Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток

Гусакова, Светлана Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток"

На правах рукописи

ООЗОБ75Д1 Гусакова Светлана Валерьевна

РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2007

003057541

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Баскаков

Михаил Борисович

Барбараш Нина Алексеевна

Яхонтов Сергей Владиславович

Ведущая организация:

ГУ НИИ физиологии СО РАМН

Защита состоится 2007 г в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208 096 01 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050 г Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г Томск, проспект Ленина, 107)

Автореферат разослан "у^ " 2007 г

Ученый секретарь л л

диссертационного совета С^//'^^ Суханова Г А

Актуальность исследования Сократительные свойства гладкомышечных клеток (ГМК) во многом определяют физиологический и патофизиологический статус сосудов и висцеральных органов В последние годы, наряду с классическими представлениями о ключевой роли кальций-зависимых механизмов регуляции сократительной функции ГМК [Шуба М Ф и соавт, 1984, 1988, Kunyama Н , 1998], все большее внимание исследователей привлечено к цитоскелету с позиции его участия в процессах сопряжения возбуждения-сокращения [Orlov S N et al, 1996, Anfinogenova Y J et al, 2004, Burgstaller G , Gimona M, 2004, Zhang D et al, 2001, 2006] Именно цитоскелет может оказаться одним из ключевых эффек-торных звеньев, к которому конвергируют различные сигнальные пути, участвующие в регуляции сократительной активности ГМК

В исследованиях единичных Са2+-токои мембраны ГМК прямо показано нарушение оперирования Са2+-каналов L-типа при дезинтеграции актиновых микрофиламентов [Nakamura М et al, 2000] С использованием культуральных ГМК из аорты крысы обнаружено, что увеличение продукции цАМФ существенно снижает вход 45Са, индуцированный деполяризацией мембраны в гиперкалиевой среде Такое же действие на вход 45Са оказывала предобработка клеток дезинтегратором Г-актина цитохалазином В [Orlov SN et al , 1995, 1996] Эти данные указывают на то, что ингибирующее действие цАМФ на L-тип Са2+-каналов, вероятно, связано с реорганизацией актинового цитоскелета Не исключено, что в данном случае ковалентная модификация белков, катализируемая цАМФ-зависимой протеинкиназой, сдвигает равновесие между F- и G-актином в сторону последнего

Другой возможный механизм расслабления гладких мышц при действии индукторов цАМФ может быть связан с угнетением №+,К+,2СГ-котранспорта (NKCC) Активация NKCC вносит существенный вклад в сократительные реакции сосудистых ГМК не только при аппликации биологически-активных веществ, но и наблюдаемые в моделях гиперосмотической и изоосмотической стрикции клеток [Anfinogenova Y J et al, 2004] Возможно, одним из механизмов изменения реактивности сосудистых ГМК в моделях стрикции клеток является увеличение общей концентрации макромолекул, ключевая роль которого была установлена в регуляции объем-чувствительного мембранного транспорта [Colclasure G С et al, 1992, Dunham Р В et al, 1995] и элементов цитоскелета [Cuneo Р et al, 1992, Madden Т L , Herzfeld J , 1993, Pedersen S F , 2001] Однако природа этого процесса остается невыясненной

В настоящее время усиливается интерес исследователей и к другому элементу цитоскелета - микротубулам Первоначально предполагалось, что деполимеризация микротубул облегчает сократительные ответы посредством устранения внутреннего механического противодействия сокращению, генерируемому актин-миозиновыми взаимодействиями [Paul R J et al, 2000] Однако позднее было показано, что микротубулы не оказывают существенного влияния на механические характеристики сосудистых гладкомышечных клеток, но участвуют в модуляции большого числа сигнальных путей Оказалось, что при активации клеток происходит изменение активности протеиновых киназ, транс-

го

'и-

локация которых опосредуется микротубулами [Chitaley К, Webb RC , 2001, Zhang D et al, 2001 ] В свою очередь, изменение активности протеинкиназы-С, MAP- и Rho-киназ является одним из ключевые механизмов кальциевой сенси-тизации гладкомышечных клеток [Somlyo А Р and Somlyo AV , 1994, Sauzeau V et al, 2000, Platts S H et al, 2002] Вопрос о роли этих процессов в регуляции сокращений гладких мышц, а также в сопряжении возбуждения - сокращения в ГМК не нашел удовлетворительного разрешения

Подавляющее большинство исследовании роли цитоскелета в оперировании внутриклеточных путей передачи сигналов выполнено на немышечных клетках В относительно небольшом количестве работ, посвященных гладким мышцам, объектами изучения являлись культуральные клетки Вместе с тем известно, что культуральные ГМК по ряду физиологических свойств отличаются от нативных

Таким образом, изучение цитоскелет-зависимых механизмов оперирования внутриклеточных сигнальных систем в гладких мышцах, их взаимосвязей с объемом клеток, ионными транспортерами и ионными каналами является актуальной проблемой современной фундаментальной физиологии Важность исследования роли цитоскелета в регуляции сократительной активности сосудистых ГМК обусловлена также и гем, что методы управления динамическими перестройками микротубул и микрофиламентов могут оказаться перспективными для разработки новых технологий местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов

Цель исследования изучить роль микротубул и микрофиламентов цитоскелета в механизмах оперирования кальциевой и цАМФ-опосредованной внутрикчеточных сигнальных систем, а также в объем-зависимой регуляции функции гладкомышечных клеток

Задачи исследования

1 Исследовать влияние модуляторов микрофиламентов и микротубул цитоскелета на сокращения сегментов аорты крысы, вызванные гиперкалиевым раствором

2 Изучить участие цитоскелета в регуляции электрогенеза и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника

3 Исследовать роль цитоскелета в сократительных ответах сосудистых гладких мышц на изменения объема клеток

4 Установить влияние дезинтеграции цитоскелета на эффекты возбуждения а,-адренэргических рецепторов в сосудистых сегментах аорты и гладкомышечных клетках мочеточника

5 Исследовать роль цитоскелета в цАМФ-зависимой регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток

Научная новизна

Впервые показано, что микрофиламенты участвуют в развитии сокращений сосудистых гладких мышц при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором, а также в генерации потенциалов действия и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки при действии деполяризующего тока

Впервые исследована роль цитоскелета в сократительных реакциях сосудистых гладких мышц, индуцированных изменениями объема клеток Установлено, что сокращения, вызванные гиперосмотическим сжатием клеток, зависят от состояния микротубул и микрофиламентов В отличие от этого сокращения, возникающие при изоосмотической стрикции, подавляются только при разрушении микрофиламентов Сокращения, вызванные гипоосмотическим набуханием, не зависят от состояния цитоскелета

Получены новые данные, касающиеся участия микрофиламентов и микротубул цитоскелета в сократительных реакциях гладких мышц, индуцированных фенилэфрином В сосудистых гладкомышечных клетках они зависят от состояния микрофиламентов, тогда как в гладких мышцах мочеточника - от состояния микротубул

Впервые установлено, что вклад отдельных элементов цитоскелета в регуляцию циклическим АМФ электрогенеза и сокращений неодинаков в различных типах гладких мышц Реализация угнетающего действия циклического АМФ на сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы осуществляется с участием микрофиламентов В гладкомышечных клетках мочеточника эффекты цАМФ опосредованы преимущественно микротубулами Теоретическая и практическая значимость работы Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных знаний о роли цитоскелета в механизмах оперирования кальциевой, цАМФ-опосредованной и зависимой от объема систем регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток Полученные данные дополняют представления о механизмах сосудистых реакций при гипертонической болезни и патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями водно-солевого обмена или метаболических процессов в организме, а также сведения о побочных действиях широко применяемых в клинической практике цито-статиков Результаты исследования могут оказаться перспективными для разработки молекулярных технологий фармакологической коррекции дисфункций гладких мышц висцеральных органов и сосудов, а также местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов

Основные положения работы используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедрах физиологии человека и животных Томского и Кемеровского государственных университетов

Методические приемы и полученные данные используются в научных исследованиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета и в отделе сердечно-сосудистой хирургии ГУ КИИ кардиологии ТНЦСОРАМН

Областями применения полученных данных являются физиология, биофизика, фармакология

Положения, выносимые на защиту

1 Микрофиламенты цитоскелета в большей степени, чем микротубулы, вовлекаются в регуляцию сокращений, вызванных гиперкалиевой деполяризацией гладких мышц аорты крысы, а также в генерацию потенциалов действия и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки

2 Сокращения сосудистых сегментов аэрты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором, зависят от состояния микрофиламентов и микроту-бул В генерации сокращений при изоосмотической стрикции клеток основную роль играют микрофиламенты

3 Микрофиламенты вовлечены в механизмы действия фенилэфрина на механическое напряжение сосудистых сегментов аорты крысы, а микротубулы

— в стимуляцию фенилэфрином электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки

4 Опосредованное циклическим АМФ угнетение сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы зависит от состояния микрофиламентов цитоскелета, а потенциалов действия и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника - от состояния микротубул

Апробация работы

Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных конгрессах • VI Международный конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», 19-20 мая 2005г (Гомск) • XV European Meeting on Hypertension, 17-21 June 2005 (Milan, Italy) • Пятый Сибирский Физиологический Съезд, 29 июня-1 июля 2005 (Томск) • 10-ая Пущинская школа

- конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 17-21 апреля 2006 (Москва) в VII международный конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», май 2006 (Томск) • XVI European Meeting on Hypertension, 12-15 June 2006 (Madrid, Spain) • 16-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 14-17 ноября 2006 (Санкт-Петербург) • I Международная (X Всероссийская) Пироговская студенческая научная медицинская конференция, 16 марта 2006 (Москва) в Всероссийская научная конференция «Механизмы индивидуальной адаптации», посвященная памяти и 100-летию со дня рождения профессора В А Пегеля, 18-20 декабря 2006 (Томск)

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из которых 6 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

Структура диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы собственных результатов и их обсуждения и заключения Библиография включает 212 ссылок, в том числе 26 - на работы отечественных авторов и 186 - зарубежных Работа иллюстрирована 25 рисунками и включает 2 таблицы

МЛ ТЕГИ АЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования• 1) деэндотелизированные гладкомышечные сег-менхы аорты 200 беспородных белых крыс весом 200-250гр , 2) изолированные гладкомышечные препараты мочеточника 56 морских свинок весом 180-230гр

Подготовка гладкомышечных препаратов: сегменты из грудного отдела аорты шириной 2-3 мм нарезались после удаления адвентиции и эндотелия механическим путем [Cakici J et al, 1993]

Сегменты из мочеточника длиной 10-12 мм вырезались после удаления с их поверхности соединительнотканных оболочек

Все манипуляции выполнялись в препаровальных ванночках с раствором Кребса при комнатной температуре

Исследование сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы. Для исследования сократительной активности сосудистые гладкомышечные сегменты после предварительной нагрузки 500 мг фиксировались в тсрмостатирусмой псрфузионной камере объемом 1 мл в условиях постоянной смены раствора Кребса (1 мл/мин)

Изменение механического напряжения ГМК передавалось на шток меха-ноэлектрического преобразователя (6МХ2Б, Москва) и регистрировалось после усиления с помощью XY рекодера (Carl Zeiss, Jena, Germany)

Амплитуду контрольных (100%) сократительных ответов сегментов на гиперкалиевый раствор (замена 30 мМ NaCl на KCl) регистрировали после 4050 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса В ряде экспериментов амплитуду сократительных ответов рассчитывали в процентах от амплитуды фенилэфрин-индуцированного сокращения

Исследование электрической и сократительной активности ГМК мочеточника. Для одновременной регистрации электрической и сократительной активности ГМК мочеточника использовалась методика двойного сахарозного моста [Артеменко ДП с соавт , 1964] Раствор сахарозы в концентрации 0 3 M готовился на основе деионизированной воды с удельным сопротивлением не ниже 15 МОм см Отведение электрических потенциалов проводили с помощью неполяризующихся электродов Механическое напряжение (МН) гладкомышечных препаратов регистрировали механотроном 6МХ2Б в условиях, близких к изометрическим Отводимые сигналы после усиления подавались на АЦП (разрядность - 12 бит, отношение сигнал/шум — 70 дб, частота дискретизации - 2 кГц) и обрабатывались с помощью IBM PC

В качестве контрольных (100%) значений служили параметры потенциала действия (амплитуда и длительность плато) и величина сокращения ГМК в нормальном растворе Кребса в ответ на электрический стимул

Исследование соотношения F- и G-актина в ГМК методом флуоресцентной микроскопии. После стимуляции гладкомышечные сегменты аорты помещали в среду для фиксирования (tissue-embedding medium Neg 52) и замораживали, используя сухой лед (-78±0 1С°)

Полученные с использованием криостата (Cryostats, Richard-Allen Scientific) поперечные срезы аорты толщиной 8 мкм помещали на стекло и высушивали на воздухе, затем фиксировали 4% формальдегидом в фосфатном буфере (0 05М Tris Base, 0 9% NaCl, pH 7 6) при комнатной температуре в течение 30 мин После 5 минутного трехкратного отмывания в фосфатном буфере срезы обрабатывали 0 2% раствором Triton XI00 в течение 5 минут с последующим повторным отмыванием Неспецифический сигнал блокировали 2% раствором

альбумина бычьей сыворотки (АБС) в фосфатном буфере в течение 30 мин при 37С° и полном насыщении водяными парами

Для окрашивания F-актина, срезы инкубировали с меченым фаллоидином в разведении 1 100 в 2% растворе АБС в течение 1 часа при 37±0 1С" и полном насыщении водяными парами

После последующего отмывания (фосфатный буфер, 3x5 мин), срезы инкубировали с флуоресцентным красителем D12371, специфичным к G-актину, в разведении 1 100 в 2% растворе АБС в течение 1 часа при 37±0 1С° при полном насыщении водяными парами

После инкубации и отмывания, срезы высушивали на воздухе при комнатной температуре и накрывали покровными стеклами, предварительно нанося реагент Fluoromount-G Сигнал визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM/RB и обрабатывали с помощью программы Multi Gauge V3 0

Используемые растворы Растворы готовились на основе дистиллированной воды добавлением соответствующих реактивов (ХЧ, «Реахим», РФ) Физиологический раствор Кребса содержал (мМ) 120 4 NaCl, 5 9 КС!, 2 5 СаСЬ, 1 2 MgCb, 5.5 глюкозы, 15 C4HJ1O3N [tns(oxymethyl)-ammometan] (рН 7 4, 316 4 мосМ) Гиперосмолярный раствор (466 4 мосМ) приготавливали добавлением к раствору Кребса 150 мМ сахарозы, а гипоосмолярный (56 4 мосМ) - снижением концентрации NaCl до 40 4 мМ вместо исходных 120 4 мМ В растворах поддерживались значения рН в пределах 7.35-7 40 и температуры 37±0 1С'

Используемые реактивы Тестир) гошне растворы готовились путем добавления в раствор Кребса соответствующих реактивов колхицина, цитохала-зина В, винбластина, фенилэфрина (все Sigma), форсколина, тетраэтиламмония хлорида (все Serva)

Статистическая обработка Результаты представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратичное отклонение (о) и обработаны с помощью программного пакета Statistika с использованием непарамстрического критерия Манна-Уитни или t-тсста для зависимых образцов (t-tcst for dependent samples) Достоверными считали различия при значении р<0 05

РЕЗУЛЬТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 31 Изучение роли цитоскелета в сократительных реакциях гладкомы-шечных сегментов аорты крысы Для изучения участия цитоскелета в сокрагительных ответах, развивающихся при действии гиперкалиевого раствора, а также при моделировании набухания и стрикции сосудистых ГМК было исследовано влияние неспецифического дезинтегратора микротубул и микрофиламентов цитоскелета колхицина [Nakamura М et al, 2000]

3 11 Влияние колхицина на гиперкалиевьи контрактуры гладкомышеч-ных препаратов аорты крысы Добавление 10 мкМ колхицина в раствор Кребса не изменяло исходного механического напряжения (МН) гладкомышечных

сегментов аорты крысы После 90-минутной обработки колхицином амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных эквимолярным замещением в растворе Кребса 30 мМ 1\'аС1 на КС1, снизилась до 62 9±12 6% (п=9, р<0 05), от контрольной гиперкалиевой контрактуры (рис 1) Подобное действие колхицина свидетельствует о вовлечении элементов цитоскелета в генерацию сокраще-

17 5 ^ 30 ММ KCl 1

X 15 0 - г J

* 12 5 / 1

и S. юо / 30 UM KCl J

g 75 - Г\

| 50 " 1 \

2 2 5 ~ а J \ j V

о - 1_Колхицин (10 мкМ]_I .-V

0 05 20 25 Время (часы)

Рис.1 Влияние колхицина на гиперкалиевое сокращение гладкомышечного сег-

мента аорты крысы Но оси ординат - механическое напряжение (иН), по оси абсцисс— время (час)

Увеличение концентрации колхицина до 100 мкМ по привело к дополнительному снижению амплитуды гиперкалиевой контрактуры Поэтому в дальнейшем использовали колхицин в концентрации 10 мкМ

3 12 Влияние колхицина на сокращения гладкомьпиечных сегментов аорты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором Для определения роли цитоскелета в сокращениях, вызванных гиперосмотическим сжатием клеток, было исследовано влияние колхицина на сокращения, вызванные модифицированным раствором Кребса, содержащим 150 мМ сахарозы в качестве непроникающего осмолита (466 4 мосМ) Повышение осмолярности раствора приводило к развитию воспроизводимого сокращения, амплитуда которого поддерживалась в течение 45 минут от начала аппликации Амплитудные и скоростные параметры сокращения оставались стабильными при трехкратном повторении аппликации гиперосмотического раствора с 30 минутным отмыванием препарата нормальным раствором Кребса между пробами Амплитуда сокращения, вызванного гиперосмотическим раствором, составляла 51 8±9 0% (п=81, р<0 05) по сравнению с величиной контрольного гиперкалиевого сокращения (рис 2)

После 90-минутной предобработки гладкомышечных сегментов аорты крысы колхицином (10 мкМ) амплитуда сокращения в гиперосмотическом растворе снизилась II составила 35 9±9 6% (п=8, р<0 05) от контрольного гиперкалиевого сокращения (рис 2) Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении элементов цитоскелета в развитие сокращений, индуцированных гиперосмотическим раствором

3 13 Влияние колхицина на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, вызванные гипоосмотическим раствором Ключевую роль в обеспечении сокращений сосудистых гладких мышц при гипоосмотическом набухании играют неравновесное распределение ионов С1 и деполяризующие хлорные токи [Аифиногенова Я Д , 2005]

Перфузия препарата гипоосмотическим раствором приводила к быстрому транзиторному сокращению сегментов аорты крысы, амплитуда которого со-

ставила 75 7±8 9% (п=18) по сравнению с величиной гинеркалиевого сокращения, а длительность - 40±4 8 мин

После инкубации сегментов в растворе Кребса, содержащем 10 мкМ колхицина, амплитуда и длительность сокращения, вызванного гипоосмотическим раствором, достоверно не изменялись

Эти данные свидетельствуют о том, что дезинтеграция колхицином цитоскелета не влияет на тран-зиторное сокращение препаратов аорты при гипоосмотическом набухании клеток, а следовательно, можно предполагать, что хлорные токи ГМК аорты крысы не зависят от состояния цитоскелета

3 14 Влияние колхицина на сократительные реакции гладко-мышечных сегментов аорты в модели изоосмотической стрищии клеток Согласно литературным данным, сокращение, вызванное изоосмотической стрикцией, в отличие от сокращения в гиперосмотическом растворе, сопровождается регуляторным увеличением объема клеток [Mongin А , Orlov S , 2001], что представляет значительный интерес для сравнения результатов, полученных в этих двух модечях

Для получения изоосмотической стрикции сегменты аорты крысы экспонировали в гипоосмо-тической среде (40 4 мМ NaCl) в течение 60 минут, затем возвращали их в нормоосмотический раствор Восстановление 'осмолярно-сти раствора во всех случаях приводило к развитию транзиторного сокращения (рис 3), амплитуда которого составляла 21 6±6 1% по сравнению с величиной гиперка-лиевои контрактуры, а длительность - 38 8±1 6 мин (п=10)

175 150 а 12 5

I 75

¥ Е0

г п

| 25 0J

10 15

Ноемя /часы)

Рис 2 Влияние колхицина на амтитуду сокращения гюдкоиышечного сегмента аорты крысы, вызванного гиперосмотическим раствором

По оси ординат — механическое напряжение (мН), по оси абсцисс — время (час)

175 150

X 2

ф 125 ф

|юо S 75

i 50

Сокращение в присутствий колхицина (ЮмкМ}

0 5 10 15

Время (часы) Контрольное сокращение

Рис 3 Влияние колхицина на амплитуду сокращения, вызванного изоосмотической стрикцией гладкомышечных клеток аорты крысы

По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс - время (час)

После 90-минутной предобработки колхицином (10 мкМ) амплитуда сокращения при изоосмотичсской стрикции достоверно уменьшилась и составила 15 8±5 2% (п=6, р<0 05) по сравнению с величиной контрольной гиперкалиевой контрактуры Длительность сократительного ответа не изменилась

Следовательно, цитоскелет принимает участие в обеспечении сокращений гладкой мышцы в условиях изоосмотической стрикции

Результаты, полученные с использованием дезинтегратора актинового и тубулинового элементов цитоскелета колхицина, свидетельствуют о вовлечении элементов цитоскелета в сократительные ответы при гиперкалиевой деполяризации, гипер- и изоосмотической стрикции

Для дифференцировки участия отдельных элементов цитоскелета в сократительных реакциях гладкомышечных клеток аорты использовались специфические модуляторы микрофиламентов и микротубул цитохалазин В и винбластин, соответственно

3.2 Исследование роли микротубул в сократительных реакциях гладко-мышечных препаратов аорты крысы Для изучения роли микротубул в сократительных реакциях гладкомышечных сегментов аорты крысы использовали алкалоид винбластин, который деполимеризуег микротубулы

3 2 1 Влияние винбластина на сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперкалиевым раствором Добавление 10 мкМ винбластина в раствор Кребса не изменяло исходного МН гладкомышечных сегментов аорты крысы После предобработки гладкомышечных препаратов в течение 60 минут

винбластином (10 мкМ) амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных гиперкалиевым раствором Кребса достоверно не изменилась и составила 103 9±6 5% от контрольного гиперкалиевого сокращения (п—6, р>0 05)

Эти данные указывают на то, что микротубулы не участвуют в генерации сокращений при гиперкалиевой деполяризации мембраны ГМК аорты крысы

3 2 2 Влияние винбпастина на сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперосмотическим раствором и изоосмотической стрищией Предобработка гладкомышечных препаратов аорты крысы винбластином (10 мкМ, 60 мин) приводила к снижению амплитуды сокращения, вызванного гиперосмо-

Рис. 4 Вчияние винбчаепшна (10 мкМ) на амтитуду сокращения гладкомышечного сегмента аорты крысы, вызванного гиперосмотическим раствором По оси ординат — механическое напрялсе-ние (мН), по оси абсцисс - время (час)_

тическим раствором до 35 13±3 4% (п=6, р<0 05) от контрольного гиперкалиевого сокращения (рис 4)

Амплитуда сокращения, индуцированного изоосмотической стрикцией, после предобработки винбластииом не изменилась

Таким образом, по данным экспериментов с винбластииом, чикротубулы не играют существенной роли в обеспечении сократительных ответов, вызванных деполяризацией мембраны ГМК, а также изоосмотической стрикцией Вместе с тем, ингибирование полимеризации микротубул достоверно уменьшает величину сокращений сегментов аорты в гиперосмотическом растворе

3 3. Исследование участия микрофиламентое в сократительных реакциях гладкомышечных клеток аорты крысы при гиперкалиевой деполяризации мембраны и изменении объема клеток Известно, что фибриллярный актин является важным структурным элементом цитоскелета Он образуется из мономеров G-актина (глобулярный актин) В клетке G-актин находится в равновесии с F-актином, их соотношение может говорить о целостности цитоскелета

3 3 1 Изучение соотношения F- и G-актина в сегментах аорты при действии гиперкалиевого, гипо- и гиперосмотического растворов Для определения соотношения F- и G- актина использовали метод фтуоресцентной микроскопии При деполяризации гиперкалиевым раствором, при сокращениях, вызванных гипер- и гипоосмотическими растворами, смещается отношение F/G актина в сторону F-актина При действии гиперосмотического раствора это отношение более чем в 2 раза превышало исходные значения (табл 1)

Таблица 1

Соотношение F- и G-актнна в гладкомышечных клетках аорты при

действии гнперкалисвого, гипо- н гиперосмотического растворов

Контроль (F/G) Гиперкалиевое сокращение (30 мМ КС1) Сокращение, вызванное гипоосмотическим раствором (40 4 мМ NaC'l) Сокращение, вызванное гиперосмотическим раствором (150 мМ сахарозы)

1 05±0 44 1 56±0 25 * 1 78±0 58 * 2 40±0 31 Я

*—статистическая значимость разчичий по сравнению с контролем (р<0 05) статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р<0 01)

Данные флуоресцентной микроскопии свидетельствуют о перестройках актиновых филаментов цитоскелета в процессе сокращений при действии при гиперкалиевого, гипер- и гипоосмотического растворов

3 3 2 Влияние цитохалазина В на сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперкалиевым раствором Для определения участия актиновых микрофиламентов цитоскелета в сократительных ответах сосудистых гладкомышечных сегментов аорты использовали цитохалазин В

Добавление 10 мкМ цитохалазина В в раствор Кребса приводило к снижению исходного МН сегментов аорты крысы, которое к 40-ой минуте составило 9 7%±3 5% (п=6) от контрольной гиперкалиевой контрактуры (рис 5)

После предобработки гладкомышечных сегментов аорты цитохалазином В

(10 мкМ, 40 мин) амплитуда сокращения, вызванного гиперкалиевым раствором, снизилась до 40 1±4 9% (п=6, р<0 05) от контрольных значений (рис 5)

Следовательно, микрофиламен-ты цитоскелета вовлечены в регуляцию сокращений сегментов аорты, вызванных деполяризацией мембраны гладкомышечных клеток

3 3 3 Влияние цитохалазина В на сокращения, вызванные гиперосмотическим раствором и изоосмо-тической стрикцией гладкомышечных клеток аорты крысы После инкубации сегментов в течение 40 минут в растворе, содержащем 10 мкМ цитохалазииа В амплитуда сокращений ГМК аорты, вызванных гнперос-мотичееккм раствором, уменьшилась до 17 2=3 8% (п=6, р<0 05) от контрольных значений (рис 6 А) Величина сокращений, индуцированных изоосмотической стрикцией, после предобработки препарата цитохала-зином В снизилась до 6 5±1 5% (п=6, р<0 05) (рис б Б) Таким образом, акткновые филаменты цитоскелета принимают участие в развитии сокращений сосудистых ГМК, вызванных гипер- и изоос-мотической стрикцией__

Рис. 5 Влияние цитохалазина В на амплитуду сокращения гпадкомышечного сегмента аорты крысы, индуцированного гиперкалиевым раствором По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс - время (час)_

175 л ^5 0 • 30 мМ КС!» Гп

12 5 7\

10 0

0 j

17 5 150 12 5 10 0

I Контрольное сорвщение

| 40 4 мМ Sag [ 1204 мМ NaCI I Цитохалазич В (10 мкМ)

05 10 15 20 25 30 Время (часы)

Рис 6 Влияние цитохалазина В на амплитуду сокращений гладкомышечных сегментов аорты крысы, индуцированных

А ~ гиперосмотическим раствором, В - изоосмотической стрикцией

По оси ординат — механическое напряжение (мН), по оси абсцисс — время (час)_

Полученные данные свидетельствуют о том, что микрофиламенты цито-скелета вовлечены в механизмы, обеспечивающие поддержание исходного МН и генерацию сокращений сосудистых гладких мышц, индуцированных деполяризацией мембраны ГМК гиперкалиевым раствором

Угнетение цитохалазином В сокращений гладкой мышцы аорты в ответ на деполяризацию мембраны может быть обусловлено нарушением оперирования потенциал-зависимых Са2+-каналов, открывание которых в этом случае является основным механизмом увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле и активации сокращения По мнению N 5рсге1аа.ч (2000), такой эффект цитохалазина В связан с освобождением нередепторной формы тирозииовой протеинкиназы (с-вгс) от цитоплазматической поверхности плазмалеммы в цитозоль Как следствие, будет нарушаться Туг-РК- зависимое фосфорилирование потенциал-зависимых Са2^-каналов и их способность активироваться при деполяризацион-ных смещениях мембранного потенциала в гиперкалиевом растворе

Снижение цитохалазином В амплитуды сокращений, вызванных гипер- и изоосмотическим растворами указывает на участие микрофиламентов цитоске-лета в объем-зависимой регуляции механического напряжения сосудистых ГМК 3.4. Изучение роли цитоскелета в сократительных реакциях гладкомы-шечных сегментов аорты крысы при действии фенилэфрина Сократительные ответы сосудистых ГМК инициируются многими физиологически активными веществами, в частности, агонистами аг адренорецепторов Для определения участия цитоскелета в генерации сокращений сегментов аорты при стимуляции агадренорецеиторов изучалось влияние колхицина, винбластина и цитохалазина В на эффекты фенилэфрина

Фенилэфрин (0 01, 0 1, 1 и 10 мкМ) в растворе Кребса вызывал дозозави-симое увеличение МН гладкомышечных сегментов аорты крысы (табл 2)

После предобработки гладких мышц колхицином амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных добавлением фенилэфрина в тех же концентрациях, статистически значимо снижалась (табл 2)

Таблица 2

Влияние колхицина на фенилэфрин-индуцированные сокращения

гладкомышечных сегментов аоргы крысы

Амплитуда сокращения, вызванного ( ¡енилэфрином

0 01 мкМ 0 1 мкМ 1 мкМ 10 мкМ

Контроль, % 10 8±7 4 74 1±9 2 103 1±4 9 107 8±6 9

+Колхицин (10мкМ),% 3 7±1 5 * 31 1±2 8 * 81 8 ±2 9 * 87 7±10 3 *

* - статистически значимые различия по сравнению с фенилэфрин-индуци рованным сокращением в отсутствие колхицина (р<0 05)

На фоне цитохалазина В (10 мкМ, 40 мин) амплитуда сокращения, вызванного 1 мкМ фенилэфрина уменьшилась до 20 6±3 7% (п=6, р<0 05) от контрольною фенилэфрин-индуцлрованного сокращения

Предобработка гладкомышечных препаратов аорты крысы винбластином (10 мкМ, 60 мин) приводила к увеличению амплитуды сокращения, вызванного

1 мкМ фенилэфрина, до 121 0±12 1% (п=6, р<0 05) от контрольного фенилэф-рин-индуцированного сокращения

Методом флуоресцентной микроскопии было показано, что при действии фенилэфрина в той же концентрации соотношение Р и О-актина сместилось в сторону Р-актина (2 27±0 31 по сравнению с 1 05±0 44 в контроле, п=7, р<0 01)

Как следует из полученных данных, актиновыс элементы цитоскелета и микротубулы вовлекаются в развитие фенилэфрин-индуцированного сокращения Это дает основание предполагать участие цитоскелета в оперировании сигнальных путей, включаемых стимуляцией си-адренергических рецепторов Угнетение цитохалазином В сокращений гладкомышечных сегментов аорты, также как и в случае деполяризации мембраны ГМК в гиперкалиевом растворе, может быть связано с нарушением оперирования потенциал-зависимых Са-каналов Ь-типа [Ыакатига М е1 а1, 2000], открывание которых является одним из ключевых этапов генерации фазного компонента сокращения в ответ на стимуляцию агадренорецепторов Деполимеризация микротубул в присутствии винбластина, напротив, вела к повышению сократительной активности исследуемых ГМК С!та1еу К (2001) показано участие микротубул в регуляции Шю-киназы, которая угнетает фосфатазу легких цепей миозина и, таким образом, увеличивает степень фосфорилирования легких цепей миозина Устранение негативного контроля активности Шго-кнназы со стороны микротубул при их деполимеризации может быть причиной усиления сокращений в ответ на фени-лэфрин в присутствии винбластина

3.5. Исследование роли цитоскелета в цАМФ-опосредованной регуляции сокращений сосудистых гладкомышечных клеток Известно, что цАМФ играет ключевую роль в расслаблении гладких мышц в ответ на стимуляцию р-адренорецепторов

Для увеличения внутриклеточной концентрации цАМФ использовали активатор аденилатциклазы дитерпен форсколин, который в концентрации 1 мкМ вызывал полумаксимальное снижение механического напряжения гладкомы-шечного препарата, предсокращенного гиперкалиевым раствором, до 49 7=е7 8% (п=7, р<0 05) от контрольного гиперкалиевого сокращения (рис 7 А)

Расслабляющее влияние форехолина на предсокращенные гладкомышеч-ные сегменты достоверно не изменялось как после предобработки 10 мкМ колхицина (63 9±9 5%, п=5) (рис 7 Б), так и 10 мкМ винбластина (70 1±13 5%, п=5) (рис 8 А) Наоборот, на фоне 10 мкМ цигохалазина В наблюдалось достоверное усиление релаксирующего действия форсколина Сосудистый сегмент под влиянием форсколина расслаблялся до 15 8±1 34% (п=5, р<0 05) от величины гиперкалиевого сокращения в присутствии цитохалазина (рис 8 Б)

Из полученных результатов следует, что эффективность оперирования цАМФ-опосредованной сигнальной системы в ГМК аорты крысы большей мере зависит от состояния актинового, но не тубулинового элементов цитоскелета Усиление расслабтяющего действия форсколина после обработки гладкой мышцы цитохалазином В может быть свидетельством взаимодействия микро-филаментов и цАМФ-зависимой протеинкиназы в регуляции оперирования потенциал-зависимых Са2+-каналов Ь-типа

175 150

X 3

£125

в. 10 О •

75 •

|форскопин (1 м«М)|

I ^ [форскопнн (1 МК>Л)[

I КОЛХИЦИН (10 мкМ) |

бремя(чагы)

Рис 7 Влияние колхицина на фор-сколин-индуци-рованное расслабление сегментов аорты крысы, предсокращенн ых гиперкалиевым раствором По оси ординат -механическое напряжение (иН), по оси абсцисс — время (час)

Г7п

Рис. 8 Влияние винбластина (А) и цитохапазича В (Б) на форсколин- индуцированное расслабление сегментов аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым растворо м По оси ординат -механическое напряжение (мН), по оси абсцисс - время (час)

3.6. Исследование роли цитоскелета в сопряжении возбуждения - сокращения гладкомышечных клеток мочеточника Одновременная регистрация электрической и сократительной активности ГМК препаратов аорты в условиях двойного сахарозного моста затруднена из-за большого содержания в ее стенке соединительной ткани Поэтому для выяснения участия цитоскелета в сопряжении возбу» дения-сокращения в IМК исследования проводились на изолированных препаратах мочеточника морской свинки, который является классическим и наиболее изученным объектом

3 61 Влияние модуляторов состояния цитоскелета на электрическую и сократительную активность гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки После 40 минут отмывания препаратов нормальным раствором Кребса в ответ на сверхпороговые деполяризующие электрические стимулы регистрировались типичные для ГМК мочеточника морской свинки потенциалы действия (ПД) и сокращения (рис 9)

После предобработки гладкомышечного препарата колхицином (10 мкМ, 90 минут), происходило уменьшение амплитуды пикового компонента ПД до 86 5±3 6% без изменения длительности плато и снижение силы сокращения до 84 3±2 6% (п=7, р<0 05) относительно контрольных значений (рис 9 А)

В отличие от этого, винбластин (10 мкМ, 60 мин) не влиял на амплитуду пикового компонента ПД, но вызывал увеличение длительности плато ПД и амплитуды сокращения до 136 0+16 3% и 127 0+13 3% (п=7, р<0 05), соответственно, в сравнении с контрольными значениями (рис 9 Б)

Предобработка гладких мышц мочеточника цитохалазином В (10 мкМ, 40 мин) снижала амплитуду пикового компонента ПД и сокращения ГМК до 34 2±7 1% и 21 7+1 4% (п=5, р<0 05), соответственно, относитечьно контрольных значений (рис 9 В) Длительность плато ПД при действии цитохалазина В не изменялась

Раствор Кребса

♦ Колхицин {10 мкМ)

=10=

► Винбластин (10 мкМ)

—'I/— J

Цктохалазин В (10 мкМ)

I 2мН

I 2 иН 15 нв

Рис 9 Влияние модуляторов цитоскелета па электрическую (б) и сократите чьпую (а) активность гчадко-мышечных клеток мочеточника морской свинки

А - действие колхицина, Б - винбластииа, В— цитохалазина В Справа - калибровочный сигнач и отметка ере мени

Эти данные свидетельствуют о том, что разрушение микрофиламентов цитохалазином В и микротубул винбластином оказывало разнонаправленное влияние на электрические и сократительные свойства ГМК мочеточника Угнетение ПД и сокращений цитохалазином В может быть обусловлено снижением потенциал-зависимой кальциевой проводимости мембраны ГМК, которая контролируется микрофиламентами [Шкатига М с( а!, 2000] Активация сокращений ГМК мочеточника после обработки препаратов винбластином, по-видимому, связана с устранением угнетающего влияния микротубул на Шю-киназу, которая тормозит дефосфорилирование легких цепей миозина соответствующей фосфатазой Такой эффект отсутствовал в ГМК аорты крысы, что может служить указанием на особенности участия микротубул в сопряжении возбуждения-сокращения различных ГМК

3 6 2 Вчшпие модучящт состояния цитоскелета на эффекты фенилэф-рина в гладкомышечных клетках мочеточника морской свинки Добавление в раствор Кребса 10 мкМ фенилэфрина на 3-5 мин приводило к увеличению длительности плато ПД и амплитуды сокращения ГМК мочеточника до 151.2+9 6%

и 188.2±28 4% (п=16, р<0 01), соответственно, относительно исходных значений в растворе Кребса (рис 10 А)

Предобработка гладкомышечных препаратов колхицином (10 мкМ) приводила к достоверному уменьшению активирующего влияния фенилэфрина Длительность плато ПД и амплитуда сокращения ГМК составили лишь 127 9±8 5% и 136 2±6 7%, соответственно, относительно контрольных значений на фоне колхицина (рис 10 Б) (п=6, р<0 05)

Добавление винбластина также снижало активирующее действие фенилэфрина на плато ПД и сокращения ГМК Значения последних составили 114 3±4 5% и 128 7±9 7% (п=6, р<0 05), соответственно (рис 10 В)

Длительность плато ПД и амплитуда сокращения в ответ на добавление фенилэфрина (10 мкМ) после предобработки цитохалазином В (10 мкМ) увеличивались до 142 2±5 2% и 157±2 1% (п=б, р<0 05), соответственно (рис 10 Г) Таким образом, после аппликации цитохалазина В активирующее влияние фенилэфрина на ПД и сокращения ГМК мочеточника достоверно не отличалось от его эффектов в нормальном растворе Кребса_

Раствор Кребса Феимлэфрин

Раствор Кребса ♦ Колхицин (10 мкМ} Фемилэфрин

_115 1 с

Раствор Кребса + Винбластин (10 мкМ) »Фенилэфрин

Рис. 10. Влияние колхщи-на (Б), винбластина (В) и цитохалазина В (Г) на изменения электрической (б) и сократительной (а) активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки, вызванные фенилэфрином Справа - калибровочный сигнал и отметка времени

Следовательно, можно предположить, что микротубулы в большей мере, чем микрофиламенты цитоскелета участвуют в реализации активирующего влияния фенилэфрина на электрогенез и сокращения ГМК мочеточника

3 6 3 Роль цитоскелета в цАМФ-опосредованной регуляции электрической и сократительной активности ГМК мочеточника морской свинки Сигнальная система, связанная с метаболизмом циклических нуклеотидов, играет важную роль в обеспечении расслабления гладких мышц при действии гормонов и медиаторов Для активации аденилатциклазы использовался форсколин

Форсколин в концентрации 1 мкМ вызывал снижение амплитуды пикового компонента ПД до 85.6±3 0%, длительности плато до 35 7±4 5% и силы со-

кратительного ответа до 20 1±5 0% (рис 11 А) в сравнении с контрольными значениями в нормальном растворе Кребса (п=7, р<0 05)

Угнетающее действие форсколина на Г1Д в большей степени связано с активацией калиевой проводимости мембраны гладкомышечных клеток, что подтверждают эксперименты с блокатором калиевых каналов тетраэтиламмонием На его фоне амплитуда, длительность плато ПД и сила сокращений после добавления форсколина составляли 105 7±15 1%, 135 4±12 0%, 155 1±14 4% (п=6, р<0 05), соответственно, относительно контроля в растворе Кребса

После предобработки препаратов колхицином (10 мкМ) форсколин вызывал снижение амплитуды пикового компонента ПД, длительности плато и силы сократительного ответа до 83,9±5,1, 38 3±7 1% и 23 0±6% (п=6, р<0 05), соответственно, в сравнении с контрольными значениями в нормальном растворе Кребса (рис 11 Б), что достоверно не отличалось от действия форсколина в отсутствие колхицина

Предобработка цитохалазином В не влияла на угнетающий эффект форсколина в ГМК мочеточника Амплитуда, длительность плато ПД и величина сократительных ответов ГМК при действии форсколина снижались до 87 9±3 0%, 35 8±6 2%, 21 4±7 1% (п=7, р<0 05), соответственно (рис 11 В), относительно значений в нормальном растворе Кребса Эти величины близки к контрольным без предобработки цитохалазином.

На фоне винбластина длительность плато ПД и амплитуда сокращений под влиянием форсколина снизились лишь до 85 8±9 1% и 58±6% (п=6, р<0 05), соответственно относительно контрольных значений в отсутствие винбластина

(рис 11 Г)_

д Раствор Кребса +Форскошн (1 мкМ)

Рис 11. Влияние форсколина на электрическую (б) и сократительную (а) активность ГМК мочеточника морской свинки в присутствии модуляторов г/итоскелета А - контрочъ, Б - предобработка колхицином, В- предобработка цитохалазином В, Г— предобработка винбластином Справа - калибровочный сигнал и отметка времени

1 с

2мН 15 кВ

Б Раствор Кребса +Колхицин(10 мкМ) +Форсколин (1 мкМ)

|2мН

В Раствор Кребса +Цщ-охалазин В (10 икМ) +Форсколин (1 мкМ) Г Раствор Кребса +Винбластин(10 мкМ) +Фореколин (1 мкМ)

1 с

! 2 мН >15мВ

1 с

| 2 мН ' 15 мВ

1 с

Таким образом, угнетающее действие форсколина на ПД и сокращения ослаблялось винбластином, но не колхицином или цитохалазином В Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что в ГМК мочеточника цАМФ-опосредованная сигнальная система оперирует с участием микротубул

Заключение

Изучение механизмов регуляции электрических и сократительных свойств гладких мышц внутренних органов, кровеносных и лимфатических сосудов, выяснение механизмов развития заболеваний, связанных с нарушением двигательной функции гладкомышечных органов, и разработка молекулярных технологий их коррекции является актуальной проблемой современной физиологии и медицины Многочисленные исследования процессов активации и поддержания сократительного ответа совершенно однозначно указывают на то, что изменения цитоплазматической концентрации свободных ионов Са2+ играют главенствующую роль в цикле сокращение - расслабление мышечных клеток Наряду с этим, детальные исследования процессов сопряжения возбуждения-сокращения в ГМК свидетельствуют о наличии дополнительных факторов, модифицирующих конечный функциональный ответ гладкой мышцы Не в последнюю очередь это касается и цитоскелета

Как показали эксперименты с использованием модуляторов состояния цитоскелета, микрофиламенты вовлечены в генерацию сокращений гладких мышц аорты крысы при действии гиперкалиевог о раствора, а также ПД и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки Эти данные согласуются с исследованиями Nakamura М (2000), где в условиях path-clamp показано снижение единичных токов потенциал-зависимых Са-каналов сосудистых ГМК при деполимеризации микрофиламентов Открывание этих каналов в данном случае является основным механизмом увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле и активации сокращения

Следует отметить, что недавние исследования исключают возможность непосредственного влияния цитоскелета на внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Показано, что деполимеризация актиновых филаментов, вела к десятикратному снижению величины фенилэфрин-индуцированного сокращения изолированных гладкомышечных клеток брюшной артерии, не влияя на [Са2+], Это свидетельствует о важной роли динамического равновесия между F-и G-актином в обеспечении чувствительности сократительного аппарата ГМК к кальцию [Shaw L et al, 2003]

Изменение баланса полимеризации/деполимеризации актина модулирует объем-зависимую регуляцию сократительной активности сосудистых гладких мышц Как указывалось выше, сокращения сегментов аорты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором зависят от состояния микрофиламентов и микротубул В генерации сокращений при изоосмотической стрикции клеток основную роль играют микрофиламенты Различный вклад отдельных компонентов цитоскелета в обеспечение сократительных ответов при стрикции клеток, по-видимому, связан с отличием механизмов индукции этих сокращений [Anfinogenova Y J et al, 2004]

Полученные данные о зависимости эффектов фенилэфрина от состояния микрофиламентов и микротубул служат доказательством того, что цитоскелет является необходимым участником сократительных реакций гладких мышц при действии биологически активных веществ Следует отметить, что степень участия микрофиламентов и микротубул в реализации эффектов фенилэфрина неодинакова в различных типах ГМК В механизмы действия данного агента на механическое напряжение сосудистых сегментов аорты крысы в большей степени вовлечены микрофиламенты, а микротубулы участвуют в стимуляции фе-нилэфрином электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки

Многие биологически активные вещества влияют на гладкие мышцы через увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ Полученные результаты показывают, что реализация угнетающего действия циклического АМФ на сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы осуществляется с участием микрофиламентов В гладкомышечных клетках мочеточника эффекты цАМФ обеспечиваются с участием, преимущественно, микротубул

ВЫВОДЫ

1 Индуцированное гиперкалиевым раствором сокращение гладких мышц аорты крысы, потенциал действия и сокращение гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки зависят от состояния микрофиламентов ци-тоскелета в большей степени, чем микротубул

2 Сокращение гладкомышечных клеток аорты крысы, вызванное изоосмо-тической стрикцией, подавляется при разрушении микрофиламентов, тогда как сокращение в гиперосмотическом растворе зависит от состояния как микрофиламентов, так и микротубул

3 Микрофиламенты цитоскелета гладких мышц аорты и микротубулы гладкомышечных клеток мочеточника вовлечены в механизмы действия фенилэфрина на сократительную активность ГМК аорты и мочеточника

4. Угнетение циклическим АМФ сокращений гладкой мышцы аорты в гиперкалиевом растворе, электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки осуществляется с преимущественным участием микротубул, тогда как кальциевая сигнальная система реализует свои эффекты в большей степени через микрофиламенты

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гусакова, С В Влияние блокатора микротрубочек колхицина на развитие сократительных реакций сосудистых гладкомышечных клеток / А А Килин, Я Д Анфиногенова // «Науки о человеке» Материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов — Томск — 2005 - С 72

2 Миноченко, И Л Механизмы действия мезатона и гистамина на электрическую и сократительную активность гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки роль Ыа+К,'2С1 -котранспорта и хлорной проводимости мем-

браны /ИЛ Миноченко, А А Килин, С В Гусакова, Я Д Анфиногенова // «Науки о человеке» Материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов - Томск - 2005 - С 78-79

3 Gusakova, S V Cell shnnkage-induced smooth muscle contraction evidence for microfilament mediated signaling / S V Gusakova, Y D Anfinogenova, A A Kilin, I.V Kovalev, MA Medvedev, M В Baskakov, SN Oriov//J Of Hypertension The 15th Europen Meeting on Hypertension - Milan -2005 -V 23, suppi 2 -P S359

4 Килин, A A Роль цитоскелета в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц / А А Килин, С В Гусакова, Я Д Анфиногенова, И В Ковалев, M Б Баскаков, И Л Миноченко, Ю Л Бородин // Бюллетень Сибирской медицины Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда - 2005 - Т 4, Приложение 1 - С 49

5 Ковалев, И В Регуляция №+К*2СГ-котранспорта и хлорной проводимости мембраны циклическими нуклеотидами вклад в электрическую и сократительную активность гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки / И В Ковалев, M Б Баскаков, И Л Миноченко, Я Д Анфиногенова, Ю Л Бородин, С В Гусакова, А А Килин, А Г Попов, M А Медведев // Бюллетень Сибирской медицины Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда -2005 -Т 4,Приложение 1 -С 114

6 Миноченко, И Л Роль Ма+К+2СГ-котранспорта и хлорной проводимости мембраны в регуляции электрической и сократительной активности гладко-мышечных клеток мочеточника морской свинки при действии мезатона и гис-тамина /ИЛ Миноченко, И В Ковалев, М.Б Баскаков, Я Д Анфиногенова, А А Килин, Ю Л Бородин, С В Гусакова, А Г Попов, M А Медведев // Бюллетень Сибирской медицины Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда - 2005 - Т 4, Приложение 1 - С 116

7 Ковалев, И В Роль Ыа+К+2СГ-котранспорт и хлорной проводимости мембраны в регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки биологически активными веществами мезатоном и гистамином / И.В. Ковалев, M Б Баскаков, И Л Миноченко, Я Д Анфиногенова, Ю Л Бородин, А В Васюков, С В Гусакова, А.А Килин, А Г Попов, Л В Капилевич, M А Медведев // Научные труды I съезда физиологов СНГ, Сочи -2005 -Том 2 -С 94-95

8 Гусакова, С В Роль цитоскелета в механизмах действия деполяризации, фенилэфрина и цАМФ на сократительную активность гладкой мышцы / С В Гусакова, M Б Баскаков, И В Ковалев, С В Кольцова, Я Д Анфиногенова // «Биология - наука XXI века» Сборник тезисов 10-й школы-конференции молодых ученых. - Пущино -2006 - С 109-110

9 Кольцова, С В Роль циклических нуклеотидов и цитоскелета в регуляции сократительной активности сосудистых гладких мышц / С В Кольцова, С В Гусакова, В В Попов // Вестник РГМУ Материалы I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной конференции - Москва -2006 -№2(49) -С383-384

10 Гусакова, C.B. Роль циклических нуклеотидов в объем-зависимой регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток / С В Гусакова, С В Кольцова, А В Васюков, В В Попов, Я Д Анфиногенова // «Науки о человеке» Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов -Томск -2006 -С 100-102

11. Gusakova, SV The role cytoskeleton in smooth muscle cell contractile responses evoked by depolarization, Phenylephrine, end Forskohn / S V Gusakova, IV Kovalev, M В Baskakov, IL Minochenko, S V Koltsova, Y D Anfino-genova, S N Orlov // J Of Hypertension The 16th Europen Meeting on Hypertension -Madid -2006 -V 24, suppl 4 -PS390

12 Ковалев, И В Исследование роли цитоскелета в регуляции циклическими нуклеотидами электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток /ИВ Ковалев, С В Гусакова, M Б Баскаков, Я Д Анфиногенова, И Л Миноченко, А В Васюков, О С Мельник, Л В. Капилевич, M А Медведев Н Вестник Томского государственного университета Сборник материалов Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации», посвященной памяти и 100-летию со дня рождения профессора В А Пегеля -Томск -2006 -23 -С 63-65

13 Ковалев, И В Изучение роли Ма+К+2СГ-котранспорта и хлорной проводимости мембраны в регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки мезатоном и гистами-ном /ИВ Ковалев, M Б Баскаков, M А Медведев, И Л Миноченко, А А. Ки-лин, Я Д Анфиногенова, Ю Д Бородин, С В Гусакова, А Г. Попов, Л В Капилевич, С H Орлов // Российский физиологический журнал им. И M Сеченова -2007 —93 №3 -С 306-317

14 Гусакова, С В Исследование роли цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / С В Гусакова // Бюллетень Сибирской медицины -2007 -№1 -С 78-82

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБС — альбумин бычьей сыворотки

ГМК - гладкомышечная клетка

МН — механическое напряжение

ПД — потенциал действия

цАМФ - циклический 3 5-аденозинмонофосфат

NKCC - Na+,K+,2C1—котранспорт

Туг-РК — тирозиновая протеинкиназа

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии ГОУ ВПО СибГМУ Подписано к печати 26 03 07 Заказ № 114 Тираж 100 экземпляров

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусакова, Светлана Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности молекулярной организации сократительного. аппарата гладких мышц.

1.2. Роль фосфорилирования и дефосфорилирования легких цепей миозина в регуляции сократительной активности гладких мышц.

1.3. Функциональная организация внутриклеточных сигнальных систем.

1.4. Механизмы регуляции объема клеток.

1.5. Строение цитоскелета гладкомышечных клеток.

1.6. Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности сосудистых гладкомышечных клеток.

ГЛАВА II.:.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методика исследования.

2.3. Растворы и реактивы.

2.4. Статистическая обработка.

ГЛАВА III.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение роли цитоскелета в сократительньгх реакциях гладкомышечных сегментов аорты крысы.

3.1.1. Влияние колхицина на гиперкалиевые контрактуры гладкомышечных препаратов аорты крысы.

3.1.2. Влияние колхицина на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором.

3.1.3. Влияние колхицина на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы вызванные гипоосмотическим раствором.

3.1.4. Влияние колхицина на сократительные реакции гладкомышечных сегментов аорты в модели изоосмотической стрикции клеток.

3.2. Исследование роли микротубул в регуляции сокращений. гладких мышц.

3.2.1. Влияние винбластина на сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперкалиевым раствором.

3.2.2. Влияние винбластина на сокращения сосудистых гладких мышц вызванные гиперосмотическим раствором и изоосмотической стрикцией.

3.3. Исследование участия микрофиламентов в сократительных реакциях гладкомышечных клеток аорты крысы при гиперкалиевой деполяризации мембраны и изменении объема клеток.

3.3.1. Изучение соотношения F- и G- актина в сегментах аорты крысы при действии гиперкалиевого, гипо- и гиперосмотического растворов.

3.3.3. Влияние цитохалазина В на сокращения, вызванные гиперосмотическим раствором и изоосмотической стрикцией гладкомышечных клеток аорты крысы.

3.4. Изучение роли цитоскелета в сократительных реакциях гладкомышечных сегментов аорты крысы при действии фенилэфрина.

3.4.1. Влияние модуляторов состояния цитоскелета на фенилэфрин-индуцируемые сокращения ГМК аорты.

3.4.2. Соотношение F- и G- актина в сегментах аорты крысы при фенилэфрин-индуцируемом сокращении.

3.5. Исследование роли цитоскелета в цАМФ-опосредованной регуляции сокращений сосудистых гладкомышечных клеток.

3.6. Исследование роли цитоскелета в сопряжении возбуждения — сокращения гладкомышечных клеток мочеточника.

3.6.1. Влияние модуляторов состояния цитоскелета на электрическую и сократительную активность гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки

3.6.2. Влияние модуляции состояния цитоскелета на эффекты фенилэфрина в гладкомышечных клетках мочеточника морской свинки.

3.6.3. Роль цитоскелета в цАМФ-опосредованной регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток"

Сократительные свойства гладкомышечных клеток (ГМК) во многом определяют физиологический и патофизиологический статус сосудов и висцеральных органов. В последние годы, наряду с классическими представлениями о ключевой роли кальций-зависимых механизмов регуляции сократительной функции ГМК [Шуба М.Ф. и соавт., 1984, 1988; Kuriyama Н., 1998], все большее внимание исследователей привлечено к цитоскелету с позиции его участия в процессах сопряжения возбуждения-сокращения [Orlov S.N. et al., 1996; Anfinogenova Y.J. et al., 2004; Burgstaller G., Gimona M., 2004; Zhang D. et al., 2001, 2006]. Именно цитоскелет может оказаться одним из ключевых эффекторных звеньев, к которому конвергируют различные сигнальные пути, участвующие в регуляции сократительной активности ГМК.

I ч

В исследованиях единичных Са -токов мембраны ГМК прямо показано нарушение оперирования Са -каналов L-типа при дезинтеграции актино-вых микрофиламентов [Nakamura М. et al., 2000]. С использованием культу-ральных ГМК из аорты крысы обнаружено, что увеличение продукции цАМФ существенно снижает вход 45Са, индуцированный деполяризацией мембраны в гиперкалиевой среде. Такое же действие на вход 45Са оказывала предобработка клеток дезинтегратором F-актина цитохалазином В [Orlov S.N. et al., 1995, 1996]. Эти данные указывают на то, что ингибирующее действие цАМФ на L-тип Са -каналов, вероятно, связано с реорганизацией ак-тинового цитоскелета. Не исключено, что в данном случае ковалентная модификация белков, катализируемая цАМФ-зависимой протеинкиназой, сдвигает равновесие между F- и G-актином в сторону последнего.

Другой возможный механизм расслабления гладких мышц при действии индукторов цАМФ может быть связан с угнетением Na+,K+,2C1"-котранспорта (NKCC). Активация NKCC вносит существенный вклад в сократительные реакции сосудистых ГМК не только при аппликации биологически-активных веществ, но и наблюдаемые в моделях гиперосмотической и б изоосмотической стрикции клеток [Anfinogenova YJ. et al., 2004]. Возможно, одним из механизмов изменения реактивности сосудистых ГМК в моделях стрикции клеток является увеличение общей концентрации макромолекул, ключевая роль которого была установлена в регуляции объем-чувствительного мембранного транспорта [Colclasure G.C. et al., 1992; Dunham P.B. et al., 1995] и элементов цитоскелета [Cuneo P. et al., 1992; Madden T.L., Herzfeld J., 1993; Pedersen S.F., 2001]. Однако природа этого процесса остается невыясненной.

В настоящее время усиливается интерес исследователей и к другому элементу цитоскелета - микротубулам. Первоначально предполагалось, что деполимеризация микротубул облегчает сократительные ответы посредством устранения внутреннего механического противодействия сокращению, генерируемому актин-миозиновыми взаимодействиями [Paul R.J. et al., 2000]. Однако позднее было показано, что микротубулы не оказывают существенного влияния на механические характеристики сосудистых гладкомышечных клеток, но участвуют в модуляции большого числа сигнальных путей. Оказалось, что при активации клеток происходит изменение активности протеиновых киназ, транслокация которых опосредуется микротубулами [Chitaley К., Webb RC., 2001; Zhang D. et al., 2001]. В свою очередь, изменение активности протеинкиназы-С, MAP- и Rho-киназ является одним из ключевых механизмов кальциевой сенситизации гладкомышечных клеток [Somlyo А.Р. and Somlyo A.V., 1994; Sauzeau V. et al., 2000; Platts S.H. et al., 2002]. Вопрос о роли этих процессов в регуляции сокращений гладких мышц, а также в сопряжении возбуждения - сокращения в ГМК не нашел удовлетворительного разрешения.

Подавляющее большинство исследований роли цитоскелета в оперировании внутриклеточных путей передачи сигналов выполнено на немышечных клетках. В относительно небольшом количестве работ, посвященных гладким мышцам, объектами изучения являлись культуральные клетки. Вместе с тем известно, что культуральные ГМК по ряду физиологических свойств отличаются от нативных.

Таким образом, изучение цитоскелет-зависимых механизмов оперирования внутриклеточных сигнальных систем в гладких мышцах, их взаимосвязей с объемом клеток, ионными транспортерами и ионными каналами является актуальной проблемой современной фундаментальной физиологии. Важность исследования роли цитоскелета в регуляции сократительной активности сосудистых ГМК обусловлена также и тем, что методы управления динамическими перестройками микротубул и микрофиламентов могут оказаться перспективными для разработки новых технологий местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Цель работы: изучить роль микротубул и микрофиламентов цитоскелета в механизмах оперирования кальциевой и цАМФ-опосредованной внутриклеточных сигнальных систем, а также в объем-зависимой регуляции функции гладкомышечных клеток.

ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать влияние модуляторов микрофиламентов и микротубул цитоскелета на сокращения сегментов аорты крысы, вызванные гиперкалиевым раствором.

2. Изучить участие цитоскелета в регуляции электрогенеза и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника.

3. Исследовать роль цитоскелета в сократительных ответах сосудистых гладких мышц на изменения объема клеток.

4. Установить влияние дезинтеграции цитоскелета на эффекты возбуждения агадренэргических рецепторов в сосудистых сегментах аорты и гладкомышечных клетках мочеточника.

5. Исследовать роль цитоскелета в цАМФ-зависимой регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Микрофиламенты цитоскелета в большей степени, чем микротубулы, вовлекаются в регуляцию сокращений, вызванных гиперкалиевой деполяризацией гладких мышц аорты крысы, а также в генерацию потенциалов действия и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки.

2. Сокращения сосудистых сегментов аорты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором, зависят от состояния микрофиламентов и микро-тубул. В генерации сокращений при изоосмотической стрикции клеток основную роль играют микрофиламенты.

3. Микрофиламенты вовлечены в механизмы действия фенилэфрина на механическое напряжение сосудистых сегментов аорты крысы, а микротубулы - в стимуляцию фенилэфрином электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки.

4. Опосредованное циклическим АМФ угнетение сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы зависит от состояния микрофиламентов цитоскелета, а потенциалов действия и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника - от состояния микротубул.

НА УЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показано, что микрофиламенты участвуют в развитии сокращений сосудистых гладких мышц при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором, а также в генерации потенциалов действия и сокращений ГМК мочеточника морской свинки при действии деполяризующего тока.

Впервые исследована роль цитоскелета в сократительных реакциях сосудистых гладких мышц, индуцированных изменениями объема клеток. Установлено, что сокращения, вызванные гиперосмотическим сжатием клеток, зависят от состояния микротубул и микрофиламентов. В отличие от этого сокращения, возникающие при изоосмотической стрикции, подавляются только при разрушении микрофиламентов. Сокращения, вызванные гипоосмотиче-ским набуханием, не зависят от состояния цитоскелета.

Получены новые данные, касающиеся участия микрофиламентов и микротубул цитоскелета в сократительных реакциях гладких мышц, индуцированных фенилэфрином. В сосудистых гладкомышечных клетках они зависят от состояния микрофиламентов, тогда как в гладких мышцах мочеточника - от состояния микротубул.

Впервые установлено, что вклад отдельных элементов цитоскелета в регуляцию циклическим АМФ электрогенеза и сокращений неодинаков в различных типах гладких мышц. Реализация угнетающего действия циклического АМФ на сократительную активность ГМК аорты крысы осуществляется с участием микрофиламентов. В гладкомышечных клетках мочеточника эффекты цАМФ опосредованы преимущественно микротубулами.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных знаний о роли цитоскелета в механизмах оперирования кальциевой, цАМФ-опосредованной и зависимой от объема систем регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток. Полученные данные дополняют представления о механизмах сосудистых реакций при гипертонической болезни и патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями водно-солевого обмена или метаболических процессов в организме, а также сведения о побочных действиях широко применяемых в клинической практике цитостатиков. Результаты исследования могут оказаться перспективными для разработки молекулярных технологий фармакологической коррекции дисфункций гладких мышц висцеральных органов и сосудов, а также местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов.

Областями применения полученных данных являются физиология, биофизика, фармакология.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы собственных результатов и их обсуждения и заключения. Библиография включает 212 ссылок, в том числе 26-на работы отечественных авторов и 186 - зарубежных. Работа иллюстрирована 25 рисунками и включает 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гусакова, Светлана Валерьевна

выводы

1. Индуцированное гиперкалиевым раствором сокращение гладких мышц аорты крысы, потенциал действия и сокращение гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки зависят от состояния микрофиламентов цитоскелета в большей степени, чем микротубул.

2. Сокращение гладкомышечных клеток аорты крысы, вызванное изоосмотической стрикцией, подавляется при разрушении микрофиламентов, тогда как сокращение в гиперосмотическом растворе зависит от состояния как микрофиламентов, так и микротубул.

3. Микрофиламенты цитоскелета гладких мышц аорты и микротубулы гладкомышечных клеток мочеточника вовлечены в механизмы действия фенилэфрина на сократительную активность ГМК аорты и мочеточника.

заключение

Изучение механизмов регуляции электрических и сократительных свойств гладких мышц внутренних органов, кровеносных и лимфатических сосудов, выяснение механизмов развития заболеваний, связанных с нарушением двигательной функции гладкомышечных органов, и разработка молекулярных технологий их коррекции является актуальной проблемой современной физиологии и медицины. Многочисленные исследования процессов активации и поддержания сократительного ответа совершенно однозначно указывают на то, что изменения цитоплазматической концентрации свободных ионов Са2"1" играют главенствующую роль в цикле сокращение — расслабление мышечных клеток. Наряду с этим, детальные исследования процессов сопряжения возбуждения-сокращения в ГМК свидетельствуют о наличии дополнительных факторов, модифицирующих конечный функциональный ответ гладкой мышцы. Не в последнюю очередь это касается и цитоскелета.

Как показали эксперименты с использованием модуляторов состояния цитоскелета, микрофиламенты вовлечены в генерацию сокращений гладких мышц аорты крысы при действии гиперкалиевого раствора, а также ПД и сокращений гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки. Эти данные согласуются с исследованиями Nakamura М. (2000), где в условиях path-clamp показано снижение единичных токов потенциал-зависимых Са-каналов сосудистых ГМК при деполимеризации микрофиламентов. Открывание этих каналов в данном случае является основным механизмом увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле и активации сокращения.

Следует отметить, что недавние исследования исключают возможность непосредственного влияния цитоскелета на внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Показано, что деполимеризация актиновых филаментов, вела к десятикратному снижению величины фенилэфрин-индуцированного сокращения изолированных гладкомышечных клеток брюшной артерии, не влияя на [Ca2+]i. Это свидетельствует о важной роли динамического равновесия между F- и G-актином в обеспечении чувствительности сократительного аппарата ГМК к кальцию [Shaw L. et al, 2003].

Изменение баланса полимеризации/деполимеризации актина модулирует объем-зависимую регуляцию сократительной активности сосудистых гладких мышц. Как указывалось выше, сокращения сегментов аорты крысы, вызванные гиперосмотическим раствором зависят от состояния микрофиламентов и микротубул. В генерации сокращений при изо-осмотической стрикции клеток основную роль играют микрофиламенты. Различный вклад отдельных компонентов цитоскелета в обеспечение сократительных ответов при стрикции клеток, по-видимому, связан с отличием механизмов индукции этих сокращений [Anfinogenova YJ. et al., 2004].

Полученные данные о зависимости эффектов фенилэфрина от состояния микрофиламентов и микротубул служат доказательством того, что цитоскелет является необходимым участником сократительных реакций гладких мышц при действии биологически активных веществ. Следует отметить, что степень участия микрофиламентов и микротубул в реализации эффектов фенилэфрина неодинакова в различных типах ГМК. В механизмы действия данного агента на механическое напряжение сосудистых сегментов аорты крысы в большей степени вовлечены микрофиламенты, а микротубулы участвуют в стимуляции фенилэфрином электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки.

Многие биологически активные вещества влияют на гладкие мышцы через увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ. Полученные результаты показывают, что реализация угнетающего действия циклического АМФ на сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы осуществляется с участием микрофиламентов. В гладкомышечных клетках мочеточника эффекты цАМФ обеспечиваются с участием, преимущественно, микротубул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусакова, Светлана Валерьевна, Томск

1. Антипенко, А.Е. Вторичные посредники в клетках сердца и гладких мышц сосудов / А.Е. Антипенко // Биохимия. 1991. - Т. 56, вып. 4.-С. 589-620.

2. Анфиногенова, Я.Д. Роль ионного транспорта, сопряженного с изменениями клеточного объема, в механизмах регуляции сократительной функции сосудистых гладкомышечных клеток / Я.Д. Анфиногенова: Дисс. д.м.н. Томск, 2005. - 237с.

3. Баскаков, М.Б. Кальмодулин в механизмах регуляции сократительной функции гладкой мускулатуры / М.Б. Баскаков, М. А. Медведев // Бюлл. СО АМН СССР. 1984. - N4. - С. 83-88.

4. Баскаков, М.Б. Механизмы регуляции вторичными посредниками электрической и сократительной активности гладких мышц / М.Б. Баскаков: Дисс. д.м.н. Томск, 1988. - 367с.

5. Баскаков, М.Б. Механизмы регуляции функций гладких мышц вторичными посредниками / М.Б. Баскаков, М.А. Медведев, И.В. Ковалев, Л.В. Капилевич, Д.В. Загулова Томск, 1996.- 154с.

6. Баскаков, М.Б. Роль протеинкиназы С в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц: эффект форболового эфира / М.Б. Баскаков, В.Б Студницкий, М.А. Медведев, Б. И. Ходоров // Бюлл. экс-перим. биол. мед. 1987. - N7. - С. 8-11.

7. Бурый, В.А. Роль внутриклеточного кальция в активации сокращения гладких мышц легочных артерий / В.А. Бурый, А.В. Гурков-ская, Н.И. Гокина, М.Ф. Шуба // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. -1989. Т. 105, N9. - С. 261-264.

8. Воротников, А.В. Внутриклеточная сигнализация и Фосфори-лирование белков при сокращении гладких мышц / А.В. Воротников, М.А. Крымскмй, В.П. Ширинский // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 12. -С. 1587-1610.

9. Костерин, С.А. Транспорт кальция в гладких мышцах / С.А. Костерин. Киев : Наукова думка. - 1990. - 216с.

10. Кочемасова, Н.Г. Роль ионов кальция в формировании плато потенциала действия гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки в безнатриевых растворах / Н. Г. Кочемасова // Физиол. ж. 1982. -Т. 28, N2.-С. 206-214.

11. Крутецкая, З.И. Метаболизм фосфоинозитидов и формирование кальциевого сигнала в клетках / З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев // Цитология. -1992. Т. 34, N10. - С. 26-44.

12. Курский, М.Д., Транспорт кальция и функции гладких мышц / М.Д. Курский, Е.Т. Михайленко, А.Н. Федоров. Киев : Наукова думка.- 1981.- 127с.

13. Орлов, С.Н. Кальмодулин / С.Н. Орлов. М: Итоги науки и техники. - 1987.-209с.

14. Орлов, С.Н. Са-насос плазматической мембраны // Кальций регулятор метаболизма / С.Н.Орлов. - Томск. - 1987. - С. 74-96.

15. Расмуссен, Г. Циркуляция кальция и внутриклеточная передача сигнала / Г. Расмуссен. В мире науки. - 1989. - N12. - С. 36-43.

16. Рекалов, В.В. Кальциевый ток и сокращение гладкомышечной клетки / В.В. Рекалов, В.В. Тараненко, М.Ф. Шуба // Докл. АН СССР. 1985. - Т.281, N2. - С. 462-466.

17. Скок, В.И. Нервно-мышечная физиология / В.И. Скок, М.Ф. Шуба. Киев : Вища школа. - 1986. - 224 с.

18. Тепперман, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы / Дж. Тепперман, X. Тепперман : Пер. с англ. М.: Мир. - 1989. - 656с.

19. Ткачук В.А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов / В.А. Ткачук // Российский Физиол. ж. им. И.М.Сеченова. -1998. Т.84, N10. - С. 1006-1018.

20. Ткачук, В.А. Регуляция кальцием аденилатциклазной системы сердца / В.А. Ткачук // Кальций регулятор метаболизма. — Томск.1987.-С. 25-37.

21. Фултон, А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки / А. Фултон. М.: «Мир». - 1987. - 120с

22. Ширинский, В.П. Клеточная подвижность в сердечнососудистой системе / В.П. Ширинский, А.В. Воротников // Природа. -№12.-2005.-С. 39-44.

23. Шуба, М.Ф. Мембранные механизмы возбуждения гладкомышечных клеток / М.Ф. Шуба, В.А Бурый // Физиол. ж. 1984. - Т.ЗО, N5.-С. 545-559.

24. Шуба, М.Ф. Механизмы возбуждения и сокращения гладких мышц мозговых сосудов / М.Ф. Шуба, Н.И. Гокина. — Киев : Наукова думка. 1991.- 129с.

25. Шуба, М.Ф. Пути и механизмы трансмембранного входа в глад-комышечные клетки ионов кальция, участвующих в активации сокращения / М.Ф. Шуба // Физиологический журнал. 1981. - Т.27, N4. - С. 533-541.

26. Шуба, М.Ф. Физиология сосудистых гладких мышц / М.Ф. Шуба, Н.Г Кочемасова, Киев : Наукова думка. - 1988. - 250с.

27. Abedi, Н. Cytochalasin D stimulation of tyrosine phosphorylation and phosphotyrosine-associated kinase activity in vascular smooth muscle cells / H. Abedi, I. Zachary // Biochem Biophys Res Commun. 1998. -№245 (3) - P. 646-650.

28. Adames, N.R. Microtubule interactions with the cell cortex causing nuclear movements in Saccharomyces cerevisiae / N.R. Adames, J.A. Cooper // J. Cell Biol. 2000. - №149 (4). - P. 863-874.

29. Akar, F. Contractile regulation of the Na+-K+-2C1" cotransporter in vascular smooth muscle / F. Akar, G. Jiang, R.J. Paul, W.C. O'Neill // Am J Physiol Cell Physiol (United States). 2001. - 281. - P. C579-584.

30. Akar, F. Vasoconstrictors and nitrovasodilators reciprocally regulate the Na+-K+-2C1" cotransporter in rat aorta / F. Akar, E. Skinner, J.D. Klein, M. Jena, R.J. Paul, W.C. O'Neill // Am J Physiol. 1999. - 276. - P. C1383-C1390

31. Anderson, R.G.W. The caveolae membrane system / R.G.W. Anderson // Annu. Rev. Biochem. 67. - 1998. - P. 199-225.

32. Barany, M. Protein phosphorylation during contraction and relaxation / K. Barany, Barany M // Biochemistry of Smooth Muscle Contraction (M. Barany, Ed.). 1996. - P. 321-339.

33. Barany, M. Exchange of the actin-bound nucleotide in intact arterial smooth muscle / Barany, M, Barron JT, Gu L, Barany К // J. Biol. Chem. 2001. -276. - P. 48398-48403.

34. Barnes, P.J. Beta-adrenoreceptors smooth muscle, nerves cells / P. J.Barnes // Life sci. 1993. - V.52, N26. - P. 2101- 2109.

35. Berridge, M. Receptors and on calcium signaling / M. Berridge // Tends. Pharmacol. Sci. 1984.-V.2101. - P. 345-360.

36. Bialecki, R. KCa channel antagonists reduce NO donor-mediated relaxation of vascular and tracheal smooth muscle / R. Bialecki, C.Stinson-Fisher // Am. J. Physiol. 1995. - V.268, N1. - P. L152-L159.

37. Biel, M. Primary structure and functional expression of a high voltage activated calcium channel from rabbit lung / M. Biel, P. Ruth, E. Bosse, R. Hullin, W. Stuhmer, V. Fockerzi, F. Hofmann // FEBS Lett. 1990. - 269. - P. 409-412.

38. Bortner, C.D. Absence of volume regulatory mechanisms contributes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes / C.D. Bortner, J.A. Cidlowski // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1996. - 271. - P .C950-C961.

39. Burg, M.B. Macromolecular Crowding as a Cell Volume Sensor / MB. Burg // Cell Physiol Biochem. 2000. -10. - P. 251-256.

40. Burgstaller, G. Actin cytoskeleton remodelling via local inhibition of contractility at discrete microdomains / G. Burgstaller, M. Gimona // J Cell Sci. -2004. 117 (Pt 2). - P. 223-231.

41. Bursell, J.D. Swelling-activated K+ transport via two functionally distinct pathways in eel erythrocytes / J.D. Bursell, K. Kirk // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 1996. - 270. - P. R61-R70.

42. Cantiello, H.F. Actin-binding protein contributes to cell volume regulatory ion channel activation in melanoma cells / H.F. Cantiello, A.G. Prat, J.V. Bonventre, C.C. Cunningham et al // J. Biol. Chem. 1993. - 268. - P. 4596-4599.

43. Chamberlin, M.E. Anisosmotic cell volume regulation: a comparative view / M.E. Chamberlin, K. Strange // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1989. - 257. - P. C159-C173.

44. Chitaley, K. Microtubule depolymerization facilitates contraction of vascular smooth muscle via increased activation of RhoA/Rho-kinase / Chitaley K, Webb RC // Med Hypotheses. 2001. - 56 (3). - P. 381-385.

45. Cipolla, M.J. Vascular smooth muscle actin cytoskeleton in cerebral artery forced dilatation / M.J Cipolla, O. George Osol // 1998. 29. -P. 1223-1228.

46. Colclasure, G.C. Cytosolic protein concentration is the primary volume signal for swelling-induced K-Cl. cotransport in dog red cells / G.C. Colclasure, J.C. Parker //J Gen Physiol. 1992. - 100 (1). - P. 1-10.

47. Crowley, C.M. The mechanism of excitation-contraction coupling in phenylephrine-stimulated human saphenous vein / C.M. Crowley, C.H. Lee, S.A. Gin, A.M. Keep et al // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002. -283 (4).-P. H1271-1281.

48. Cuneo, P. "Macromolecular crowding" is a primary factor in the organization of the cytoskeleton / P. Cuneo, E. Margi, A. Verzola, E. Grazi // Bio-chem. J. 1992. - 281. - P. 507-512.

49. Damron, D.S. Role of PKC, tyrosine kinases, and Rho kinase in a-adrenoceptor-mediated PASM contraction / D.S. Damron, N. Kanaya, Y.

50. Homma, S.O. Kim et al // Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol. 2002. -283. - P. L1051-L1064.

51. D'Angelo, G. Inhibition of ERK attenuates force development by lowering myosin light chain phosphorylation / G. D'Angelo, L.P. Adam // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002. - 282 (2). - P. H602- H610.

52. Davis, M.J. Signaling Mechanisms Underlying the Vascular Myogenic Response / M.J. Davis, M.A. Hill // Physiological Reviews. 1999. -79.-2.-P. 387-423.

53. De Alfonzo, R. A Ca2+/CaM protein kinase associated with Ca2+ transport in sarco(endo)plasmic vesicles from tracheal smooth muscle / R.De Alfonzo, I.De Becemberg, M. Alfonzo // Life Sci. 1996. - V.58, N17. - P. 1403-1412.

54. Dessy, C. A role for MAP kinase in differentiated smooth muscle contraction evoked by alpha-adrenoceptor stimulation / C. Dessy, I. Kim, C.L. Sougnez, R. Laporte et al //Am J Physiol. 1998.-275 (4 Pt 1). - P. С1081- CI 086.

55. Doughty, J.M. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries / J.M. Doughty, P.D. Langton // J Physiol. -2001. 534 (Pt 3). - P. 753-761.

56. Dunham, P.B. Effects of urea on K-Cl cotransport in sheep red blood cells: evidence for two signals of swelling / P. B. Dunham // Am. J. Physiol. -1995.-268 (4 Pt 1).-P. C1026-1032.

57. Earley, J.J. Caldesmon inhibits active crossbridges in unstimulated vascular smooth muscle: an antisense oligodeoxynucleotide approach / J.J. Earley, X. Su, R.S. Moreland // Circ Res. 1998. - 83 (6). - P. 661-667.

58. Ebertz, SL. Cryoprotectant permeability parameters for cells used in a bioengineered human corneal equivalent and applications for cryopreservation / S.L. Ebertz, L.E. McGann // Ciyobiology. 2004. - 49 (2). - P. 169-180.

59. Fukumitsu, T. Increase in calcium channel current by beta-adrenoceptor agonists in single smooth muscle cells isolated from porcine coronary artery / T. Fukumitsu, H. Hayashi, H. Tokuno, T. Tomita // Br. J. Pharmacol.1990.-100.-P. 593-599.

60. Feng, J. Inhibitory phosphorylation site for rho-associated kinase on smooth muscle myosin phosphatase / J.Feng, M. Ito, K. Ichikawa, N. Isaka et al // J. Biol. Chem. 1999. - 274. - P. 37385-37390.

61. Ghisdal, P. Rho-dependent kinase is involved in agonist-activated calcium entry in rat arteries / P. Ghisdal, G. Vandenberg, N. Morel // J Physiol. -2003.-551 (Pt3).-P. 855-867.

62. Gilles, R. Comparative aspects of cell osmoregulation and volume control / R. Gilles // Renal Physiol. Biochem. 1988. - 11. - P. 277-288.

63. Gorenne, I. Caldesmon phosphorylation is catalyzed by two kinases in permeabilized and intact vascular smooth muscle / I. Gorenne, X. Su, R.S. More-land // J Cell Physiol. 2004. - 198 (3). - P. 46146-46149.

64. Gorenne, I. Inhibition of p42 and p44 MAP kinase does not alter smooth muscle contraction in swine carotid artery / I. Gorenne, X. Su, R.S. More-land // Am J Physiol. 1998. - 275 (1 Pt 2). - P. H131- HI38.

65. Haas, M. The Na-K-Cl cotransporters / M. Haas, B. Forbush // J. Bio-energ. Biomemb. 1998. - 30. - P. 161-172

66. Hamilton, C. Calmodulin and excitation-contraction coupling / C. Hamilton, I. Serysheva, G. Strasburg // News Physiol. Sci. 2000. - V.15, N.12. - P. 201-204.

67. Hartshorne, D.J. Myosin light chain phosphatase: subunit composition, interactions and regulation / D.J. Hartshorne, M. Ito, F. Erdodi // J. Muscle

68. Res. Cell Motil. 1998. - 19. - P. 325-341.

69. Herrera, A.M. Influence of calcium on myosin thick filament formation in intact airway smooth muscle / A.M. Herrera, K.-H. Kuo, C.Y. Seow // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002. - 282. - P. СЗ10-C316.

70. Herzig, S. Mechanisms of beta-adrenergic stimulation of cardiac Ca 21 channels revealed by discrete-time Markov analysis of slow gating / S. Herzig, P. Patil, J. Neumann, C.M. Staschen, D.T. Yue // Biophys. J. 1993. -65.-P. 1599-1612.

71. Hoffmann, E.K. Membrane mechanisms and intracellular signalling in cell volume regulation / E.K. Hoffmann, P.B. Dunham // Int. Rev. Cytol.- 1995.- 161.-P. 173-262.

72. Hughes, S. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo / Hughes S, Chan-Ling T. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004. - 45 (8). - P. 2795-2806.

73. Hughes, A.D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. / A.D. Hughes// 1995.

74. Hyvelin, J.M. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway / J.M. Hyvelin, C. O'Connor, P. McLoughlin // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004. -287(4).-P. L673- L684.

75. Ignarro L Endothelium-derived relaxing factor produced and secreted from artery and vein is nitric oxide / L. Ignarro, G. Buga, K. Wood, et.all. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1987. - V.84. - P. 9265-9269.

76. Inoue, R. Acetylcholine activates nonselective cation channels in guinea-pig ileum through a G-protein / R. Inoue, G. Isenberg // J. Physiol. 1990. - 258. - P. CI 173-C1178.

77. Ito, M. Myosin phosphatase: structure, regulation and function / M. Ito, T. Nakano, F. Erdodi, D.J. Hartshorne // Mol Cell Biochem. 2004. -259 (1-2).-P. 197-209.

78. Iwasaki, H. Mechanical stretch stimulates growth of vascular smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor / H. Iwasaki; S. Eguchi; H. Ueno; F. Marumo et al. // Am J. Physiol Heart Circ Physiol (United States). -2000. 278 (2). - P. H521-529.

79. Janssen, L.J. KC1 evokes contraction of airway smooth muscle via activation of RhoA and Rho-kinase / L.J. Janssen, T. Tazzeo, J. Zuo, E.Pertens, S. Ke-shavjee // Am J. Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004. - 287 (4). - P. L852- L858.

80. Je, H.D. Calponin is required for agonist-induced signal transduc-tion—evidence from an antisense approach in ferret smooth muscle / H.D. Je, S.S. Gangopadhyay, T.D. Ashworth, K.G. Morgan // J. Physiol. 2001. - 537 (Pt 2). - P. 567-577.

81. Jessen, B.S. Activation of Na+,K+,2C1- cotransport system by reorganization of the actin filaments in Ehrlih ascites tumor cells / B.S. Jessen, E.K. Hoffmann // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - 1110. - P. 199-201.

82. Jones K.A. F-actin stabilization increases tension cost during contraction of permeabilized airway smooth muscles in dog / K.A. Jones, W.J. Perkins, R.R. Lorenz, Y.S. Prakash et al. // J. Physiol. 1999. - 519. - P. 527-538.

83. Kaibuchi, K. Regulation of the cytoskeleton and cell adhesion by the rho family GTPases in mammalian cells / K. Kaibuchi, S. Kuroda, M. Amano // Annu. Rev. Biochem. 1999. - 68. - P. 459-486.

84. Kawano, Y. Smooth muscle contraction by small GTPase Rho / Y. Kawano, T. Yoshimura, K. Kaibuchi // Nagoya J. Med Sci. 2002. -65(1-2). -P.l-8.

85. Kinjo, A.R. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation studied by density functional theory: Statics / A.R. Kinjo, S. Ta-kada // Physical Review. 2002. - E 66. - P. 31 -91.

86. Kirk, K. Functional properties and physiological roles of organic solute channels / K. Kirk, K. Strange // Annu. Rev. Physiol. 1998. - 60. -P. 719-739.

87. Koch, W.J. cDNA cloning of a dihydropyridine-sensitive calcium channel from rat aorta / W.J. Koch, P.T. Ellinor, A. Schwartz et al.// J. Biol. Chem. 1990. - 265. - P. 17786-17791.

88. Konev, S.V. Structural Lability of Biological Membranes / S.V. Konev. Minsk : Nauka i Tekhnika. - 1987.101. . Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells / E.D Korn // Physiological Rev. 1982. - 62. - P. 672-737.

89. Knapp, J. Calcium-independent activation of the contractile apparatus in smooth muscle of mouse aorta by protein phosphatase inhibition / J. Knapp, S. Aleth, F. Balzer, W. Schmitz // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2002. - 366 (6). - P. 562-569.

90. Kuriyama, H. Physiological features of visceral smooth muscle cells, with special reference to receptors and ion channels / H. Kuriyama, K. Kitamura, T. Itoh, R. Inoue // Physiol. Rev. 1998. - V. 78, No.3 - P. 811-920.

91. Lan, C. Endothelin-1 modulates hemoglobin-mediated signaling in cerebrovascular smooth muscle via RhoA/Rho kinase and protein kinase С / С. Lan, D. Das, A. Wloskowicz, B. Vollrath // Am J Physiol Heart Circ Physiol. -2004. 286 (1). -P. H165-173.

92. Lang, F. Cell volume in the regulation of cell proliferation and apop-totic cell death / F. Lang, M. Ritter, N. Gamper, S. Huber et al. // Cell Physiol Biochem. 2000. - 10 (5-6). - P. 417-428.

93. Lang, F. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms / F. Lang, G.L. Busch, M. Ritter, H. Volkl, S. Waldegger, E. Gulbins, D. Haussinger // Physiol. Rev. 1998. - 78. - P.247-306.

94. Lang, F. The diversity of volume regulatory mechanisms / F. Lang, G.L. Busch, H. Volkl // Cell Physiol. Biochem. 1998b. - 8. - P. 1-45.

95. Langton, P.D. Effect of mechanical strain on expression of Na+,K+-ATPase alpha subunits in rat aortic smooth muscle cells / P.D Lang-ton., E. Songu-Mize; X. Liu; L.J. Hymel // Am J. Med Sci (United States). -1998.-316 (3).-P. 196-199.

96. Lauzon, A.M. Coiled-coil unwinding at the smooth muscle myosin head-rod junction is required for optimal mechanical performance / A.M. Lauzon, P.M. Fagnant, D.M. Warshaw, K.M. Trybus // Biophys. J. 2001. -80.-P. 1900-1904.

97. Lee, C.H. The mechanism of phenylephrine-mediated Ca(2+).(i) oscillations underlying tonic contraction in the rabbit inferior vena cava / C.H. Lee, D. Poburko, P. Sahota, J. Sandhu et al. // J. Physiol. 2001. - 534 (Pt 3). - P. 641-650.

98. Lee, C.J. Membrane stretch increases the activity of Ca(2+)-activated K+ channels in rabbit coronary vascular smooth muscles / C.J. Lee, S. Kwon, Y.H. Lee, D.S. Ahn et al. // Yonsei Med J (Korea (south)). 2000. - 41(2). - P. 266-72.

99. Levitan, I. Modulation of volume-regulated CI- current by F-actin / I. Levitan, C. Almonte, P. Mollard, S.S. Garber // J. Membrane Biol. -1995.- 147.-P. 283-294.

100. Lee, Y.H. Regulation of vascular smooth muscle tone by N-terminal region of caldesmon. Possible role of tethering actin to myosin / Y.H. Lee, C. Gallant, H. Guo, Y. Li et al. // J. Biol Chem. 2000. - 275 (5). - P. 3213-3220.

101. Li, S. Signal transduction in matrix contraction and the migration of vascular smooth muscle cells in three-dimensional matrix / S. Li, J.J. Moon, H. Miao, G. Jin et al. // J. Vase Res. 2003. - 40 (4). - P.378-388.

102. Li, X.-D. The interaction between the regulatory light chain domains on two heads is critical for regulation of smooth muscle myosin / X-D. Li, J. Saito, R. Ikebe, K. Mabuchi, et al. // Biochemistiy 2000. - 39. - P. 2254-2260.

103. Lytle, C. Activation of the avian erythrocyte Na-K-Cl cotransport protein by cell shrinkage, cAMP, fluoride, and calyculin-A involves phosphorylation at common sites / C. Lytle // J. Biol Chem. 1997. - 272. - P. 15069-15077.

104. Macknight, A.D. Regulation of cellular volume / A.D. Macknight, A. Leaf//Physiol. Rev. 1977. - 57. - P. 510-573.

105. Madden, T.L. Crowding-induced organization of cytoskeletal elements: I. Spontaneous demixing of cytoplasmic proteins and model filaments to form filament bundles / T.L. Madden, J. Herzfeld // Biophys.J. 1993. -65. - P.1147-1154.

106. Masuda, T. Effect of propofol on hypotonic swelling-induced membrane depolarization in human coronary artery smooth muscle cells / T. Masuda, Y. Tomiyama, H. Kitahata, Y. Kuroda et al. // Anesthesiology. -2004.- 100 (3).-P. 648-656.

107. Mehta, D. Actin polymerization stimulated by contractile activation regulates force development in canine tracheal smooth muscle / D. Mehta, S.J. Gunst // J. Physiol. 1999. - 519. - P. 820-840.

108. Mongin, A.A. Mechanisms of cell volume regulation and possible nature of the cell volume sensor / A.A. Mongin, S.N. Orlov // Pathophysiology. 2001. - 8. - P. 77-88.

109. Muraki, K. Effect of isoprenaline on Ca2/ channel current in single smooth muscle cells isolated from taenia of the guinea-pig caecum / K. Muraki, T.B. Bolton, Y. Imaizumi, M. Watanabe // J. Physiol. (Lond.).1993. 471. - P. 563-582, 764.

110. Nagumo, H. Rho-kinase inhibitor HA-1077 prevents rho-mediated myosin phosphatase inhibition in smooth muscle cells / H. Nagumo, Y. Sasaki, Y. Ono, Okamoto et al. // Am. J. Physiol. 2000. - 278. - P. C57-C65.

111. Nakamura, M. Actin filament disruption inhibits L-type Ca2+ channel current in cultured vascular smooth muscle cells / M. Nakamura, M. Sunagawa, T. Kosugi, N. Sperelakis // Am. J. Physiol. Cell. 2000. - 279. - P. C480-C487.

112. Nakayama, K. Interactive role of tyrosine kinase, protein kinase C, and Rho/Rho kinase systems in the mechanotransduction of vascular smooth muscles / K. Nakayama, K. Obara, Y. Tanabe, M. Saito et al. // Biorheology. 2003. - 40 (1-3). - P. 307-314.

113. Nelson, M.T. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone / M.T. Nelson, J.B. Patlak, J.F. Worley, N.B. Standen // Am. J. Physiol. 1990. -259 (Cell Physiol. 28). - P. C3-C18.

114. Nelson, M. Quayle Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle / M. Nelson //Am.J. Physiol. 1995. -V.268.-P. 799-822.

115. Nilius, B. Annexin II modulates volume-activated chloride currents in vascular endothelial cells / B. Nilius, V. Gerke, J. Prenen, G. Szucs et al. // J. Biol. Chem. 1996. -271. - P. 30 631-30 636.

116. Noguera, M. Role of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzymes in contractile responses of denuded rat aorta related to various Ca2+ sources / M.

117. Noguera, M. Ivorra, С. Lugnier, P. D'Ocon // N.- Sch. Arch.Pharmacol. 2001. -V.363, N6. - P. 612-619.

118. Noma, K. Physiological role of ROCKs in the cardiovascular system / K. Noma, N. Oyama, J.K. Liao // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. -290 (З).-Р. C661-8.

119. Nunes, J.P. Cytoskeleton, passive tension and the contraction of the rat aorta to phorbol 12,13-dibutyrate / J.P. Nunes // Pharmacol. Res. 2002. -46(2).-P. 113-117.

120. O'Donnel, M. Regulation of ion pumps and carriers in vascular smooth muscle / M. O'Donnel, N. Owen // Physiol. Rev. 1994. - V.74, N3. -P. 683-721

121. Ohashi, T. Dynamics and Elasticity of the Fibronectin Matrix in Living Cell Culture Visualized by Fibronectin Green Fluorescent Protein / T. Ohashi, Kiehart, D., Erickson, H. P. // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1999. - Vol. 96.-P. 2153-2158.

122. Okada, Y. Receptor-mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD) / Y. Okada, E. Maeno, T. Shimizu, K. Dezaki et al. // J. Physiol. 2001. - 532 (Pt 1). - P. 3 -16.

123. Okamoto, T. Caveolins, a family of scaffolding proteins organizing 'preassembled signalling complexes' at the plasma membrane / T. Okamoto, A. Schlegel, P.E. Scherer, M. Lizanti //J. Biol. Chem.- 1998.-273. P. 5419-5422.

124. O'Neill, W.C. Physiological significance of volume-dependent transporters / W.C. O'Neill // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1999. - 276. -P. C995-C1011.

125. Orlov, S.N. Altered a-adrenergic regulation of Na-K-Cl cotransport in cultured smooth muscle cells from the aorta of spontaneously hypertensive rats /

126. S.N. Orlov, J. Tremblay, P. Hamet // Am.J.Hypertens. 1995. - 8. - P. 739-747.

127. Orlov, S.N. Apoptosis in serum-deprived vascular smooth muscle cells: evidence for cell volume-independent mechanism / S.N. Orlov, D. Pchejet-ski, S. Taurin, N .Thorin-Trescases et al. // Apoptosis. 2004. - 9. - P. 55-66.

128. Orlov S.N. Bumetanide-sensitive ion fluxes in vascular smooth muscle cells: lack of functional Na+,K+,2C1" cotransport / S.N. Orlov, J. Tremblay, P. Hamet // J. Membrane Biol. 1996. - 153. - P. 125-135.

129. Orlov, S.N. Cell volume in vascular smooth muscle is regulated by bumetanide-sensitive ion transport / S.N. Orlov, J. Tremblay, P. Hamet // Am. J. Physiol. Cell Physiol. -1996b. 270. - P. C1388-C1397.

130. Orlov, S.N. Genetic and biochemical determinants of abnormal monovalent ion transport in primary hypertension / S.N.Orlov, N.Adragna, V.A. Adarichev, P. Hamet // Am J. Physiol. 1999. - 276. - P. C511-C536.

131. Orlov, S.N. Hypertension. In Red cell membrane transport in health and disease / Bernhardt I. and Ellory J.C. // editors. Springer, Berlin. -2003.-P. 587-602.

132. Papakonstanti, E.A. Actin cytoskeleton: a signaling sensor in cell volume regulation / E.A. Papakonstanti, E.A. Vardaki, C. Stournaras // Cell. Physiol. Biochem. 2000. - 10. - P. 257-264.

133. Paul, R.J. Effects of microtubule disruption on force, velocity, stiffness and Ca2+.j in porcine coronary arteries / R.J. Paul, P.S. Bowman, M.S. Kolodney // Am J. Physiol Heart Circ Physiol. 2000. - 279 (5). - P. H2493- H2501.

134. Pearce, J.D. Differential effects of Rho-kinase inhibition on artery wall mass and remodeling / J.D. Pearce, J. Li, M.S. Edwards, W.P. English et al. // J Vase Surg. 2004. - 39(1). - P. 223-8.

135. Pedersen, S.F. The cytoskeleton and cell volume regulation / S.F. Pedersen, E.K. Hoffmann, J.W. Mills // Сотр. Biochem. Physiol. A Mol. Integ.r Physiol. 2001. - 130 (3). - P. 385-399.

136. Perry, P.B. Swelling-activated К fluxes in vascular endothelial cells: volume regulation via K-Cl cotransport and К channels / P.B. Perry, W.C. O'Neill // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1993. - 265. - P. C763-C769.

137. Platts, S.H. Microtubule-dependent regulation of vasomotor tone requires Rho-kinase / S.H. Platts, L.A. Martinez-Lemus, G.A. Meininger // J. Vase Res.-2002.-39 (2).-P. 173-182.

138. Quevillon-Cheruel, S. Role of the C-terminal extremities of the smooth muscle myosin heavy chains: implication for assembly properties / S. Quevillon-Cheruel, G. Foucault, M. Desmadril, A-M. Lompre, et al. // FEBS Letters. 1999. - 454. - P. 303-306.

139. Raat, N.J. Regulation of Na(+)-K(+)-2Cl- cotransport in rabbit proximal tubule primary culture / N.J. Raat, A. Hartog, van C.H. Os, R.J. Bindels et al.// Am. J. Physiol. 1994. - 267. - P. F63-F69.

140. Remillard, C.V. Role of Ca2+- and swelling-activated CI- channels in alphal-adrenoceptor-mediated tone in pressurized rabbit mesenteric arterioles / C.V Remillard, M.A. Lupien, V. Crepeau, N. Leblanc // Cardio-vasc Res. 2000. - 46. - P. 557-568.

141. Rohvver, J.M. Implications of macromolecular crowding for signal transduction and metabolite channeling / J.M. Rohwer, P.W. Postma, B.N. Kholodenko, H.V. Westerhoff// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -Vol.95.-P. 10547-10552.

142. Russell, J.M. Sodium-potassium-chloride cotransport / J.M. Russell // Physiol.Rev. 2000. - 80. - P. 212-276

143. Rutllant, J. Osmotic tolerance limits and properties of rhesus monkey (Macaca mulatta) spermatozoa / J. Rutllant, A.C. Pommer, S.A. Meyers // J. An-drol. 2003. - 24 (4). - P. 534-41.

144. Rovner, A.S. A long, weakly charged actin-binding loop is required for phosphorylation dependent regulation of smooth muscle myosin / A.S. Rovner //J. Biol. Chem. 1998. -273. - P. 27939-27944. I.

145. Rovner, A.S. The carboxyl-terminal isoforms of smooth muscle myosin heavy chain determine thick filament assembly properties / A.S.Rovner, P.M.Fagnant, S. Lowey, K.M. Trybus // J. Cell. Biol. 2002. - 156. - P. 113-124.

146. Saga, H. Phenotype-dependent expression of alpha-smooth muscle actin in visceral smooth muscle cells / H. Saga, K. Kimura, K. Hayashi et.all. // Exp. Cell. Res. 1999. - V. 247 (1). - P. 279-292.

147. Shaw, L. Inhibitors of actin filament polymerisation attenuate force but not global intracellular calcium in isolated pressurised resistance arteries / L. Shaw, S. Ahmed, C. Austin, M.J. Taggart // J. Vase Res. 2003. - 40 (1). - P.l-10.

148. Shimokawa, H. Anti-anginal effect of fasudil, a Rho-kinase inhibitor, in patients with stable effort angina: a multicenter study / H. Shimokawa, K. Hiramori, H. Iinuma, S. Hosoda et al. // J. Cardiovasc Pharmacol.2002.-40(5).-P. 751-761.

149. Shirasawa, Y. Modulation of protein kinase С (PKC)-mediated contraction and the possible role of PKC epsilon in rat mesenteric arteries / Y. Shirasawa, T.J. Rutland, J.L. Young, D.A. Dean et al. // Front Biosci.2003.- 1;8.-P. al33-138.

150. Shum, W.W. Involvement of Rho-kinase in contraction of guinea-pig aorta induced by prostanoid EP3 receptor agonists / W.W. Shum, G.Y. Le, R.L. Jones, A.M. Gurney et al. // Br. J. Pharmacol. 2003. - 139(8). - P. 1449-1461.

151. Smirnov, S.V. Ca2+ currents in single myocytes from human mesenteric arteries: evidence for a physiological role of L-type channels / S.V. Smirnov, PI. Aaronson // J. Physiol. (Lond.). 1992. - 457. - P. 455-475.

152. Small, C. The cytoskeleton of the vertebrate smooth muscle cell / C. Small, H. Gimona // Acta Physiologia Scandinavica. 1998. - V. 164. - P. 341.

153. Solaro, R.J. Myosin light chain phosphatase a Cinderella of cellular signaling / R.J. Solaro // Circ. Res. 2000. - 87. - P. 173-175

154. Somlyo, A.P. Signal transduction and regulation in smooth muscle /

155. A.P. Somlyo, A.V. Somlyo // Nature. 1994. - 372. - P. 231-236.

156. Somlyo, A.P. Signal transduction by G-proteins, Rho-kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II / A.P. Somlyo, A.V, Somlyo//J. Physiol.-2000.-522.-P. 177-185.

157. Sperelakis, N. Properties of calcium channels in cardiac muscle and vascular smooth muscle / N. Sperelakis // Molecular, and Cell Biochem. 1990.-V.99.-P. 97-109.

158. Standley, P.R. Cyclic stretch regulates autocrine IGF-I in vascular smooth muscle cells: implications in vascular hyperplasia / P.R. Standley, T.J. Obards, C.L. Martina // Am J. Physiol. 1999. - 276 (4 Pt 1). - P. E697-705.

159. Steenbergen, J.M. The quantal nature of calcium release to caffeine in single smooth muscle cells results from activation of the sarcoplasmic reticulum Ca2/-ATPase / J.M. Steenbergen, F.S. Fay // J. Biol. Chem. -1996.-271.-P. 1821-1824.

160. Strange, K. Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels / K. Strange, F. Emma, P.S. Jackson // Am. J. Physiol. Cell Physiol. -1996.-270.-P. C711-C730.

161. Stull, J.T. Myosin light chain kinase / J.T. Stull, J.K. Krueger, K.E. Kamm, Z-H. Gao et al. // In Biochemistry of Smooth Muscle Contraction (M. Barany, Ed.). 1996. - P. 119-130.

162. Surks, H.K. Myosin phosphatase-Rho interacting protein. A new member of the myosin phosphatase complex that directly binds RhoA / H.K. Surks, C.T. Richards, M.E. Mendelsohn et al. // J. Biol Chem. 2003. -278(51).-P. 51484-51493.

163. Sward, K. Inhibition of Rho-associated kinase blocks agonist induced Ca2+sensitization of myosin phosphorylation and force in guinea pig ileum / K. Sward, K. Dreja, M.Susnjar, P.Hellstrand, et al. // J. Physiol. -2000.-522.-P. 33-49.

164. Sward, K. The role of RhoA and Rho-associated kinase in vascular smooth muscle contraction / K. Sward, M. Mita, D.P. Wilson, J.T. Deng et al. //

165. Curr Hypertens Rep. 2003. - 5 (1). - P. 66-72.

166. Sweeney, H.L. Regulation of asymmetric smooth muscle myosin II molecules / H.L. Sweeney, L-Q. Chen, K.M. Trybus et al. // J.В iol. Chem. 2000. - 275. - P. 41273-41277.

167. Takeshima, H. Ca2+-induced Ca2+ release in myocytes from dyspedic mice lacking the type-1 ryanodine receptor / H. Takeshima, T. Yamazawa, T. Ike-moto, H. Takekura et al. // EMBO J. 1995. - 14. - P. 2999-3006.

168. Tang, D.D. Downregulation of profilin with antisense oligodeoxynucleo-tides inhibits force development during stimulation of smooth muscle / D.D. Tang, J. Tan // Am J. Physiol Heart Circ Physiol. 2003. - 285(4). - P. H1528- H1536.a i

169. Tani, E. Continuous elevation of intracellular Ca is essential for the development of cerebral vasospasm / E. Tani, T. Matsumoto // Curr. Vase. Pharmacol.-2004.-2(1).- P.13-21.

170. Throckmorton, D.C. Protein kinase С activation during Ca2+-independent vascular smooth muscle contraction / D.C. Throckmorton, C.S. Packer, C.M. Brophy // J. Surg Res. 1998. - 78(1). - P. 48-53.

171. Timasheff, S.N. In vitro assembly of cytoplasmic microtubules / S.N. Timasheff, L.M. Grisham // Ann. Rev. Biohem. 1980 - 49. - P. 565-591.

172. Theurkauf, W.E. / Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated 2 / W.E. Theurkauf, R.B. Vallee // J. Biol. Chem. 1982. - 257. - P. 3284-3290.

173. Toland, H. Ca -activated CI current in sheep lymphatic smooth muscle / H. Toland, K. Mc. Closkey, K. Thornbury et all. //Am. J. Physiol. Cell. Physiol. -2000. -V. 279. P. C1327-C1335.

174. Touyz, R.M. P47phox associates with the cytoskeleton through cortactin in human vascular smooth muscle cells / R.M. Touyz, G. Yao, M.T.

175. Quinn, P.J. Pagano, E.L. Schiffrin // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology.-2005.-25.-P. 512.

176. Trouet, D. Caveolin-1 modulates the activity of the volumeregulated chloride channel / D. Trouet, B. Nilius, A. Jacobs, C. Remacle et al. // J. Physiol, (bond.). 1999. - 520. - P. 113-119.

177. Trouet, D. Inhibition of volume-regulated anion channels by dominant-negative caveolin-1 / D. Trouet, D. Hermans, G. Droogmans, B. Nilius et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - 284. - P. 461-465.

178. Urban, N.H. K+ depolarization induces RhoA kinase translocation to caveolae and Ca sensitization of arterial muscle / N.H. Urban, K.M. Berg, P.H.Ratz // Am J. Physiol Cell Physiol. 2003. - 285(6). - P. С1377-1385.

179. Van Breemen, C. Ca-regulation of vascular smooth muscle / C. Van Breemen, C. Cauvin, A. Jons et al // Federation. Proc. 1986. - V.45. -P. 2746-2751.

180. Wede, O.K. Mechanical function of intermediate filaments in arteries of different size examined using desmin deficient mice / O.K. Wede, M. Lofgren, Z. Li, D. Paulin et al. // J. Physiol. 2002. - 540(3). - P. 941-949.

181. Wier, W.G. Alpha 1-adrenergic signaling mechanisms in contraction of resistance arteries / W.G. Wier, K.G. Morgan // Rev Physiol. Biochem. Pharmacol.-2003.- 150.-P. 91-139.

182. Worth, N.F. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins / N.F. Worth, B.E. Rolfe, J. Song, G.R. Campbell // Cell Motil. Cytoskeleton. -2001.-49(3).-P. 130-145.

183. Wede, O.K. Mechanical function of intermediate filaments in arteries of different size examined using desmin deficient mice / O.K. Wede, M. Lofgren,

184. Z. Li, D. Paulin, A.Arner // J. Physiol. 2002. -540(Pt 3). - P. 941-949.

185. Xiong, Z. Regulation of L-type calcium channels of vascular smooth muscle cells / Z. Xiong, N. Sperelakis // J. Mol. Cell. Cardiol. -1995.-27.-P. 75-91.

186. Yamboliev, I.A. E vidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HSP27 pathway /1.A. Yamboliev, J.C. Hedges, J.L.Mutnick, L.P. Adam et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000. -278(6).-P. H1899-1907.

187. Zhao, G. Trapped water of human erythrocytes and its application in cryopreservation / G. Zhao, L. He, H. Zhang, W. Ding et al. // Biophys. Chem. -2004.-107 (2).-P. 189-195.

188. Zhang, W. Dynamic association between a-actinin and p integrin regulates contraction of canine tracheal smooth muscle / W. Zhang, S. J. Gunst // 2006. Physiology in Press.

189. Zhang, D. Microtubule disruption modulates the Rho-kinase pathway in vascular smooth muscle / D. Zhang, Z. Wang, N. Jin, L. Li, R.A. Rhoades et al. // J. Muscle Res. Cell. Motil. 2001. - 22(2). - P. 193-200.

Информация о работе

Гусакова, Светлана Валерьевна
кандидата биологических наук
Томск, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы