Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синаптонемный комплекс как индикатор хромосомной изменчивости

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Коломией, Оксана Леонидовна, Москва

/

у

Российская Академия Наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова

СИНАПТОНЕМНЫЙ КОМПЛЕКС КАК ИНДИКАТОР ХРОМОСОМНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ

Генетика 03.00.15

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва

1998

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор М.М. Асланян

Биологический факультет МГУ им.М.В. Ломоносова г.Москва

ч

доктор биологических наук,

/ ^" ^ ' И.Н. Голубовская

'"X. С^ 1 — Всероссийский НИИ

^ - ^ - растениеводства РАХН

г.Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор В.Г. Митрофанов Институт биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова г.Москва

Ведущее учреждение: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится " у " /У/Л^Т/? 1998 г. на У/Т7/&

заседании диссертационного Совета Д 002.49.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: Москва, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН

Диссертация в форме научного доклада разослана " 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат биологических наук Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синалсис гомологичных хромосом — ключевое событие профазы I мейоза, обеспечивающее кроссинговер и формирование хиазм. Не менее важным событием профазы 1 мейоза явля-

ртла ТТАГ>ИИ0|ТГГМР уплитллг* — ппптталл ииллатптто xivttott т> imnnT-TAUTQ-

V Л Ч//1 ^WXlXXMliVllV rt^VAUWVAU llp'J^VVVj AJXJ. VWlÚfillU JJIWIU/J, IWvjyjlVlllW

цию, сегрегацию гомологов и последующее сбалансированное распределение генетического материала в гаметах.

Синапсис, рекомбинация и десинаисис хромосом — процессы, связанные с функционированием синаптонемного комплекса (СК) — специфической структуры, располагающейся между двумя гомологичными хромосомами в профазе I мейоза.

СК был открыт Moses (1956). Первоначально методом исследования СК был электронно-микроскопический анализ и реконструкция ультратонких срезов, выявивший больше сходства, чем различий, в структуре СК у представителей весьма отдаленных систематических групп. СК обнаружены у представителей всех царств зукариот: животных, растений и грибов (Moses, 1958; von Wettsíein et al., 1984). Эволюционная консервативность СК подтверждена данными биохимических и им-муноцитохимических исследований (Moens, 1992; Sato et. al., 1995).

В совокупности накопленные сведения позволяют рассматривать СК как древнейшее прогрессивное морфофизиологическое приобретение, возникшее на заре эволюции зукариот и сохранившее свое значение во всех систематических группах зукариот от простейших, появившихся в протерозое, до современных форм млекопитающих, появившихся в кайнозое.

В 1973 г. Counce & Meyer предложили новый метод анализа мейоти-ческих хромосом в профазе I мейоза, заключающийся в распластывании мейотических хромосом на поверхности гипотонического раствора • с последующим контрастированием и анализом поведения осевых элементов хромосом и СК. СК является своеобразным скелетом мейоти-ческого бивалента, поэтому конфигурация осевых элементов, приобретающих роль боковых элементов в структуре СК, служит парадигмой поведения гомологов'*на стадии профазы I мейоза. На основе метода, сложенного Counce & Meyer, удается проследить все детали фор-'рования осевых элементов, начало их физического сближения и си-сиса на стадии зиготены, синапсис и его коррекцию у гетерозигот ? хромосомным перестройкам на стадии пахитены и динамику деси-усиса хромосом на стадии диплотены.

Структурные изменения хромосом играют важную роль в мёйоти-•<их и постмейотических процессах. Многочисленные данные свиде-твуют о том, что события, определяющие эволюцию кариотипа, ты с презиготической селекцией (Демин и др., 1978). На основе за СК в распластанных препаратах были сделаны фундаменталь-"крытия современной цитогенетики: открыто явление синапти-

ческой пригонки у гетерозигот по инверсиям и дупликациям (Moses & Poorman, 1984) и явление ареста и селекции клеток на стадии пахите-ны (Forejt et al., 1981), вскрыты причины нарушения гаметогенеза на стадии профазы I у анеуплоидов и отдаленных гибридов. Получены данные, позволяющие прогнозировать влияние гетерозиготности по хро-

млрпмным ттр.пргтппйнгам вгя Л1^птиттт.млгтч. nf.irnsc.tra vühhtuuv тл

*----•. ~, - —. r ~--------------------М--г„. ~ —------- — —, ....... i- ^

тений (Navarro et al., 1981; Chandley, 1982; Федотова и др., 1991), доказана зависимость интерференции кроссинговера от непрерывности СК в биваленте (Moeiis, 1985; Бородин. 1992; Горлов. 1993; Maguire. 1996).

Формирование СК находится под контролем генов мейоза. Анализ СК растений позволил во многих случаях точно идентифицировать истинную природу мутаций, имеющих одинаковый или близкий фенотипический эффект (Федотова, 1988; Гребенникова, Голубовская, 1991 и др.).

В последние годы возрос интерес к биохимии и молекулярной организации С К (Rose et al., 1990; Dobson et al., 1994; Mocns, 1994;* Heyting, 1996). Однако при всем обилии данных о молекулярной организации СК вопрос о закономерностях реорганизации и роли отдельных структурных компонентов СК в процессе синапсиса хромосом остается неясным, а судьба осевых элементов хромосом на стадии поздней диплотены практически не обсуждалась: признанным оставалось представление об их деструкции (Holm, 1986).

Успехи, достигнутые цитогенетикой на основе анализа СК, свидетельствуют о перспективности использования этого метода для изучения хромосомной изменчивости, механизмов дифференциального воспроизведения генотипов и эволюции кариотипов. Этот метод нашел применение для решения актуальных проблем генетической безопасности (Allen et al., 1982).

Описанный круг проблем определил цели и задачи настоящей работы.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследование закономерностей синапсиса хромосом в профазе 1 мейоза и выявление таких деталей структуры и поведения осевых элементов хромосом и СК, которые могут служить маркерами хромосомной изменчивости и свидетельствовать о презиготической селекции и нарушении фертильности. Кроме того, были проведены иммуноцито-химкческие исследования, целью которых было выяснение вопросов о структурной организации С К, динамике изменения структурных компонентов СК в течение профазы I мейоза и эволюционной консервативности структурн ых компонентов С К.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем. 1. Исследовать закономерности синапсиса хромосом у гетерозигот по хромосомным транслокациям, в том числе у гетерозигот по микроаберрациям.

2. Проанализировать взаимосвязи между изменчивостью хромосом, особенностями синапсиса хромосом, плодовитостью и процессами видообразования на основе исследования СК у гибридов разно-хромосомных форм слепушонок вида Ei'lobius tancrei рода Ellobius (Rodentia, Mammalia).

3. Провести сравнительный анализ структуры и поведения СК половых хромосом в профазе I мейоза у представителей трех видов слепушонок рода Ellobius, проанализировать возможные пути эволюции ТТОТТОВЬПГ ХПОМОСОМ В Г7ТЮЛÎ1, Л,'! \ этого ооца.

4. Исследовать закономерности формирования осевых элементов и СК В-хромосом к поовести анализ озспределения В-хромосом на разных стадиях профазы I мейоза у лесной мыши Apodemus peninsulae (Muridae, Rodentia).

5. Исследовать действие различных мутагенных факторов, в том числе химических мутагенов, являющихся ингибиторами структурно-функциональных компонентов СК и хроматина, на структуру хромосом и СК.

6. Проанализировать эффективность выявления хромосомных аберраций с помощью электронно-микроскопического анализа СК на стадиях зиготены-диплотены у самцов домовой мыши (Mus muscuhis), подверженных действию радиационного облучения, и сравнить их с возможностями анализа хромосомных аберраций на стадиях диа-кинеза-метафазы I.

7. Исследовать особенности формирования СК у мужчин с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза неясной этиологии, установить стадию и, по возможности, причины нарушения сперматогенеза.

В. Проанализировать закономерности поведения осевых элементов хромосом и СК у асинаптических и десинаптических мутантов ржи Secale cereaîe.

9. Исследовать формирование аутоиммунных антител против антигенов структурных компонентов СК у интактных самцов мыши и после сингенной иммунизации самцов мыши антигенами СК.

10. Исследовать распределение антигенов RecA-подобных белков в ядрах сперматоцитов у самцов млекопитающих, принадлежащих к разным таксономическим группам млекопитающих.

Научная новизна. Получены и интерпретированы новые данные о закономерностях синапсиса хромосом в мейозе. Выявлена динамика становления структуры СК-мультивалентов у грызунов, гетерозиготных по робертсоновским, реципрокным и нереципрокным транслокациям; выявлена задержка формирования осевого элемента хромосом в зоне транслокаций на стадиях зиготены и ранней пахитены, приводящая к отставанию синапсиса хромосом в районах транслокаций и фор-

мированию псевдобивалентов и тривалентов. Описаны детали реституции транспонированных хромосом на стадии поздней пахитены.

Впервые описана картина синапсиса хромосом у гибридов разно-хромосомных форм слепушонок Е. 1апст, гетерозиготных по разному числу Шз-метацентриков. Впервые обнаружено явление формирования цепочек СК-тривалентов, соединенных друг с другом на счет гетероло-гичного синапсиса между короткими (С-гетерохроматиновыми) плечами акроцентриков.

^дЗу'^Нйд ^хруГчлууи ¿1 ^ИИсиГС!!^ л]Х5МиСиГ*1 у С и Г»1аДТрСл шш^й

слепушонок рода ЕИоЫш, характеризующегося уникальной дивергенцией половых хромосом: Е. /шсосарПт (XX — у самок, ХУ — у самцов), Е. Ыезсет (КО — у обоих полов) и Е. ¡апсш (XX — у обоих полов). Особенности синапсиса половых хромосом позволили предположить, что дивергенция хромосомного механизма определения пола берет качало от общего предка рода с обычными для грызунов формулами (XX — у самок, ХУ — у самцов).

Обнаружено, что уникальные половые хромосомы (XX) у самцов Е. 1апсге1 формируют в профазе I мейоза нетипичный для самцов других видов млекопитающих закрытый половой бивалент. Сделано заключение, что гомозиготность дистальных районов XX хромосом, приводящая к формированию закрытого полового бивалента, служит эволюци-онно-адаптивным приспособлением, которое способствует прохождению профазы 1 мейоза у гетерозигот по множественным КЬ-трансло-кациям у Е. ¡апсгек поддержание в природе робертсоновского веера с 2п = 54 до 2п = 32; скрещивание между собой отдаленных форм этого надвида и может служить объяснением неучастия половых хромосом в формировании ЯЬ-метацентриков.

Установлено, что В-хромосомы у самцов восточно-азиатской мыши Аробетш решши1ае на стадии пахитены формируют уни-, би- и муль-тиваленты, которые ассоциируют с половым (Х,У) бивалентом, что, однако, не препятствует формированию полового пузырька и не вызывает ареста клеток на стадии пахитены. Впервые описано явление увеличения числа В-хромосом в процессе профазы I мейоза.

При анализе СК у стерильных самцов мышей, гетерозиготных по микроаберрациям в Т-локусе хромосомы 17 пары, показана неслучайность ассоциации аутосомного бивалента с ХУ-бивалентом и арест сперматогенеза на стадии пахитены.

Впервые выявлена модификация боковых элементов СК на стадии диплотены: показано, что в участках, визуализированных до сих пор как бреши в структуре СК, происходит трансформация боковых элементов в длинные тонкие осевые элементы, поддающиеся контрастированию только кислым раствором Аз>ТО3 и, формирующие в материнских клетках пыльцы спирали, а в сперматоцитах мыши вытянутые волнистые оси.

Впервые описан блок десинапсиса хромосом у человека. Блок деси-напсиса хромосом экспериментально воспроизведен у самцов мышей путем введения им ингибиторов ДНК-топоизомеразы II.

На основании собственных иммуноцитохимических исследований СК на разных стадиях профазы I мейоза и данных литературы сделано ПрСДГЗОЛОЖСКЙС О МОДйфйКйЦЙК МОЛб^ЛЯрНОЙ ОрГйНйЗиЦИК СК к хроматина при переходе клеток от стадии пахитен ы к стадии диплотены. В частности, нами впервые выявлено уменьшение 11есА-подобных антигене р. в яцоах от стадии летттотекы к стадии пяхитены и отсутствие их на стадии диплотены.

Практическая ценность работы. Разработаны критерии идентификаций структурных перестроек хромосом на ранних стадиях профазы 1 мейоза на основе анализа конфигурации СК и возможного вклада аберрантных конфигураций СК и их ассоциаций с половым (XV) бивалентом в нарушение фертильности самцов животных.

Метод анализа СК использован для диагностики причин мужского бесплодия. При исследовании СК мужчин с нарушением сперматогенеза и нормальным кариотипом (46 ХУ) у разных пациентов обнаружено блокирование мейоза на разных стадиях: от лептотены до диплотены. Показана связь между развитием аутоиммунного процесса и нарушением синапсиса хромосом. Описанные случаи позволяют предполагать наличие асинаптической и десинаптической мутаций, а также микроаберраций в генотипах отдельных пациентов.

Показано, что эффективность метода выявления структурных перестроек хромосом на основе СК в 2 и более раз превосходит эффективность анализа перестроек на стадиях диакинеза-метафазы Г. Проанализированы причины различий результатов, полученных этими методами.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983, 1985, 1987, 1990), II Международном конгрессе по клеточной биологии (Токио, 1984), II Европейском конгрессе по клеточной биохимии (Будапешт, 1986), IV Всесоюзном конгрессе Териологического общества (Москва, 1986), V съезде ВОГИС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987), XVI Международном генетическом конгрессе (Торонто, 1988), Всесоюзном совещании по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990), на конференции сексопатологов (Харьков, 1990), IV Всесоюзном съезде урологов (Москва, 1990), III Съезде Всесоюзного общества медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), Конференции по радиационной генетике (Обнинск, 1990), Международном симпозиуме "Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологаческих исследованиях (Москва, 1992), Всероссийской конференции "Функциональная морфология клетки" (Санкт-Петербург, 1993, 1996), на семинарах Института общей генетики РАН.

Объем и структура работы. В представляемом докладе обобщены данные 49 работ, опубликованных в журналах Доклады АН СССР, Генетика, Онтогенез, Цитология, Известия АН MCCP, Chromosoma, Cytogenetics and Ceil Genetics, Mutation Research, Genetica (Netherlands), Genome, Theoretical and Applied Genetics и других отечественных и зарубежных изданиях в 1983 1997 гг. В тексте доклада ссылки на данные из списка опубликованных работ обозначены цифрами в косых скобках.

Все экспериментальные данные, касающиеся электронно-микроскопического анализа О К, с вето - и электронно-микроскопического км-муноцитохимического анализа антигенов СК, получены автором лично. Скрещивания животных, анализ их плодовитости и исследование хромосом на стадии диакинеза-метафазы I животных проведены соавторами исследований.

Автор выражает глубокую благодарность соавторам исследований и исследователям, принимавшим участие в обсуждении полученных результатов и предоставивших материал для исследования: Ю.Ф. Богданову, Н.Н. Воронцову, Е.Я. Гречаниной, Л.Ф.Курило, Е.А. Ляпуновой, Ю.М. Борисову, М.Д. Померанцевой, В.А. Шевченко, И.Ю. Баклушин-ской, Т.Э. Борбйеву, Г.Г. Горач, С.Я. Дадашеву, Е.И. Каликинской, О.И. Карповой, Е.Ф. Лосевой,Т.Ф. Мазуровой, Т.В. Пащенко, Л.Д. Сафроно-вой, Т.В. Сухачевой, Ю.С. Федотовой.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1. Материалом электронно-микроскопического исследования СК служили:

• самцы слепушонок Е. fuscocapillus; Е. talpinus; Е. lutescens;

• самцы разнохромосомных форм слепушонок Е. tancrei с 2п=54 и

2п—34 к Fj (2п=44) от скрещивания этих форм;

• самцы с 2п = 49 F, гибриды от скрещивания форм 2n=50 х 2п=48;

• самцы Fj от скрещивания слепушонок, отличающихся по одной паре

хромосом: с 2п=51 от скрещивания Е. alaicus 2n=52 х 2n=50 Е. tancrei и гибридов Fj 211=33 от скрещивания двух форм Е. tancrei 2n=34 X 2п=32;

• девять гибридов F2 от свободного скрещивания внутри Fp а также в

результате возвратного скрещивания гибридов Ft с родительскими формами. Все представители рода Ellobius отловлены из природных популяций, скрещены, и кариотипированы проф. Н. Н. Воронцовым, к.б.н. ЕА. Ляпуновой и к.б.н. И.Ю. Баклушинской (ИБР РАН);

• самцы восточно-азиатской мыши, отловленные в 15 км к с.-з. от Крас-

ноярска (самцы № 1-6), и на Алтае пос. Артыбаш (самцы № 7, 8). Животные предоставлены для исследования и кариотипированы д .б.н. Ю.М. Борисовым (НПО "Енисей", Красноярск) и к.б.н. Т.Э. Борби-евым.

• самцы мыши, дигетерозиготные по мутациям в Т-локусе хромосомы

17 пары г5/^"'', гРз-уг18), предоставленные для исследова-

ния к.б.н. Л.Д. Сафроновой (ИПЭЭ РАН).

• самцы лабораторной мыши, экспонированные в период эмбриогенеза

в районе ЧАЭС в течение 22 сут. (с 9.У1.-1.УИ.1988) и самцы мыши из потомства Рр по�