и сарколеммапьного цитоскелета (дистрофина) (Baldwin and Haddad, 2002). Но каковы механизмы, реализующие механический сигнал в мышечном волокне?

Вместе с тем, если механическая активность мышцы посредством ряда внутриклеточных механизмов контролирует ее структурно-метаболический профиль, то характер самой этой активности в значительной степени регулируется центральными нейрогенными механизмами. Известно, например, что при уменьшении механической активности мышц происходит их атрофия и соотношение волокон, содержащих быстрые и медленные изоформы тяжелых цепей миозина, меняется в быструю сторону (Oganov et al, 1981, Ohira et al, 1999). Эти изменения, непосредственно обусловленны характеристиками импульсной активности мотонейронов двигательных единиц (Edgerton, Roy, 1997). ЦБ. Козловской и ее сотрудниками показана преимущественная инактивация двигательных единиц медленного типа в условиях гравитационной разгрузки (Киренская, Козловская, 1983). Layne с соавторами (1998) обнаружили увеличение электромиографического ответа от постуральных синергистов мышц конечностей при искусственной стимуляции опорных зон стопы методом оказания пневматического давления на стопу во время космического полета. Весовая нагрузка на мышцы при этом отсутствовала. Однако неизвестно, предотвращает ли сама опорная стимуляция атрофию скелетных мышц при реальной, или моделируемой гравитационной разгрузке, если нет нагруженного сокращения мышцы. Вопрос о соотношении вклада центрального и локального уровней регуляции мышечной деятельности в поддержании ее структурно-метаболических характеристик остаётся открытым.

При хроническом растяжении мышц на фоне гравитационной разгрузки наблюдается уменьшение степени атрофии мышечных волокон (Jaspers, 1998; Goldspink,

1977). Вьщеляют рефлекторный и местный компоненты (ОЫга et.al.,2000), которые могут быть задействованы в предотвращении атрофии в этих условиях. Во-первых, при растяжении мышцы происходит активация афферентных входов, конвергирующих на спинальные мотонейроны, и продуцирующих соответствующий элементарный рефлекторный сократительный ответ. Во-вторых, растяжение приводит к непосредственной активации поперечных мостиков (Proske and Morgan, 1999). Кроме того, механическое напряжение цитоскелетных и мембранных структур, наблюдаемое при растяжении, можно рассматривать как пассивную компоненту процессов, вызванных растяжением мышцы (Ohira et.al.,2000). Есть некоторые данные, указывающие на существенную роль афферентного входа в реализации профилактического эффекта хронического растяжения (Falempin and Fodili-In-Albon,1999). Тем не менее, до сих пор остается неясным, насколько активная рефлекторная компонента может быть ответственна за уменьшение или полное предотвращение атрофических изменений при хроническом растяжении мышцы на фоне гравитационной разгрузки.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящего исследования является поиск ключевых пусковых стимулов, вовлеченных в механо-зависимую перестройку мышечных волокон, связанную с:

- изменением экспрессии быстрых и медленных изоформ тяжелых цепей миозина;

- развитием атрофических или гипертрофических процессов;

- изменением окислительного потенциала мышечных волокон;

Предстояло получить ответ на два наиболее важных нерешенных вопроса, касающихся центрального контроля структурно-функциональных характеристик скелетных мышц:

- является ли опорная афферентация первичным пусковым гравитационно-зависимым стимулом, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности мышечных волокон?

каковы системные механизмы, опосредующие опорный афферентный контроль импульсной регуляции миозинового фенотипа мышечного волокна?

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптация мышечных волокон, капиллярного бассейна и митохондриальных ферментов к различным видам сократительной активности может происходить независимо друг от друга. Стимулами для этих изменений являются независимые триггерные механизмы.

2. Адаптация скелетных мышц к состоянию микрогравитации и гипергравитации не подчиняется принципу непрерывности. То есть эффекты, наблюдаемые при адаптации к гипогравитации, не являются зеркальным отражением эффектов гипергравитации. Адаптивной перестройке подвергаются преимущественно медленные мышцы, а не быстрые.

3. Опорная афферентация является пусковым гравитационно-зависимым стимулом, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности волокон постуральных мышц. При этом действие опорной афферентация опосредовано механической активностью этих мышц.

Научная новизна работы

В рамках настоящей работы впервые

- обнаружено, что последовательное длительное применение экзогенной гипоксии и физической нагрузки приводит к ускорению новообразования капилляров и изменения окислительного потенциала скелетных мышц;

- показано, что концентрация макроэргических фосфатов является триггером для увеличения (или снижения) скорости дыхания митохондрий, активности митохондриальных ферментов и способности мышцы к утомлению.

- установлено, что энергетический транспорт внутри мышечного волокна способен меняться за сравнительно короткий срок при различных режимах его сократительной активности. Эти изменения могут происходить не за счет увеличения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, а за счет изменения активности митохондриальной креатинкиназы и изменения транспорта АДФ через внешнюю мембрану митохондрий;

- выявлено, что опорная афферентация является пусковым гравитационно-зависимым стимулом, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности волокон постуральных мышц; действие опорной афферентации опосредовано механической активностью этих мышц;

- показано, что гипергравитация ведет к трансформации тяжелых цепей миозина в сторону увеличения медленных изоформ и увеличению объемной плотности митохондрий в медленных мышечных волокнах. Гипер- (или микро-) гравитация ведет к изменению чувствительности к кальцию только в медленно сокращающихся волокнах.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическиое значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о принципах адаптации скелетных мышц к разным режимам сократительной шспшности, а также физиологических и клеточных механизмах, запускающих эти процессы адаптации. Полученные результаты могут быть использованы для научного обоснования разработки новых методов коррекции проявлений гипогравитационного и гипокинетического мышечных синдромов, новых эргогенных технологий в спортивной и экстремальной медицине, для разработки новых программ тренировки спортсменов. Познание основных закономерностей структурно-метаболических изменений скелетных мышц находит свое применение и в космической медицине. Повышение длительности космических полетов и усложнение условий работы экипажей диктуют необходимость разработки новых средств и методов профилактики неблагоприятных последствий действия невесомости. Базисные закономерности структурно-метаболической адаптации скелетных мышц являются составной частью теоретических основ разработки таких средств и методов.

Результаты исследования используются в учебном процессе на факультете фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, на кафедре физиологии Российской государственной академии физической культуры.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на научных форумах: Международном конгрессе физиологических наук ШРЭ (С.-Петербург, 1997); Европейских мышечных конференциях (Флоренция, 1995, Берлин, 2000, Павия, 2001, Люнтерен, 2002, Монпелье, 2003); Ежегодных симпозиумах по гравитационной физиологии (Копенгаген, 1997, Рим, 1998, Будапешт, 2001, Стокгольм, 2002); Венском мышечном симпозиуме (Цюрих, 1995); Международном симпозиуме «Человек в космосе» (Вашингтон, 1997, Санторини, 2000); Международных симпозиумах по биологической подвижности (Пущино, 1994-2000); 6 Европейском симпозиуме по космическим исследованиям в области наук о жизни (Трондхайм, 1996); Международных конференциях по биохимии упражнений (Абердин,1993, Сидней, 1998, Маастрихт,2003); а также на Всероссийском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), на Конференциях по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 1993,1998). На школе по физиологии мышц (Москва, 2003). Материалы диссертации опубликованы в 28 статьях в отечественных и международных журналах.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 180 страницах текста, включая 30 Рисунков и 17 таблиц, и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и условий постановки эксперимента, результатов собственных исследований и их обсуждений, общего заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 240 работ.

2. МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ И АНАЛИЗА МАТЕРИАЛА

В работе применяли многоуровневый комплекс физиологических, биохимических и морфологических методов анализа. Для выявления физиологических характеристик мышц проводился анализ их сократительных характеристик на уровне интактной мышцы и на уровне единичных мышечных волокон. Для определения состава изоформ сократительных белков применяли электрофорез и иммуноблотгинг, а также иммуногистохимические методы. Для выявления ультраструктурного состояния сократительных белков применяли метод электронной микроскопии. Для выявления характеристик энергетического метаболизма мышечного аппарата применяли методы определения дыхания митохондрий в единичных скинированных мышечных волокнах и гистохимического определения активности в них ферментов. Концентрацию макроэргических фосфатов в мышцах определяли биохимическими методами. Ультраструктурное состояние митохондрий выявляли методом электронной микроскопии. Для определения кровотока в артериях использовали ультразвуковой доплеровский метод. Капилляризацию скелетных мышц оценивали гистохимическими методами. Регистрацию механических ответов изолированной мышцы крысы в изометрическом режиме проводили при помощи полупроводникового тензорезистора КТД 7Б (Наследов и др.,1998). Изолированную мышцу помещали вертикально в термостатированной камере с забуференным раствором Рингера. Нижнее сухожилие фиксировали на дне камеры, верхнее жестко соединяли с тензометрическим датчиком. Прямое раздражение через пластинчатые платиновые электроды производили одиночными стимулами длительностью 1 мс или сериями импульсов с частотой 10,25, 50 и 100 гц.

Исследования сократительных характеристик единичных мышечных волокон бьши проведены в лаборатории проф. Y.Mounier (Лилльский технологический университет, Франция) с использованием силового трансдьюсера (FORT 10, компании WPI). Один конец волокна жестко закрепляли пинцетом, а второй крепили к трансдьюсеру. Сократительных ответов добивались путем немедленной смены растворов, содержащих различные концентрации Са2+. Растворы для исследований готовили, как было описано

ранее (Stevens, 1993). Кривая зависимости напряжения волокна от концентрации кальция в растворе была рассчитана с использованием коэффициента Хилла Р/Ро = ([ Са2+] /К)"" /(1 +([ Са2+] /К) пН ), где Р/Ро - относительное напряжение, пН - коэффициент Хилла, К -константа диссоциации (рК = -log К = р Ca jo).

Измерение кровотока проводили ультразвуковой высокочастотной допплеровской техникой, работающей на частоте 27 Мгц (Мациевский, 1993). Кровоток регистрировали как в виде кривой пульсирующего потока, оцениваемого в единицах линейной скорости, так и его интегративную величину (мл/мин).

Пробы ткани брали из различных мышц, ориентировали, заключали в среду Tissue Тек и замораживали или в жидком азоте, или в изопентане, охлажденном до температуры жидкого азота. Готовили криостатные поперечные срезы толщиной 10 рм при -20° С. Срезы монтировали на предметные стекла и окрашивали на миофибриллярную АТФазу с преинкубацией при рН=4,2 (Brooke and Kaiser, 1970), цитохром С-оксидазу, NADH-тетразолий редуктазу (НАДН-ТР), сукцинатдегидрогеназу (СДГ) и на а-глицерофосфатдегидрогеназу (а-ГФДГ) (Лойда, 1982). Цитофотометрию проводили точечным методом при длине волны 570 нм на телевизионной системе анализа изображений QUANTIMET 500 (LEICA, GERMANY). Капилляры мышц крысы выявляли окрашиванием на АТФазу по Sillau and Banchero (1977). Определяли количество капилляров, приходящихся на одно волокно, и плотность капилляров: количество капилляров на мм2 среза. Иммуногистохимические определения типов волокон пероксидазным методом на срезах проводили с использованием антител против быстрых и медленных изоформ миозина (клоны NCL-MHCf (а+в) и NCL-MHCs (Novocastra Laboratories)). Распределение волокон было выражено как соотношение между числом волокон каждого типа на срезе к общему количеству волокон. Измерены были все волокна на каждом срезе. Площадь поперечного сечения (ППС MB) была измерена не менее чем у 100 волокон каждого типа с помощью системы анализа изображений QUANTIMET-500 (Leica).

Композиция тяжелых цепей миозина была определена также и методом электрофореза в полиакриламидном геле (Stevens и др., 1999). Процедура проводилась 18 часов при 12"С (180 вольт, 13 мА/гель). После разгонки в геле проводили окрашивание серебром. Относительные пропорции каждой изоформы МНС в каждой мышце были определены интегральной денситометрией. Изоформы тропонинов (TnT, Tnl and ТпС) были разделены одномерным электрофорезом в 10-20% полиакриламидном геле. Быстрые и медленные изоформы тропонинов, а также актин были определены методом иммуноблоттинга. Разгонка белков осуществлялась на тонкой подложке (0.2 цт) из нитроцеллюлозы

(Advantec MFS, Pleasanton, CA, USA). Быстрая изоформа TnT бьша идентифицирована моноклональными антителами JLT-12 (Sigma). Поликлональными антителами, полученными и идентифицированными Pette с соавторами (1981 г.), были выявлены: i) медленная изоформа TnT; ii) обе изоформы быстрого и медленного ТпС (распознавание 50-50%), iii) медленная и быстрая изоформа Tnl.

Измерение дыхания митохондрий в скицированных сапонином мышечных волокнах проводили полярографическим методом с использованием электрода Кларка и оксианализатора фирмы "Yellow Spring Instrument" (Veksler et al.,1987). Свободные концентрации Ca2+ и Mg*+ в используемых растворах рассчитывали на основании уравнений, описанных ранее (Fabiato, 1979), с использованием величин констант диссоциации (Fabiato,1981).

Для определения концентрации макроэргических фосфатов образцы ткани весом 30-50 мг немедленно замораживали в жидком азоте, затем подвергали депротеинизации перхлоридом натрия (отношение объемов 1:1) и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин при 2°С. Определения проводится при максимуме экстинкции 365 нм в течение 15 минут. Концентрация рассчитывалась в цмоль/мл (Lamprecht et al,1974).

Ультраструктурный анализ проб мышечной ткани проводится на ультратонких поперечно ориентированных срезах, приготовленных на ультратоме фирмы LKB после двойного контрастирования в растворах уранилацетата и цитрата свинца. Префиксация материала осуществляется в смеси растворов глутарового альдегида и параформа на 0,1 М фосфатном буфере, дофкксация проводится 1% раствором тетроксида осмия на том же буфере, и после обезвоживания в спиртовых растворах возрастающей концентрации, проба заключается в эпон-аралдитовую смесь. На электронных микроскопах JEM-100B и JEM-100CX. проводили качественный и количественный анализ состояния миофибрилл и митохондрий методом стереологии по Weibel (1979).

Для статистической оценки результатов применяли непарный критерий Стьюдента.

3. ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Для экспериментов были использованы самцы крыс Wistar. Все животные, отобранные для экспериментов, получали корм и воду в соответствии с рационом для лабораторных животных и содержались в виварии при температуре 22°С со сменой светового дня 12/12 часов. Через 24 ч. после окончания эксперимента крыс забивали введением сверх дозы нембутала (200 мг/кг). Перед забоем у всех животных забирали пробы мышечной ткани под нембуталовым наркозом (20 мг/кг).

Структурно-метаболические характеристики, которые мы исследовали - это изменение площади поперечного сечения мышечных волокон (1111С МВ), капилляризации и окислительного потенциала. Основная гипотеза, которой до недавнего времени придерживались многие авторы (^ЫЬе1, 01зр1апсЬе5, Норре1ег) - это постулат, что изменения, которые происходят в скелетной мышце под влиянием повышенной сократительной активности, связаны со снижением в ней парциального напряжения кислорода. Мы проверяли гипотезу, является ли гипоксия, возникающая при физической нагрузке, обязательным условием для увеличения в ней ПТТС МВ, капилляризации и окислительного потенциала. Проведены следующие серии исследований:

а) Анализ кислородного режима как стимула для изменения структурно-метаболических характеристик скелетных мышц при повышенной сократительной активности.

Эксперимент 1.Чередование бега крыс и гипоксического воздействия.

Для эксперимента было взято 28 3-х месячных самцов крыс Wistar (вес 240-260 г.), разбитых на 4 группы по 7 крыс в каждой. Одну группу животных в течение 2-х недель выдерживали в гипоксии по 4 часа в день 6 дней в неделю. В барокамере поддерживали разряжение воздуха, соответствующее высоте 5000 м над уровнем моря. Температура 20°С, вентиляция 9 л/мин. Вторая группа крыс это же время бегала на тредбане при скорости беговой дорожки 30 м/мин, 35 мин/день. Третью группу крыс выдерживали сначала в барокамере, по той же схеме, что и группу 1, а через 2 часа отдыха подвергали бегу на тредбане. Четвертая группа служила интактным контролем. Для морфологических и гистохимических исследований брали т.даэ^оспепиш 1а1егаНз, т.к. эта мышца наиболее активно включена в работу при беге. Выявляли капилляры, приходящиеся на волокно, типировали мышечные волокна (миофибриллярной АТФ-азой) и измеряли площадь их поперечного сечения (ППС МВ), измеряли активность сукцинэтдегидрогеназы (СДГ). о-глицерофосфатдегидро-геназы (а-ГФДГ) и цитохромС-оксидазы (цитС-ок.) в единичных мышечных волокнах.

В группе, к которой применяли последовательно оба воздействия: гипоксию и бег, количество капилляров, приходящихся на волокно, было достоверно выше, чем у контрольных животных. В группе крыс, которые 2 недели только бегали, достоверного отличия количества капилляров от уровня контроля не наблюдалось. Из результатов, приведенных в таблице, хорошо видно, что сама по себе выдержка в гипоксии вообще не способствует росту капилляров в данной мышце.

Таблица 1. Количество капилляров, приходящихся на мышечное волокно, в m.gastrocnemius lateralis (М±т).__

Группы Гипоксия Бег Гипоксия+ бег Контроль

Кап/вол 1.47+0.03 1.60+0.05 1.71+0.01* 1.50+0.04

* - отличия от контроля р<0.05

В таблице 2 приведены результаты измерений активности ферментов в различных типах мышечных волокон у крыс, которым чередовали гипоксическое воздействие и тренировку бегом на тредбане. После 2х недель тренировки ни в одной из групп не было обнаружено достоверных отличий активности митохондриальных ферментов от уровня контроля.

Таблица 2. Активность митохондриальных ферментов в единичных мышечных волокнах m.gastrocnemius lateralis (в единицах оптической плотности), (Mim)._

СДГ а-ГФДГ цитС-ок.

MBIIa MBIIb MBIIa MBIIb MBIIa MBIIb

Гр.Гипоксия 0.48±0.02 0.22±0.01 0.47±0.05 0.49±0.05 0.41±0.04 0.22±0.03

Гр. Бег 0.54±0.03 0.24±0.02 0.51±0.04 0.59±0.05 0.52±0.02 0.26±0.03

Гр.Гипоксия +Бег 0.53±0.02 0.23±0.03 0.58±0.04 0.66±0.05 0.53±0.02 0.26±0.03

Гр.Контроль 0.48±0.05 0.20±0.04 0.56±0.04 0.51±0.05 0.44±0.04 0.25±0.04

СДГ - сукцинатдегидрогеназа, а-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа и цитС-ок. -цитохромС-оксидаза, MBIIa - мышечные волокна Па типа, MBIIb - мышечные волокна IIb типа.

Результаты измерения площади поперечного сечения мышечных волокон m. gastrocnemius lateralis крыс представлены в таблице 3. Таблица 3.

Параметр (цт2) Контроль Гипоксия Бег Бег+Гипоксия

ППС MB I ППС MB IIa ППС MB IIb 887 ± 33 1026 ±41 1629 ±64 898 ± 26 1063 ±49 1634 ±116 952 ±28 1020 ±46 1618 ±68 1105 ±86* 1135 ±66 1838 ±64*

*-Отличия от контроля достоверны при р<0,05; ППС MB I - площадь поперечного сечения мышечных волокон I типа; ППС MB IIa - площадь поперечного сечения мышечных волокон IIa типа; ППС MB IIb - площадь поперечного сечения мышечных волокон ПЬ типа. (М±т).

ППС MB первого и второго b типа у крыс после попеременного воздействия гипоксии и физической нагрузки была достоверно выше, чем у контроля. Во всех остальных группах увеличения размеров мышечных волокон не наблюдалось. Эксперимент 2. Тренировка крыс плаванием в условиях экзогенной гипероксии. 45 крыс Wislar были получены из вивария института медико-биологических проблем. После отбора животные, которые не могли плавать, были исключены из эксперимента. Оставшиеся 23 крысы одинакового возраста и веса были разделены на 3 группы. Первая группа животных плавала в условиях нормоксии (п=9). Вторую группу тренировали так же, как и первую, но с концентрацией кислорода в воздухе 65% (п=7). Группа 3 оставалась интактной и служила контролем (п=7). Перед экспериментом две группы животных, отобранных для плавания, были предварительно протестированы плаванием с грузом,

прикрепленным к хвосту и составляющим 5% от веса тела. Группы, плавающие в нормоксии и гипероксии, показали время плавания соответственно 25±3 и 27±1 мин.. Температура воды была 37°С. В течение первой недели время плавания увеличивалось на 10 мин. каждый день и в конце недели составляло 60 мин. Груз крепили к хвосту (он составлял 5% от веса тела животного). Следующие 6 недель крысы плавали по 60 мин. в день 5 дней в неделю. Группу, которую тренировали в бассейне с повышенным содержанием кислорода в воздухе, кислород подавали в плавательную камеру. Из противоположного конца камеры воздух поступал в оксианализатор. Содержание кислорода в воздухе проверяли в течение плавания непрерывно и постоянно поддерживали на уровне 65%. Было показано, что такой режим гипероксии не индуцирует вазоконстрикторные эффекты и образование свободных радикалов (Kindwall, 1995).

После окончания тренировочного цикла у всех животных была взята и немедленно заморожена в жидком азоте m. tibialis anterior, т.к. эта быстро сокращающаяся мышца в большей степени активна при плавании. После этого был проведен морфологический и гистохимический анализ мышечной ткани. Выявляли капилляры, приходящиеся на волокно, подсчитывали плотность капилляров, приходящуюся на мм2 ткани, типировали мышечные волокна и измеряли площадь их поперечного сечения (ППС MB), измеряли активность митохондриальных ферментов и концентрацию миоглобина в единичных мышечных волокнах.

Результаты определения капилляризации m. tibialis anterior крыс, после тренировки плаванием прдставлены в таблице 4.

Таблица 4. Количество капилляров, приходящихся на волокно в m. tibialis anterior

(Mim).

Плавание Плавание+ О2 Контроль

кап/вол 1.96 ±0.03* 1.90 ±0.05* 1.59 ±0.01

кап/мм2 752 ±76* 637 ±73 512 ±31

* - отличия от контроля р<0.05

Количество капилляров, приходящихся на волокно, было достоверно увеличено в обеих группах животных, подвергавшихся плаванию, по сравнению с контролем.

В таблице 5 приведены результаты измерений активности ферментов и концентрации миоглобина в различных типах мышечных волокон у крыс, которых тренировали плаванием в гипероксии. Активность митохондриальных ферментов и концентрация миоглобина в группе, тренирующейся плаванием, были достоверно повышены по сравнению с уровнем контроля. Исключение составила только ЫАОН-тетразолийредуктаза, активность которой в этой группе не была увеличена. Иная картина наблюдалась в группе, тренирующейся плаванием в условиях гипероксии. Активность

митохондриальных ферментов в ней не была увеличена по сравнению с

исключением активности цитохромС-оксидазы в волокнах IIb типа.

Таблица 5. Активность ферментов в разных типах мышечных волокон в т. (в единицах оптической плотности), (Mim). _

Параметр Плавание Плавание + 0г Контроль

СДГ MBIIa 0.71 ± 0.02* 0.65 ± 0.03 0.60 ± 0.03

MBIIb 0.44 ± 0.02 0,40 ± 0.03 0.44 ±0.04

ЦитС-ок.МВПа 0.36 ±0.04* 0.32 ±0.04 0,23 ± 0.03

MBIIb 0.22 ±0.03* 0.21 ± 0.03* 0.13±0.02

NADH-тр. MBIIa 0.27 ± 0.02 0.21 ±0.03 0.22 ±0.13

MBIIb 0.15±0.01 0.13±0.02 0.13 ±0.01

а-ГФДГ MBIIa 0.58 ±0.04* 0.52 ±0.05 0.40 ±0.03

MBIIb 0.52 ±0.03* 0.47 ±0.05 0.37 ±0.02

МГ MBIIa 0.17±0.01* 0.13 ±0.01 0.14±0.01

MBIIb 0.11 ±0.01 0.09 ±0.00 0.11 ±0.01

"■-достоверное отличие от контроля (р<0.05) сукцинатдегидрогеназа (СДГ), а-глицерофосфатдегидрогеназа (а-ГФДГ) и цитохромС-оксидаза (цитС-ок.), NADH-тетразолийредуктаза (NADH-тр), МГ - миоглобин, мышечные волокна MBIIa типа -, мьппечные волокна - MBIIb типа.

Результаты измерения площади поперечного сечения мышечных волокон m. tibialis

anterior крыс после 7 недель тренировки плаванием представлены в таблице 6.

Табл. 6. Площадь поперечного сечения мышечных волокон m. tibialis anterior (М±т).

Параметр (|W) Плавание Плавание + 0г Контроль

ППС MB IIa ППС MB IIb 2339 ±191 3963 ±100* 2444±114 4005±133* 2196± 104 3172 ±96

*-Отличия от контроля достоверны при р<0,05; ППС MB IIa - площадь поперечного сечения мышечных волокон IIa типа; ППС MB IIb - площадь поперечного сечения мышечных волокон IIb типа.

ППС MBIIb типа была в одинаковой степени повышена в обеих тренирующихся

группах (на 24 и 26%) вне зависимости от кислородного режима (р<0.05). Изменений ППС в волокнах IIa типа не наблюдалось.

Weibel и Taylor (1981 г.) была выдвинута гипотеза симморфоза, т.е. согласованного ответа всех структур скелетной мышцы (капилляризации, ППС MB, митохондриальных ферментов) для адаптации к изменяющемуся уровню её сократительной активности. Согласно этой гипотезе, при изменении сократительной активности изменяется уровень потребления кислорода мышцей, что и ведет к перестройке всей кислород-транспортной и кислород-утилизирующей систем. Следовательно, содержание кислорода в мышце при различной сократительной активности по мнению этих авторов является основным стимулом для её структурно-метаболической перестройки. Мы проверяли гипотезу, действительно ли гипоксия в мышце, создаваемая при физической нагрузке, является стимулом для изменения в ней капилляризации, окислительного потенциала и ППС MB. К сожалению методически очень трудно регистрировать напряжение кислорода

контролем, за tibialis anterior

непосредственно в работающих скелетных мышцах. Поэтому мы пошли по пути изменения параметров газовой среды, т.е. создания экзогенной гипо- или гипероксии.

Исследовали скорость новообразования капилляров при попеременном действии гипоксии и физической нагрузки. В группе с чередованием действия гипоксии и физической нагрузки капилляризация была существенно выше, по сравнению с контрольной группой (табл.1). В группе крыс, только тренировавшейся на тредбане в течение 2х недель, количество капилляров, приходящихся на волокно, недостоверно отличалось от уровня контроля. Существенное увеличение количества капилляров при аналогичной тренировке в условиях нормоксии происходило только через 4 недели (таблица 7). Ранее было показано, что при тренировке в среднегорье капилляризация у спортсменов растёт быстрее (Masao,1990; Desplanches et al.,1993). Но при длительном пребывании альпинистов на высоте 8 тыс. м количество капилляров, приходящихся на волокно, несколько снижалось (Green et al.,1989; Hoppeler et al.,1990). Эти феномены совпадают с данными об увеличении синтеза mPHK VEGF при острой нагрузке в гипоксии (Breen et.al.,1996; Gustafsson et.al.,1999; Richardson et.al.,1999) и снижению этого синтеза после длительного пребывания в ней (Hudlicka et.al.,2002). Мы показали, что для ускорения новообразования капилляров в скелетных мышцах при их повышенной сократительной активности не обязательно создавать дополнительную «гипоксию нагрузки». Экзогенная гипоксия может бьпъ модулирующим фактором, который при определенных условиях способен ускорить их рост.

Суммирующего действия на активность митохондриальных ферментов при попеременном действии пшоксии, а затем физической нагрузки мы не обнаружили (эксперимент 1, табл.2). Увеличение окислительного потенциала скелетных мышц при физической активности наблюдают обычно не ранее, чем через 4 недели тренировки. О более раннем повышении сообщают только при одновременном действии гипоксии и физической нагрузки (Masao et.al.1990, Hoppeler et. al.,2003). В отличие от крыс, бегавших в условиях нормоксии, у животных, которые сначала подвергались действию гипоксии, а затем бегали на тредбане, наблюдали достоверное увеличение ППС MB (эксперимент 1, табл.3). Т.е. ППС MB в этом эксперименте меняется таким же образом, как и капилляризация. В обычных условиях тренировки для достоверного увеличения ППС MB требуется не менее 6 недель. Можно предположить, что при действии гипоксии образуется некий фактор, который может ускорять синтез сократительных белков, но только если мышца будет сокращаться. Вероятно, этот фактор способен сохраняться в мышце некоторое время после воздействия гипоксии. Итак, мы обнаружили феномен ускорения увеличения ППС MB и капилляризация при попеременном действии

гипоксии и бега, и для этого ускорения не обязательно применять одновременное воздействие физической нагрузки и гипоксии.

Если изменение кислородного режима мышцы при повышенном уровне сократительной активности не является лимитирующим фактором для новообразования капилляров и изменения ППС MB, то отсутствие гипоксия при тренировке не должно снизить темпы их увеличения. Для проверки этой гипотезы был поставлен эксперимент с тренировкой крыс плаванием в условиях гипероксии (эксперимент 2). Содержание кислорода в камере для плавания крыс составляло 65%. Ранее было показано, что при вдыхании газовых смесей с содержанием кислорода от 21 до 100% при физической нагрузке субмаксимальной мощности, содержание кислорода в артериальной и венозной крови работающих мышц увеличивается (Knight et.al.,1993). Это приводит к более высокому потреблению кислорода мышцами и увеличению времени работы до утомления (Pedersen et.al.,1989). Количество капилляров, приходящихся на волокно, было достоверно увеличено относительно контроля в обеих группах крыс вне зависимости от того, в каких условиях проходила тренировка: в условиях нормоксии увеличение составило 23%, в условиях гипероксии 20% (р<0,05). Существенной разницы по этому показателю между тренирующимися группами не наблюдалось. Аналогичную картину мы наблюдали и для ППС MB. Одинаковое увеличение количества капилляров и ППС MB у крыс, тренирующихся при разных концентрациях кислорода во вдыхаемом воздухе, свидетельствовует о том, что кислородный режим не является лимитирующим фактором для рабочего ангиогенеза и изменения поперечного сечения мышечных волокон. Что касается окислительного потенциала, то у крыс, тренировавшихся в условиях гипероксии, в отличие от животных, тренированных в нормоксии, достоверного увеличения активности митохондриальных ферментов в m.tibialis anterior не обнаружено. Можно предположить, что содержание кислорода во внешней среде влияет на изменение окислительного потенциала мыщц при физической нагрузке.

Гипотезу о том, что изменение кислородного запроса мышцы не является сигналом к увеличению капилляризации подтверждают результаты эксперимента с введением ß-гуанидинпропионовой кислоты (см. ниже эксперимент 4). В обычных условиях капилляризация мышц увеличивается после длительной физической нагрузки (не меньше 1 месяца). Для изменения кислородного запроса мы вводили животным в течение 1 месяца бета-гуанидинпропионовую кислоту (ß-ГПК). Длительное введение ß-ГПК ведет к увеличению активности митохондриальных ферментов (Ohira,1992). Мы также обнаружили увеличение максимальной скорости дыхания митохондрий как в m.soleus, так и в m.plantaris. В то же время, несмотря на увеличение потребления кислорода

мышечными волокнами, увеличения капилляров, приходящихся на мышечное волокно, или плотности капилляров не обнаружено (табл.8). Не изменилось и значение объемного кровотока на разные сутки после введения препарата (см. эксперимент 4).

Все эти результаты не вполне согласуются с теорией Weibel и Taylor об одновременном изменении кислород-транспортной и кислород-утилизирующих систем для адаптации мышцы к определённому оптимальному состоянию. Мышца нормально функционировала и при более высокой активности митохондриальных ферментов без всякого изменения со стороны кислород-транспортной системы.

б. Возможные регуляторные механизмы изменения окислительного потенциала и сократительных характеристик скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности

Некоторые авторы отмечали, что регуляторные пути, которые приводят к митохондриальному биогенезу, изучены более детально, чем регуляторные механизмы (Goffart и Wiesner,2003). Основная концепция регуляции синтеза митохондриальных белков до сих пор остаётся не исследованной. Возможные регуляторные механизмы изменения окислительного потенциала и сократительных характеристик скелетных мышц мы исследовали в экспериментах с тренировкой животных на тредбане, вывешиванием, введением ß-гуанидиЕпропионовой кислоты и креатина.

Эксперимент 3. Тренировка крыс на тредбане 2 и 4 недели.

Для эксперимента было взято 4 группы крыс Wistar (по 7 крыс в каждой) весом 200-220 г.. Одна группа крыс бегала на тредбане в течении 2-х недель, а вторая- в течение 4-х недель. Две другие группы животных служили интактным контролем к первой и второй группам тренирующихся крыс.

Протокол тренировки крыс. Животные бегали на тредбане 5 дней в неделю по 35 мин/день при скорости движения беговой дорожки 30 м/мин.. Через 24 ч после эксперимента у животных брали го. gastrocnemius lateralis. Мышца была разделена на две части. Одна часть была немедленно заморожена в жидком азоте для проведения морфологического анализа, а вторая - положена в специальный раствор для проведения биохимических определений ex temporo. Проводили типирование мышечных волокон выявлением миофибриллярной АТФ-азы и измеряли площадь их поперечного сечения. Определяли количество капилляров, приходящихся на мышечное волокно. Измеряли скорость дыхания митохондрий в пучках скинированных сапонином мышечных волокон.

Результаты определения количества капилляров, приходящихся на волокно у крыс после бега на тредбане, представлены в таблице 7.

Таблица 7. Количество капилляров, приходящихся на волокно в m.gastrocnemius lateralis, (Mim)._

Бег 2 нед. Контроль Бег 4 нед. Контроль

Кап/вол 1.22±0.09 0.97±0.10 1.51±0.20* 1.05±0.05

* - отличия от контроля р<0.05 После 2 недель бега крыс количество капилляров, приходящихся на волокно,

достоверно не отличалось от группы контроля. Существенное увеличение капилляризации

наблюдалось только к 4й неделе тренировки.

Рис.1. Изменение в % скорости дыхания митохондрий т gastrocnemius lateralis, -. стимулированной добавлением креатина.

100 80 60 40 20 0

Контроль

2 недели

После 2х недель тренировки крыс на тредбане процент увеличения скорости дыхания митохондрий, стимулированный добавлением креатина, был достоверно повышен по сравнению с уровнем контроля (рис.1). В то же время максимальная скорость дыхания митохондрий через 2 недели не отличалась от уровня контрольных животных (25,0±2,4 против 22,8±0,9 нг.атом Ог на мг сухого веса ткани соответственно).В отличие от группы с

*- отличие от контроляр<0.05 двухнедельной тренировкой, после 4х недель скорость дыхания митохондрий, стимулированная добавлением креатина, не отличалась от уровня контроля, тогда как максимальная скорость дыхания митохондрий, стимулированная добавлением 5мМ АДФ, была достоверно выше (17,9±0,9 против 26,5±1,7 нг.атом Ог на мг сухого веса ткани).

Эксперимент 4. Введение крысам р-гуанидинпропионовой кислоты и креатина

а) Использовали 28 самцов крыс Wistar весом 240-27- г.. Животные были разделены на 4 группы. Часть животных служила контролем (Гр.1; п=8); вторая группа подвергалась действию антиортостатического вывешивания в течение одного месяца и получала питание по обычной схеме (Гр.2; п=7); третьей группе во время вывешивания давалась р-ГПК ежедневно per os с пищей в концентрации 1% (Гр.З, п=7); животные четвертой группы не подвергались вывешиванию, но получали препарат по той же схеме, что и группа 3 (гр.4; п=6). Вывешивание крыс осуществляли по методике Morey-Holton (1979 г) за хвост так, что тело находилось в положении наклона к полу под углом 40-45°, чтобы задние конечности не касались пола, а передние могли нормально опираться и

функционировать (рис.2). Через месяц крыс забивали и забирали ш.зо1еш и т.р1агйап8. М.зо1еш исследовали в связи с тем, что эта мышца является позно-тонической, выполняющей, преимущественно, антигравитационную функцию, и подвергающаяся наибольшим изменениям при гравитационной разгрузке. М.р1агйапз - это синергист т.зо1еш, который, в отличие от него, является быстрой мышцей. После взятия часть мышцы немедленно помещали в жидкий азот для определения концентрации макроэргических фосфатов, а часть использовали для определения скорости дыхания митохондрий в оптированных мышечных волокнах. Рис.2. Схема вывешивания крыс.

б) У б самцов крыс Wistar группы, которые просто сидели в клетках, измеряли кровоток до введения Р-ГПК, на 5-е и 15-е сутки после начала кормления препаратом. Измерения проводили на левой и правой бедренной артерии под нембуталовым наркозом.

в) Мышцы других животных использовали для исследования сократительных свойств m.soleus и m. extensor digitorum longus. Для этого часть крыс служила контролем (п=7); другую группу одну неделю содержали в виварии, но к ее рациону добавляли бета-гуанидинпропионовую кислоту (п=9), по такой же схеме. После этого немедленно выделяли мышцы и помещали в аэрируемый раствор для исследования их сократительных характеристик. После месяца введения Р-ГПК крысам, количество капилляров, приходящихся на мышечное волокно как в m.soleus, так и в и m.plantaris, не отличалось от контроля. В то же время процентное содержание мышечных волокон I типа в m.soleus после введения Р-ГПК достоверно выросло по сравнению с уровнем контроля. Результаты приведены в таблице 8.

Таблица 8. Морфологические характеристики m.soleus и m.plantaris после 2х недель введения р-ГПК (М±т).

%МВ1 кап ./вол кап./мм2

m.soleus

Контроль 83±5 2,2±0,1 662±43

Контроль+GPA 95±3* 2,3±0,1 793±86

m.plantaris

Контроль - 1,8±0,1 772±58

Контроль+GPA - 1,9±0,1 683±6

*-отличия от контроля (р<0,05)

Значения объемного кровотока, измеренные до-, на 5-е и 15-е сутки введения Р-ГПК

группе крыс, сидящих в клетках, существенно не различались между собой и составляли 1,7±0,1; 1,8+0,1 и 1,9±0,2 мл/мин соответственно.

После месяца введения р-ГПК наблюдалось увеличение максимальной скорости дыхания митохондрий, особенно выраженное в быстрой т.р1аШап5 (рис.3).

Рис.3. Утах дыхания митохондрий в т.$о1ет Утах дыхания митохондрий в т.р1аШат после введения р-ГПК после введения Р-ГПК

§ 25

: я

1 и

\ i 20

г Я Я

I 115

11»

I g

й s

контроль контр.+ГПК

£ я

8 Я

В ^

О 2

контроль контр.+ГПК

*- отличия от контроля (р<0.05)

После месяца введения Р-ГПК концентрация фосфокреатина в m.soleus была снижена на 74%, а АТР - на 38% по сравнению с уровнем контроля (рис.4, р<0.05). Аналогичная картина наблюдалась у крыс после введения р-ГПК и в m.plantaris. Результаты приведены в таблице 9. После 4х недель эксперимента концентрация фосфокреатина в m.plantaris животных, сидевших в клетке и получавших р-ГПК, была достоверно снижена по сравнению с контролем.

Рис.4. Изменение (в %) содержания фосфокреатина и аденозинтрифосфорной кислоты в m.soleus после месяца введения ß-ГПК.

и --10

-20

£ -30

в -40

Я -50

S -60

-70

-80

-90

РСг чн АТР —I—

*- отличия от контроля (р<0.05)

Таблица 9 Концентрация фосфокреатина и аденозиновых нукпеотидов в m.plantaris

Группы РСг АТР ADP AMP ATP/ADP+AMP

Контроль 8,3±1,4 4,7±0,8 0,9±0,2 0,6±0,2 3,3±0,6

Контроль+ГПК 2,5±0,4* 3,5+0,3 1,0±0,1 0,3+0,0 2,8±2,4

'-Отличия от контроля и от вывешивания достоверны при р<0,05; РСг - фосфокреатин, АТР - аденозинтрифосфорная кислота, ADP - аденозиндифосфорная кислота, AMP -аденозинмонофосфорная кислота.

Площадь поперечного сечения и % содержания MB I и П типов в m.soleus и

m.plantaris крыс после 1 месяца введения ß-ГПК представлена в табл.10. После введения

крысам ß-l lüC ППС MB m.soleus и m.plantaris не отличалась от уровня контроля, а

процентное содержание волокон I типа в m.soleus достоверно увеличилось.

Таблица Ю.Морфологические характеристики m.soleus и m.plantaris (M±m).

ППСМВ1 ППСМВЫ %МВ1

m.soleus

Контроль 17091125 1466±97 83±5

Контроль+GPA 1707±126 - 95±3*

m.plantaris

Контроль 919±69 1295±97 -

Контроль+GPA 1051±122 1339±94 -

*-Отличия от контроля достоверны при р<0,05

После 4 недель вывешивания крыс максимальная скорость дыхания митохондрий (Ушах) в т.зо1еиз была достоверно снижена как по отношению к контролю, так и по отношению к группе, которая была вывешена с введением |3-ГПК (на 34 и 24% соответственно, р<0,05). Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11. Результаты определения параметров дыхания митохондрий в скинированных

Группы Уо Vadp Уо Vmax У/Vo Сг%

Контроль 4,1±0,8 9,1+2,8 11,6±3,2 21,0±3,1 6,0+0,9 48±20

Вывешивание 1,9+0,5* 4,9+1,6* 8,6±1,3 14,0+0,7* 6,3±1,3 54±9

Выв.+GPA 2,9±0,6 9,7+1,5 13,4±1,6 19,0+1,б& 8,8±2,7 51±12

Примечание: Уо-дыхание митохондрий в среде; Удор-Дыхание митохондрий в среде с добавлением 6 мкл50 мМ АОР; Усг-дыхание митохондрий с добавлением к предыдущей среде 9 мг креатина; Ушах- дыхание митохондрий после добавления к предыдущей среде б мкл 500 мМ АОР; У/Уо-дыхательный контроль; Сг%-скорость креатинстимулируемого дыхания в исследуемых образцах. *-отличия от контроля достоверны при р<0,05; &-отличия от вывешенной группы достоверны при р<0,05.

Параметры одиночного сокращения мыши

5-8-дневное введение животным |3-ГПК не оказывает влияния на параметры одиночного сокращения как m.soleus, так и m. extensor digitorum longus (EDL) в растворе, содержащем кальций. Временные характеристики сокращения обеих мышц после введения р-ГПК не отличались от уровня контроля.

Сравнительным тестом для выяснения изменений, происходящих в начальном звене электро-механического сопряжения (включающей в себя переход активирующего сигнала на клеточную мембрану, его переход с клеточной мембраны на мембрану саркоплазматического ретикулума и, отчасти, выход кальция из CP) было выбрано удаление ионов кальция из внешнего раствора. Параметры одиночного сокращения ш. soleus и m.extensor digitorum longus (EDL) в растворе, не содержащем кальций, приведены в табл. 12.

Таблица 12. Параметры одиночного сокращения m. soleus и т. extensor digitorum longus

| контроль | р-ГПК Контроль | Р-ГПК

soleus EDL

Время подъема,мс 101+11 138±7* 33+6 34±2

Время полуспада,мс 227+44 238±19 56±10 44+4

Сила сокращения,г 9,0±1,4 19,0±2,0* 12,0+4,0 10,0±2,0

*- отличия контроля (р<0,05)

Время подъема и сила одиночного сокращения т. зокив в бескальциевом растворе после введения р-ГПК достоверно выше, чем у контроля. Быстрая мышца ЕОЬ не меняет своих характеристик вне зависимости от наличия, или отсутствия кальция в среде и параметры ее сокращения не отличаются от контроля.

Устойчивость к утомлению. Устойчивость к утомлению медленной т.зокив после введения р-ГПК выше как в среде с кальцием, так и в бескальциевом растворе (таблица 13).

Таблица 13. Устойчивость к утомлению: время полусокращения мышцы (t5o),c, (М±т).

Устойчивость к утомлению в среде с кальцием Устойчивость к утомлению в бескальциевой среде

Контроль Р-ГПК Контроль ß-ГПК

Soleus 156±14 294±65* 12б±20 198±24*

EDL 64±5 63±8 71±11 86±18

*-р<0,05 - отличия от контроля Как видно из результатов в табл. 13, устойчивость к утомлению т. эокия как в

кальциевой, так и в бескальциевой среде выше, чем у контроля. В быстрой т.ЕБЬ

существенных изменений в устойчивости к утомлению, по сравнению с контролем, не

обнаружено. Следовательно, изменение концентрации макроэргических фосфатов по-

разному влияет на устойчивость к утомлению в быстро- и медленно сокращающейся

мышце.

Для второй серии экспериментов использовали 14 самцов крыс \№$1аг весом 370-400 г.. б животных использовали как интакгный контроль, а 8 животным в течение 8 недель вводили 1% креатин с водой и 1% (от веса тела) - с пищей. Через 2 месяца у животных забирали ш^окив и т.ех(епздг с^иогит 1опдш. Часть каждой мышцы замораживали для дальнейших морфологических исследований, а другую часть использовали для определения параметров дыхания митохондрий в скицированных сапонином волокнах. После 8 недель введения крысам креатина обнаружили снижение Рис.5 Утах дыхания митохондрий в т.¡о1еш Утах дыхания митохондрий в т.ЕйЬ

после 2х недельного введения креатина

контроль

креатин

*- отличия от контроляр<0.05

максимальной скорости дыхания митохондрий (Vmax) как в медленной m.soleus, так и в быстрой extensor digitorum longus (рис.5). Площадь поперечного сечения MB m.soleus

после введения креатина не отличалась от уровня контроля. В эксперименте с тренировкой крыс бегом (эксперимент 3) мы исследовали динамику активности митохондриальной креатинкиназы. Если при физической активности важно поддержание концентрации макроэргических фосфатов на высоком уровне, можно предположить, что активность митохондриальной креатинкиназы должна увеличиваться в первую очередь. Однако ранее было показано, что при аналогичной тренировке активность митохондриальных ферментов увеличивается не ранее, чем через 1-1,5 месяца. Связано это было с тем, что при применявшихся ранее методах митохондрии подвергались центрифугированию, у них увеличивалась проницаемость наружной мембраны для ADP и терялась возможность исследовать работу митохондриальной креатинкиназы, которая находится на внешней мембране митохондрий (Walsh et.al.,2001). Кроме того, после центрифугирования можно было собрать только 10-25% не поврежденных митохондрий (Walsh et.al.,2001). При использовании нами метода определения дыхания митохондрий in vivo в скинированных сапонином мышечных волокнах эти недостатки были устранены. Было обнаружено, что увеличение активности митохондриальной креатинкиназы при стимулировании дыхания митохондрий креатином происходит уже через 2 недели тренировки (рис.1). Однако после 4х недель этот показатель уже не отличался от уровня контроля. В то же время максимальная скорость дыхания митохондрий, стимулированная добавлением 5 mM ADP, через 2 недели была сравнима с уровнем контроля, тогда как после 4х недель тренировки она была уже достоверно выше. Таким образом, было впервые обнаружено, что на ранних этапах увеличения сократительной активности обеспечение работающих мышц макроэргическими фосфатами происходит за счет увеличения активности митохондриальной креатинкиназы.

Можно предположить, что увеличение скорости дыхания митохондрий, обнаруженное на более позднем этапе тренировки, могло быть связано с изменением концентрации макроэргических фосфатов. Для выяснения роли концентрации макроэргических фосфатов в изменении окислительного потенциала мышц нами были проведены эксперименты с длительным введением животным р- ГПК и креатина. Мы обнаружили достоверное снижение концентрации АТР и РСг после месяца введения Р-ГПК (рис. 4). Известно, что длительное снижение макроэргических фосфатов, вызванное введением Р-ГПК, ведет к увеличению активности митохондриальных ферментов (Ohira,1992, Tanaka et.al.,1997). Мы также обнаружили увеличение максимальной скорости дыхания митохондрий как в медленной m.soleus, так и в быстрой m.plantaris у животных, которые сидели в клетках 4 недели (рис.3). В быстрой мышце это увеличение было более существенным. После 4х недель вывешивания крыс Vmax дыхания митохондрий

снизилась (эксперимент 4, табл.11). Введение р-ГПК крысам на фоне моделируемой гравитационной разгрузки предотвратило эти изменения в MB m.soleus. Таким образом, снижение концентрации махроэргических фосфатов в скелетных мышцах сопровождается увеличением максимальной скорости дыхания митохондрий, как при повышенном, так и при пониженном уровне их сократительной активности.

Во второй серии экспериментов у животных, которым в течение 2 месяцев вводили креатин, обнаружено достоверное падение Vmax как медленной m.soleus, так и в быстрой m.extensor digitorum longus (рис.5). Ранее, в экспериментах с людьми-добровольцами и спортсменами и в опытах на животных неоднократно было обнаружено повышенное содержание макроэргических фосфатов в скелетных мышцах после введения креатина per os (Balsom et al.,1995; Febraio et al.,1995). По результатам двух экспериментов можно заключить, что изменение концентрации макроэргических фосфатов в мышце является триггером для изменения в ней активности мвтохондриальиых ферментов.

После 5-8-дневного введения Р-ГПК животным динамические и силовые характеристики m.soleus в растворе с кальцием не отличались от значений контроля. При смене среды на бескальциевую время подъема и сила сокращения m.soleus достоверно повышались (таблица 12). Удаление ионов кальция из внешнего раствора было выбрано в качестве сравнительного теста для выяснения изменений, происходящих в начальном звене электро-механического сопряжения (ЭМС). Так как эти отличия проявлялись только в разных средах, то можно предположить, что они связаны с изменением внутриклеточной кальциевой сигнализации, активирующей сокращение. Как в растворе, содержащем кальций, так и в бескальциевом, ни динамические, ни силовые характеристики сокращения быстрой мышцы EDL не изменились (таблица 12). Устойчивость к утомлению m. soleus как в кальциевой, так и в бескальциевой среде выше, чем у сидячего контроля (таблица 13). Это может быть связано с увеличением процента медленных мышечных волокон после введения Р-ГПК (табл.10). Никаких изменений в быстрой m.EDL по сравнению с контролем не обнаружено. ВЫВОД: 1. длительное р-ГПК оказывает влияние на изменение временных характеристик сокращения только медленной m.soleus, но не быстрой extensor digitonim longus. 2. Устойчивость к утомлению увеличивается у m.soleus уже после 5-8 дней введения Р-ГПК. Снижение концентрации макроэргических фосфатов приводит к увеличению количества мышечных волокон I типа в m.soleus.

Известно, что при изменении уровня сократительной активности мышц часто наблюдается трансформация мышечных волокон. Происходят ли вместе с трансформацией волокон изменения в транспорте макроэргических фосфатов? Ранее было

показано, что регуляция внутриклеточного транспорта АДР контролируется по-разному в быстрых и медленных мышцах (Saks et.al., 1995, Kuznezov et.al.,1999). Для выяснения этого вопроса мы использовали экспериментальную модель вывешивания животных, при которой происходит трансформация мышечных волокон (эксперимент 6). Мы рассмотрим только 3 группы животных из этого эксперимента. Одна группа животных - интактный контроль (К), вторая группа животных была вывешена в течение 2-х недель (В), третью группу животных подвергали вывешиванию в течение этого же времени с иммобилизацией конечности в голеностопном суставе под углом 35° (растяжение m.soleus) (группа ВИ). Исследовали миозиновый фенотип, скорость дыхания митохондрий и активность сукцинатдегидрогеназы в единичных волокнах m.soleus. На рис.6 видно, что после 2-х недель вывешивания крыс уменьшилась ППС MBI m.soleus (р<0.05). На 13% Рис.6 ППС MB I типа после вывешивания и растяжения m.soleus -------- снизилось количество волокон I

j мк2 I 3000

2S00 2000 1500 1000 500 0

нн

типа (р<0.05) и существенно увеличилось количество МВ П типа (р<0.05) по сравнению с группой контроля (рис.7). В группе вывешенных крыс обнаружено также увеличение активности СДГ в МВ I типа на 24% (р<0.05), рис.8, и увеличение Ушах митохондрий, стимулированное добавлением 5 тМ АДФ, на 54% (р<0.05, рис.9) по сравнению с контрольными животными. Это 24% увеличение оптической плотности, измеренное в единичных мышечных волокнах, можно связать не с увеличением реальной активности СДГ, а со снижением площади поперечного сечения мышечных волокон (ППС МВ I типа) (на 28%). В меньшем объеме волокна оказывается то же количество фермента.

Дыхание митохондрий в нашем эксперименте было измерено в целых мышечных волокнах, скинированных сапонином (рис.9). В быстрых мышечных волокнах, или у изолированных митохондрий креатин не влияет на аффинность АДФ, и Кш для АДФ в этом случае очень низкая (VеЫег и др.,1989, Эакя и др., 1995,1997,2002).

ВИ

Рис.7. % волокон в т.мкш крыс, позитивных для антител против I и П типов МНС:

I ТИП МНС *

ВИ

100

« 60 м м

Я 40 2

* 20

П ТИП МНС

ВИ

К-контроль, В- вывешивание, ВИ- вывешивание+иммобилизация конечности

Рис.8 Активность СДГ в I типе волокон во Па типе волокон

т. soleus после вывешивания т. soleus после вывешивания

ZWj-!Mi1

Шг

я ^

ч0,6

29,4 -

ВИ

В нашем эксперименте после вывешивания наблюдалась существенная трансформация мышечных волокон от медленных к быстрым и существенное увеличение скорости дыхания митохондрий, стимулированное добавлением АДФ (на 54%). Можно предположить, что такое увеличение скорости дыхания т.вокш было связано с трансформацией мышечных волокон в сторону от медленных к быстрым и изменением

Рис.10 Ушах оптированных волокон т.зо1еш крыс кинетики регуляции АДФ-

стнмулированного дыхания в трансформированных волокнах.

Растяжение т.зо1еш при вывешивании предотвратило развитие атрофии мышцы и трансформацию мышечных волокон. В этой группе активность СДГ и максимальная скорость дыхания митохондрий также не отличалась от группы контроля. ВЫВОД: Кинетика АДФ-стимулированного дыхания может изменяться не за счет увеличения активности митохондриальных

530 0«

1=25 я

■ 20 ■

■

■5 15

(Ч

н м

£ 5

*54%

-Ь

ви

Рис.10

Растяжение т. 5о1еш

11« ЦЙЯИ

ферментов, а за счет других механизмов (например,

увеличения проницаемости

внешней мембраны митохондрий при трансформации мышечных волокон). Эти изменения могут происходить уже через 2 недели.

в) Исследование соотношения нейрогенных и локальных регуляторных механизмов, которые отвечают за поддержание структурных характеристик скелетных мышц

Структурные характеристики скелетных мышц, которые мы изучали, это: миозиновый фенотип и размеры мышечных волокон. Исследовали роль афферентной информации, поступающей от опорной зоны стопы, и от самой скелетной мышцы, в поддержании ее структурных и метаболических характеристик. Эксперимент 5 с вывешиванием крыс и опорой

стопы от вклада, вносимого сокращением самой работающей мышцей на её структурные

характеристики. Самцы крыс Wistar (180-190 г) были разделены на 4 группы. Одна группа

служила клеточным контролем (гр.К, п=7), три другие подвергались вывешиванию за

хвост (В), (рис.2). У всех вывешенных групп левая конечность оставалась свободной (JI), в

то время, как правая (Пр.): или опиралась на платформу во время вывешивания (гр.ВО,

п=6), (рис.10), или была иммобилизована в голеностопном суставе в нейтральной позиции

(гр.ВИ., п=5), или одновременно была иммобилизована в нейтральной позиции и

опиралась на платформу (гр. ВОИ, п=7). Период вывешивания составил 2 недели.

Схема эксперимента. Гр.1. Вывешивание с опорой (правая нога).

Гр.2 Вывешивание с иммобилизованной в нейтральной позиции (под углом 90° в голеностопном суставе) опирающейся конечностью. Гр.З Вывешивание с иммобилизованной в такой же позиции конечностью без опоры.

Контралатерапъные конечности в этих группах оставались свободными Гр.4 Интактный контроль

Для вывешивания использовали модифицированный аппарат Овертона-Типтона (1990г), (рис.11). Рис.11 Опора конечности при вывешивании крысы

Передняя часть тела находилась в метали-ческой трубке с эластичным ремнем, размер которого был подобран под размер тела крысы. Задняя часть тела находилась в металлической

трубке с прикрепленной к ней металлической платформой. Обе металлические трубки могут двигаться и закрепляться на верхней ведущей оси по размеру тела животного. Хвост крысы был прикреплен к верхней оси специальным парижским пластырем (Hanges et al, 1984).

Организация опоры при вывешивании и иммобилизации конечности. При вывешивании опорная платформа была подведена на 4 см ниже металлической полукруглой трубки, пол опоры был закреплен параллельно верхней ведущей оси аппа-

рата (рис.11). Между задними конечностями находился барьер, который мешал контакту левой конечности с опорой. В группе крыс, вывешенных с опорой и иммобилизацией конечности в голеностопном суставе под углом в 90° (Riley et al., 1990), опирающаяся лапа могла в любое время давить на платформу, т.к. конечность оставалась подвижной в коленном и тазобедренном суставах. В то же время soleus в этой группе не мог изменять своей длины. При иммобилизации, опирающаяся зона стопы была оставлена свободной от гипса. Во время крепления крыс к аппарату они находились под слабым наркозом нембутала (12 мг/кг веса тела). По окончании эксперимента была немедленно изолирована m.soleus для исследования площади поперечного сечения и процентного соотношения мышечных волокон. Анализ проводили после типирования MB с помощью миофибриллярной АТФ-азы.

Характеристика групп крыс после 2х недель вывешивания с опорой и иммобилизацией конечности представлена в таблице 14. После вывешивания вес soleus всех свободно висящих конечностей достоверно отличался от веса контроля. Вес soleus свободно висящей иммобилизованной конечности также был достоверно ниже, чем у контроля. Вес soleus опирающейся иммобилизованной конечности был несколько выше, чем у мышцы Таблица. 14 Вес тела, вес soleus и %медленных волокон у крыс, вывешенных с опорой.

Группы Вес Вес soleus, мг %медленных волокон

тела, г

Пр. Л Пр. Л

Гр.Опора 21117* 102.0±4.0 63.014.0*# 84.0±2.0 74.013.0*#

(п-в)

Гр.Оп.+Им. 20014* 70.415.3* 57.614.8* 7б.0±4.0 64.015.0*

(п = 7)

Им. 209112* 57.014.0* 52.015.0* 76.0±7.0 77.017.0

(п=5)

Контроль 251±6 113.016.0 82.0±2.0

(п-7)

*- Достоверное отличие от контроля, Р<0.05; # - достоверное отличие от контралатеральной правой конечности (Пр.), Р<0.05. Оп.+Им. - опора + иммобилизация, Им.-иммобилизация, Пр.-правая нога, Л-левая нога.

контралатеральной конечности, но эти различия не были достоверными. Процентное содержание медленных мышечных волокон зокиэ в висящей опирающейся конечности не отличалось от уровня контроля. Во всех остальных 8о1еш, как свободно висящих, так и иммобилизованных конечностей, процент медленных волокон был существенно ниже, чем у контроля. ППС МВ после 2х недель вывешивания крыс с опорой под одну конечность представлена на рис.12. Во всех трех экспериментальных группах левая конечность (Л) оставалась свободно висящей, а правая (Пр.) конечность 1) стояла на опоре Опора (Пр.); 2) стояла на опоре, иммобилизованная в голеностопном суставе в нейтраль-

Рис.12 Площадь поперечного сечения мышечных волокон (ППС MB, mc2) медленных (MBI) и быстрых (MBII) мьппечных волокон m.soleus после 14-дневного вывешивания с депривацией сократительной активности soleus

3000 ,

2500

¡□mbi J i m mbH I

<3 2000 -a

I 1500

5 looo -

500

Опора Оп.+Им. Им.

+ -отличие контроля и опирающейся конечности, Р<0.05; # - отличие от Оп.+Им. (Л.) конечности, Р<0.05.

ной позиции - Оп.+Им. (Пр.); 3) иммобилизована как в гр. 2, но без опоры (Пр.). Величины представлены как Средняя ± ошибка средней. После 2х недельного вывешивания ППС как MBI, так и MBU m.soleus всех левых свободно висящих конечностей были достоверно снижены по сравнению с контролем. Не наблюдалось атрофии в soleus опирающейся при вывешивании конечности (Опора, Пр.). В мышце иммобилизованной и опирающейся конечности снижение ППС MBI (но не MBU) типа было выражено в меньшей степени, чем в свободно висящей контралатеральной (Л) конечности.

Иммобилизация мышцы в нейтральной и/или сокращенной позиции и гравитационная разгрузка, как известно, приводят к атрофии мышечных волокон (Booth and Thomason, 1973, Fitts et al„ 1989, Kannus et al., 1998). Атрофия мышцы иммобилизованной конечности у вывешенной крысы и атрофия m.soleus ее левой свободно висящей конечности были одинаковы (таблица 14). Мы обнаружили полное предотвращение атрофии m.soleus конечности, которая при вывешивании опиралась на платформу. Следовательно, атрофия предотвращается при сократительной активности мышц, преодолевающей сопротивление опоры. Ненагруженные сокращения (без опоры) не предотвращают атрофию мышцы при гравитационной разгрузке (Furby et al., 1993). В

soleus конечности, которая подвергалась иммобилизации и опоре (Оп.+Им. П), были достоверно увеличены мышечные волокна I типа по сравнению со свободно висящей контрапатеральной свободной конечностью (Оп.+Им. JI), (рис.12). В то же время мы не обнаружили достоверной разницы между ППС MB soleus группы Опора+Имобилизация, (правая нога) и иммобилизованной конечностью без опоры. Стимуляция опорной зоны без нагруженного сокращения мышц не предотвращает ее атрофии. В то же время, наши данные показали, что некоторое предотвращение снижения ППС MB I m.soleus в иммобилизованной и опирающейся конечности не может быть исключено. При гравитационной разгрузке происходит трансформация медленно сокращающихся мышечных волокон в быстро сокращающиеся (Thomason and Booth, 1990). Мы также наблюдали увеличение процента МВП типа в свободно висящих Л конечностях по сравнению с группой контроля (табл.16). У вывешенных животных трансформация волокон была полностью предотвращена только в опирающейся конечности. Композиция мышечных волокон m.soleus во всех иммобилизованных конечностях (группы Оп.+Им. и Им.) была такая же, как у свободно висящих контралатеральных конечностей. Опора у иммобилизованной конечности не вносит вклада в изменение соотношения мышечных волокон. ВЫВОД: 1) опора при гравитационной разгрузке полностью предотвращает развитие атрофии и трансформацию мышечных волокон от медленных к быстрым только в случае, если мышца может сокращаться. 2) У иммобилизованной m.soleus опора при вывешивании не полностью предотвращает снижение ППС MB I типа. Эксперимент 6. Вывешивание и деафферентация животных.

Для выявления вклада афферентной информации, поступающей от мышцы, в поддержание ее структурных и метаболических характеристик (т.е. собственно внутримышечных сенсоров, способных воспринимать ее растяжение) был проведен эксперимент с деафферентацией животных при моделировании гравитационной разгрузки и растяжении мышцы.

Использовали 51 самца крыс Wistar. 6 крыс находилось в клетках в виварии в течение 14 дней (группа Контр. 1.; вес 276±10 г.), 7 животным делали операцию деафферентции правой задней конечности (рис. 13) и оставляли в клетках на тот же срок (подгруппа Деаф.; вес 299±9 г.). 7 крыс вывешивали за хвост (подгруппа Вывеш.; вес 211±7 г), (рис.9). 6 крыс деафферентировали и вывешивали (подгруппа Выв.+Деаф.; вес 2б7±9 г); 7 крыс вывешивали, при этом одна задняя конечность (левая) оставалась свободной, а другая (правая) была иммобилизована в голеностопном суставе под углом 35° (рис.10) (подгруппа Выв.+Раст.; вес 250±19 г). 6 животных вывешивали с иммобилизованной под

тем же углом деафферентированной правой конечностью (подгруппа Выв.+Раст.+Деаф.;

Для операции деафферентации открывали правую сторону спинномозгового канала и вырезали 3-4 мм афферентных волокон корешков 1,7, 1,6, 1,5, включая ганглий (рис.13). После этого сшивали фасции мышц и кожу. Операция проводилась под анестезией нембуталом (20 мг/кг веса тела). После операции животных выдерживали 5 дней и затем использовали для эксперимента. После эксперимента часть т.вокив помещали в жидкий азот.

Контроль (п=6)

Деафферентированные крысы, сидящие в клетке (п=7)

Вывешенные крысы (п=6)

Крысы, вывешенные с деафферентацией (п=6)

Крысы, вывешенные с ложной операцией деафферентации (п=б)

Крысы, вывешенные с растянутой т.вокиэ (п=7)

Крысы, вывешенные с растянутой т.зокиэ и деафферентацией конечности (п=7)

Мышечные волокна типировали антителами против быстрых и медленных тяжелых

цепей миозина. Подсчитывали процентное соотношение волокон и площадь их

поперечного сечения. Измеряли активность сукцинатдегидрогеназы в отдельных типах

волокон и скорость дыхания митохондрий в скинированных сапонином пучках мышечных

волокон.

При сравнении веса мышцы и ППС волокон обоих типов у деафферентированных животных и животных виварного контроля отличий в динамике этих характеристик не было обнаружено. У животных, подвергнутых вывешиванию, сырой вес мышцы был

вес 224+15 г). Схема эксперимента представлена ниже (рис.13).

Рис.13

Схема проведения операции.

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

I 1

Рис.14 Вес т.Бокиэ после 2х недельной деафферентацнн, вывешивания и растяжения мышцы.

140 120 100 80 60 40 20

т£т

вд

ви

вди

* - отличия от контроля (р<0,05). К-контроль, Д - деафферентированные животные, В -вывешивание, ВД - вывешивание деафферентированных крыс, ВИ - вывешивание животных с иммобилизованной в растянутом состоянии т^окш, ВДИ - вывешивание деафферентированных животных с иммобилизованной т.5о1еш.

значительно (на 36%) меньше, чем у контрольных крыс (рис.14), а ГТПС медленных волокон у них снизилась на 28,5%. Снижение размеров быстрых волокон у них было менее выражено (на 14%) и недостоверно отличалось от гр. контроля. Вес мышцы и морфометрические параметры у животных, предварительно деафферентированных, а затем подвергнутых вывешиванию, достоверно не отличались от значений, характерных для вывешенных животных с нормальной афферентацией конечности (рис. 14,15). Иммобилизация мышцы в растянутом состоянии при вывешивании крыс привела к отсутствию снижения ее веса (рис.14) и достоверному уменьшению (примерно наполовину) глубины редукции размеров медленных волокон (рис.15). Уменьшения размеров быстрых волокон у этой группы не было. Вес т. зокия животных, которые были вывешены с деафферентацией и растяжением мышцы (как и ППС их МВ) не отличался от контроля.

Рис.15. Площадь поперечного сечения мышечных волокон (ППС МВ) после 2х недель вывешивания и деафферентации

3000 1

2500

я 2000

1500

| 1000

Н 500

0 -

КД

В вд

Группы

ВИ

вди

2500

^2000 £

¡1500 н Н «1000

500 0

КД

В ВД

Группы

ВИ

ВДИ

*- отличие от контроля, Ь<0.05. К - контроль, КД - деафферентированный контроль, В -вывешенные крысы, ВД - вывешенные с деафферентацией крысы, ВИ - крысы, вывешенные с иммобилизованной в растянутом состоянии т.эокиз, ВДИ -крысы, вывешенные с деафферентированным и иммобилизованным вок^ю.

У деафферентированных крыс с нормальной двигательной активностью наблюдалась тенденция к несколько большей доле волокон, позитивно окрашенных на препаратах, обработанных антителами против МНС медленного и быстрого типов соответственно (рис.16). Следствием этого у них явилось достоверно более высокое процентное

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петербург 09 300 акт

Ч I ....... >1

Рис. 16 % волокон, позитивных для I и Па типа МНСвт.$о1ега (эти волокна могут иметь в своем составе до 2% МНС Их) .

содержание гибридных волокон, (имеющих в своем составе как быстрые, так и медленные изоформы МНС), (рис.17).

Группа вывешенных животных характеризовалась достоверно меньшей долей волокон, связывающих антитела против медленных МНС, и также достоверно большим процентом волокон, реагирующих с антителами против быстрых изо-форм МНС по сравнению с контрольной группой. Интересное распределение изоформ МНС продемонстрировали деафферентирован-ные и вывешенные животные. На препаратах, обработанных антителами против медленных МНС, доля позитивно окрашеннных волокон у них была достоверно выше контрольного уровня (рис. 16). Однако анализ серийных препаратов, обра-

*-отличие от контроля, Р<0.05 ботанных антителами против быстрых МНС,

выявил, что часть этих волокон является гибридными, т.е. содержащими как медленные, так и быстрые изоформы МНС. Поэтому количество волокон I типа у этих животных было достоверно ниже, чем у контрольной группы, и не отличалось от такового у вывешенных животных с сохраненной афферентацией (рис. 17). В целом, у деафферентированных вывешенных животных значительно выросла доля гибридных волокон (рис.17). Растяжение т. зо1еив (гр.ВИ) приводит к поддержанию относительного содержания волокон на уровне контроля, и предотвращению трансформации МВ (рис. 16 и 17). Деафферентация т.жкш на фоне растяжения мышцы ведет к перераспределению изоформ МНС в сторону увеличения синтеза МНС I и количества гибридных волокон (как в гр. деафферентированных вывешенных животных).

100 90

! *

| г ! § о

70 60 50 40 30 -н

я 20 * 10 о

; зо

К КД В ВД ВИ вди

§ 10 в

г?

т———г

К КД В ВД ВИ ВДИ

Рис.17 % распределение мышечных волокон в m.soleus

; 100%

80%

60%

' м 40% — й I о 1 &Й

§ 20% О CP

nsn

; MJ

□ Па

■ Hybrid

□ I

К КД В ВД ВИ ВДИ

Часто отмечается, что гравитационная разгрузка сопровождается инактивацией большинства афферентных входов, что приводит к соответствующей инактивации двигательных центров, к последующему снижению активности мышц и к развитию глубоких атрофии-ческих изменений (Т)е-

Бопскег ег.а1.,2000; Ншк

*-отличие от контроля, Р<0.05. Hybrid- гибридные волокна et.al.,1985; Kannus,1998). Мы не обнаружили изменений массы m. soleus и ППС ее мышечных волокон у животных, деафферентированных на фоне нормальной двигательной активности, по сравнению с животными виварного контроля (рис.14). У животных, подвергнутых гравитационной разгрузке, обнаружено значительное уменьшение массы m. soleus, ППС ее волокон как медленного, так и быстрого типа по сравнению с животными виварного контроля (рис.15). Также мы наблюдали достоверное уменьшение процента волокон, содержащих медленные изоформы тяжелых цепей миозина, и увеличение дож волокон, содержащих быстрые изоформы. У животных с иммобилизацией голеностопного сустава вывешенной конечности в положении тыльного сгибания (m. soleus растянут) масса m. soleus и средние значения ППС медленных мышечных волокон значительно выше, чем у животных, вывешенных без растяжения мышцы. Основной задачей настоящей работы было определение вклада рефлекторного нагрузочного компонента, возникающего при хроническом растяжении мышцы, в предотвращение редукции ППС мышечных волокон, характерной для условий гравитационной разгрузки. Значения ППС мышечных волокон m. soleus при сочетании растяжения и деафферентации на фоне гравитационной разгрузки не были меньшими по сравнению ППС волокон при воздействии хронического растяжение на конечности с сохраненными афферентными путями. Таким образом, деафферентация не оказывает существенного влияния на профилактическое действие хронического растяжения по отношению к развитию атрофических изменений при гравитационной разгрузке. Результаты работы не подтверждают гипотезу о преобладающем вкладе активации

мышечных афферентов при хроническом растяжении разгруженной мышцы в предотвращение развития атрофических изменений. Вероятно, отсутствие атрофии при растяжении разгруженной мышцы обусловлено механическим напряжением структур мышечного волокна (ОоМзртк е1 а1.,2002). Можно предположить, что в условиях нормальной антигравитационной работы га. вокиз роль механического напряжения в поддержании размеров мышечных волокон также важна. Мы обнаружили достоверное увеличение доли волокон, содержащих медленные изоформы МНС, и "гибридных" волокон, содержащих оба типа изоформ миозина у всех деафферентированных животных по сравнению с животными соответствующих групп, у которых не проводилась деафферентация (рис.16,17). Наименее выражен такой эффект у деафферентированных животных с нормальной двигательной активностью. Наиболее глубокие изменения наблюдались у вывешенных животных. Эти изменения противоположны тем сдвигам в сторону синтеза "быстрых" изоформ МНС, которые мы регистрировали в т. «Леш вывешенных животных. Мы обнаружили у деафферентированных животных достоверное превышение доли волокон, содержащих медленные МНС, над уровнем контроля. Вывод: механическая деафферентация задней конечности не оказывает влияния на предотвращение редукции размеров мышечных волокон при использовании хронического растяжения мышцы в условиях гравитационной разгрузки. Деафферентация как вывешенных животных, так н животных с нормальной двигательной активностью, приводит к увеличению доли волокон ш. $о1еиз, содержащих медленные изоформы МНС.

г) Структурная перестройка скелетных мышц при действии гипергравитации.

В этой части работы мы исследовали действие гипергравитации на скелетные мышцы. Рабочая гипотеза: 1) вектор изменений, происходящих в скелетной мышце, будет непрерывным от (Ю до Ю. Т.е. адаптация к условиям гипергравитации будет зеркальным отражением их адаптации к условиям микрогравитации. 2) влияние гипергравитации на мышцы будет аналогично действию их повышенной сократительной активности. Эксперимент 7. Воздействие гипергравитации

15 2,5 месячных самцов крыс \Vistar были отобраны для вращения на центрифуге (радиус -4 м, постоянная скорость вращения 21,16 р.п.м.) при ускорении в +20. 7 крыс вращали 19 дней (гр.1, вес тела 258+8 г), а 8 крыс - 33 дня (гр.2, вес тела 309+5 г.). К каждой из групп имелся свой клеточный контроль из 7 животных, который находился в той же комнате, где происходило вращение крыс (вес тела 288+8 г. и 335+5 г.

соответственно). После остановки центрифуги крысы были забиты декапитацией, билатерально были немедленно извлечены т^окив и т.р1атапз и взвешены. Мышцы были разделены на 3 части. Одна часть предназначалась для иммуногистохимического (выявление тяжелых цепей миозина), вторая - для морфологического анализа (определения ППС МВ и площади, занимаемой соединительной тканью) и биохимических исследований с помощью электрофореза (в вВв-геле) и последующего иммуноблоттинга и была заморожена в изопентане в жидком азоте. С помощью электрофореза были определены также типы тяжелых цепей миозина, субъединицы тропонина и актин. Третья часть мышцы предназначалась для электронномикроскопического анализа объемной плотности миофибрилл и митохондрий в центральной и периферической зонах мышечных волокон. Контралатеральные мышцы были использованы для исследования сократительных свойств единичных скицированных ЕйТА мышечных волокон (только в гр.1). Вес крыс и вес т.яокия после действия гипергравитации. Масса тела крыс снизилась достоверно после 33 дней действия гипергравитации. Диаметр (табл.17) и ППС МВ после 19 и 33 дней воздействия и гипергравитации не изменились. Вес т-воЬш не изменялся и после 33 дней (табл.15).

Таблица 15 Вес тела и вес т.текш у крыс после действия гипергравитации

19 дней +2G 33 дня +2G

Вес тела Вес М. soleus Вес тела Вес М. soleus

(г) (мг) (г) (мг)

Контроль 287+8 123+6 333+5 124+3

Эксперимент 258+8 139+6 306+5* 118+4

*- отличия от контроля (р<0,05)

Экспрессия изоформ миозина в m.soleus и т plantaris. Электрофоретическое сепарирование тяжелых цепей миозина не выявило изменений паттерна тяжелых цепей миозина в m.soleus и m.plantaris в целой мышце после 19 дней гипергравитации (табл.16). Табл.16. Изоформы паттернов тяжелых цепей миозина и тропонинов после 19 дней

Soleus Plantaris

Контроль Гипергравитация Контроль Гипергравитация

MHCI 83.1 ±2.8 82.1 ±1.7 3.03 ±0.22 2.22 ±1.05

MHCIIa 16.9 ±2.7 17.9 ±1.7 20.1 ± 1.2 17.4 ±1.5

MHCIId/x - - 38.0 ± 0.5 41.2 ±2.1

MHCIIb - - 38.9 ±0.2 39.1 ±4.3

TnTls 42.5 ±2.0 41.7 ±7.8 40.7 ± 4.8 40.2 ±3.0

TnT2s 41.0 ±2.0 43.1 ±2.4 39.5 ±1.2 38.2 ±3.5

TnT3s 16.5 ±1.2 15.2 ±4.5 19.8 ±5.9 16.8 ±6.3

TnTlf 24.7 ±0.6 27.2 ±2.3 20.8 ±1.4 20.9 ±1.1

тъта 41.7 ±0.5 38.3 ±0.6 23.5 ±0.9 19.6 ±1.7

TnTЗf 31.5 ±0.4 30.9 ±1.1 24.0 ±1.1 22.8 ± 0.7

ТпШ 2.1 ±0.6 3.6 ±0.8 31.7 ±0.7 30.4 ±2.3

ТпЬ 75.5 ± 3.4 62.3 ± 4.2 * 38.2 ±6.9 36.3 ± 6.4

ТпК 24.5 ±4.0 37.7 ±3.1 * 61.8 ±12.4 63.7 ±6.1

ТпСв 78.8 ± 3.9 59.1 ± 3.0 * 10.4 ±2.8 10.5 ±2.7

ТпС5 21.2 ±3.9 40.9 ±3.0* 89.6 ±2.8 89.5 ±2.7

* Достоверные отличия от контроля (р<0,05). э- медленная изоформа тропонина, £ быстрая изоформа тропонина

Проводилось также иммуиогистохимическое выявление тяжелых цепей миозина в

единичных мышечных волокнах. Процент волокон т.бокиэ, позитивно окрашенных с

использованием набора антител против тяжелых цепей миозина I и Па типа представлен

на рис.18. После 19 дней действия гипергравитации процент волокон, в которых были

выявлены I и На тяжелые цепи миозина (МНС), а также волокон, которые содержат оба

типа миозинов (1+Па), был достоверно увеличен по сравнению с контролем. После 33 дней

гипергравитации обнаружено достоверное увеличение волокон, содержащих только I тип

МНС, и количество гибридных волокон (1+Па). При сопоставлении серийных срезов было

рассчитано процентное соотношение волокон в т.эокиз, которые содержат только I тип

миозина, На, или только волокна с обоими типами миозинов (гибридные, Ну),рис.19.

Рис.18. % волокон, содержащих различные изоформы миозина. 19 дней воздействия +20 33 дня воздействия +Ю

S S

контроль 19 дней1К>

*-отличие от контроля (р<0,05)

После выдержки животных в условиях гипергравитации процентное содержание волокон I типа не отличалось от контроля. Количество гибридных волокон (Ну) было увеличено в обеих группах, а процентное содержание волокон Па было достоверно снижено (рис.19). Рис.19

120%

100%

я 80%

§ 60%

40% 20% 0%

11Ж1

V Ulla

□ Па ■ Ну

□ I

Контроль 19 дней

Увеличение количества гибридных волокон можно отнести преимущественно за счет экспрессии в быстрых волокнах изоформ МНС I типа. Picquet F. с соавторами в 2002 г. обнаружила при центрифугировании в течение Зх месяцев при 2G у крыс, взятых сразу после рождения, наличие только МНС I типа в soleus. Авторы объяснили этот эффект особенностями адаптации мышц молодых крыс к хронической перегрузке. В plantaris отличий от контроля также не было выявлено. Мы обнаружили, что при увеличении срока центрифугурования от 19 до 33 дней в мышцах взрослых крыс происходит увеличение синтеза МНС I типа. Таким образом, эффект, обнаруженный группой французских исследователей, мог быть связан не с возрастом крыс, а со временем их выдержки в условиях гипергравитации. В быстрой m.plantaris никаких изменений не обнаружено. Экспрессия изоформ субъединиц тропонина. Субъединицы ТпТ. Имеются три субъединицы медленного тропонина ТпТ (TnTls, TnT2s и TnT3s) и четыре субъединицы быстрой изоформы ТпТ (TnTlf, TnT2f, TnT3f и TnT4f). Как видно из результатов в таблице 16, после 19 дней действия гипергравитации их экспрессия не изменилась ни в soleus, ни в plantaris. Субъединицы Tai: Tnl состоит только из двух хорошо разделяемых изоформ. Изменения были оценены после использования двух форм антител против быстрых и медленных изоформ Tnl. Tills преимущественно экспрессировала контрольная мышца soleus (75 %). Его экспрессия была снижена после 19 дней гипергравитации на 13%, в то время как экспрессия Tnlf увеличилась. В plantaris соответствующая экспрессия

Tnls (~38%) и Tnlf (~62%) не изменилась после действия гипергравитации. Субъединицы TnC: TnCs - преимущественная изоформа в контрольном soleus - содержит ~79 % общего ТпС, и была снижена на 25% после действия гипергравитации. Пропорции TnCf и TnCs в контрольном plantaris не изменялись после действия гипергравитации. Объемная плотность миофибрилл и митохондрий. Объемная плотность миофибрилл после 19 дней выдержки крыс в условиях гипергравитации была достоверно снижена в m.soleus в центральной зоне волокна (табл.17). В то же время, объемная плотность митохондрий в центральной и периферической зонах - увеличена (по сравнению с контролем).

Таблица 17. Объемная плотность митохондрий и миофибрилл в центральной и периферической зонах m.soleus после 19 дней выдержки при +2G.

Объемная плотность митохондрий Объемная плотность митохондрий

периферия центр периферия центр

Контроль 10.24Ю.85 2.76±0.47 83.91±1.98 93.99±2.01

Эксперимент 14.39±1.40* 6.06±1.05* 75.95±3.33 86.98±2.24*

*- отличие от контроля (р<0.05)

Максимальная сила и взаимосвязь между концентрацией кальция и силой единичных мышечных волокон. Максимальное изометрическое напряжение Ро было записано в растворе при насыщении рСа 4.2 (табл.18). После воздействия гипергравитации (HG) волокна медленной мышцы soleus, так же, как и быстрой plantaris не претерпели каких-либо изменений в абсолютном и нормализованном (Ро) напряжении по сравнению с контролем. После 19 дней гипергравитации график зависимости напряжения волокна от концентрации кальция (в растворе) медленной m.soleus был смещен в сторону более высокого содержания кальция для порога активирования Ca 2+ и угол подъема графика был более крутой.

Табл.17 Сократительные характеристики единичных волокон медленно сокращающейся soleus и быстро сокращающейся plantaris у контрольных и центрифугированных при 2G

Soleus Plantaris

Контроль (п = 41) Гипергравитация (п = 52) Контроль (п = 42) Гипергравитация (п = 40)

Диаметр (мк) 74.7± 2.2 71.5± 1.9 69.3± 1.8 67.6± 2.0

PoOO^N) 3.54± 0.32 3.63±0.35 3.90± 0.34 3.54± 0.31

Po(kN.m"') 88.7± 10.1 96.9± 10.2 110.3± 10.9 102.5± 8.5

рСа порог 6.63±0.03 6.45± 0.02* 6.31± 0.03 6.33± 0.04

рСа50 5.85± 0.02 5.80± 0.02 5.76± 0.02 5.76± 0.03

пн 2.32± 0.11 3.09± 0.13* 3.53± 0.16 3.49± 0.27

ш 2.19± 0.11 2.88±0.21* 2.90± 0.39 2.67± 0.39

п2 3.22± 0.11 3.73± 0.17* 4.60± 0.43 4.25± 0.49

* достоверные отличия от контроля в той же мышце (р<0,05). Величины даны в ±8Е; п -число волокон; Ро - максимальное напряжение; рСа порог - порог активирования волокон

Са2+ ; pCaso, (напряжение волокон), - когда напряжение волокна равно половине от максимального; Пн, линия перегиба для графика напряжение-рСа; П[ и nj - коэффициент Хилла для относительного напряжения >50% и <50%, соответственно.

Коэффициенты Хилла ni и П2 были также увеличены. Величина pCaso не изменилась. В противоположность этому, в быстрой plantaris ни один из этих трех параметров не был изменен (табл.17). Можно заключить, что микро- (или гипер-) гравитация ведет к преимущественной адаптации к разгрузке (или увеличению нагрузки) для Са2+ активации только в медленно сокращающихся мышцах.

Содержание соединительной ткани и центральных ядер. После 19 дней центрифугирования процент, занимаемый центральными ядрами в soleus, вырос в 5,4 раза по сравнению с группой контроля. После 33 дней действия гипергравитации достоверных различий между группой контроля и HG отмечено не было. Это может свидетельствовать о завершении острого периода адаптации m.soleus к длительному действию гипергравитации до этого времени. Никаких структурных изменений в быстрой m.plantaris после действия микрогравитации не обнаружено.

Экспрессия сократительных белков и чувствительность к активации

Результаты наших исследований показали, что экспрессия МНС в soleus и plantaris после 19 дней действия гипергравитации, согласно результатам электрофореза, не отличались от контроля (табл. 16). Однако при иммуногистохимических исследованиях на замороженных срезах мы обнаружили увеличение экспрессии как медленной, так и быстрой изоформ миозина в единичных мышечных волокнах (рис.18). За счет экспрессии обеих изоформ миозинов после 19 дней HG существенно увеличилось количество гибридных волокон (рис. 19). Т.к. количество медленных волокон при этом не изменилось, то снижение количества волокон Па типа можно отнести только за счет увеличения количества гибридных волокон. Можно предположить, что неспецифический синтез миозинов, который мы наблюдали после 19 дней центрифугирования, мог быть ответом на перегрузку мышцы. Причем, вероятно, перегрузка в 2G была для m.soleus существенной, т.к. в этой мышце мы обнаружили снижение объемной плотности миофибрилл в центральной зоне волокна, большое количество центральных ядер и соединительной ткани. Функциональная значимость изменений экспрессии изоформ Тп субъединиц важна в связи с Са2+-активационными возможностями единичных мышечных волокон. Существенные изменения чувствительности волокон к Са2+ после действия 19 дней гипергравитации указывают на увеличение кооперации между различными белками тонких филаментов. Это может быть связано с увеличением экспрессии быстрых изоформ TnC (Moss et.al.,1986). Некоторое увеличение чувствительности волокон к Са2+ после

действия 2G находится в согласии с большей пропорцией TnCf. Изменения во взаимосвязи напряжение-рСа медленной soleus сравнимы с результатами, полученными в различных медленных мышцах разных животных (таких, как крыса, обезьяна, человек) после действия микрогравитации (Stevans et.al.,2001). Никаких изменений в графике напряжение-рСа в единичных волокнах быстрой plantaris обычно не обнаруживают ни при 0G, ни обнаружено нами и при +2G.

Можно заключить, что 1) при действии гипергравитации в течение 33 дней в медленной soleus происходит изменение экспрессии МНС в сторону увеличения синтеза МНС I типа; 2) микро- (или гипер-) гравитация ведет к преимущественной адаптации к разгрузке (или увеличению нагрузки) для Са2+ активации только в медленно сокращающихся мышцах.

Итак, адаптация скелетных мышц к состоянию микрогравитации (0G) и гипергравитации (2 G) не подчиняется принципу непрерывности. То есть эффекты, наблюдаемые при адаптации к гипогравитации, не являются зеркальным отражением эффектов гипергравитации. Адаптации в большей степени подвергаются медленные мышцы, а не быстрые.

4. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

I. Одной из целей работы был ответ на вопрос, является ли дефицит кислорода основным физиологическим стимулом для изменения структурных характеристик скелетных мышц при их повышенной активности? После проведения экспериментов: 1) попеременная выдержка животных в гипоксии + физическая нагрузка; 2) тренировка животных в условиях гипероксии и 3) введение животным ß-гуанидинпропионовой кислоргы можно заключить, что гипоксия не является обязательным условием для увеличения капилляризации и ТПТС MB при повышенной сократительной активности мышц. Но может быть модулирующим фактором, который при определенных условиях способен ускорить их рост. В работе показано, что в отличие от капилляризации и размеров мышечных волокон, для митохондриального биогенеза при физической нагрузке содержание кислорода во внешней среде играет существенную роль. Это было отмечено в эксперименте с тренировкой крыс плаванием в условиях гипероксии. У животных, которые тренировались при повышенной концентрации кислорода, активность митохондриальных ферментов достоверно не увеличилась, в отличие от тренированных в нормоксии крыс. Некоторые авторы отмечали, что регуляторные пути, которые приводят к митохондриальному биогенезу, изучены более детально, чем регуляторные механизмы. Например, не найден сенсор кислорода в скелетной мышце. Основная концепция регуляции синтеза

митохондриальных белков до сих пор остаётся не исследованной. Один из возможных регуляторных механизмов, который вовлечен в ответ митохондрий мышц на действие гипоксии, может быть связан с формированием особого реагирующего кислородного фактора, который образуется в митохондриях во время окислительного фосфорилирования (Hoppeler et.al.,2003). Как этот фактор связан с активизацией HIF-1, MAP киназой и другими сигнальными путями - этот вопрос до сих пор обсуждается.

что ведет к увеличению митохондриального биогенеза. Обратная картина наблюдается при снижении сократительной активности мышц, или введении креатина. В наших экспериментах впервые показано, что изменение концентрации макроэргических фосфатов является триггером для увеличения (или снижения) митохондриального биогенеза.

Впервые показано, что длительное снижение концентрации макроэргических фосфатов в мышце является триггером не только для митохондриального биогенеза, но и для трансформации мышечных волокон, а также увеличения устойчивости мышцы к утомлению. Внутриклеточная концентрация макроэргических фосфатов (ATP, ADP, РСг) и креатина в свою очередь может регулировать скорость дыхания митохондрий. Это было показано в экспериментах с тренировкой крыс на тредбане и моделировании гравитационной разгрузки. Уже через 2 недели увеличения сократительной активности мышц (бега на тредбане), увеличивается скорость дыхания митохондрий, стимулированная добавлением креатина.

регулируюмую добавлением в среду АОР, в быстро- и медленно сокращающихся мышцах. Эта группа авторов отнесла эти различия за счет разной проницаемости внешней мембраны митохондрий для А1)Р в этих мышцах. Мы обнаружили, что кинетика дыхания митохондрий при добавлении АБР изменяется уже через 2 недели, одновременно с трансформацией мышечных волокон. Можно заключить, что энергетический транспорт внутри мышечного волокна способен меняться за короткий срок при различных режимах сократительной активности. Эти изменения могут происходить не за счет увеличения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, а за счет изменения активности митохондриальной креатинкиназы и изменения транспорта АОР через внешнюю мембрану митохондрий.

III. Следующая проблема, которой мы занимались - это исследование роли нейрогенных и локальных регуляторных механизмов, которые отвечают за поддержание структурных характеристик скелетных мышц: миозинового фенотипа и размеров мышечных волокон. Исследовали роль афферентной информации, поступающей от: 1) опорной зоны стопы, и 2) поступающей от мышцы, в поддержание ее структурных и метаболических характеристик.

Для выявления вклада опорно-зависимых механизмов (сигнала от рецепторов стопы) поставлен эксперимент с моделированием гравитационной разгрузки у животных с опорой при вывешивании. Стояла задача отделить действие давления опоры на рецепторы стопы от вклада, вносимого сокращением самой работающей мышцей на её структурные характеристики. Чтобы разделить эти факторы была проведена серия экспериментов с действием опорной стимуляции на рецепторы стопы при депривации сократительной активности мышцы. В этом эксперименте впервые получены данные о роли опорной афферентации в поддержании структурных и метаболических характеристик позно-тонических мышц, в частности - т.зокиэ. Показано, что 1) опора при гравитационной разгрузке полностью предотвращает развитие атрофии и трансформацию мышечных волокон от медленных к быстрым только в случае, если мышца может сокращаться. 2) У иммобилизованной т.зокив опора при вывешивании препятствует (но не полностью предотвращает) снижению ППС МВI типа.

моделирования гравитационной разгрузки, ее атрофии также не происходит. Следовательно, в самих мышечных волокнах есть механо-чувствительные структуры, воспринимающие ее растяжение. Их активация ведет к синтезу сократительных белков. 2) Деафферентация как вывешенных животных, так и животных с нормальной двигательной активностью, приводит к увеличению доли волокон т. 5о1еш, содержащих медленные изоформы МНС. Результатами этих двух экспериментов было показано, что афферентная информация участвует в поддержании размеров медленных МВ и миозинового фенотипа мышцы при гравитационной разгрузке.

IV. Структурная перестройка скелетных мышц при действии гипергравитации.

В настоящей работе мы исследовали действие гипергравитации на скелетные мышцы. Мы полагали, что влияние гипергравитации будет аналогично действию повышенной сократительной активности мышц и обратно действию микрогравитации. В результате проведения экспериментов с 19 и 33-дневным действием гипергравитационной нагрузки мы обнаружили, что после 19 дней действия гипергравитации увеличивается синтез обеих изоформ тяжелых цепей миозина (быстрой и медленной) и увеличение быстрой изоформы тропонина (ТпС1). Отмечено также снижение чувствительности единичных волокон к Саг+. После гравитационной разгрузки наблюдается увеличение синтеза быстрых изоформ тяжелых цепей миозина и снижение кальциевой чувствительности медленных мышечных волокон. После 33 дней нахождения в условиях гипергравитации мы наблюдали увеличение синтеза медленных тяжелых цепей миозина. Аналогичные изменения обнаруживают после длительного увеличения сократительной активности мышц. То же самое можно сказать и об увеличении объемной плотности митохондрий в мышечных волокнах, которое мы наблюдали после гипергравитационного воздействия в т.здЬив. Однако ППС МВ после действия гипергравитации не изменялась, в отличие от действия микрогравитации и физической активности. Микро- (или гипер-) гравитация ведет к преимущественной адаптации к разгрузке (или увеличению нагрузки) для Са2+ активации только медленно сокращающихся мышц.

Итак, адаптация скелетных мышц к состоянию микрогравитации и гипергравитации не подчиняется принципу непрерывности. То есть эффекты, наблюдаемые при адаптации к гипогравитации, не являются зеркальным отражением эффектов гипергравитации. Адаптации в большей степени подвергаются медленные мышцы, а не быстрые.

4. ВЫВОДЫ

1. Экзогенная гипоксия оказывает модулирующее действие, ускоряющее увеличение

капилляризации и площади поперечного сечения мышечных волокон при

повышенной сократительной активности мышц. Содержание кислорода во внешней среде играет решающую роль для увеличения активности митохондриальных ферментов и миоглобина при физической нагрузке.

2. Изменение концентрации макроэргических фосфатов является триггером для увеличения (или снижения) скорости дыхания митохондрий, активности митохондриальных ферментов и способности мышцы к утомлению.

3. Энергетический транспорт внутри мышечного волокна способен меняться за короткий срок при различных режимах его сократительной активности. Эти изменения могут происходить не за счет увеличения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, а за счет изменения активности митохондриальной креатинкиназы и изменения транспорта ADP через внешнюю мембрану митохондрий.

4. Опорная афферентация является пусковым гравитационно-зависимым стимулом, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности мышечных волокон, только в случае, если мышца может сокращаться.

5. Гипергравитация, как и длительная физическая активность, ведет к трансформации тяжелых цепей миозина в сторону увеличения медленных изоформ и увеличению объемной плотности митохондрий в медленных мышцах. Гипер- (или микро-) гравитация ведет к изменению Са2+ чувствительности только в медленно сокращающихся волокнах.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ППС MB - площадь поперечного сечения мышечных волокон

Р-ГПК - бета-гуанидинпропионовая кислота

HIF-1 - фактор, индуцированный гипоксией

MAP киназа - механо-активируемая протеиикиназа

АМФ-аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

РСг - фосфокреатин

CP - саркоплазматический ретикулум

АДФ - аденозиндифосфат

МНС - тяжелые цепи миозина

MGF - механозависимый фактор роста

IGF-1 инсулино-подобный фактор роста-1

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

ЭМС - электро-механическое сопряжение

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.Б. Кошелев, Т.Л. Немировская, Б.С. Шенкман, А.Н. Некрасов. Влияние интервальной гипобарической гипоксии на архитектонику кровеносного русла и

структурно- метаболические характеристики мышц у крыс //Интервальная пшоксическая тренировка: эфективность, механизмы действия (Материалы международного совещания). Киев 1992. С. 114-118

2. T.L.Nemirovskaja, B.S. Shenkman, A.N. Nekrasov, O.L. Vinogradova. Training-induced capillary growth in skeletal muscles of endurance athletes// Intern. J. Microcirc.: Clinical and Exp.- 1992.V.11. Suppl.l. P.S185

3. Б.С. Шенкман, Т.Jl. Немировская. Реактивный (рабочий) ангиогенез в скелетных мышцах //В книге "Ангиогенез. Образование, рост и развитие кровеносных сосудов (В.В. Куприянов, В .А. Миронов, 0,Ю.Гурина) М.НИО "Квартет"- 1993. С.120-122

4. Т.Л. Немировская, Б.С. Шенкман, В.Б. Кошелев, А.Н. Некрасов. Влияние интервальной гипобарической гипоксии на максимальную гидравлическую проводимость кровеносного русла, капилляризацию и размеры мышечных волокон у крыс// Бюлл. эксп. биол. мед 1993, Т.116(9). С.227-229

5. Т.Л. Немировская, О.С. Тарасова, Б.С. Шенкман, В.Б. Кошелев. Влияние десятидневной тренировки аэробной направленности на энергетический потенциал и систему кровоснабжения скелетных мышц у крыс// Бюлл. эксп. биол. мед.- 1994. Т.117(1). С.33-35

6. T.L.Nemirovskaya, B.S.Shenkman,V.B.Koshelev, A.N.Nekrasov. Effects of two regimes of hipobaric hyipoxia on muscle vascularization and fibre characteristics in rats// Hypoxia Medical 1994,№.1.P.11-14

7. ТЛ.Немировская, Б.С. Шенкман, А.Н.Некрасов. Адаптация скелетных мышечных волокон человека в условиях тренировки аэробной направленности// Морфология, 1994, №.4-6, С. 151-156

8. Т.Л. Немировская, О.С. Тарасова, Б.С. Шенкман, В.Б. Кошелев. Влияние двенадцатидневного комбинированного воздействия гипобарической гипоксии и физической нагрузки на структурно- метаболические характеристики скелетных мышц// Бюлл.эксп.биол.мед. -1995. Т.119(6).С.602-605

9. R.S.Arutyunyan, I.B. Kozlovskaya, G.A.Nasledov, T.L. Nemirovskaya, T.L.Radzyukevitch,B.S.Shenkman. The Contraction of Unweighted Fast and Slow Rat Muscles in Calcium-Free Solution// Basic and Appl. Myology. -1995.V.5(2). P.169-175

10. G.A.Nasledov,R.S.Arutyunyan, T.L.Nemirovskaya,B.S.Shenkman,I.B.Kozlovskaya. Contractile properties of rat skeletal muscles after hindlimb unloading and GPA-administration// J.Gravit.Physiol.-1996. V.3(2). P. PI 1-P12

11. Б.С.Шенкман, Т. Л.Немировская, О.Л.Виноградова,В.Б.Кошелев. Накопление продуктов гликолиза как возможный стимул роста активности сукцинатдегидрогеназы скелетных мышц при тренировке// Доклады Академии Наук- 1996. Т.349(2). С.269-272

12. Т.Л.Немировская, Б.С.Шенкман. Является ли гипоксия стимулом для структурно-метаболических изменений в скелетной мышце? //Физиология человека- 1997. № 1. Т. 23, С.123-130

13. T.L.Nemirovskaya, B.S.Shenkman, G.A.Nasledov, R.S.Arutyunyan. Physical performance and skeletal muscle characteristics after 2-week hindlimb unweighting// J.Gravitat Physiol. -1997. V.4. (2). P. P135-P.136

14. Т.Л.Немировская, Б.С.Шенкман, В.Б.Кошелев. Является ли "гипоксия нагрузки" стимулом для структурно-метаболических изменений в скелетной мышце? //Докл. Акад. Наук,- 1998. Т.359(1). С. 1-3

15. T.L.Nemirovskaya,B.S.Shenkman,E.Mayevsky,E.Grishina. What is the trigger mechanism for changes of the oxidative potential in skeletal muscle? // J.Gravitat Physiol.- 1998. V.5(l). P. P81-P.82

16. Г.А.Наследов, Т.Л.Немировская, Р.С.Арупонян, Д.ФибекДШеин, Б.С.Шенкман. р-гуанидинпропионовая кислота предотвращает снижение работоспособности и активности митохондриальных ферментов мышц при гравитационной разгрузке у крыс// Докл. Акад. Наук- 1998. Т. 363(1). С. 126-129

17. T.L.Nemirovskaya, B.S.Shenkman, V.B.Koshelev. Exercise-induced hypoxia and structural and metabolic adaptation of skeletal muscle/ZBasic and Appl. Myology-1998. V.8(6).P.441-445

18. T.L.Nemirovskaya, B.S.Shenkman. Influence of single hindlimb support on fiber characteristics of unloaded skeletal muscle// J.Gravitat. Physiol.- 1999.V.6.P.151-152

19. Т.Д. Немировская, Б.С.Шенкман, М.Г. Мазин, В.Б. Кошелев, Е.И. Маевский, Е. Гришина. Концентрация макроэргических фосфатов и окислительный потенциал скелетных мышц// Цитология- 2000. Т. 42(1). С. 79-83

20. Т.Л.Немировская, Б.С Шенкман., Д.Д.Мациевский, Е.Ю.Бычкова, Е.И.Маевский, Е.Гришина. Сниженная концентрация макроэргических фосфатов предотвращает снижение окислительного потенциала в скелетных мышцах при гравитационной разгрузке//ДАН -2000.Т. 370 (1-6). С. 10-13

21. Ricart-Firinga С, Stevens L, Сaiiu МН, Nemirovskaya TL, Mounier Y. Effects of beta(2)-agonist clenbuterol on biochemical and contractile properties of unloaded soleus fibers of tat// Am J Physiol Cell Physiol.- 2000 Mar;278(3). P. C582-588.

22. T.L. Nemirovskaya, I. Krasnov, B.S. Shenkman, and I.N. Belozerova. Morphology Changes in Rat Skeletal Muscles after 19 Day Exposure to+2G//J. Gravit. Physiol- 2001,V.8(l).P73-74

23. T.L. Nemirovskaya, B.S. Shenkman, I.N. Belozerova. Plasticity of rat extensors under conditions of long-term hypergravity. 111. Muscle Res. Cell. Motil.- 2001. V. 22(7). P. 573

24. Nemirovskaya TL, Shenkman BS. Effect of support stimulation on unloaded soleus in rat// Eur J Appl Physiol.- 2002.V. 87(2).P. 120-126

25. Y. Volodkovich, A. Muchina, M. Sayapina, O. Larina, E. Bratcseva, B.S. Shenkman, T.L. Nemirovskaya. Effects of deafferentation on soleus fiber size and MHC isoform distribution in rats exposed to hindlimb suspension// J. Muscle Res. Cell. Motil.- 2002. V. 23(1). P. 43.

26. T.L.Nemirovskaya, B.S.Shenkman, A.Muchina, Y.Volodkovich, M.Sayapina, O.Larina, E.Bratcseva. Role of afferent control in maintaining structural and metabolic characteristics of stretched soleus in rats exposed to hindlimb suspension//!. Gravit. Physiol.-2002.V.9(1).P. P121-123.

27. T. Nemirovskaya, B. Shenkman. Effects of long duration +2g hypergravity on MHC distribution and maximal tension of rat m.soleus fibers// J. Gravit. Physiol.- 2002.V.9(1). P. P123-P125

28. T.JI. Немировская, Б.С. Шенкман, A.M. Мухина, Я.Ю. Володкович, М.М. Саяпина, Е. Братцева, О. Ларина. Влияние деафферентации на размеры и миозиновый фенотип мышечных волокон при растяжении m. soleus крысы на фоне гравитационной разгрузки// Росс. Физиол. Журнал им. И.М. Сеченова- 2003. Т. 89(3). С. 259-270

Выражаю глубокую признательность за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы заведующему лабораторией миологии института Медико-биологических проблем РАН, доктору биологических наук Б.С.Шенкману, профессору член.-кор. РАН И.Б.Козловской. А также выражаю особую признательность за методическую помощь в разработке и применении ряда уникальных приборов, использованных в работе, заведующему лабораторией биоинженерии института Общей патологии и патофизиологии РАМН Д.Д.Мациевскому. А также всем моим друзьям и коллегам в России и за рубежом, без вклада которых выполнение данной работы было бы невозможно. Финансирование работы осуществлялось в рамках грантов РФФИ, INTAS, контрактом NAS и программ, финансируемых из госбюджета.

Соискатель

P1472Z

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Немировская, Татьяна Леонидовна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1 Полиморфная организация скелетной мышцы.

2.2 Пластичность мышечной системы транспорта и утилизации кислорода.

2.3 Возможные триггерные механизмы роста капилляров в скелетных мышцах.

2.4 Вероятные стимулы изменения окислительного потенциала мышечных волокон и регуляции дыхания митохондрий in vivo.

2.5 Какие стимулы влияют на изменение размеров мышечных волокон?.

3. Методы обработки и анализа материалов.

4. Организация исследований, результаты и обсуждения.

4.1 Анализ кислородного режима как стимула для изменения структурно-метаболических характеристик скелетных мышц при повышенной сократительной активности.

4.2 Возможные регуляторные механизмы изменения окислительного потенциала и сократительных характеристик скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности.

4.3 Исследование соотношения нейрогенных и локальных регуляторных механизмов, которые отвечают за поддержание структурных характеристик скелетных мышц.

4.4 Структурная перестройка скелетных мышц при действии гипергравитации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Системные и клеточные механизмы пластичности скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности"

Актуальность проблемы. Известно, что скелетная мышца обладает высокой степенью пластичности. Механо-зависимая пластичность скелетной мышцы это ее фундаментальное свойство отвечать глубокой структурно-функциональной перестройкой на изменение режима сократительной активности. Существенной перестройке подвергается микроциркуляторное русло мышцы при длительном изменении функциональной активности, что выражается в увеличении, или снижении капилляризации. Известно, что при длительной физической активности наблюдается рост капилляров. Существует 2 гипотезы относительно механизмов, инициирующих этот рост. Одна из них отдает преимущество метаболическим (32) а другая (115) механическим факторам, детерминирующим этот процесс. Тот факт, что в работающих мышцах синтезируются ангиогенные вещества, не подвергается сомнениям. Однако вопрос о том, какие физиологические факторы запускают их синтез, остаётся открытым. При длительных однонаправленных изменениях функциональной активности изменяются также и сами мышечные волокна. Наиболее важные изменения, обнаруживаемые в мышечных волокнах при повышенной или пониженной сократительной активности, сводятся к перестройке всех основных внутриклеточных систем, осуществляющих сократительную деятельность мышцы: функциональные изменения клеточной мембраны, приводящие к ускорению или замедлению проведения волны деполяризации, к снижению или повышению порогов возбуждения (10, 11); качественные и количественные изменения сократительных и цитоскелетных белков миофибрилл, определяющие сдвиги механических характеристик мышечного волокна (194); изменения системы электромеханического сопряжения (включая изменения кальциевой чувствительности миофибрилл) (246); увеличение или уменьшение окислительного потенциала мышечного волокна, определяемого качественной и количественной перестройкой митохондриальной системы; В адаптацию скелетных мышц вовлечены вне- и внутриклеточные факторы. Изменения в мышце, вызванные повышенной, или пониженной сократительной активностью, могут быть обусловлены комбинацией этих факторов, и зависеть не Экстра- и интрацеллюлярные факторы, вовлеченные в адаптацию скелетных мышц. только кровоток гормоны механическое напряжение системные факторы механизма. от одного Ранее многими авторами подчеркившюсь механического жения значение напрявомышечных как локон, факторы роста и цитокины нервная активность фактора, влияющего на соотношение анаболических и многих Схема из обзора Widegren U. и соавторов, 2001 г (276). катаболических процессов в мышце. В последние годы исследования зарубежных и отечественных лабораторий были направлены на поиски молекулярных сенсоров, вовлеченных в систему внутриклеточной механо-зависимой сигнализации и механизмов селективной активации транскрипции мРНК ключевых сократительных, регуляторных и митохондриальных белков (62, 194). Выявлен один из молекулярных сенсоров, контролирующих энергетический метаболизм в мышечном волокне: 5АМФ-зависимая физиологические протеинкиназа триггерные АМПК. Но каковы метаболические и факторы её регуляции при различных режимах сократительной активности? Не исключено, что пусковым механическим стимулом к активизации белок-синтезирующего аппарата может служить напряженное состояние эластических белков саркомерного цитоскелета (титина, небулина) и сарколеммального цитоскелета (дистрофика). Но каковы механизмы, реализующие механический сигнал в мышечном волокне? Вместе с тем, если механическая активность мышцы посредством ряда внутриклеточных механизмов контролирует ее структурно-метаболический профиль, то характер самой этой активности в значительной степени регулируется центральными нейрогенными механизмами. Известно, например, что при уменьшении механической активности мышц происходит их атрофия и соотношение волокон, содержащих быстрые и медленные изоформы тяжелых цепей миозина, меняется в быструю сторону (181, 185, 194). Эти изменения, непосредственно обусловлены характеристиками импульсной активности мотонейронов двигательных единиц (66). И.Б. Козловской и ее сотрудниками показана преимущественная инактивация двигательных единиц медленного типа в условиях гравитационной разгрузки (140). Layne с соавторами постуральных (150) обнаружили мышц увеличение конечностей электромиографического при искусственной ответа синергистов стимуляции опорных зон стопы методом оказания пневматического давления на стопу во время космического полета. Весовая нагрузка на мышцы при этом отсутствовала. Однако неизвестно, предотвращает ли сама опорная стимуляция атрофию скелетных мышц при реальной, или моделируемой гравитационной разгрузке, если нет нагруженного сокращения мышцы. Вопрос о соотношении вклада центрального и локального «к уровней регуляции мышечной деятельности поддержании ее структурно- метаболических характеристик остаётся открытым. При хроническом растяжении мышц на фоне гравитационной разгрузки наблюдается уменьшение степени атрофии мышечных волокон (75, 122). Выделяют рефлекторный и местный компоненты (186, 187), которые могут быть задействованы в предотвращении атрофии в этих условиях. Во-первых, при растяжении мышцы происходит активация афферентных входов, конвергирующих на спинальные мотонейроны, и продуцирующих соответствующий элементарный рефлекторный сократительный ответ. Во-вторых, растяжение приводит к непосредственной напряжение активации поперечных мостиков (201). Кроме того, механическое цитоскелетных и мембранных структур, наблюдаемое при растяжении, можно рассматривать как пассивную компоненту процессов, вызванных растяжением мышцы (186, 187). Есть входа некоторые в данные, указывающие на существенную роль афферентного реализации профилактического эффекта хронического растяжения (58). Тем не менее, до сих пор остается неясным, насколько активная рефлекторная компонента может быть ответственна за уменьшение или полное предотвращение атрофических изменений при хроническом растяжении мышцы на фоне гравитационной разгрузки. Цель и задачи исследования: Целью настоящего исследования является поиск ключевых пусковых стимулов, вовлеченных в механо-зависимую перестройку мышечных волокон, связанную с: изменением экспрессии быстрых и медленных изоформ тяжелых цепей миозина; развитием атрофических или гипертрофических процессов; изменением окислительного потенциала мышечных волокон; предстояло получить ответ на два наиболее важных нерешенных вопроса, касающихся центрального контроля структурно-функциональных характеристик скелетных мышц: является ли опорная афферентация первичным пусковым гравитационно-зависимым стимулом, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности мышечных волокон? каковы системные механизмы, опосредующие опорный афферентный контроль импульсной регуляции миозинового фенотипа мышечного волокна? Положения, выносимые на защиту: 1. Адаптация мышечных волокон, капиллярного бассейна и митохондриальных ферментов к различным видам сократительной активности может происходить независимо друг от друга. Стимулами для этих изменений являются независимые триггерные механизмы. 2. Адаптация скелетных мышц к состоянию микрогравитации и гипергравитации не подчиняется принципу непрерывности. То есть эффекты, наблюдаемые при адаптации гипогравитации, не являются зеркальным отражением эффектов гипергравитации. Адаптивной перестройке подвергаются преимущественно медленные мышцы, а не быстрые. 3. Опорная афферентация является пусковым гравитационно-зависимым стимузюм, необходимым и достаточным для поддержания нормальных значений параметров, определяющих клеточный тип и сократительные возможности волокон постуральных мышц. При этом действие опорной афферентации опосредовано механической активностью этих мышц.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Немировская, Татьяна Леонидовна

6. выводы

1. Экзогенная гипоксия оказывает модулирующее действие, ускоряющее увеличение капилляризации и площади поперечного сечения мышечных волокон при повышенной сократительной активности мышц. Содержание кислорода во внешней среде играет решающую роль для увеличения активности митохондриальных ферментов и миоглобина при физической нагрузке.

3. Энергетический транспорт внутри мышечного волокна способен меняться за короткий срок при различных режимах его сократительной активности. Эти изменения могут происходить не за счет увеличения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, а за счет изменения активности митохондриальной креатинкиназы и, вероятно, изменения транспорта ADP через внешнюю мембрану митохондрий.

Гипер- (или микро-) гравитация ведет к изменению Са чувствительности только в медленно сокращающихся волокнах.

5. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что в отличие от капилляризации и размеров мышечных волокон, для митохондриального биогенеза при физической нагрузке содержание кислорода во внешней среде играет существенную роль. Это было отмечено в эксперименте с тренировкой крыс плаванием в условиях гипероксии. У животных, которые тренировались при повышенной концентрации кислорода, активность митохондриальных ферментов достоверно не увеличилась, в отличие от тренированных в нормоксии крыс. Некоторые авторы отмечали, что регуляторные пути, которые приводят к митохондриальному биогенезу, изучены более детально, чем регуляторные механизмы. Например, не найден сенсор кислорода в скелетной мышце. Основная концепция регуляции синтеза митохондриальных белков до сих пор остаётся не исследованной. Один из возможных регуляторных механизмов, который вовлечен в ответ митохондрий мышц на действие гипоксии, может быть связан с формированием особого реагирующего кислородного фактора, который образуется в митохондриях во время окислительного фосфорилирования (62, 110). Как этот фактор связан с активизацией HIF-1, MAP киназой и другими сигнальными путями - этот вопрос до сих пор обсуждается.

II. Возможные регуляторные механизмы изменения окислительного потенциала и сократительных характеристик скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности мы исследовали в экспериментах с тренировкой животных на тредбане, вывешиванием, введением креатина и p-гуанидинпропионовой кислоты. Обнаружено, что при увеличении физической активности (или введении Р-ГПК) происходит снижение концентрации макроэргических фосфатов в мышце. Недавно показано, что снижение концентрации макроэргов приводит к активации 5-АМР-киназы, что ведет к увеличению митохондриального биогенеза. Обратная картина наблюдается при снижении сократительной активности мышц, или введении креатина. В наших экспериментах впервые показано, что изменение концентрации макроэргических фосфатов является триггером для увеличения (или снижения) митохондриального биогенеза. Схематично роль концентрации макроэргических фосфатов в митохондриальном биогенезе можно было бы представить следующим образом (рис.29).

Рис.29 Схема, описывающая влияние концентрации макроэргических фосфатов на митохондриальный биогенез.

Вывешивание, Введение креатина

Тренировка, Введение (3-ГПК I

Снижение РСг и АТФ

Снижение

Увеличение РСг и АТР

Ингибирование

Активацияция

5'AM протеинкиназа

Стоит еще раз обратить внимание, что добавлением креатина можно стимулировать дыхание только в скинированных волокнах. В них сохраняется внешняя мембрана, на которой находится креатинкиназа (132). Исследование изолированных митохондрий такой возможности не даёт.

Мы впервые обнаружили, что активность митохондриальной креатинкиназы, отвечающей за синтез и транспорт креатинфосфата, увеличивается до изменения активности других митохондриальных ферментов. А при исследовании кинетики дыхания митохондрий скинированных волокон было показано, что она изменяется согласованно с изменением миозинового фенотипа. В то же время активность митохондриального фермента СДГ, измеренная в отдельных мышечных волокнах, оставалась неизменной. Ранее V.Saks с соавторами (214, 215) отмечали разную кинетику дыхания митохондрий, регулируюмую добавлением в среду ADP, в быстро-и медленно сокращающихся мышцах. Эта группа авторов отнесла эти различия за счет разной проницаемости внешней мембраны митохондрий для ADP в этих мышцах. Мы обнаружили, что кинетика дыхания митохондрий при добавлении ADP изменяется уже через 2 недели, одновременно с трансформацией мышечных волокон. Можно заключить, что энергетический транспорт внутри мышечного волокна способен меняться за короткий срок при различных режимах сократительной активности. Эти изменения могут происходить не за счет увеличения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, а за счет изменения активности митохондриальной креатинкиназы и, возможно, изменения транспорта ADP через внешнюю мембрану митохондрий.

Для выявления вклада опорно-зависимых механизмов (сигнала от рецепторов стопы) поставлен эксперимент с моделированием гравитационной разгрузки у животных с опорой при вывешивании. Стояла задача отделить действие давления опоры на рецепторы стопы от вклада, вносимого сокращением самой работающей мышцей на её структурные характеристики. Чтобы разделить эти факторы была проведена серия экспериментов с действием опорной стимуляции на рецепторы стопы при депривации сократительной активности мышцы. В этом эксперименте впервые получены данные о роли опорной афферентации в поддержании структурных и метаболических характеристик позно-тонических мышц, в частности - m.soleus. Показано, что 1) опора при моделировании гравитационной разгрузки полностью предотвращает развитие атрофии и трансформацию мышечных волокон от медленных к быстрым только в случае, если мышца может сокращаться.

2) У иммобилизованной m.soleus опора при вывешивании препятствует (но не полностью предотвращает) снижению ППС MB I типа.

Для выявления вклада афферентной информации, поступающей от мышечных веретен, в поддержание структурных и метаболических характеристик мышцы был проведен эксперимент с деафферентацией животных при моделировании гравитационной разгрузки и растяжении мышцы. Известно, что растяжение m.soleus при вывешивании крысы предотвращает развитие её атрофии (152). В эксперименте впервые было показано, что 1) при отсутствии афферентной информации от растянутой мышцы во время моделирования гравитационной разгрузки, ее атрофии также не происходит. Следовательно, в самих мышечных волокнах есть механо-чувствительные структуры, воспринимающие ее растяжение. Их активация ведет к синтезу сократительных белков.

2) Деафферентация как вывешенных животных, так и животных с нормальной двигательной активностью, приводит к увеличению доли волокон m. soleus, содержащих медленные изоформы МНС.

Результатами этих двух экспериментов было показано, что афферентная информация участвует в поддержании размеров медленных MB и миозинового фенотипа мышцы при гравитационной разгрузке.

IV. Структурная перестройка скелетных мышц при действии гипергравитации.

После 33 дней нахождения в условиях гипергравитации мы наблюдали увеличение синтеза медленных тяжелых цепей миозина. Аналогичные изменения обнаруживают после длительного увеличения сократительной активности мышц. То же самое можно сказать и об увеличении объемной плотности митохондрий в мышечных волокнах, которое мы наблюдали после гипергравитационного воздействия в m.soleus. Однако ППС MB после действия гипергравитации не изменялась, в отличие от действия микрогравитации и физической активности (211,212).

Итак, можно заключить, что микро- (или гипер-) гравитация ведет к преимущественной адаптации к разгрузке (или увеличению нагрузки) для Са активации только медленно сокращающихся мышц. При гравитационной нагрузке, как и при длительной физической активности, в мышцах происходит трансформация тяжелых цепей миозина в сторону увеличения медленных изоформ и увеличения объемной плотности митохондрий.

Итак, адаптация скелетных мышц к состоянию микрогравитации и гипергравитации не подчиняется принципу непрерывности. То есть эффекты, наблюдаемые при адаптации к гипогравитации, не являются зеркальным отражением эффектов гипергравитации (рис.30). Адаптации в большей степени подвергаются медленные мышцы, а не быстрые.

Рис.30 Эффекты микро- и гипергравитации на скелетные мышцы

ЭФФЕКТЫ МИКРОГРАВИТАЦИИ

МАССА ТЕЛА I

ППС MB J

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ \ Vv МИОф. ХАРАКТЕРИСТИКИ | Vv МИТ.

МИОЗИНОВЫИ ФЕНОТИП

ТРОПОНИНЫ

S—►F

ВСЕ Тп СУБЪЕДИНИЦЫ

ЭФФЕКТЫ ГИПЕРГРАВИТАЦИИ 1 i Уумиоф. f Vv мит. f Ну ВОЛОКНА; { F

Tnl-TnC (SKF)

СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ I СИЛА . = СИЛА

ХАРАКТЕРИСТИКИ | ЧУВСТВИТ. К [Са] | ЧУВСТВИТ. К [Са]

Расшифровка сокращений к рис. 30. Vv миоф,- объемная плотность митохондрий; Vv мит,- объемная плотность миофибрилл; S- медленные; F- быстрые; Ну - гибридные волокна; Тп - тропонин

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Немировская, Татьяна Леонидовна, Москва

1. Кузнецов С.Л., Талис B.J1. Состояние скелетных мышечных волокон у крыс при физических нагрузках на фоне "антиортостатического вывешивания" при моделировании невесомости. //Косм. биол. авиакосм, мед.- 1990. -№6.С.31-34.

2. Мациевский Д.Д. Внутрисосудистые измерения кровотока на крысах// Бюллетень экспериментальной Биологии и медицины.- 1993.-№ 8.1. С.144-146

3. Шенкман Б.С., Немировская Т.Л., Белозерова И.Н., Чеглова И.А., Козловская И.Б. Скелетно-мышечные волокна человека после длительного космического полета// Докл. Акад.наук. -1999.-Т.367.№2.С.279-281.

4. Шенкман Б.С., Немировская Т.Л., Чеглова И.А., Белозерова И.Н., И.Б. Козловская. Морфологические характеристики m. vastus lateralisчеловека в безопорной среде// Докл.Акад.наук.-1999,- Т.364.№4.С.563-565.

5. Alford ЕК, Roy RR, Hodgson J A, Edgerton VR Electromyography of rat soleus, medial gastrocnemius, and tibialis anterior during hind-limb suspension// Exp Neurol.-1987.- V.96.№3.P.635-649

6. Andrienko Т., Kuznetsov A.V., Kaambre Т., Usson Y., Orosco A., Appaix F., Tiivel Г.,

7. Sikk P., Vendelin M., Margreiter, Saks V.A.// Metabolic consequences of functional complexes of mitochondria, myofibrils and sarcoplasmic reticulum in muscle cells// J.Experimental Biology.-2003.-V.206.P.2059-2079

8. Askanas V. and Engel W.K. Distinct subtypes of type I fibers of human skeletal muscle//Neurology. 1975.-V.25.P. 879-887

9. Baldwin KM, Valdez V, Herrick RE, Macintosh AM, and Roy RR. Biochemical properties of overloaded fast-twitch skeletal muscle// J Appl Physiol.- 1982,- V.52.P.467-472,

10. Baldwin KM, Haddad F. Skeletal muscle plasticity: Cellular and molecular responses to altered physical activity paradigma// Am.J.Phys.Med.Rehabil.-2002.-V.81 (Suppl). P.S40-S51

11. Balsom P.D., Harridge S.D., Soderlund K., Sjodin B. and Ekblom В. Creatine supplementation per se does not enhance endurance exerccise performance//Acta Physiol.Scand. -1993,- V.149.P.521-523,

12. Balsom P.D., Soderlund K., Sjodin B. and Ekblom В. Skeletal muscle metabolism during short duration high-intansity exercise: influence of creatine supplementation// Acta Physiol.Scand.- 1995.-V.154.P.303-310,

13. Bar A. and Pette D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle

14. FEBS Lett- 1988.-V.235.P.153- 155,

15. Bastide B, Kischel P, Puterflam J, Stevens L, Pette D, Jin JP, and Mounier Y. Expression and functional implication of troponin T isoforms in soleus muscle fibers of rat after unloading// Pfliigers Archiv Europ J Physiol.- 2002,-V.444.P.345-354,

16. Bergeron R., Ren J.M.,Cadman K.S., Moore I.K., Perret P., Pypaert M., Young L.H., Semenkovich C.F.,Shulman G.I.// Chronic activation of AMP kinase results in NRF-1 activation and mitochondrial biogenesis// Am.J.Physiol.-2001 .-V.281. P.E 1340-1346

17. Billeter R, Weber H, Lutz H, Howald H. Eppenberger H.M. and Jenny E. Myosin types in human skeletal muscle fibers// Histochemistry.-1980.- V.65. P.249- 259

18. Breen EC, Johnson EC, Wagner H, Tseng H-M, Sung LA, and Wagner PD. Angiogenic growth factor mRNA responses in muscle to a single bout ofexercise// J.Appl. Physiol.- 1996,- V.81. P.355-361

19. Brooke M.H. and Kaiser K.K. Muscle fiber types: how many and what kind? //Arch Neurol.- 1970.-V. 23.P.369-379

20. Brutsaert T.D., Gavin T.P., Fu Z., Breen E.C, Tang K.,Mathieu-Costello O., Wagner P.D. Regional differences in expression of VEGF mRNA in rat gastrocnemius following 1 hr exercise or electrical stimulation)/ BMC Physiol. -2002.-V.2.№l.P.8

21. Burton H.W. and Barclay J.K.Metabolic factors from exercising muscle and the proliferation of endothelial cells// Med.Sci. Sports Exerc. -1986.-V.18.N 4. P.390-395

22. Burton RR, and Smith AH. Adaptation to acceleration environments// In : Handbook of Physiology, Environmental Physiology. Bethesda, MD : Am Physiol Soc.- 1996.-V. 40.P.943-970

23. Caiozzo VJ, Haddad F, Baker MJ, and Baldwin KM. The influence ofmechanical loading upon myosin heavy chain protein and mRNA isoformexpression//J Appl Physiol.- 1996.-V.80. P.1503-1512,

24. Caiozzo VJ, Haddad F, Baker MJ, Mc Cue A, and Baldwin KM. MHCpolymorphism in rodent plantaris muscle : effects of mechanical overload andhypothyroidism// Am J Physiol. 2000.-V. 278.P. C709-717

25. Campione MS, Ausoni S, Guezennec CY, and Schiaffmo SJ. Myosin andtroponin changes in rat soleus muscle after hindlimb suspension// J Appl

26. Physiol.- 1993.-V.74. P.1156-1160

27. Chi MMY, Manchester JK, and Lowry OH. Effect of centrifugation at 2G for 14 days on metabolic enzymes of the tibialis anterior and soleus muscles// Aviat Space Environ Med.- 1998.-V.69.P. A9-11,

28. Claffey KP, Shih S-C, Mullen A, Dziennis S, Cusick JL, Abrams KR, Lee

29. SW, and Detmar M. Identification of a human VPF/VEGF 3' untranslated region mediating hypoxia-induced mRNA stability. Mol. Biol. Cell. 1998,-V.9.P.469-481

30. Dahl H.A. and Roald L. How unequivocal is the muscle fibre type concept?// Anat Embryol.- 1991.-V.184.P. 269- 273,

31. Denardi C, Ausoni S, Moretti P, Gorza L, Velleca M, Buckingham M, and Schiaffino S. Type 2X-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene// J Cell Biol.- 1993.-V. 123.P. 823- 835

32. Desplanches D.,Hoppeler H.,Linossier M.T et.al.Effects of training in normoxia and normobaric hypoxia on human muscle ultrastructure// Pflugers Arch. 1993.-V.425. P.263-267

33. Dubowitz V and Pearse Age. A comparative histochemical study of oxidative enzyme and phosphorylase activity in skeletal muscle// Histochemie.- 1960,-V. 2.P. 105-117

34. Egginton S. Temperature and angiogenesis: the possible role of mechanical factors in capillary growth// Compar. Biochem. Physiol.-2002.-Part A.V.I32. P.773-787

35. Eggington S.,Turek Z. and Hoofd L.J.C. Differing patterns of capillary distribution in fish and mammalian skeletal muscle// Respir.Physiol. 1988.-V.74. P.383-396

36. Egginton S, Hudlicka O., Brown M.D., Walter H., Weiss J.В., and Bate A. Capillary growth in relation to blood flow and performance in overloaded rat skeletal muscle// J.Appl.Physiol. -1998. V.85.№6. P.2025-2032

37. Egginton S., Zhou A.L.,Brown M.D., Hudlicka O. Unorthodox angiogenesis in skeletal muscle// Cardiovasc. Res.- 2001- V.49.№3. P.634-646.

38. Eisenberg B.R., Kuda A.M. and Peter J.B. Stereological analysis of mammalian skeletal muscle I. Soleus muscle of the adult guinea pigll J Cell Biol.- 1974.-V.60.P.732- 754

39. Engel W.K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease// Neurology. -1962,-V.12.P. 778- 794

40. Ennion S, Sant'ana Pereira J, Sargeant A. Young A, And Goldspink G. Characterization of human skeletal muscle fibres according to the myosin heavy chains they express// JMuscle Res Cell Motil.-1995.-V. 16. P.35- 43

41. Falempin M., Fodili In-Albon S. Influence of brief daily tendon vibration on rat soleus muscle in non-weight-bearing situation// J. Appl. Physiol. -1999.-V.87.№ l.P. 3-9.

42. Fauteck SP, and Kandarian SC. Sensitive detection of myosin heavy chain composition in skeletal muscle under different loading conditions// Am J Physiol.- 1995.-V.268. P. C419-424

43. Febraio M.A., Flanagan T.R., Snow R.J., Zhao S. and Carey M.F. Effect of creatine supplementation on intramuscular Tcr, metabolism and performance during intermittent, submaximal exercise in humans// Acta Physiol.Scand.,155: 387-395. 1995

44. Ferrara N and Davis-Smyth Т. The biology of vascular endothelial growth factor// Endocr. Rev. -1997.-V.18. P.4-25

45. Fliick M.,Hoppeler H. Molekular basis of skeletalmuscle plasticity-from gene to form and function//Rev.Physiol.Biochem Pharmacol.-2003.-V.146.P.159-216

46. Fitts RH, Brimmer CJ, Heywood-Cooksey A, Timmerman RJ. Single muscle fiber enzyme shifts with hindlimb suspension and immobilization// Am J Physiol.- 1989,-V.256. P. 1082-1091

47. Folkman J and Klagsbrun M. Angiogenic factors// Science.-1987.- V.236.P.442.447

48. Forsythe JA., Jiang ВН., Iyer NV., Agani F., Leung SW., Koos RD., and Semenza GL. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1// Mol.Cell Biol.- 1996,- V.16. P.4604-4613

49. Fox RA, Daunton NG, and Corcoran ML. Study of adaptation to altered gravity through systems analysis of motor control// Adv Space Res.- 1998.-V. 22.P. 245-253,

50. Furby A, Mounier Y, Stevens L, Leterme D, Falempin M. Effects of chronic electrostimulation on rat soleus skinned fibers during hindlimb suspension// Muscle&Nerv.- 1993.-V.16.P. 720-726

51. Gayeski Т.Е. J.and Honig C.R.Intracellular PO2 in long axis of individual fibers in working dog gracilis muscle// Amer.J.Physiol. 1988,- V.254.N 6.Pt.2.P.l 179-1186

52. Gerber HP., Condorelli F., Park J., and FerraraN. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes// J. Biol. Chem.- 1997,- V.272 P.23659-23667

53. Goffart S. and Wiesner R. J. Regulation and co-ordination of nuclear gene expression during mitochondrial biogenesis// Experimental Physiology.-2003.-V.88.№ 1.Р. 33-40,

54. Gordon SE, Fliick M, and Booth FW. Plasticity in skeletal, cardiac, and smooth muscle. Selected contribution : Skeletal muscle focal adhesion kinase, paxillin, and serum response factor are loading dependent// J Appl Physiol.-2001.-V. 90.P. 1174-1183

55. Gorza L. Identification of a novel type 2 fiber population in mammalian skeletal muscle by combined use of histochemical myosin ATPase and anti-myosin monoclonal antibodies// J Histochem Cytochem.- 1990.-V. 38.P. 257265

56. Graham SC, Roy RR, Hauschka EO, and Edgerton VR Effects of periodic weight support on medial gastrocnemius fibers of suspended rats// J Appl Physiol.- 1989.-V. 67.№ 3.P. 945-953,

57. Green H.J.,Sutton J.R.,Cymerman A. et.al.Operation Everest II: adaptationin human skeletal muscle// J.Appl.Physiol.- 1989.-V.66. N 5.P.2454-2461

58. Griitzner P. Zur Physiologie und Histologic der Skelettmuskeln// Breslauer Arztl Z.- 1883. -V. 5.P. 257- 258

59. Gutmann ES, Schiaffino S, and Hanzlikova V. Mechanism of compensatory hypertrophy in skeletal muscle of the rat// Exp Neurol. -1971.-V. 31.P. 541 -464

60. Hanges AR, Steskai J, Johansson C, and Tipton CM Tissue fluid shift, forelimb loading and tail tension in tail suspended rats// Physiologist.- 1984.-V. 27.P. S37-S38

61. Hartner KT, Kirschbaum BJ, and Pette D. The multiplicity of troponin T isoforms. Distribution in normal rabbit muscles and effects of chronic stimulation//Eur J Biochem.- 1989.-V.179.P. 31-38

62. Henriksson J.,Galbo H. and Blomstrand E.Role of the motor nerve in activity-induced enzymatic adaptation in skeletal muscle// Am. J.Physiol.-1982.-V.242.No.11. P.C272-C277

63. Hepple R.T., Hogan M.G., Stary C, Bebout D.E.,Mathieu-Costello 0., and Wagner P.D. Structural basis of muscle O2 diffusing capacity: evidence from muscle function in situ//J.Appl.Physiol.-2000.- V.88. P.560-566

64. Herbert ME, Roy RR, and Edgerton VR. Influence of one-week hindlimb suspension and intermittent high load exercise on rat// Exp Neurol.- 1988.-V.102.P.190-198

65. Hnik P.,Vejsada R.,Goldspink DF,Kasicki S,Krekule I. Quantitative evaluation of electromyogram activity in rat extensor and flexor muscles immobilized at different lengths// Exp Neurol. -1985,- V.88.№ 3.P. 515-528,

66. Hochachka P.W. Muscle enzymatic composition and metabolic regulation in high altitude adapted natives// Int.J.Sports Med.- 1992.-V.13.Suppl.l .P.S89-S91

67. Hochachka P.W.,Stanley C.,McKenzie D.C.et al.Enzyme mechanisms for pyruvate-to-lactate flux attenuations stady of Sherpes, Quechuas, and Hummingbirds//Int.J.Sports Med.- 1992 .-V.13.Suppl.l.P.Sl 19-S122

68. Hochachka P.W.,Stanley C.,Merkt J. and Sumar-Kalinowski J. Metabolic meaning of elevated levels of oxidative enzymes in high altitude adapted animals: an interpretative hypothesis// Respir. Physiol.- 1983.-V.52. P.303-313

69. Honig R.C.,Connet R.J.,Gayeski E.J. O2 transport and its interaction with metabolism; a systems view of aerobic capacity// Med.Sci.Sports Exerc.1992.- V.24. No.l .Р.47-53

70. Hood D.A. Plastisity in Skeletal, Cardiac, and Smooth Muscle. Invited Review: Contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle// J.Appl.Physiol. -2001 .- V.90.P.1137-1157

71. Hoppeler H, Liithi P, Claassen H, Weibel E.R. and Howald H. The ultrastructure of the normal human skeletal muscle. A morphometric analysis on untrained men, women and well-trained orienteers// Pfltigers Arch.- 1973.-V.344.P. 217- 232

72. Hoppeler H„ Vogt M., Weibel E. R. and Fliick M. Response of skeletal muscle mitochondria to hypoxia// Experimental Physiology.- 2003 .-V. 88.P.109-119

73. Hoppeler H.,Desplanches. Muscle structural modifications in hypoxia//Int.J.Sports Med.- 1992.-V.13.Suppl.l,P.S166-S168

74. Hoppeler H.,Howald H.,Ceretelli P.Human muscle structure after exposure to extreme altitude//Experientia.- 1990.-V.46.N 11-12.P.1185-1187

75. Hoppeler H.,Howald H.,Conley K.et.al. Endurance training in humans: aerobic capacity and structure of skeletal muscle// J.Appl.Pysiol.- 1985.-V.59.-N 2.-P. 320-327

76. Hoppeler H.,Kleinert E.,Schlegel C. et.aLMorfological adaptations of human skeletal mascle to chronic hypoxia// Int.J.Sports Med.- 1990.- V. 11 .-Suppl. 1 .-P.S3-S9

77. Hudlicka O. and Price S.The role of blood flow and/or muscle hypoxia in capillary growth in chronically stimulated fast muscles// Pflugers Arch.-1990.- V.417.-No 1 .-P.67-72

78. Hudlicka O., Brown MD., Silgram H. Inhibition of capillary growth in chronically stimulated rat muscles by N(G)-nitro-l-arginine, nitric oxidesynthase inhibitor// Microvasc. Res.- 2000.- V.59(l), P.45-51

79. Hudlicka O., Milkiewicz M., Cotter MA., Brown MD. Hypoxia and expression of VEGA-A protein in relation to capillary growth in electrically stimulated rat and rabbit skeletal muscles// Exp. Physiol. -2002,- V.87.№ 3.P.373-381

80. Iljina-Kakueva E.I.,Portugalov V.V. The effect of artificial gravitation on the skeletal musculature at space flight// Archiv of Anatomy, Gistology and Embriology .-1979.-V 76. № 3.V. 22-27

81. Ingjer F. Effects of endurance training on muscle fibre ATPase activity, capillary supply and mitochondrial content in man.// J Physiol (bond).- 1979,-V. 294.P. 419-432

82. Iyer NV, Leung SW, and Semenza GL. The human hypoxia-inducible factor 1 alpha gene: HIF-la structure and evolutionary conservation// Genomics.-1998.- V.52, P.159-165

83. Jansson E, Sjodin B, And Tesch P. Changes in muscle fibre type distribution in man after physical training. A sign of fibre type transformation?// Acta Physiol Scand.- 1978.-V. 104.P. 235-237

84. Jaspers S., Fagan J.M., Satarug S., Cook P.H., Tischler M.E. Effects of immobilization on rat hind-limb muscles under non-weight-bearing conditions //Muscle Nerve.- 1988.-V.1 l.P. 458-466

85. Johnson MA, Polgar J, Weightman D, and Appleton D. Data on the distribution of fibre types in thirty-six human muscles. An autopsy study/ J Neurol Sci.- 1973.-V.18.P.111- 129

86. Jiirgens KD, Papadopoulos S, Peters T, and Gross G. Myoglobin: just an oxygen store or also an oxygen transporter ? //News Physiol. Sci. -2000.-V.15, P.269-274

87. Kamiya A, Ando J., Shibata M.and Wakayama H. The efficiency of the vascular-tissue system for oxygen transport in the skeletal muscles// Micrivasc.Res.- 1990.-V.39.P. 169-185

88. Kandarian SC, and Williams JH. Contractile properties of skinned fibers fromhypertrophied skeletal muscle// Med Sci Sports Exerc.- 1993.-V. 25.P. 9991004

89. Kandarian SC, Peters DG, Taylor JA, and Williams JH. Skeletal muscle overload upregulates the sarcoplasmic reticulum slow calcium pump gene// Am J Physiol.- 1994,- V.266.P. 1190-1197

90. Kandarian SC., Stevenson E.J. Molecular events in skeletal muscle duringdisuse atrophy// Exerc.Sport Sci.Rev.-2002.-V.30.№ 3.P.111-116

91. Kannus P, Jozsa L, Jarvinen TLN, Kvist M, Vieno T, Jarvinen TAH, Natri A, and Jarvinen M. Free mobilization and low-to-high-intensity exercise in immobilization-induced muscle atrophy// J Appl Physiol.- 1998.-V. 84.N 4.P. 1418-1424

92. Karpati G, Eisen Aa, And Carpenter S. Subtypes of the histochemical type I muscle fibers// J Histochem Cytochem.- 1975.-V. 23.P. 89- 91

93. Khan MA. The histoenzymology of striated muscle fibres: an over-view// Cell Mol Biol.- 1977.-V. 22.P. 383- 393

94. Kindwall E.P. Hyperbaric Medicine Practice// Arizona:best.- 1995.- V.28. №365. P.20-27

95. Kischel P, Bastide B, Stevens L, and Mounier Y. Expression and functional behavior of troponin С in soleus muscle fibers of rat after hindlimb unloading// J Appl Physiol.- 2001.-V. 90.P. 1095-1101

96. Kischel P, Stevens L, and Mounier Y. Differential effects of bepridil on functional properties of troponin С in slow and fast skeletal muscles// Br J Pharmacol.- 1999.-V. 128.P. 767-773

97. Kischel P, Stevens L, Montel V, Picquet F, and Mounier Y. Plasticity of monkey triceps muscle fibers in microgravity conditions// J Appl Physiol.-2001.-V.90.P. 1825-1832

98. Knight D.R.,Schaffartzik W.,Poole D.C.,Hogan M.C.,Bebout D.E.,Wagner P.D. Effects of hyperoxia on maximal leg O2 supplay and utilization in men//J.Appl.Physiol.-1993.-Vo.76.-No 6.-P.2586-2594

99. Krogh A. The number and distribution of capillaries in muscles with calculations of the oxygen pressure head necessary for supplying the tissue J.Physiol.(London).- 1919.-V.52.P.409-415

100. Krtiger P. and Giinther PG. Das "sarkoplasmatische Reticulum" in den quergestreiften Muskelfasern der Wirbeltiere und des Menschen// Acta Anat.1956.-V. 28.P. 135- 149

101. Kruger P. Die Innervation phasisch bzw. tonisch reagierender Muskeln von S" augetieren und des Menschen//Acta Anat.- 1960.-V 40.P. 186- 210

102. Kruger P. Uber Fasern mit Fibrillenstruktur und Fasern mit Felderstruktur in den quergestreiften Skeletmuskeln der Wirbeltiere und des Menschen// Verh Anat Ges.- 1951 .-V. 49.P. 65- 69

103. Kumar A., Ghaudhry I., Reid M.B., Boriek A. Distinct signaling pathways are activated in response to mechanical stress applied axially and transversely to skeletal muscle fibers// J.Biological chemistry.-2002.- V.48. P. 4649346503

104. Larsson L and Moss RL. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles// J Physiol (Lond| -1993.- K472.P. 595-614,

105. Larsson L., Li X, Berg H.E., Frontera W.R. Effects of removal of weight-bearing function on contractility and myosin isoform composition in single human skeletal muscle cells// Pflugers Arh.- 1996.-V. 432. № 2.P. 320-328.

106. Layne CS, Mulavara AP, McDonald PV, Kozlovskaya IB, Bloomberg JJ Theuse of in-flight foot pressure as a countermeasure to neuromuscular degradation//Acta Astronaut.- 1998.-V. 42(1-8) .P. 231-246

107. Leeuw T, and Pette D. Coordinated changes in the expression of troponin subunit and myosin heavy-chain isoforms during fast-to-slow transition of low-frequency-stimulated rabbit muscle// Eur J Biochem.- 1993.-V.213.P. 1039-1046

108. Leterme D, Cordonnier C, Mounier Y, Falempin M. Influence of chronic stretching upon rat soleus muscle during non-weight-bearing conditions// Pflugers Arch.- 1994,- V.429.P. 274-279

109. Levy AP, Levy NS, Wegner S, and Goldberg MA. Transcriptional regulation of rat vascular endothelial growth factor gene by hypoxia// J.Biol. Chem.-1995,- V.270, P.13333-13340

110. Lind A And Kernell D. Myofibrillar ATPase histochemistry of rat skeletal muscles: a "two-dimensional" quantitative approach// J Histochem Cytochem.-1991 .-V.39.P. 589- 597

111. Lloyd P.G., Yang H.T., and Terjung R.L. Arteriogenesis and angiogenesis in rat ischemic hindlimb: role of nitric oxide// Am.J.Physiol. Heart Circ Physiol.-2001.-V.281 .P. H2528-H2538

112. Lojda Z, Gossrau R, and Schiebler T Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual// Heidelberg: Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg. New York, 1979. P. 1-270

113. Londraville R.L., Sidell B.D. Maximal diffusion-distance within skeletal muscle can be estimated from mitochondrial distributions//Resp.Physiology.-1990,- V.81.- No.3.- P.291-301

114. Loughna P.T., Morgan M.G. Passive stretch modulates denervation induced alterations in skeletal muscle myosin heavy chain mRNA levels// Pflugers

115. Arch. -1999.-V.439.P. 52-55.

116. Lucas CA, Rughani A, and Hoh JF. Expression of extraocular myosin heavy chain in rabbit laryngeal muscle// J Muscle Res Cell Motil.- 1995.-V. 16.P. 368-378,

117. MacDougall J.D.,Green H.J.,Sutton J.R.et.al.Operation Everest II: structural adaptations in skeletal muscle in response to extreme simulated altitude//Acta Physiol.Scand.- 1991 .-V. 141. N 2.P.421-427

118. Martin TP, Vailas AC, Duravage JB Quantitative histochemical determination of muscle enzymes: biochemical verification//J Histochem Cytochem.- 1985.-V.10.P. 1053-1059

119. Martin W. Berchtold, Heinrich Brinkmeier, And Markus Muntener. Calcium Ion in Skeletal Muscle: Its Crucial Role for Muscle Function, Plasticity, and Disease// Physiological reviews.- 2000.-V. 80. No. 3

120. Martin W.H.III,Coggan A.R.,Spina R.J. and Saffitz J.E.Effects of fiber type and training on adrenoreceptor density in human skeletal muscle//

121. Am.J.Physiol.- 1989,- V.257. No5Ptl. P.E736-E742

122. Martin WD, and Romond EH. Effects of chronic rotation and hypergravity on muscle fibers of soleus and plantaris muscles of the га// Exp Neurol.- 1975.-V.49. P. 758-771

123. Martin WD. Effects of chronic centrifugation on skeletal muscle fibers in young developing rats// Aviat Space Environ Med.- 1980.-V.51.P. 473-479

124. Masao M.,Carsten J.,Bro-Rasmussen T.,Mygind E.,Schibye B.,Rasmussen В., and Saltin В.Limb skeletal muscle adaptation in atlhetes after training at altitude//J.Appl. Physiol.- 1990.-V.68, N2.P.496-502

125. Mathien-Costello 0.,Pool D.C.and Logemann R.B. Muscle fiber size and chronic exposure to hypoxiaio In:Oxigen transport to tissue // XI.Adv.Exp.1. Med. Biol.- 1989.-P.248,

126. McAllister R.M.,Ogilvie R.W., Terjung R.L. Impect of reduced cytochrome с oxidase activity on peak oxygen consamption of muscle// J. Appl.Physiol.- 1990,- V.69. N 1. P.384-389

127. McGuire BJ, and Secomb TW. A theoretical model for oxygen transport in skeletal muscle under conditions of high oxygen demand// J.Appl.Physiol.-2001,- V.91. P.2255-2265

128. Mizuno M.,Juel C.,Bro-Rasmussen Т. et al. Limb skeletal muscle adaptation in athletes after training at altitude//J.Appl.Physiol.- 1990.-V.68,N 2,- P.496-502

129. Milner D.J., Mavroidis M., Weisleder N., Capetanaki Y. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function// J.Cell Biol.-2000.-V.150. № 6.P.1283-1297

130. Moran MM, Stein TP, and Wade CE. Hormonal modulation of food intake in response to low leptin levels induced by hypergravity// Exp Biol Med.- 2001 .V. 226.P. 74-74

131. Morey E.R. Space flight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness//Bioscience.- 1979 .-V. 29.P. 168-172.

132. Morgan MJ, and Loughna PT. Work overload induces changes in fast and slow skeletal muscle myosin heavy chain gene expression// FEBS Lett.-1989.-V. 255.P. 427-430

133. Mozdziak PE, Greaser ML, and Schultz E. Moyogenin, MyoD, and myosinexpression after pharmacologically and surgically induced hypertrophy// J Appl Physiol.- 1998.-V. 84.P. 1359-1364

134. Murakami Т., Shimomura Y., Yoshimura A., Sokabe M., Fujitsuka N. Induction of nuclear respiratory factor-1 expression by an acute bout ofф exercise in rat muscle// Biochim. Biophis. Acta.- 1998,- V.1381.№ 1.P.113122

135. Nemeth PM and Pette D. The limited correlation of myosin-based and metabolism-based classifications of skeletal muscle fibers// J Histochem Cytochem.- 1981.-V.29.P. 89-90

136. Nemirovskaya T, Krasnov I, Shenkman B, and Belozerova I. Morphologicalchanges in rat skeletal muscles after 19 day exposure to + 2G// J Gravit Physiol. 2001.-V. 8.P. 73-74

137. Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S. Effect of support stimulation on unloaded soleus in rat// Eur. J. Appl. Physiol.- 2002. -V.87.№ 2. P. 120-126.

138. Oganov V.S., Skuratova S.A., Murashko L.M., Shirvinskaya M.A., Szilagyi Т., Szoor A., Rapcak M., Tacacs O. Postflight changes in the composition and properties of contractile proteins of muscles// Biophysics. -1982 .-V.27. N l.P. 26-31.

139. Ohira M., Hanada H., Kawano F., Ishihara A., Nonaka I., Ohira Y. Regulation of the properties of rat hind limb muscles following gravitational unloading// Jap. J. Physiol.- 2002.-V. 52. № 3. P. 235-245.

140. Ohira Y. Effects of denervation and deafferentation on mass and enzymeactivity in rat skeletal muscles// Jap.J.Physiol. -1989 .-V.39. № 1. P. 21-31.

141. Ohira Y. Neuromuscular adaptation to microgravity environment// Jap. J. Physiol. -2000.-V. 50. № 3.P. 303-314.

142. Ohira Y., Yasui W., Roy, R.R., Edgerton V.R. Effects of muscle length on the response to unloading// Acta Anat.- 1997.-V. 159.P.90-98.

143. Ohira Y., Yoshinaga Т., Yasui W.,Ohara M., Tanaka T. Effects of hinglimb suspension with stretched or shortened muscle length on contractile properties of rat soleus//J. Appl. Biomechanics.- 2000.-V. 16.P. 80-87.

144. Ohira Y.,Wakatsuki T.,Endo N.,Nakamura K.,Asakura T.,Ikeda K.,Tomiyoshi T. and Nakajoh M.//Guanidino Compounds in Biology and Medicine, eds. by P.P.De Deyn, B.Marescau, V.Stalon and I.A.Qureshi. John Libbey & Company Ltd., 1992.P.175-179

145. Olfert ML, Breen PD„ Mathieu-Costello O., and Wagner PD. Chronic hypoxia attenuates resting and exercise-induced VEGF, fit-1, and flk-1 mRNA levels in skeletal muscle// J.Appl. Physiol.- 2001,- V.90.P 1531-1538

146. Ortiz RM, and Wade CE. Water balance in rats exposed to chronic centrifugation// J Appl Physiol.- 2000.-V. 89.P. 56-60

147. Pedersen P.K., Plet J. Increased endurance performance with hyperoxia in human.// Physiol.Sci.,Helsinki.- 1989,- Abstr.-P.438

148. Pedram A, Razandi M, Hu R-M, and Levin E. Vasoactive peptides modulate vascular endothelial cell growth factor production and endothelial cell proliferation and invasion//J.Biol. Chem.- 1997.-V.272. P.17097-17103

149. Pette D and Staron RS. Cellular and molecular diversities of mammalian skeletal muscle fibers// Rev Physiol Biochem Pharmacol.- 1990.-V. 116. P. 1-76

150. Pette D., Staron R.S. Transitions of muscle fiber phenotypic profiles//

151. Histochem. Cell Biol.- 2001 .-V.115. №5.P. 359-372.

152. Picquet F, Bouet V., Canu MH, Stevans L, Mounier Y,Lacour M, Falempin M. Contractile properties and myosin expression in rats born and reared in hypergravit//.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.- 2002-V.282.N 6.P.R1687-95

153. Pittman R.N. Influence of Microvascular Architecture on Oxygen Exchange in Skeletal Muscle// Microcirculation.- 1995.-V.2.-No.l.-P.l-18,

154. Ponticos M, Lu QL,Morgan JE, Hardie DG, and Patridge ТА. Dual regulation of the AMP-activated protein kinase provides a novel mechanism for the control of creatine kinase in skeletal muscle// EMBO J .- 1998.-V.17. P.1688-1699

155. Pool D.C.,Mathien-Costello O. Effects of hypoxia on capillary orientation in anterior tibialis muscle of hihly active miceg// Respir.Physiol.- 1990.-V.82.-N 1.-P.1-10

156. Poole D.C,Mathieu-Costello 0.,West J.В.Capillary tortuosity in rat soleus muscle is not affected by endurance training//Am.J.Physiol.- 1989.-V.256.N 4. P.H1110-1116

157. Preedy V.R.,Sugden P.H. The effects of fasting or hypoxia on rates of protein synthesis in vivo in subcellular fractions of heart and gastrocnemius muscle//Biochem.J. -1989.-V.257. P.519-527

158. Proske U. and Morgan D.L. Do cross-bridges contribute to the tension during stretch of passive muscle? //J. Muscle Res. Cell Mot. .- 1999.-V.20.P. 433442.

159. Radegran G., Calbet J.A. Role of adenosine in exercise-induced human skeletal muscle vasodilatation// Acta Physiol Scand.- , 2001 .-VI71. P. 177185

160. Ranvier L. Proprietes et structures differentes des muscles rouges et des muscles blancs chez les lapins et chez les raies// С R Acad Sci Paris.- 1873.-V. 77.P. 1030- 1034

161. Rasmussen U.F.,Rasmussen H.N.,Krustrup P.,Quistorff B.,Saltin B.,Bangsbo J. Aerobic metabolism of human quadriceps muscle: in vivo data parallel measurements on isolated mitochondria// Am.J.Physiol.Endocrinol Metab.-2001 .-V280.P.E301 -E307

162. Rennie M.J., How muscles know how to adapt// J.Physiol.- 2001.-V.535.№1 .P.l-1

163. Richardson RS, Wagner H, Mudaliar SRD, Henry R, Noyszewski EA, and Wagner PD. Human VEGF gene expression in skeletal muscle: effect of acute normoxic and hypoxic exercise// Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol.- 1999.-V.277. P.H2247-H2252

164. Rivero JL, Talmadge RJ, And Edgerton VR. Interrelationships of myofibrillar ATPase activity and metabolic properties of myosin heavy chain-based fibre types in rat skeletal muscle^ //Histochem Cell Biol.- 1999.-V. 11 l.P. 277- 287

165. Rowlerson A, Heizmann Cw, And Jenny E. Type-specific proteins of single IIM fibres from cat muscle// Biochem Biophys Res Commun. 1983.-V. 113.P. 519- 525

166. Rowlerson A, Pope P, Murray J, Whalen RG, And Weeds AG. A novel myosin present in cat jaw-closing muscles// J Muscle Res Cell Motil.- 1981.-V 2.P. 415- 438

167. Roy RR, Baldwin KM, Martin TP, Chimarusti SP, and Edgerton VR. Biochemical and physiological changes in overloaded rat fast- and slow-twitch ankle extensors// J Appl Physiol.- 1985.-V.59.- 639-646

168. Roy RR, Meadows ID, Baldwin KM, And Edgerton VR. Functional significance of compensatory overloaded rat fast muscle// J Appl Physiol.-1982.-V. 52.P. 473-478

169. Roy RR, Roy ME, Talmadge RJ, Mendosa R, Grindeland RE, and Vasques M. Size and myosin heavy chain profiles of rat hindlimb extensor muscle fibers after 2 weeks at 2G// Aviat Space Environ Med.- 1996.-V. 67. P. 854858

170. Saks V.A., Ventura-Clapier R., Aliev M.K. Metabolik control and metabolik capacity: two aspects of creatine kinase functioning in the cells//Bioch.Biophis.Acta.-1996.-V.1274.P.81-88

171. Sant'ana Pereira J, Ennion S, Sargeant Aj, Moorman Af, And Goldspink G. Comparison of the molecular, antigenic and ATPase determinants of fast myosin heavy chains in rat and human: a single-fibre study// Pflugers Arch.-1997.- К435. P. 151- 163

172. Schachat FH, Diamond MS, and Brandt PW. Effect of different Troponin T tropomyosin combinations on thin filament activation// J Molec Biol.- 1987.-V.198.P. 551-554

173. Schiaffino S, Gorza L, Sartore S, Saggin L, Ausoni S, Vianello M, Gundersen K, And L0mo T. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres// J Muscle Res Cell Motil.- 1989.-V.10.P. 197- 205

174. Schiaffino S, Saggin L, Viel A, And Gorza L. Differentiation of fibre types in rat skeletal muscle visualized with monoclonal antimyosin antibodies// J Muscle Res Cell Motil.- 1985.-V 6.P. 60- 61

175. Schiaffino S., Murgia M., Serrano A.L.,Calabria E.,Pallafacchina G. How is muscle phenotype controlled by nerve activity? //Ital.J.Neurol.Sci.1999 .-V.20.P.409-412

176. Schwerzmann K, Hoppeler H, Kayar SR, Weibel ER Oxidative capacity of muscle and mitochondria: correlation of physiological, biochemical and morphometric characteristics// Proc Natl Acad Sci USA.- 1989.V.86. P. 1583-1

177. Semenza GL and Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietine gene enhancer at a site required for transcriptional activation// Mol Cell Biol.- 1992,- V.12. P.5447-5454

178. Shenkman B.S., Kozlovskaya I.В., Nemirovskaya T.L., Cheglova I.A. Human muscle atrophy in supportlessness: Effects of short-term exposure to dry immersion//J.Gravitat Physiol.- 1997 .-V. 4. № 2.P. P137-P.138.

179. Shenkman B.S., Lee P., Belozerova I.N., Nemirovskaya T.L. Structural and metabolic characteristics of rhesus monkey m.soleus after space flight// J.Gravitat Physiol.- 2000,- V.7. № l.P. 39-42.

180. Sillau A.H. and Banchero N. Visualisation of capillaries in skeletal muscle

181. ATP-ase reaction.Pfluger Arch.-1977.-V.369.P.269-71.

182. Sjogaard G.Capillary supply and cross-sectional area of slow and fast-twitch muscle fibres in man// Histochemistry.- 1982.-V.76. N 4. P.547-555

183. Sjostrdm M, Kidman S, Larsen KH, And Angquist KA. Z- and M-band appearance in different histochemically defined types of human skeletal muscle fibers// J Histochem Cytochem.- 1982.-V. 30.P. 1- 11

184. Skorjanc D, and Pette D. Kinetic versus endpoint measurement for quantitative histochemical determination of enzyme activity in muscle fibers//J Histochem Cytochem.- 1998.-V. 46. № 2. P. 275-276

185. Smerdu V, Karsch-Mizrachi I, Campione M, Leinwand L, And Schiaffino S. Type IIx myosin heavy chain transcripts are expressed in type lib fibers of human skeletal muscle// Am J Physiol Cell Physiol.- 1994.-V. 267.P. С1723-C1728

186. Snyder G.Capillary growth and diffusion distances in muscle// Сотр. Biochem. Physiol. A.- 1987,- V.87. N 4 .- P.859-861

187. Snyder G.K, Farrelly C., Coelho J.R. Adaptations in skeletal muscle capillarity following changes in oxygen supply and changes in oxygen demands//Eur.J. Appl.Physiol.- 1992.-V.65.N.2.P.158-163

188. Sommerkamp H. Das Substrat der DauerverkYrzung amFroschmuskel// Naunyn-Schmiedeberg's Arch Exp Pathol Pharmakol.- 1928.-V.128. P.99-115

189. Sousi В., Idstrom J.-P.,Schersten T. Kinetic Parameters of cytochrom с oxidase in rat skeletal muscle: effect of endurance training. Acta Physiol. Scand.-1989.-V. 135.-p.373-379

190. Spurway N. Interrelationship between myosin-based and metabolism-based classifications of skeletal muscle fibers// J HistochemCytochem.- 1981.-V.29.Р. 87- 90

191. Staron RS And Hikida RS. Histochemical, biochemical, and ultrastructural analyses of single human muscle fibers, with special reference to the C-fiber population//J Histochem Cytochem.- 1992.-V. 40.P. 563- 568

192. Staron RS And Pette D. Correlation between myofibrillar ATP-ase activity and myosin heavy chain composition in rabbit musclefibers// Histochemistry.-1986.-V. 86.P.19- 23

193. Staron RS, Kraemer WJ, Hikida RS, Fry Ac, Murray JD, And Campos GE. Fiber type composition of four hindlimb musclesof adult Fisher 344 rats// Histochem Cell Biol.- 1999.-V. 111.P. 117- 123,

194. Stauber WT, Miller GR, and Grimmett JG. Adaptation of rat gastrocnemius muscles to 2 weeks of centrifugation : myofibers and extracellular matrix// Aviat Space Environ Med.- 1998.-V. 69.№ 6.P. A45-48

195. Stephens T.G., Chen Z.-P., Canny B.J., Michell B.J., Kemp B.E., McConell G.K. Progressive increase in human skeletal muscle AMPKa2 activity and ACC phosphorilation during exercise// Am.J.Physiol.-2002.-V.282.P.E688-E694

196. Stephenson DG, and Williams DA. Calcium-activated force responses in fast-and slow-twitch skinned muscle fibers of the rat at different temperatures// J Physiol.-1981.-V. 317.P.281-302

197. Stephenson DG, Lamb GG, And Stephenson GM. Events ofthe excitation-contraction-relaxation (E-C-R) cycle in fast- and slow-twitch mammalian muscle fibres relevant to muscle fatigue// Acta Physiol Scand.- 1998.- V. 162. P. 229- 245

198. Stevens L, Bastide B, Kischel P, Pette D, and Mounier Y. Time-dependent changes in expression of troponin subunit isoforms in unloaded rat soleusmuscle// Am. J. Physiol.- 2002.-V.282.P.C1025-1030

199. Stevens L, Gohlsch B, Mounier Y, and Pette D. Changes in myosin heavy chain mRNA and protein isoforms in single fibers of unloaded rat soleus muscle// FEBS Lett.- 1999.- V.463. 15-18

200. Stevens L, Mounier Y, and Holy X. Functional adaptation of different rat skeletal muscles to weightlessness// Am J Physiol.- 1993.-V.264.P. R770-776

201. Stevens L, Mounier Y, Holy X, and Falempin M. Contractile properties of rat soleus muscle after 15 days hindlimb suspension// J Appl Physiol.- 1990.-V.68. P. 334-340

202. Stevens L, Sultan KR, Peuker H, Gohlsch B, Mounier Y, and Pette D. Time-dependent changes in myosin heavy chain mRNA and protein isoforms in unloaded soleus muscle of rat// Am J Physiol.- 1999.-V.277. P. C1044-1049

203. Stevens L.,Mounnier Y. and Holy X. Functional adaptation of different rat skeletal muscles to weightlessness// Am. J.Physiol.- 1993.-V.264. N.33.P.R770-R776

204. Stump CS, Overton JM, and Tipton CM. Influence of single hindlimb support during simulated weightlessness in the rat// J Appl Physiol.- 1990.-V. 68 № 2.P. 627-634

205. Sutton J.R. V02max new concepts on an old theme//Med.Sci.Sport. Exerc.-1992,-V.24.No.l. P.26-29

206. Takagi A, and Endo M. Guinea pig soleus and extensor digitorum longus : a study of single-skinned fibers// Exp Neurol.- 1977.-V. 55. P. 95-101

207. Takekura H. and Yoshioka T. Ultrastructural and Metabolic Profiles on Single Muscle Fibers of Different Types after Hindlimb Suspension in rats// Jap.J.Physiol.- 1989.-V.39.P. 385-396

208. Talmadge R.J., Roy R.R., Edgerton V.R. Distribution of myosin heavy chainisoforms in non-weight-bearing rat soleus muscle fibers// J.Appl.Physiol. -1996.-V.81. № 6.P. 2540-2546.

209. Talmadge RJ, Roy RR, Chalmers GR and Edgerton VR. MHC and sarcoplasmic reticulum protein isoforms in functionally overloaded cat plantaris muscle fibers// J Appl Physiol.- 1996.-V. 80. P. 1296-1303

210. Tanaka Т., Ohira Y., Danda M., Hatta H., Nishi I. Impruved fatigue resistance not associated with maximum oxygen consumption in creatine-depleted rats// J.Appl.Physiol.- 1997,- V.82. № 6. P.1911-1917

211. Tavakol M, Roy RR, Kim JA, Zhong H, Hodgson JA, Hoban-Higgins TM, Fuller CA, and Edgerton VR. Fiber size, type, and myosin heavy chain content in rhesus hindlimb muscles after 2 weeks at 2G// Aviat Space Environ Med.- 2002.-V. 73. P. 551-557

212. Terrados N. Altitude training and muscular metabolism// Int.J.Sport Med.-1992.-V. 13.Suppl. 1 P.S206-209

213. Terrados N.,Melichna J.,Sylven C.et.al.Effects of training at simulated altitude on performance and muscle metabolic capacity in competitive road cyclists//Eur.J.Appl.Physiol.-, 1988,- V.57.P.203-209

214. Thomason D.B., Booth F.W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting// J.Appl.Physiol.- 1990.-V.68. № 1. P. 1-12.

215. Tsika RW, Herrick RE, and Baldwin KM. Interaction of compensatory overload and hindlimb suspension on myosin isoform expression// J Appl Physiol.- 1987.-V. 62. P. 2180-2186

216. Uhlig Y, Weber Br, Grob D, And Miintener M. Fiber compositionand fiber transformations in neck muscles of patients withdysfunction of the cervical spine// J Orthop Res.- 1995.-V. 13. P. 240- 249

217. Vandenburgh H.H. Mechanical forces and their second messengers instimulating cell growth in vitro// Am.J.Physiol.- 1992.-V.262. № 31.P.R350-R355

218. Vandenburgh H.H.Motion into mass: How does tension stimulate muscle growth? Med.Sci.Sports Exerc.,Vol.l9.-N5(Suppl.)-P.S142-S149, 1987

219. Vasques M,Lang C,Grindeland RE,Roy RR, Daunton N, Bigbec AJ, Wade CE. Comparison of fiber- and microgravity on rat muscle, organ weights and selected plasma constituents// Aviat.Space Environ. Med. -1998.-V.69. № 6. P.A2-8

220. Veksler V, Kuznetsov A, Sharov V, Kapelko V, Saks V. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment using saponin-skinned fibers// Biochim.Biophys.Acta.- 1987,- V.892. P. 191-196

221. Vogt M, Puntschart A, Geiser J, Zuleger C, Billeter R, and HoppelerH. Molecular adaptations in human skeletal muscle to endurance training under simulated hypoxic conditions// J.Appl. Physiol.- 2001 .- V.91. P. 173-182

222. Wackerhage H.,Woods N.M. Exercise-induced signal transduction and gene regulation in skeletal muscle// J.Sports Sci and Medicine.- 2002.-V.1. P. 103114

223. Wade R, Sutherland C, Gahlmann R, Kedes L, Hardemane, And Gunning P. Regulation of contractile protein gene familym RNA pool sizes during myogenesis// Dev Biol.- 1990.-V. 142. P. 270- 282

224. Wakatsuki T.,Ohira Y.,Yasui W.,Nakamura K.,Asakura T.,Ohno H., and Yamamoto M. Responses of contractile properties in Rat Soleus to High-Energy Phosphates and/or Anloading// Japanese J.Physiol.- 1994.-V.44. P. 193-204

225. Walsh В., Tonkonogi M., Soderlund K., Hultman E., Saks V., and Salin K. The role of phosphorylcreatine and creatine in the regulation of mitochondrialrespiration in human skeletal muscle. J.Physiol.- 2001,- V537. № 3, P. 971978

226. Warren E, Horwitz В A, and Fuller, CA. Gravity and body mass regulation// J Gravitational Physiol.- 1997. V.4. P. 89-92.

227. Weber BR, Grob D, Dvorak J, And Muiintener M. Posteriorsurgical approach to the lumbar spine and its effect on the multi-fidusmuscle. Spine. In press.

228. Weber Br, Uhlig Y, Grob D, Dvorak J, And Miintener M. Duration of pain and muscular adaptations in patients with dys-functionof the cervical spine// J OrthopRes.- 1993.-V. 11. P. 805- 810

229. Weibel E.R.,Taylor C.R.and Hoppeler H. Variations in function and design: Testing symmorphosisin the respiratory system//Resp.Physiol.-1992,-V.87.P.325-348

230. Wenger RH and Gassmann M. Oxygen(es)and the hypoxia-inducible factor-1// Biol. Chem.- 1997,-V.378.P. 609-616

231. Widegren U., Ryder J.W., Zierath J.R. Mitogen-activated protein kinase signal transduction in skeletal muscle: effects of exercise and muscle contraction// Acta Physiol. Scand.- 2001.- V.172.P.227-238

232. Wieczorek Df, Periasamy M, Butler-Browne Gs, Whalen Rg, And Nadal-Ginard B. Co-expression of multiplemyosin heavy chain genes, in addition to a tissue-specific one, in extraocular musculature// J Cell Biol.- 1985.-V. 101. P. 618- 629

233. Wiesner RJ, Adaptation of motochondrial gene expression to changingcellular energy demands// News Physiol. Sci.- 1997.- V.12. P. 178-184

234. Williams R.S.,Caron M.G. and Daniel K.Skeletal muscle-adrenergic receptors: variations due to fiber type and training// Am.J.Physiol.- 1984.-V.246. P.E160-E167

235. Winger W.W. Energy-sensing and signaling by AMP-activated protein kinase in skeletal muscle//J.Appl.Physiol.-2001.-V.91.P. 1017-1028

236. Winder W.W.,Holmes B.F., Rubink D.S.,Jensen E.B.,Chen M., and Holloszy J.O. Activation of AMP-activated protein kinase increases mitochondrial enzymes in skeletal muscle// J.Appl.Physiol.- 2000 .- V.88. P.2219-2226

237. Wretman C., Lionikas A., Widegren U., Lannergren J., Westerblad H., Henriksson J. Effects of concentric and eccentric contractions on phosphorylation of MAPKerkl/2 and MAPKp38 in isolated rat skeletal muscle// J.Physiol.- 2001,-V535.№ 1. P.155-164

238. Yajid F, Mercier JG, Mercier BM, Dubouchaud H, and Prefaut С (1998) Effects of 4 wk of hindlimb suspension on skeletal muscle mitochondrial respiration in rats. J Appl Physiol.-2002.-V. 84. № 2. P. 479-485

239. Zhou M.-Y., Klitgaard H., Saltin В., Roy R.R., Edgerton V.R., Gollnick P.D. Myosin heavy chain isoforms of human muscle after short-term spaceflight// J.Appl.Physiol.- 1995.-V. 78. № 5.P. 1740-1744

240. Ziada A.,Hudlicka O.,Tyler K. and Wright A.The effect of long-term vasodilatation on capillary growth and performance in rab-bit heart and skeletal muscle// Cardiovasc.Res.- 1984,- V.18. P. 724-732

241. Выявление быстрых МНС Выявление медленных МНС1. быстрое волокно, 2,3-медленно сокращающиеся волокна1. Бег крыс на тредбане

242. ЦЕНТРИФУГА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

243. Позитивная окраска для МПС типа Па; 2. Позитивная окраска для МНС типа I; 3. Позитивная окраска для МНС I и Пав1. ШЯЁНЙ№3, Л ■ , * 4л я

Информация о работе

Немировская, Татьяна Леонидовна
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.13

Диссертация

Системные и клеточные механизмы пластичности скелетных мышц при различных режимах их сократительной активности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы