Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов

Каплан, Игорь Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов"

004601

На правах рукописи

Каплан Игорь Борисович

Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 9АПР

2дш

Москва 2010

004601645

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и на кафедре фитопатологии Корнельского университета (г. Итака, США)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН

Атабекоь Иосиф Григорьевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор

Добров Евгений Николаевич доктор биологических наук, профессор

Завриев Сергей Кириакович доктор биологических наук, профессор

Рубцов Пётр Михайлович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН

совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119991 Москва ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « ^ » апреля 2010 года.

Защита состоится

мая 2010 года в

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.А.Крашенинииков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизма распространения вирусной инфекции в растении-хозяине является одной из ключевых проблем современной фитовирусологии, открывающей фундаментальные подходы к пониманию вирусоустойчивости растений и получению новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур. С другой стороны, в силу простоты организации вирусы растений служат удобной экспериментальной системой для изучения репликации и экспрессии вирусных геномов вообще.

Для активного межклеточного транспорта вирусного генома из зараженной клетки в соседнюю здоровую, происходящего в растениях через плазмодесмы, необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984; Atabekov and Taliansky, 1990). Вирусные транспортные белки, как принято считать в настоящее время, модифицируют и используют клеточную систему активного транспорта молекул растения-хозяина. В связи с этим, изучение вирусных ТБ и РНК-белок и белок-белковых взаимодействий важно для понимания процессов межклеточных взаимодействий в растениях.

Основными объектами настоящей работы служили вирусы, принадлежащие к трем таксономическим группам: Tobamo-, Bromo- и Luíeoviruses. Организация геномов вирусов этих груш и их биологические особенности различии. Тем не менее, во всех трех группах межклеточный транспорт обеспечивается ТБ.

Специфическое взаимодействие нуклеиновой кислоты с белком является составной частью самых разных биологических процессов, к которым относится синтез белков и нуклеиновых кислот, самосборка надмолекулярных структур и т.д.

Удобной моделью для изучения РНК-белковых и белок-белковых взаимодействий является вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV). Преимущество TMV заключается в простоте строения (TMV состоит всего из двух компонентов: одноцепочечной РНК и одного типа структурного белка) и в возможности осуществления его сборки In vitro из РНК и белка (Fraenkel-Conrat and Williams, 1955). Для понимания топких механизмов РНК-белкового узнавания при сборке TMV особый интерес представляет исследование различных мутантов. В связи с тем, что мутант NÍ2519 является температурочувствительным (ts) одновременно по двум функциям (по сборке вирионов и транспорту вирусной инфекции), изучение свойств этого мутанта позволяет расширить наши представления, во-первых, об избирательности нуклеиново-белкового взаимодействия, и, во-вторых, о механизмах транспорта вирусной инфекции в растениях.

Вирус огуречной мозаики (cucumber mosaic virus, CMV) имеет чрезвычайно широкий спектр растений-хозяев и уже только по этой причине представляет большой интерес. Его штаммы обладают различной патогенностью и скоростью распространения по растениям; выяснение причин таких различий имеет не только теоретический, но и практический интерес.

Вирус скручивания листьев картофеля (potato leaftoll virus, PLRV) является самым опасным вирусным патогеном картофеля, из года в год нанося значительный экономический ущерб во всём мире. PLRV является флоэмно-ограниченным вирусом, способным репродуцироваться только в клетках флоэмы (проводящей ткани) и не обнаруживаемый в клетках мезофилла. Понимание механизмов распространения внутри растениий, а также механизма переноса инфекции от одного растения к другому растению тлями, необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией.

Цели н задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов сборки вирусных частиц и распространения по растениям представителей трёх семейств фитовирусов.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение причин образования дефектных вирусных частиц при сборке мутанта TMV Ni2519 in vitro при непермиссивной температуре и локализация участков инициации реконструкции в молекуле РНК №2519;

2. Изучение возможности комплементации ts-функций транспорта мутантов TMV N¡2519 и LSI вирусом-помощником;

3. Изучение влияния транспортного белка TMV трансгенных растений на накопление чужеродного вируса крапчатости красного клевера (red clover mottle virus, RCMV);

4. Изучение влияния нефункциональных и гетерологичных вирусных транспортных белков травсгенных растений на репродукцию TMV;

5. Изучение причин отличий в накоплении CMV, его штаммов и мутантов в различных растениях;

6. Определение возможности комплементации дефектных по транспорту мутантов CMV в трапсгенных растениях, экспрессирующих ТБ (За белок);

7. Изучение возможности распростанения флоэмно-ограниченного вируса PLRV из проводящих тканей в клетки мезофилла в присутствии вируса-помощника;

8. Определение участков структурного белка PLRV, имеющих определяющее значение для сборки вирионов, распространения инфекции в растении и переносе вируса тлями.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что при пепермиссивной температуре (33°С) в клетках растений табака Nicotiana tabacum, зараженных ts-мутантом TMV N¡2519, синтезируется вирионная РНК и функционально активный структурный белок. В результате реконструкции in vitro при 33° образуются дефектные вирусные частицы СДВЧ), чувствительные к РНКазе (РНК нормальных вирионов TMV защищена от действия рибонуклеаз). Определено положение чувствительного к действию РНКаз сайта в составе ДВЧ. Показано, что причиной образования ДВЧ является множественная инициация сборки вирионов. Таким образом, можно предполагать, что ts-фенотип сборки этого мутанта обусловлен температурочувствителъностью самой молекулы РНК, проявляющейся в одновремешюм функционировании двух участков инициации реконструкции при непермиссиовной температуре.

В ходе исследований установлено, что функция транспорта (распространение из клетки в клетку) мутантов N¡2519 и LSI при непермиссиовной температуре может быть комплементирована вирусом-помощником. С другой стороны, комплементировать функцию сборки зрелых вирусных частиц у N¡2519 вирусом-помощником не удалось. Показано также, что комплементация транспорта может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений, а также гетерологичными траенпортными белками в трансгенных растениях.

Показано, что нефункциональный ТБ, экспрессирующийся в трансгепных растениях, способен подавлять накопление близкородственного вируса, а полноценный ТБ может негативно сказываться на накоплении неродственных вирусов.

Продемонстрировала роль ТБ CMV в процессе транспорта вируса в ряде растений-хозяев, а также способность трансгенных по ТБ растений комплементировать не только различных мутантов CMV с дефектными ТБ , но и ряд других вирусов. В ходе детального изучения процесса формирования делеций в гене ТБ в составе дефектных РНКЗ CMV в трансгенных растениях было обнаружено, что все конечные стабильные формы РНКЗ мутантов имели исходную рамку считывания гена ТБ вне зависимости от характера первоначальной делеции.

Впервые продемонстрировано, что для межклеточного распространения CMV необходим лишь белок оболочки (CP) - но не сформированные вирионы.

С использованием мутантов по структурному белку PLRV определепы аминокислотные последовательности, ответственные за сборку полноценных вирионов,

за распространение инфекции в ряде растений-хозяев и за способность этого вируса передаваться от растения к растению вектором-насекомым (тлями).

Практическая значимость работы. Вирус табачной мозаики (TMV), вирус огуречной мозаики (CMV) и вирус скручивания листев картофеля (PLRV) имеют широкий круг растений-хозяев и относятя к числу важнейших патогенов селькохозяйстивенных культур, нанося значительный экономический ущерб. В работе исследованы механизмы сборки вирусных частиц и распространения вирусной инфекции в растениях, понимание которых необходимо для получения новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур и новых фундаменталных подходов к проблеме вирусоустойчивости растений в целом. В частности, результаты работы позволяют понять механизм транспорта вирусной инфекции в растениях, пораженных изученными вирусами, выяснить причины различной патогеяности и скорости распространения по растениям-хозяевам CMV, механизм переноса PLRV от одного растения к другому растению тлями, что необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией, а также особености распространения вирусной инфекции в трансгенных растениях.

Полученные в работе данные вошли в курсы лекций, читаемых на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на II Всесоюзном симпозиуме «Штаммы вирусов растений» (Елгава, 1981), конференции «Вирусы микроорганизмов» (Путцино-на-Оке, 1981), IV Советско-Западногерманском симпозиуме «Структура генома» (Ереван, 1981), совещании ФЕБС «Структура и экспрессия вирусного генома» (Рига, 1991), Симпозиуме X годовщины Центра Сельскохозяйственной Биотехнологии Огго Варбурга «Молекулярная биология в селекции растений: теоретические, практические и легальные аспекты» (Реховот, Израиль, 1994), Конференциях Американского Общества Фитопатологии (Нэшвил, Теннесси, 1993; Монреаль, Канада, 1998; Анахайм, Калифорния, 2004), Конференциях Американского Общества Вирусологов (Мэдисон, Висконсин, 1995; Лондон, Онтарио, Канада, 1996), IX (Глазго, Шотландия, 1993) и X (Иерусалим, Израиль, 1996) Международных Вирусологических Конгрессах.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 37 работ, в том числе 3 статьи в отечественных журналах, 18 статей в иностранных журналах, 6 статей в составе книг и сборников, 10 сообщений (тезисы конференций).

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, в котором формулируются цели и задачи исследования, аналитический обзор литературы о сборке, структуре геномов TMV, CMV и PLRV, о комплементациоцном анализе вирусов растений, описание материалов и методов исследования, экспериментальную часть, обсуждения результатов, выводы и список цитируемой литературы. Общий объем работы составляет ^^страниц, включая таблиц и русунков, список литературы содержитназваний.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Вирус табачной мозаики (TMV) 1. Изучение реконструкции вирионав мутанта N¡2519

Многие ts-мутанты TMV содержат аминокислотные замены в белке оболочки (Jockusch, 1966). При нспермиссивной температуре структурный белок таких ts-мугантов денатурирует как in vivo, так и in vitro (Jockusch, 1968). С другой стороны, при непермиссивной температуре РНК таких мутантов реплицируется п они способны распространяться от клетки к клетке (Jockusch, 1966,1968).

Известны 3 ts-мутанта TMV по функции распространения инфекции, продуцирующие полноценный структурный белок при непермиссивной температуре: №2519 (Jockusch, 1968), П-27 (Peters and Murphy, 1975) и LSI (Nishiguchi et al., 1978). Эти мутанты можно отличить от мутантов с tr (температуро резистентным) транспортным фенотипом (включая ts-мутанты по структурному белку) по типу продуцируемых некрозов яа растениях табака Xanthi-NN при дифференциальной температурной обработке (ДТО). Инокулированные растения выдерживают 2 дня при 24°С, затем переносят на 32°С на 1-2 дня. При 32°С некрозы не образуются, т.к. реакция некрозообразоваяия является температурочувствительной (Samuel, 1931). После возвращения па 24°С на инфицированных участках листа начинают образовываться некрозы. В результате некрозы, вызванные tr по транспорту штаммами TMV, значительно увеличиваются в размерах после инкубации при 32°С и при возвращении на 24°С (когда некротическая реакция вновь включается), в то время, как некрозы ts-мутантов по транспорту остаются мелкими, поскольку эти мутанты не способны распространяться при 32°С.

Мутант N¡2519 продуцирует значительные количества структурного белка в изолированных клетках заражённого листа при непермиссивной температуре (Bosch

and Jockusch, 1972), однако при этом не происходит образования инфекционного вируса. Таким образом, N¡2519 дефектен сразу по двум функциям. Реконструкция TMV может быть условно подразделена на две фазы. Первая фаза (инициация реконструкции) состоит в образовании специфического комплекса между определенным участком молекулы РНК TMV (сайт начала сборки, origin of assembly -Оа) и белком оболочки в форме 20S-arperaTOB. Вторая фаза реконструкции (элонгация), по-видимому, менее специфична, чем первая, и заключается в одевании белком той части молекулы РНК TMV, которая находится за пределами Оа. Оа распложен на расстоянии 800-1000 нуклеотидов от У -конца молекулы РНК, и сборха TMV происходит, таким образом, в двух направлениях из одной внутренней точки (Оа) РНК TMV (Otsuki et al., 1977).

Мы обнаружили, что температурочувствительной является стадия инициации реконструкции N¡2519. От температуры достройки первичного комплекса (неполный нуклеопротеидный комплекс, Н-НПК) инфекционность получаемого вируса практически не зависит (табл. 1).

Таблица 1. Воздействие температуры па разные этапы реконструкции NÍ2519

Компоненты инкубационной смеси Температура получения Н-НПК Температура достройки Н-НПК Инфекционност ь

РНК Белок (инициация), °С (элонгация), °С

24 24 83

N¡2519 А14 33 69

33 24 2

33 1

Примечание. Н-НПК получали в опытах по ограниченной (90-секундной) реконструкции. Реконструкцию проводили в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,3 при 24 0 и 33°. Полученный Н-НПК выделяли центрифугированием и достраивали до полного вируса также при 24° и 33". Инфекционность определяли как среднее для 6-8 листьев число некрозов, вызываемых на половине листа растения N. glutinosa реконструированным материалом в концентрации 50 мкг/мл. Приведены средние цифры для 2-5 независимых опытов.

Использование для реконструкции РНК и белка tr штамма показало, что на инфекционность вируса не влияет температура ни на одной стадии сборки.

Был проведён элекгронномикроскопический анализ структуры Н-НПК. Ранее (Butler et al., 1977; Lebeurier et al., 1977) , была определена структура Н-НПК для обычного, tr , штамма TMV: такие комплексы имеют два конца свободной РНК, находящиеся на одном конце растущего нуклеопротеида. Структура Н-НПК N¡2519, полученных при 33°, отличалась принципиально: они состояли из двух участков РНК, соединённых участком свободной РНК (Рис. 1). Реулыаты свидетельствуют, что при непермиссивной температуре инициация реконструкции NÍ2519 происходит не в

одном, а как минимум в двух участках РНК.

300

■Мч'"'

Рис. 1. Электронные микрофотографии неполных нуклео-протещщых комплексов (Н-НПК), образованных при инициации реконструкции мутанта ТМУ N¡2519 при 24° (А) и 33° (Б-3). Стрелками указано положение участков свободной РНК

В связи с этим было важно изучить причины формирования дефектных вирусных частиц (ДВЧ) в процессе полной (а не ограниченной) реконструкции.

Рис. 2. Фракционирование в градиенте концентрации сахарозы (3-22%) РНК из частиц, реконструированных с использованием РНК tr штамма vulgare при 24° (А) и 33°(В), и РНК №2519 при 24°( С) и 33° (D). Перед выделением РНК частицы обрабатывали РНКазой. Вертикальные стрелки соответствуют положению натавной РНК.

Горизонтальные стрелки указывают направление седиментации

Сопоставление длин двух фрагментов РНК, защищенных от РНКазы в составе ДВЧ, указало на участок на расстоянии 600-800 нуклеотидов от одного из концов РНК как на незащищённый (Рис. 2). Способность З'-конца РНК TMV быть аминоацилированным гистидином (Oberg and Phiüpson, 1972) позволила определить, что аминоацилируется только короткий фрагмент, т.е. чувствительный к РНКазе сайт находится на расстоянии 600-800 нуклеотидов от З'-конца РНК N¡2519 (табл. 2).

Таблица 2. Гистидкн-акцептирующая способность фрагментов РНК N¡2519

Происхождение РНК

Радиоактивность нерастворимого в ТХУ материала имп/мин на 100 мкл смеси, содержащей 0,25 мкКи 3Н-гистидина _

Опыт 1

Опыт II

Интактный N¡2519

1422

1680

N¡2519, реконструированный при 24°

1535

1462

N¡2519, реконструированный при 33°_

Длинный фрагмент

220

193

Короткий фрагмент

1520

1170

Без РНК (контроль)

248

267

Интактный N¡2519; образец без аминоацилирующих ферментов (контроль)

148

Примечание. - фрагменты РНК выделяли из обработанных РНКазой дефектных вирусных частиц (ДВЧ). Разделение фрагментов осуществляли центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (см. рис. 2)

Для более точной локализации участков инициации реконструкции был использован метод фингерпринта (Pedersen and Haseltine, 1980) с последующим определением нуклеотидной последовательности полученных олигонуклеотидов (Donis-Keller et al., 1977). Оказалось, что большинство олигонуклеотидов, защищаемых в составе Н-НПК N¡2519 (24°), группируются в районе 800-1000 нуклеотидов от З'-конца. В составе Н-НПК N¡2519 (33°) представлены также олигонуклеотады, расположенные в области 300-520 нуклеотидов от З'-конца РЖ. Этот участок (SERF) известен высоким сродством к структурному белку, которое проявляется только в составе фрагментированкой РНК. Скорее всего, при непермиссивной температуре у N¡2519 SERF приобретает способность взаимодействовать с CP одновременно с нормальным участком инициации реконструкции (Оа), что и приводит к образованию ДВЧ (Рис. 3). Известен ппамм коровьего горошка TMV, у которого инициация нормальной сборки вирионов происходит как раз в районе SERF (Fukuda el al., 1980).

Рис. 3 Предлагаемая схема образования дефектных

вирусных частиц (ДВЧ) мутанта ТМУ N¡2519. а, Ь, с - стадии образования комплекса. ИБ! и ИБИ - участки инициации реконструкции. Стрелкой указан участок РНК, доступный действию РНКазы в составе ДВЧ

с (ШШШ^Щт-

' ' 11 --J

RNoi«

2. Комплементация вирусной транспортной функции

Ранее нами было показано, что распространение мутанта N12519 из клетки в клетку может быть комплементировано штаммом-помощником TMV в условиях ДТО (Taliansky el al., 1982а). Но, поскольку N¡2519 является температурочувствительным не только то функции транспорта, но и по функции сборки вирионов (Taliansky el al., 1982b), интерпретация результатов по комплементации транспорта была неоднозначной. Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран мутант TMV LSI, ts по функции транспорта, нормально репродуцирующийся в первоначально заражённых клетках при непермиссивной температуре (Nishiguchi et al., 1978).

Использовали две модельные системы. Первая была направлена на изучение комплементации распространения LSI из клетки в клетку в тканях растения, предварительно системно зараженного tr вирусом. Два типа экспериментов были проведены в рамках первой модельной системы. (У) Использовали растение-хозяин, по-разному отвечавшее на инфекцию LSI (некрозы) и вирус-помощник (системная реакция) при пермиссивной температуре (24°С). Комплементация происходила в условиях смешанной инфекции при непермиссивной для LSI (32°С, факт

комплементации выявлялся с помощью ДТО (24°—+32°—»24°С). (2) Распространите LSI из клетки в клетку в присутствии вируса-помощника напрямую исследовали иммунофлуоресцентной микроскопией.

Во второй модельной системе рассматривался вирусный транспорт из проводящей системы стебля в клетки мезофилла растений предзаражённых вирусом-помощником.

Комплементация распространения LSI из клетки в клетку в условиях дифференциальной температурной обработки

Ранее при комплементации распространения №2519 использовали U1 штамм TMV (Taliansky et al„ 1982а). В последующих экспериментах мы использовали не только этот штамм, но и неродственный вирус PVX (potato virus X, Х-вирус картофеля). Показано, что оба вируса-помощника позволяют мутанту LSI распространяться из точки первоначального заражения при пепермиссивной температуре. Эффективность комплементации LSI (отношение количества увеличившихся в размерах некрозов по отношению к общему количеству некрозов) составляла при использовании в качестве помощника U1 TMV 50-70%, a PVX -30-50%.

Обработка клеток мезофилла табака специфическими флуоресцентными антителами показала, что при 32°С только отдельные клетки обнаруживают присутствие LSI. При 24°С большое количество точек свечения относилось на счет двух и более соседних клеток. В том случае, когда лпетья растений табака были заражены одновременно LSI и PVX, при 32°С обнаруживались кластеры из 3 и более светящихся клеток. То есть неродственный вирус способен комплементировать функцию транспорта LSI.

Распространение вирусных частиц из проводящих тканей стебля в ткани листа

При простом погружении срезанного стебля в вирусную суспензию не происходит проникновения вируса в ткани листьев и заражения растения (Matthews, 1970). Мы изучали влияние предсуществующей а растении вирусной инфекции (вирус-помощник) на способность зависимого вируса проникать из проводящих тканей в клетки листа и реплицироваться в них. Предзаражение верхних листьев растений штаммом TMV U1 приводит к тому, что штамм TMV U2 приобретает способность проникать из проводящих тканей в лист. Это доказывается тем, что экстракты из таких листьев вызывают формирование некрозов на растениях N. sylvestris, что характерно для U2 (U1 на листьях этого растения вызывает системную реакцию).

Заражение верхпих листьев растений томатов Lycopersicon esculentum сорта Маяк вирусом PVX позволяло L штамму TMV (томатный штамм TMV, wt по

отношению к LSI, tr). нроникать из проводящих тканей в ткани листа и там репродуцироваться: экстракт из листьев вызывает на N.sylvestris некрозы, что характерно для L, но ие для PVX.

Таким образом, преинокуляция верхних листьев вирусом-помощником делает их восприимчивыми к заражению зависимым вирусом через проводящие ткани. Следует отметить, что данный эффект не связан с механическим повреждением листьев: инокулированные буфером контрольные растения не обладали способностью к комплементации транспорта зависимого вируса.

Было интересно изучить способность ts-мутанта по транспорту LS1 в данной системе, используя его и как зависимый вирус, и как вирус-помощник. Вторым вирусом был выбран штамм TMV L. Для идентификации двух геномов использовали ДГО: на листьях N. glutinosa штамм L в этих условиях вызывает формирование крупных некрозов, a LS1 - мелких. Как и предпологалось, LS1 мог служить помощником для L только при пермиссивной температуре, в то же время L обеспечивал переход LS1 из проводящих тканей в ткани листа как при 24°С, так и при 32°С.

Таким образом мы показали, что в обеих модельных системах ts функция вирусного транспорта может быть комплементирована не только близкородственным tr штаммом TMV, но и неродственным вирусом — PVX Из чего можно предположить, что вирусспецифическая транспортная функция вируса-помощника «открывает ворота» зависимому вирусу путём модификации клеток растения-хозяина. Влияние нефункциональных и гетсрологичных вирусных транспортных белков трансгснных растений на репродукцию TMV

Ранее было продемонстрировало, что комовирус RCMV может заражать растспия-псхозяева в присутствии тобамовирусов (Malyshenko et aL, 1988, 1989). Мы изучали возможность комплементации транспорта RCMV в растениях табака, экспрессирующих ЗО-kDa транспортный белок TMV. В таких растениях ts транспорта« функция мутанта LS1 комплементируется и вирус приобретает способность распространяться по трансгенному растению при непермиссивной температуре. Оказалось, что эти растения не способны обеспечивать транспорт RCMV. Но в том случае, если трансгенное растение одновременно инокулируют RCMV и LS1 при непермиссивной для LS1 температуре, RCMV приобретает способность накапливаться. Таким образом, доя репродукции в клетках растеиия-нехозяина наличия только транспортного белка недостаточно: требуется либо полный геном TMV, либо какой-то другой, помимо ТБ, TMV-специфический фактор. Также нельзя

исключить, что использованная в эспериментах линия трансгенных растений продуцировала достаточно ТБ для комплементации LSI, но недостаточно для комплементации RCMV.

Таблица 3. Накопление Ш штамма TMV в трансгенных растениях, экспресснрующих температурочувствительный транспортный белок N¡2519_

Линия трансгенного растения Накопление U1 штамма ТМУ в старых листьях (мкг/г ткани)

24°С 33°С 33°С 24°С

I I II III IV V VI I II

Tni-l (N¡2519 ТБ+) 14,0 <0,5 2,6 <0,2 5,8 <0,2 0,5 11,0 15,0

То-4 (U1 ТБ4) 28,0 14,0 - - - - - 18,0 -

Тк-1 (ТБ") 05,0 12,0 46,0 64,0 25,0 54,0 20,0 20,0 22,0

Накопление U1 штамма ТМУ в молодых листьях (мкг/г ткани)

Tni-l (N¡2519 ТБ4) 57,0 13,0 85,0 11,7 15,0 10,5 — 72,0 —

То-4 (U1 ТБ*) 36,0 28,0 — — - - - 14,0 -

Тк-1 (ТБ") 42,0 38,0 92,0 12,0 11,0 125,0 - 24,0 -

Примечание - растения выдерживали при указанной температуре 2 недели до инокуляции Ш. В последней группе экспериментов растения выдерживали 2 недели при 33°С, а затем переносили на 24°С на 2 недели до инокуляции. Линия трансгенных растений Тш-1 продуцировала ТБ N¡2519, линия То-4 - ТБ 1г штамма 1Л, а линия Тк-1 ТБ не экспрессироьала. Содержание вируса определяли методом иммуноферментного анализа.

Было показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие транспортный белок мутанта N¡2519, (а) не обладают устойчивостью к штамму ТМУ Ш при пермиссивной для транспортного белка № 2519 температуре (24°С), (б) приобретают определённый уровень устойчивости к ТМУ Ш при 33°С (непермиссивная для ТБ мутанта температура) (табл. 3,4).

Если вирусная транспортная функция не выполняется (белок не синтезируется или является дефектным), то в этом случае при инокуляции вирус остаётся блокированным в первично заражённых клетках. Продукция нефункционального или частично функционального транспортного белка в растении способна привести к ограничению распространения вируса дикого типа в таком растении за счёт конкуренции с нормальным транспортным белком: например, дефектный белок сохраняет способность связываться с РНК, но утрачивает способность взаимодействовать с плазмодесмами. Или наоборот. Подобного рода растения могут оказаться устойчивыми не только по отношению к близкородственному вирусу, но и к некоторым неродственным.

Таблица 4. Накопление U1 штамма TMV при 33°С в иеииокулированиых (системных) листьях растении табака, экспрессирующих транспортный белок N¡2519

Порядковый номер листа Накопление U1 штамма TMV в растениях (мкг/г ткани)

I II 111

Tni-1 (N¡2519 ТБ") Тк-1 (ТБ") Tni-1 (N¡2519 ТБ*) Тк-1 (ТБ") Tni-1 (N¡2519 ТВ*) Тк-1 (ТБ")

1 0,5 10,0 - - 1,8 3,5

2 0,9 10,0 <0,2 30,0 1,0 2,7

3 0,3 8,0 <0,2 35,0 1,2 3,6

4 <0,2 7,0 <0,2 40,0 - -

5 <0,2 8,0 - - 0,5 3,8

6 - - <0,2 10,0 0,5 1,8

Примечание - см. Примечание к Таблице 3. В данных экспериментах растения на протяжении всего времени выдерживали при 33°С.

Были также тестированы растения табака, экспрессирующие ген За (транспортный белок) BMV (Brome Mosaic Virus, вирус мозаики костра) - члена семейства Bromoviridae. BMV способен служить помощником для распространения TMV в растениях ячменя (Hamilton and Nicols, 1977), а некоторые тобамовирусы способны комплементировать транспорт BMV из клетки в клетку в растениях фасоли и томатов (Taliansky et al., 1982е).

Наши результаты однозначно свидетельствуют, что накопление штамма U1 TMV в трансгенных растенях табака, экспрессирующих транспортный белок BMV было значительно снижено по сравнению с контрольными растениями (Табл. 5).

Таблица 5. Накопление ТМУ в инокулированных листьях трансгенных растений табака, экспрессирующих транспортный белок вируса мозаики костра (ВМУ)

Линия трансгенного растения Накопление U1 штамма TMV в старых листьях (мкг/г ткани)

I II 1П IV V

Tbmv-1 (BMV ТБ*) 0,5 2,0 0,6 <0,2 0,6

Тк-1 (ТБ") 25,0 18,0 12,7 2,5 42,0

Накопление U1 штамма TMV в молодых листьях (мкг/г ткани)

Tbmv-1 (BMV ТБ+) 1,0 7,0 - 1,3 —

Тк-1 (ПТ) 82,0 42,0 - 62,0 -

Примечание - см Примечание к Таблице 3

Вирус огуречной мозаики (CMV)

CMV является икосаэдрическим вирусом растений с чрезвычайно широким спектром растений-хозяев - около 1000 видов (Lot et al., 1991). Как к другие представители семейства Bromoviridae, геном CMV состоит из трёх геномных РНК положительной полярности, которые кодируют 5 белков (Рис. 4). Белки 111- и 97-KDa, кодируемые РНК 1 и 2 соответственно, являются компонентами репликазы CMV (Hayes and Buck, 1990). РНКЗ кодирует белок За (ТБ, ЗО-kDa), ответственный за транспорт из клетки в клетку и за дальний транспорт CMV, и белок оболочки (CP, 24-kDa), который транслируется с субгеномной РНК4 и также играет роль в распространении вируса (Suzuki et al., 1991). РНК2 наряду с белком 2а кодирует небольшой белок 2Ъ (11 k-Da), транслирующийся с субгеномной РНК4А; этот белок является супрессором еайленсинга (Ding et al., 1995а), что позволяет вирусу избегать защитные системы растения-хозяина. Как следствие, 2Ь оказывает существенное влияние на характер симптомов инфекции.

и ом

(ШЮ

¥ САР

-S

_±ГОН RNA 1

5* САР

САГ

За ORF (ЗОЮ

CP ORF (*л Iii

5'САГ

ОН

он

3-357 ИМ

2а OR*

(9? Iii

он RNA 2

* 4--1 30 50 т

2b ORF

ill ю

Г САР г—Ч>У0Н

RNA4A «jSSni

RNA 3 2216 lit

RNA 4 1031 nt

Рис. 4. Структура генома вируса огуречной мозаики (CMV). РНК 1, 2 и 3 геномные, РНК4 - субгеномная РНК структурного белка. РНКЗ содержит ген За, кодирующий транспортный За белок, и ген структурного белка. РНК4А кодирует 2Ь белок, супрессор сайленсянга. ORF (open reading frame) - открытая рамка считывания. Данный рисунок сделан согласно Roossinck (2002) с модификациями

РНКЗ СМУ кодирует два белка: 30-Ша За белок, дефекты которого не влияют на репликацию в протопластах, но влияют на локальный (от клетки к клетке) и системный (от инокулврованного листа к неинокулированному) транспорт вируса, а

также 24-kDa белок оболочки (CP), который влияет на накопление вируса в протопластах и на локальный и системный транспорт (Suzuki el al., 1991). По аналогии с другими вирусами и на основе алаймента последовательностей белков, За ген считался кодирующим транспортный белок, отвечающий за локальный н, возможно, системный транспорт по растению (Davies and Symons, 1988; Melcher, 1990; van dcr Kuyl el al., 1991; Poirson el ah, 1993). Способность За белка перемещаться и переносить РНК из клетки в клетку, как и увеличивать размер плазмодссм, была ранее продемонстрирована (Vaquero el al., 1994; Ding el al., 1995). С другой стороны, для эффективного локального транспорта CMV, в отличии от TMV, требуется CP, так что вполне можно было ожидать различий свойств транспортных белков этих вирусов. Поэтому мы изучали способность трансгенных растений комплементировать транспорт мутантов CMV по гену транспортного белка и определяли участки гена За, необходимые для вирусного транспорта.

1. Характеристика мутантов по За белку

Для изучения роли За белка на основе биологически активного клона РНКЗ Fny-CMV были сконструированы мутанты по гену За (Рис. 5). Далее РНК транскрипты различных мутантных кДНКЗ клопов транслировали в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кролика Трансляция транскрипта дикого типа (wt) выявила три основных полипептида: За, CP и белок промежуточного размера, по всей видимости являющийся продуктом трансляции со второго AUG кодона (аминокислота 35) гена За, всего кодирующего 279 аминокислот. Этот третий белок и CP были основными продуктами трансляции у РНК двух мутантов, у которых либо был удалён первый инициаторпый кодон (AAUG), либо имелся сдвиг рамки после четвёртой аминокислоты (AUG-fs). РНК мутант ДНра1, имевшего делецию 43 С-концевых аминокислот , при трансляции давала продукт заметно короче продукта мутанта AAUG (минус 34 аминокислоты с N-конца).

РНКЗ мутанта с делецией 70 С-концевых аминокислот (ДЕ-Н) давала при трансляции белок несколько меньшего размера, чем wt CP (218 аминокислот), —За белок этого мутанта содержит 208 аминокислот. Трансляция мутанта со сдвигом рамки Nhe-fs приводила к образованию белка из 175 аминокислот, дополнительная полоса с молекулярной массой 35-kDa предположительно является димером продукта трансляции. Мутант ДКрп1 имел делецию 167 аминокислот (без сдвига рамки трансляции РНК, аминокислоты 7-173). Ожидавшийся белок размером 112 аминокислот не был обнаружен: возможно, причиной тому было удаление всех метиошшов за исключением шшциаторного.

-Transgenic plants —

Aval QpI

Styl Kpnl Nhel Hpal

к/ N К

S'NTR.% / ЗА Gene

'AUG

RNA3 WT, 2216m [ Nhel-fs (A8nt) [

ДКрпХ СД501ПЦ ÄHpal (Ai24nt)

-V

ДЕ-Н (Д202п() Д AUG (A12nt) AUG-fs (+4nl)

AUGг

AUS,

Nrul

ICR CP Gene 3'NTR

Infectivity on Plants

За (+) За (-)

+ +

-4-

Рис. 5. Внесение мутаций в ген транспортного белка (За) CMV; способность мутантных вирусов заражать трансгенные За(+) и нетрансгенные За(-) растения табака. NTR - S'-нетранслируемый район, ICR - интерцистронный район между генами За и структурного белка. Transgenic plants - обозначен участок, использованный для получения За трансгенных растений

Транекрипты РНКЗ различных мутантов совместно с транскриптами РНК1 и РНК2 вводили в протопласты табака методом электропорацш. Все мутанты эффективно реплицировались в протопластах. Мутанта с большими делециями (АЕ-Н и AKpnl), как и ожидалось, продуцировали РНКЗ значительно меньшего размера, чем остальные, при этом размер РШС4 был для всех мутантов и wt неизменным (Рис. 6).

Рис. б Продукция вирусных RNA 1 +2 РНК CMV в протопластах, RNA 3 изолированных из нетранс-генных растений табака. Трансфекцию осуществляли RNA 4 элекгропорацией. Варианты мутантных РНКЗ перед заражением смешивали с транскриптами РНК1 и 2. Зондом для детекции являлась меченная РНК, комплементарная 3'-концу всех 4 РНК CMV. Стрелками указаны положения полноразмерных РНК1-2, РНКЗ и РНК4.

RNA 3

ДКрп! | ДНра! j ÄAUG j WT ДЕ-Н Nhel-fs AUG-fs

2. Комплементация За мута1гтов в растениях, экспрсссирующих За белок

При заражении нетрансгенных растений табака транскриптами РНК1, 2 и мутантной РНКЗ, только «Ч и мутант ДНра1 были способны накапливаться и вызывать типичные симптомы инфекции СМУ. Когда заражали За-трансгенные растения, то все мутанты эффективно реплицировались и системно распространялись по растению. Все мутанты, кроме ДНра1, вызывали только сильное просветление жилок, а не ярко выраженные симптомы, характерные для СМУ; ЛНра! вызывал симптомы, неотличимые от Ш. Однако с помощью гибридизации было продемонстрировано, что мутанты накапливаются до сравнимых с уровней (Рис. 7). Через 2-3 недели после инокуляции из растений выделяли вирусы и их количество у мутантов также было сравнимо с количеством вируса дикого типа. Когда полученными вирусными препаратами инокулировали нетрансгенные растения, то инфекции не наблюдалось (кроме ДНра!) (Рис. 5), что свидетельствует об отсутствии рекомбинации мутантного вируса с трансгеном.

Рис. 7. Накопление вирусных РНК мутантами СМУ в трансгенных растенях табака, экспрессируюших транспортный белок СМ\'. Детекцию проводили при помощи меченной РНК, комплементарной З'-концу всех 4 РНК СМУ

Накопление мутантных вирусов до уровня дикого вируса было достаточно неожиданным,™. уровень За белка в трансгенных растениях ниже такового в заражённых растенияхи вызываемые дефектными мутантами симптомы заметно более мягкие, чем у Для сравнения кинетики накопления мутантов с был выбрал мутант ДКрп1 - накопление вирусных РНК сравнивали в инокулированных и системных листьях 2, 4 и б дней после заражения растений. Через 6 дней уровень накопления вирусных РНК как в инокулированных, так и в системных листьях был примерно одинаковым (Рис. 8). С другой стороны, на 2-ой и 4-ый день после инокуляции ДКрп1 отставал от что, возможно, связано с ограниченным количеством доступного трансгенного За белка.

Рис. 8 Сравнение скорости накопления вирусных РНК мутанта АКрп! и wt CMV в трансгенных растениях через 2, 4 и 6 дней после заражения, sys - системные листья, inoc - инокулированные. Детекцию осуществляли меченной РНК, комплементарной 3'-концу всех 4 PHKCMV

3. Комплементация транспорта гетеролегичных вирусов в За-трансгенных растениях

Мы также тестировали ряд вирусов в трансгенных растениях табака на предмет возможности комплементации их транспорта в табаке. Из всех использованных вирусов только BMV (вирус мозаики костра) и PSV (вирус задержки роста арахиса) приобретали способность к локальному распространению в кнокулированиом листе; оба этих вируса относятся к тому же семейству Sromoviridae, что и сам CMV.

4. Определение аминокислотных последовательностей За белка, необходимых для осуществления его функции вирусного транспорта Мутант AKpni, у которого отсутствуют аминокислоты 7-173, мог распространяться только в трансгенкых растениях. У него отсутствовили 2/3 N-концевого района За белка. Мутант Nhe-fs, содержащий сдвиг рамки после аминокислоты 175, обладал таким же фенотипом. Таким образом, треть С-концевого района За белка содержит важные последовательности. Мутант ДЕ-Н содержал делению 70 С-концевых аминокислот и тоже был неспособен реплицироваться и распространяться в нетрансгенных растениях. Однако мутант ДНра1, у которого отсутствовали 43 С-концевых аминокислоты, сохранял способность заражать нетрансгенные растения и вызывать ярко выраженные симптомы. Анализ нуклеотидной последовательности вирусного потомства из растений подтвердил присутствие изначально внесённой делеции.

У мутанта AAUG был удалён первый AUG-кодон, второй AUG-кодон (в той же рамке считывания) находится на позиции аминокислоты 35. И хотя такая РНК давала продукт в белоксинтезирующей системе, мутант был неспособен заражать нетрансгенные растения. Таким образом, первые 34 аминокислоты белка За содержат последовательность, необходимую для вирусного транспорта.

Мутант AUG-fs содержал вставку 4 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания после 4-ой аминокислоты. Мутант не заражал нетрансгенные растения, но в трансгенных растениях спустя 3 недели после заражения происходило изменение

симптомов инфекции: на смену просветлению жилок приходили выраженные симптомы CMV (яркая мозаика и нарушение формы листа). Выделецпый вирус был способен заражать нетрансгенные растения. Секвенирование гена За вирусного потомства выявило делецшо одного из 4 нуклеотидов исходной инсерции, что приводило к восстановлению рамки считывания белка За с добавлением одной аминокислоты (Gin) после 4-ой. В нетрансгенных растениях такой вирус лишь незначительно отставал по времени появления симптомов от wt.

5. Образование делении в дефектных РНКЗ при пассаже в трансгенных растениях табака, экспрссспрующих ген За CMV

Дефектные интерферирующие (DI) РНК, оказывающие влияние на накопление вирусных геномных РНК, описаны для ряда вирусов растений (Simon and Bujarski, 1994; Graves et al., 1996; Simon andNagi, 1996, White, 1996). Однако y членов семейства Bromoviridae были обнаружены дефектные (D) РНК, не интерферирующие с накоплением материнского вируса (Graves et al., 1996). В случае Fny штамма CMV были описаны две D-РНК, содержащие делеции в гене За с сохранением рамки считывания, накапливающиеся в присутствии wt РНКЗ (Graves and Roossinck, 1995). В более ранних исследованиях такие РНК не обнаруживались (Roossinck and Palukaitis, 1990). Кроме того, никаких природных D-РНК у РНК1 и РНК2 не было описано (Hayes and Buck, 1990).

Принято считать, что D-РНК растительных вирусов образуются в результате рекомбинации, включающей смену матриц (Nagy and Simon, 1997). D-РНК CMV могут образовываться как в результате гомологичной, так и негомологичной рекомбинации (Graves et al., 1996). С целью дальнейшего изучения этой проблемы За мутанты РНКЗ (Рис. 5) подвергали многократным пассажам в трансгенных растениях (Рис. 10 и 11). Была изучена стабильность исходных вариантов РНКЗ, среди которых были как мутанты со сдвигом рамки, так и с сохранением рамки считывания гена За.

РНКЗ wt состоит из 2216 нуклеотидов; РНК мутантов Nhe-fs и [M]-Nhe-fs (M штамм CMV) содержали делецию 8 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания; ДЕ-Н содержал делещпо в 202 нуклеотида; ДКрп1 делецию в 501 нуклеотид и AAUG - в 12 нуклеотидов. Эти РНК смешивали с транскриптами РНК1 и РНК2 и шшокулировали трансгенные растения табака. На протяжении 6 пассажей было обнаружено делегирование дополнительных последовательностей гена За, приводившее во всех случаях к восстановлению рамки считывания (Рис. 11).

5. 1. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта Nhe-fs

Исходная деления мутанта Nhe-ts составляла 8 нуклеотидов и приводила к сдвигу рамки считывания, в результате трансляция белка терминировалась после аминокислоты 175 (из 279 у За белка wt). В результате одного пассажа в За-трансгенных растениях (2 недели) мутантная РНКЗ накапливалась в количествах, сравнимых с wt. Электрофоретическая подвижность обеих РНКЗ не отличалась. Однако после 6 пассажей РНКЗ мутанта, неотличимая по размеру от РНК wt, полностью исчезала и замещалась новой РНК, по размеру находящейся между РНКЗ и РНК4. При анализе потомства РНКЗ мутанта после 3 пассажей оказалось, что наряду с полноразмерной РНКЗ (-8 нуклеотидов) появляется укороченный вариант (Рис. 10, 11). Укороченная РНКЗ после 3 пассажей была несколько больше по размеру, чем после 6. Во всех случаях уровень накопления всех РНК CMV был практически одинаковым, что свидетельствовало об отсутствии интерференции новых вариантов РНКЗ с репликацией или инкапсидированием РНК1, 2 и 4.

5.2. Рекомбинация дефектных РНКЗ мутанта [Mj-Nhe-fs в трансгенных растениях При пассажах мутантов с дефектными РНКЗ в трансгенных растениях иногда наблюдалось резкое изменение симптомов: просветление жилок сменялось типичной для wt мозаикой (Рис. 9).

А Б

Рис. 9 Экспрессирутощие ТБ СМУ трансгенные растения, заражённые мутантом [М]-КЬе-Г8. А - растение на ранней стадии проявления симптомов рекомбинантного вируса, на одном из верхних листьев видны две яркие точки; Б - слева растение с типичными для мутантов, содержащих дефектные (О) РНКЗ. симптомами ; справа растение, в котором произошла рекомбинация й-РНКЗ с трансгеном

Вирусное потомство из таких растений было способно заражать нетрансгенные растения. Дня выявления возможной рекомбинации использовали РНКЗ мутанта М-

штамма CMV, несущую ряд нуклеотидных замен по сравнению со штаммом Fny (источник трансгена). Из 1 ООО трансгенных растений, инокулированных мутантом [М]-Nhe-fs (Рис. 11), со временем 9 растений приобрели симптомы дикого типа штамма М. Определение нуклеотидной последовательности вирусного потомства (инкапсидируемых РНК) показало, что рекомбинация происходила в межцистронном районе РНКЗ (ICR, Рис. 5) и во всех случаях была точной (без вставки или делеции нуклеотидов). Рекомбинантные РНКЗ содержали ген За Fny и ген белка оболочки М-CMV Следует отметить, что образующаяся в результате рекомбинации РНКЗ полностью вытесняла исходную мутантную форму, т.е. даже в трансгенных растениях ока обладала селективным преимуществом.

5,3. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта АЕ-Н

Данный мутант содержал делению 202 нуклеотидов, приводящую к сдвигу рамки считывания. Мы проводили 6 пассажей в трансгенных растениях табака, в каждом из которых спустя 2 недели после инокуляции все 4 РНК мутанта накапливались до уровней дикого типа CMV. Уровень накопления при первом и шестом пассаже практически не менялся. Однако при шестом пассаже уже не обнаруживалось РНК с делецией в 202 нуклеотида - она била полностью вытеснена новой D-PHK3, которая лишь незначительно превосходила по размеру субгеномную РНК4. Секвенирование РНКЗ из преаратов вируса показало, что РНКЗ была полностью заменена на один тип D-PHK3, содержащий делецию 943 нуклеотидов: делеция простирается на нуклеотида 91-1033 или 92-1004 (Рис. 10, 11).

Рис. 10. Образование делеций в дефектных РНКЗ.

RNA П2

А - после первого пассажа (2-3 недели),

RNA 3

В - после 6 пассажей в растениях, экспрессирующих транспортный белок CMV. healthy - здоровое растение.

ЯМА 4

Треугольниками обозначены вновьобразованные РНК.

Детекцию проводили при помощи меченной РНК, комплементарной З'-концу всех 4 РНК СМУ

HNA 1+2

ЯНА 3

RNA4

Таким образом, делетировашпо подвергается не только кодирующая область гена За, но дополнительно 28 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области (NTR) и 79 из межцистронного района (IGR). Как и в случае ряда других D-PHK3, фланкирующие делецию районы содержат последовательности, состоящие из одного типа нуклеотидов.

5.4. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта ЛКрпI

Мутант ДКрп1 содержал делецию без сдвига рамки размером в 501 нуклеотид [нуклеотиды 137-637], исключающую аминокислоты 7-172 из 279 аминокислот белка За. Мутант подвергали серии из 6 пассажей так же, как и в случае других мутантов. И хотя не наблюдалось изменения в размере исходной РНК, секвенирование потомства из двух растений выявило наличие дополнительной делеции [нуклеотиды 65б(9)-685(8)] (Рис. 11).

5.5. Полноценная РНКЗ, образующаяся при пассаже мутанта AAUG

AAUG был способен заражать только трансгенные растения (Рис. 5). Однако спустя несколько недель слабые симптомы на трансгенных растениях сменялись на сильные, типичные для дикого типа, и потомство мутантного вируса приобретало способность заражать петрансгепные растения. Определение нуклеотидной последовательности РНКЗ в вирусных препаратах показало, что последовательность AUU в непосредственной близости перед 12-нуклеотидной делецией (включающей в себя инициаторный кодон AUG), мутировала в AUG. А так как этот новый AUG находился в рамке трансляции За, то образующийся белок являлся белком За, у которого только 2-ая и 3-ья аминокислоты отличались от wt: аланин был замещён фенилалатшом, а серии - аргинином. Пассаж псевдоревертапта AAUG в трансгенных растениях не приводил к изменению размера РНКЗ и никакого образования делений или прочих изменений не наблюдалось (Рис. 11). Потомство псевдоревертапта сохраняло способность заражать нетрапсгецные растения и вызывать симптомы, неотличимые от вируса дикого типа. Таким образом, вариант РНКЗ, кодирующей функциональный транспортный белок, не подвергается делецип в трансгенных растениях, где транспортная функция комплементируется продуктом трансгена, т.е. даже в условиях комплементации вирус, кодирующий полпоцепный За белок, имеет селективное преимущество по сравнению с мутантом, чей транспорт комплементируется in trans.

paoj

RNA3 wt ЫДШ _

За protein

Nftel-fs

[M]-Af/iel-fs |

&E-H

AKprA

AAUG

D-RNA 3a D-RNA 3P

91(2)

[956} —

:::*Е2ЙГ

137 637

137 637 •

U I 656(9) 685(6)

117 12В

331 486

Рис. 11. Сравнение делеций мутантов РНКЗ CMV до и после пассажей в трансгенных растениях табака, экспрессирующих транспортный белок (За) CMV. Некодирующие участки закрашены. NTR - 5'-нетранслируемый район, IGR - интерцистронный район между генами За и структурного белка. Цифры указывают границы делеций. Последние две РНК (D-RNA 3a and 3(3, ) иногда образуются в нетрансгенных растениях, но существуют только в присутствии полноценной РНКЗ. * -новый AUG кодон, формируемый в РНКЗ мутанта AAUG при пассажах в трансгенных растениях

6. Образование делеций в РНКЗ при пассаже в нетрансгенных растениях табака и инкапсиднрование таких РНК

Ранее были описаны две D-PHK3, обнаруженные в нетрансгенных расгниях табака (Graves arid Roossinck, 1995; см. «Образование делеций в дефектных РНКЗ при пассаже в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген За CMV» и Рис. 11). Нами были обнаружены и охарактеризованы ещё две похожих D-PHK3 из нетрансгенных растений:

Э-ЯЫА 3-1 штамма Рпу [деления нуклеотидов 296(7)-634(5)] и [М] D-RNA 3-2 штамма М [делеция 303-713]. Обе этих О-РНКЗ возникали и сохранялись в присутствии РНКЗ при пассировании в растениях табака, но исчезали при заражении растений кабачка: следы таких Р-РНКЗ можно было обнаружить только в инокулированных семядолях кабачка и только с помощью особовысокочувствительного метода ИТ-РОЯ. В верхних, системных, листьях кабачка В-РНКЗ не детектировались. Вирусные частицы, выделенные из заражённых семядолей, не содержали О-РНКЗ.

D RNA 3-1

Squash

Squash Tobacco L С M

WT RNA 3* D RNA 3-i®

Рис. 12. Анализ методом RT-PCR •WT RNA 3 репликации и инкапсндирования *D RNA 3-1 D-PHK3-1 в семядолях (с) или в системных листьях (!) растениий кабачка (squash), и в системных листьях табака.

(a) из заражённых препаратами CMV с D-PHK3-i (+) или без (-) растений через 2 недели выделяли вирус, а затем из вируса выделяли РНК;

(b) тотальную РНК из растений выделяли через неделю после инокуляции;

Продукты RT-PCR анализировали электрофорезом в агарозном геле. М - маркёры размера (1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600 и 500 нуклеотидных пар)

WT vDKHAi-i Wf

Таким образом, отсутствие D-PHK3 з листьях кабачка, системно заражённых CMV, обусловлно отсутствием инкапсндирования D-PHK3 в данном растении-хозяине, что приводит к неспособности дефектной РНКЗ системно распространяться.

7. Определение последовательностей транспортного белка CMV, влияющих на накопление и системную инфекцию вируса в растениях табака Считается, что белок За CMV не имеет никаких функций кроме обеспечения вирусного транспорта в процессе инфекции (Suzuki et ah, 1991). В связи с этим маловероятно, что мутации в этом белке могут иметь плейотропное действие на другие вирусные функции. Тем не менее, некоторые различия в аминокислотной последовательности транспортного белка могут по-разному проявляться в разных растениях-хозяевах (Zhang and Palukaitis, 1993), свидетельствуя о том, что взаимодействие между За белком и данным видом растения может зависеть от

изменения всего нескольких аминокислот За белка. Подобные наблюдения были сделаны и для За транспортного белка бромовирусов (De Jong cl ai, 1995; Fujita el al., 1996).

Мы обнаружили, что в системно заражённых (нсинокулировьшных) листьях табака многие штаммы CMV. включая Fny, не накапливаются равномерно, а проявляют некую цикличность: т.е. листья с высоким содержанием вируса и яркими симптомами перемежаются с бессимптомными листьями с низким вирусным титром. В противоположность этому штамм Sny не проявляет цикличности симптомов и имеет менее выраженные различия в накоплении вируса в разных листьях. Таким образом, штамм Sny более равномерно распределён в заражённых растениях табака, чем Fny; кроме того, растения в случае Sny содержали более высокий уровень ТБ За - что наблюдалось также в протопластах кабачка, и было менее ярко выражено в табачных проталгетах. Исследованные нами штаммы также различались по способности системно распространяться в растениях кабачка (Roossinck and Palukaius, 1990): инфекция Sny ограничивалась инокулированиымн семядолями, но не проникала в листья. Повышенный уровень продукции За белка Sny не обеспечивает системного распространения Sny; и табаке За белок Sny накапливался в больших количествах чем За Fny, но это также не сказывалось на скорости распространения системной инфекции. Мы определяли отличия ТБ двух штаммов, определяющие повышенную продукцию ТБ Sny по сравнению с Fny в табаке и более равномерное накопление Sny в листьях разных уровней этого растения-хозяина, а также приводили к неспособности Sny заражать кабачки системно.

Поскольку транспортный белок CMV транслируется с РНКЗ, было логично предположить, что РНКЗ, содержит последовательности, отвечающие за различия в накоплении За белков двух штаммов. Заражение растений табака транскриптами РНК1 и 2 штамма Fny вместе с транскриптом РНКЗ штамма Sny вызывало сильные симптомы (нарушение формы листьев и подавление роста растений). Уровень вирусспецифических РНК в случае Fny был сходным с псевдорекомбинантом FFS. Тем не менее, иммуноблот-анализом детектировалось в 25 раз больше За белка в случае инокуляции псевдорекомбинантом, хотя уровнь накопления CP практически не отличался. Таким образом, РНКЗ Sny в составе псевдорекомбинанта FFS обуславливала фенотип, отвечающий за гиперпродукцию За белка в табаке. Для определения последовательностей РНКЗ Sny, ответственных за высокий уровень За белка, нами был сконструирован ряд химерных Sny/Fny РНКЗ (в том числе F/S и S/F, котроые содержали ТБ и CP разных штаммов). Анализ этой пары химер показал, что

ярко выраженные симптомы, вызываемые ими на табаке, не являются следствием изменения уровня накопления самого белка За, а, скорее, обусловлены различиями последовательностей генов белков оболочки двух штаммов или граничащих с ними последовательностями. Эксперименты по инфекционности подтвердили предположение, что высокий уровень продукции За белка может быть картирован на 5'- половине РНКЗ, а степень выраженности симптомов инфекции определяется 100 14-концевыми аминокислотами СР. Повышенное накопление За белка определялось районом 1294 5'-концевых нукяеотидов РНКЗ Бпу, содержащим ген За и граничащие с ним нетранслируемые последовательности.

8. Последовательности транспортного белка СМУ,

контролирующие системную инфекцию в растениях кабачка

Псевдорекомбинант РИЗ, содержащий РНКЗ штамма 8пу, как и сам штамм Бпу,

эффективно заражал растения табака системно, но не давал системной инфекции в

кабачках: на инокулированных семядолях образовывались некрозы, вирус в них

накапливался на уровне Рпу, но верхние листья не проявляли симптомов и не

обнаруживали присутствия ни вирусных РНК, ни белков (Рис. 13).

Рис. 13. Накопление РНК, транспортного и

структурного белков в растениях кабачка,

зараженных 3 вирусами, содержащими три варианта РНКЗ СМУ. Определение проводили через 7 дней после заражения в семядолях (с) или в системных листьях (/). А - детекция вирус-специфических РНК при помощи меченной РНК, комплементарной 3: -концу всех 4 РНК СМУ. В - детекция транспортного (За) и структурного (СР) белков методом иммуно-блота с исполь-зованием соответствующих антисывороток. Треугольниками указано положение соответствующего белка

И Рпу №3 Р/К

ес1с1е1с1с1

М М Гау (М>8) __

ЙЙ5 Р5ММО

За

1Щ

¿о -СР

<? ! с I а {

Это означает, что не распространение инфекции за пределы инокулированных семядолей кабачка происходит не из-за неспособности БИв реплицироваться в них.

Это также свидетельствует, что происходит распространение псевдорекомбинанта от клетки к клетке в пределах семядолей.

Следующим этапом исследования было выяснение того, определяется ли ограничение накопления Бпу только в семядолях различиями в последовательностях транспортного или структурного белка двух штаммов.

Использование химерных РНКЗ (Р/^ и 8/Р) показало, что ограничение транспорта не определяется различиями в генах СР, а, по-видимому, определяется геном За впу. Ранее в экспериментах по изучению поведения этих штаммов в табаке нами были обнаружены три отличия в аминокислотных последовательностях За белка (аминокислоты 51,170 и 240): гиперпродукцию За и цикличность симгпомов инфекции в листьях растений определяли аминокислоты 51 и 240. В кабачке нн аминокислоты 51, 240, ни комбинации 51/170, 170/240 по отдельности не определяли способность к системному распространению. Это позволило предположить, что либо сочетание 51/240, либо наличие всех трёх аминокислот Бпу (51/170/240) блокирует дальний транспорт в кабачке. Замена всех трёх аминокислот За белка Бпу в химере Э/Т на аминокислоты Рпу приводит к появлению способности такого вируса распространяться в кабачке, что подтверждает ранее сделанное предположение об отсутствии влияния нетранслируемыех последовательностей РНКЗ и структурного белка 8пу СМУ на системную инфекцию в этом хозяине.

Для окончательной локализации критических аминокислот использовали двойной мутант , содержавший аминокислоты штамма Эпу Ьув51 и РЬе240. Такой мутант был способен системно заражать растения табака, но не распространялся по растению за пределы нно кулиро ванных семядолей кабачка, что сидетельствует о совместном алиями аминокислот 51 и 240 на взаимодействия вируса с растением-хозяином, приводящие к ограничению системного транспорта СМУ в кабачке.

Затем мы исследовали влияние замен в аминокислотной последовательности белка За на скорость распространения инфекции в семядолях кабачка (локальный транспорт, 01 клетки к клетке). Количество вирусных РНК через 7 дней после инокуляции было примерно одинаковым (Рис. 12 А), было важно оценить скорость распространения штаммов и мутантов в пределах семядолей. Для этого делали отпечатки семядолен на нитроцеллюлозу после удаления нижнего эпидермиса.

Рис.14. Анализ распространения CMV и ряда его мутантов в семядолях кабачка (отпечатки на нитроцеллюлозе после удаления нижнего эпидермиса) 5 (А) и 9 (В, С) дней после инокуляции. Healthy - неияо-кулированная семядоля. Присутствие вируса детектировали меченной РНК, комплементарной 3''-концу всех 4 РНК CMV (А и В). Та же самая мембрана В была впоследствии использована для детекции CP методом

нммуноблота-С

Те вирусы, которые не заражали кабачок системно, были на 5-ый день в значительной степени ограничены размерами некрозов, вызываемых на семядолях. На 9-ый день мутант F51/240 существенно накапливался и распространялся в семядолях, тем не менее не вызывая системной инфекции в растении (Рис. 14, В и С). Накопление вирусных РНК мутанта коррелировало с накоплением CP, однако вирусные РНК и белки не обнаруживались в основных сосудах семядолей (в отличие от Fay).

9. Влияние продукта PIIK1 (белка 1а) на кинетику наконления CMV

в растениях кабачка Детерминанты, определяющие круг растений-хозяев, были ранее картированы на РНК2 и РНКЗ, тогда как быстрое проявлеаие симптомов вирусной инфекции в растениях кабачков связывали с РНК1 (Palukaitis el ol., 1992). Оба вышеназванных

фенотипа сильно зависят от сорта растения и могут отражать какие-то высокоспецифические взаимодействия между вирусом и растением-хозяином.

Мы сравнивали скорость накопления вирусных РНК двух штаммов (Рпу и Зпу) в семядолях: у штамма Рпу оно происходило значительно быстрее, однако к 6 дню уровень выравнивался. В то же время в изолированных протопластах кабачков РНК и белки обоих штаммов накапливались с одинаковой скоростью. В дальнейшем для исключения влияния продуктов РНК2 и 3 на скорость распространения по растению, нами вместо Эпу был использован псевдорекомбинантный вирус, содержавший РНК) штамма Бпу и РНК2 и 3 Рпу (81Т).

Для изучения различий в репликации и распространении двух штаммов в семядолях кабачков применялся метод отпечатков: у заражённых семядолей удаляли нижний эпидермис, а затем делали отпечатки на нитроцеллюлозу. Вирусные РНК детектировали гибридизацией, а СР (белок оболочки) методом иммуноблота. Хотя количество сайтов инфекции у Рпу и 8пу было примерно равным, размер поражённых Рпу участков увеличивался намного быстрее. Это касалось и вирусных РНК, и СР. Таким образом, не только РНК2 и 3, но и РНК1 (и продуцируемый ею белок ¡а) оказывает влияние на скорость распространения СМУ в растениях.

10. Для распространения СМУ из клетки в клетку нужен белок оболочки (СР)> но не вирионы

У бромовируса хлоротической крапчатости коровьего горошка (ССМУ), достаточно близкого к СМУ, 25 Ы-концевых аминокислот СР находятся на внутренней поверхности сферической вирусной частицы (5ре1г е! а!., 1995), что, предположительно, верно и дня СМУ; эти аминокислоты в силу их расположения могут либо взаимодействовать с вирусными РНК и способствовать сборке вирусных частиц, либо участвовать в межсубъединичных белок-белховых взаимодействиях и способствовать стабилизации вирионов ^¡коЯГ е! с/., 1997). Кроме того, известно, что аминокислоты 29-33 СР ССМУ и гомологичные им аминокислоты 38-42 СМУ играют ключевую роль в формировании и стабильности вирионов (йрец еГ Ы., 1995; \У1ко£0/' а/., 1997). Для выяснения роли Ы-концевых аминокислот структурного белка в связывании РНК и формировании вирионов нами были получены два делеционных мутанта с сохранением рамки считывания: с делецией аминокислот 15-40 (Д8а1-Кги) или 26-40 (ДБас-Ыги). Кластер основных аминокислот вблизи И-конца СР расположен между аминокислотами 11 и 22, таким образом 5 из 9 аминокислот этого кластера были удалены у мутанта ДБаЬКги, но оставались у ДБас-Мги. В растениях N. с1е\е1епс1п и N. ЬешЬат'шт оба мутанта вызывали ситемную инфекцию; СМУ и ДБас-Ыги вызывали

схоже симптомы, а инфекция ASal-Nru развивалась более медленно и симптомы были менее выражены. После множественных пассажей в табаке мутант ASal-Nru приобретал способность системно заражать растения табака. Секвенирование такого потомства, обозначенного как ASal-Nru*, подтвердило наличие исходной делиции аминокислот 15-40 и не обнаружило мутаций вблизи границ делеции. Тем не менее, в удалённых районах CP было обнаружено три аминокислотных замены: Asp-81 ( GAC) был заменён на Glu (GAA ), Leu-166 (CUG ) на Val (GUG) и Met-173 (AUG ) на Arg (AGG ). Никаких других, кроме перечисленных, нуклеотидных замен не наблюдалось.

В растениях лебеды Chenopodium quinoa wt CMV вызывал некрозы, но не вызывал системной инфекции. ASac-Nru также вызывал образование некрозов, но более мелких; ASac-Nru вызывал только очень мелкие хлоротические точки. ASal-Nru* вызывал некрозы, по размеру промежуточные между ASal-Nru и ASac-Nru.

В растениях табака штамм Fny CMV вызывет системную мозаику наряду с подавлением роста растений и деформацией листовой пластинки, без каких-либо симтомов на инокулированном листе. ASac-Nru также вызывал сильновыраженные симптомы, хотя и отличные от wt CMV, и появлявшиеся на 2-3 дня позднее. ASal-Nru вызывал хлоротические круги на инокулированных листьях, но ne вызывал системной инфекции. ASal-Nru* не вызывал симптомов на инокулировынных листьях, но вызывал симптомы на верхних, неинокулироваиных листьях (хотя эти симптомы и отличались от таковых wt CMV или ASac-Nru), т.е. этот мутант вновь приобретал способность системно заражать табак.

В кабачке wt CMV иногда вызывал некрозы на инокулированных семядолях, сильное замедление роста и ярковыраженную мозаику на листьях.. ASac-Nru также вызывал системную мозаику, хотя и с некоторым запозданием; подавление роста растения было менее выраженным. Симптомы на семядолях выражались в образовании крупных хлоротических участков, которые позднее некротизировались. ASal-Nru* вызывал только точечные некрозы на семядолях, ASal-Nru не вызывал никаких. Ни ASal-Nru* , im ASal-Nru не не заражали растения кабачка системно. Таким образом, различные мутации CP CMV по-разному влияют на системное распространение вируса в растениях N. clevelendii (и N. benthamianä) по сравнению с табаком и кабачком.

11. Структура вирнонов делециоппых мутантов по CP

После ультрацентрифугирования экстрактов из растений N. benthamiana, заражённых wt CMV и делеционными мутантами по CP, методом иммупоэлеетронной микроскопии были обнаружены вирусные частицы. Типичные вирионы были обнаружены у wt CMV и ASac-Nru. Вирусных частиц не наблюдалось в случае ASal-

Nru. В растениях, заражённых ASal-Nru*, наблюдались два типа вирусоподобных частиц, отличавшихся по размеру от частиц wt CMV. Таким образом, делеция 15 N-концевых аминокислот допускает формирование вирусных частиц, тогда как делеция 26 аминокислот нарушает сборку вирионов. В то же время, аминокислотные замены в ASal-Nru* по сравнению с ASal-Nru позволяют частично восстановить функцию сборки вирионов (но - двух типов). Вирусоподобные частицы, выделенные из растений N. bemhamiana, анализировали методом электрофореза в агарозном геле, при котором разделение происходит в зависимости от поверхностного заряда и гидродинамического объёма частиц, а не от их плотности: результат коррелировал с данными электронной микроскопии.

Выделение РНК из препаратов частиц ASac-Kru и ASal-Nru* почти всегда давало отрицательные результаты. Лишь в одном из четырёх экспериментов удалось выделить вирусные РНК из препаратов вирионов ASac-Nru. Скорее всего, и мутант ASal-Nru* формирует нестабильные вирусные частицы, в составе которых РНК не защищена, а ASal-Nru пристутствует в клетке в какой-то форме комплекса РНК.'белок, отличной от вирионов. Кинетика накопления wt CMV и трёх мутантов разнилась, при этом количество РНК коррелировало с количеством CP: wt CMV и ASal-Nru* имели высокий уровень, тогда как в случае ASac-Nru и ASal-Nru количество вирусных РНК (особенно -РНК1 и РНК2) и структурного белка заметно снижалось через месяц после заражения растений.

В экспериментах in vitro исследовали способность структурных белков мутантов связываться с РНКЗ. В предварительных экспериментах определяли количество белка специфической к CP сывороткой, затем выравнивали его количество в наносимых образцах и, после электрофореза в полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозу; мембраны обрабатывали меченой РНКЗ. Способность мутанта ASac-Nru связываться с вирусной РНК была несколько ниже, чем у wt CMV, тогда как белки ASal-Nru и ASal-Nru* в присутствии 0,3M NaCl не формировали стабильных комплексов с РНК (Рис. 15).

Причиной медленного распространения по растению мутанта ASal-Nru в тех растениях, в которых он всё же способен распространяться за пределы инокудированного листа, может быть его распространение от клетки к клетке по растению, а не замедленниеый дальнего транспорта через флоэму - тпкое распространение обычно приводит к гораздо более быстрой системной инфекции.

Рис. 15. Связывание in vitro РНКЗ CMV с калсидным белком дикого типа и белками ряда мутантов. Тотачьный белок из экстрактов заражённых растений фракционировали в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозу. Детекцию осуществляли либо антисывороткой к белку (А), либо радиоактивно меченной РНКЗ (В, С) - в этом случае мембрану перед радиоавтографией трижды промывали 0,3M NaCl. Мембраны В и С из двух независимых экспериментов. Треугольник указывает положение 29-kDa маркёра. Правая дорожка - здоровое растение.

Вирус скручивания листьев картофеля (PLRV)

Представители семейства Luteoviridae формируют вирионы с икосаэдрическим типом симметрии, содержащие плюс-РНК размером около 6-kb. Их распространение ограничено клетками флоэмы - проводящей ткани растения, обеспечивающей транспорт ассимилятов. Передача вируса от одного растения к другому осуществляется тлями и не может быть достигнута механическим инфицированем ни соком заражённого растения, ни очищенным вирусным препаратом. Хотя PLRV и сохраняет инфекциоиность в организме тлей довольно продолжительное время, в тлях он не реплицируется (Gray and Gildow, 2003).

1. Преодоление флоэмного ограничения инфекции PLRV

Известно, что флоэмно-ограниченные вирусы способны эффективно реплицироваться в протопластах, изолированных из мезофилла листьев растений (Kubo and Takanami, 1979; Mayo et al., 1982), и, вероятно, в клетках эпидермиса, первично-инфицированных при механической инокуляции, хотя в соседних клетках они не обнаруживаются (Kubo, 1981). Можно было предположить, что отсутствие флоэмно-ограниченных вирусов в тканях мезофилла и эпидермиса листа обусловлено блокированием транспортной функции, обеспечивающей перенос вирусного материала из флоэмы в ткани паренхимы. В таком случае при определённой комбинации вирусов, один из которых способен преодолевать барьер между флоэмой и паренхимой, зависимый вирус в условиях смешанной инфекции также сможет преодолеть этот барьер, используя транспортную функцию вируса-помощника.

Для вменения возможности комплементации транспортной функции PLRV и приобретения им способности системно распространяться в клетках мезофилла листьев растений дурмана (Datura stramonium), предварительно заражённых потэксвирусом PVX или тобамовирусом TMV, такие растения заражали PLRV. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствуют о резком повышении накопления PLRV

в листьях смешанно инфицированных растениях - более чем в 16 раз. Для подтверждения возможности распространения PLRV при совместной инфекции с PVX в паренхиме, из заражённых растений изолировали протопласты: в них было обнаружено присутствие антигена PLRV. Аналогичные результаты были получены и при заражении D. stramonium, предварительно инфицированных TMV при повышенной температуре (32°С, т.е. в условиях, когда TMV системно распространяется в этом растении), а также в растениях Physalis floridana, предзаражённых PVX.

2. Влияние различных последовательностей структурного белка (CP) PLRV на сборку и стабильность внряонов, на способность вируса распространиться по растению н передаваться тлями Вирионы представителей семейства Luteoviridae состоят из двух структурных белков: основного CP (22-24-kDa), кодируемого ORF3, и минорного белка, образующегося в результате иногда происходящей супрессии терминирующего кодона гена СР. Этот белок, обозначаемый RTP (readthrough protein, ORF3+ORF5, CP+RTD, Рис. 16), также входит в состав вирусных частиц, хотя его количестве в вирионе, состоящем из 180 субъедениц CP, до сих пор не. определено. Вирионы могут образовьюаться и в отсутствии RTP, но они обладают пониженной эффективностью распространения по растению и не переносятся тлями (Reinbold el al., 2001).

ORF4, перекрывающаяся в другой рамке с геном белка оболочки, кодирует 17-kDa ТБ PLRV, чья роль в распространении вируса была продемонстрирована в ряде растений-хозяев (Lee el al., 2002).

Использование специально сконструированного на основе PLRV вектора позволило с высокой эффективностью получать различные мутанты при гомологичной рекомбинации в дрожжах. Таким образом был получен ряд мутантов, в том числе -ART, содержавший деледаю, исключавшую трансляцию домена RT, но по-прежнему продуцирующий полноценный белок оболочки.

Рис. 16. Организация генома PLRV и описание CP мутантов в двух кислотных доменах. Аминокислотные замены подчёркнуты. Жирным выделены консервативные для лютеовирусов аминокислоты,

курсивом - кислые. Указаны номера заменённых аминокислот, а также названия мутантов. Строчные буквы в названии мутантов соответствуют заменённым аминокислотам

UL_J I

Н CP i ЯТР |7 I

LKAYHÍY „..«S5M...!P«V£*»HflSSaDQ H»Y*S CWi»

Miliní r,

Htfr

£j»H 17» $¡20«» HgS«S

'¿¿a líMJr

£¿От

Ové VeW EwH *W>0

Has

Os«E

¡NOVáWMjpSíjO rn.rain.iTl CP»«

Остальные мутации были локализлвывались в самом СР (Рис. 16). На основании известных структур вирионов и структурных белков РНК-содержащих вирусов с икосаэдрической симметрией, СР может быть разделён на N-концевой аргинин-богатый домен и поверхностный домен, содержащий остальную часть молекулы бежа (Dolja and Koonin, 1991). Обычно заряженный аргинин-богатый домен вовлечён во взаимодействие с РНК. Хотя последовательности в составе поверхностного домена белков небольших икосаэдрических вирусов растений заметно отличаются, вторичная и третичная структура этих участков консервативна. У двух представителей рода Palerovirus, которому относится PLRV, из семейства лютеовирусов выявлены консервативные районы в поверхностном домене белка оболочки (Mayo and Ziegler-Graff, 1996), и на этом основании были построены несколько моделей структуры вирионов (Brault eí al, 2003, Terradot et al, 2001).

Первоначально мы подвергали мутационному анализу были два «кислых» домена СР, локализованных в центральной и С-концевой частяхразделённых 55 аминокислотами, и, предположительно, вовлечённых в белок-белковые взаимодействия на поверхности вирионов (Рис. 15). 11 точечных мутантов с помощью агроинокуляции тестировали на способность накапливаться в агроинфильтрированных тканях растений, формировать вирусные частицы, системно распространяться по растениям и переноситься тлями. За единственным исключением все, представлявшие интерес, аминокислоты били заменены па аланин. Замена любой из 3 аминокислот EWH (170172) или D177 нарушала способность СР формировать стабильные вирионы и способность системно распространяться в 4 использованных растениях-хозяевах. Аланиновые замены кислых аминокислот Е109, D173 и Е176 отрицательно сказывались на накоплении вируса в агроинфильтрированных тканях, эффективности системного распространения по растениям, эффективности переноса тлями, но не оказывали влияния на стабильность вирионов. В качестве дополнительных контролей использовались вышеописанный мутант ART и CPRD: последний продуцировал только полноразмерный RTP, но не 22-kDa CP, и не образовывал вирионов.

Инфильтрация листьев N. benthamiana агробакгериями, содержащими инфекционные кДНК клоны различных мутаптов PLRV, приводила к практически синхронной инфекции всех клеток и позволяла оценить уровень репликации РНК и трансляции структурных вирусных белков. СР и RTP выявляли Вестерн блот анализом в грубых экстрактах, т.к. при агроинфильтрации, в отличии от системно заражённых растений, инфекция не ограничена исключительно клетками флоэмы и титр вируса

высокий. Нозерн гибридизацией с использованием рибопробы, комплементарной 3'-концевому участку, общему для всех РНК PLRV, была продемонстрирована способность всех мутантов реплицироваться. Уровень накопления РПК мутантов не отличался от такогого у \vt. Для определения способности мутантов формировать вириопы использовали два подхода: РНКазо-чувствителыюсть вирусного потомства в заражённых тканях, и способность формировать вириопы. Анализ РНКаза-чувствительности показал, что ряд мутаций приводил к полной потере способности формировать вирионы или к формированию нестабильных вирусных частиц (Рис. 16). Особенно ярко это проявилялось при аланиновых заменах Е170 (мутант VeW), W171 (мутант EwH), Н172 (мутант WhD) и D177 (мутант EdQ). Кроме того, двойная замена Е176 и D177 (Sed) и замена всех 4 аминокислот во втором домене (CPall) приводила к пониженной протекции РНК. Способность формировать вирионы определяли методом иммуноферментного анализа. Только вирионы PLRV, а не свободный CP, определяются этим методом при использовании коммерческих тест-наборов фирмы Agdia (США), содержащих поликлональные антитела.

CPRD служил негативным, контролем при определении РНКазо-чувствительности, т.к. не образовывал вирионов и его РНК не была защищена от действия РНКаз; ART и \vt служили положительными контролями, т.к. оба формировали стабильные вирусные частицы. Защищённость вирусных РНК у мутантов V169 (GvE), Е109 (HeY), D173 (HdS), S174+S175 (DssE), E176 (SeD) бьиа сравнима с таковой у дикого типа. Однако, даццый способ определения - чувствительности к РНКазе является скорее качественным, чем количественным. Данные иммуноферментного анализа подтвердили формирование вирионов вышеперечисленными мутантами. Неожиданным результатом стало инкапсидирование субгеномной РНК структурного белка, но это может быть объяснено очень высокой концентрацией вирусных белка и РНК в агроинфильтрированных растительных тканях. Хотя уровень трансляции CP у всех мутантов был примерно одинаковым, трансляция или стабильность RTP либо была понижена, либо вообще отсутствовала у тех мутантов, которые являясь дефектными по функции сборки вирионов. Замена на аланин El76 (SeD) не сказалась на накоплении RTP, тогда как замена D177 (мутант EdQ) подавляла продукцию RTP; двойная замена Е176 и D177 (Sed) частично восстанавливала продукцию RTP. В отсутствии RTP иногда наблюдалась продукция белка с молекулярной массой примерно 40 ГОа. Этот белок выявляется при помощи антител к структурному белку, то есть он либо является продуктом преждевременной терминации синтеза RTP, либо димером CP (Рис. 16).

т лср лктмоскз-кос рт ОРО-р-К 1.-Н зе ЕШНСКТК <зш то

■<<40(<0а

т лср акт коек э-к се ¡г ер о-р-к ьн зе ец> нск жоме то

Рис. 17 Структурные белки и РНК ряда мутантов Р1,НХ накапливающиеся в растениях N. Ьеп/Иатгапа. (а) иммуноблот-анализ экстрактов агроинфильтрировакных растений. Для детекции использовались моноклокальные антитела к СР. Моек - лист растения N. ЬепЛаппапа, инфильтрированный не несущей вирусного генома агробактерией. Отмечено положение оснобвых белков, выявляемых антителами. (Ь,с) - КТ-?СК анализ вирусной РНК после инкубации с эндогенными РНКазами (Ь) или без инкубации (с). Был амшшфицирован ген СР и часть КТ.

Кроме перечисленных мутантов были получены ещё 12 с точечными мутациями в различных областях СР (Рис. 17). Девять из них не формировали вирионов и не заражали системно 4 вида растений. Из четырёх, формировавших вирионы и системно распространявшихся, у 2 эффективность переноса тлями оказалась пониженной. Мутации, интерферировавшие с образованием вирионов, находились в области предполагаемого взаимодействия белковых субъединиц в составе вириона.

Мы осуществляли выделение вирусных препаратов ряда мутантов из агроинфильтрировакных листьев N. Ьеп1Иатшпа. Оказалось, что мутанты, не способные распространяться системно (но накапливающие количества СР, сравнимые с

wt. при arpo инфильтрации, Рис. 17), не способны формировать стабильные вирусные частицы. Это видно и из результатов центрифугирования в градиенте сахарозы в процессе очистки (Рис. 18а), и из электронномикроскопического анализа фракций, соответствующих содержащим стабильные вирионы фракциям (Рис. !8Ь).

(3?

¿RT

ТК-1

i ; tí

sem

"! I;

, «í 1|А , M li

лет

TK-t

SEM

тьлщ? ftípif:^ "V"** .>- ¡i <i • 0М: ЩШШ-ШШ

шшшшш

Рис. ¡8.

(а) Спектры УФ-поглощеня препаратов дикого типа («1) и трёх мутантов Р[.НЛ/ после центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (10-40%), стрелками указано ожидаемое положение вируссодер-жащего пика;

(Ь) электронные

микрофотографии

соответствующих

Таким образом, в результате описанных выше экспериментов установлено, что образование стабильных вирионсв во всех случаях необходимо для системной инфекции Р!ЛУ. Для переноса вируса тлями также был необходим белок ИТ: мутант АКТ формировал высокостабильные вирионы (Рис. 17Ъ и 18 а,Ъ), но не переносился от растения к растению тлями (единственный источник распространения данного вируса в природе).

Выводы

1. Установлено, что причиной образования дефектных частиц у температурочувствителыюго (ts) мутанта вируса табачной мозаики (TMV) N¡2519 является инициация сборки вируса одновременно в двух участках - нормальным сайте инициации Оа и критическом сайте (вероятно SERF), активным только при непермиссивпой температуре.

2. Продемонстрирована возможность копмплементации транспортной функции двух ts мутантов TMV N¡2519 и LSI другими вирусами. Установлено, что комплементация может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений.

3. Показано, что трансгенные растения, экспрессирующие нефункциональные вирусные транспортные белки, могут блокировать распространение как близкородственных, так и отдалённых вирусов.

4. Определены особенности механизмов распространения вируса огуречной мозаики (CMV) в различных растенях-хозяевах. В частности, продемонстрирована комплементация функции транспорта различных мутантов траспортаого белка CMV (За) в трансгенных растениях, продуцирующих транспортный белок, и формирование делеционных мутантов в таких растениях.

5. Обнаружено, что растения, трансгенные по траспортному белку CMV, способны комплементировать межклеточный транспорт таких вирусов как вирус мозаики костра (BMV) и вирус задержки роста арахиса (PSV).

6. Доказано, что для распространения CMV из клетки в клетку нужен белок оболочки (CP), но не цельные вирионы.

7. Установлено, что в присутствии вируса-помощника флоэмно-ограниченный вирус скручивания листьев картофеля (PLRV) приобретает способность распространяться из проводящих тканей растений в клетки мезофилла и репродуцироваться в них;

8. Доказано, что мутации в ряде участков структурного белка PLRV влияют па сборку и стабильность вирионов, а также на способность вируса распространяться по растению и передаваться тлями.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах: Статьи в научных журналах

1. Морозов С.Ю., Каплан И.Б., Тальянский М.Э., Атабеков И.Г. Синтез вирусспецифических РНК и белка оболочки в листьях растений, зараженных мутантом вируса табачной мозаики N¡2519 // Биологические Науки.- 1979.— № П.—С. 34-40.

2. Каплан И.Б., Пшешшкова Е.С., Козлов Ю.В., Аграновский А.А., Тальянский М.Э., Атабеков И.Г. Локализация участков инициации реконструкции в молекуле РНК мутанта вируса табачной мозаики N¡2519// Молекулярная Биология.-1982- Т. 16-W»l.-C. 160-169.

3. Taliansky, М.Е., Atabekova, T.I., Kaplan, I.B., Morozov, S.Yu., Maiyshenko, S.I., Atabekov, J.G. A study of TMV ts-mutant N¡2519. I. Complementation experiments // Virology.-1982,- V. 118,- P. 301-308.

4. Taliansky, M.E., Kaplan, I.B., Jarvekulg, L.V., Atabekova, T.I., Agranovsky, A.A., Atabekov, J.G. A study of TMV ts-mutant N¡2519. H. Temperature- sensitive behavior of N¡2519 RNA upon reassembly // Virology.-1982.- V. 118,- P. 309-316.

5. Kaplan, 1.В., Kozlov, Yu.V., Pshennikova, E.S., Taliansky, M.E., Atabekov, J.G. A study of TMV ts-muxant N¡2519. III. Location of the reconstitution initiation sites on N¡2519 RNA // Virology. - 19S2.- V. 118,- P. 317-323.

6. Taliansky, M.E., Maiyshenko, S.I., Pshennikova, E.S., Kaplan, I.B., Ulanova, E.F., Atabekov, J.G. Plant-specific transport function. I. Virus genetic control required for systemic spread// Virology.-1982.-V. 122.-P.318-326.

7. Атабеков И.Г., Тальянский М.Э., Дрампян A.X., Каплан И.Б., Турка И.Э. 1984. Системное распространение флоэмно-ограниченного вируса б клетках паренхимы в условиях смешанной инфекции // Биологические Науки - 1984 10,- С. 28-31.

8. Taliansky, М.Е, Maiyshenko,S.I., Kaplan, 1.В., Kondakova, О.А., Atabekov, J.G. Production of the tobacco mosaic virus (TMV) transport protein in transgenic plants is essential but insufficient for complementing foreign virus transport: a need for the full-length TMV genome or some other TMV-encoded product // Journal of General Virology- 1992.-V.73 - P. 471-474.

9. Maiyshenko, S.I., Kondakova, O.A., Nazarova, Ju.N., Kaplan, I.B., Taliansky, M.E., Atabekov, J.G. Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic plants producing non-functional transport proteins // Journal of General Virology.- 1993.- V. 74,-P. 1149-1156.

10. Kaplan, I.B., Zhang, L„ Shintaku, M.H., Li, Q., Marsh, L.M., Palukaitis, P. Complementation of virus movement defective mutants in transgenic tobacco expressing the cucumber mosaic virus movement protein II Phytopathology.- 1993 - V. 83.- P. 1349.

11. Gal-On, A, Kaplan, I.B., Roossinck, M.J., Palukaitis, P. The kinetics of infection of zucchini squash by cucumber mosaic virus indicate a function for RNA-1 in virus movement //Virology.-1994-V. 205.-P. 280-289.

12. Gal-On, A., Kaplan, I.B., Palukaitis, P. Differential effects of satellite RNA on the accumulation of cucumber mosaic virus RNAs and their encoded proteins in tobacco vs zucchini squash with two strains of CMV helper virus // Virology-1995,- V. 208 - P. 58-66.

13. Kaplan, I.B., Shintaku, M.H., Li Q., Zhang, L., Marsh, L.M., Palukaitis, P. Complementation of virus movement in transgenic tobacco expressing the cucumber mosaic virus 3a gene // Virology.-1995.- V. 209,- P. 188-199.

14. Gal-On, A., Kaplan, I.B., Palukaitis, P. Characterization of cucumber mosaic virus. II. Identification of cucumber mosaic virus movement protein sequences that influence accumulation and systemic infection in tobacco // Virology.- 1996,-V. 226 —P. 354-361.

15. Kaplan, I.B., Gal-On, A., Palukaitis, P. Characterization of cucumber mosaic virus. III. Localization of sequences in the movement protein controlling systemic infection in cucurbits //Virology.-1997,-V. 230,-P. 343-349.

16. Kaplan, I.B., Zhang, L., Palukaitis, P. Characterization of cucumber mosaic vims. V. Cell-to-cell movement requires capsid protein but not virions II Virology,- 1998.- V. 246.- P. 221-231.

17. Kaplan, I.B., Palukaitis, P. Characterization of cucumber mosaic virus. VI. Generation of deletions in defective RNA 3s during passage in transgenic tobacco expressing the 3a gene // Virology.-1998 - V. 251,- P. 279-287.

18. Kaplan, I.B., Lee, K-C., Canto, T., Wong, S-M., Palukaitis, P. Host-specific encapsidation of a defective RNA 3 of cucumber mosaic virus // Journal of General Virology.-2004.-V. 85.- P.3757-3763.

19. Liang, D., Gray, S.M., Kaplan, I., Palukaitis, P. Site-directed mutagenesis and generation of chimeric viruses by homologous recombination in yeast to facilitate analysis of plant-virus interactions // Molecular Plant-Microbe Interactions (MPMI).- 2004 - V. 17.-No 6,-P. 571-576.

20. Lee, L., Kaplan, I.B., Ripoll, D.R., Liang, D., Palukaitis, P., Gray, S.M. A surface loop of the potato leafroll virus coat protein is involved in virion assembly, systemic movement, and aphid transmission// Journal of Virology-2005 - V. 6-P. 571-576.

21. Kaplan, I.B., Lee, L„ Ripoll, D.R., Palukaitis, P., Gildow, F.E., Gray, S.M. Point mutations in the potato leafroll virus major capsid protein alter virion stability and aphid transmission // Journal of General Virology.- 2007.- V.88 - p. 1821 -1830.

Статьи в книгах и сборниках

22. Тальянский М.Э., Каллан И.Б., Морозов С.Ю. Некоторые особенности поведения температурочувствительного мутанта ВТМ N¡2519 в зараженных растениях // Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними: сб.ст., Владивосток, 1980.-С. 62-65.

23. Каплан И.Б., Пшенникова Е.С., Тальянский М.Э. Специфичность РНК-белкогого взаимодействия при сборке некоторых штаммов ВТМ // Штаммы вирусов растений и их практическое применение: сб.ст., Елгава, 1981- С.72-75.

24. Gal-On, A., Kaplan, I. and Palukaitis, P. In vitro and in vivo synthesis of cucumber mosaic virus// Phytopathology1993-V.83.-p.l350.

25. Kaplan, I.B. and Palukaitis, P. Characterization of defective forms of cucumber mosaic virus RNA 3 generated in CMV 3a-transgenic plants // Phytopathology- 1995.-V.85.-p. 1152.

26. Kaplan, I.B., Wong, S-M. and Palukaitis, P. (1999). Characterization of a new naturally-occurring defective RNA 3 of cucumber mosaic virus // Phytopathology.- 1999 -V.89(6).- S3 8.

27. Lee, L., Kaplan, I., Ripoll, D., Liang, D., Palukaitis, P. and Gray, S. (2004). A surface loop of the potato leafroll virus coat protein is involved in virion stability and aphid transmission // Phytopathology. - 2004,- V.94.- S58.

Избранные тезисы

28. Taliansky, M.E., Malyshenko, S.I., Kaplan, I.B., Kondakova, O.A., Atabekov, J.G. The plant virus genome structure and expression II Abstracts of the FEBS Advanced Course, April 29-May 5,1991. -Riga, USSR.- P. 10.

29. Zhang, L., Kaplan, I.B., Palukaitis, P. Effects of cucumber mosaic virus coat protein deletions on RNA binding and assembly // Abstracts of the IX International Congress of Virology, August 8-13, 1993.-Glasgow, Scotland. -P. 62.

30. Kaplan, I.B., Palukaitis, P. Transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus 3a gene complement the movement of За-deficient viral mutants II Abstracts of the IX International Congress ofVirology, August 8-13, 1993.- Glasgow, Scotland. - P. 336.

31. Kaplan, I.B., Zhang, L., Shintaku, M.H., Marsh, Li. and Palukaitis. Replication of movement-deficient cucumber mosaic virus mutants in transgenic tobacco // Proceedings of the American Society for Virology, 1994. -July 9-13, Madison, Wl. - P. 146.

32. Taliansky M.E., Malyshenko S.I., Kondakova O.A., Nazarova Yu.V., Kaplan I.B., Nazarova J.N. and Atabekov J.G. Induction of antiviral resistance in plants by transformation with viral movement protein gene sequences // Proceedings of 10th Anniversary Symposium of the Otto Warburg Center for Agricultural Biotechnology "Molecular Biology in Plant Breeding: Theoretical, Practical and Legal Aspects", 1994. - Rehovot, Israel. - P.31.

33. Kaplan, I.B., Gal-On, A. and Palukaitis, P. Movement protein sequences of cucumber mosaic virus that control systemic infection in squash // Abstracts of the American Society for Virology, 15th Annual Meeting, 1996. - London, Ontario, Canada. - P.91.

34. Zhang, L., Kaplan, I.B. and Palukaitis P. Effect of capsid protein deletions on movement RNA binding and assembly of cucumber mosaic virus // Abstracts of the American Society for Virology, 15th Annual Meeting, 1996. -London, Ontario, Canada. -P.160.

35. Kaplan, LB., Gal-On, A., Palukaitis, P. Cucumber mosaic virus 3a gene sequencescontrolling systemic infection in squash II Abstracts of the X International Congress ofVirology, Augustll-16,1996.-Jerusalem, Israel.- P. 157.

36. Kaplan, I.B. and Palukaitis, P. Characterization of cucumber mosaic virus defective RNA3 variants generated in tobacco transgenic for the 3a gene II Abstracts of the X International Congress ofVirology, August 11-16, 1996. - Jerusalem, IsraeL - P. 157.

37. Zhang, L., Kaplan, I.B. and Palukaitis, P. Effects of cucumber mosaic virus capsid protein deletions on RNA binding and assembly // Abstracts of the X International Congress ofVirology, August 11-16,1996.-Jerusalem, Israel. - P. 62.

Подписано в печать:

06.04.2010

Заказ № 3502 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Каплан, Игорь Борисович

Введение

Используемые сокращения

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Распространение вирусной инфекции в растении

1.1.1. Вирусы, использующие один ТБ для межклеточного транспорта

1.1.1.1. Связывание РНК с ТБ

1.1.1.2. Взаимодействие с плазмодесмами

1.1.1.3. Роль фосфорилирования

1.1.1.4. Межклеточный транспорт вРНП ТМУ

1.1.2. Вирусы, использующие один ТБ и белок оболочки (СР) для межклеточного транспорта

1.1.3. Вирусы, использующие тройной блок генов для транспорта

1.1.4. Вирусы, для межклеточного транспорта которых требуется ряд различных белков

1.1.4.1. Потивирусы (Ро1уупт1з)

1.1.4.2. Клостеровирусы (Оозгегоукиэ)

1.1.5. Вирусы, формирующие трубочки внутри плазмодесм -Сото- и Ксро-вирусы

1.1.6. Комплементация межклеточного транспорта 3 О

1.1.7. ТБ, контролирующие дальний транспорту вируса в растении (системное распространение)

1.2. Роль капсидных белков РНК-содержащих вирусов растений

1.2.1. Проникновение вируса в клетку и трансляция вирусной РНК

1.2.2. Репликация вирусного генома

1.2.3. Сборка вирионов

1.2.4. Влияние CP на межклеточное и системное распространение вирусов по растению

1.3. Передача вирусов от растения к растению с помощью природных переносчиков (векторов)

1.3.1. Два основных типа передачи вирусов векторами

1.3.1.1. Неперсистирующий Cucumovirus CMV

1.3.1.2. Персистирующий не реплицирующийся в теле вектора Luteovirus PLRV

Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Вирус табачной мозаики (TMV)

3.1.1. Изучение реконструкции вирионов мутанта №

3.1.2. Комплементация вирусной транспортной функции

3.1.2.1. Комплементация распространения из клетки в клетку ts-мутанта ТМ V Ni

3.1.2.2. Комплементация распространения ts-мутанта TMV LSI из клетки в клетку в условиях дифференциальной температурной обработки

3.1.2.3. Распространение вирусных частиц из проводящих тканей стебля в ткани листа

3.1.2.4. Влияние нефункциональных и гетерологичиых вирусных транспортных белков трансгенных растений на репродукцию TMV

3.2. Вирус огуречной мозаики (CMV)

3.2.1. Характеристика мутантов по За белку

3.2.2. Комплементация За мутантов в растениях, экспрессирующих За белок

3.2.3. Комплементация транспорта гетерологичных вирусов в За-трансгенных растениях

3.2.4. Определение аминокислотных последовательностей За белка, необходимых для осуществления его функции вирусного транспорта

3.2.5. Образование делеций в дефектных РНКЗ при пассаже в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген За CMV

3.2.5.1. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта Nhe-fs

3.2.5.2. Рекомбинация дефектных РНКЗ мутанта [М]-Nhefs в трансгенных растениях

3.2.5.3. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта ЛЕ-Н

3.2.5.4. Дефектные РНКЗ, образующиеся при пассаже мутанта AKpnl

3.2.5.5. Полноценная РНКЗ, образующаяся при пассаже мутанта A AUG

3.2.6. Образование делеций в РНКЗ при пассаже в нетрансгенных растениях табака и инкапсидирование таких РНК

3.2.7. Определение последовательностей транспортного белка

СМУ, влияющих на накопление и ситемную инфекцию вируса в растениях табака

3.2.8. Последовательности транспортного белка СМУ, контролирующие системную инфекцию в растениях кабачка

3.2.9. Влияние продукта РНК1 (белка 1а) на кинетику накопления СМУ в растениях кабачка

3.2.10. Для распространения СМУ из клетки в клетку нужен белок оболочки (СР), но не вирионы

3.2.11. Структура вирионов делеционных мутантов по СР

3.3. Вирус скручивания листьев картофеля (РЬЯУ)

3.3.1. Преодоление флоэмного ограничения инфекции РЬЯУ

3.3.2. Влияние различных последовательностей структурного белка (СР) РЬЯУ на сборку и стабильность вирионов, на способность вируса распространяться по растению и передаваться тлями

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов"

Изучение механизма распространения вирусной инфекции в растении-хозяине является одной из ключевых проблем современной фитовирусологии, открывающей фундаментальные подходы к пониманию вирусоустойчивости растений и получению новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур. С другой стороны, в силу простоты организации вирусы растений служат удобной экспериментальной системой для изучения репликации и экспрессии вирусных геномов вообще.

Для активного межклеточного транспорта вирусного генома из зараженной клетки в соседнюю здоровую, происходящего в растениях через плазмодесмы (ПД), необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) [Atabekov and Dorokhov, 1984; Atabekov and Taliansky, 1990, Carrington et al., 1996; Citovsky, 1990; Lazarowitz and Beachy, 1999; Waigmann et al., 2004; Heinlein and Epel, 2004; Lucas, 2006; Verchot-Lubicz et al., 2007]. Распространение вирусов по растению состоит из двух отдельных и последовательных стадий: локального транспорта из клетки в клетку и цепи событий, суммарно обозначаемых как системное распространение по растению, включающих проникновение в проводящие ткани, системное распространение с флоэмным потоком с последующим выходом инфекционного начала из флоэмы в незаражённые ткани. Вирусы растений кодируют один или несколько ТБ [Lucas, 2006], которые либо взаимодействуют с вирусной нуклеиновой кислотой и обеспечивают проникновение образующегося комплекса в соседние клетки, либо образуют патогенные тяжи, через которые вирусные частицы переходят из клетки в клетку. При первом сценарии комплексы проникают в соседние клетки, не разрушая или необратимо не изменяя ПД, при втором - ПД либо заменяются тяжами, либо значительно модифицируются ими.

Наиболее изучен ТБ TMV. Этот белок взаимодействует ПД и в результате такого взаимодействия более крупные макромолекулы приобретают способность проникать из клетки в клетку [Tomenius et al., 1987; Wolf et al., 1989; Atkins et al., 1991; Ding et al., 1992; Oparka et al., 1997]. ТБ TMV связывается с одноцепочечныим РНК in vitro [Citovsky et al., 1990], и, поскольку комплексы ТБ и вирусной РНК были выделены из заражённых растений [Дорохов и др., 1980; Dorokhov et al., 1983, 1984a,b], по-видимому процесс транспорта РНК TMV осуществляется в форме рибонуклеопротеидного комплекса. В самом деле - белок оболочки (CP, coat protein) не нужен для межклеточного транспорта [Siegel et al., 1978; Dawson et al., 1988; Hilf and Dawson, 1993], т.е. транспорт вируса осуществляется в неинапсидированной форме.

Вирусные транспортные белки, как принято считать в настоящее время, модифицируют и используют клеточную систему активного транспорта молекул растения-хозяина. В связи с этим, изучение вирусных ТБ и РНК-белок и белок-белковых взаимодействий важно для понимания процессов межклеточных взаимодействий в растениях.

Использование трансгенных растений, экспрессирующих различные (как функциональные, так и дефектные) ТБ или CP (или их сочетание), имеет широкие перспективы, поскольку такие растения могут приобретать частичную или далее полную устойчивость к вирусно инфекции.

Основными объектами настоящей работы служили вирусы, принадлежащие к трем таксономическим группам: Tobamo-, Вгото- и Luteovirus. Организация геномов вирусов этих групп и их биологические особенности различны. Тем не менее, во всех трех группах межклеточный транспорт обеспечивается ТБ.

Удобной моделью для изучения РНК-белковых и белок-белковых взаимодействий является вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV). Преимущество TMV заключается в простоте строения (TMV состоит всего из двух компонентов: одноцепочечной РНК и одного типа структурного белка) и в возможности осуществления его сборки in vitro из РНК и белка [Fraenkel-Conrat and Williams, 1955]. Для понимания тонких механизмов РНК-белкового узнавания при сборке TMV особый интерес представляет исследование различных мутантов. В связи с тем, что мутант №2519 является температурочувствительным (ts) одновременно по двум функциям (по сборке вирионов и транспорту вирусной инфекции), изучение свойств этого мутанта позволяет расширить наши представления, во-первых, об избирательности нуклеиново-белкового взаимодействия, и, во-вторых, о механизмах транспорта вирусной инфекции в растениях.

Вирус скручивания листьев картофеля (potato leafroll virus, PLRV) является самым опасным вирусным патогеном картофеля, из года в год нанося значительный экономический ущерб во всём мире. PLRV является флоэмно-ограниченным вирусом, способным репродуцироваться только в клетках флоэмы (проводящей ткани) и не обнаруживаемый в клетках мезофилла.

Понимание механизмов распространения внутри растениий, а также механизма переноса иифекции от одного растения к другому растению тлями, необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов сборки вирусных частиц и распространения по растениям представителей трёх семейств фитовирусов.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

2. Изучение возможности комплементации ts-функций транспорта мутантов TMV №2519 и LS 1 вирусом-помощником;

4. Изучение влияния нефункциональных и гетерологичных вирусных транспортных белков трансгенных растений на репродукцию TMV;

5. Изучение причин отличий в накоплении CMV, его штаммов и мутантов в различных растениях;

6. Определение возможности комплементации дефектных по транспорту мутантов CMV в трансгенных растениях, экспрессирующих ТБ (За белок);

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что при непермиссивной температуре (33°С) в клетках растений табака Nicotiana tabacum, зараженных ts-мутантом TMV №2519, синтезируется вирионная РНК и функционально активный структурный белок. В результате реконструкции in vitro при 33° образуются дефектные вирусные частицы (ДВЧ), чувствительные к РНКазе (РНК нормальных вирионов TMV защищена от действия рибонуклеаз). Определено положение чувствительного к действию РНКаз сайта в составе ДВЧ. Показано, что причиной образования ДВЧ является множественная инициация сборки вирионов. Таким образом, можно предполагать, что ts-фенотип сборки этого мутанта обусловлен температурочувствительностью самой молекулы РНК, проявляющейся в одновременном функционировании двух участков инициации реконструкции при непермиссиовной температуре.

В ходе исследований установлено, что функция транспорта (распространение из клетки в клетку) мутантов №2519 и LSI при непермиссиовной температуре может быть комплементирована вирусом-помощником. С другой стороны, комплементировать функцию сборки зрелых вирусных частиц у №2519 вирусом-помощником не удалось. Показано также, что комплементация транспорта может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений, а также гетерологичными траснпортными белками в трансгенных растениях.

Показано, что нефункциональный ТБ, экспрессирующийся в трансгенных растениях, способен подавлять накопление близкородственного вируса, а полноценный ТБ может негативно сказываться на накоплении неродственных вирусов.

Продемонстрирована роль ТБ CMV в процессе транспорта вируса в ряде растений-хозяев, а также способность трансгенных по ТБ растений комплемептировать не только различных мутантов СМУ с дефектными ТБ , но и ряд других вирусов. В ходе детального изучения процесса формирования делеций в гене ТБ в составе дефектных РНКЗ СМУ в трансгенных растениях было обнаружено, что все конечные стабильные формы РНКЗ мутантов имели исходную рамку считывания гена ТБ вне зависимости от характера первоначальной делеции.

Впервые продемонстрировано, что для межклеточного распространения СМУ необходим лишь белок оболочки (СР) - но не сформированные вирионы.

С использованием мутантов по структурному белку РЬЫУ определены аминокислотные последовательности, ответственные за сборку полноценных вирионов, за распространение инфекции в ряде растений-хозяев и за способность этого вируса передаваться от растения к растению вектором-насекомым (тлями).

Практическая значимость работы. Вирус табачной мозаики (ТМУ), вирус огуречной мозаики (СМУ) и вирус скручивания листев картофеля (РЫО/) имеют широкий круг растений-хозяев и относятя к числу важнейших патогенов селькохозяйстивенных культур, нанося значительный экономический ущерб. В работе исследованы механизмы сборки вирусных частиц и распространения вирусной инфекции в растениях, понимание которых необходимо для получения новых вирусоустойчивых сортов сельскохозяйственных культур и новых фундаменталных подходов к проблеме вирусоустойчивости растений в целом. В частности, результаты работы позволяют понять механизм транспорта вирусной инфекции в растениях, пораженных изученными вирусами, выяснить причины различной патогенности и скорости распространения по растениям-хозяевам СМУ, механизм переноса РЬЯУ от одного растения к другому растению тлями, что необходимо для борьбы с этой вирусной инфекцией, а также особености распространения вирусной инфекции в трансгенных растениях.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на И Всесоюзном симпозиуме «Штаммы вирусов растений» (Елгава, 1981), конференции «Вирусы микроорганизмов» (Пущино-на-Оке, 1981), IV Советско-Западногерманском симпозиуме «Структура генома» (Ереван, 1981), совещании ФЕБС «Структура и экспрессия вирусного генома» (Рига, 1991), Симпозиуме X годовщины Центра Сельскохозяйственной Биотехнологии Отто Варбурга «Молекулярная биология в селекции растений: теоретические, практические и легальные аспекты» (Реховот, Израиль, 1994), Конференциях Американского Общества Фитопатологии (Нэшвил, Теннесси, 1993; Монреаль, Канада, 1998; Анахайм, Калифорния, 2004), Конференциях Американского Общества Вирусологов (Мэдисон, Висконсин, 1995; Лондон, Онтарио, Канада, 1996), IX (Глазго, Шотландия, 1993) и X (Иерусалим, Израиль, 1996) Международных Вирусологических Конгрессах.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Названия вирусов

AMV - alfalfa mosaic virus, вирус мозаики люцерны

BGMV - bean golden mosaic virus, вирус золотистой мозаики фасоли

BMV - brome mosaic virus, вирус мозаики костра

BSMV - Barley stripe mosaic virus , вирус штриховатой мозаики ячменя

BeYDV - bean yellow dwarf virus, вируса желтой карликовости бобов

BWYV - beet western yellows virus, вирус западной желтухи свёклы

В YMV - bean yellow mosaic virus, вирус жёлтой мозаики бобов

BYV - beet yellows virus, вирус желтухи свёклы

CaMV - cauliflower mosaic virus, вирус мозаики цветной капусты

CCMV - cowpea chlorotic mottle virus, вирус хлоротической крапчатости коровьего горошка CMV - cucumber mosaic virus, вирус огуречной мозаики CPMV - cowpea mosaic virus, вирус мозаики коровьего горошка GFV - grapevine fanleaf virus, неповирус винограда GRV - groundnut rosette virus вирус, вирус розеточности арахиса GVA - grapevine virus А, вирус А виноградной лозы PCV - peanut clump virus, вирус сморщивания арахиса PEMV - pea enation mosaic virus

PLRV - potato leafroll virus, вирус скручивания листьев картофеля

PMV - papaya mosaic virus, вирус мозаики папайи

PMTV - potato mop-top virus, вирус курчавости верхушки картофеля

PSV - peanut stunt virus, вирус карликовости арахиса

PVA - potato virus А, А вирус картофеля

PYX - potato virus X, X вирус картофеля

PVY - potato virus Y, Y вирус картофеля

RCMV - red clover mottle virus, вирус крапчатости красного клевера RCNMV - red clover necrotic mosaic virus, вирус некротической мозаики красного клевера

SHMV - Southhemp mosaic virus, также называемый Dolichos mosaic vims вирус мозаики долихоса, штамм коровьего горошка TMV TAV - tomato aspermy virus, вирус аспермии томатов TBSV - tomato bushy stunt virus, вирус карликовой кустистости томатов TCV —Turnip crinkle virus, вирус морщинистости турнепса TEV— tobacco etch virus, вирус гравировки табака TMV — tobacco mosaic virus, вирус табачной мозаики TRo V — turnip rosette virus, вирус розеточности турнепса TVCV - turnip vein-clearing virus, вирус просветления жилок турнепса TVMV — tobacco vein mottling virus, вирус крапчатости жилок табака TYLCSV - tomato yellow leaf curl Sardinia virus, вирус жёлтого скручивания листьев томатов, штамм Сардиния TYMV - turnip yellow mosaic virus, вирус жёлтой мозаики турнепса WC1MV - white clover mosaic virus, вирус мозаики белого клевера ZYMV — zucchini yellow mosaic virus, вирус желтой мозаики цукини

Другие сокращения wt - wild type, дикий тип

CP - coat protein, белок оболочки (структурный, капсидный белок) вРНП - вирусный рибонуклеопрот РНП - рибонуклеопротеид ПД - плазм од есма

TGB — triple gene block, тройной блок генов

GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок

ICR - intercistronic region, межцистронный участок РНК mAbs — monoclonal antibodies, моноклональные антитела

ТБ - транспортный белок (MP, movement protein)

NTR - nontranslated region (3', 5'), нетранслируемый участок РНК

ORF - open reading frame, открытая рамка считывания

PCR - polymerase chain reaction, полимеразная цепная реакция, ПЦР

ТХУ - трихлоруксусная кислота

RT-PCR - reverse transcription PCR, обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией

RT(D) — read-through domain, последовательность после слабого терминирующего кодона гена CP

RTP — read-through protein, продукт трансляции при супрессии терминирующего кодона гена CP

SERF - specifically encapsidated RNA fragment

RIS - reconstruction initiation site, участок инициации реконструкции вирусной РНК

Оа (Oas) - origin of assembly, участок инициации реконструкции вирусной РНК кДНК - комплементарная ДНК мРНК - матричная РНК

ПААГ — полиакриламидный гель

EDTA — этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - sodium dodecyle sulphate, додецил сульфат натрия

БСА - бычий сывороточный альбумин tr - temperature resistant, температурорезистентный ts — temperature sensitive, температурочувствительный

ДТО — дифференциальная температурная обработка заражённых растений

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Каплан, Игорь Борисович

выводы

1. Установлено, что причиной образования дефектных частиц у температурочувствительного (ts) мутанта вируса табачной мозаики (TMV) №2519 является инициация сборки вируса одновременно в двух участках -нормальным сайте инициации Оа и криптическом сайте (вероятно SERF), активным только при непермиссивной температуре.

2. Продемонстрирована возможность копмплементации транспортной функции двух ts мутантов TMV №2519 и LSI другими вирусами. Установлено, что комплементация может осуществляться не только родственным штаммом тобамовируса, но и таксономически весьма отдаленными вирусами растений.

4. Определены особенности механизмов распространения вируса огуречной мозаики (CMV) в различных растенях-хозяевах. В частности, продемонстрирована комплементация функции транспорта различных мутантов траспортного белка CMV (За) в трансгенных растениях, продуцирующих транспортный белок, и формирование делеционных мутантов в таких растениях.

6. Доказано, что для распространения CMV из клетки в клетку нужен белок оболочки (CP), но не цельные вйрионы.

8. Доказано влияние мутаций в различных участках структурного белка РЬЮ/ на сборку и стабильность вирионов, а также на способность вируса распространяться по растению и передаваться тлями.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Каплан, Игорь Борисович, Москва

1. Аграновский A.A., Доля В.В., Атабеков И.Г. (1981) Аминоацилирвание РНК вируса штриховатой мозаики ячменя // Биол. Науки2, 57-63.

2. Дорохов Ю.Л., Александрова Н.М., Мирошниченко H.A., Атабеков И.Г. (1980) Роль вирус-специфических частиц в системном рпспространении ВТМ // Биол. Науки 9, 23-28

3. Селенска-Трайкова С.И., Родионова Н.П., Новикова В.К., Атабеков И.Г. (1978) Присутствие в препаратах РНК огуречного вируса 3,4 короткой информационной РНК, кодирующей белок оболочки // Биол. науки3, 23-28.

4. Тальянский М.Э., Атабекова Т.И., Атабеков И.Г. (1974) Отсутствие маскирования генома при смешанном заражении клеток двумя штаммами ВТМ // Докл. ВАСХНИЛ 6, 4-7

5. Тальянский М.Э., Атабекова Т.И., Атабеков И.Г. (1975а) Специфичность взаимодействия РНК с белком при совместной реконструкции двух штаммов ВТМ // Докл. АН СССР 220. 6, 1459-1462

6. Тальянский М.Э., Атабекова Т.И., Атабеков И.Г. (1975в) Смешанная реконструкция двух штаммов ВТМ // Докл. ВАСХНИЛ 5, 23-25.

7. Тальянский М.Э., Атабекова Т.И., Атабеков И.Г. (1975с) Причины образования фенотипически смешанных частиц при заражении растений некоторыми штаммами вируса табачной мозаики // Доклады ВАСХНИЛ 12, 5-7.

8. Шаскольская Н.Д., Атабеков И.Г., Сахаровская Г.Н., Джавахия В.Г. (1968) Репродукция температурочувствительного штамма вируса табачной мозаики при непермиссивных условиях в присутствии штамма-помощника//Биол. Науки 8, 101-105.

9. Alzhanova, D.V., Napuli, A.J., Creamer, R., and Dolja, V.V. (2001) Cell-to-cell movement and assembly of a plant closterovirus: roles for the capsid proteins and Hsp70 homolog // EMBO J., 20, 6997-7007.

10. Annamalai, P. and Rao, A.L.N. (2005) Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: A functional role for viral replicase in RNA packaging // Virology 338, 96-111.

11. Atabekov, J.G. and Dorokhov, Yu. L. (1984) Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. // Adv. Virus Res., 29, 313— 364.

12. Atabekov, J.G. and Taliansky, M.E. (1990) Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes // Adv. Virus Res., 38, 201-248.

13. Atkins D., Hull, R., Wells, B., Roberts, K., Moore, P., and Beachy, R.N. (1991) The tobacco mosaic virus 30 K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata // J. Gen. Virol., 72, 209-211.

14. Basnayake VR, Sit TL, Lommel SA. (2009) The Red clover necrotic mosaic virus origin of assembly is delimited to the RNA-2 trans-activator // Virology. Feb 5; 384(1): 169-178.

15. Bayne, E.H., Rakitina, D.V., Morozov, S.Yu., and Baulcombe, D.C. (2005) Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing // Plant J., 44, 471^182.

16. Beachy, R.N. and Zaitlin, M. (1977) Characterization and in vitro translation of the RNAs from less-than-full-length, virus-related, nucleoprotein rods present in tobacco mosaic virus preparations // Virology 81, 160-169.

17. Bendahmane M, Chen I, Asurmendi S, Bazzini AA, Szecsi J, Beachy RN. (2007) Coat protein-mediated resistance to TMV infection of Nicotiana tabacum involves multiple modes of interference by coat protein // Virology. 15; 366: 107-116.

18. Berna, A., Gafiiy, R., Wolf, S., Lucas, W.J., Holt, C.A., and Beachy, R.N. (1991) The TMV movement protein-role of the C-terminal 73 amino acids in subcellular localization and function // Virology 182, 682-689.

19. Bertens, P., Wellink, J., Goldbach, R., and van Kämmen, A. (2000) Mutational analysis of the cowpea mosaic virus movement protein // Virology 267, 199-208.

20. Boccard, F., and Baulcombe, D. (1993). Mutational analysis of cis-acting sequences and gene function in RNA 3 of cucumber mosaic virus // Virology 193, 563-578.

21. Boevink, P., Oparka, K.J., Santa Cruz, S., Martin, B., Betteridge, A., and Hawes, C. (1998) Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network // Plant J., 15, 441-447.

22. Bol, J.F. (2005) Replication of Alfamo- and Ilarviruses: Role of the coat protein // Annu. Rev.Phytopathol., 43, 39-62.

23. Bosch, F.X. and Jockusch, H. (1972) Temperature-sensitive mutants of TMV: bevavior of a non-coat protein mutant in isolated tobacco cells // Mol. Gen. Genet., 116, 95-98.

24. Brault, V., Herrbach, E., and Reinbold, C. (2007) Electron microscopy studies on luteovirid transmission by aphids // Micron 38, 302-312.

25. Brault, V., Ziegler-Graff, V., and Richards, K. (2001) Viral determinants involved in luteovirus-aphid interactions // K.F. Harris, ed. (Academic press, Inc., USA), pp. 207-232.

26. Brill, L.M., Nunn, R.S., Kahn, T.W., Yeager, M., and Beachy, R.N. (2000) Recombinant tobacco mosaic virus movement protein is an RNA-binding, alpha-helical membrane protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 7112-7117.

27. Butler, P.J.G., Finch, J.T., Zimmern, D. (1977) Configuration of TMV RNA during virus assembly // Nature 265, 217-219.

28. Cadman, C.H. (1962) Evidence for association of tobacco rattle virus nucleic acid with a cell component // Nature. 193, 49-52.

29. Callaway AS, George CG, Lommel SA. (2004) A Sobemovirus coat protein gene complements long-distance movement of a coat protein-null Dianthovirus //Virology. Dec 5; 330(1): 186-195.

30. Callaway, A., Giesman-Cookmeyer, D., Gillock, E.T., Sit, T.L., and Lommel, S.A. (2001) The multifunctional capsid proteins of plant RNA viruses // Annu. Rev. Phytopathol., 39, 419-460.

31. Canetta E, Kim SH, Kalinina NO, Shaw J, Adya AK, Gillespie T, Brown JW, Taliansky M. (2008) A plant virus movement protein forms ringlike complexes with the major nucleolar protein, fibrillarin, in vitro // J Mol Biol. Feb 29; 376(4): 932-937.

32. Canto, T., Prior, D. A. M., Hellwald, K-H., Oparka, K. J., and Palukaitis, P.(1997). Characterization of cucumber mosaic virus. IV. Movement protein and coat protein are both essential for cell-to-cell movement of CMV // Virology 237, 237-248.

33. Carr, RJ. and Kim, K.S. (1983) Tvidence that bean golden mosaic virus invaded non-phloem tissue in double-infections with tobacco mosaic virus // J. Gen. Virol., 64, 2489-2495.

34. Carrington, J.C., Jensen, P.E., and Schaad, M.C. (1998) Genetic evidence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement // Plant J., 14,393^100.

35. Carrington, J.C., Kasschau, K.D., Mahajan, S.K., and Schaad, M.C. (1996) Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants // Plant Cell 8, 1669-1681.

36. Chapman, S., Hills, G., Watts, J., and Baulcombe, D. (1992) Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity // Virology 191, 223-230.

37. Chen C, Kao CC, Dragnea B. Self-assembly of brome mosaic virus capsids: insights from shorter time-scale experiments // J Phys Chem A. 2008 Oct 2; 112(39): 9405-9412.

38. Chen , S.C. and Olsthoorn, R.C. (2010) In vitro and in vivo studies of the RNA conformational switch in Alfalfa mosaic virus // J. Virol., 84(3), 14231429.

39. Choi SK, Choi JK, Ryu KH. (2003) Involvement of RNA2 for systemic infection of Cucumber mosaic virus isolated from lily on zucchini squash // Virus Res. Nov; 97(1): 1-6.

40. Choi SK, Yoon JY, Ryu KH, Choi JK, Palukaitis P, Park WM. (2002) Systemic movement of a movement-deficient strain of Cucumber mosaic virus in zucchini squash is facilitated by a cucurbit-infecting potyvirus // J Gen Virol. Dec; 83(Pt 12): 3173-3178.

41. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., and Zambryski, P. (1990) The p-30 movement protein of tobacco mosaic-virus is a single-stranded nucleic-acid binding-protein // Cell. 60, 637-647.

42. Citovsky, V., Wong, M.L., Shaw. A.L., Prasad, B.V.V., and Zambryski, P. (1992) Visualization and characterization of tobacco mosaic-virus movement protein-binding to single-stranded nucleic-acids // Plant Cell 4, 397411.

43. Culver, J.N. (2002) Tobacco mosaic virus assembly and disassembly: Determinants in pathogenicity and resistance. // Annu. Rev. Phytopathol., 40, 287-308.

44. Curin M, Ojangu EL, Trutnyeva K, II au B, Truve E, Waigmann E. (2007) MPB2C, a microtubule-associated plant factor, is required for microtubular accumulation of tobacco mosaic virus movement protein in plants // Plant Physiol. Feb; 143(2): 801-811.

45. Davies C, Symons RH. (1988) Further implications for the evolutionary relationships between tripartite plant viruses based on cucumber mosaic virus RNA 3 // Virology. Jul; 165(1): 216-224.

46. Dawson, W.O., Bubrick, P., and Grantham, G.L. (1988) Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication, movement and symptomatology // Phytopathology. 78, 783-789.

47. De Jong, W. and Ahlquist, P. (1992) A hybrid plant RNA virus made by transferring noncapsid movement protein from a rod-shaped to an icosahedral virus is competent for systemic infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 68066812.

48. De Jong, W., Chu, A., and Ahlquist, P. (1995). Coding changes in the 3a cell-to-cell movement gene can extend the host range of brome mosaic virus systemic infection // Virology 214, 464 474.

49. Deom, C.M., Lapidot, M., and Beachy, R.N. (1992) Plant virus movement proteins // Cell. 69, 221-224.

50. Deom, C.M., Oliver, M.J., and Beachy, R.N. (1987) The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement // Science. 237, 389-394.

51. Deom, C.M., Wolf, S., Holt, C., Lucas, W.J., and Beachy, R.N. (1991) Altered function of the tobacco mosaic virus movement protein in hypersensitive host//Virology. 180, 251-256.

52. Ding, B., Haudenshield, J.S., Hull, R.J., Wolf, S., Beachy, R.N., and Lucas, W.J. (1992) Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic-virus movement protein in transgenic tobacco plants // Plant Cell. 4, 915-928.

53. Ding, S-W., Li, W-X., and Symons, R. H. (1995a). A novel naturally occurring hybrid gene encoded by a plant RNA virus facilitates long distance virus movement // EMBO J., 14, 5762-5772

54. Ding, S-W., Li, Q., Nguyen, L. Palukaitis, P., and Lucas, W.J. (1995b). Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants // Virology 207, 345-353.

55. Dolja., V.V. (2003) Beet yellow virus: the importance of being different // Mol. Plant Pathol., 4, 91-98.

56. Dolja, V.V., Halderman-Cahill, R., Montgomery, A.E., Vandenbosch, K.A., and Carrington, J.C., (1995) Capsid protein determinants involved in cell-to-cell and long distance movement of tobacco etch potyvirus // Virology 206, 10071016.

57. Dolja, V.V. and Koonin, E.V. (1990) Phylogeny of capsid proteins of small icosahedral RNA plant viruses // J. Gen. Virol., 72, 1481-1486.

58. Dolja, V.V., Kreuze, J.F., and Valkonen J.P. (2006) Comparative and functional genomics of closteroviruses // Virus Res., 117, 38-51.

59. Donald, R.G., Lawrence, D.M., and Jackson, A.O. (1997) The barley stripe mosaic virus 58- kilodalton beta(b) protein is a multifunctional RNA binding protein//J. Virol., 71, 1538-1546.

60. Donis-Keller, H. (1977) Mapping adenines, guanines, and pyrimidins in RNA // Nucl. Acids Res., 4, 2527-2538.

61. Donis-Keller, H. (1979) Site specific enzymatic cleavage of RNA // Nucl. Acids Res., 7, 179-192.

62. Dorokhov, Y.L., Alexandrova, N.M., Miroshnichenko, N.A., Atabekov, J.G. (1983) Isolation and analysis of virus-specific ribonucleoprotein of tobacco mosaic virus-infected tobacco // Virology 127, 237-52.

63. Dorokhov, Y.L., Alexandrova, N.M., Miroshnichenko, N.A., Atabekov, J.G. (1984) The informosome-like virus-specific ribonucleoprotein (vRNP) may be involved in the transport of tobacco mosaic virus infection // Virology 137, 127-34.

64. Dreher, T.W. and Miller, W.A. (2006) Translational control in positive strand RNA plant viruses // Virology 344, 185-197.

65. Dunoyer, P., Thomas, C., Harrison, S., Revers, F., and Maule, A. (2004) A cysteine-rich plant protein potentiates potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg // J. Virol, 78, 2301-2309.

66. Fraenkel-Conrat, H., Singer, B., and Tsugita, A. (1961) Purification of viral RNA by means of bentonite // Virology. 14, 54-58.

67. Fraenkel-Conrat, H. and Williams, R.C. (1955) Reconstitution of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 41, 690-698.

68. Forster, R.L., Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Van Dolleweerd, C.J., and Andersen, M.T. (1992) The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants // Virology. 191, 480-484.

69. Fujita, Y., Mise, K., Okuno, T., Ahlquist, P., and Furusawa, I. (1996) A single codon change in a conserved motif of a bromovirus movement protein gene cjnfers compatibility with a new host // Virology. 223, 283-291.

70. Fujiwara, T., Giesman-Cookmeyer, D., Ding, B., Lommel, S.A., and Lucas, W.J. (1993) Cell-to-cell trafficking of macromolecules through plasmodesmata potentiated by the red-clover necrotic mosaic-virus movement protein // Plant Cell. 5, 1783-1794.

71. Fukuda, M., Okada, Y., Otsuki, Y., and Takebe, I. (1980) The site of initiation of rod assembly on the RNA of tomato and cowpea strain of tobacco mosaic virus // Virology. 101, 493-502.

72. Gal-On, A., Meiri, E., Raccah, B., and Gaba, V. (1998a) Recombination of engineered defective RNA species produces infective potyvirus in plants // J. Virol., 72, 5268-5270.

73. Gao, Z., Johansen, E., Eyers, S., Thomas, C.L., Ellis, T.H.N., and Maule A.J. (2004) The potyvirus recessive resistance gene, sbml, identifies a novel role for translation inititiation factor eIF4E in cell-to-cell trafficking // Plant J., 40, 376-385.

74. Gera, A., Loebenstein, G., and Raccah, B. (1979) Protein coats of two strains of cucumber mosaic affect transmission by Aphis gossypii // Phytopathology 69, 396-399.

75. Ghoshroy, S., Lartey, R., Sheng, J., and Citovsky, V. (1997) Transport of proteins and nucleic acids through plasmodesmata // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 27-49.

76. Gilbertson, R.L. and Lucas, WJ. (1996) How do viruses traffic on the 'vascular highway'? // Trends Plant Sei., 1, 260-268.

77. Gildow, F.E. (1999) Luteovirus transmission and mechanisms regulating vector specificity // In The Luteoviridae, G.H. Smith and H. Baker, eds. (CAB International, Oxon, UK), pp. 88-113.

78. Gildow FE, Reavy B, Mayo MA, Duncan GH, Woodford JA, Lamb JW, Hay RT. (2000) Aphid Acquisition and Cellular Transport of Potato leafroll virus-like Particles Lacking P5 Readthrough Protein // Phytopathology. Oct; 90(10): 1153-61.

79. Golemboski DB, Lomonossoff GP, Zaitlin M. (1990) Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus // Proc Natl Acad Sei USA. Aug; 87(16): 6311-5.

80. Gorbalenya, A.E. and Koonin, E.V. (1993) Helicases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships // Curr. Opin. Struct. Biol., 3, 419-429.

81. Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Donchenko, A.P., and Blinov, V.M. (1989) Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes // Nucleic Acids Res., 17, 4713^1730.

82. Graves, M. V., and Roossinck, M. J. (1995) Characterization of defective RNAs derived from RNA 3 of the Fny strain of cucumber mosaic cucumovirus // J. Virol., 69, 4746-4751.

83. Graves, M. V., Pogany, J., and Romero, J. (1996) Defective interfering RNAs and defective viruses associated with multipartite RNA viruses of plants // Semin. Virol., 7, 399-408.

84. Gray, S., and Gildow, F.E. (2003) Luteovirus-aphid interactions // Annu. Rev. Phytopathol., 41, 539-566.

85. Guilley, H., Jonard., G., Richarsd K.E., and Hirth, L. (1975) Observations concerning the sequence jf two additional specifically encapsidated RNA fragments originating from the tobacco-mosaic-virus coat protein cistron // Eur. J. Biochem., 54, 145153.

86. Haley, A., Hunter, T., Kiberstis, P., and Zimmern, D. (1995) Multiple serine phosphorylation sites on the 30 kDa TMV cell-to-cell movement protein synthesized in tobacco protoplast // Plant J., 8, 715-724.

87. Hamilton, R.I. and Nicols, C. (1977) The influence of bromegrass mosaic virus on the replication of tobacco mosaic virus in Hordeum vulgare II Phytopathology 67, 484-489.

88. Hammond, J., Lister, R. M., and Foster, J. E. (1983) Purification, identity and some properties of an isolate of barley yellow dwarf virus from Indiana. // J. Gen. Virol., 64, 667-676.

89. Haupt, S., Cowan, G.H., Ziegler, A., Roberts, A.G., Oparka, K.J., and Torrance, L. (2005) Two plant-viral movement proteins traffic in the endocytic recycling pathway // Plant Cell 17, 164-181.

90. Hayes, R. J., and Buck, K. W. (1990) Complete replication of a eukaryotic virus RNA in vitro by a purified RNA-dependent RNA polymerase // Cell 63, 363-368.

91. Heinlein, M. and Epel, B.L. (2004) Macromolecular transport and signaling through plasmodesmata // Int. Rev. Cytol., 235, 93—164.

92. Herrbach, E. (1999) Virus-vector interactions, Introduction / In The Luteoviridae, G.H. Smith and H. Barker, eds. (CAB International, Oxon, UK), pp. 85-88.

93. Herrbach, E. (2005) Arthropod transmission / In Viruses and Virus Diseases of Poaceae (Graminae), Lapierre H., and A. Signoret P, eds. (INRA editions, Versailles, pp. 114-124.

94. Herzog, E., Hemmer, O., Hauser, S., Meyer, G., Bouzoubaa, S., and Fritsch, C. (1998) Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus // Virology 248, 312-322.

95. Higgins, T.J.V., Goodwin, P.B., and Whitfeld, P.R. (1976a) Occurance of short particles in beans infected with cowpea strain of TMV. I. Purification and characterization of short particles // Virology 71, 471—485.

96. Higgins, T.J.V., Goodwin, P.B., and Whitfeld, P.R. (1976b) Occurance of short particles in beans infected with cowpea strain of TMV. II. Evidence that short particles contain the cistron for coat-protein // Virology 71, 486-497.

97. Hilf, M.E. and Dawson, W.O. (1993) The tobamovirus capsid protein functions as a host-specific determinant of long-distance movement // Virology 193, 106-114.

98. Hirashima, K. and Watanabe,Y. (2001) Tobamovirus replicase coding region is involved in cell-to-cell movement// J. Virol., 75, 8831-8836.

99. Hirashima, K. and Watanabe,Y. (2003) RNA helicase domain of tobamovirus replicase executes cell-to-cell movement possibly through collaboration with its nonconserved region// J. Virol., 77, 12357—12362.

100. Hong, J.S., Ohnishi, S., Masuta, C., Choi, J.K., and Ryu, K.H. (2007) Infection of soybean by cucumber mosaic virus as determined by viral movement protein // Arch Virol. Feb; 152(2): 321-328.

101. Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholiz, D., Rogers, S.G., and Fraley, R.T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants // Science 227, 1229-1231.

102. Hull, R. (1989) The movement of viruses in plant // Annu. Rev. Phytopathol., 27, 213-240.

103. Jockusch, H. (1966) Temperatursensitive mutanten des tabakmosaikvirus. I. In-vivo verhalten // Z. Vererbungsl., 98, 320-343.

104. Jockusch, H. (1968) Two mutants of tobacco mosaic virus temperature-sensitive in two different functions // Virology 35, 94-101.

105. Jolly, C.A. and Mayo, M.A. (1994) Changes in the amino acid sequence of the coat protein readthrough domain of potato leafroll luteovirus affect the formation of an epitope and aphid transmission // Virology. May 15; 201(1): 182-185.

106. Jonard, G., Guilley, H., and Hirth, L. (1975) Specific encapsidation of TMV RNA fragments by 25 S protein: isolation and some properties of the nucleoprotein complexes formed // Virology 64, 1-9.

107. Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, Т., Morozov, S.Yu., and Atabekov, J.G. (1996) Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25 К movement protein // FEBS Lett., 397,75-78.

108. Kalinina, N.O., Rakitina, D.V., Solovyev, A.G., Schiemann, J., and Morozov, S.Yu. (2002) RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block // Virology 296, 321329.

109. Kaplan, I.B., Zhang, L., and Palukaitis, P. (1998) Characterization of cucumber mosaic virus. V. Cell-to-cell movement requires capsid protein but not virions // Virology 246, 221-231.

110. Karpova, O.V., Ivanov, K.I., Rodionova, N.P, Dorokhov, Y.L., and Atabekov, J.G. (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro // Virology 230, 11-21.

111. Karpova, O.V., Rodionova, N.P, Ivanov, K.I., Kozlovsky, S.V., Dorokhov, Y.L., and Atabekov, J.G. (1999) Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability // Virology 261, 20-24.

112. Kim, S.H., Ryabov, E.V., Brown, J.W., and Taliansky, M. (2004b) Involvement of the nucleolus in plant virus systemic infection // Biochem Soc Trans. Aug; 32(Pt 4): 557-560

113. Kleinschmidt, A.K. (1968) Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules // Methods in Enzymol., 12b, 361-377.

114. Kleinschmidt, A.K., Zahn, R.K. (1959) Uber desoxyribonucleinsaure molecolen in protein mischfilmen // Z. Naturforsch., 14b, 770-779.

115. Kohl, R.J. and Hull, T.C. (1974) Aminoacylation of RNA from several viruses: amino acid specificity and differential activity of plant, yeast and bacterial synthesases // J.Gen.Virol., 25, 257-261.

116. Koenig, R., Pleij, C.W., Beier, C., and Commandeur, U. (1998) Genome properties of beet virus Q, a new furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus // J. Gen. Virol., 79, 2027—2036.

117. Koonin, E.V. and Dolja, V.V. (1993) Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28, 375^130.

118. Kubo, S. (1981) Tobacco necrotic dwarf virus / Descriptions of Plant Viruses, No 234.

119. Kubo, S. and Takanami, Y. (1979) Infection of tobacco mesophyll protoplasts with tobacco necrotic dwarf virus, a phloem-limited virus // J. Gen. Virol., 42, 387-392.

120. Kung, Y.J., Bau, H.J., Wu, Y.L., Huang, C.H., Chen, T.M., Yeh, S.D. (2009) Generation of transgenic papaya with double resistance to Papaya ringspot virus and Papaya leaf-distortion mosaic virus // Phytopathology 99, 1312-1320.

121. Kwon, S-J., Park, M-R., Kim, K-W., Plante, C.A., Hemenway, C.L. and Kim, K-H. (2005) c/s-Acting sequences required for coat protein binding and in vitro assembly of Potato virus X//Virology 334, 83-97.

122. Lane, L. C., and Kaesberg, P. (1971). Multiple genetic components in bromegrass mosaic virus //Nature New Biol., 232, 40-43.

123. Lazarowitz, S.G. and Beachy, R.N. (1999) Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants // Plant Cell 11, 535-548.

124. Lawrence, D.M. and Jackson, A.O. (2001) Requirements for cell-to-cell movement of barley stripe mosaic virus in monocot and dicot hosts // Mol. Plant Pathol., 2, 65-75.

125. Lebeurier, G., Nicolaieff, A., and Richards, K.E. (1977) Inside-out model for self assembly of tobacco mosaic virus // Hroc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 149-153.

126. Lee, L., Kaplan, I.B., Ripoll, D.L., Liang, D., Palukaitis, P., and Gray, S. M. (2005) A surface loop of the potato leafroll virus coat protein is involved in virion assembly, systemic movement, and aphid transmission // J. Virol., 79, 1207-1214.

127. Lee, L., P. Palukaitis, and S. M. Gray. (2002) Host-dependent requirement for the potato leafroll virus 17-kDa protein in virus movement // Mol. Plant-Microbe Interact., 15, 1086-1094.

128. Lehto, K., Bubrick, P., and Dawson, W.O. (1990) Time course of TMV 30K protein accumulation in intact leaves // Virology. Jan; 174(1): 290-293.

129. Leonard, D.A. and Zaitlin, M. (1982) A temperature-sensitive strain of tobacco mosaic virus defective in cell-to-cell movement generates an altered viral-coded protein // Virology. Mar; 117(2): 416-424.

130. Li, Q.B. and Palukaitis, P. (1996) Comparison of the nucleic acid- and NTP-binding properties of the movement protein of cucumber mosaic cucumovirus and tobacco mosaic tobamovirus // Virology 216, 71—79.

131. Li, Y., Wu, M.Y., Song, H.H., Hu, X., and Qiu, B.S. (2005) Identification of a tobacco protein interacting with tomato mosaic virus coat protein and facilitating long-distance movement of virus // Arch Virol. Oct; 150(10): 1993-2008

132. Liu, S., Sivakumar, S., Sparks, W.O., Miller, W.A., Bonning, B.C. (2010) A peptide that binds the pea aphid gut impedes entry of Pea enation mosaic virus into the aphid hemocoel // Virology 401, 107-116.

133. Liu, S., Sivakumar, S., Wang, Z., Bonning, B.C., and Miller, W.A. (2009) The readthrough domain of pea enation mosaic virus coat protein is not essential for virus stability in the hemolymph of the pea aphid // Arch Virol.; 154(3): 469-479.

134. Lot, H. (1991) Cucumoviruses / Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the international Committee on Taxonomy of Viruses/

135. R.L.B. Franki, C.M. Fauquet, D.L. Krundson, and F. Braun, Eds. Arch. Virol. Suppl. 2, pp. 386-388. Springer-Verlag. Vienna.

136. Lot, H., and Kaper, J. M. (1976) Physical and chemical differentiation of three strains of cucumber mosaic virus and peanut stunt virus // Virology 74, 209-222.

137. Lucas, W.J. (1995) Plasmodesmata-intercellular channels for macromolecular transport in plants // Curr. Opin. Cell Biol., 7, 673-680.

138. Lucas, W.J. (2006) Plant viral movement proteins: Agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes I I Virology 344, 169-184.

139. Lucas, W.J. and Gilbertson, R.L. (1994) Plasmodesmata in relation to viral movement within leaf tissue // Annu. Rev. Phytopathol., 32, 387-411.

140. Malashenko, S.I., Kondakova, O.A., Taliansky, M.E., and Atabekov, J.G. (1989). Plant virus transport function: complementation by helper viruses is non-specific // J. Gen. Virol., 70, 2751-2757.

141. Malashenko, S.I., Lapchic, L.G., Kondakova, O.A., Kuznetsova, L.L., Taliansky, M.E., and Atabekov, J.G. (1988). Red clover mottle comovirus B-RNA spreads between cells in tobamovirusinfected tissues // J. Gen. Virol., 69, 407412.

142. Matthews., R.E.F. (1970) Plant virology / Acad. Press., 379 p.

143. Mauck, K.E., De Moraes, C.M., Mescher, M.C. (2010) Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts // Proc Natl Acad Sci USA. Feb 23; 107(8): 3600-3605.

144. Maule, A.J. (1991) Virus movement in infected plants // Crit. Rev. Plant Sci., 9, 457-473.I

145. Mayo, M.A., Barker, H., J. Robinson, D.J., T. Tamada, T., and B. D. Harrison, B.D. (1982) Evidence that Potato Leafroll Virus RNA is Positive-stranded, is Linked to a Small Protein and Does Not Contain Polyadenylate // J .Gen Virol., 59 163-167.

146. Mayo, M.A., Robinson, D.J., Jolly, C.A., Hyman, L. (1989) Nucleotide sequence of potato leafroll luteovirus RNA // J Gen Virol., 70, 10371051.

147. Mayo, M.A. and Ziegler-Graff, V. (1996) Molecular biology of luteoviruses // Adv. Virus Res., 46, 413-460.

148. McClintock, J.A. and Smith, L.B. (1918) True nature of spinach-blight and relation of insects to its transmission // J. Agric. Res., Washington DC 14, 1-59.

149. McGeachy, K.D. and Barker, H. (2000) Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants // Mol. Plant Microbe Interact., 13, 125-128.

150. McLean, B.G., Zupan, J., and Zambryski, P.C. (1995) Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cells // Plant Cell 7,2101-2114.

151. Melcher U. (1990) Similarities between putative transport proteins of plant viruses // J. Gen. Virol., 71, 1009-1018.

152. Morozov, S.Yu., Lukasheva, L.I., Chernov, B.K., Skryabin, K.G., and Atabekov, J.G. (1987) Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome // FEBS Lett., 213, 438^442.

153. Morozov, S.Yu. and Solovyev, A.G. (2003) Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement // J. Gen. Virol., 84, 1351-1366.

154. Morozov, S.Yu., Solovyev, A.G., Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Schiemann, J., and Atabekov, J.G. (1999) Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25 K movement protein //Virology 260, 55-63.

155. Mossop, D. W., and Francki, R. I. B. (1979). Comparative studies on two satellite RNAs of cucumber mosaic virus // Virology 95, 395-404.

156. Mushegian, A.R. and Koonin, E.V. (1993) Cell-to-cell-movement of plant viruses. Insights from amino acid sequence comparisons of movement proteins and from analogies with cellular transport system // Arch. Virol., 133, 239-257.

157. Nagano, H., Mise, K., Furusawa, I., and Okuno, T. (2001) Conversion in the requirement of coat protein in cell-to-cell movement mediated by the cucumber mosaic virus movement protein // J. Virol. 75, 8045-8053.

158. Nagy, P. D. and Bujarski, J. J. (1998). Silencing homologous recombination hot spots with GC-rich sequences in brome mosaic virus // J. Virol., 72, 1112-1130.

159. Nagy, P. D. and Simon, A. E. (1997). New insights into the mechanisms of RNA recombination // Virology 236, 1-9.

160. Nagy, P. D., Zhang, C., and Simon, A. E. (1998). Dissecting RNA recombination in vitro: Role of RNA sequences and the viral replicase // EMBO J., 17, 2392-2403.

161. Nault, L.R. (1997) Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis // In Ann. Entomol .Soc. Am., 90, pp. 521-541.

162. Nejidat, A., and Beachy, R.N. (1989). Decreased levels of TMV coat protein in transgenic tobacco plants and elevated temperatures reduce resistance to TMV infection//Virology 173, 531-538.

163. Nelson, R.S., and van Bel, A.J.E. (1998) The mystery of virus trafficking into, through and out of the vascular tissue // Progr. Bot., 59, 476-533.

164. Nicolas, O., Dunnington, S.W., Gotow, L.F., Pirone, T.P., and Hellmann, G.M. (1997) Variations in the VPg protein allow a potyvirus to overcome va gene resistance in tobacco // Virology 237, 452-459.

165. Ng, J.C., and Falk, B.W. (2006) Virus-vector interactions mediating nonpersistent and semipersistent transmission of plant viruses // Annu. Rev. Phytopathol., 44: 183-212.

166. Ng, J.C., Josefsson, C., Clark, A.J., Franz, A.W., and Perry, K.L. (2005) Virion stability and aphid vector transmissibility of Cucumber mosaic virus mutants // Virology 332, 397^105.

167. Nicolaieff, A., Lebeurier, G., Morel, M.C., and Hirth, L. (1979) The uncoating of native and reconstituted TMV by DMSO: the polarity of stripping // J/Gen/Virol., 26, 295-306.

168. Nishiguchi, M., Motoyoshi, F., and Oshima, M. (1978) Behaviour« of a temperature sensitive strain of tobacco mosaic virus in tomato leaves and protoplasts // J. Gen. Virol., 39, 53-61.

169. Noueiry, A.O., and Ahlquist, P. (2003) Brome mosaic virus RNA replication: revealing the role of the host in RNA virus replication // Annu. Rev. Phytopathol., 41, 77-98.

170. Oberg, B., and Philipson, L. (1972) Binding of histidine to tobacco mosaic virus RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 927-932.

171. Oparka, K.J. (2004) Getting the message across: how do plant cells exchange macromolecular complexes? // Trends Plant Sci., 9, 33—41.

172. Oparka, K.J., Prior, D.A.M., Santa Cruz, S., Padgett, H.S., and Beachy, R.N. (1997) Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV) // Plant J., 12, 781-789.

173. Oparka, K.J., and Turgeon, R. (1999) Sieve elements and companion cells-traffic control centers of the phloem // Plant Cell 11, 739-750.

174. Osman, T.A., Hayes, R.J., and Buck, K.W. (1992) Cooperative binding of the red clover necrotic mosaic vims movement protein to single-stranded nucleic acids // J. Gen. Virol., 73, 223-227.

175. Osman, F., Schmitz, I., and Rao, A.L.N. (1999) Effect of C-terminal deletion in the movement protein of cowpea chlorotic mottle virus on cell-to-cell and long-distance movement // J. Gen. Virol., 80, 1357—1365.

176. Palukaitis, P. and Garcia-Arenal, F. (2003) Cucumoviruses // Adv. Virus Res., 62,241-323.

177. Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. I. B. (1992) Cucumber mosaic virus // Adv. Virus Res,. 41, 281-348.

178. Palukaitis P. and Zaitlin M. (1997) Replicase-mediated resistance to plant virus disease // Adv Virus Res.; 48: 349-377.

179. Park, M.R., Kwon, SJ., Choi, H.S., Hemenway, C.L., and Kim, K.H. (2008) Mutations that alter a repeated ACCA element located at the 5' end of the Potato virus X genome affect RNA accumulation // Virology 378(1), 133-141.

180. Pedersen, F. and Haseltine, W. (1980) A micromethod for characterization of high molecular weight RNA // Methods in Enzymol., 65, 680687.

181. Peremyslov, V.V., Andreev, I.A., Prokhnevsky, A.I., Duncan, G. H., Taliansky, M.E., and Dolja, V.V. (2004) Complex molecular architecture of beet yellows virus particles //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 5030-5035.

182. Peremyslov, V.V., Hagiwara, Y., and Dolja, V.V. (1999) HSP70 homolog functions in cell-tocell movement of a plant virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14771-14776.

183. Peter, K.A., Gildow, F., Palukaitis, P., and Gray, S.M. (2009) N-terminus of the Polerovirus P5 readthrough domain limits virus infection to the phloem // J. Virol, 83, No. 11, 5419-5429

184. Peter, K.A, Liang, D, Palukaitis, P., and Gray, S.M. (2008) Small deletions in the potato leafroll virus readthrough protein affect particle morphology, aphid transmission, virus movement and accumulation // J. Gen. Virol, 89, 2037-2045

185. Peters, D.L. and Murphy, T.M. (1975) Selection of temperature-sensitive mutants of tobacco mosaic virus by lesion morphology // Virology 65, 595-600.

186. Petty, I.T., French, R., Jones, R.W., and Jackson, A.O. (1990) Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. // EMBO J., 9, 3453-3457.

187. Pouwels, J., Carette, J.E., Van Lent, J., and Wellink, J. (2002a) Cowpea mosaic virus: effect on cell host processes // Mol. Plant Pathol., 3, 411418.

188. Pouwels, J., Van der Krogt, G.N., Van Lent, J., Bisseling, T., and Wellink, J. (2002b) The cytoskeleton and the secretory pathway are not involved in targeting the cowpea mosaic virus movement protein to the cell periphery // Virology 297, 48-56.

189. Prins, M., Laimer, M., Noris, E., Schubert, J., Wassenegger, M., Tepfer, M. (2008) Strategies for antiviral resistance in transgenic plants // Mol. Plant Pathol., 9, 73-83.

190. Prokhnevsky, A.I., Peremyslov, V.V., Napuli, A.J., and Dolja, V.V. (2002) Interaction between long-distance transport factor and Hsp70-related movement protein of Beet yellows virus // J. Virol., 76, 11003—11011.

191. Qu, F. and Morris, T.J. (1997) Encapsidation of turnip crinkle virus is defined by a specific packaging signal and RNA size // J. Virol., 71, 1428—1435.

192. Rajamaki, M.L. and Valkonen J.P. (2009) Control of nuclear and nucleolar localization of nuclear inclusion protein a of picoma-like Potato virus A in Nicotiana species // Plant Cell. Aug; 21(8): 2485-2502.

193. Rao, A.L.N. (1997) Molecular studies on bromovirus capsid protein: III. Analysis of cell-to-cell movement competence of coat protein defective variants of cowpea chlorotic mottle virus // Virology 232, 385—395.

194. Rao, A. L. N. and Grantham, G. L. (1995). Biological significance of the seven amino-terminal basic residues of brome mosaic virus coat protein // Virology 211,42-52.

195. Rao, A. L. N. and Grantham, G. L. (1996). Molecular studies on bromovirus capsid protein. II. Functional analysis of the amino-terminal argininerich motif and its role in encapsidation, movement and pathology // Virology 226, 294-303.

196. Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., and Maule, A.J. (1999) New advances in understanding the molecular biology of plant/potyvirus interactions // Mol. Plant Microbe Interact., 12, 367-376.

197. Richards, K.E., Guilley, H., Jonard, G., and Hirth, L. (1974) F specifically encapsidated from the RNA of tobacco mosaic virus: sequence homology with the coat protein cistron // FEBS Lett., 43, 31-32.

198. Rochon, D., Kakani, K., Robbins, M., and Reade, R. (2004) Molecular aspects of plant virus transmission by olpidium and plasmodiophorid vectors // Annu. Rev. Phytopathol., 42: 211-241.

199. Rojas, M.R., Zerbini, F.M., Allison, R.F., Gilbertson, R.L., and Lucas, W.J. (1997) Capsid protein and helper compoment-proteinase function as potyvirus cell-to-cell movement proteins // Virology 237, 283-295.

200. Roossinck, M.J. (2002) Evolutionary history of Cucumber mosaic virus deduced by phylogenetic analyses // J Virol. Apr;76(7): 3382-3387.

201. Roossinck, M. J. and Palukaitis, P. (1990). Rapid induction and severity of symptoms in zucchini squash (Cucurbita pepo) map to RNA 1 ofcucumber mosaic virus // Mol. Plant-Microbe Interact., 3, 188—192.

202. Rouleau, M., Smith, R.J., Bancroft, J.B., and Mackie, G.A. (1994) Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein // Virology 204, 254-265.

203. Ryabov, E.V., Fräser, G., Mayo ,M.A., Barker, H., and Taliansky, M.E. (2001a) Umbravirus gene expression helps potato leafroll virus to invade mesophyll tissues and to be transmitted mechanically between plants // Virology 286, 363-372.

204. Ryabov, E.V., Kim, S.-H., and Taliansky, M. E. (2004) Identification of a nuclear localization signal and nuclear export signal of the umbraviral longdistance RNA movement protein // J. Gen. Virol., 85, 1329-1333.

205. Ryabov, E.V., Oparka, K.J., Santa Cruz, S., Robinson, D.J., and Taliansky, M.E. (1998) Intracellular location of two groundnut rosette umbravirus proteins delivered by PVX and TMV vectors // Virology 242, 303-313.

206. Ryabov, E.V., Robinson, D. J., and Taliansky, M. E. (1999) A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, 1212-1217.

207. Ryabov, E.V., Robinson, D.J., and Taliansky, M.E. (2001b) Umbravirus-encoded proteins both stabilize heterologous viral RNA and mediate its systemic movement in some plant species // Virology 288, 391-400.

208. Salanki, K., Gellert, A., Huppert, E., Naray-Szabo, G., and Balazs, E. (2004) Compatibility of the movement protein and the coat protein of cucumoviruses is required for cell-to-cell movement // J. Gen. Virol., 85, 10391048.

209. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual / 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY., 1024 p.

210. Samuel, G. (1931) Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions // Annals Appl. Biol., 18, 494-507.

211. Sanchez-Navarro, J.A. and Bol, J.F. (2001) Role of the alfalfa mosaic virus movement protein and coat protein in virus transport // Mol. Plant Microbe Interact., 14, 1051-1062.

212. Scholthof, H.B., Scholthof, K.B., Kikkert, M., and Jackson, A.O. (1995) Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion // Virology 213, 425—438.

213. Seddas, P. and Boissinot, S. (2006) Glycosylation of beet western yellows virus proteins is implicated in the aphid transmission of the virus // Arch. Virol., 151,967-984.

214. Shin, H.I., Kim, I.C., and Cho, T.J. (2008) Replication and encapsidation of recombinant Turnip yellow mosaic virus RNA // BMB Rep. Oct 31; 41(10): 739-744.

215. Shintaku, M. (1991). Coat protein gene sequences of two cucumber mosaic virus strains reveal a single amino acid change correlating with chlorosis-induction // J. Gen. Virol., 72, 2587-2589.

216. Shintaku, M. H., Zhang, L., and Palukaitis, P. (1992). A single amino acid substitution in the coat protein of cucumber mosaic virus induces chlorosis in tobacco // Plant Cell 4, 751-757.

217. Siegel, A., Hari, V., Kolacz, K. (1978) The effect of tobacco mosaic virus infection on host and virus-specific protein synthesis in protoplasts // Virology 85, 494-503.

218. Simon, A. E. and Bujarski, J. J. (1994). RNA-RNA recombination and evolution in virus-infected plants // Annu. Rev. Phytopathol., 32, 337—362.

219. Simon, A. E. and Nagy, P. D. (1996). RNA recombination in turnip crinkle vims; its role in formation of chimeric RNAs, multimers, and in 39-end repair// Semin. Virol., 7, 373-379.

220. Sit, T.L. and AbouHaidar, M.G. (1993) Infectious RNA transcripts derived from cloned cDNA of papaya mosaic vims: effect of mutations to the capsid and polymerase proteins // J. Gen. Virol., 74, 1133-1140.

221. Sit, T.L, Haikal, P.R, Callaway, A.S, and Lommel, S.A. (2001) A single amino acid mutation in the carnation ringspot virus capsid protein allows virion formation but prevents systemic infection // J Virol. Oct; 75(19): 95389542.

222. Skryabin, K.G, Morozov, S.Yu, Kraev, A.S, Rozanov, M.N, Chernov, B.K, Lukasheva, L.I, and Atabekov, J.G. (1988) Conserved and variable elements in RNA genomes of potexviruses // FEBS Lett, 240, 33-40

223. Soards, AJ, Murphy, A.M., Palukaitis, P, and Carr, J.P. (2002) Virulence and differential local and systemic spread of cucumber mosaic virus in tobacco are affected by the CMV 2b protein // Mol Plant Microbe Interact. Jul; 15(7): 647-653.

224. Sokolova, M, Prafer, D, Tacke, E, and Rohde, W. (1997) The potato leafroll virus 17 K movement protein is phosphorylated by a membrane-associated protein kinase from potato with biochemical features of protein kinase C // FEBS Lett, 400, 201-205.

225. Speir, J. A, Munshi, S, Wang, G, Baker, T. S, and Johnson, J. E. (1995). Structures of native and swollen forms of cowpea chlorotic mottle virus determined by x-ray crystallography and cryoelectron microscopy // Structure 3, 63-78.

226. Suzuki, M, Kuwata, S, Kataoka, J, Masuta, C, Nitta, N, and Takanami, Y. (1991). Functional analysis of deletion mutants of cucumber mosaic virus RNA3 using an in vitro transcription system // Virology 183, 106-113.

227. Suzuki, M., Kuwata, S., Masuta, C., and Takanami, Y. (1995). Point mutations in the coat protein of cucumber mosaic virus affect symptoms expression and virion accumulation in tobacco // J. Gen. Virol., 76, 1791-1799.

228. Swanson, M., Barker, H., and MacFarlane, S.A. (2002) Rapid vascular movement of tobraviruses does not require coat protein: evidence from mutated and wild-type viruses // Ann. Appl. Biol., 141, 259-266.

229. Tacke, E., Prufer, D., Schmitz, J., and Rohde, W. (1991) The potato leafroll luteovirus 17 K protein is a single-stranded nucleic acid-binding protein //J. Gen. Virol., 72, 2035-2038.

230. Taliansky, M.E., Atabekova, T.I., Kaplan, I.B., Morozov, S.Yu., Malyshenko, S.I., Atabekov, J.G. (1982a) A study of TMV ts-mutant №2519. I. Complementation experiments // Virology 118, 301-308.

231. Taliansky, M. E. and Garcia-Arenal, F. (1995). Role of cucumovirus capsid protein in long-distance movement within the infected plant // J. Virol., 69, 916-922.

232. Taliansky, M., Mayo, M.A., and Barker, H. (2003a) Potato leafroll virus: a classic pathogen shows some new tricks // Mol. Plant Pathology 4, 81-89.

233. Taliansky, M.E., Malyshenko, S.I., Pshennikova, E.S., and Atabekov, J.G. (1982b) Plant virus-specific transport function. II. A factor controlling virus host range // Virology 122, 327-331.

234. Taliansky, M.E. and Robinson, D.J. (2003) Molecular biology of umbraviruses: phantom warriors// J. Gen. Virol., 84, 1951-1960.

235. Taliansky, M., Torrance, L., and Kalinina, N.O. (2008) Role of plant virus movement proteins // Methods Mol. Biol., 451, 33-54.

236. Terradot, L., Souchet, M., Tran, V., and Ducray-Bourdin, D. G. (2001) Analysis of a three-dimensional structure of potato leafroll virus coat protein obtained by homology modeling // Virology 286: 72-82.

237. Tomenius, K., Clapham, D., and Meshi, T. (1987) Localization by immunogold cytochemistry of the virus-coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaicvirus // Virology 160, 363—370.

238. Torrance, L. (1992) Analysis of epitopes on potato leafroll virus capsid protein // Virology 191, 485-489.

239. Torrance, L., Andreev, I.A., Gabrenaite-Verhovskaya, R., Cowan, G., Makinen, K., and Taliansky, M.E. (2006) An unusual structure at one end of potato potyvirus particles // J. Mol. Biol., 357, 1-8.

240. Van der Kuyl, A.C., Langereis, K., Houwing, C.J., Jaspars, E.M., and Bol, J.F. (1990) Cis-acting elements involved in replication of alfalfa mosaic virus RNAs in vitro // Virology. Jun; 176(2): 346-54.

241. Van der Kuyl, A.C., Neeleman, L, and Bol, J.F. (1991a) Complementation and recombination between alfalfa mosaic virus RNA3 mutants in tobacco plants // Virology. Aug; 183(2): 731-738.

242. Van der Kuyl, A.C., Neeleman, L., and Bol, J.F. (1991b) Deletion analysis of cis- and trans-acting elements involved in replication of alfalfa mosaic virus RNA 3 in vivo II Virology. Aug; 183(2): 687-694.

243. Van Lent, J., Storms, M., van der Meer, F., Wellink, J., and Goldbach, R. (1991) Tubular structures involved in movement of cowpea mosaic virus are also formed in infected cowpea protoplasts // J. Gen. Virol., 72, 26152623.

244. Verchot-Lubicz, J. (2005) A new cell-to-cell transport model for potexviruses. // Mol. Plant Microbe Interact., 18, 283-290.

245. Verchot-Lubicz., J., Ye, C.M., and Bamunusinghe., D. (2007) Molecular biology of potexviruses: recent advances l/J. Gen. Virol., 88, p. 16431655.

246. Waigmann, E., Chen, M.H., Bachmaier, R., Ghoshroy, S., and Citovsky, V. (2000) Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein // EMBO J., 19, 4875-4884.

247. Waigmann, E., Ueki, S., Trutneva, K., and Citovski, V. (2004) The Ins and Outs of Nondestructive Cell-to-Cell and Systemic Movement of Plant Viruses II Crit. Rev. Plant Sci., 23, 195-250.

248. Waigmann, E., and Zambryski, P. (1995) Tobacco mosaic virus movement protein-mediated protein transport between trichome cells // Plant Cell 7, 2069-2079.

249. Watanabe, Y., Ogawa T., and Okada, Y. (1992) In vivo phosphorylation of the 30-kDa protein of tobacco mosaic virus // FEBS Lett., 313, 181-184.

250. White, K. A. (1996). Formation and evolution of Tombusvirus defective interfering RNAs // Semin Virol., 7, 409-416.

251. Wikoff, W. R., Chao, J. T., Wang, G., Baker, T. S., and Johnson, J. E. (1997). The structure of cucumber mosaic virus: Cryoelectron microscopy, x-ray crystallography, and sequence analysis // Virology 232, 91-97.

252. Wilcockson, J. and Hull, R. (1974). The rapid isolation of plant virus RNAs using sodium perchlorate // J.Gen.Virol., 23, 107-111.

253. Wintermantel, W.M., Banerjee, N., Oliver, J.C., Paolillo, D.J., and Zaitlin, M. (1997) Cucumber mosaic virus is restricted from entering minor veins in transgenic tobacco exhibiting replicase-mediated resistance // Virology. May 12; 231(2): 248-57.

254. Wolf, S., Deom, C.M., Beachy, R., and Lucas, W.J. (1989) Movement protein of tobacco mosaic-virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit // Science 246, 377-379.

255. Wolf, S., Deom, C.M., Beachy, R., and Lucas, W.J. (1991) Plasmodesmatal function probed using transgenic tobacco plants that express a virus movement protein // Plant Cell 3, 593-604.

256. Wu, X. and Shaw, J.G. (1998) Evidence that assembly of a potyvirus begins near the 5'-terminus of the viral RNA // J. Gen. Virol., 79, 1525-1529.

257. Wung, C.H., Hsu, Y.H., Liou, D.Y., Huang, W.C., Lin, N.S., and Chang, B.Y. (1999) Identification of the RNA-binding sites of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaic potexvirus // J. Gen. Virol., 80, 1119-1126.

258. Wylie, S.J., Kueh, J., Welsh, B., Smith, L.J., Jones, M.G., and Jones, R.A. (2002) A non-aphid-transmissible isolate of bean yellow mosaic potyvirus has an altered NAG motif in its coat protein // Arch Virol. Sep; 147(9): 1813-20.

259. Yi, G., Letteney, E., Kim, C.H., and Kao, C.C. (2009a) Brome mosaic virus capsid protein regulates accumulation of viral replication proteins by binding to the replicase assembly RNA element // RNA. Apr; 15(4): 615-626.

260. Yi, G., Vaughan, R.C., Yarbrough, I., Dharmaiah. S., and Kao, C.C. (2009b) RNA binding by the brome mosaic virus capsid protein and the regulation of viral RNA accumulation // J. Mol. Biol., 391, 314-326.

261. Zaitlin, M., Bruening, G., Beachy, R.N., and Scalla, R. (1976) The cowpea strain of TMV is a pseudomulticompjnent virus // Ann. Microbiol., 127A, 37-38.

262. Zhang, L. and Palukaitis, P. (1993). Sequences in LS-CMV controlling tobacco expressing the cucumber mosaic virus 3 a gene // Virology 209, 188-199.

263. Ziegler-Graff, V. and Brault, V. (2008) Role of vector-transmission proteins // Methods Mol. Biol., 451, 81-96.

264. Zimmern, D. (1976) The region of TMV RNA involved in the nucleation of assembly // Phil. Trans. R. Soc. London Ser. B., 276, 189-204.

265. Zimmern, D. (1977) The nucleotide sequence at the origin for assembly of tobacco mosaic virus RNA // Cell 11, 463-482.

266. Zimmern, D. (1983) An extended secondary structure model for the TMV assembly origin, and its correlation with protection studies and an assembly defective mutant // EMBO J., 2, 1901-1907.

267. Zimmern, D, Hiang T.C, and Harley, C. (1993) Wild-type coat protein of tobacco mosaic virus mutant Ni2519 // J. Gen. Virol, 74, 901-905.

268. Zimmern, D. and Hunter, T. (1983) Point mutation in the 30-K open reading frame of TMV implicated in temperature-sensitive assembly and local lesion spreading of mutant Ni2519 // EMBO J, 2, 1893-1900.

269. Zimmern, D. and Wilson, T.M.A. (1976) Location of the origin for virus reassembly on tobacco mosaic virus RNA and its relation to stable fragment //FEBS Lett, 71, 294-298.

Информация о работе

Каплан, Игорь Борисович
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы