Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система мониторинга микроорганизмов на основе генов биолюминесценции

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Система мониторинга микроорганизмов на основе генов биолюминесценции"

На правах рукописи

! М I . '

\ БУРМАКИНА Светлана Владимировна ¡1 / ! /1

V..................-..............— ¿ци*

СИСТЕМА МОНИТОРИНГА МИКРООРГАНИЗМОВ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Центре "Биоинженерия" Российской академии наук.

доктор биологических наук, профессор А.И.Степанов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.П.Щипков кандидат биологических наук Е.У.Полуэктова

Ведущая организация: Московский государственный университет им.М.ВЛомоносова

Защита состоится "/7 "СК)&&рС1ги%1996 г. в" !Ь * часов на заседании диссертационного совета К 053.22.16 в Российском университете дружбы народов по адресу:. 117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г.Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.6.

Научный руководитель:

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.Б.Гигани

Актуальность темы.

Биолюминесценция или способность организмов светиться в темноте, присуща ряду прокариот и эукариот, и обусловлена протеканием специфических биохимических реакций, в ходе которых испускаются кванты света. Реакции биолюминесценции, протекающие in vitro, нашли применение в разнообразных тест-системах обнаружения различных ферментов, метаболитов, гормонов, лекарств. В молекулярной биологии гены биолюминесценщи широко используются в качестве репортеров для исследования регуляции генов.

Перенос люминесцентных генов в несвет^люся органами, количественное изучение экспрессии в них биолюминесценции' при учете зависимости светпродуцирующей реакции от метаболита клетки-хозяина, может позволить понять биохимические особешюсти этих клеток. Созданные таким путем светящиеся бактерии в дальнейшем могут быть использованы в качестве биосепсоров в токсикологических исследованиях.

Представляется перспективным использование биолюминесцентных генов в качестве маркеров микроорганизмов для изучения процессов взаимодействия бактерий с растениями, при интродукции микроорганизмов в окружающую среду, в модельных экспериментах по внушаемости бактерий. Способность к свечению позволяет легко идентифицировать колонии бактерий и обнаруживать микроорганизм» в субстратах среды с помощью специальных устройств, регистрирующих фотоны. Актуальной проблемой является разработка простых и наглядных способов слежения за судъбой биоконтролирующих нггзммов, используемых для обработки семян, с целью обоснования практических рекомендаций применения бактериальных средств защиты растений. '

Цель кастолаеп оасоты заключалась в создании система мониторинга микроорганизмов на основе генов биолюминесцентхл л исследовании экспрессии биолюминесценции в различных бактериях. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- создать генетическую конструкцию, несущую оперон биолюминесценции морской светящейся бактерии Photofcacterium leicgnathi Ha векторе с широким кругом хозяев;

- отработать методы переноса данной конструкты в различные, микроорганизмы и количественно исследовать экспрессию люминесценции в этих организмах;

- исследовать стабильность наследования созданной плазмнды в бактериях;

- исследовать, влияет ли функционирование биолюминесцентной системы в бактериях на их свойства;

- исследовать выккваемость сконструированных светящихся бактерий в образцах почви методом посева разведений и люминометрическим способом; проанализировать сохраняемость лшинесцентной плазмвды в штамме в образцах почвы;

- осуществить мониторинг распределения светящихся бактерий в процессе робта растений из семян, инкрустированных маркированным штаммом в условиях климакамеры и в открытом грунте;

- исследовать возможность мониторинга с помощью биолюминесцентной плазмиды активности фермента 5Ш-оксидоредуктазы в клетках.

Научная новизна и практическое значение работы. Автором впервые количественно исследована экспрессия биолши-несвднтной системы морской светящейся бактерий P.leiognathi, состоящей из пяти генов, в ряде грамогрицательных бактерий. Разработан способ мониторинга с помощью биолшинесцентной метки биоконтролирувдих бактерий в процессе развития растений из семян, обработанных светящимся штаммом, в модельных экспериментах в кпимакамере и в полевых условиях. Показана возможность использования биолюминесценция для приблизительной оценки сроков хранения обработанных штаммом семян к исследования способности штаммов колонизировать растения. Лшинесцентная метка вводилась В биоконтролирущий штамм Enterobacter agglomerana; ПО ДЭННЫМ литературы ранее данный ввд бактерий не использовался в подобных экспериментах. Созданная генетическая конструкция» несущая гены биолюминесценции, как продемонстрировано в настоящей работе; может - быть использована для мониторинга активности фермента ОМН-оксвдоредуктазы в бактериальных клетках и скрининга фрагментов ДНК-в составе плазмид на оксидоредуктазную активность. Q^M ра<?ртн- "

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включапцей материалы а методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литература. Список литературы вклшчает 146 литературных источников отечественных и зарубежных авторов. Материал диссертации изложен на 120 страницах машинописного текста и включает 14 рисунков и 2 таблицы.

Апробация работы• . Основные результаты диссертационной работы были представлены на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии расте-

ний" (18-20 мая 1993г, г.Пущино), в виде доклада на научной конференция "Интродукция микроорганизмов в окрумаютс/а среду" (17-19 мая 1994 г., г.Москва) и на семинаре лаборатории генетики микроорганизмов Центра "Биоинженерия" (1995).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре литературы приведены сведения об оргашзации наиболее известных биолтаинесцентных систем - светлячков и морских светящихся бактерий, подробно доказаны различные аспект их использования - в тест-системах обнаружения различных веществ, для исследования регуляции генон, в качестие генетических маркеров микроорганизмов.

II. ЭКСПЕРИМЕНТА-ТЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы и плаз милы. В работе использованы различные штаммы: Е .со 11 С600 - из лаборатории генетики микроорганизмов Центра "Биопнтенерия"; e.cou дф1, дефектный по оксидоредуктззе - из университета г. Турку, Финляндия; s.aonnai i-941-hp-iз, il фаза, аоирулентшй - из лаборатории молекулярной эпидемиологии ММА им.Сеченова; штамма E.coli с плазмвдами ВР4 и R?5i , а также штамми почвешшх бактерий - Enterobacter aglomeran» X, Agroba'ctor i um radiobacter 51, А.radiobacter 9, A.tumefас lena C58. А.tumefaciens 1 DI - ИЗ КОЛЛеКЦКИ Лаборатории Молекулярной

генетики взаимодействия микроорганизмов с растениями Центра "Виоинненерия".

Плазмида с' гонами биолюминесценции морской светящейся бактерии P.leiognathi pBRPL-tac любезно предоставлена Л.Р.Птицыным (НБХ), векторная плазмида рМСШЗОК - Г.Марченко (НИИ генетика). Плазмида рВасаиЗб и рВаояи37, несущие на репликоне pUCi9 фрагменты ДНК в.3ubti11з размером 2 и 3,7 т.п.н., соответственно, -из университета г.Турку, Финляндия.

Условия культивации. В качестве полноценной использовали среду LB, минймальной - М9, для аграбактерий также использовалась среда 523. Штаммы E.coli и s.sonnai культивировали при 37°0, E.agglomerana И агробактерии - При 30°0.

Выделение плазмидной ДНК щз штаммов E.coli. рестрикцию ДНК^_ лигирование,. приготовление компетентных клеток. трансформацию. ä2£MJ2£t£ES3. ДНК аг^розном геле ,.. определение активности

р-галактозидази- осуществляли в соответствии со стандартными методиками (Sambrook, Frttach, Maniatia, ШЗЭ).

Обнаружение плазмид разного молекулярного веса а. различных грамотрицательных бактериях осуществляли по методу Кадо (Kado, Liu, 1981).

Мобилизация плазмиды pBSl6 а разные дтаммы■ В качестве донора в экспериментах по мобилизации плазмиды pBSie в различные штаты использовали E.coli С600 ( pBSlб,RP4 ) И E.coll С600 <pBS16,R75t ), полученные нанесением на фильтры iMUUpore, (Ж, 0,22 ци) смеси ночных бульонных культур донора и реципиента (по юо мкл каждой), инкубацией фильтров на поверхности LB-arapa в течение 2 часов и высевом суспензии фальтра на селективную среду. При мобилизации плазмиды pBS16 В S.sonnai И E.agglomerans ИНКубаЦШ) фильтров на плотной питательной среде проводили в течение б часов. При мобилизации pBSl б в агробактерии на фильтр наносили смесь подрощеншх до титра юв кл/мл культур донора < !50wauH я реципиента (50мкл) с последующей ie-часовой инкубацией фильтров на питательной среде. Выросшие трансконъюганты дважды расчищались на селективной среде.

Стабильность наследования плазмиды pBSie в бактериях определяли при культивации бактерий в. жидких средах - LB и М9 в отсутствие антибиотиков в течение определенного периода времени, делая пересевы в случае полноценной среды каздый день, в минимальной среде ' - через день. Периодически делали высевы на J-B-arap и подсчитывали количество светящихся колоний, выросших на чашках, либо переносили 100-200 колоний на среду с Km.

Образование агробактерцями 3-кетолактозы исследовали по методу, описанному В работе Bornaorte, Do Ley, 1963.

Антагонистическую активность почвенного итамма в отношении аитопатогенных бактерия исследовали в соответствии с методикой, ОПИСаННОЙ Pugsley, Oudega, 1987.

Индукцию образования корончатогалловых опухолей на растении . штаммом агробакхерий выполняли методом, описанным в работе Зоз H.H. с соавторами, 198Б.

Популяции светящихся ■ бактерия g. образцах стерильной и нестерильно^ почвы исследовали после инокуляции ночной культурой штамма через определенные промежутки времени. Образец почвы смешивали с 5 мл 0,9* р-ра NaCl, измеряли лгаяинесценцию надоса-дочной жидкости на бшхеяашвшометрв БХЛ-ОбМ и определяли количество исследуемых бактерий высевом на селективную среду.

Показателя биолюминесценции различных атаимов исследовала в процессе роста жидких культур, периодически отбирая пробы, измеряя в них оптическу» плотность и люминесценции с помощью лшино-метра "emilite".

Инкрустацир семян шташом E.aggloiosrans л ( pESl 6 ) осуществляли, замачивая стерильные семена на 20 мин в ночной культуре штамма, содержащей 2« натриевой соли карбоксиметилцеллшозы, и затем подсушивая их.

Визуализацию биолюминесценции растительного материала црово-¿хлц после процедур« обогащения - помещения частей растений, проростков семян на поверхность селективной среды, подращивания в течение ночи при 30°С, просматривая я фотографируя чашки в темноте.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 2. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ pBSlö. ПЕРЕНОС pBSiö В РАЗНЫЕ тКОТГСЩТИГгаЫЕ . БАКТЕРИИ. ИССЛЕДОВАНИЕ свойств рВ316-С0ДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИИ.

2•1. Конструирование плазмиды pBS 1 б■

Для придания разлотшил бактериям способности к свечении было осуществлено клонирование генов биолюминесценции морской светящейся .бактерии Р.leiognathi на векторе с широким кругом хозяев среди грамотрицательных бактерий. В качества источника lux-генов была использована штзмида pBftPL-tac Штвднн и др., 199Q). размером 10,6 т.п.н., несущая репликон плазмиды рВй322 и регулируемый tac-промотором lux-оперон размером 6,5 т.п.н., состоящий из двух генов lux а и luxb, кодирущих сшпез субъедашиц бактериальной лвдиферазы и трех генов iu*c, luxD, luxE, кодирущих ферменты синтеза альдегидного субстрата (Рис.1). В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pNGUi50К, размером 9,7 'т.п.н., содержащую в своем составе 2/3 ДНК плазмиды RSFioio с отрогам кругом' хозяев среди грамотрицательных бактерий, гены устойчивости к канамицину и ампициллину, полилинкер между lao-промотором и ls.cZ геном (Рио.1). Шщзмида pBRPL-tac. была обработана рестриктазой Said, вырезающей фрагмент ДНК с, lux-генами, и дотирована с рестрицированным по уникальному сайту SaiGi вектором pMGUiзок (Рис.1). На среде с Km после трансформации лигазной смесью была отобрана светящаяся в темноте колония.

Повторные трансформации, анализ плазмздной ДНК из этого клояа рестриктазами SalGI, PstI, Spbl, BaraHI, Hindlll ПОДТВврДИЛИ встраивание участка ДНК с lux-генами в векторную плазмиду pNGMUOK.

Полученная конструкция размером 16,4 т.п.н., обозначенная pßsiб, несет гены трех белков рвшшкации RepA,B,C; область Моь, определяющую способность к мобилизации; участки начала вегетативной репликации (ort) и репликации при конъюгативном переносе (nie); ПЯТЬ lux-генов (luxC.D,А,в,Е), подстроенных под lac-промотор; кодирует устойчивость к Км и Ар. Клетки штамма Е.col1 Сбоо после трансформации данной конструкцией приобретали способность к биолюминесценции: колонии бактерий при .просмотре в темноте обладали ярким зелено-голубым свечением.

Обнаружено, что несмотря .на наличие в плазмиде рВ31б гена lacZ, в штаммах, несущих pBSiö, отсутствовал синтез функционально активной р-галактозидазы: на среде с x-gal и iptg pBsiä-содерекаииЯ штамм с мутацией, в хромосомаяьном гене lacZ образовывал белые колонии. Возможно, вследствие расположения петли терминации транскрипции в lux-фрагменте не происходит эффективной транскрипции гена lacZ, либо образуется гибридный неактивный полипептид из продуктов генов luxE и lacZ.

Максимальный уровень свечения 1 мл культуры штамма E.coli сбоо (pBsie) составлял 1,18 х Ю11 фотонов в сек при ОП культуры 1,6. При добавлении iptg на разных стадиях роста (при 0П=0,2 и 0,7), не наблюдалось значительного увеличения биолюминесценции. Другими исследователями в штаммах, несущих lux-гены под контролем lac-промотора, отмечалось увеличение свечений под влиянием iptg в 40 И даже В 1000 раз (Miyamoto ,1986; Engebrecht,1S85). По-видимому, в lux-фрагменте на плазмвде pBSi6 присутствуют внутренние промоторнне последовательности, препятствующие эффективной регуляции lac -промотором транскрипции lux-гонов. Несмотря на это, уровень свечения штаммов E.coli, несущих плазмиду pBSie, является достаточным для обнаружения единичных колоний бактерий в темноте по признаку свечения и для количественного сравнения показателей биолюминесценции разных штаммов.

2.2. Перенос pBSl б g. бактерии S. sonnet, Е. agglomerates. ft.radlobacter. A.turaefaclena.

Сконструированная плазмида pBsiö сохранила способность векторной плазмвды передаваться в грамотрицательные бактерии путем

ßS я

£ $> В S

SM

у*кгнРо£анне.

£ Л ß S Sh

S Sit

Рис.1. Конструирований плазмиды pBsib. Сайты рестрикции: В - BamHI¡ Е - EcoRI; S - Sali; Sh - Sphl.

Рис.2. Биолюминесценция штаммов, несущих плазмиду pBSlö : l-S.aonnai 1—941 —HP—18; 2-Е.col i 3-E.agglomerana X; 4-A. radlobaotor. 51; 5-A. turne?'

мобилизации с помощью плазмид-помощников incP-i группы несовместимости (RP4 и R751). Частота мобилизации варьировала у исследованных штаммов. С наибольшей частотой плазмвда pBSlö Передавалась В ШТаММЫ Е.agglomérai X - 2 X 10"1 — 3,3 X 10"3 и s.sonnai 1-941-HP-ie - 1,1 X Ю"2. При мобилизации в штамм E.aggiomerans X 90-100* конъвгантов содержали мобилизуемую плазмиду. Плаэмдца-помовдик в 90-98% случаев способствовала

переносу pBSl б В E.agglomorans X, НО ПОрЭНОСЯ В рЗЦШШеНТ СВОЮ

собственную днк. в штамм s.sonne i i-941-hp-ib плазмнда pBSie вводилась также по стандартной методике трансформации для E.coíi. Частота трансформации была порядка 105 трансформантов на 1 мкг илазмидной днк. Мобилизация pßsi6 в агробактерии происходила с низкой частотой - 3,2 х 10"э - 3,5 х 10"6 и тробовала несколько измененных условий эксперимента (Материалы и методы).

2-3.Исследование свойств pBSlб-содержззшх бактерия.

Колонии ШТаММОВ - Представителей семейства Enterobacteriaceao - Е.соIi С600, S.aonnei I-941-HP-Í6, E.aggiomerans X, НвСУПМХ

плазмиду pBSlб, обладали в темноте ярким зеленовато-голубым свечением. Колонии агробактерий посла переноса в них pBSi6

A.radiobacter 51 (Rifr), A.radiobacter 51 (Strr), A.radlobactcr 9, A. turns f ас lena С5в, Л. turaafaciena 1 Dl , при ПрОСМОТрЗ В Т6ЫН0Т0

обладали едва заметишь тусклым свечением.

Исследованы по!сазатели биолкашесценщга растущих культур разных птаммои, пасущих pBsi6 (Рис.2). Наибольший уровень биолюминесценции наблюдался у штамма s.aonnai' 1-941 -НР-1 в, чуть конь.-' ШЙ - у E.coll C6Û0, более НИЗКИЙ у E.agglomorans X И С&'.ЯХЙ низкий - у агробактерий. Ранее отмечалась слабая биолюминесценция некоторых видов агробактерий при введения в них лшидасцент-НОЙ системы Морской бактерии V.fl3cheri (Shaw, Kado, 198S). Низкий уровень активности лшцйферазы светлячков наблюдался в А. tucsf ас lana (Palomares, 198Э). ВОЗМОЖНО, какие-то ОбЩИО DCO-бенности метаболизма. обуславливают низкий уровень экспрессии люминесцентных систем в агробактериях. Яркая лшанесценция ави-рулентного штамма S.sonnei x-941-hp-is после введения pBSie оплывает возможность маркирования бактерий - возбудителей болезней животных и человека.

Штамм E.aggiomerans X ранее был выделен из почвы как антагонист фитопатогенной микрофлоры с широким спектром действия,

обладающий хптиголитической активностью (Chemin, 1995). Посла

введения плазмвды pnsifi данный штамм сохранял способность подавлять рост фитопатогенннх бактерий a.tumef.-seíens idi (Авдиенко П.Д. , ЙОГ РАЛ). ШтаММ A.tumefaciens 1 DI , НвСуЩИЙ pBSl6, ВЫЗШЗЭЛ форлиропапзе корончатогалловнх опухолей на тест-растении (Авдиенко И.Д., ЙОГ РАН), Вило подтворвдапо злоягрофоретпчески сохранение ¡»BS15 в штамме, выделенном из 3-недельнной опухоли каланхоэ. Все вида агробактерий после введения pBsi6 сохраняли спо-лплстп^тт-. про.'цтгт?^^*;?!. 3-кстол2кгс~:\ ¿2i3t.: обраго:,;, Фушшое рззпшгс ".пизсцептпоЁ системы, дополнительный энергетические затраты клетки-хозяина па биолтаинесценцнв не повлияли на свойства почвенных бактерий.

Стабильность наследования плазшды pbsiô в отсутствие селекция при шогодневной культивации отличалась в разных бактериях. Наибольшая сохраняемость pbsiô наблвдалась в штамме

Е,agglomérant I - 100* П0СЛ6 6 ДНеВНОЙ КуЛЬТИВаЦИИ В П0ЛН0Ц6НК0Й

и гетпглпдъттсЯ прядях, Пгшчэнзв стабильно pesie поддеркив&яаеъ в тт&чмах е.coi; сбоо и g.sonnai i-9<u-hp~ig - на 4-й донь культивации в полноценной среде pBsió сохранялась у 4% и 2« клеток, соотвотствогаю. При росте этих яе штаммов в минимальной среде на 6-й дань 100» и 89к клеток, соответствешго, сохранят pssig. Встраивание крупного фрагмента ДНК, несущего lux-гены (6,5 т.п.п.) в рзпликон плазмиды rsfioio может приводить к ограничении круга бактериальных хозяев, что проявляется в нестабильности наследования плавмиды (Цыганков и др., 1984).

Глава 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАРКИРОВАННОГО ШОШЯШЕСШШШИ ГЕНАМИ ПД'АША е.AGGLOMERANT X В ПОЧВЕННЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ.

3.1. Исследование выживаемости штамма e.aqgiomerana л (pBSlá) ц_ сохраняемости в нем биолюминесиентноя плазмиды в образцах почвы-Яркосветящийся штамм E.agglomenans X (рВ51б), сохранивший бйошггролхфулпув активность, был использован в почвенных п растительных экспериментах. Исследовали в динамике количество 'светящихся бдктвряз E.àggiàmérâne х (pesié) и показатели биолю-вдцесцепций в образцах почвы, анокулирсванных данным штаммом, хранившихся в комнатных условиях (Авдиенко И.Д., ЙОГ. РАН). О" увеличением срока хранения показатели биолшинесценцш и количество высеваемых pbsiе-содержащих бактерий уменьшались (Рис.3). При графическом отображении этих данных отмечается сходство в

характере обеих кривых (Рис.3). Основываясь на этих результатах и на литературных данных, можно предположить, что по показателям лдаинометрии может осуществляться приблизительая оценка динамики популяции светящихся бактерий в образцах почвы, при подборе условий эксперимента и достаточной чувствительности прибора. Оценка количества бактерий в образцах почвы по данным лшиномет-рии признана исследователями неточным методом из-за зависимости продукция света от физиологического состояния бактерий (Р га V.!, 1990).

ямичта о

/О* л*

tu*

■л/аминсеи&щия

/С

10у

к?

20 28 30

35 40

Рис.3. Динамика популяции бактерий Е.адд1от»гап& X <рвз1 6) (1) и показателей биолшинесценции (2) в образцах нестерильной сухой почвы.

Исследовали выживаемость штамма e.aggiomerans х н сохраняемость в нем плазмиды p&si6 в течение нескольких месяцев в образцах стерильной и нестерильной почвы в комнатных условиях. Популяции бактерий постепенно уменьшались, на протяжении всего периода исследования в образцах нестерильной почвы количество исследуемых бактерий было на 2-3 порядка ниже, чем в стерильной почве. Динамика сохранения плазмиды pesie в штамме e.aggiomerans х отличалась в стерильной и нестерильной почве. В стерильной почве количество р bs i б- содержащих бактерий падало постепенно, на 20-й день составляло Збя, на 38-й день - 4*. В нестерильной почве в течение 20 дней 100* бактерий E.aggiomerans X СОХраНЯЛИ pBsí6, на 25-й день - 84*, затем количество рвs16-содержащих бактерий резко падало и на 38-й день составляло Зх.

о

10

3.2. Мониторинг биолвминесцентного штамма Е.асс1огг.егапз

{рВБ16 > ца рророаенцы^ семенах а. на 3-недельных проростках огурцов. выращенных а. климакамеое.

Бколжштесцентная метка штамма Е.ас^отегапэ х позволила осуществить мониторинг маркированных бактерий на растениях, развиватащгхся из инкрустированных исследуемым штаммом семян. Биолшинесценцив растительного материала обнаруживали после обогащения - помещения частей растений на поверхность селективной питательной среды и подращивания в благоприятных для исследуемого штамма условиях. Семена рапса, горчицы, гороха, пелюшки, кормовых бобов, люцерны, клевера, обрабатывали светящейся штаммом, через разные промежутки Бремени проращивали их и оценивали визуально интенсивность биолюминесценции проростков (Авдиенко И.Д., ЙОГ РАН). С увеличением срока хранения семян наблюдалось уменьшение интенсивности свечения проростков. Интенсивная колонизация проростков

баодалинесцентнымя бактериями наблюдалась у семян хранившихся в комнатных условиях не более 2-х недель.

Показано равномерное распределение биолшинесцентяого штамма Е.а8д1отвгапз X (рВ31б 1 на всех органах 3-недельных проростков огурцов, Выращенных из инкрустированных семян на столбике агара в климакамере (Рис.4 А,Б). Биолюминесценция проростшв обнаруживалась такие при экспозиции растений на рентгеновскую пленку»

3.3. Мониторинг биолюминесцентного штамма Е.а^1оюегзпз & (рВЗ! б ) в процессе роста растения в открытом грунте

Исследована в динамике биолюминесценция растений овощных культур - редиса, огурцов, петрушки, лука, сельдерея, выращиваемых яз инкрустированных светящимся штаммом семян в открытом грунте. Люминесцентные бактерии обнаруживались на всех частях З-недельшх растений огурцов, петрушки, лука, сельдерея, в ризосфере редиса (Рис.4 В,Г). Интенсивность биолюминесценции разных растений отличалась» что, по-вадимому, свидетельствует о различил колонизирупцей способности штамма на разных растениях. Детально исследовали биолшшесценцшз ризосфер редиса и огурцов в течение 4-5 недель после посева. Количество светящихся бактерий в ризосфере по мере роста растений постепенно уменьшалось, как вследствие снижения общего количества, так и вследствие потери плазмиды рВЗ!б. Наилучшая визуализация колонизирующих ризосферу

бактерий наблюдалась в течение 3 - 3,5 недель после посева семян. Отмечалась преимущественная локализация люминесцентных бактерий на периферии' корневой системы. На приведенных фотографиях (Рис.4 В,Г) показана биолюминесценция ризосферы 24-дневного растения редиса, количество бактерий Е-а^ошегапэ х <рВ31б) составляло 2,4 х Ю5 на грамм корня, 90-Э5г исследуемых бактерий

Рис.4. Биолюминесценция растений выращенных да инкрустированных штаммом Е.аее1отагапз Х <рВ31б) семян: 3-нбд0лыюго проростка огурца (А,Б), выращенного в климакаморо и 24-дневного растопил редиса (В,Г) выращенного в условиях открытого грунта. А,В- чашки сфотографированы при освещения; Б,Г- в темноте.

содержали плазмиду pBSiö. К концу 5-й недели после посева в ризосфере редиса только клеток штамма содержали pESlь.

Таким образом, представляется возможным использовать введение биолгагянесценткой плазмидн в разные штаг,таг для исследования лх способности колонизировать растения я для ртзрзботхот практических рекомендаций по жяюльзовапшо' бактериальных средств завиты растений.

Гжн» i. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШШЭДШВДШ! 11МЗМЩ5Н pBS16 ZZi ::С;ШТОРШГЛ АКТИВНОСТИ -У/Л-ОКСйДОРЕДУкТАЗЫ ® п'^И-^ЛЫШл КЛИКАХ.

4.1 ■ Исспд-Оони^« 0и^"^;.,инесцениин итамма Е.со, 1.1, ДФ1._ дефектного ..n üjin-i'.Kíi *мН-оксидоредуктазы •

ФШ-оксццоредуктаза катализирует реагадда восстановления <ШН в CTffl,, который используется в реакции бполшшесцошрй.-Дефектный по Ш!-сксддородагазв тгамм е.coli дм, с остаточков 1-2% оксидоредуктазной аятзаностьа, бнл трир.; jn-, »т.-фивш пяаегшой pBSlö. Кодоштз, трапсфор^нгг-г- --¡vr:^' a.;auu

разЛ5ГЕГ,ИГЛ ВИЗуаЯЧВЗ СIi.':,. "Г : - -'II.

pacrypjsü цухь'гур! ••.*"■''i 'í-"',':. I• ' i.;'- .X

" n ;V • я гуся*«*. ti> ¡•■ciutrai.-.oy. a.-n ¡тнадялщп рассева*

• ir^n: <n'pfí!"rn.;ro :л:ршы Лю:.тш<зсцо!п>"~, .;¡,.fü.v;.>

:r-' »^w.wu.-í.i лпш»о!'& «ärraföia составляв i;,.-* / ic" до « f'nY^s/ocst /ОП в 1 ¡aя гУЛьщ-.г ¡.ive. >¡, r>.c uj«io®ratanocb к шяй0ШШ.т4 дадазтъягнипа ¿ouo (pBSiei (Рис.2).

í ...2... Гспозьзоааиие, pJÜlá. &M опосредованно""; ч^адгдопония активности ФМН-оксияорелуктпзц р. ДД_а. несудам в

составе плазмид Фрагменты' /Щ B.a»htiUa._

Штамм е. sol i д-?1 uta тршефэрыаройвй шюэпдосш! рВасаиЗб а рГЪ сг:и37, ПЗСУШСТТЯ ЦЗ ВбКТОрй pUC19 фрэгМЗНТН ДМК B.3Ubtllla

Р"П"еро?.! 2 T.Tf.Tt. ч 3,7 т.п.и. соотаетстввйно. Полученные шаз-тдгтно птак.щ были вторично трансформированы алазмядой рВ31б. Hamme двух алазгазд в штаммах подтверадалось злектрсфоретическя. Ира просмотре в темноте капонш итакда»

. E.coIi ДФ1 {pBSiб, рВасзиЗб) обладали ярким свечением, а колонии штамма E.coli ДФ1 (pßsi б, Рвасзи37) тусклым. Показатели биолюминесценции культуры штамма Е.со И ДФ1 (pBS16, рВасзиЗб) были в 100-200 раз вше показателей лшинесценциа штаммов E.coli ДФ1 (pBSie, pBacsu37) И E.coli ДФ1 (pBSlö) (Рис.5). Таким образом, белок в 20 кЦ, кодируемый фрагментом ДНК B.subtilis размером 2 т.п.н. в составе плазмиды pBacsu36, обладал активностью ФМН-

Рис.5. Биолтаинесценция штаммов E.coli ДФ1, несущи* разный набор пдазмид: 1- е.coli ДФ1 (pBSie}{ г-Ё.соИ ДФ1 (pBSlöi ярКОСВетЯЩЯЙСЯ; 3- E.coli ДФ1 (pBSl6,рВасзиЗб )i 4- E.coli ДФ1 . (pBSlö , pBacsu37 ).

оксидоредуктазы и комплементировал дефект исходного штамма. .Уровень биолюминесценции комплементированного штамма E.coli ДФ1 (рв316, рвасзизб) превышал люминесценцию штамма E.coli ДФ1 iPBSi6) с восстановленной функцией оксидоредуктазы и был в 1,4-4 раза выше (при 0П культуры 0,6-1,4) люминесценции штамма E.coli сьоо (PBSi6(. Можно предположить, что ФМН-оксидоредуктаза, кодируемая фрагментом ДНК B.subtilis в составе рВасзиЗб, обладает большей активностью, чем аналогичный фермент E.coli и более эффективно катализирует реакцию образования ФМННг, являвшегося субстратом реакции биолюминесценции. Таким образом, используя дефектный по оксвдоредуктазе штамм и шгазмиду pBSiö, измеряя в динамике количество света, образующееся в культуре, мокно опосредованно исследовать активность в живых бактериальных

клетках фермента ©Ш-оксвдоредуктазн и осуществлять скрининг фрагментов ДНК в составе плазмвд на наличие оксидоредуктазной. активности.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструированная гогазмяда рВЭ15, ттездая п споен составе опероп биолюминесценции морской светящейся бактерии р. иходп^м и обладающая способностьи псрадппатъся з грзмотря-цатолыгоо бактерии с помощью конъгогативних планид н чти, может быть использована для придания разнообразным бактериям

отдатц м«г.Ийг>НОТО СВОЙСИЗа - циХСбПССТП Г .

2. Экспрессия биолшинасцейцсш, появлявшаяся прэ введении плазмидн рВ31б, в. исследованных грамотрицательных бактериях различна. Наиболее ярки?,! свечением обладают представители семейства Еп*егоЬае*аг1асеаа, слабая бИОЛЮМИНеСЦвНЦИЯ ОТМвЧвНа у штаммов агробактерий.

3. Свойства почвенпнх бактерий пра фугищцошрованнн в них бтточтгчиттеспетщтой системы ло пгмелягхел, з частпэст;:, сохраняются пчтагоштстическяя активность гггамгла г.азд1отегаг.5 х <Рзз1б> в отяогоеиии флтопатогевшк бактерий, способность штамма

501 индуцировать формирование корончато-

гаялохзн-Т опухолпй па растениях, продукция агробактериями 3-катаяактозы.

4. Введете бяолшинесцептной плазмады в биоконтролирующий

ЯТвКЧ е.-1дд10(ларап1 X ПОЗВОЛПвТ В ГОСЛвДУВДЭМ ОСУЩЕСТВЛЯТЬ ШПЗ-

торкпг светящихся бокторий в процессе развития растений из обработанных данным штаммом семян, как в лабораторных, так и в поле-выя условиях. Визуальная оценка интенсивности биолюминесценции обоГ9!",9йного растительного материала дает представление о степени колонизации ризосферы люминесцентными бактериями.

5. Созданная генетическая конструкция рБ5к>, несущая гены биолюминесценции, может использоваться в качестве зонда для опосредованного мониторинга активности фермента ФМН-оксидоредуктазы в бактериальных клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование биолюминесцентной метки для изучения почвенных бактерий - антагонистов фитопатогенной микрофлоры / Бурмакина С.В.. Авдиенко И.Д.', Исмаилов 3\Ф. и др. // Биотехнология.-1993.-И.9.-С.35-38.

2. Маркирование штаммов почвенных бактерий с помощью генов биолюминесценции РЬо1оЬас1ег1шп ^ое^Ы / Бурмакина С.В.. Авдиенко И.Д., Исмаилов З.Ф.° и др. .// Тезисы догаадов и Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений".-18-20 мая 1993 Г, Г.ПУЩИН0.-С.73.

• 3. Использование биолшинесцентной метки для изучения бактерий - антагонистов фитопатогенной микрофлоры / Авдиенко И.Д., Мирошникова Л.К., Бурмакина С.Ц. и др. // Тезисы докладов II Российского симпозиума '"Новые методы биотехнологии растений".-18-20 мая 1993 г, г.Пущнно.-С.69.

4. Использование биолюминесцентной метки для исследования миграции микроорганизмов в ризосфере растений / Авдиенко И.Д., Бурмакина С-В-, Исмаилов З.Ф. и др. // Тезисы докладов конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду".-17-19 мая 1994 Г, Г.Москва.-С.5-6.

Бурмакина C.B.

"СИС iE МЛ МОНИТОРИНГА МИКРООРГАНИЗМОВ на основе ГЕНОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ".

Осуществлено конструирование плазмиды pBGiO, «зсущей гены биолюминесценции морской светящейся бактерии Photobacterium leiognathi, способной. я переносу з различные грамотрицательныв бактерии. Присутствие в бактериальных клетках pBS16 придаст игл сяосо^даость ©бра2С£ь;ггтъ таяиты света и, таким образен, бактерии могут быть легко идентифицированы по признаку свечения а темноте. Уровень биолюминесценции после введения плазглиды pBS16 в разных грстетрицатолыгых бактёриях различав гея. Крайне слабой 5иог>!окин<?сц®ицией обладали представители рода Agrobaoforium. Свойства почоемпых бактерий при сЬу»|К!1.МОМИрОВЯН!«И с них биолюминзецонтной системы не изменялись.

Показана возможность мониторинга .маркированного биолгоминвецентной ллазмидой штамма Enterobacter agglomerans X п ггачвйнно-раститвльных экспериментах. Продемонстрировано использования плазмиды pBS16 для исследования- активности фермента ФМН-оксидородуктаза в бактериальных клетках без их разрушения.

Bourmakina S.V.

V

"MICROORGANISMS MONITORING SYSTEM BASED ON BIOLUMINESCENCE GENES."

The plasmid pBS16 carrying genes of marine bioluminescent bacteria Photobacterium leiognathi capable of being transferred into different Gram-negativfc bacteria ha.s been constructed. As a result of the pBS16 plasmid presence a light production appears in bacterial cells what allows to identify bacterial colonies in darkness. The biolurninescence levels were different in the Gram-negative bacteria containing the pBS16 plasmid. The most weak light production was observed in the Agrobacterium strains. The biolumin&scence system functioning in soil bacteria did not change their properties.

It has been shown the monitoring possibility of the strain Enterobacter agglomerans X containing pBS16 plasmid at soil-plant experiments. It has. been demonstrated the pBS16 plasmid utilization for investigations on the FMN-oxidorediictase enzyme activity in bacterial cells without their distruction.