Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост и развитие актиномицетов в условиях низкой влажности среды обитания

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Рост и развитие актиномицетов в условиях низкой влажности среды обитания"

На правах рукописи

НАПОЛЬСКАЯ Ксения Романовна

РОСТ И РАЗВИТИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ВЛАЖНОСТИ

СРЕДЫ ОБИТАНИЯ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005057676

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Звягинцев Дмитрий Григорьевич

Официальные оппоненты:

Лихачев Александр Николаевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микологии и альгологии, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Демкина Елена Витальевна

кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН

Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К. А. Тимирязева

Защита состоится. 23 апреля 2013 г. в 15:30 в аудитории М2 на заседании диссертационного совета Д.501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "Л1 " марта 2013г.

Учёный секретарь диссертационного совета: Зенова Галина Михайловна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСКИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность микроорганизмов к росту и развитию определяется увлажненностью среды их обитания, характеризующейся энергетическим состоянием воды: ее давлением (Р, мегапаскалей) или активностью (а„). Энергетическое состояние воды является важным фактором, влияющим на способность микроорганизмов к росту и развитию. Традиционно существовало мнение, что прокариоты более требовательны к давлению влаги (Р), чем эукариоты, и большинство из них могут развиваться лишь при давлении влаги, большем -4 мегапаскалей (МПа), (а,, > 0,95). Большинство грибов также нуждаются в довольно высокой влажности, лишь некоторые из них способны развиваться при Р = -70 МПа (а„ 0.60) (Griffin, 1969, Dix, Webbster, 1995). В многочисленной литературе, касающейся способов хранения продуктов (зерна, муки, хлебобулочных и мясных изделий и т.д.), приводятся сведения о том, что оптимальным условием хранения продуктов является активность воды aw 0.40. Ксерофильные виды грибов (Aspergillus chevalieri, Asp. canidus, Wallemia sebi) способны развиваться на патоке, сухофруктах, орехах при aw 0.65-0.75. Осмофильные дрожжи (Saccharomyces rouxii, Saccharomyces bisporus) и некоторые виды плесеней (Asp. echinulaíus, Monascus bisporus) развиваются и вызывают порчу сухофруктов, содержащих 15-20 % влаги, меда, карамели (aw 0.60-0.65). (Нечаев и др, 2003). Также во многих работах приводятся экспериментальные доказательства выживания микроорганизмов в условиях низкого уровне давления влаги (aw 0.1 - 0.5) (Laroche, Gervais, 2003; Pogoda de la Vega, Rettberg, Reitz, 2007; Wierchos etc, 2011).

Актиномицеты, являясь активными гидролитиками, продуцентами биологически активных веществ, обладая мицелиальным строением и апикальным ростом, составляют активное звено сапротрофных организмов почв аридных районов (Звягинцев, Зенова, 2001). По сравнению с другими бактериями, мицелиальные актинобактерии (актиномицеты) более устойчивы к высушиванию почв (Калакуцкий, Агре, 1977). Однако вопрос о том, определяется ли широкое распространение актиномицетов в почвах аридных территорий способностью мицелия развиваться при низкой влажности или устойчивостью спор к высушиванию, до настоящего времени остается открытым. Недавно Дорошенко Е.А. (Дорошенко и др., 2005) удалось обнаружить, что актиномицеты могут (хотя и очень медленно) развиваться даже при aw 0.50. Однако эти данные получены по-прежнему оставалось неясным, способны ли они развиваться при таком уровне увлажненности естественных почв. Поэтому весьма актуальными являются выявление нижнего допустимого предела увлажненности почв, при котором актиномицеты еще

способны развиваться, и определение характерных параметров циклов их развития при различных уровнях увлажненности.

Поэтому, целью работы явилось определение закономерностей развития актиномицетов при различных' уровнях давления влаги не только на стеклах и искусственной питательной среде, но и в естественной почве.

Задачи исследования

1. Разработка методических приемов исследования способности прорастания спор и прохождения полного цикла развития актиномицетов (от споры до образования спор новой геперации) па агаризованной питательной среде и в почве.

2. Установление предельных значений уровня давления влаги для прорастания спор актиномицетов 5. ос1оп/ег и Х р1иг1Со1огезсет.

3. Определение закономерностей прорастания спор, роста мицелия, прохождения стадий жизненного цикла й^ерютусез ос!оп/ег и 5. р1игко1оге$сет в тонком слое агаризованной среды. Эти стрептомицеты были отобраны как наиболее приспособленные к жизни при низкой увлажненности среды среди многих исследованных штаммов предыдущих экспериментах.

4. Определение интенсивности прорастания спор, роста мицелия и прохождения стадий жизненного цикла 5. ос1оп/ег и £ р1иг1со1огезсепз в почве.

5. Определение наличия свободной воды в лиофильно высушенных спорах актиномицетов, находящихся в условиях низкого давления влаги.

Научная новизна. Впервые определен нижний предел увлажненности среды соответствующий 0.48 для прорастания спор актиномицетов (5. о(1оп/ег и 5. р1игко1оге5сет) на чистых стеклах. При более низкой увлажненности среды (а№ 0.32 -0.43) споры актиномицетов не прорастали.

Впервые установлено, что при давлении влаги Р -104.8 МПа (а„ 0.48) в тонком слое агаризованной питательной среды споры ксеротолерантных стрептомицетов (^¡гврютусез оЛоп/ег и 5. р1ипсо1огезсепз) прорастают, проростки увеличиваются в длину, а через 5 суток отмечается латеральное ветвление мицелия. При Р -26.7 МПа (а„ 0.84) мицелий ветвится уже через 2 суток, а при Р -3.6 МПа (а« 0.98) за 5 суток проходит полный цикл развития актиномицета от прорастания споры до образования новых спор. Динамика прорастания спор подчиняется экспоненциальному закону, позволяющему вычислять время, необходимое для прорастания 50% жизнеспособных спор (1о,5о - 24,2 часа) и среднюю продолжительность жизни спор до прорастания (8 = 34,5 часа) в искусственной питательной среде.

Впервые установлено, что в бурой полупустынной почве при давлении почвенной влаги (Р) - 104.8 МПа (а„ 0,48) в условиях лабораторного эксперимента споры ксеротолерантного штамма 51гер1отусез о^оп/ег прорастают, проростки увеличиваются в длину, образуя мицелий, из которого затем формируются споры новой генерации (таким образом, осуществляется полный цикл развития актиномицета от спор до образования новых спор). Споры 5. р1ипсо1огезсепз в условиях эксперимента при активности воды а„

0.48 прорастали, но образовавшийся мицелий лизировался и споры новой генерации не образовывались.

Продолжительность первых циклов развития актиномицетов варьировала от 13 суток при Р -3.6 МПа до 57 суток при Р -104.8 МПа и была прямо пропорциональной абсолютной величине давления почвенной влаги (Р). В течение первых циклов развития актиномицетов скорости прироста концентрации проросших спор и мицелия (а также и логарифмы отношений концентрации мицелия к концентрации проросших спор) находились в обратной линейной зависимости от логарифма Р. Существование этих функциональных зависимостей свидетельствует о том, что именно энергетическое состояние влаги определяет ее доступность почвенной биоте и, следовательно, активность протекающих в ней физиологических и биохимических процессов.

Установленные факты позволяют считать, что жизнедеятельность мицелиальных актинобактерий (актиномицетов) может осуществляться при экстремально низкой увлажненности и в питательной среде и в естественных почвах.

Практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют существовавшие ранее представления об экологии актиномицетов и их роли в почвах аридных зон. В диссертации разработаны методические подходы для исследования прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях увлажненности как в искусственных средах, так и в естественных почвах.

Результаты работы могут найти применение в области биотехнологии, пищевой промышленности, сельскохозяйственной биологии, медицины, астробиологии. Результаты исследования используются в курсах лекций «Биология почв» и «Строение, развитие и экология актиномицетов» для студентов факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных конференцях: VI Съезда Общества почвоведов имени В.В.Докучаева (Петрозаводск, 2012); «European Geosciences Union General Assembly 2011» (Vienna, Austria, 2011); на VII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2010» (Москва, 2010); на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); на V Всероссийском съезде общества почвоведов (Ростов-на-Дону, 2008), на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах согласно списку ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение и выводы. Работа изложена на iZS страницах текста, содержит иллюстрации и ¡¿{"таблиц. Список литературы включает 9 наименований, в том числе на иностранных языках.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность заведующему кафедрой биологии почв, факультета почвоведения, член-корр. РАН, проф., д.б.н И.Ю.

Чернову, своему руководителю академику РАЕН проф., д.б.н. Д.Г. Звягинцеву. Автор благодарит проф. д.б.н., Г.М. Зенову, . академикт^РАЕН проф., д.б.н. И.И. Судницынь^ с.н.с. кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, к.б.н. Г.М. Николаева, сотрудников кафедры биологии почв: к.б.н. Т.А. Грачеву, к.б.н. Е.В. Лапыгину, М.С. Дуброву за помощь в проведении исследований, всех сотрудников кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В .Ломоносова за помощь и поддержку.

И. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования в работе служили две культуры рода Э^ерЮтусез: сн1оп/ег шт.1 и £ р1ипсо1оге5сепз шт.1. & р1игко1огевсет шт.1 был выделен из бурой полупустынной почвы (гумусовый горизонт А 5-15 см, Астраханская область, Прикаспийская низменность, бугор Большой Барфон.). 5. ос/ог//ёг шт.1 был выделен из водорослевых корочек пересохших засоленных лагун Крыма. Идентификацию культур проводили по фенотипическим (культурально-морфологическим и физиологическим) признакам и с помощью молекулярно-генетических методов (сиквенс гена 168 гГШЛ) (Манучарова, 2010). Культуры идентифицировали как 5. р1игко1оге$сею шт.1. 5. р1ипсо1огеясеп5.

В опытах с почвой использовалась бурая полупустынная почва (гумусовый горизонт А 5-15см) образцы которой отобраны на территории Астраханской области, Прикаспийской низменности, бугор Большой Барфон.

Разработаны три оригинальных методических приема для исследования прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях влажности.

Первый прием основан на наблюдении за прорастанием спор и ростом проростков актиномицетов на чистых предметных стеклах при определенной влажности воздуха, которую создавали в эксикаторах над насыщенными растворами различных солей (табл. 1). В работе использовали моноспоровые суспензии актиномицетов. Моноспоровую суспензию готовили по традиционной методике Кузнецова (Кузнецов, 1973).

Таблица 1. Насыщенные растворы солей, используемые для создания различных уровней давления влаги в эксикаторах при 28°С

Относительная

Соль Уровень давления влажность воздуха Активность воды

влаги (МПа) (%) а«г

МёС12*6Н20 -154.5 32 0,32

К2С0з*2Н2О -117.7 43 0,43

Са(М03)2 -104.8 48 0,48

КС1 -26.7 84 0,84

К2804 -3.6 98 0,98

Микроскопический контроль за распределением и количеством спор в суспензии производили с помощью камеры Горяева под микроскопом Zeizz Axiostar х 100.

Для приготовления препаратов использовали моноспоровые суспензии чистых культур актиномицетов (105 кл./мл). Одну каплю суспензии (20 мкл) наносили на предметное стекло, распределяли по площади 1 см2. Стекла осторожно подсушивали до воздушно сухого состояния. Препараты со спорами помещали в эксикатор с определенным уровнем влажности воздуха и инкубировали в термостате °£фи 28 Уровень влажности воздуха в эксикаторах контролировали цифровым термовлагомером Viking АВ с погрешностью измерения не более 1% во всех опытах. Стекла окрашивали акридином оранжевым (1 : 10000) в течение 2 минут, затем 2 минуты промывали в стакане с водой и просчитывали среднее число спор в поле зрения под люминесцентным микроскопом сразу после нанесения спор и спустя 8, 24, 72 ч экспозиции в эксикаторе. Подсчитывали число проросших спор, т.е. число спор с ростовыми трубками, длину мицелия. Повторность опыта для одной культуры на каждый срок опыта составила не менее 100 полей зрения. Просмотренное стекло в эксикатор не помещали.

Второй прием основан на наблюдении за прорастанием спор и ростом мицелия актиномицетов на предметных стеклах покрытых тонким слоем агаризованной среды при определенной влажности воздуха (Р -104.8 МПа, aw 0.48, Р - 26.7 МПа, a,v 0.84, Р - 3.6 МПа, а„ 0.98). Обезжиренные стекла покрывали тонким слоем (менее 0,5 мм) агаризованной среды Гаузе 1 (1,5% агара), давая среде стекать со стекла. Наблюдали за ростом и развитием актиномицетов. Для приготовления препаратов использовали моноспоровые суспензии чистых культур актиномицетов (105 кл./мл). Одну каплю суспензии (20 мкл) наносили на предметное стекло, покрытое тонким слоем агаризованной питательной среды, распределяли по площади 1 см2. Препараты со спорами помещали в эксикатор с определенным уровнем влажности воздуха и инкубировали в термостате при 28?С. Стекла просматривали сразу после нанесения спор и после 8, 24, 72, 120 часов экспозиции в эксикаторе. Подсчитывали число проросших спор и длину мицелия. Повторность составляла не менее ста полей зрения для одной культуры на каждый срок опыта. Просмотренное стекло снова в эксикатор не помешали.

Третья серия экспериментов основана на наблюдение за прорастанием спор и развитием мицелия актиномицетов при различных уровнях давления влаги в почве. Создавали три уровня увлажненности почв: максимальная гигроскопическая влажность (Р - 3.6 МПа, а„ 0.98), максимальная адсорбционная влагоемкость (Р - 26.7 МПа, aw 0.84) и экстремально низкая увлажненность (Р -104.8 МПа, a,v 0.48). Опыт проводили следующим образом. Из почвы отбирали корешки, просеивали через сито с диаметром пор 1 мм. Почву, предварительно слегка увлажнив, последовательно стерилизовали 3 раза в автоклаве чередуя с инкубированием в термостате. Навеску почвы (1г) помещали в стерильные одноразовые чашки Петри и распределяли по дну чашки слоем высотой менее 1 мм. Чашечки с открытыми крышками помешали в эксикаторы и выдерживали до

постоянной массы при ежедневном взвешивании. В почву вносили сухие споры или увлажненные споры (моноспоровая суспензия (109 кл./мл)). В случае внесения моноспоровой суспензии опыт проходил следующим образом. После внесения моноспоровой суспензии чашки с почвой подсушивали под лампой до массы, которой почва достигла в эксикаторах, затем чашки помешали в эксикатор. В случае внесения сухих спор опыт проходил следующим образом. Готовили сухие споры, методика приготовления сухих спор была следующая. Готовили моноспоровую суспензию стрептомицета (109 кл./мл), центрифугировали при 4600 об./мин., воду после центрифугирования сливали, а оставшиеся споры помещали на предметное стекло и высушивали в течение 10 минут до воздушно-сухого состояния. После внесения спор в почву чашки помещали в эксикаторы с различными солями (табл.1) с открытыми крышками в определенных условиях влажности и исследовали через различные сроки. (ви-ерютусез ос1оп/ег - 7, 10, 14, 17, 21, 28, 36, 43, 50, 57, 64 сутки; 81гер1отусез р1ипсо1огехсет - 7, 10, 14, 17, 24, 28, 35, 42, 49, 56, 62 сутки). Эксикаторы в течение всего опыта находились в термостате (28°С). На каждый временной срок использовалась одноразовая чашечка. Почву из чашки (1г) помещали в колбу со 100 мл стерильной воды, обрабатывали на ультразвуковой установке УЗДН-1 2 минуты при частоте 22 кГц, силе тока I 0,44А. Далее готовили и окрашивали препараты по описанной ранее методике. Учет проросших спор и мицелия проводился с использованием люминесцентного микроскопа Люмам-Ш (объектив х90, масляная иммерсия). Расчет количества проросших спор производили по формуле: ^81*а*п/У*82*С, (где N - число проросших спор в 1г почвы, в] - площадь препарата (мкм2), а - усредненное количество проросших спор в поле зрения, просчитанное для 90 полей зрения, п - показатель разведения (мл), V - объём капли (мл), в2 - площадь поля зрения (мкм2), С - навеска (г)). Расчет длины мицелия на 1 г почвы производился по аналогичной формуле: М = (вг а • п) / (V • вг • С), где а -усредненная длина мицелия в поле зрения.

Для оценки достоверности полученных данных был проведен их статистический анализ с помощью программы <&ТАТ15Т1СА 6.1». Для определения достоверности полученных данных необходимо было определить тип статистического распределения, адекватно опись1вающий массив полученной информации. Обьино это делается при помощи проверки гипотезы о допустимости предполагаемого типа статистического распределения с помощью критерия хи-квадрат (Дмитриев, 1995). Большой объем полученного в данной работе массива экспериментальных данных, достигающий 720 значений для каждого уровня увлажнения почвы, позволил провести такую проверку.

Традиционно эту процедуру начинают с проверки гипотезы о допустимости нормального статистического распределения (Гаусса). Четко выраженная ассиметричность полученного экспериментального распределения (рис. 1) ясно свидетельствует о том, что оно не является нормальным статистическим распределением.

Рис. 1. Статистическое распределение (Пуассона) данных о количестве спор Я/герЮтусеэ ос1ог1/ег в одном поле зрения микроскопа при различных уровнях давления влаги (Р) и активности воды в почве (а„): А - Р=- 104.8 МПа (а„ = 0.48); Б - Р = 22.6 МПа (ачу = 0.84); В - Р = - 3.6 МПа (а>» = 0.98). Условные обозначения: «Лямда»?0 - среднее арифметическое значение массива случайных величин; «сс» - степень свободы; «скорр.» -скорректированная; р» - вероятность встречаемости значенййв полях зрения микроскопа; «Число наблюдений» - частота встречаемости различных «групп»; «Группа (верхние границы)» - количество спор в одном поле зрения микроскопа; заштрихованные столбики гистограмм - экспериментальные частоты встречаемости различных «Групп», а незаштрихованные столбики (и горизонтальные линии в заштрихованных столбиках) -теоретические частоты их встречаемости

Действительно, проверка гипотезы о допустимости нормального распределения показала, что величины критериях2 при давлениях влаги - 104.8, - 26.7 и - 3.6 МПа равны, соответственно, 98.43, 89.09 и 183.79. Эти величины во много раз превышают допустимую величину (5.99), соответствующую количеству имеющихся классов статистической

9

выборки (5) и принятому уровню значимости (0.05) (Дмитриев, 1995). Следовательно, при уровне значимости 0.05 полученное экспериментальное статистическое распределение недопустимо рассматривать как нормальное.

Если же предположить, что полученные данные описываются статистическим распределением Пуассона, то критерий д^ для разных вариантов увлажнения почвы уменьшится в десятки раз (соответственно, до 2.90, 2.55 и 3.59) (рис. 1)

Для определения свободной протонов воды в лиофильно высушенных клетках Streptomyces odorifer, культуру выращивали на минеральном агаре Гаузе-1 14 суток, затем воздушный мицелий собирали и высушивали в лиофильной установке. Перед сушкой образцы замораживали при -20°С и помещали в установку, где создавали вакуум 10"5 торр. На последних этапах сушки образец нагревался до комнатной температуры. Для определения содержания общей фракции липидов в образцах использовали метод Фолча.

Для определения состояния и количества воды в исследуемых образцах использовали метод ядерно-магнитного резонанса спинового эхо, который нечувствителен к неоднородности магнитной восприимчивости..

Для проведения измерений на установке ЯМР-спиновое эхо около 0,5 г исследуемого образца помещается в ампулу. При измерении Тг для исключения влияния диффузии использовали метод Carr-Purcell-Meiboom-Gill (90°- п 180°).

Регистрация спектров высокого разрешения ЯМР проводилась на спектрометре Avance 600 фирмы Bruker. Частота работы установки на Н1 - 600 МГц, на С13 - 150.9 МГц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Прорастание спор и рост мицелия актиномицетов при различном уровне давления влаги на предметных стеклах без питательной среды

Установлено, что споры Streptomyces odorifer и S. plitricolorescens способны прорастать при давлении влаги - 104.8 МПа (а„ 0.48). Интенсивность прорастания спор оказалась наиболее высокой у Streptomyces odorifer. Уже через 8 часов в эксикаторе количество проросших спор (спор с ростовыми трубками) достигало 13%, а через 72 часа 24% от среднего количества спор в поле зрения (табл. 2). Споры S. pluricolorescens прорастали значительно менее интенсивно: к 8 часам опыта прорастало только 4 %, а к 72 часам опыта - 13% от среднего количества спор в поле зрения (табл. 2). При несколько более высоком уровне давления влаги (- 26.7 МПа, а„. 0.84) наиболее активно прорастали споры S.pluricolorescens. При активности воды а„ 0.98 споры двух исследуемых культур актиномицетов хорошо прорастали.

При всех уровнях давления влаги развивался мицелий. Из двух исследуемых культур наибольшей длины мицелий достигал у ос1ог1/ег при всех уровнях давления влаги во все сроки опыта.

При экстремально низких влажностях (ачу 0.32 и а№ 0.43) споры ^/гер/одаусея ойоп/ег и 5. р/ып'со/о/-е^сел5 не прорастали, мицелий не развивался. Таким образом, можно говорить об установлении предельного уровня давления влаги достаточного для прорастания спор £ ос1ог1/ег и 5. р1иг\со1оге8сет на стеклах без питательной среды. Этот предел характеризуется величиной активности воды а„. 0.48.

Таблица 2. Прорастание спор стрептомицетов при различных значениях активности воды (%)

а* —Время, ч Вид $1герМтусех .......... 0 8 24 72

0.48 ос1ог1/ег 0 13 20 24

р1иг1со1огезсет 0 4 10 13

0.84 5. ос!оп/ег 0 15 21 25

5. р1ипсо1огезсеп$ 0 20 28 30

0,98 5. ос!ог1/ег 0 21 29 32

X рЫпсоЬгевсет 0 25 33 38

2. Развитие актиномицетов на стеклах,

Исследование развития актиномицетов

Время, ч

Рис 2. Динамика прорастания спор стрептомицетов при давлении влаги -104.8МПа (а„0.48): 1- 5. ос1оп/ег, 2- 5. р1ипсо1оге5сет

покрытых агаризованной средой

на стеклах, покрытых тонким слоем агаризованной среды, позволивший продлить срок развития

актиномицетов до 120 часов, показал, что даже при самой низкой влажности (а„ 0.48, Р - 104.8МПа) развитие стрептомицетов не ограничивается прорастанием спор и образованием ростовых трубок, а наблюдается интенсивный рост мицелия и его латеральное ветвление.

Число проросших спор 51. ой?ог(/ёг оказалось по сравнению с

рЫпсоЬгеясет наиболее высоким. Уже через 8 часов инкубации в этих условиях доля проросших спор достигала 16% от их общего количества, а к 120 часу доля увеличилась до 42% (рис. 2). ■ ; >

Споры 5. р1иг!со1оге$сеп5 при этом давлении влаги прорастали с меньшей интенсивностью по сравнению со спорами £ (¡¿огг/ег. Через 8 часов доля проросших спор не превышала 6%, а к 5-ым суткам составила лишь 25% (рис. 2). При более высоком давлении влаги (Р - 26.7МПа, а„ 0.84) численность проросших спор обоих штаммов увеличилась - к 120-му часу опыта проросло 36% спор (рис. 3).При Р - 3.6 МПа (а* 0.98) споры прорастали наиболее активно: к 120-му часу проросло 74% (рис. 4).

В целом, динамика прорастания спор двух штаммов стрептомицетов при различных уровнях увлажненности окружающей среды однотипна: в начале опыта интенсивность их прорастания максимальна, но затем она постепенно уменьшалась, асимптотически приближаясь к концу опыта (к 120 часу) к весьма низким значениям, близким к нулю. Математическая обработка результатов показала, что

N, = N0 ее"41,

О)

Доля проросших спор, 40 г

Доля проросших спор,

Рис. 3. Динамика прорастания спор стрептомицетов при давлении влаги - 26.7 МПа (а„ 0.84). I- В. odorifer, 2- 5. р1ипсо1огезсепз

80 120 Время, ч

Рис. 4. Динамика прорастания спор стрептомицетов при давлении влаги - 3.6 МПа (а„ 0.98). 1- & сн!оп/ег, 2- 5. р1игко1огеясею

где N0 - доля всех жизнеспособных спор (то есть всех спор, которые прорастут к концу опыта), Н - доля жизнеспособных спор, ещё не успевших прорасти к моменту 1, е -основание натуральных логарифмов, q - постоянный коэффициент, характеризующий среднюю вероятность прорастания каждой отдельной споры в любой из интервалов времени.

Логарифмируя это уравнение, получаем: ■ . :

^(N,/N0) =-0.43ч1 (2) .-.", .У г.--..

Полученные результаты изображены на рисунке 5. Эти уравнения позволяют вычислить важные параметры - среднюю продолжительность жизни спор до прорастания, 5=1/ц, 5=1/ц=34,5 часа; а также время необходимое для прорастания 50% всех спор 1о,5о= 24,2 часа.

Рост гиф 5. р1иг\со1огехсепз следует этой зависимости только в течение первых 8 часов, а затем скорость их роста замедляется, возможно, вследствие недостаточной доступности влаги. Очевидно, различные закономерности роста исследуемых культур связаны с их генетическими особенностями. . —

0 8 24 72 120

время, ч . _

Рис. 5. Усредненный график изменения количества спор актиномицетов в процессе прорастания при различных уровнях увлажненности среды

Что касается прохождения различных стадий развития, то необходимо отметить, что даже при самом низком давлении влаги (Р - 104.8 МПа; а« 0.48) в тонком слое агара споры не только прорастали, но и увеличивалась длина их проростков, а у 5. ос1ог1/ег через 120 ч отмечено даже латеральное ветвление мицелия. При Р - 26.7 МПа (а* 0.84) через 72 ч у обоих штаммов стрептомицетов наблюдалось ветвление мицелия. При Р - 3.6 МПа (а„ 0.98) через 72 ч у обоих штаммов отмечено не только ветвление мицелия, но и образование микроколоний. Вероятно, это вызвано тем, что в этих вариантах опыта длина мицелия была прямо пропорциональной количеству проросших спор. При этом т = 0.028

[1/ч], 8 = 36 ч, 1о.5 = 25 ч. ....."

Таким образом, модификация метода, включающая использование питательного субстрата (тонкого слоя 1.5% агаризованной питательной среды на предметных стеклах), находящегося в равновесии с водяным паром в эксикаторе, позволила увеличить

продолжительность опыта до 120 часов. Это дало возможность обнаружить у исследованных актиномицетов не только прорастание спор и рост мицелия, но и его обильное латеральное ветвление даже при экстремально низкой влажности (при а„. 0.5 и соответствующем давлении влаги - 104.8 МПа). Математический анализ полученных данных о динамике прорастания спор показал, что эта динамика подчиняется таким же закономерностям, что и химические реакции 1-го порядка.

ее X

4

Ф

| I

то X

5

«

г я 11 11 —

1 1 8» В

1 в ц /

7 24 72 120 время, час.

« 51 ойогКег

4 V в В ' I [ | в Б! р1ипсо1оге5сегв

Я 2 1 0

8 24 72 120

время, час.

Рис. 6. Длина проростков актиномицетов при разных уровнях давления влаги: а - 104.8МПа, б - 26.7МПа, в - 3.6 МПа

ЬСИ'Ьо)

Рис. 7. Усредненный график роста мицелия актиномицетов

3. Развитие актиномицетов в почве

Наблюдения за динамикой развития Я^ерЮтусез ос!ог1/ег в бурой полупустынной почве показали, что в условиях модельного эксперимента (в лабораторных условиях) споры прорастали, а проростки увеличивались в длину, образуя мицелий, из которого затем формировались споры новой генерации даже при экстремально низких уровнях давления почвенной влаги. Данные при внесении в почву моноспоровых суспензий актиномицетов и сухих спор были аналогичными в адекватных условиях.

Длительность опыта 5.£к/ог(/Ьг в почве составила 63 суток. В развитии стрептомицета наблюдали следующие этапы: споры прорастали, проростки увеличивались в длину, развивался мицелий, достигая максимальной длины, а затем мицелий распадался на споры. При разных уровнях влажности развитие стрептомицета шло по-разному Параметры циклов развития актиномицета (их длительность и уровни минимума и максимума) зависели от уровня увлажненности почвы. При максимальной гигроскопической влажности (а„ 0.98, Р -3.6 МПа) в течение опыта произошли 3 полных циклов развития от прорастания спор, роста мицелия до образования спор новой генерации. Продолжительность первых циклов развития актиномицета варьировала от 13 суток при Р -3.6 МПа до 57 суток при Р - 104.8 МПа и была прямо пропорциональной абсолютной величине давления почвенной влаги (Р). Максимальные значения длины мицелия последовательно снижались во времени и были прямо пропорциональны абсолютной величине давления почвенной влаги (рис. 10).

При увлажненности почвы, соответствующей Р - 26.7 МПа, аш 0.84 в течение опыта наблюдали 2 цикла развития актиномицета. 1-ый цикл завершился через 21 сутки, а 2-ой -через 28 суток При а„ 0.48 и Р - 104.8 МПа в течение опыта наблюдали только 1 цикл

развития актиномицета, закончившийся появлением новой генерации спор. Он длился 57 суток.

Таким образом, наблюдения за динамикой прорастания спор и удлинения мицелия актиномицета $1гер1отусе$ ос!оп/ег при низких уровнях увлажнения почвы, позволили обнаружить чрезвычайно высокую устойчивость этого актиномицета к почвенной засухе (ксеротолерантность). До сих пор в литературе отсутствовали сведения о возможности прохождения актиномицетами полного цикла развития при столь низких уровнях активности воды и давления почвенной влаги.

Длительность опыта Лгер/оотусел р1иг!со1оге$сега в почве составила 62 суток. Наблюдение за поведением 5. р1иг1Со1оге$сеп$ в почве показало, что споры стрептомицета интенсивно прорастают, проростки увеличиваются в длину при разных уровнях давления влаги. Так же, как и в случае со Б^ерЮтусез ос!оп/ег при максимальной гигроскопической влажности (а„ 0.98, Р -3.6 МПа) в течение опыта произошли 3 полных цикла развития актиномицета от прорастания спор, роста мицелия до образования спор новой генерации. При а„ 0.84 5. рЫпсоЬгезсею проходит 2 полных цикла развития, от прорастания споры до образования спор новой генерации. Каждый последующий цикл более растянут во времени, чем предыдущий.(рис. 11) Интересно, что при а„ 0.84 споры 8.р1ипсо1огезсет прорастают более интенсивно, что видно из рисунка 10, чем при а„ 0,98, но это не приводит к увеличению длины мицелия. Длина мицелий при а„ 0.84 в 1 г почвы достигает меньших значений, чем при а,, 0.98. Это, как доказано ранее, связано с тем, что скорость роста проростков мицелия 5. р1иг\со1огезсепз замедляется через 8 часов (рис. 9). При а„ 0.48 споры 5. р!иг1со1огезсепз прорастают, проростки увеличиваются в длину, развивается мицелий, однако полный цикл развития не проходит - после 14 суток количество проросших спор и длина мицелия перестают увеличиваться. После 28 суток длина мицелия постепенно уменьшается. Количество непроросших спор при этом не увеличивается, из этого мы можем сделать вывод, что происходит лизис мицелия (рис. 9).

Результаты экспериментов дали возможность выявить ряд закономерностей, которые позволяют впервые строго количественно оценить способность актиномицетов З^ерЮтусез ос!оп/ег и 5. р1иг1со1огасепз выживать и развиваться в условиях экстремально низкой увлажненности почвы.

Выяснилось, что динамика количества непроросших спор (Сн, количество спор в 1 г почвы), спор проросших (Сп, количество спор в 1 г почвы) и длины мицелия (См, м гиф в 1 г почвы) при всех заданных в опыте уровнях увлажненности почвы характеризуется четко выраженной цикличностью (рис. 8, 9).

10 20 за 40 50 60 70' время, сутки

Рис. 8. Развитие Зи-ерШтусея ос1ог1/ег в почве при разных уровнях давления влаги: А -динамика количества непроросших; Б — динамика количества проросших спор (количество спор на 1 г почвы); В - динамика длины фрагментов мицелия в 1 г почвы

20 30 40 50 время, сутки

Рис. 9. Развитие 5&ерШтусез р1иг1со1огезсею в почве при разных уровнях давления влаги: А -динамика количества непроросших; Б - динамика количества проросших спор (количество спор на 1 г почвы); В - динамика длины фрагментов в 1 г почвы

Таблица 3. Динамика прироста спор и мицелия. В каждой ячейке 1-ое число означает среднюю скорость прироста количества проросших спор (количество спор в 1 г почвы в сутки, умноженное на 108), 2-ое число - среднюю скорость прироста мицелия (м в 1 г почвы в сутки), 3-е число — отношение длины мицелия к количеству проросших спор (мкм на 1 спору)

Р {МПа) Циклы развития

1-й 2-ой 3-ий

0.98; -3.6 0.23; 81; 3.5 0.17; 37; 2.2 0.093; 24,2.6

0.84; - 26.7 0.12; 37; 3.1 0.06; 14; 2.3

0.48; -104.8 0.03; 9; 3.0

Так, при Р -3.6 МПа в течение 1-ого цикла У„ достигала 0.23-10*, во 2-ом цикле она снизилась до 0.17108, а в 3-ем - до 0.093 108 спор в г почвы за сутки. V,, в 1-ом цикле была равна 81, во 2-ом цикла уменьшилась до 37, а в 3-ем-до 24 м в г почвы за сутки.

При Р - 26.7 МПа У„ в 1-ом цикле была равна 0.12-108, а во 2-ом снизилась до 0.06-108 спор в г почвы за сутки. Соответственно, Ум уменьшилась от 37 до 14мвг почвы за сутки.

При Р - 104.8 МПа У„ была еще ниже - 0.03-108 спор в г почвы за сутки, а У„-всего лишь 9 м в г почвы за сутки.

Оказалось, что между значениями Уп, Уы и логарифмом абсолютной величины полного давления почвенной влаги (|Р|, МПа) в течение 1-ых циклов существует функциональная (обратная линейная) зависимость:

У„ = (0.425-0.133 1йР|)108, У„=154-49.5 ^|Р|.

Уменьшение энергии жизнедеятельности популяции актиномицетов при увеличении абсолютной величины («модуля») давления почвенной влаги несомненно вызвано снижением ее доступности микроорганизмам. Постепенное же снижение энергии их жизнедеятельности во 2-ом и 3-ем циклах при постоянном давлении почвенной влаги, вероятно, могло быть обусловлено уменьшением концентрации доступного азота, который в процессе прохождения биохимических реакции мог переходить в газообразное состояние и покидать почву.

Полученные данные позволили выявить и динамику соотношения между концентрациями мицелия (С„, м гиф в г почвы) и проросших спор (С„, количество спор в г почвы). Это соотношение (См/С„) также уменьшалось как при повторных циклах, так и при снижении давления почвенной влаги. Так, при Р = -3.6 МПа См/С„ в 1-ом цикле

достигало 3.5 микрометров (то есть одной споре соответствовал отрезок мицелия длиной 3.5 мкм), во 2-ом оно уменьшилось до 2.2. а в 3-ем - до 1.7 мкм. При Р - 26.7 МПа См/Сп даже в 1-ом цикле не превышало 3.1 мкм и 2.3 - во 2-ом, а при Р = - 104.8 МПа даже в 1-ом цикле было равно 3 мкм. Уменьшение этого соотношения, вероятно, и было одной из причин ослабления популяции как во времени, так и при снижении давления почвенной влаги.

Между величиной См/С„ (мкм) в 1-ых циклах и логарифмом абсолютной величины полного давления почвенной влаги (|Р|, атм) существует регрессионная (обратная линейная) зависимость:

(См/С„) = 0.22 (4 - ^

Таким образом, наблюдения за динамикой прорастания спор и удлинения мицелия актиномицетов 31гер1отусез ос!оп/ег и 5. р1иг1со1огезсепз, внесенных в виде моноспоровой суспензии или сухих спор в почву при низких уровнях ее увлажнения, позволили обнаружить чрезвычайно высокую устойчивость этого микроорганизма к почвенной засухе (ксеротолерантность). До сих пор в литературе отсутствовали сведения о возможности прохождения актиномицетами полного цикла развития при столь низких уровнях активности воды и давления почвенной влаги.

Тот факт, что в интервале Р от -3.6 до -104.8 МПа (а„ от 0.98 до 0.48) длительность 1-х циклов развития актиномицетов прямо пропорциональна абсолютной величине полного давления почвенной влаги, свидетельствует о том, что, хотя актиномицеты и способны развиваться при экстремально низкой увлажненности почвы, однако при этом скорость основных физиологических процессов закономерно снижается в результате уменьшения доступности почвенной влаги микроорганизмам. Это доказывается и наличием обратной линейной зависимости между средними скоростями увеличения концентраций проросших спор и мицелия в почве, с одной стороны, и логарифмом полного давления почвенной влаги, - с другой.

Существование регрессионных зависимостей между длительностью циклов, скоростью увеличения концентрации проросших спор и мицелия, а также соотношением этих концентраций, с одной стороны, и энергетическим состоянием почвенной влаги (активностью воды), - с другой, свидетельствует о том, что именно энергетическое состояние влаги (а не концентрация влаги в почве, которая традиционно использовалась для характеристики степени увлажненности почвы) определяет "доступность влаги почвенной биоте и, следовательно, уровень ее физиологической активности. Если дальнейшие исследования подтвердят справедливость1 этих функциональных зависимостей для других почв и штаммов микроорганизмов, то появится возможность

использовать методы математического моделирования этих физиологических процессов и, следовательно, выйти на новый, более высокий (строго количественный) этап познания закономерностей жизнедеятельности почвенной микробиоты в условиях почвенных засух.

Чрезвычайно сильно развитая ксеротолерантность дает этим штаммам актиномицетов (Зггер/отусея ойо^ег и 5. рЫгкоЬгеясепв) возможность адаптироваться в почвах аридной зоны, где резко выражен прерывистый режим снабжения биоты доступной влагой. Она позволяет этим актиномицетам даже в условиях длительных почвенных засух не только расти и образовывать мицелий, но и продуцировать новые генерации спор. Это делает актиномицеты важнейшими компонентами сапротрофного микробного блока, утилизирующего органические вещества, синтезирующего почвенный гумус и тем самым формирующего плодородие почв в аридной зоне.

4. Определение свободной воды в лиофнльно высушенных клетках .Ч!герГотусе.'; ос1оп/гг

Измерение методом ЯМР-спиновое эхо в лиофильно высушенных клетках З^ерЮтусея ос1оп/ег показало, что в них содержится 1,1-1,3% свободной воды.

Рис.10. Спектры ЯМР высокого разрешения Н1 600 МГц (верхняя кривая) и С13 150.9 МГц (нижняя кривая) в лиофильно высушенных клетках 31гер1отусез ос!ог1/ег

Можно предположить, что данного количества воды достаточно для прорастания спор, а дальнейшее развитие идет за счет метаболической воды и воды, поглощенной из среды обитания.

выводы

1. Разработаны методические приемы, которые позволили исследовать способности прорастания спор, роста мицелия и прохождения полного цикла развития актипомицетов Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens (от споры до образования спор новой генерации) на стеклах, в тонком слое агаризованной питательной среды и в почве.

2. Впервые установлено предельное значение уровня давления влаги (- 104.8 МПа, а„ 0.48), при котором споры актиномицетов Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens способны прорастать, проростки увеличиваться в длину и осуществлялся полный цикл развития от прорастания споры и развития мицелия до образования спор новой генерации.

3. Установлено, что в тонком слое агаризованной питательной среды развитие актипомицетов зависит от уровня давления влаги. При экстремально низком давлении влаги (- 104.8 МПа, а*, 0.48) споры актиномицетов Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens прорастают и, проростки увеличиваются в длину, происходит развитие мицелия. При а„ 0.84 мицелий ветвится, а при aw 0.98 происходит образование микроколоний актиномицетов.

4. Математическая обработка данных выявила количественные закономерности развития спор актиномицетов в тонком слое агаризованной питательной среды при низкой влажности. Впервые установлено, что динамика прорастания спор подчиняется экспоненциальному закону, позволяющему вычислить время, необходимое для прорастания 50 % спор, (24,2 ч) и среднюю продолжительность их существования до прорастания (34,5 ч).

5. Впервые установлено, что в бурой полупустынной почве при экстремально низкой активности воды aw 0.48 споры актиномицетов Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens прорастают, и проростки увеличиваются в длину, однако полный цикл развития от прорастания споры до образования спор новой генерации наблюдается только у S. odorifer. Актиномицеты в почве проходят полный цикл развития от прорастания споры, и развития мицелия до образования спор новой генерации при активности воды aw 0.98 и aw 0.84. Число циклов развития и их параметры зависели от уровня увлажненности почвы: чем выше влажность почвы, тем быстрее проходит цикл развития.

6. При помощи метода ЯМР-спиновое эхо в лиофильно высушенных клетках Streptomyces odorifer определено содержание свободной воды. Можно предположить, что прорастание спор при экстремально низкой влажности происходит за счет свободной воды, содержащейся в спорах, а дальнейшее развитие идет за счет метаболической воды и воды, поглощенной из среды обитания.

III. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зенова Г.М., Судницын И.И., Грачева Т.А., Пушкарь K.P., Судницына А.Е. Прорастание спор и дифференциация мицелия актиномицетов в условиях экстремально низкой влажности // V Всероссийский съезд общества почвоведов. 2008. Ростов-на-Дону С. 108.

2. Напольская K.P., Грачева Т.А. Влияние влажности на развитие актиномицетов // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва, МГУ, биологический фак., М.: МАКС Пресс 2009. С. 135.

3. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Судницын И.И., Грачева ТЛ., Напольская K.P.. Белоусова МЛ. Динамика прорастания спор и роста мицелия стрептомицетов в условиях низкой влажности // Микробиология. 2009. Т. 78. №4. С. 491-495.

4. Напольская K.P.. Влияние влажности на развитие актиномицетов в почве // VII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов — 2010. Секция «Почвоведение» М., 2010. С. 74-75.

5. Napolskaya К. Humidity influence on growth and development of soil Streptomyces // European Geosciences Union, General Assembly 2011, Vienna, Austria. P. 104.

6. Жегалло ЕЛ., Орлеанский B.K., Напольская K.P., Курапова А.И. Биологические проблемы первых колонизаторов планеты Земля // Теоретическая и прикладная экология. 2011. № 2. С. 15-20.

7. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Судницын И.И., Грачева ТЛ., Лапыгина Е.Е., Напольская K.P., Судницына А.Е. Развитие актиномицетов в бурой полупустынной почве при низкой влажности // Почвоведение. 2012. № 2. С. 799809.

8. Звягинцев Д.Г., Зенова Г. М., Судницын И.И., Грачева Т.А., Лапыгина Е.В., Напольская KP., Судницына А.Е. Математическая модель зависимости развития актиномицетов от давления почвенной влаги // Материалы международной конференции «Тенденции развития агрофизики в условиях изменяющегося климата» (к 80-летию Агрофизического НИИ) Санкт-Петербург. 2012. С. 506-510.

9. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Судницын И.П., Грачева Т.А., Лапыгина Е.Е., Напольская K.P., Судницына А.Е. Развитие актиномицетов в условиях почвенных засух // Материалы докладов VI Съезда Общества почвоведов имени В.В.Докучаева, том 2, Карельский научный центр РАН Петрозаводск. 2012. С. 345-346.

Подписано в печать: 14.03.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 137 ;'.' Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Напольская, Ксения Романовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

04201355588

Напольская Ксения Романовна

РОСТ И РАЗВИТИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ВЛАЖНОСТИ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ

03.02.03 - микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Звягинцев Д.Г.

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................9

1.1. Вода в клетках микроорганизмов...............................................................9

1.2. Термодинамическая характеристика состояния почвенной влаги........12

1.3. Влияние влажности на различные группы микроорганизмов...............16

1.4. Пределы влажности для выживания разных групп живых организмов24

1.5. Приспособление микроорганизмов к условиям низкой влажности......26

1.6. Влияние свойств жидкой фазы почв на микроорганизмы и их развитие

37

1.7. Микробная порча продуктов питания при разных влажностях............43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ................................................................50

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................50

2.1. Объекты исследований...............................................................................50

2.2. Методы исследования................................................................................54

2.2.1. Методика приготовления моноспоровой суспензии........................55

2.2.2. Методика приготовления сухих спор................................................56

2.2.3. Методика опытов на стеклах без питательной среды..................56

2.2.4. Методика опытов на стеклах, покрытых тонким слоем агаризованной среды......................................................................................57

2.2.5. Методика опытов с почвой................................................................58

2.2.6. Методика определения свободной воды в лиофильно высушенных клетках ^и'ерЬотусез ос1оп/ег.......................................................................62

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................65

3.1. Прорастание спор и рост мицелия актиномицетов при различной влажности, определение предела влажности прорастания спор..................65

3.2. Развитие актиномицетов на стеклах, покрытых агаризованной питательной средой...........................................................................................68

3.3. Развитие актиномицетов в почве..............................................................87

3.4. Определение свободной воды в лиофильно высушенных клетках

Streptomyces odorifer........................................................................................108

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................115

ВЫВОДЫ............................................................................................................117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Способность микроорганизмов к росту и развитию определяется увлажненностью среды их обитания, характеризующейся энергетическим состоянием воды: ее давлением (Р, мегапаскалей) или активностью (aw). Энергетическое состояние воды является важным фактором, влияющим на способность микроорганизмов к росту и развитию. Традиционно существовало мнение, что прокариоты более требовательны к давлению влаги (Р), чем эукариоты, и большинство из них могут развиваться лишь при .давлении влаги, большем -4 мегапаскалей (МПа), (aw > 0,95). Большинство грибов также нуждаются в довольно высокой влажности, лишь некоторые из них способны развиваться при Р = -70МПа (aw 0.60)(Griffin, 1969, Dix, Webbster, 1995). В многочисленной литературе, касающейся способов хранения продуктов (зерна, муки, хлебобулочных и мясных изделий и т.д.), приводятся сведения о том, что оптимальным условием хранения продуктов является активность воды aw 0.40. Ксерофильные виды грибов (Aspergillus chevalieri, Asp. canidus, Wallemia sebi) способны развиваться на патоке, сухофруктах, орехах при aw 0.65-0.75. Осмофильные дрожжи (Saccharomyces roiixii, Zigosaccharomyces bisponis) и некоторые виды плесеней {Asp. echinulatiis, Monascus bisporus) развиваются и вызывают порчу сухофруктов, содержащих 15-20 % влаги, меда, карамели (aw 0.60-0.65). (Нечаев и др, 2003). Также во многих работах приводятся экспериментальные доказательства выживания микроорганизмов в условиях низкого уровне давления влаги (aw 0.1 - 0.5) (Laroche, Gervais, 2003; Pogoda de la Vega, Rettberg, Reitz, 2007; Wierchos etc, 2011).

Актиномицеты, являясь активными гидролитиками, продуцентами биологически активных веществ, обладая мицелиальным строением и апикальным ростом, составляют активное звено сапротрофных организмов почв аридных районов (Звягинцев, Зенова, 2001). По сравнению с другими

4

бактериями, мицелиальные актинобактерии (актиномицеты) более устойчивы к высушиванию почв (Калакуцкий, Агре, 1977). Однако вопрос о том, определяется ли широкое распространение актиномицетов в почвах аридных территорий способностью мицелия развиваться при низкой влажности или устойчивостью спор к высушиванию, до настоящего времени остается открытым. Недавно Дорошенко Е.А. (Дорошенко и др., 2005) удалось обнаружить, что актиномицеты могут (хотя и очень медленно) развиваться даже при а№ 0.50. Однако эти данные получены по-прежнему оставалось неясным, способны ли они развиваться при таком уровне увлажненности естественных почв. Поэтому весьма актуальными являются выявление нижнего допустимого предела увлажненности почв, при котором актиномицеты еще способны развиваться, и определение характерных параметров циклов их развития при различных уровнях увлажненности.

Поэтому целью работы явилось определение закономерностей развития актиномицетов при различных уровнях давления влаги не только на стеклах и искусственной питательной среде, но и в естественной почве.

Задачи исследования.

1. Разработка методических приемов исследования способности прорастания спор и прохождения полного цикла развития актиномицетов (от споры до образования спор новой генерации) на агаризованной питательной среде и в почве.

2. Установление предельных значений уровня давления влаги для прорастания спор актиномицетов & ос1оп/ег и 5. р1ипсо1оге8сет.

3. Определение закономерностей прорастания спор, роста мицелия, прохождения стадий жизненного цикла Би-ер^тусез ос1о?ч/ег и Б. ркичсоЬгезсет в тонком слое агаризованной среды. Эти стрептомицеты были отобраны как наиболее приспособленные к жизни при низкой увлажненности среды среди многих исследованных штаммов предыдущих экспериментах.

4. Определение интенсивности прорастания спор, роста мицелия и прохождения стадий жизненного цикла & ос1оп/ег и & ркичсоЬгеБсет в почве.

5. Определение наличия свободной воды в лиофильно высушенных спорах актиномицетов, находящихся в условиях низкого давления влаги.

Научная новизна.

Впервые определен нижний предел увлажненности среды соответствующий а№ 0.48 для прорастания спор актиномицетов (5*. ос1оп/ег и 5. рШпсоЬгеясепз) на чистых стеклах. При более низкой увлажненности среды (а№ 0.32 - 0.43) споры актиномицетов не прорастали.

Впервые установлено, что при давлении влаги Р -104.8 МПа (а%у 0.48) в тонком слое агаризованной питательной среды споры ксеротолерантных стрептомицетов (ЗЬ'ерШпусеБ ос1о)ч/ег и 8. ркичсоЬгеясет) прорастают, проростки увеличиваются в длину, а через 5 суток отмечается латеральное ветвление мицелия. При Р -26.7 МПа (а№ 0.84) мицелий ветвится уже через 2 суток, а при Р -3.6 МПа (а№ 0.98) за 5 суток проходит полный цикл развития актиномицета от прорастания споры до образования новых спор. Динамика прорастания спор подчиняется экспоненциальному закону, позволяющему вычислять время, необходимое для прорастания 50% жизнеспособных спор ^0,50 = 24,2 часа) и среднюю продолжительность жизни спор до прорастания (Б = 34,5 часа) в искусственной питательной среде.

Впервые установлено, что в бурой полупустынной почве при давлении почвенной влаги (Р) - 104.8 МПа (а№ 0.48) в условиях лабораторного эксперимента споры ксеротолерантного штамма Би-ерШпусех схЛоН/ег прорастают, проростки увеличиваются в длину, образуя мицелий, из которого затем формируются споры новой генерации (таким образом, осуществляется полный цикл развития актиномицета от спор до образования новых спор). Споры б1. рЬпсоЬгеясет в условиях эксперимента при

активности воды 0.48 прорастали, но образовавшийся мицелий лизировался и спор новой генерации не образовывались.

Продолжительность первых циклов развития актиномицетов варьировала от 13 суток при Р -3.6 МПа до 57 суток при Р -104.8 МПа и была прямо пропорциональной абсолютной величине давления почвенной влаги (Р). В течение первых циклов развития актиномицетов скорости прироста концентрации проросших спор и мицелия (а также и логарифмы отношений концентрации мицелия к концентрации проросших спор) находились в обратной линейной зависимости от логарифма Р. Существование этих функциональных зависимостей свидетельствует о том, что именно энергетическое состояние влаги определяет ее доступность почвенной биоте и, следовательно, активность протекающих в ней физиологических и биохимических процессов.

Установленные факты позволяют считать, что жизнедеятельность мицелиальных актинобактерий (актиномицетов) может осуществляться при экстремально низкой увлажненности и в питательной среде и в естественных почвах.

Практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют существовавшие ранее представления об экологии актиномицетов и их роли в почвах аридных зон. В диссертации разработаны методические подходы для исследования прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях увлажненности как в искусственных средах, так и в естественных почвах.

Результаты работы могут найти применение в области биотехнологии, пищевой промышленности, сельскохозяйственной биологии, медицины, астробиологии. Результаты исследования используются в курсах лекций «Биология почв» и «Строение, развитие и экология актиномицетов» для студентов факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных конференцях: VI Съезда Общества почвоведов имени В.В.Докучаева (Петрозаводск, 2012); «European Geosciences Union General Assembly 2011» (Vienna, Austria, 2011); на VII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» (Москва, 2010); на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); на V Всероссийском съезде общества почвоведов (Ростов-на-Дону, 2008), на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах согласно списку ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, заключение и выводы. Работа изложена на 128 страницах текста, содержит 32 иллюстрации и 25 таблиц. Список литературы включает 97 наименований, в том числе 43 на иностранных языках.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность заведующему кафедрой биологии почв, факультета почвоведения, член-корр. РАН, проф., д.б.н И.Ю. Чернову, своему руководителю академику РАЕН проф., д.б.н. Д.Г. Звягинцеву Автор благодарит проф. д.б.н., Г.М. Зенову, с.н.с. кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, академика РАЕН проф., д.б.н. И.И. Судницына, к.б.н. Г.М. Николаева, сотрудников кафедры биологии почв: к.б.н. Т.А. Грачеву, к.б.н. Е.В. Лапыгину, М.С. Дуброву за помощь в проведении исследований, всех сотрудников кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени

М.В.Ломоносова за помощь и поддержку.

8

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ВОДА В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Вода является самым распространенным веществом на Земле. Вода играет огромную роль в жизни живых организмов. В их клетках содержится до 80% воды, она является основой всех биохимических процессов, происходящих в организме. Жизнь клетки, любые проявления обмена веществ клетки в целом и ее отдельных структур возможны только в присутствии воды.

В живых клетках вода служит средой, в которой молекулы разных размеров взаимодействуют между собой. Структура воды, в которой находятся растворенные вещества, контролирует все жизненно важные процессы в клетке: действие ферментов и регуляцию их активности, ассоциацию и диссоциацию органелл, структуру мембран и их функционирование.

Вода является уникальным веществом в биологических системах благодаря ряду специфических свойств. Уникальные свойства определяются структурой ее молекул. В молекуле воды один атом кислорода образует две ковалентные полярные связи с двумя молекулами водорода. Молекула изогнута под углом: в вершине угла находится атом кислорода, а по краям -атомы водорода. Поскольку электроны притягиваются сильнее к кислороду, чем к водороду, молекулы воды полярны (Кемп, Арме, 1988). Вода имеет максимальную плотность при 4° С. У воды высокая теплота испарения (539 кал/г) и величина плавления (80 кал/г). Также у воды высокие величины поверхностного натяжения, внутреннего давления и диэлектрической постоянной (0=80) (Бекер и др. 1981).

Молекулы воды являются диполями и благодаря этому способны образовывать водородные связи между собой. Это делает воду хорошим растворителем для веществ, имеющих полярные молекулы, в том числе

большинства ионных соединений. Но с другой стороны водородные связи сохраняют специфическую структуру воды обуславливают появление 3 типов эффектов, которые непосредственно влияют на формирование структуры важнейших биополимеров и на вопросы функционирования.

К первому типу эффектов относится изменение конформации макромолекул за счет включения молекул воды в структуру биополимеров и вместо прямых связей образованием водородных между участниками цепи или разными цепями, входящих в состав надмолекулярной структуры. Этот тип взаимодействия участвует в стабилизации структуры фибриллярных биополимеров, в том числе ДНК и коллагена.

Ко второму типу эффектов воды в биологических структурах относятся гидрофобные взаимодействия. Эти взаимодействия играют большую роль в стабилизации глобулярных белков (Хипполь, Шлейх, 1973).

К третьему типу эффектов относится возможность передачи заряда в биологических системах по структуре воды на расстояния, включая использование островков «льдоподобной» структуры воды вокруг макромолекул биополимеров.

Данные эффекты обуславливают исключительные свойства воды как участника биологических реакций и как среды (Аксенов, 1990). Вода уникальна среди множества жидкостей еще и тем, что сохраняет в жидком состоянии специфическую структуру благодаря образованию до 4 водородных связей (Аксенов, 1978).

Вода обладает высокой теплоемкостью, благодаря этому вода действует в клетках как тепловой буфер, сводящий к минимуму все температурные изменения. Протекание биохимических процессов в меньшем интервале температур, с более постоянной скоростью, ведет к снижению опасности нарушения этих процессов от резких отклонений температур (Ленинджер, 1985).

Можно выделить основные функции, которые вода выполняет в клетке:

1. Вода выступает в роли химического реагента в клетке, вступает в химические реакции гидролиза и конденсации.

2. Вода служит растворителем для метаболитов клеточного пула, концентрация которых играет важную роль в метаболической регуляции.

3. Вода обеспечивает тургор клеток, поддерживая гироскопическое давление внутри клеток.

4. Вода выполняет структурную функцию, обеспечивает гидратацию белка и других клеточных компонентов за счет образования водородных связей с полярными группами (Перт, 1987).

5. Вода образует дисперсную фазу сложных растворов органических и неорганических веществ, не встречается в виде чистого вещества в клетках.

Вода встречается в клетках в виде следующих структурных типов и выполняет следующие функции в клетке:

1. Ионные растворы способны к разрушению упорядоченной структуры.

2. Водородно-связанные растворы активно внедряющиеся в водную решетку.

3. Инертные в химическом отношении растворы стабилизируют структуру воды благодаря формированию сверхструктуры.

4. Полифункциональные растворы включают различные сочетания вышеперечисленных типов взаимодействия (Бекер и др., 1981).

Вода может принимать несколько модификаций в зависимости от температуры:

1. Вода, которая образуется ща счет водородных связей.

2. Структура льда, которая образуется при температуре ниже 4 °С.

3. Вода, структура которой аналогична структуре кварца. Такая вода преобладает при обычных температурах.

4. Вода с более плотной упаковкой молекул. Такая вода преобладает при высоких температурах.

В живых клетках выделяют свободную и связную воду. Связной водой называют такую воду в биологических объектах, которая вступает в прочное взаимодействие с компонентами объекта и пл�