Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Систематика и география видов рода Rosa L. sect. Gallicanae DC.

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Систематика и география видов рода Rosa L. sect. Gallicanae DC."

На правах рукописи

Федорова (Вагина) Алина Викторовна

Систематика и география видов рода Rosa L. секц. Gallicanae DC.

03.02.01 - ботаника

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2014 0 3 АПР 2014

005546648

005546648

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН).

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Шанцер Иван Алексеевич

Официальные оппоненты: Кочиева Елена Зауровна

доктор биологических наук, профессор. Центр «Биоинженерия» РАН, лаборатория генетической инженерии

Крамина Татьяна Евгеньевна

кандидат биологических наук. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра высших растений

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук (БИН РАН)

Защита диссертации состоится 29 мая 2014 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.028.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4.

Факс/тел.: (499) 977-91-72.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4.

Автореферат диссертации разослан-? ^ г. и размещён на сайтах

ГБС РАН www.gbsad.ru и ВАК http://vak2.ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного Совета

доктор биологических наук

Ю.К. Виноградова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Род Rosa L. всегда находился под пристальным вниманием людей и особенно систематиков. Повышенный интерес к этому роду объясняется исключительными декоративными качествами роз, благодаря которым по обилию и продолжительности цветения, по тонкости аромата, изысканности и богатейшей палитре оттенков и красок с розами никто не может соперничать в декоративном садоводстве. Цветки роз изумительно разнообразны по форме и удивительно красивы. Многие виды дикорастущих роз (шиповника) успешно используются в качестве подвоя, при сооружении живых изгородей, для декорирования беседок, арок и т.п. Эти растения, обладая ярко выраженными фармакологическими свойствами, используются, как сырье в пищевой, косметической и фармакологической промышленности. Существует огромное количество культурных сортов роз. Родоначальником многих из них является центральный вид секц. Gallicanae DC. К galilea L. Так, например, от R. gallica произошли дамасские, центифольные, галлийские розы и розы Альба. Все они относятся к группе старых садовых роз. Секция Gallicanae, как и весь род Rosa, все еще плохо изучена в систематическом отношении, и среди ботаников нет устоявшейся точки зрения на общее число видов. По данным отечественных родологов секция Gallicanae включает в себя от 1 до 14 дикорастущих видов для территории Восточной Европы (Юзепчук, 1941; Хржановский, 1958; Дубовик, 1987; Бузу нова, 2001), в то время когда зарубежными ботаниками в рамках этой секции признается лишь один дикорастущий вид R. gallica L., остальные же считаются продуктами гибридизации его с другими видами (Klástersky, 1968; Wissemann, 2003).

Отдельную проблему представляет наличие карликовых форм в секции Caninae DC. Некоторые исследователи рода Rosa относят к этой секции виды с карликовой формой роста, столь характерной для секции Gallicanae, предполагая, что такая форма роста возникала неоднократно в процессе эволюции как приспособление к неблагоприятным условиям обитания (Дубовик, 1973). Значительный вклад в разрешение таксономических трудностей в секции Gallicanae может внести использование не только данных морфологии, но и молекулярно- генетических данных, а также изучение природных популяций шиповников, которому уделяется мало внимания со стороны родологов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является установление видового состава Rosa L. секции Gallicanae, определение секционной принадлежности, родственных связей и вероятного происхождения карликовых шиповников юга Восточной Европы, а также выявление и оценка частоты и генетических последствий гибридизации у шиповников в естественных популяциях.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменчивость морфологических признаков у R. gallica, карликовых шиповников дискуссионной таксономической принадлежности и встречающихся совместно с ними в природе видов секции Caninae.

2. Изучить генетический полиморфизм исследуемых видов методом фрагментного анализа межмикросателлитных (ISSR, Inter Simple Sequence Repeats) участков ДНК.

3. Выявить высоковариабельные участки хлоропластной ДНК и установить их генеалогические связи у исследуемых видов.

4. Сопоставить результаты анализа изменчивости морфологических признаков и молекулярно-генетических маркеров и на их основе сделать предположения о степени родства и происхождении исследуемых видов.

5. Изучить характер гибридизационных процессов и их последствия в нескольких локальных популяциях, в которых присутствуют представители исследуемых видов.

6. Экспериментально изучить системы размножения исследуемых видов.

Научная новизна работы. Впервые проведено специальное исследование секции Gallicanae. Впервые изучена популяционная структура R. gallica и других карликовых шиповников морфометрическими и молекулярно-генетическими методами. Установлено, что карликовые виды шиповников, растущие на юге Восточной Европы, не близкородственны R. gallica, а представлены, в большинстве своем, различными гибридами между видами секции Caninae. Установлено гибридное происхождение R. oskolensis Buzunova & Grigorj. и целого ряда форм, традиционно признаваемых в качестве самостоятельных видов секции Caninae. Впервые получены и депонированы в ГенБанк нуклеотидные последовательности хлоропластного межгенного спейсера trnV-ndhC ряда восточноевропейских представителей рода Rosa (секц. Gallicanae, секц. Caninae). Впервые получены экспериментальные данные о системах размножения восточноевропейских представителей рода Rosa, установлено, что апомиктическое завязывание семян характерно только для R rubiginosa, в то время как остальные виды размножаются преимущественно путем перекрестного или самоопыления.

Практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть использованы при написании «флор», при составлении ключей для определения видов шиповников, а также при разработке курсов для студентов биологических вузов по теории эволюции генетике. Полученные данные, а также отработанные в ходе выполнения работы методики могут быть использованы для расшифровки происхождения культивируемых сортов роз, а также для их селекции.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международной конференции «Systematics 2008» в Гетгингене (Германия) в 2008 г.; 6-м Совещании

«Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» (Санкт- Петербург) в 2009 г, на XII Московском совещании по филогении растений, посвященном 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана в 2010 г., на ежегодных конкурсах научно-исследовательских работ молодых ученых ГБС РАН в 2010 и 2011 гг., на конференции памяти проф. А. К. Скворцова в 2010 г., на семинарах лаборатории Гербарий ГБС РАН (2008-2010 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, и 5 статей в сборниках и материалах конференций.

Сгруюура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (включающего 78 источника, в том числе 48 на иностранных языках), 2 приложений. Работа изложена на 127 страницах, иллюстрирована 10 таблицами, 2 картами и 56 рисунками.

Основное содержание работы

ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ROSA GALLICA L. И БЛИЗКИХ

К НЕЙ ВИДОВ.

В главе рассмотрены история изучения R. gallica и карликовых шиповников секций Caninae и Gallicanae, а также вопросы происхождения секц. Gallicanae и явления карликовости у роз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были исследованы восточноевропейские виды рода Rosa, в современных таксономических обработках относящиеся к секциям Gallicanae и Caninae. Растительный материал для исследования был собран в период с 2008 по 2010 гг. с территорий Украины и Белгородской области. Большинство исследованных растений были гербаризированны в фазе цветения и в фазе плодоношения и сфотографированы для сравнения прижизненных морфологических признаков (таких, как цвет лепестков, размеры и форма куста и др.) цифровым фотоаппаратом. Всего в анализ были включены 210 растений, вошедшие в 4 популяционные выборки и 1 объединенную таксономическую выборку. В состав объединенной таксономической выборки вошли 11 образцов Rosa gallica из Греции, хранящихся в гербарии Берлин-Далема (В), 5 образцов Rosa gallica из Румынии (Romania, Cluj County), собранных Dr. L. Bartha и 5 образцов Rosa gallica с территории Венгрии (Hungary, Zala, Nograd), любезно предоставленных Mr. V. Kerény-Nagy.

Морфологические признаки. В анализе были использованы 14 признаков, традиционно используемых в систематике роз. Морфологические признаки изучались визуально и с помощью бинокуляра МБС-10.

Гибридизационные эксперименты проводились непосредственно в поле в начале июня 2008 г. в Белгородской области и 2009 г. в Крыму перед

началом массового цветения шиповников, по методике, предложенной Wissemann и Hellwig (1997).

Выделение ДНК. Тотальная ДНК из листьев, высушенных в силикагеле, была получена с использованием двух методов: стандартного метода выделения ДНК с применением цетилтриметил аммоний бромида (СТАВ) [Doyle, Doyle, 1987] или с помощью набора для экстракции растительной ДНК Nucleospin Plant Extraction Kit (Macherey-Nagel, Германия).

Молекулярные маркеры, параметры ПЦР. Для выявления уровня внутри и межвидового полиморфизма шиповников был использован фрагментный анализ межмикросателлитных участков ДНК (Inter Simple Sequence Repeats, ISSR). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с 10 праймерами производства ЗАО Синтол (Россия) в амплификаторе MJ Research РТС-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) Условия ПЦР: предварительная денатурация 95°С - 3 мин; 35 циклов: денатурация при 94°С - 30 с, отжиг при соответствующей температуре - 30 с, элонгация при 72°С - 40 с + прибавление 2 с на каждый цикл, заключительная элонгация в течении 4 минут. Для амплификации потенциально высоковариабельных некодирующих участков хлоропластного генома trnL-trnF, rpl32-trnL, trnQ-5'rpsl6, 3'trnV-ndhC, ndhF-rpl32, psbD-trnT, trnH-psbA, rpoB-trnC, trnD-trnT (Taberlet et al., 1991; Shaw et al., 2005; Shaw et al., 2007) использовали праймеры и условия ПЦР, приведенные в статьях указанных авторов.

Визуализация продуктов амплификации и секвенирование. Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1,7% агарозном (Amresco) геле в 0,5-кратном трис-боратном буфере с окрашиванием бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 125 в течение 50 минут в горизонтальной камере Sub- Cell® Model 192(Bio-rad) и фотографировали с помощью системы гель-документирования GelDoc-It® Imaging System (США). Очистка ПЦР-продукта для секвенирования осуществлялась переосаждением в смеси ацетата аммония с этанолом. Постановка сиквенсной реакции осуществлялась с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1. (Applied Biosystems, США) согласно протоколу производителя. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems) на базе ЦКП «Геном» (ИМБ РАН), ЗАО Синтол и

кабинета молекулярных методов анализа ИПЭЭ РАН.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи компьютерных программ Statistica 6.0, Structure 2.2, NewHybrids, SplitsTree4.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Морфологическая изменчивость карликовых шиповников и

R. gallica

Результаты дисперсионного анализа 4 количественных морфологических признаков (длина цветоножки, длина и ширина концевого листочка и общая высота растения) указывают на достоверное (р<0,05) разделение групп. Однако тест Тьюки для неравных групп выявил, что по этим признакам ото всех остальных образцов отличаются только образцы R. gallica. Поэтому в дальнейшем для анализа были использованы только качественные признаки, традиционно используемые для диагностики входящих в состав выборки видов Rosa.

Эти признаки были предварительно протестированы в программе Statistica 6.0. методом построения пиктограмм. Результаты данного анализа представлены на звездчатой пиктограмме (рис.1). Пиктограммы позволяют визуально разделить выборку на 10 групп, которые соответствуют видам, определяемым по морфологическим признакам. Внутри этих групп также происходит разделение на более мелкие группы, которые соответствуют популяционным выборкам.

Icon Plot (dwarís_morph.sta 17v"117c>

ч V- к к- к * к к к- к 4 v Jp

V V k ■Ir l \ \ Ш y y <u

L к У у к к к к к к к ■k

4 к к к к к к i k^ >

> k- V ¥ A- ¥ V Clockwise: конец ПСТ

к3\ \ A \ 4 i 5\ \ \ i i зубч края ftp. on. верх

К ¿ i i 6 A A i 7 < \ пр on низ жел on верх жеп on низ

жел цвтн

К \ ¥ "> - V $ коне стгщ рассей, чшл жел чшл

* 6 4 <v я 9 A 1 желгпнт шипы

Рисунок 1. Пиктограмма 81агР1о1 по качественным морфологическим признакам для карликовых шиповников: 1—7?. %аШса\ 2 — R. ^гоъъкехти', 3 — R. ]ипс12И1и\ 4 -R. о$ко1ет1$\ 5-7?. ратшзси1а\ 6 - R. роггесМет\ 7 - R. pygmaea^, 8 - й. ^йи^оха; 9 - R. зр. тс1е1; 10 - R. subpygmaea

Анализ полной выборки карликовых шиповников по морфологическим признакам методом главных координат (PCO) (дистанция Говера) в программе PAST позволяет частично разделить только образцы Rosa gallica, R. shistosa и R. porrectidens. Все остальные же образцы карликовых шиповников разделяются плохо» (не показано). Анализ морфологических признаков выборки образцов R. gallica дает четкое разделение образцов в соответствии с их популяционной приуроченностью (рис. 2). Отдельные облака образуют R. gallica из Греции, Крыма, Венгрии и Украины. Образцы R. gallica из двух точек сбора в Венгрии также хорошо отделены друг от друга. 3 образца из Румынии находятся в непосредственной близости облака образцов из Украины, еще два образца оттуда же попадают в это облако. Сходный результат дает и кластерный (UPGMA) анализ этой выборки.

$п + i + * О ++ 2 1

; 4Í+ + ■ ........................L............................ ...........„j*..... ...................................;.............................. X 5 о s

« ....... = ' .........^ ........^ .....О ...■. ... ... ОШ □ о

А* I f i о I 1 □

«И- : -• • ! í

Рисунок 2. Анализ главных координат по морфологическим признакам для всех исследуемых образцов R. gallica: 1 - NO (Nograd, Huhgary); 2 - GB (Greece); 3 -U (Узун- Сырт, Крым, Украина); 4 -Z (Zala, Hungary); 5 - R (Romania); 6 - LL-LV-LO-LB-LG (Львовская, Ивано-Франковская, Тернопольская области Украины).

3.2. Анализ молекулярных ISSR маркеров

Анализу по ISSR маркерам подверглись 90 образцов карликовых шиповников из 15 локальных популяций. В результате ПЦР с 6 различными праймерами (UBC840, UBC855, МЗ, М4, М12, М13) было получено 133 ISSR маркера, из которых 104 оказались информативными. Полученная бинарная

матрица была проанализирована в программе SplitsTree4 методом Neighbour Joining (рис.3).

Рисунок 3. Соотнесение результатов анализа молекулярных данных в программах 8рШзТгее4 и ТСБ (буквами обозначены гаплотипы КпУ-псИкС).

Образцы К gallica образовали отдельный кластер, удаленный от кластера, в который попали остальные виды карликовых шиповников. Стоит отметить, что большая часть карликовых шиповников (отмечены прямоугольником с крестом на рис. 3) имеет подтвержденный гибридный статус, выявленный в ходе наших исследований отдельно взятых популяций. Статус остальных карликовых шиповников, присутствовавших в данной анализе, не ясен, так как они не были подробно изучены в условиях локальных популяций. Эта же бинарная матрица была проанализирована в программе 8рШзТгее4 отдельно для 44 образцов К %аШса (рис. 4). Среди всех исследованных образцов, наиболее удаленными от остальных оказались образцы К gaШca из Греции (1). Все изученные образцы группируются в четыре кластера, соответственно популяциям, из которых они происходят, за исключением 3 образцов. В группу крымских К gallica (2) попал один образец из Западной Украины (ЬО19), а в группу К. gallica из Западной

Рисунок 4. Результаты анализа молекулярных данных ( для всех

образцов Я. gaШca: 1 - С В (Греция); 2 - и (Узун- Сырт, Крым, Украина)+ 1X319; 3 - ЬЬ-ЬУ-ЬО-ЬВ-ЬСт (Львовская, Ивано-Франковская, Тернопольская области Украины)+1ЧОЗ; 4 - N0, Ъ (№^гас1, 2а1а, Венгрия)+ЬУ1; 5 - К (Румыния)

Украины (3) попал один образец из Венгрии (N03). Еще один образец из Западной Украины (LV1) расположился на дереве в непосредственной близости от группы из Венгрии.

3.3. Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера trnV- ndhC у видов Rosa секц. Gallicanae и

секц. Caninae

Предварительный скрининг различных потенциально вариабельных участков хлоропластного генома (trnL-trnF, rpl32-trnL, trnQ-5'rpsló, 3'trnV-ndhC, ndhF-rpl32, psbD-trnT, trnH-psbA, rpoB-trnC, trnD-trnT) показал, что с использованием универсальных праймеров, доступных из литературы (Taberlet et al., 1991; Shaw et al., 2005; Shaw et al., 2007), добиться устойчивой амплификации с ДНК шиповников удалось только для участков trnL-trnF, 3'trnV-ndhC, trnH-psbA и trnD-trnT. Однако во всех случаях, кроме 3'trnV-ndhC, практически никакой изменчивости между испытанными образцами шиповников выявить не удалось. Поэтому для дальнейшего исследования на большой выборке образцов была использована только эта последовательность. Пробное секвенирование последовательностей ядерного внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1, как и ожидалось в соответствии с литературными данными (Ritz et al., 2005; Wissemann, 1999), выявило наличие сильного второго сигнала, связанного с присутствием множественных неидентичных копий рибосомального оперона у видов секции Caninae. Так как клонирование последовательностей ITS1 в нашей работе не предполагалось, мы отказались от их использования в дальнейшей работе.

Анализ нуклеотидных последовательностей хлоропластного спейсера trnV-ndhC был проведен для 209 образцов разных видов рода Rosa. Из них 108 образцов по морфологическим признакам (Бузунова, 2001) были определены, как виды секции Gallicanae, остальные - как виды секции Caninae. Общая длина выравнивания составила 564 п.н. Анализ этого выравнивания выявил присутствие в исследуемой выборке 11 гаплотипов, генеалогические отношения которых, реконструированные методом статистической парсимонии (Templeton et al., 1992) в программе TCS (Clement et al., 2000), показаны на рисунке 5.

Построенная сеть имеет две петли, которые не позволяют оценить генеалогические связи гаплотипов с полной однозначностью. Тем не менее, в распределении гаплотипов среди изученных образцов наблюдается ряд закономерностей. Так, большинство образцов морфологически типичной R. gallica характеризуются одним и тем же гаплотипом "g". Один образец R. gallica из Румынии (R5) характеризуется производным от "g" минорным гаплотипом "h", который отличается от гаплотипа "g" заменой С/А в 473 позиции выравнивания. Гаплотипом "g" обладают также 3 образца R.

j q R. grossheimií С ¿ R. cory mbíi'era

E. canina, R. grossheimií, R, corymbifera, R. glauca, R. pygmaea, R. sp., R. jundzillii.R. parviuscuia, R. gaiiicaX, R. subcanina R. porrectidens

R, jundzillii

R. villosa

R. caryopbyilacea, R, shistosa, R. ucraintca, R. taJijevii, R, subpygmaea, R. chomutoviensis, R. subpomifera, R. ksrynkensis R. «chalhauseniana

R shistosa,R. uerainica.R. talijevii, R. chomutoviensis,R. canina, R. grossheimií, R. corymbifera, R pygmaea, R. sp., R. jundzillii, R. parviuaetila, R. rubiginosa, R. oskolensis

R. grosshrimii, R. canina

R. villosa, R, rubiginosa, R. bordzilowsk», R. turcica

R. spinosissima О к

• - отсутствующие в выборке промежуточкы<! гапдотнпы

Рисунок 5. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей в программе TCS

grossheimii и 1 образец R. pygmaea, собранные на хребте Биюк-Янышар близ пос. Коктебель (Крым).

Большинство других карликовых шиповников обладают гаплотипами "а" и "Ь", широко распространенными и среди других представителей секции Caninae (R. canina, R. corymbifera, R. jundzillii, R. subcanina) и отличающимися от гаплотипа "g" одной заменой ("b") и одной дупликацией восьминуклеотидного мотива "а" соотвественно. Минорные гаплотипы "d", "f", "с", "е" встречаются у единичных образцов R. grossheimii (US27), R. corymbifera (US23), R. jundzillii (US6). Гаплотип "f' присущ всего двум образцам R. canina (ХС 42) и R. grossheimii (ХС 22). Характерным гаплотипом ("j") обладает группа образцов, относящихся к подсекциям Villosae и Rubigineae секции Caninae: R. villosa L., R. turcica Rouy и R. rubiginosa (включая R. bordzilowskiï). Один из образцов R. villosa (SI31) из популяции в Белгородской области имеет минорный гаплотип "i", отличающийся от общего для этой группы гаплотипа "j" единственной гомопластической заменой А/С в 473 позиции выравнивания. Заменой в этом же сайте различаются гаплотипы "g" и "h" у R. gallica. Растения R. spinosissima были использованы в качестве внешней группы. Все они обладают одним и тем же гаплотипом ("к"), отдаленно родственным гаплотипу "j". Это позволяет принять последний за корневой гаплотип, предковый для остальных гаплотипов изученной группы (рис. 4). Данный гаплотип связан с гаплотипом "g", то есть со всеми образцами R, gallica, поэтому существует вероятность происхождения его от гаплотипов'^" и/ или "Ь".

3.4. Байесовский анализ данных фрагментного (ISSR) анализа

По результатам байесовского анализа полиморфизма ISSR фрагментов у R. gallica и других карликовых шиповников в программе Structure 2.2 максимальное значение логарифма функции вероятности 1п(Р)= -3440.8 достигается при К=9, что говорит о том, что с наибольшей вероятностью выборка может быть разделена на 9 групп. К первой группе программа с близкой к 100% апостериорной вероятностью отнесла все 11 образцов R. gallica из Греции. Вторая группа включает 5 образцов R. gallica (R5) из Румынии. К третьей группе программа отнесла 4 образца R. gallica из Венгрии и 13 образцов из Западной Украины. Причем несколько образцов из третьей группы (N01, LO 19, LV1, LG1), согласно результатам анализа, имеют генетически смешанную природу и, не могут быть однозначно отнесены к той или иной популяции R. gallica. Четвертая группа состоит из образцов Крымских R gallica:US1, US20, US31, US32, US45, US49, US50, US52 и US44. Пятую группу составили всего 4 образца, три из которых были определены как R. grossheimii и один как R. pygmaea. Они также были собраны в Крыму. Еще один образец R. grossheimii (US7) программа определила как промежуточный между 4 и 5 группами с большей

вероятностью отнесения к группе 4. Шестая группа образована семью образцами из Крыма: R. grossheimii (U22), R grossheimii (U27), R pygmaea (U28), R parviuscula^U15), R parviuscula(UlT), R. parviuscula{T21) и R. sp. indet. (US25), последние два из которых представлены образцами, генетически смешанными с группой 9. В самую объемную группу 7 вошли 23 образца: 11 R grossheimii, 5 R pygmaea, 5 R shistosa, 1 R parviuscula и 1 R jundzillii. В самую объемную группу 7 вошли 23 образца: 11 R grossheimii, 5 R pygmaea, 5 R. shistosa, 1 R parviuscula и 1 R jundzillii. Все они, за исключением образца LG7, были собраны с территории Восточной Украины, еще один образец (SI13) был собран в Белгородской области на границе с Украиной. Среди всех образцов седьмой группы программа выделяет 7 образцов генетически смешанной природы. Причем 4 из них программа относит к гибридам между группами 7 и 8, еще 3 к гибридам между группами 7 и 9. Восьмую группу образовали всего 3 образца R schistosa из Восточной Украины. К девятой группе программа отнесла 10 образцов, но только один (R. porrectidens (LG5)) из них относится к этой группе с высокой апостериорной вероятностью близкой к 100%. Остальные имеют генетически смешанную природу с группами 3,6 и 7.

Образцы групп 1, 2, 3, 4 и 5 обладают характерными гаплотипами R gallica "g" и "h". Все остальные группы обладают гаплотипами "a", "b", "d" и "f\ которые распространены и среди других видов секции Caninae по результатам анализа нуклеотидных последовательностей в программе TCS.

3.5. Гибридное происхождение карликовых шиповников 3.5.1. Результаты опытов по изоляции цветков и экспериментальных скрещиваний

Результаты опытов по скрещиванию показали, что апомиксис не наблюдается ни у одного из видов, участвовавших в экспериментах, за исключением R rubiginosa (до 35% апомиктического завязывания плодиков), а самоопыление характерно только для растений R canina (59%), R villosa (70%), и R. rubiginosa (50%). У R jundzillii, R corymbifera, R. gallica, Roskolensis, R. grossheimii и R spinosissima плодики при самоопылении в наших экспериментах не завязывались, что указывает на то, что они являются облигатно перекрестно опыляемыми растениями. Карликовые шиповники Roskolensis и R grossheimii не завязали ни одного орешка, ни в одном из вариантов опытов. Завязываемость орешков при свободном опылении у них также оказалась крайне низкая - от 3 до 9%, в то время как у R. rubiginosa и R. villosa, например, она приближается к 90-100%. Опыты по перекрестному опылению дают относительно высокий процент завязываемости орешков для R canina, R. corymbifera, R rubiginosa и R villosa (65-90%) при скрещивании с другими видами. Любопытно, что образцы R. canina успешно гибридизируют со всеми видами, участвовавшими в экспериментах, за исключением R gallica, если последняя

выступает в качестве донора пыльцы. В случае скрещиваний R. corymbifera х R. gallica процент завязываемости орешков составляет 91%. В то время, как при скрещивании R. gallica х R. corymbifera этот показатель резко уменьшается и составляет всего 35%. При опылении R. jundzilii, а также предположительно гибридных образцов R. corymbifera пыльцой других видов не завязывается ничего. Это может являться следствием их гибридной природы. Однако, если опылять R. gallica пыльцой R. jundzilii, орешки все же завязываются, хотя и в небольшом числе (всего 9%).

3.5.2. Проверка потомства с помощью ISSR маркеров

Прорастить орешки, завязавшиеся в ходе постановки гибридизационных экспериментов, не удалось. Вероятными причинами этого могли стать: 1) недостаточная скарификация; 2) короткий отрезок времени, в течение которого производилось проращивание в условиях лаборатории. Из одного орешка, полученного при скрещивании R. corymbifera х R. gallica (эксперименты на плато Узун- Сырт (Крым)), путем препарирования был извлечен зародыш. Из него была выделена тотальная ДНК, которая подверглась ISSR- маркированию для проверки результатов гибридизации.

ШВх_1 нВх_0 BF2

■ F1

■ риге_1 □ pure_0

Рисунок 6. Результаты анализа в программе №\уНуЬп<18 (риге_0 - 1-й родительский вид, риге_1 - 2-й родительский вид, Б1- гибриды первого поколения, Р2-гибриды второго поколения, Вх_0-Вх_1- бэккроссы, СогушЬ-R.corymbifera (материнское растение), СаШса- R. gallica (отцовское растение)).

С помощью ПИР с 5 различными праймерами было получено 63 информативных ISSR маркера. Байесовский анализ бинарной матрицы в программе NewHybrids подтвердил статусы родителей и потомства в данном случае (рис. 6). Тот факт, что программе не удается однозначно определить гибридное растение, как гибрид F1, связан, вероятно, с полиплоидным состоянием генома обоих родителей и гибрида. У образца Rcorymbifera присутствуют 19 специфических маркеров, в то время как у образца R. gallica таких маркеров 6. Всего от родительских видов гибрид получил 32 маркера: 1) от материнского растения - 17 маркеров; 2) от отцовского растения - 15 маркеров. При этом гибридное растение имело 6 своих специфических маркеров, вероятно связанных с рекомбинацией.

3.5.3. Результаты исследования гибридизационных процессов с участием R. gallica, а также других карликовых шиповников в локальных природных популяциях

В результате анализа морфологических и молекулярных признаков в локальных природных популяциях шиповников было установлено следующее:

1) Показано существование спонтанной межвидовой гибридизации у шиповников заповедника «Хомутовская степь». Установлено, что в заповеднике «Хомутовская степь» естественно произрастают только два вида шиповников - R. rubiginosa и R. grossheimii, которые гибридизируют между собой. Все остальное морфологическое разнообразие шиповников заповедника представлено их гибридами. Анализ распределения ISSR маркеров и хлоропластных гаплотипов показал, что вероятно, гибридизация произошла только один раз в прошлом. При этом материнским растением была R. grossheimii, а донором пыльцы - R. rubiginosa, так как хлоропластные гаплотипы R. rubiginosa у гибридов отсутствуют (Шанцер, Вагина, Остапко, 2011).

2) В популяциях с территории Подольской возвышенности (Западная Украина) R. canina является полиморфным видом - морфотипы разнообразны по морфологическим признакам. R. gallica для данной территории не проявляет каких-либо признаков дифференциации по морфологическим признакам и по ISSR маркерам. Она редко гибидизирует с шиповниками секции Caninae, всегда выступая в качестве донора пыльцы. Наличие предполагаемых бэккросов указывает на вероятную интрогрессию между R. gallica и собачьими шиповниками (Fedorova, Schanzer, Kagalo, 2010).

3) Карликовые шиповники из Белгородского заповедника (участок «Стени Изгорья»), в том числе и R. oskolensis, могли возникнуть в результате гибридизации между R. rubiginosa и R. villosa, но не напрямую друг с другом, а с участием третьего карликового шиповника, близкого к R. grossheimii, выступавшего при гибридизации в качестве материнского растения и

передавшего гибридам свою хлоропластную ДНК (Федорова, Шаицер, Мещерский, 2012).

4) Характер распределения хлоропластных гаплотипов и ISSR маркеров среди образцов выборки с г. Узун - Сырт (Крым) позволяет заключить, что R. gallica и R. turcica в данном местонахождении произрастают симпатрично, не вступая в гибридизацию ни между собой, ни с остальными «видами» секции Caninae. Последние, вероятно, гибридизируют между собой, на что указывает наличие генетического смешения по ISSR маркерам и полное отсутствие корреляции последних с морфологическими признаками конкретных растений.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование R. gallica и карликовых шиповников с позиций морфологического и молекулярно-генетического подходов позволило установить, что карликовые шиповники, произрастающие на юге Восточной Европы, не близкородственны R gallica и, соответственно, не могут быть отнесены таксономически к секции Gallicanae, а являются в большинстве случаев продуктами гибридизации между различными представителями секции Caninae. Rosa gallica в ряде случаев, вероятно, все же может гибридизировать с видами секции Caninae, однако такая гибридизация ни в одном из изученных случаев не носит массового характера Все растения R. gallica обладают единственным гаплотипом "g", не встречающимся ни у одного из других исследуемых видов. Минорный гаплотип "h", присутствующий в одной из популяций R. gallica из Румынии, отличается от гаплотипа "g" единственной мутацией и свидетельствует о наличии, хотя и незначительного внутривидового полиморфизма по этому участку. Четыре образца из Крыма с горы Биюк-Янышар, определяемые по морфологическим признакам как R. grossheimii (Т5, Т7, Т17) и R. pygmaea (ТЗО), также обладают гаплотипом "g", характерным для R. gallica. Но морфологически и по данным ISSR-маркирования все они попадают в группу прочих карликовых роз. Вероятно, эти растения возникли в результате гибридизации R gallica с другим видом шиповника из секции Caninae, в которой R gallica была материнским растением и передала свою хлоропластную ДНК потомкам. При укоренении сети гаплотипов по R. spinosissima, использованной в качестве внешней группы, генеалогически наиболее близким и предковым для гаплотипа "g" (R. gallica) оказывается гаплотип "j", характерный для представителей подсекций Rubigineae и Villosae секции Caninae. Это подтверждает правильность предположения О. Н. Дубовик (1973) о происхождении секц. Gallicanae от подсекц. Rubigineae секц. Caninae, сделанное ею на основании анализа комплекса морфологических признаков.

Все остальные карликовые шиповники обладают широким спектром гаплотипов - "а", "Ь", "с", "d", "е", "f", как широко распространенных, так и

минорных, встречающихся в единичных популяциях. Гаплотипы "a", "b", "f'обнаруживаются и у других представителей секции Caninae, не проявляющих карликовой формы роста. Это дает основание относить все восточноевропейские карликовые шиповники к секции Caninae, а не к секции Gallicanae.

В ходе проведения данной работы нами установлена гибридная природа многих низкорослых роз в локальных популяционных выборках. Так, представители подсекций Rubigineae и Villosae, такие как R. rubiginosa, R turcica, R villosa, вступая в гибридизацию с другими представителями секции Caninae всегда сохраняют свою морфологическую и генетическую обособленность, что указывает на отсутствие массовых возвратных скрещиваний и интрогрессии. Напротив, растения морфологически определяемые, как R canina, а также многочисленные эндемичные «виды», описанные, преимущественно, с территории Украины, в том числе и карликовые, обычно оказываются генетически крайне гетерогенными. Никаких корреляций между диагностическими морфологическими признаками этих «видов» и их генотипическим составом по данным ISSR маркирования или составом хлоропластных гаплотипов установить не удается. Вероятно, карликовость многих шиповников, представляющих собой продукты гибридизации и расщепления в последовательных поколениях гибридов, выявляемых в ходе анализа ДНК маркеров, может быть связана с генетическим дисбалансом. На это, помимо крайней нестабильности морфологических признаков, указывает и установленная нами их низкая семенная продуктивность, даже в условиях свободного опыления. Участие R. gallica в таких скрещиваниях подтверждается для некоторых локальных популяций из Западной Украины и Крыма, но состав ISSR генотипов свидетельствует о том, что такая гибридизация происходила не часто и не имела значительных генетических последствий. Генетические последствия гибридизации между представителями секции Caninae, напротив, могут быть драматичными. Об этом свидетельствуют результаты Байесовского анализа ISSR генотипов в популяциях на территории заповедников «Хомутовская степь» и «Белогорье». Здесь анализ скоплений исключительно морфологически разнородных растений с практически 100% апостериорными вероятностями позволяет разделить выборки на пары родительских видов и гибридов разных поколений. Эти данные указывают на бессмысленность попыток формального таксономического описания этого морфологического разнообразия, так как описываемые морфотипы генетически не являются стабилизированными видами. Хорошим примером здесь может служить R. oskolensis, считавшаяся эндемиком Белгородской области, экологически приуроченным к выходам мела. Наши данные свидетельствуют о том, что на самом деле, это лишь один из морфологических вариантов, возникший в результате гибридизации между R. villosa и R rubiginosa с участием третьего вида из той же секции, возможно

R. grossheimii. Карликовая форма роста многих из этих гибридов может быть связана с их генетическим дисбалансом, проявляющимся, в частности, в неспособности завязывать семена ни в результате перекрестного опыления, ни в результате самоопыления. Вероятно, такие гибриды удерживаются в составе популяций в результате вегетативного размножения, к которому они все способны за счет образования подземных одревесневающих корневищ.

Выводы

1. Rosa gallica хорошо отличается от остальных восточноевропейских карликовых шиповников по стабильному комплексу качественных морфологических признаков. Различение остальных видов карликовых шиповников по морфологическим признакам затруднено из-за значительного их варьирования.

2. Rosa gallica хорошо отграничена генетически от других карликовых видов шиповников, относимых современными систематиками как к секции Gallicanae, так и к секции Caninae, как по данным ISSR маркирования, так и по составу гаплотипов хлоропластного межгенного спейсера trnV-ndhC.

3. Восточноевропейские карликовые виды шиповников, относимые в современных таксономических обработках к секции Gallicanae, все, за исключением самой R gallica, следует рассматривать в составе секции Caninae. Это подтверждается как фрагментным анализом ДНК, так и составом характерных для них гаплотипов хлоропластного межгенного спейсера trnV-ndhC.

4. Фрагментный анализ ДНК (ISSR) позволяет разделить отдельные географические популяции R gallica, что свидетельствует об их значительной генетической изолированности друг от друга, вероятно, связанной с их стабильно низкой численностью и сильной пространственной разобщенностью.

5. Реконструированная генеалогия гаплотипов хлоропластного межгенного спейсера trnV-ndhC свидетельствует в пользу верности предположения О. Н. Дубовик о происхождении R gallica от видов подсекции Rubigineae секции Caninae.

6. Карликовые шиповники, произрастающие на юге Восточной Европы, представляют собой генетически гетерогенные продукты современной гибридизации между различными симпатрически произрастающими представителями секции Caninae, как правило, без участия R gallica.

7. При симпатрическом произрастании с видами секции Caninae R gallica может иногда гибридизировать с ними, выступая, как правило, в качестве донора пыльцы (отцовского растения).

8. Rosa oskolensis, описанная как узко локальный эндемик Белгородской области, не является самостоятельным видом, а представляет собой один из продуктов расщепления в результате гибридизации R villosa х R rubiginosa с

участием третьего, вероятно карликового, вида шиповника.

Благодарности

Я хочу выразить признательность и глубокую благодарность научному руководителю И. А. Шанцеру за неоценимую помощь в проведении полевых и лабораторных исследований, полезные советы и замечания, а также за поддержку на протяжении всей работы над диссертацией. В сборе материала большую помощь оказали В.М. Остапко (Донецкий ботанический сад HAH Украины), A.A. Катало (Институт экологии Карпат HAH Украины), H. М. Решетникова (ГБС РАН), А. С. Шаповалов (заповедник «Белогорье»), И. В. Павлова (ГБС РАН). Я благодарна И. Г. Мещерскому (ИПЭЭ РАН) за помощь в секвенировании. Особую благодарность выражаю всему замечательному коллективу Гербария ГБС им. Н. В. Цицина РАН. Спасибо моей семье за моральную поддержку и проведение некоторых камеральных работ.

Публикации по теме диссертации

Публикации в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Schanzer, I. А. & А. V. Vagina. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) markers reveal natural intersectional hybridization in wild roses [Rosa L., sect. Caninae (DC.) Ser. and sect. Cinnamomeae (DC.) Ser.] // Wulfenia. V. 14. 2007. P. 1-14.

2. Alina V. Fedorova, Ivan A. Schanzer, Alexander A. Kagalo Local differentiation and hybridization in wild rose populations in Western Ukraine. // Wulfenia. V. 17. 2010. P. 99-115.

3. Шанцер И. А., Вагина А. В., Остапко В. M. Критическое исследование шиповников (Rosa L.) заповедника «Хомутовская степь» // Бюлл. МОИП, отд. биол. 2011. Т. 116, вып 3 С. 38-48.

Прочие публикации

1. Федорова A.B., Шанцер И.А., Мещерский И.Г. Гибридизация между Rosa rubiginosa L. и R villosa L. в условиях заповедника «Белогорье» и природа R oskolensis Buzunova et Grigorj. И Бюл. Главн. бот. сада. 2012. Вып. 198, №4. С. 33-40.

2. Schanzerl.A., VoilokovaV.N., VaginaA.V., KutluninaN.A. Intraspecific polymorphism, hybridization and reticulate evolution in roses: how to tell the difference? // Systematics 2008. Programme and Abstracts. Ed. by S.R. Gradstein et al. Goettingen, 7-11 April 2008. — Goettingen: Universitaetsverlag, 2008. P. 127

3. Вагина A.B., Шанцер И.А. Межвидовая гибридизация шиповников при совместном произрастании в заповеднике Хомутовская Степь // XII Московское совещание по филогении растений, посвященное 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана. Материалы (Москва, 2—7 февраля

2010 г.). — М: Товарищество научных изданий КМК. 2010. С. 106— 109.

4. Шанцер И.А., Вагина A.B. Межвидовая гибридизация в популяции шиповников (RosaL. sect. Caninae) в Волгоградской области // Особь и популяция - стратегии жизни. Матер, докладов IX Всероссийского семинара. 2-6 октября 2006 г. Республика Башкортостан, г. Уфа. Ч. 2. Уфа: Изд. дом "Вилли Окслер", 2006. С. 401^07.

5. Вагина А. В. Гибридизация шиповников Крыма // 6 совещание по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений (Санкт- Петербург, 1-2 декабря 2009 г.). ООО «ПиФ.сот» 2009 С. 138-140.

Подписано в печать: 22.03.14

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 219 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова (Вагина), Алина Викторовна, Москва

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н. В. ЦИЦИНА РАН

На правах рукописи

04201457545

ФЕДОРОВА (ВАГИНА) АЛИНА ВИКТОРОВНА

СИСТЕМАТИКА И ГЕОГРАФИЯ ВИДОВ РОДА ROSA L. SECT. GALLICANAE DC.

Специальность 03.02.01 - ботаника

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Иван Алексеевич Шанцер

Москва 2014

СОДЕРЖАНИЕ

Введение............................................................................................................4

ГЛАВА 1. История изучения шиповников секции ОаШсапае.....................8

1.1. Общая характеристика секции ОаШсапае.............................8

1.2.Объем секции ОаШсапае................................................10

1.3. Происхождение шиповников секции ОаШсапае...................17

1.3.1 .Происхождение карликовости у роз................................18

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.............................................21

2.1. Таксономические выборки..............................................................23

2.2. Гибридизационные эксперименты.................................................27

2.3. Выделение ДНК ..............................................................................30

2.4. Амплификация ДНК........................................................................31

2.5. Визуализация продуктов амплификации.......................................34

2.6. Очистка ПЦР - продукта, постановка сиквенсной

реакции и секвенирование.....................................................................34

2.7. Выравнивание ДНК последовательностей....................................35

2.8. Выбор морфологических признаков для анализа.........................35

2.9. Статистическая обработка данных.................................................37

ГЛАВА 3. Результаты.......................................................................................41

3.1. Морфологическая изменчивость карликовых шиповников

и Я. gallica................................................................................................41

3.2. Анализ молекулярных 18811 маркеров..........................................46

3.3. Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера /гп V- пс1ИС

у видов Rosa секц. Gallicanae................................................48

3.4. Байесовский анализ молекулярных данных в программе Structure 2.2 .............................................................................................57

3.5. Гибридное происхождение карликовых шиповников.................60

3.5.1. Результаты опытов по изоляции цветков и экспериментальных скрещиваний.........................................................60

3.5.2. Проверка потомства с помощью ISSR маркеров.......................61

3.5.3. Результаты исследования гибридизационных процессов

с участием R. gallica, а также карликовых шиповников в локальных

природных популяциях ................................................63

ГЛАВА 4. Обсуждение...............................................................88

Выводы..............................................................................................................92

Список литературы.........................................................................................94

Приложение 1. Таблицы исследованных образцов......................................103

Приложение 2. Фотографии роз.....................................................................113

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Род Rosa L. всегда находился под пристальным вниманием людей и особенно систематиков. Повышенный интерес к этому роду объясняется исключительными декоративными качествами роз, благодаря которым по обилию и продолжительности цветения, по тонкости аромата, изысканности и богатейшей палитре оттенков и красок с розами никто не может соперничать в декоративном садоводстве. Цветки роз изумительно разнообразны по форме и удивительно красивы. Многие виды дикорастущих роз (шиповника) успешно используются в качестве подвоя, при сооружении живых изгородей, для декорирования беседок и арок, из них можно оформлять клумбы, перголы, цветники, бордюры. Эти растения, обладая ярко выраженными фармакологическими свойствами, используются как сырье для изготовления целого ряда продуктов: розового масла, вина, лекарств, варенья, тонйзирующих и лечебных настоек, витаминных сиропов, уксуса, дубильного экстракта, красителей. Существует огромное количество культурных сортов роз, большинство из которых выведено селекционерами специально для применения в области ландшафтного дизайна. Центральный вид секц. Gallicanae DC. R. galilea L. является родоночальником большинства из них (Wylie, 1954). Так, например, от R. gallica произошли дамасские, центифольные, галлийские розы и розы Альба. Все они относятся к группе старых садовых роз. Секц. Gallicanae, как и род Rosa, все еще плохо изучена в систематическом отношении, и среди ботаников нет устоявшейся точки зрения на общее число видов. Таксономические трудности в секции Gallicanae вызваны ее слабой изученностью, как в природе, так и в культуре (Шанцер, 2001, 2005, 2007). По данным отечественных родологов секция Gallicanae включает в себя от 1 до 14 дикорастущих видов для территории Восточной Европы (Юзепчук, 1941; Хржановский, 1958; Дубовик, 1987; Бузунова, 2001), в то время когда зарубежными ботаниками в рамках этой секции признается лишь один дикорастущий вид R. gallica, остальные же

являются продуктами гибридизации его с другими видами (Klástersky I., 1968; Wissemann, 2003).

Отдельную проблему представляет наличие карликовых форм в секции Caninae DC. Некоторые исследователи рода Rosa относят к этой секции виды с карликовой формой роста, столь характерной для секции Gallicanae, предполагая, что такая форма роста возникала неоднократно в процессе эволюции как приспособление к неблагоприятным условиям обитания (Дубовик, 1973). Значительный вклад в разрешение таксономических трудностей в секции Gallicanae может внести использование не только данных морфологии, но и молекулярно-генетических данных, а также изучение природных популяций шиповников, которому уделяется мало внимания со стороны родологов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является установление видового состава Rosa L. секции Gallicanae, определение секционной принадлежности, родственных связей и вероятного происхождения карликовых шиповников юга Восточной Европы, а также выявление и оценка частоты и генетических последствий гибридизации у шиповников в естественных популяциях.

Д ля достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменчивость морфологических признаков у R. gallica, карликовых шиповников дискуссионной таксономической принадлежности и встречающихся совместно с ними в природе видов секции Caninae.

2. Изучить генетический полиморфизм исследуемых видов методом фрагментного анализа межмикросателлитных (ISSR, Inter Simple Sequence Repeats) участков ДНК.

3. Выявить высоковариабельные участки хлоропластной ДНК и установить их генеалогические связи у исследуемых видов.

4. Сопоставить результаты анализа изменчивости морфологических признаков и молекулярно-генетических маркеров и на их основе сделать предположения о степени родства и происхождении исследуемых видов.

5. Изучить характер гибридизационных процессов и их последствия в нескольких локальных популяциях, в которых присутствуют представители исследуемых видов.

6. Экспериментально изучить системы размножения исследуемых видов.

Научная новизна работы

Впервые проведено специальное исследование секции Gallicanae. Впервые изучена популяционная структура R. gallica и других карликовых шиповников морфометрическими и молекулярно- генетическими методами. Установлено, что карликовые виды шиповников, растущие на юге Восточной Европы, не близкородственны R. gallica, а представлены, в большинстве своем, различными гибридами между видами секции Caninae. Установлено гибридное происхождение R. oskolensis Buzunova & Grigorj. и целого ряда форм, традиционно признаваемых в качестве самостоятельных видов секции Caninae. Впервые получены и депонированы в ГенБанк нуклеотидные последовательности хлоропластного межгенного спейсера trnV-ndhC ряда восточноевропейских представителей рода Rosa (секц. Gallicanae, секц. Caninae). Впервые получены экспериментальные данные о системах размножения восточноевропейских представителей рода Rosa, установлено, что апомиктическое завязывание семян характерно только для R. rubiginosa L., в то время как остальные виды размножаются преимущественно путем перекрестного или самоопыления.

Практическая значимость работы

Результаты исследований могут быть использованы при написании «флор», при составлении ключей для определителения видов шиповников, а также при разработке курсов для студентов биологических вузов по теории эволюции и

генетике. Полученные данные, а также отработанные в ходе выполнения работы методики могут быть использованы для расшифровки происхождения культивируемых сортов роз, а также для их селекции.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на международной конференции «Systematics 2008» в Геттингене (Германия) в 2008 г.; 6-м Совещании «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» (Санкт-Петербург) в 2009 г, на XII Московском совещании по филогении растений, посвященном 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана в 2010 г., на ежегодных конкурсах научно-исследовательских работ молодых ученых ГБС РАН в 2010 и 2011 гг., на конференции памяти проф. А.К. Скворцова в 2010 г., на семинарах лаборатории Гербарий ГБС РАН (2008-2010 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, и 5 статей в сборниках и материалах конференций.

Благодарности

Я хочу выразить признательность и глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., проф. И. А. Шанцеру за неоценимую помощь в проведении полевых и лабораторных исследований, полезные советы и замечания, а также за поддержку на протяжении всей работы над диссертацией. В сборе материала большую помощь оказали В.М. Остапко (Донецкий ботанический сад HAH Украины), A.A. Кагало (Институт экологии Карпат HAH Украины), Н. М. Решетникова (ГБС РАН), А. С. Шаповалов (заповедник «Белогорье»), И. В. Павлова (ГБС РАН). Я благодарна И. Г. Мещерскому за помощь в секвенировании. Особую благодарность выражаю всему замечательному коллективу Гербария ГБС им. Н. В. Цицина РАН. Спасибо моей семье за моральную поддержку и проведение некоторых камеральных работ.

ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ROSA GALLICA L. И БЛИЗКИХ

К НЕЙ ВИДОВ

1.1. Общая характеристика секции Gallicanae

Одной из основных таксономических проблем для секции Gallicanae до сих пор остается установление ее состава. Согласно современным европейским авторам (Wissemann, 2003), к секции относится единственный дикорастущий вид R. gallica (приложение 2: рис. 1-4) и несколько культивируемых видов гибридогенного происхождения, неизвестных в природе (R. alba L., R. centifolia L., R. damascena Mill.). Согласно отечественным авторам, в состав секции входят также от 4 до 14 дикорастущих видов, распространенных, за исключением R. gallica, исключительно в Восточной Европе. В настоящей работе научный интерес для нас представляли исключительно дикорастущие представители данной секции.

До 2005 года лектотипом рода Rosa являлась R. centifolia, поэтому Gallicanae считалась типовой секцией и к ней, согласно современным номенклатурным правилам, применялся автоним Rosa. На номенклатурной секции Венского конгресса 2005 г. было принято предложение Ch. Jarvis сделать типом рода R. cinnamomea L.. Поэтому автоним Rosa в настоящее время применяется к секции Cinnamomeae DC., а к секции Gallicanae вернулось ее исходное название. Дикорастущие представители данной секции - мелкие прямостоячие кустарнички до 50-60 см высотой, с длинными корневищными побегами, с яркими насыщенно-розовыми, в основном, немахровыми пятичленными одиночными цветками, с перистыми, опадающими по мере созревания чашелистиками и кожистыми листочками со сложными зубцами по краю. Плоды сочные и красные. Карликовые шиповники образуют небольшие по площади диффузные заросли, за счет вегетативного разрастания. Представители секции Gallicanae - это тетраплоиды (2n=4x=28) (Hurst, 1941; Klásterská, 1969; Klásterská & Natarajan,

1974; Jicinská D., 1975), светолюбивые мезофиты, произрастающие на лесных опушках и полянах, остепненных щебнистых склонах, выходах известняка, в зарослях кустарников, в дубовом редколесье в Восточной Европе и в Закавказье. Центральным видом (и, единственным, по мнению зарубежных исследователей рода Rosa) секции является Rosa galilea (Галльская роза). Rosa gallica была завезена в середине XIII в. из Малой Азии через острова Эгейского моря и Македонию в Грецию, оттуда - в Рим, из Рима розы были завезены в Египет, позднее - на территорию Испании и Франции уже в XV в., а затем они появились в Англии и Германии (Сааков, 1965). Благодаря своим исключительным декоративным качествам, тетраплоидности, которая обеспечивает оптимальные декоративные качества при выведении сортов (махровость венчиков), и способностью к гибридизации с другими видами, эта роза, а также ее гибридные формы и сорта, получили широкое распространение во Франции, где с XVI в. ее выращивали в городе Провен (Provins). Отсюда она и получила еще одно свое название - Rosa provincialis Herrm.. Провен является историческим центром выращивания и культивирования сортов, произошедших от Rosa gallica, также здесь производят розовое масло, варенье из лепестков роз, мед и конфеты из роз (http://www.provins.net/index.php/natural-outings/the-provins-rose-garden.html). Rosa gallica считается единственным дикорастущим видом, давшим начало группе старинных садовых роз - дамасским, портландским и розам центифолиа, которые были получены от скрещивания Rosa gallica с другими розами. Так, некоторые авторы указывают на происхождение R. alba и R. damascena путем скрещивания Rosa gallica с R. corymbifera Borkh. и R. canina L. соответственно (Клименко, 1974; Сааков, 1965). Другие же авторы на основе анализа секвенированных последовательностей ITS указывают на происхождение старых дамасских роз путем гибридизации трех видов роз: R, moschata Herrm., R. gallica и R. fedtschenkoana Regel (Iwata, Kato, Ohno, 2000). Считается, что R.centifolia произошла от Rosa gallica путем почковых

мутаций. Гибриды Rosa gallica находят широчайшее применение декоративном садоводстве, также они служат источником розового масла.

в

1.2.0бъем секции Gallicanae

Взгляды зарубежных и отечественных исследователей на объем видов секции Gallicanae очень сильно различаются. В обработке рода Rosa во «Flora Europea» I. Klástersky (1968) для секции Gallicanae указывает один единственный вид - R. gallica: кустарничек до 80 см высотой, образующий большие заросли, с крупными венчиками цветков до 9 см в диаметре. В обработке шиповников во «Flora von Mittel-Europa » (Henker, 2000) в состав секции Gallicanae входит также всего один вид R. gallica, распространенный в Ц, Ю и В Европе, для которого указываются следующие синонимы: R. provincialis, R. austriaca Crantz, R. pumila Scopoli non Jacq. Секция включает также ряд таксонов, имеющих гибридогенное происхождение, известных только в культуре и не встречающихся дико в природе. К ним относятся 5 культивируемых гибридов: R. alba, R. centifolia, R. damascena, R. francofurtana Münchhausen, R. polliniana Spreng. V. Wissemann в «Encyclopedia of Rose Science» (Wissemann, 2003) придерживается аналогичной точки зрения на видовой состав секции Rosa (= Gallicanae). Первая современная обработка восточноевропейских шиповников была сделана C.B. Юзепчуком во «Флоре СССР» (Юзепчук, 1941). В ней для территории европейской части СССР автором приводится 21 дикорастущий вид Rosa. Секция Gallicanae содержит всего лишь один дикорастущий вид R. gallica и 5 гибридов: R.centifolia, R. damascena, R. bifera Poir., R.turbinata Ait., R. alba. Сильное влияние на взгляды отечественных исследователей рода Rosa оказала монография В. Г. Хржановского (1958), посвященная дикорастущим розам европейской части СССР. В ней была разработана классификация рода, приведены многочисленные сведения о географии, экологии и возможном происхождении видов. К секции Gallicanae В. Г. Хржановский относит уже 14 дикорастущих видов, которые почти все сам и

описал, и 5 культивируемых гибридов. Виды эти различаются, в основном, единичными признаками (например, наличием или отсутствием простого и железистого опушения листочков). Примечательно то, что вид R. gallica, по мнению Хржановского, на территории европейской части СССР отсутствует. Автор пишет, что детальное изучение R. gallica s.l показывает довольно высокую степень его изменчивости, и наличие многочисленных переходных форм к другим секциям рода Rosa. Эти формы, как считает Хржановский, произошли гибридогенным путем в плейстоцене, и многие из них довольно устойчиво «закрепились» в статусе гибридов, характеризующихся особым ареалом. Хржановский был убежден, что большинство видов были описаны на основе морфологических различий зачастую весьма ограниченного материала, причем выяснение причин морфологических изменений у видов роз не являлось основной целью исследователей - родологов. Отдельный вопрос вызывает систематическое положение R jundzilli Bess, (приложение 2: рис. 10-12). Хржановский поместил ее в пределах секции Gallicanae. RJundzillii, по мнению Хржановского, имеет самый обширный ареал, дальше всех продвигается на запад и север, для нее приводятся и среднерослые, и высокорослые формы. Хржановский рассматривает этот вид, как географическую расу, обособившуюся в лесных условиях, и относит его к секции Gallicanae, несмотря на то, что сам указывает на наличие несбалансированного гексаплоидного набора хромосом (2п= 14+28) данного вида, характерного исключительно для представителей Caninae, и на его весьма интенсивную изменчивость и, следовательно, относительно недавнее гибридогенное происхождение. Другие же исследовате�