Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль верхних листьев и градиентов фитогормонов в стебле в регуляции апикального доминирования у Pisum sativum L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котов, Андрей Александрович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

КОТОВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РОЛЬ ВЕРХНИХ ЛИСТЬЕВ И ГРАДИЕНТА ФИТОГОРМОНОВ В СТЕБЛЕ В

РЕГУЛЯЦИИ АПИКАЛЬНОГО ДОМИНИРОВАНИЯ У P1SUM SATIVUM L.

03.00.12 - физиология растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

^ Научный руководитель

доктор биол. наук Н. Г. БУХОВ

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................4

СОКРАЩЕНИЯ.............................................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................11

1.1. Коррелятивное торможение роста латеральных почек и выход их

из покоя.........................................................................................................11

1.2. Транспорт ауксина - основной коррелятивный сигнал апикального доминирования.............................................................................................15

1.3. Предположительные механизмы ингибирующего действия апикального ауксинового сигнала (транспорт ИУК).....................................18

1.4. Цитокинины и ауксин-цитокининовое взаимодействие в апикальном доминировании.....................................................................................26

1.5. Роль АБК и ГК в апикальном доминировании.........................................34

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................37

2.1. Растительный материал и схемы экспериментов.......................................37

2.2. Хроматографическое разделение и очистка фитогормонов для

ИФА...............................................................................................................42

2.3. ИФА фитогормонов.....................................................................................52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................................67

3.1. Ростовая активность 1-й и 2-й латеральных почек и междоузлий. Уровень АБК и ГК в междоузлиях.............................................................67

3.2. Базипетальный транспорт ИУК.................................................................72

3.3. Базипетальный транспорт цитокининов и его взаимосвязь с транспортом ИУК................................................................................................75

3.4. Рост латеральных почек и базипетальный транспорт фитогормонов..................................................................................................................79

3.5. Содержание ИУК в междоузлиях...............................................................90

3.6. Содержание цитокининов в междоузлиях..................................................92

3.7. Содержание З/ЗР в междоузлиях и базипетальный транспорт ИУК

и ЗР................................................................................................................95

3.8. Рост латеральных почек и содержание З/ЗР и ИУК в междоузлиях........98

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................104

4.1. Базипетальный транспорт фитогормонов как коррелятивный сигнал регуляции отрастания латеральных почек........................................104

4.2. Коррелятивная связь ингибирования латеральных почек с содержанием фитогормонов в междоузлиях.....................................................107

4.3. Формирование ауксин-цитокининового статуса междоузлия..............110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................117

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................120

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................................122

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Функционирование высшего растения как целостной системы основано на наличии коррелятивных взаимосвязей между его отдельными органами. Наглядное проявление таких взаимосвязей - ростовые корреляции, заключающиеся в том, что рост каждого органа зависит от интенсивности и характера роста остальных органов растения. Одним из таких типов ростовых корреляций является апикальное доминирование, то есть преимущественный рост верхушки стебля и торможение роста ниже расположенных почек.

Степень выраженности апикального доминирования определяет характер ветвления растений, что важно для решения многих вопросов растениеводства. Увеличение урожая некоторых культур (голубика, черника, кукуруза, каянус) достигается снятием апикального доминирования, а для других культур в этих целях удаляют отрастающие боковые побеги (томаты, шелковица). Коммерческие затраты для выполнения операций по удалению боковых побегов и декапитации могут достигать 5-10% от всех затрат на производство продукции. Значительные средства затрачиваются на обрезку боковых веток с деревьев вокруг линий электропередач, железных дорог и зданий.

Несмотря на то, что апикальное доминирование является одним из наиболее изученных типов ростовых корреляций, проблема гормонального контроля этого, явления еще далека от полного решения (Cline, 1994; Tamas, 1995; Beveridge et al., 1997; Stafsírom et al., 1997). Она объединяет в себе как проблему гормональных основ взаимодействия sink-органов в системе донорно-акцепторных отношений целого растения (Мокроносов, 1983; Bangerth, 1989; Tamas, 1995), так и проблему эндогенной гормональной регуляции процессов контроля выхода и входа в покой, представляющий собой временную приостановку видимого роста растительной

структуры, содержащей меристему (Чельцова, 1980; Wang, Faust, 1990; Wang et al., 1994).

На настоящий момент не вызывает сомнений, что ИУК, транспортирующаяся из апикальной почки, играет ключевую роль в коррелятивном ингибирова-нии латеральных почек, однако, при этом ауксин не проникает в сами почки (Cline, 1991; Tamas, 1995). Механизм, опосредующий его действие, вероятно, может быть двояким. Согласно первому, подавление роста латеральных почек может происходить на уровне конкуренции самих транспортных потоков ИУК: мощный поток из доминирующего апикального sink-органа (почка, плод) коррелирует с ослаблением её оттока из нижерасположенных латеральных вторичных sink-органов (Bangerth, 1989; Gruber, Bangerth, 1990). По мнению авторов этой гипотезы, для конкуренции потоков ИУК между собой не нужно участия вторичных гормональных мессенджеров, и в её основе скорее всего лежат специфические свойства полярного транспорта ИУК в ткани растения (Sachs, 1969, 1984; Johnson, Morris, 1989; Morris, Johnson, 1990), однако, детальный механизм этого явления не совсем понятен (Tamas, 1995). Другим ингибиторным механизмом действия ИУК, транспортирующейся из апикальной почки, является подавление транспорта цито-кининов из корня (Bangerth, 1994) и снижение содержания цитокининов в стебле (Li et al., 1995). Поскольку ранее было показано, что цитокинины, нанесенные на. коррелятивно заторможенные латеральные почки, способны полностью или частично снимать апикальное доминирование (Sachs, Thimann, 1967; King, Van Staden, 1988; Li, Bangerth, 1992; Tepper, 1993), то данный механизм действия апикального ауксина является цитокинин-опосредованным.

В опытах с нанесением цитокининов на верхушечную почку было показано, что они способны стимулировать из нее экспорт ИУК (Li, Bangerth, 1992). В связи с обнаружением такого эффекта И. Тамас (Tamas, 1995) выдвинул предположение,

что отмечаемое постдекапитационное повышение уровня цитокининов в ксилем-ном соке и стебле (Bangerth, 1994; Li et al., 1995), а также, вероятно, в самой латеральной почке, помимо активации клеточных делений, могло бы восстанавливать в покоящихся латеральных почках полярный транспорт ИУК, утраченный во время коррелятивного покоя (Morris, Johnson, 1990). Таким образом, первый механизм апикального доминирования, основанный на предложенной теории конкуренции ауксиновых транспортных потоков (Bangerth, 1989), можно объяснить реализацией ингибиторного действия апикального ауксина в отношении поступления в побег цитокининов из корня, т. е. через второй механизм.

Для выяснения вопроса о том, является ли цитокинин-опосредованный механизм действия ИУК основным механизмом апикального доминирования, возникает необходимость точного количественного исследования взаимосвязи ауксино-вого и цитокининового сигналов с ростовой активностью латеральной почки, что не предпринималось ранее. Такой количественный подход также интересен и в отношении эндогенных АБК и ГК, роль которых в апикальном доминировании еще не до конца выяснена (Cline, 1991; Tamas, 1995). Экзогенное применение этих гормонов способно усиливать или ослаблять действие ИУК и цитокининов на рост латеральных почек (Catalano, Hill, 1969; Phillips, 1971; Wooley, Wareing, 1972; Härtung, Fünfer, 1981), а градиент распределения по стеблю АБК может коррелировать в ряде случаев с порядком растормаживания латеральных почек вдоль оси стебля (Zieslin et al., 1978; Everat-Bourbouloux, 1987).

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучить роль базипеталь-ного транспорта ИУК и баланса фитогормонов в стебле в регуляции роста латеральных почек проростков гороха (Pisum sativum L.). В работе решали следующие задачи:

— исследовать влияние апикальных листьев разного возраста как эндогенного источника ИУК на степень отрастания латеральных почек и сравнить с действием экзогенной ИУК;

— определить интенсивность базипетального транспорта ИУК из листьев апикальной почки и при нанесении экзогенной ИУК, а также базипетальный транспорт других фитогормонов, для выяснения их роли в регуляции роста латеральных почек;

— выяснить особенности распределения по стеблю АБК и ГК и их динамику в связи с ростовой активностью латеральных почек;

— исследовать уровни содержания цитокининов и ИУК в междоузлиях для оценки их значения в регуляции ростовой активности латеральных почек;

— изучить взаимосвязь уровней ИУК и цитокининов в междоузлиях с интенсивностью базипетального транспорта этих фитогормонов и АБК-ГК статусом междоузлий.

Методическими предпосылками для успешного решения поставленных задач были, во-первых, выбор адекватной биологической модели и, во-вторых, разработка аналитических методов, позволявших количественно характеризовать уровни различных фитогормонов в ткани и их транспорт.

Научная новизна работы. На основе сопоставления ростовой активности латеральных почкек и интенсивности активного базипетального транспорта ИУК было обнаружено, что действие последнего зависит от ряда факторов, модулирующих его ингибиторную эффективность. В качестве этих факторов выступают возраст и/или АБК-ГК статус междоузлия, на котором расположена почка и также возраст апикальных листьев. Впервые выяснено, что дополнительное ингибирую-щее воздействие, оказываемое на отрастание латеральной почки более взрослым

листом, опосредуется более низким базипетальным флоэмным транспортом цито-кининов, имеющих, вероятно, корневое происхождение. Установлено, что рост латеральных почек определяется ауксин-цитокининовым статусом междоузлия, а ГК и АБК в междоузлиях скорее принимают участие в модификации этого статуса, повышая или снижая накопление тканями междоузлия ИУК и цитокининов из их транспортных пулов.

Теоретическое и практическое значение. Полученные результаты, с учетом литературных данных, позволяют дополнить общую схему гормональной регуляции апикального доминирования, в которой действие апикального ауксина на рост и торможение отрастания латеральных почек преобразуется гормональными стимулами практически всех частей растения: корнем, листьями, стеблем. Это объясняет сложность и интегративность явления апикального доминирования. Стебель является не только транспортирующим органом, но и важным звеном в управлении роста латеральных меристем, поскольку не интенсивность транспорта ИУК и цитокининов, а уровень содержания этих фитогормонов в таани междоузлия определяет активность роста латеральных почек. Данный подход дает основу для изучения клеточных и биохимических механизмов реализации фитогормо-нальных стимулов в апикальном доминировании.

Нами была разработана быстрая и эффективная система очистки, разделения и ИФА фитогормонов в одной пробе, содержащей небольшое (до 100 мг сырого веса) количество растительного материала, позволяющая проводить изучение полного гормонального баланса (ИУК, Зеа и ЗР, ИП и ИПА, АБК, ГК) в различных органах и тканях растения.

СОКРАЩЕНИЯ

2,4-Д - 2,4-дихлорофеноксиуксусная кислота 2,6-Д - 2,6-дигидроксиацетофенон

АБК - абсцизовая кислота АВГ - аминоэтоксивинилглицин АС - антисыворотка AT - антитела

АТФ - аденозин-5-трифосфат

БАП - 6-бензиламинопурин (7У6-бензиладенин)

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГК - гиббереллин

ДЦКД - дициклогексижарбодиимид

Зеа (=3) - транс-зеатин

ЗР - /я/?аяс-зеатинрибозид (рибозилзеатин)

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ЗФР-Т - ЗФР, содержащий 0.05% Тритона Х-100

ИААсп - индолилацетиласпарагиновая кислота

ИМК - индолил-3-масляная кислота

ИП - #6-(изопентен-2-ил)аденин

ИПА - тУ6-(изопентен-2-ил)аденозин

ИУК - индолил-3-уксусная кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

Лиз-Ов - конъюгат лизина с овальбумином

НУК - 1-нафталинуксусная кислота

НФК - N-1 -нафтилфталаминовая кислота

Ов - овальбумин

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПБК - 2-(1-пиренол)бензойная кислота (фитотропин)

ПВПП - поливинилполипирролидон

ТИБК - 2,3,5-трииодобензойная кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФГ - фитогормон

ХПФМ - Аг-фенил-Лг'-(2'-хлор-4'-пиридил)мочевина (синтетический цитокинин) ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АсОН - уксусная кислота

ВНТ - бутилированный гидрокситолуол (от англ. butylated hydroxytoluene) С18 - силикагель, модифицированный октадецилсиланом EtOH - этанол

GR - скорость роста (от англ. growth rate) МеОН - метанол г - коэффициент корреляции

SE - стандартная ошибка (стандартное отклонение среднего арифметического)

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиолого-биохимические основы коррелятивного покоя и выхода из него.

В целом растении, как правило, интенсивный рост одних частей (апикальный побег, развивающиеся плоды) сопровождается ингибированным состоянием других (латеральные побеги и/или почки, завязывающиеся плоды) (Cline, 1991; Tamas, 1995). Коррелятивное растормаживание латеральных почек наблюдается при удалении активно растущих побегов или плодов (Tamas, 1995) или торможении их роста (в основном, апикальной верхушки) при обработке АБК (Bellandi, Dôrffling, 1974) или ретардантами антигиббереллинового действия, такими как AMO 1618 (Cline, 1991). Кроме того, улучшение корневого минерального питания (Mclnture, 1968; Tomar, 1983), а также оптимизация условий фотосинтеза (интенсивность света, СО2) способно снимать апикальное доминирование (Andersen, 1976). Таким образом, на формирование конечного коррелятивного сигнала, управляющего ростом меристем растения, может влиять много факторов, но вначале мы подробнее остановимся на тех процессах и событиях, которые происходят в результате действия этого сигнала.

Экспрессия генома при переводе от покоя к росту. Выход из покоя латеральных почек проростка после декапитации сопровождается достаточно быстрым включением экспрессии одних генов и спадом экспрессии других. Так, уже через 6 ч после декапитации в латеральных почках проростка гороха появляется большое количество ростоспецифичных белков и понижается уровень покой-специфичных белков, в то время как видимый рост наблюдается только через 8 ч после декапитации (Stafstrom, Sussex, 1988). Уже через 1 ч после декапитации в пазушной почке 2го рудиментарного листа проростка Pisum sativum cv. Alaska, была обнаружена экспрессия гена рибосомального белка pGB8, уровень мРНК которого через 3 ч возрастал 13-кратно, а через 12 ч выходил на максимальный 35-кратный

уровень, который при длительном росте почки оставался относительно стабильным (Stafstrom, Sussex, 1992; Stafstrom, 1993; Stafstrom, Devitt, 1995). Высокий уровень мРНК pGB8 был также в апикальной почке и практически не обнаруживался в полностью развитых листьях (Stafstrom, Sussex, 1992).

Экспрессия другого гена в латеральных почках проростков гороха, drml, напротив, после декапитации достаточно резко снижалась и уровень его мРНК через 6 ч был в 20 раз ниже, чем в покоящейся почке интактных растений (Stafstrom et al., 1997). Интересно отметить, что последовательность клона ДНК гена drml имела 65% идентичности ауксин-репрессируемому клону, полученному на землянике, т. е. снижение экспрессии этого гена, по-видимому, связано с началом увеличения уровня эндогенной ИУК в выходящих из покоя латеральных почках - факт, который был показан на декапитированных проростках фасоли (Gocal et al., 1991). Интенсивная экспрессия гена drml была также обнаружена в закончивших рост зрелых частях корня и стебля Pisum sativum L., что может охарактеризовать этот ген как покой-специфический (Stafstrom et al., 1997).

Клеточный цикл и митотическая активность. В коррелятивно заингибиро-ванных почках Pisum sativum клетки пребывают в фазе Go-i (пролонгированная стадия Gi) (Nougarede et al., 1990). После декапитации растений клеточный цикл реактивируется и клетки латеральных меристем последовательно входят в фазу S (происходит синтез ДНК и гистоновых белков), G2 и митоз соответственно через 6, 12 и 24 ч (Nougarede et al., 1990).

Активация клеточного цикла и переход от Gi к S фазе, вероятно, может быть связано с активацией МАР-киназ (mitogen-activated protein kinases, Епифанова, 1997, с. 73-75), ген растительного гомолога которых был идентифицирован в латеральных почках гороха при анализе, проведенном спустя 24 ч после декапитации (Stafstrom et al, 1993). Многие аспекты МАР-киназной активности в расти-

тельных объектах, т. е. время синтеза, способ регуляции, субстратная специфичность, еще