Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Селекционное и генетическое изучение устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Селекционное и генетическое изучение устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу"

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи ИГНАТОВ Александр Николаевич

УДК 635.34:632.938:631.52

СЕЛЕКЦИОННОЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ К СОСУДИСТОМУ БАКТЕРИОЗУ

06.01.05 — селекция и семеноводство, 06.01.11 — защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1992

Диссертация выполнена в отделе иммунитета и защит: растений Всероссийского ордена Трудового Красного Знамен научно-исследовательского института селекции и семеноводе-ва овощных культур в 1989—1992 гг.

Научный руководитель — доктор сельскохозяйственны наук, старший научный сотрудник А. Н. Самохвалов.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН Респуб лики Молдова, доктор сельскохозяйственных наук, профессо Н. Н. Балашова, кандидат биологических наук Ф. С. Джг лилов.

Ведущее учреждение—Овощная'станция им. Э^елыитейн Московской сельокохозяйственной академии им. К. А. Тим1 >рязева. * ~

Защита диссертации состоится » . . .

1992 года в « » часов на заседании специализированног совета К 120.89.01 при Всероссийском научно-исследовател! ском институте селекции и семеноводства овощных культу по адресу: 143080, Московская область, Одинцовский р-1 п/о Лесной городок, п. ВНИИССОК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инст!

Автореферат разослан »

»

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат сельскохозяйственных наук

А. С. Агапсв

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ

Капуста - одна из главных овощных культур России. К 1985 г. она занимала 302 площадей (Матвеева, 1984), что составляет около 60 тыс.га, в Нечерноземье эта доля доходит до 55-602 от общей площади посевов овощных (Федорова, 1981).

Все виды капустн в течение вегетационного периода пора«а-втся болезнями и.вредителями, в результате чего потери урощая могут достигать более 702 (Антонов, 1973; Дорожкин, Куневич, 1980; Тивари, 1989). К основным вредоносным болезням капустн относится сосудистый.бактериоз, заболеваемость которым усилилась в последние года из-за концентрации площадей под этой культурой. С момента описания болезни в 1891 году не было предло«ено нн одного радикального метода борьбы с сосудистым бактериозом, за исключением гидротермической обработки семян и санитарных нвр. (Йи53е1, 1897: Ш11авз, 1980: 5ЬекЬауаЬ а!.. 1982). Поэтомуособое значение приобретает селекция капуста на устойчивость и поиск методов борьбы, максимально использующих генетический потенциал растений.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью нашей работа было изучить особенности реакции устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу, учи-тнвая характер наслодобания этого признака у селекционных линий и гибридов и возмояность иммунизации растений против заболевания.

Для достиаения поставленной цели предполагалось ревить следующие задачи:

-вазвить особенности внутривидовой дифференциации возбудителя сосудистого бактериоза капусты:

- разработать метод оценки устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу, позволявший проводить индивидуальнув оценку растения к ряду «таммов с последувчн* его использованием в селекционном процессе:

-изучить наследование признака-устойчивости к патогена в селекционных линиях и гибридах белокочанной капусты; -разработать способы получения иммунизирувчих штампов для индуцирования устойчивости капуст» к сосудистому бактериозу; -показать возмомность иммунизации белокочанной капусты против сосудистого бактериоза.

НЯНЧНА8 НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ

Выявлено разнообразие популяции возбудителя сосудистого бактериоза по патогенности, вирулентности, биохимическим признакам, активности экзоферментов, белковому и плазмидному профиля. ■

Предло1ен подход к расовой дифференциации возбудителя на основе использования линий и гибридов белокочанной капусты.

Выявлен диапазон условий, обвспечивавций проявление наи-больмих различий по устойчивости растений к патогену,

Предло«ен метод отбора устойчивых к сосудистому бактериозу селекционных образцов на основе.использования для оценки нескольких различающихся итаммов Хап^оюпаэ савре^МЗ ру, саирезШз. ' . '

Показано существование, как минимум, двух рецессивных и аддитивных генов устойчивости к сосудистому бактериозу у линии. И436606. : /

Предложены методы получения непатогенних штаммов возбудителя сосудистого бактериоза,; способных иммунизировать растения капусты против этого заболевания; ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Отобраны сильнопатогенние итамма X. савревЪНБ ру. саарези^, обеспечивающие наиболее дифференцированную оценку устойчивости капусты к сосудистому бактериозу.

• Разработан метод оценки капуста на устойчивость к сосудистому бактериозц'по листовым высечкам, позволяющий проводить' в расцепляющемся гибридном потомстве оценку на устойчивость к нескольким итаммам патогена одновременно без потери растений для дальнейшей репродукции. . /

Получены 1? непатогенннх «таймов X. campestris pv. caipestrls, Йригодных для иммунизации белокочанной капусты.

Выявлены селекционные образцы устойчивые к сосудистому бактериозу, и проведен анализ спектра их устойчивости и возможного происхождения и взаимодействия генов.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Основные материалы, работы были доложены на конференции молодых ученых "Экологические проблемы защиты растений" (21-24 ноября 1990г.) в Ленинграде: на республиканской конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60- летию образова- . ния Казахского СХИ, в Алма-Ате, 1990 г.; на иколе-семинаре мо-лодх ученых "Генетика, физиология и биохимия микроорганизмов" " в Алувте, ноябрь 1990 г.: на конференции молодых ученых ТСХА , Москва, 1991 г.

ПНБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликованы 3 работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЙ

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц, 16 рисунков и состоит «з введения, обзора литературы и экспериментальной части, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы из 180 наименований, в том числе 95 зарубежных, приложений, справки о внедрении.- ■ *..

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа была выполнена в 1989-1992 гг. на базе отдела иммунитета и завиты растений Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, в лаборатории иммунитета растений Института общей генетики им. Н.И.Вавилова и во ВНИИ генетики и селекции промысленных микроорганизмов.

Сбор инфекционного материала для выделения изолятов X.caipestris pv. caspestrls осуществляли в периоды, наиболее благоприятные для развития заболеваний в Московской, Ленинградской областях и Белоруссии. Выделение проводили по общепринятым в микробиологии и фитопатологии методам СБельтюкова.Ма-

' - е-.-. ■

тквевская, 1958; Кирай и др., 1974: Чумаков, 1974: Сэги, 1983: Герхард. 1983: Джалилов, 1989: Чумаевская, Иатвеева, 1989).

Изучение биохимических и морфологических свойств изолятоэ проводили стандартными методами (Герхард, 1983: Сэги. 1983: Матвеева. Чумаевская.1986). оценку патогенцости - в лабораторных и тепличных условиях, с предварительной проверкой пореак-цин сверхчувствительности на растениях-индикаторах Pelargonia 2onale (Kle»ent,1968) и Plectranthus australls (Самохвалов и др.. 1989; Рогачев, 1986).

Селекционные образцы и гибриды F1 и F2. в том числе с линией PI 436608, предоставленные лабораторией селекции и семеноводства капусты ВНИИССОК, выращивались в течении круглого года в климатических камерах, в течении вегетационного сезона - на опытном поле лаборатории селекции и семеноводства капусты. : ;; г-!■■ ./-:-.vV:,'

Оценки развития сосудистого бактериоза проводили сначала по 5 балльной икале Студенцова с модификациями (Никитина, Сту-денцов. 1971: Сухорукова,1986). а затем по разработанной нами ' 7-и баядьнай икале.

Математическую обработку результатов.опытов проводили методами дисперсионного, регрессионного и' кластерного анализа при помочи пакетов статистических программ для- PC IBM. AT STATGRAF 3.0 и SURFER 3.0.'"' *

.Погодные условия (среднемесячная температура, влавность' воздуха и сумма осадков) полевых сезонов 1990-91гг. были типичными по сравнению с многолетними. условия 1992 г. - экстремальными по дефициту влаги и высоким средним температурам.

Для введения систематических поправок на неоднородность опытного участка и инфекционного фона бил использован метод построения изолиний по точкам контрольных делянок с помощью пакета программ SURFER.. Результаты кавдого'года испытаний суммировались. . .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ • .СОСТАВ ПОПУЛЯЦИИ Xanthoaonas caapestris pv.caopestrls.

Популяции ХапШвопаз саарезЬМз pv.caBpest.ris оценивали по патогенности, биохимическим признакам и активности экзофер-ментов, часть «таймов была такяе оценена по спектру общих водорастворимых белков и плазмидному профилю.

Мы проводили комплексную оценку патогенности собранной коллекции X» саярезЫг ру. санрез1г1э по продоляительности латентного периода, степени развития* болезни и способности вызывать сверхчувствительность на растениях-индикаторах.

Общее распределение частот непатогенных (слабопатогенных ), патогенных и сильнопатогенных втаммов представлено на рис.1. Соотновение фенотипов близко к распределению 3:7:4 (достоверность по анализу Хи-квадрат 782), что соответствует результатам предыдущих исследователей (Тивари, .1989), и показывает более высокую приспособленность патогена к растению-хозяину. чем у фитопатогенных псевдомонад, где это соотновение сменено в сторону непатогенных (авирулентных) втаммов (Король, 1992 К

По морфологическим и некоторым , биохимическим свойствам втаммы соответствовали признакам рода Хап^овопаз с Вегду, 1974), и какой-либо дифференциации выявлено не было (за исключением гидролиза крахмала, интенсивности окраски и синтеза ЗПС на среде с сахарозой, различия по которым были количественными). йенее однородным было отношение к источникам углерода. По утилизации ряда углеводов (мальтозы, рамнозы, галактозы и глицерина) показана высокая вариабельность, не соответствующая видовым характеристикам X. салрез1г1з рч. саврез^1з (Вегвеу, 1974); Для выявления природы этой вариабельности нами был проведен групповой анализ биохимических признаков у сильно, средне и слабопатогенных втаммов. Как показывает таблица 1, сильнопатогенные итамма являются наиболее стабильной по биохимическим признакам группой, соответствующей патовару саирез1г15 рч, саврезШз. Вариабельность свойств средне и слабопатогенных втаммов мовет указывать на генетическую нестабильность и затрудняет определение видовой принадлеяности этих

А В

feo. I, Распределение штаииов X.c.pv.campeatrie по патогекности: 1-сла0опагогенные;

таблида 1.

Анализ групповых особенностей вутилизашш углеводов усильно-Ч средне- и слабопато-гешшх шта»1о& Хапгьошопаз сашрезгг1з р». сашрезтз.

Группа показатель Углеводы:

/ по пато-

генности сх ГАЛ ♦Р НАЛ АР НАН ТРЕ ЦЕЛ РАН СОР ДУЛ ГЛИН ЛАК

ЭТАЛОН« ■ ♦'. ♦ ♦ .• « Л ♦ ♦ у - <1 ' <1 <1

Иода ♦ - ♦ ♦ - ' ♦ ♦ + .. - ■ - - ■

г Сильно Частота Г .6? . вт .6 1 1 1 1 1 . 53 1 .93 . 73

Дисперсия о 0 . 1г . 12 .2(1 о 0 0 о 0 . 2Т 0 .02 .21

Пода ♦ ■ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ . ♦ ♦ - */- >

1 Средне Частота 1 1 .83 . 92 . Зв .91 1 1 . 83 . 6Т . 5 .83 . 75 . 67

дисперсия 0 0 -15 .08 . 27 . 11 0 0 . 15 .24 . 2Т • 15 .20 .24

Иода ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ , ♦ .. ♦ - . - -

0 Слабо частота .94 .94 .вз . 33 .61 .94 .94 1 . 9* .61 .54 .69 .72 . Т2

Дисперсия .00 .06 . 13 .15 .23 .06 .08 0 . 08 • 24 . 1 .21 .21

гл-глюкоза. СХ-сахароза. ГАЛ-галактоэа, фр-фруктоза. нлл-нальтоза. АР-арабиноэа. НАН-нанвоза. ТРБ-Треголоза» ЦЕЛ-аедлобиоза. РАН-раняоза. СОР-сорбит. ДУЛ-ДУЛышт, ГЛИЦ-глиперин, ЛАК-яактоза. » - итанн Р1Я> СС13 (Вегвеу. 19Т4)

групп.

Анализ признаков вновь выделенных изолятов позволил определить критерии достаточности числа проведенных тестов для идентификации выделяемых бактерий с вероятностью правильного результата не менее 95JC. Аналогичная работа,; выполненная для PseudoEonag syrlneae pv. lachryaans,позволяет значительно удешевить и ускорить ход оценки популяций, патогенных бактерий (Король , 1992), снизив число необходимых тестов с полутора десятков до 5-7. Они основывались на специфичных морфологических и биохимических признаках X. canpestris pv. ca«pestrls и сопутствующих фитопатогенных и эпифитных бактерий. (Noman, qivares, 1989)

Основными тестами, позволяющими отобрать изоляты X. ca»pestris pv. canpestrls, являются морфологические признаки, патогенность на растении-хозяине, использование глицерина, целлобиозы, отсутствие способности использовать рамнозу, синтез ЭПС и редукция нитратов. Достоверность отбора по этим 5 тестам, проверенная при полном анализе, составляла 91-992.

Анализ результатов оценки активности экэоферментов X, caapestrls pv. caipestrls показал отсуствие обязательной связи меиду патогенностью и активность!) экзоферыентов (коэффициенты корреляции 0.35. 0.24 и 0.4 для протеазы, амилазы и пектиноли-тических ферментов соответственно), хотя в группах близких по' происхоаденив итаммов. такая зависимость наблюдается. Мощно проследить общую тенденцию в распределении втамиов по активности ферментов, имеющее максимум частот слева от средней, (критерий Скауннаса 0.78 для протеаз, 1.19 для амилазы) (Рис. 2) Такое распределение характерно для признаков, находящихся под негативной регуляцией (Tang et al., 1990). Активность группы петинолитических ферментов, видимо, является более вакным свойством для бактерии, поэтому распределение смещено к нормальному типу, показывая высокую приспособленность втаммов со средней активностью пектинолитических ферментов, . ' Проведенное изучение злектрофорьтическог? профиля йТДйЛь

- il '

ных ферментов, показали высокую вариабельность их как меаду патоварами X. caapestrls, так и внутри их. < Strîpecke and RosatO. 1988). Поэтому мы остановились на анализе спектра об-цих водорастворимых белков. Наией задачей в данном разделе работы было удостовериться в однородности выделенных ятаммов X. caapestrls pv. caapestrls, найти простой способ различить их от аелтопигыентирбванных зпифитных бактерий, в основном Erwinla herblcola (Королева. 1981) и оценить степень изменения мутантов, имеющих морфологические отличия от родительских штаммов.

Был использован вертикальный электрофорез е присутствии DOC-Na по методу Лэммли (Laenmll, 1970 ) с модификациями. Результаты анализа показали, что спектры белков природных штаммов очень близки друг к другу, независимо от места выделения, мутации проявляющиеся фенотипически сходным образом сопровоз-давтся аналогичными изменениямии спектра белков. НутацйИцСвя-занные с глубокими изменениями оболочки и физиологии бактерии (бесцветные штаммы),приводят к несопоставимым изменениям белкового спектра. Проведенное;сравнение спектров X. caapestrls pv. caapestrls и Erulnla herbicola показало присутствие не менее 10 отдельных маверных полос, позволявших отличать эти два вида, что показывает пригодность метода для анализа видовой принадлеяности аелтопигментирозанных бактерий.

Плазииды. являясь наиболее мобильной частью бактериального геноаа. а то яе время остаются очень стабильным признаком, когда выполняют вазнуа роль в приспосабливаемое«) патогена к растеииэ-хозяину или окрувающей среде. (Lazo and Gabriel, 1987) Видимо, это определяется особой ролью генов,локализованных в плазмидах. Для изучения плазыидного профиля X. caapestrls pv. caapestrls была проведена подготовительная работа по выбору методик .позволяющих наиболее детально охватить весь спектр плазмид штаммов и доступных для массовой оценки втаммов.

В работе были использованы-втаммв. разлячаюяиеся по sop-

■ - 12 - ;

фокулътуральным, биохимическим признакам и патогенности. Применение для выделения плазмид X. саврезШэ ру. сашре5Ьг1з десяти микро-методик, рекомендованных для родов ХапМоаопаз и Рзеиёовопаз показало, что;

> ни один из опробованных методов не обеспечивает выделения всего спектра плазмид X. саврезШз ру. са1рез1г1$, и для анализа плазмидного профиля лучке всего применять методы Кабо £ Ни (модификация Бмпзоп И а1.,1988) и метод В1гпЬо1ж, Во1у, 1988 г.;'' ■'■

- кольцевые молекулы плазмид массой более 45 КД видимо нахо-' дятся в колплексе с белками и требуют для выделения предварительной обработки 50 м* НаС1 в 50 мМ растворе глюкоза или сахарозы (для поддержания осмотического давления перед лизирова-нием клеток):

-обнаружены по яеныей мере 4 типа плазмид с массой от 45 до 18 мДа. из которых 2 с иаименьвей массой встречаются у 952 штаммов 8 бельмом числе копий: г

-потеря этих плазмид. у мутантного втамма МИ ( родительский ■тамм VI) сочеталась с утратой пигментации и.патогенности. 1тамя VII был получен с помощью воздействия метаболитами фито-, ¡Патогенного гриба при совместном культивировании (Самохралов, 1388); ■■■ '

-«тшты,.проведенные с целью ал\иминирования плазмид традицион-' ныяи методами (высокими температурами и акридином оранжевым), не дали ожидаемого эффекта.

На основе полученных результатов мы' можем предполскить,. что биохимические признаки у втаимов X. са«ре51г1з ру. савр081г15 находятся под контролем блока генов, обладающих высокой гомологичностью в естественной популяции патогена и обеспечивающих контроль за фенотипическим проявлением основной части генома бактерии.

НАСЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КАПУСТЫ К СОСУДИСТОМУ БАКТЕРИОЗУ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПУЛЯЦИИ ХапШиспаз «врези^ pv.caspe.str' 15 ПО ОТНОШЕНИИ», К РАСПНИ®-ХОЗЯИНУ.

- 13 -V

Принадлежность возбудителя сосудистого бактериоза к виду общему с хорошо исследованными в расовом отношении патогенами (X. caipestrls pv. vesicatoria, X. caipestris pv. oryzae. X. caapestris pv. ■alvoceanm) и общие с ними черты в механизме патогенеза (Todd et al., 1990), заставляет предположить суг чествование расовой дифференциации у X. canpestrls pv, caipestrls. Рад исследователей отмечал необходимость использовать для оценки устойчивости капусты изоляты возбудителя сосудистого бактериоза, выделенные из разных источников (Hunter et al., J98I; Сухорукова, 1987). Несмотря на это, работ по выявление расовых различий у X. caapestris pv. caapestris нами не обнаружено.

Используя поколения F2» полученные при скрещивании ряде линий белокочанной капусты с линией PI 436608 китайской селекции, несущей рецессивный ген устойчивости к сосудистому бактериозу (Dlckson, Hunter.1987) и любезно предоставленные нам лабораторией селекции и семеноводства капуста ВНИИССОК, кн разработали метод оценки устойчивости по высечкам из листовой пластинки растений. Из 2-4 листа.сверху с поаощьв пробкового сверла высекают диски диаметром 7 мм, которые помещают в пробирки с 2-3 мл суспензии бактерий концентрацией ДО^кл/ия. Пробирки инкубирувт в течении 2 суток при 22-24*С, освещенность 4 -б тис.лк. Учет проводили по разработанной нами 5 балльной шкале: 0- отсутствие реакции; 1 - слабая мацерация по крав диска: 2 - мацерация не более 1/5 диска; 3 - не более 3/4; 4 -полная мацерация диска. Отдельно учитывали присутствие теано-окравенного кольца, образованного фенольными векестваыя на границе нивой и пораженный тканей.

При оценке влияния концентрации суспензии патогена а температуры . были получены результаты, интерполированные методам Кригинга прикладного пакета программ SURFER. Оъенно представ,-' ленный результат опыта показывает, что период до появления симптомов является минимальным при температуре около 23 С для всех вариантов (Рис. 3V. что указывает на факт наибольшей ско-

190

А, ча&

степен^'

с основанием 10 Рис.Ь.Ьавнсимость

инкубационного периода (А) о? температуры!В) н концентрации : суспензии патогена (С)

на группы во »ирупектвостя к 20 pacTcRMM ¿опусти « геЕвкв тстойчкяост* о* лкник?! 438608

■А -В -

Сггпень «крупенткост» (от 1 до 20) С тем та сходства СО

: t . ■

рости установления совместимости в системе патоген-растение в диапазоне температур оптимальных для растения. Наш вывод подт-вершдэат результаты, полученные для растений капусты с f-геном устойчивости к сосудистому бактериозу.(Staub & Hilllams. 1972) При анализе устойчивости гибридов Fl, полученных при скрецивании мевду собой б среднеустойчивых и восприимчивых линий белокочанной капусты, нами был получен слоаный характер наследования устойчивости с аддитивным, нейтральны» и негативным взаимодействием ген<5£. Характерен неоднозначный вклад в устойчивость муаских и ленских гамет, знак которого такае зависит от комбинации линий. При теоретическом расчете, полученный результат доляен обеспечиваться не менее чем б различными генами. Некоторые из этих комбинаций затем были оценены на устойчивость к нескольким втаммам патогена. Результат подтвердил суцестаование нескольких генов устойчивости, обладавши атам-моспецифичным действием. Этот факт поставил задачу выделения штаммов отличавшихся по вирулентности к линиям и гибридам несучим разные гены устойчивости. Как видно из таблицы 2, а которой представлены .гибриды и сорта капусты, более' половины из оцененых образцов (группа Й) не обладали какой-либо специфичностью по отношение к втаммам возбудителя. Средняя пораяен-ность сосудистым бактериозом для них составила 41.5'/., для группы В (более устойчивой к штаииу 41) - 18.6% (12.6% для самого втамма- 410, а для группы С (устойчивой к отаыму И10 -23.4 2 (8.72 для штамма МП.

Такой результат позволяет говорить о том, что ген (гены) устойчивости к втамау 41 обладают более общим действием, или находятся в блоке с генами отвечающими за неспецифичнув устойчивость, тогда как ген (гены) устойчивости к М1 более специализированы. .В таблице 3 представлены данные по распределению рстенмй гибридов Fl, устойчивых и восприимчивых к итаы-мам ШПб и 923, вирулентных к генам устойчивостичшши PJ 430606. Как видно из этих результатов, существует достаточно .большое количесто генов устойчивости к сосудистому бактериозу.

. Таблица 2

Распределение некоторых линий и гибридов капусты по отновенивк »таммам Kanthoionas caipestris pv.caepestrls.

Пора«енность, X Отновение

Образец" поракенно-

41 VI лл1б сти 41 к М1

Зимовка 50.0 34.4 50.0 1.42/Я*

1474

К125 . 14.4 30.4 45.е ' 0.53/В

К 97 50 24.5 40.7 1.78/С

Фора 42.3 5.5 11.1 ■ 6.54/С

Ва-Йл 35.4 43.? 50.0 .8 /Й

Ленний 41.1 31.8 •50.0 1.3 Э/Й

ßMarepBiJ 56.6 45.7 50.0 1.21/А

Cr-St 5.е 13.3 8.5 0.4 /В

Во-Фо 12.5 20. Ö.65/B

ад-st 40 7.5 15 4.85/С

Таб 10.8 7.2 - 1.82/С

Дт-См 51 36.8 ' - . 1.39/fl

ТР 32.8 37,6 - 0.92/Й

Дт-Июнь£ 18.0 35 - 0.51/В

Июньская 45.7 73.7 - 0.62/fl

Ксрб 34.4 30.6 1.12/fl

Нср? 15 18.7 0.9 /Й

НСР 95 3.1 2.3 4.0

* группы по преобладанию устойчивости к одному из »таммов.

Таблица 3 „

Анализ характера наследования устойчивости к сосудистому бактериозу у гибридов 71 белокочанной капуста.

Комбина- Доля(Х) устойчивых растений Вероятность

ция _ и вероятное распределение к: одинаковых

генбв устойчивости

вт ЛЛ16 ■т.923 хи-квадрат

и5/1 ' 47.7/1:1 42.2/1:1 0.05/0.47 0.73 , 2.0#Ю «

и5/3 23.5/1:3 82.3/3:1* 0.06/0.61

и5/3 61.5/1:1 61.5/1:1 0.60/0.60 1.0

и7/1 66.7/3:1 83.3/3:1 0.67/0.22 0.81.

и?/! 52.9/1:1 52.9/1:1 0.05/0.05 1.0 •

и11/1 43.6/1:1 50.0/1:1 0.25/0.0 0.92 :

иНЛ 25.0/1:3 15.0/3:13 0.0/0.4 0.42

5Ь2/1*Р1 42.8/1:1 50.0/1:1 0.28/0.0 0.60 2.0*10"*

2604#ЬМ 6.3/0:1 75.0/3:1 0.30/0.0

2604*ЬЬ2 12./3:13 100.0/1:0 0.32/0.0 2,1*10

2604*ЬЬЗ 30.0/1:3 50.0/1:1 0.21/0.0 . 0.07

"*. Вероятность определения устойчивости к обоим втаммам одним или несколькими сцепленными генами,

Таблица 4

Распределение устойчивых Ш, сгзднеустойчивих (Н) и восприимчивых (5) растений в поколении Р2 (один из родителей-линия Р1 436606 >

серия втамм число растений *еор, распред.» хи-кв, 95% (т. = .352)

Й И Б

10 111 12 10' 23 4(г1г1):3(г1г2):9 0.18

531 8 13 22 3(г1г2):4(г2):9 0.23 '

23 Ш 1'2 7 26 4:3:9 0.10

531 .■6 13 25,; 3:4:3 0.16

♦для гипотезы, что:г! и г2 - рецессивные гены, г1 действует независимо, г2 действует в присутствии г1.

показывавших разные 'типы взаимодействия, наследуемых возможно независимо, и обладающих специфичностью по отношению к отдельным гтаммам. Можно предположить, что устойчивость к сосудистому бактериозу наследуется как признак,определяемый многими вариантами одной или нескольких аллелей, подобно признаку самонесовместимости. Это предположение было проверено при анализе более изученной устойчивой линии капусты.

По сообщению М.Диксона, линия китайской селекции PI 436606 несет рецессивный ген устойчивости и несколько генов-модификаторов (Dickson. Hunter. 1987). Для изучения характера наследования устойчивости был проведен анализ родительских форм и растений, полученных при скрещивании с линией PI436606 на устойчивость к различным штаммам патогена, отобранных из коллекции Xanthoaonas caapestrls pv. caapestris и дававших различную реакцию на растениях поколения F2. Штаммы LL1, S31 и итама 6112. вирулентный к линии PI 436606, использовались для дальнейшей оценки.

Все родительские линии в этом опыте (кроме PI 436606) и растения F1 были восприимчивы к патогену. При изучении расцепления фенотипа в F2 наблюдалось отклонение от соотношения восприимчивых и устойчивых растений 3:1, ожидаемого для одного, рецессивного гена устойчивости. Это отклонение выража-

лось в виде наличия большого числа растений промежуточного ( среднеустойчивого) фенотипа, подходящего под соотнояение 4:3:9, характерное для расщепления 2 генов с аддитивным взаимодействием. Одновременная оценка растений к двум различавшимся штаммам позволила показать присутствие в линии PI 436606 как минимум, еще одного гена устойчивости, зависимого от rl, определяющего устойчивость к-'штамму'. S31, и действующего аддитивно с rl и только в его присутствии ( Табл. 4V Распределение устойчивых и восприимчивых к LL1 (к группе которого по этому признаку относятся 80 7. изученных штаммов) растений, полностью совпадает с результатами, полученными й.Диксоном.В большинстве вариантов, имевших балл поражения от 1 до 3. наблвлалосг четко

Таблица 5

Распределение штаммов х. с, сашрез1г1з по грлшан в соответствии с результатом кластерного анализа (Рис. Я.

Группа Втанны

1 011 20 «3 23

г 22 20 31

3 И1Т ЧС2Ч ВС4 НХ21

4 Н1 92 ^ 921 922

5 41 29 1-12 90-18-1

о ЛЛ1УУ Л/11 40 Л/116

7 г31 88Я7 88Я8

в Л/11И ЛЛУУ /1/12

9 Л/114П Л/113 А/115 А/110

10 АЛИ АЛ4 3311

Таблица в.

Возникновение и устойчивость иииунизашш по времени. (сорт Аиагер 611) .

Время экспоэи-шш, час

О 18

24 10

6 СУТ. 9 СГГ.

КСР 95

Степень развития болезни, '/. в вауиаяте:

с преннокул.

98.0 80.0 55.0 11. 3 £0. О 21. 5

б. 6

в контроле

97. 5 100.0 100. О 66. О 100. О 91.0

9. 8

Снижение развитая болезни к контролю, *

О 20.0 44. 4 83; 4 60. О 80. 5

Ппткечаггие: Экспозиция - с иоиента прешюкулягош до зарахеккя.

выраженное темноокравенное кольцо на границе здоровой и пораженной ткани, типичное для хиноновых веществ, накапливающихся в тканях устойчивых растений в ответ на вторжение патогена в результате окисления производных фенола. - . .

При оценке растений поколения ?2, отнесенных к группе устойчивых, наблюдалось появление фенотипов устойчивых к штаммам, вирулентным к родительской линии Р1436606. Это может означать, что присутствие генов от другого родителя может модифицировать прявление устойчивости, расширяя спектр действия на вирулентные прежде штаммы. Результаты проведенного для каждой серии анализа степени влияния второго родителя на проявление (экспрессию) признака устойчивости, полученного от линии Р1 436606. показывают отсутствие связи между реакцией растений к двум разным по происхождению отаммам (1117 и 6112), вирулентным к генам устойчивости в исходной линии Р1 436606. : ..Коэффициент корреляции между реакцией растений к этим двум втам-мам находился в рамках -0.07 - 0.25. а проведенный методом хи-квадрат анализ сложившихся комбинаций у 167 растений показал,

что вероятность определения устойчивости только общими г-гена-¡и

ми составляет 2.2*10.

На основании оценки на устойчивость к популяции возбудителя сосудстого бактериоза, нами были отобраны растения висо-коустойчивые ко- всем штаммам патогена,» использующиеся в дальнейшей работе по созданию родительских самонесовместимых линий для получения гибридов П.

Полученные результаты показывают, что при выполнении селекционных программ по получению сортов и гибридов белокочанной капусты, устойчивых к сосудистому бактериозу, необходимо использовать доноры специфичной (или олигогенной устойчивости), например Р1436606. в сочетании с родительскими линиями, обепечиваюцими стабильность проявления признака для максимально больвей части популяции патогена. Полученные результаты также дают подход к изучению расового состава популяции возбудителя сосудистого бактериоза и прогнозированию успешности

внедрения устойчивых сортов и гибридов капусты в производство.

На основе анализа результатов оценки 34 ктаммов X. савре31г15 pv. caepe5t.ris, выбранных случайно из популяции патогена. на 168 растениях поколения $2, полученных при скрещивании линии Р1 436606 с 6 другими линиями, были выбраны 20 растени^показаввих наиболее дифференцированную реакцию на заражение патогеном. Для изучения степени различия этих 34 штаммов был использован метод кластерного анализа (Дюран, Оделл, 197?) - группировка обьекто! на основе коэффициента принадлеш-ности (В-коэффициент). На практике мы вычисляли В как коэффициент сходства по формуле:

Ъ- (Нвс.-Нобк,)/Нвс,«100, где Иоби,- число общих признаков, Нвс.- число признаков, участвовавших в анализе (число отобранных растений).

На рисунке 3 приведены результаты анализа. Выделенные десять групп втаммов были сопоставлены между собой по биохимическим признакам, включая активность зкзоферыентов. Признак вирулентности к определенным генотипам растений не бал связан с биохимическими свойствами и с общим уровнем патогенности и являлся наиболее стабильной характеристикой штаммов, меньше всего изменяющейся при мутагенезе и естественной диссоциации втаммов. в отличие от биохимических показателей. Видна группировка итаммов, связанных общим местом выделения или родителем (штаммы белорусского происхождения, группы с названиями М_ и 93_, ЛЛ-,йл_) (Табл.5).

Полученные результаты не противоречат наиин предположениям о существовании расоспецифичности во взаимоотновениях патогена с белокочанной капустой и ставят задачу выделения константных линий растений, обеспечивающих стабильные результаты при дифференциации-популяции X.с.р^.сашрегШБ. .СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИШНИЗИРОДОЩХ ¡ШИЛОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ.

Потеря патогенности может вызываться мутациями в'локусах с разными фенотипическими проявлениями: от появления авиру-лентности,' потери Активности экзоферментов или синтеза ЭПС до

изменения проницаемости оболочки и ее компонентов(Иатывевс-кая. 1980: Daniels et'al..1904; flou et a]., 1987; Suanson et al., 1987). Поэтому не каядый непатогенный втамм способен слу-шить эффективным индуктором защитной резкими растения, а только сохраниваий компоненты, активно взаимодействующие с растение*. (Conrads-Strauch et al., 1930)

Для оценки времени^необходимого для иммунизации, растения попле преинокуляции спонтанным непатогенным мутантом А/19 с интервалом от б часов до 9 суток проводили инокуляцию втаммом АЛ 14/п. Развитие болезни оценивалось через 3 суток.(Табл.^) Как видно из полученного результата реакция растения на преи-г нокуляцио непатогенным втаммом занимает не менее 6-7 часов, причем до появления максимального эффекта проходит около 40 часов. Результат, полученный для турнепса (Brassica canpestrls) показывает, что через 7-10 часов после инокуляции несовиести-. мым патоваром Х.с. pv.vltlans происходит увеличение активности. 1,3 -глюконазы и хитиназ/лизоцимз в листьях растения, лродол-ваюаее наростать в течении 2 суток (50 часов) (Conrads-Strauch et al.. 1990)

Спонтанные мутанты, как правило,происходят от слабопатогенных втаммов, и редко обладают иммуниэируювим эффектом. Ливь 322 от общего числа непатогенных итаммов проявляли такую способность и тольйо у 4У. втаммов эффективность иммунизации была выве 50%. При оценке пар родительский втамм - мутант, выявлена тесная связь мееду латогенностьв родителя и иммуиизирувцей способностью мутанта, коэффициент корреляции составил 0.73. Эффективность искусственно получешшх мутантов была намного выве,' чем у естественных непатегеннах втаммов. Б.озмоино,иммунизация связана не только с накоплением антимикробных вевеств типа фигоалексинов, но и с активизацией более специфичных к патогену механизмов защиты растения. Больиая эффективность иммунизации штаммом АЛ9 при инокуляция ПЛ14/п, чем при инокуляции М1 (54% и 5%), и aoiitaas избирательность втамма АЛ14/3 (78% и 52.6% соответственно;,1, показанная при иммунизации моло-

- гV; - 23 - ' . ,

дых растений с покощьв обработки семян, позволяют нам предпо-лоттъ многовариантность защитной реакции у растений капусты, специфичность которой доходит до втаммовой дифференциации.Такой вывод требует от нас более детального изучения разнообразия популяций патогена и растения-хозяина- применительно к ха-' рактерц их взаимоотношений. • ; .

Для получения непатогенных втаммов бактерий нам представляется целесообразным использовать глубокие перестановки в ге-■■ номе,происходящих в состоянии покоя (т.н. диссоциация) и эл\и-минирование плазмид, в ¿расчете на то, что эти изменение поддаются контроля и воспроизводимы. (йегЬаН а1., 1981^ Нам не удалось достичь поставленной цели путем применена традиционных методов, направленных на элиминирование плазмид. Зф-' фективнам приемом здесь оказалось культивирование Х.саарегШг ру. ЬавреаЬНз с фйтопатогенным грибом из рода ЙНегпаг1а (Самохвалов. 1988), приводивоее к потере зкзофермонтной активности, пигментации и утрате 2 легких плазмид массой около 13-20 МДа. К; соваленив, полученные такиа методом ыутантные штаммы .имели не самую высокую имаунизирувчуп способность в ходе двухлетних испытаний. '

Наиболее аффективный методом получения иммунизирующих втаммов оказалось введение культуры бактерий в состояние покоя с последующим отбором диссоциировавших фори. Таким способом был получек "мутант 1Ш 4/3, показавший эффективность по снише'нию развития сосудистого бактериоза в полевых условиях от 25 до 57 7„ Двухлетние испытания на искуственнои инфекционном участка показали, что: \

-иммунизация при двух или трех-кратних обработках, начиная с ранних стадий развития капусты,сильнее сниаает площадь под линией кривой развития,чем само развитие болезни; ■-максимальное снинение развития болезни к моменту уборки кочанов достигается при одной обработке в фазу завязывания кочана; -эффективность иммунизации зависят от условий развития болезни и сорта1,: наиболее1 отзывчивой среди 4 испытанных средне и позд-

неспелых сортов оказалась Слава грибовская 231, наименее -Московская поздняя 15;

-803М01Н0 дальнейшее увеличение эффективности иммунзации растений во взрослом состоянии за счет селекции непатогенных ■таймов, т.к. при увеличении концентрации суспензии эффект возрастал.

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая степень гетерогенности по патогеннос-ти популяции возбудителя сосудистого бактериоза капусты в Нечерноземье с преобладанием среднепатогенных штаммов (47%), но наиболее стабильными по культуральныы и биохимическим признакам были сильнопатогенные штаммы, составлявшие 247. от общего числа

2. Найдены по меньшей мере 4 типа плазмид с массой от 45 до 18 НДа и показана высокая однородность изученных штаммов по плазмидному профили и спектру общих водорастворимых белков.

■ 3. Установлено, что для идентификации патогена с 95Х вероятностью достаточно провести тестирование изолята по морфологии, патогенности на растении-хозяине, утилизации глицерина, рамнозы, целлобиозн, синтез экзополисахарида на среде с сахарозой и редукции нитратов.

4. Резулыатн кластерного анализа показали, что для выделения групп штаммов главным признаком является вирулентность к образцам белокочанной капусты, обладаюцих дифференцированной реакцией к возбудителю, а не биохимические признаки или пато-генность.

■ 5, На основе анализа расщеплений в Р1 и Р2 показано наличие как минимум двух рецессивных аддитивных генов устойчивости к сосудистому бактериозу у линии Р1 436606, действие которых может модифицироваться при скрещивании со среднеустойчивыми линиями белокочанной капусты.

: 6. Разработан ускоренный метод оценки устойчивости селекционных образцов в комбинациях . несущих гены устойчивости к сосудистому бактериозу, заключающийся в оценке степени мацерации листовых высечек в бактериальной суспензии возбудителя при температуре 22-24"С, концентрации суспензии 101 кл/ыл и экспозиции 2 суток.

7. Выделены два спомба получения непатогенних мутангое. •

более эффективных по сравнении с традиционными: кульшзировй-ние с фитопатогенным грибок рода Alternaria и многократной прохомдение культуры патогена через состояний покоя. С их помощью выделены 17 мутантных втаммов, способных иммунизировать растение капусты против сосудистого бактериоза.

8. Эффективность иммунизации составляла в лабораторных условиях до 932, в полевых- до 5?Х. Наибольшее снижение развития болезни достигалось при иммунизации в фазу завязывания кочана. Наиболее восприимчивой к иммунизации в полевых условиях среди четырех испытанных сортов была Слава грибовская 231, наименее - Московская поздняя 15.

ПРШ08ЕШ ПРОИЗВОДСТВУ # 1, Рекомендуется испытание селекционных образцов белокочанной капусты на устойчивость к сосудистому бактериозу на основе раздельной оценки к группам втаммов патогена. ;

2. Целесообразно использовать в качестве источников устойчивости высоко и среднеустойчивие самонесовместимые линии капусты, по-разному относящиеся к группам штаммов возбудителя сосудистого бактериоза: PI4366Q6, St, AI, ВВ и 2604.

3. Рекомендуется проведение испытаний имунизирувщих штаммов X. caapestris pv. caapestris, способных снимать развитие болезни в полевых условиях.

По материалам диссертации опубликованы 3 работы:

Самохвалов А.Н., Игнатов А.Н. Активирование иммунитета Brassica oleracea против сосудистого бактериоза, // Биологические науки.-1991,-No 12.-стр.34-37

Самохвалов А.Н... Рогачев Ю.Б., Игнатов А.Н. Разработка методов-защиты капусты от килы и бактериозов //'Тезисы докладов республиканской конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летив образования Казахского СХИ, ч. II, Алма-Ата, 1990, 165с.

Самохвалов А.Н.. Рогачев Ю.Б.. Игнатов A.M. Изучение совместного развития возбудителей слизистого и сосудистого бактериоза in vitro // Тезисы докладов конференции молодых ученых. Экологические проблемы защиты растений (21-24 ноября 1990г.) 1., 1990. -178с.