Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль циклического 3,5-аденозинмонофосфата в регуляции экспрессии вирулентности и механизме аттенуации сальмонелл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль циклического 3,5-аденозинмонофосфата в регуляции экспрессии вирулентности и механизме аттенуации сальмонелл"

*

О,

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

БОЙЧЕНКО Марина Николаевна

УДК 579.842.14:577.218:57.053.4

РОЛЬ ЦИКЛИЧЕСКОГО 3,5-АД ЕНОЗИНМОНОФОСФАТЛ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ВИРУЛЕНТНОСТИ И МЕХАНИЗМЕ АТТЕНУАЦИИ САЛЬМОНЕЛЛ

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1992

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И.М.СЫЕНОВА 1 ■——— ■

рггци^у Дд Правах рукописи

БОЙЧЕНКС Марина Николаевна'

Ш 579.842.14:577.218:57.053.4

роль циклического з',51шнозшонмоомта В

решении экспрессии вирулентности и механизме АТГШАШ сальмонелл

03.00.07 - кикройиологкя

Автореферат диссертации на соискание ученой степени, доктора биологических нау*

Москва -.1992

Работа выполнена на кяфедрз ^микробиологи, гггчгиэлогйП 1' вирусологии Московской медищшокр!; аяаясказ ш. Н.Ы, Сеченова _ ' ;

Научный. консультант- действительной член СССР лауреат Госуадрствеппо5 Пркга СССР, пра-фоосо? А..А. .Воройьеа .

0Т)ИШШЛЬК39 оппоненты: . .

1. Доктор ыэаишнскях илук, арз^ессор В.ГДгжсиед

i «

2. Доктор бко.чогачэскнх наук, про1>гссор Г.И.ВйЛЕ

3. Доктор ветарпнаршис каун, пооЪэссор Р.В.Боровгк

I

Вецуезч организация - Сакс^-ПетсрЗургскгЛ.саагтаркб-

-гигиенгчсо1ш£ кеднгонский вкяктут

■ »

Заптята смтоатоп "_с 1532г. с час.

на. заседала Спецкаякэяроианкого Ученого совста Д0?€.05.10 при 1ЬзскоезкоП л!здщ[кок&2' ксгдегла: ее, Е.И.Ссчзсска

( Г.ИоСКЕа, УЛ..В.ПйрОГОЕОЕБД, л.2/6 )

С югоеертадаей мокко огдачоитага в СсЗшявео акетс-

Авторе$ерм разослан в__° 1552г.

Учени! сеирзтарь СяещюлгзграБанкого. Учэкога оогста, к&шшат иадшквокшс нгух • А.В.Мнрокой

'' Дктуальяость проблемы-В настоящее время в экономически развзпнх странах наблглается тенденция роста заболеваемости сальиоггзляезса С Crulckshank J. , 1986, Tonya к., 1988). 3 СССР забояезаляость сальмонеллезсм за пграод о I960 по 1333 г. Бозрасаа.з 7. раз ( ЧерзассззЯ Б.П, с соавторами,1S9I) DjtoaofjirTccFs3 угзрй .ст этого злбояэванял в СССР ежегодно оостпвйягт «5,6 :--зга руб/ эй ( Нзркзвпп ?Л,И, о .соавт.1989), По гквшв ряда агтороэ ( ПснровокяЛ.В.И,, 1933, aasuth a., IS34, Chriatenren j.tXornsr в,, i°85), ооноэ!й)3 арлтаюЯ актлпа-■ш эпщгзсгасхог-о процэос* является алтэно'л^ааиия агазоотк-15сд0г0. 3 спязз о разнтгп2:.э прсглллопггогэ зпвотповодствд гзпюттшэ п птзпз соорздото*тога глосшст сбрззогл л а крупник fjepsex, что 0!ic«c56crs73T раопроотрзпзпия возбудителя ородя Ксзотгзпс, а затея чзрзз продукт;: глтаягтл'арзтз лнтэЛ, Подтоку, как счзгтзз? азтороз ( 3ul?jln У., I933,Oruickihaiik j., I53S ) одяоЗ нз cap прзд7пргял93!гл рлопэточг^огал еалмопел-'лага ори лггаЗ явяяатоя отого зшЗолэв-эгш!

оегдп сглг-схохсзяЗотзеягах зяесткуз. , •

. Щц п^гязетзкз оачьмо'и^мээа . проводятся когшлзко про-тапоэиазеаичэейкя а протасоэ/пзсота'изкпз мропраятлЯ. Од-» ааяо, ах оф5г*4язяос1Ь аозрзотаз?'пра налпчлзз опзцпфачеоиоЯ аро^ндадтагга Длл соада;ш офгакглзпгпг арофплозтя-

. ческа* арзпара?оз к-зобхош-'о чэгисо прадотамзнзз о факторах сатог-зяксота дзучаеиого кякребз, осоденпоотлх мтоРэнеза гагзваомого ю заболээапял я шланга П1!1>7пйог» otsaia.V

- Патогенез сал^-оноялеза' слсший uirorecry-

пенчатнЛ араэдеа," могла аопэага.которогоегп Яз ясны ( Пот-рОЕСкая З.Г., Нарглупа Б.И., IS87). Однако ЗшдаьтатийшП 'ааутряклаточкаЗ еаразятзза яррав?1 сущвств&йную'-

. раяь з раз'гххал .сабелевааала Ьпрздзлязт оогбзаностЬ'шеду- , '•Мпгэта, которая яыяется кс;шшеаш* • в\в$рвов*еазияи?Л;аиа-чгяяем кяато^сго, звона (Collins . 1974/.' вр^п-в" , ■at all, 1933)..Ис2сдя пзхос<Йипоотэ^niiibfanssa зайоле->;загаяу яврвой;еяавюй^.аса"ав« адгаэяярз;Ыр-(!." - <•' Доралыяса йпособазарггсайгд йЕЛЯэгм ,^таз^:&йзиотой обо-i лЬтая-.а-¿яфлцлрэиап'яа paraqitapriit' лш^дтяЦктах'Уэлоа- Тонкого ютавчвяяа^ (

. - 2 - . .. ... перспективными профилактическими препаратами пероральиого \ гшмэнешя являютоя живые вакцины, .сконструированные на основе аттенуировлнных штаммов сальмонелл.

Попытки создания ияактивироьйнных вг.кцин на основе протективных антигенов не игавели к получению эф}>ективных ' препаратов ( Dougea G.et all, 1933, Hackett J., 1990). Имеется несколько направлений исслесонаний, посвященных по. лучению аттенуированных штатов сальмонелл. Известны прян-; ципы аттенуации сальмонелл, направленные на получение й-итаммов сальмонелл к на выделение мутантоЕ, сблацапаих снит генным метаболизмом и ограниченным размножением. К аттену* крзванным н- штаммам сальмонелл относятся к»1Е мутанты, полученные Geraianiar R. { Gdraanler К.,1986, Hone Э. ot all. •1987). Однако они не нашли широкого применения iym профилактики сггльмонелйеза у сельскохозяйственны^ животах вслея-ствие генетической нестабильности, низкой иммуногенности, цлохой сохраняемости в лиофилизированном виде. Наиболее приемлемыми для получения живых вакцин являются мутанты сальмонелл , облакапцйе сбитенным метаболизмом. К ним, в первую очередь, олеДует отнести ыго А,С,Д мутанта сальмонелл,, разработанные Stocker и. (Hotseth A.,Stocker В., 1980,

stocker'п., 1988), и мутанты, облгшапаие устойчивостью к ■ неамину, разработанные Петровской Маракуцей Б.К.

( Петровская В.Г., Маракуша Б>1., 1936,1987 ). Aro А,С,Д мутанты s.typhimuiium и я.dunlin были успешно использованы для иммунизации сельскохозяйственных животных, Однако, применение вакцин, созданных на их основе, требует ряда ограничений в диете. ; ' • ■'

Следует учесть, что мутанты, полученные'с использованием перечисленных выше принципов аттенуаиг.п оляьмонелл, не имеют нарушений в регуляции экспрессии вирулентности и /снижение вирулентности, достигается за счет их пониженного Метаболизма, Являясь Факультативными внутриклеточными паразитами , сальмонелла находятся в тесном взаимодействии с sy-: кариотичсокой клеткой, кал ним фактором регуляции кизнеде- • я«льности которой, таккэ как и. поокариогдческой клетке; ? - я^яетояг ц^личёсквй -З'.ьЦдемозинмонофб^ат ( ц-АМФ )

• - 3 - ■' "■ (8»Л1--ег1ап(1 в., 1972), Анализу роли ц-АМФ в пг.тогенезе различных инфекций, в частности сшгьмонеллеза, в настоящее время уделяется большое внимание. Благодаря работам, проводимым под руководством Покровского В.И.., Пака С.Г., а также 01«пв11а л.¿СЬогр* А.,РеЬегзоа .Т., установлена роль ц-АМФ.в механизме развития диарейного синдрома и иктоксика-. цки при сальмонеллезе, К началу нашей работа, в-1977р. не бы- : ло данных о роли этого циклического нуклеотида в экспрессии вирулентности сальмонелл. Именно поэтому нами были начата исследования по изучению ролл ц-АМФ бактериальной клетки в регуляции экспрессии вирулентности сальмонелл.

Цель и задачи иоолеяования

Цель работа - изучить роль ц-АМФ е регуляции экспрео- . сии вирулентности л аттенуации сальмонелл, получить мута^' ты сальмонелл,-о дефектами в ц-АМФ-регуляторной системе бактериальной клетки, экспериментально обосновать возможность использования этих мутантов в качестве живых вакпин против сальмонеллез'р сельскохозяйственных животных.

.В соотвествии о поставленной целью и работе рэшалиоь олегушие задачи:

. получить оуа, сгр мутанты из вирулентных штаммов ■ '.' сальмонелл.'

- провести.генетическое исоледованке .полученных мутантов ;"■.

- изучить вирулентные, и иммуногенныё свойства получен- ..

. • ных мутантов^ . "Л л . л ;-Ч'., ■

- исследовать в экспэри*лентв еозмсиснос+ь использования,

, суа, сгр мутантов сальмонелл в качестве 'зйвых вавда-'"

: против оальмонеллеза сельскохозяйственных мзотйку'^

■ • ■■ Научная новизна исследования и получениях результатов ".■

Впервые.установлено, что знрулентйость.сйлшонсллУ':;1 ; контрсшруется ц-АМФ-ре гуляторшлг комплексом, опосредбзан-;\>: ним генами оуа и сгр %тахт в гвнэ; оуа',! ззгратамшш адеь'* кялапшхлаэу, приводят к снижению' рирулеНтиротя'сальмонелл,. .уменьшая штотокбичёские. п{х)явления'п0 ртновешй к фагоцитам, ограничивая интенсивность размножения- мгк^боУз';лим- •

фоки ной ткани мысроорганнжга и потная эптеротоксЕГшшув Í активность сальмонелл. 'i

Получены ноаие дашше ъ пользу того, что ссгоа ) ; '

взаимодействия сальмонелл о макрофагйиа как в сиетаиз in «lira, так и в системе la vivo определяется обраткопропораео-нальнсй -зависимостью от внутриклеточной кокцеитргниг a-i^S макрофага, . ■ .; ;

^ доказано, чго секзочх-а, модуле пушве_ Е-.гутрпкязточкаЯ уровань ц-/МЗ макрофага, окезикают существенное июядаа на "; исход оальмоиелгезной кк-Тшшн*. . ' '

Разработан новый метод дттенуашга сплькоиелл, ка осяо- ' во которого подучен сга, орр мутант (сШ \ g.<iu\iUü 160 (С-44), пригодный по своей безвредное^ и пратеитавний ,,: айткшюсти для' использования ,б качестве яивай оряЛькоК вакцины против еллы/.оналлеза молодняка круцного рогатого '; сксте. ,

Тсорзтич-?скор г практическое знзчбнке рчбоуа' . . . i

Полученный оуa, wpe гдутяит ( 0SU. ) s.ckibíjR IGQ (С-44), зачищенный агторокки овадетепьствок I3783S0, ". используется в качэотве jaiBofl орачькой вакцшж в Сглг- , »/.оро^вак телят из штага s.duülin • 160", на ксгеоруы увшрэдены технкчаскио уолоиап ТУ-Ю ЗССР I-4I-SQ От 2G.03.SQ, Вакнина Г1ркис1ш&:г-ся, па тгрркто^ж Зе«о;ши.

ti результате пепельном; кпк вакшшы сэ .стаад» •(S.4ubita " 160 (С-44) на террпjopan' Эошжг оЗссеочокв схабшгзвщм " ' ' эпкзоотичсско!; обстаноЕкг по рячьмонпялез?. ё£0всздчес£&1 ~ ofíer.T составил 10 рублей отдьчз на I рубль мскбккг ( до pc-iofí-J цеп I апрзлп K-í'Ir,).

Разработанный enoocd аттекуещш сшЕшонаы, ..2ЕШзшсгЕ.;; obtqpouek ииушельатео.: к i3s74is, псполь&оьйе esgqc» й31шм Гооудвроувйввдаз 1Ш контра&я &яързвщчаа£ щепарятов для получения .ьакцкккш: ETar¿;.:o2 s.^cmneruc-paiicrus кскользусках ztá- прогзл&ктскк сшлж.сгжзи r/p<

- 5 -.......

. / На- защиту выносятся сведущие положения:

• I. Экспрессия вирулентных свойств сальмонелл: интенсивность размножения в лим$оидной ткани, характер взаимодействия с макрофагами, знтеротоксигепная активность, контролируется геном суа.

2. Мутации в генах суа и Сгр приводят к утрате вирулентности сальмонелл.- ',,■,'

3. Исход сальмонпллезнбй инфекции определяется уровнем внутриклеточной концентрация а-А.'М Фагогатарутриего сальмонеллы макрофага. ...

4. Суд, егр мутанты сальмонелл щяголга для использования в качестве яииог вакцин. орального прзгенения против сальмонэллс-за молодняка крупного рогатого скота.

Апробация работы и публикации

Основные 'положения И результата исследований доложены: ' на 5 Всесоюзной илмунодогическоЯ конфзренцип ( г.Таллгтг, 1382) . .

4 Всесоюзном шлпозиуг/.о по циклическимНуклзотпдач (г.Минск, 1582),"' '..''•.' . .

I Всесоюзной конференция по теоретической :1 прикладной шг-фекпионноЛ яудунологяп ( Москва, 1982 ) I Всесоюзной гианого-отчэтной кои-?ерз;гагл: по направленна-"Генная л клеточная шяенерия" ( Пукпшо-на-Окз, 1390), : на заседаниях Всесоюзного общества г.шробиологоэ. я циоктстоз гизгп И.И.Мечникова'в 1979,.1Э85» 1963 годах. •

По тема дяосертацга опублзкосано 22 печа'гтгх работы, получено 3 авторских свидетельства.

Работа гзпелнено лично автором на каЗедрз ьяпробяояо-' пш, якитзояогяг а етрусолопи:ША ик^И.М.Ссчзноза ...

V! .Структура I! об'^г .тптссертагсга Работа 'пзлодена на

страница:: гашпнопленого текста, л состоит '.та преданы, сбзс-; ра литература, 5 глав собственных пссдекозлня;!, заклетзгош,-' выводов. Ссдергшт 5'0 таблиц?; < 24: .рисуйга,8.(£отографяй. Спи-V сок литератора включает' -360 'источников,-' т |пс: 54 па русскс!.г : языке,.' ' ' '. •.'-

. . , - 6 -Материалы и методы исследования I. Бактериальные шт.чущ В работе использовали следу пйие ; , штаммы: ' .•

1. Etimousllu typhliauriutt 415, прототроф. Выделен в лабо- . ратоши кишгчшх инфэкций в IS60 г. в МНШВС им. И,И.Мечникова.. Получен из музея культур лаборатории знтеральных

i/.e гоцов имцукчзацик ШШВС им. й.И.Мечникова .

2. Salmonella ,typl;lœuriun lŒ-2 прототроф I. 4. Получены

3. Sjleore llu typhimuriua lff-2 , (A20)scysA i из музея

4. Salmonella, typtiiauriua .iJí-2 ' ■ (£84) : суп Ü культур

5.' ЗйЬпопе-Иа typhitauriua Ш-2 агов ' • ИЭМ им.

6. .Simone]la typhirauriwa lÄ-2 , (570): aetA,. . Н.$.Гама-. ilvA.,í>yrü,aialA.,trpB,lilsF,xyl ,греЬ . Л6Я

•7, ¡jdiaonellti dublin C-96: никотиновая кислота>(5QiîKr/wi)

Выделен от больного телояка п Эстонском КЖ животноводства

i

и ветеринария :

6, üschsriohitt coli LEG . 853; r-,trp¿ü,purC,rpbIi

à cya/cye .i'íü-4 Гибридная нлазмидй рга-4 содержит ген аден'лнаишлази, цетермянируший синтез г-Ш? ( Гсльцмай-ер Т,А...,Гйрщзноы1ч В.Н.,1986).Любса.чо прелосмглен-автораш лчазмиды.

9.' Çacherichic. coli " ' к 120- trp.tUyA. ( ß 2^5/tctr ) Штамм содержит конъкгативную лл.^змиду 245. Получен из музея культур И SM им. Н.Ф.Гамалел.

10. 1>эголиэат Pg2 . . Получены из музея культур

11. Фаголизат Pog (in 10) И ЗМ им. Н.Ф.Гауалея ;

2, Пкгатеяьчно с рады г. химичзскио пз активы В работе ис польза паля сухой агар, пептон, триптон, казаминовиь кислоты, ; ьгар t¿o Qonhoy , фирмы"Uiíco" , 'Антибиотическую срезу .42 агар Kîuffitmril , агар Симмонса, Фирмы •• Merl: " . Циклический 3,5-аиенозшимонофосфат, <иош "Fluku" и» Serva " Цсклкческпй З^б-гуакозкпконоЪосфат, фкрьи " Sarve 2 . Углеводы, фирм , " lícrk " , аишокп слоты, ф-ирты '« Reama " В качестве ;лутагона использовали китрозокетилмочевнцу, про-пзрот, скнтезкровашшЯ а Институте химической физики АН СССР, Для-прлгэтовлэнкя буферов, солевых концентратов, ецшпщллято-

ров использовали неорганические соли и реактива отечественного производства.

3. Лабораторные тавотные В экспериментах были использованы: мыши б°лые беспородные, массой тела 12-14г .•

шпт белые беспородные, массой .теле 13-гОг

шоп:, линия СБА, массой, тела 12-14г

кролики породи шинтлла, wacooîi тела 2-2,5 кг. .

телята крупного рогатого скота эстонской красной порот в

возрасте от 3 дней до 3 недель.

4. Определение вирулгнтноста ляучае'дых к;гяьт/'р проводили по вычисления ЛДсд lia белых беопорэдкых уыыах, массой 12-14г " .

5. , Определение пммуногс-к-гнх свойств изучлокнх ;'ульт/р проводила в опытах активной защиту, вычисляя-ЕД^д, на белых, беспородных шпюх, массоП 12-14г. ЕД5д л ЛДг^ вычисляли по Вэндер-Ваидеру'( Агама рии K.U., Воробьев А.Л.,1Э82).

6. Определение пзрспстсшшп сальмонелл з ляг/фатической тяпни проводили путем высева гомэгонатов сэлеяснгга,' 'ввделегшоП . из зарааеяпнх мишеЗ, на агар .Xauffnaimi зйо.Сопкеу' . Ре- . зультатп выражали »толем кЬлоняеобрйзугатх едшгац (КОЕ) на орган. - ...,'•

7. Эктерототгоигснцую активность язу.чп-згзх п^кмов 'оаяклопел.т определяли на изолированно!! петле топкого кяиечияха кролика ( Gianella lt., . 1975). / ' ;

3. Получение ямуяпих. сывороток :? олродалеггле титра 0-.;ш?;!--тел в РНГЛ проводили ейомряшмакя иохоцазга. ! •

9.' Определение .количества Т-лтг^ооятоп з кроет г/ояодпяка .• крупного. рогатого скота • oôjrae отвляля. по «зтоду ( Суро--: ■ вас З.М. ,1570)' У

10. Задеяаипе í-taitpafaran селепепгл п пориопэалья'&^Ь ;оксбу~ • . дата кипой псоводкля адгезией на плавтпяе' по ( i1. •

I98Ô)... .'.';'..''■.; '...:•'.''. ' ' . ' .. "'

11. Фапшгардуп активность Maxpáíaron з сг-тег» ^ 7ièrà зсслеловалп'.по. методу ( Степанова Л.К., Белая Ю.А. ,1977)'-', определяя фагоштарнуо"'активность''(ФА) фагошструщих-кдоток, цатояатячэское'действие (;Ш1Д ) % :разрупеянгс • клеток, фагоцатарное чяолв ( ЭТ ) -.среднесг Число мздроЛах

!

тел, приходящихся ла один макрофаг, . .

12. Экстракцию ц-АЫФ из и&лрофагов проводили ТХУ по-ме-' \ тоду ( Подопригора Г .И., Абакумова О.Ю;, Т976 ). . .

13. Экстракцию ц-AM'J из бактериальна! клеток проводили 2JP KCl па методу ( Peterkofaky A.,Uus<lur С.,1974).

14.'Определение содержания ц-АМФ в-экстрактах из макрофа— гельких и бактериальных клеток проводили методом ргщиоим-мунного анализа с помощыг о-Ш> asaay kit фирмы rimershMi" , Англ/я. Результат выражали в пико М ц-А1№ на ;. 1 вео или количество клеток,

15; Мутагенез проводили поAdeiberg i. Конъюгацию,.транс- '. дукцию проводили общепринятыми методами ( Клаус Р., Хейо 7.,' 1970). ... _ ;

Результчты исследований и обсуждение ' Для установления роли ц-ЛМ$ в регуляции экспрессии вирулентности сальмонелл были получены мутанты'сальмонелл, имеющие дефект з генчх, детерминирующих синтез аленилат- ' циклазы, оуь, и ц-АЬЙ-реиепторног.0 белка, сгр (рис.1 ). Для выделения этих мутантов была разработана схема селекции, которая позволяет получать суа и сгр мутанта, образованные как в результате химического ¡мутагенеза, так и в результате инсзрции транспозоном.

В основу селекции была 'положена неспособность суа и сгр ц/тактов сальмонелл утилизировать цитрат и ряд катабо-личеоки чувстьг.тэльных Сахаров: рамнозы, мальтозы, манкозы при сохранении способности утилизировать глюкозу, и ДЕукрат-*-ное увеличение по сравнению о.родительским штампом устойчи-' вости к отрептомицику (botsford 3., 1981). , .

С использованием данной схемы селекции были получены; мутанты, представленные в таблице I, Все полученные мутанты снизила свою вирулентность пс сравнению с исходными роди-телгскими .штаммами. / •■ '

. ";. Д|Ш доказательства роля ц-AMS и участия гена суа в регуляции экспросоии' барулэнтнбсти сальмонелл.нам был. предпринят подход реиения теьромы от обратного: во-порвых, в мутант / S.typ^iautluäV.'В-24^'.;о;фонотвпом СУА," была введена шгаэык-''' ■¿а.детергашрувдая, синтезво-вторых, из;

СХЕМА СЕЛЕКЦИЯ суа.сгр МУТАНТОВ САЛЬМОНЕЛЛ

, I sran « , С5РАБОТХА МУТАГЕНОМ.

Н irán i ПССЕЗ ПЛ С?ЕЛУ N 1

(сргдз Н 1! тгтразоляЕ!^! :lv.i íícCcrccy пгз;). соггрззпуте J54 рагятзн, 1% юлЫозм , стрсгггсткяшн ® жвпцгпрлияз 3Í.1IIX ■ зириср трансмозснз.)

, Ш этап « ОТЕОР.САХЛГОНЕГА'ПИШЫХ КОЛДОШШ. '

- . п •

IV изп i ПШВЩШШШОгОВ ОГОГАЩЕННЕ ИЛ МШП1МАЛЫ|0П ЦНТРЛТПОП

■. • СРЕДЕ.' >' ■

V згзИ i ПОСЕВ НЛ СРЕДУ N I. • '' •

VI этап i ОТСЕВ САХАРОНГ.ГЛТИППЫХ КОЛОНИЯ НА ГЛЮДЮЗОМШШМАЛЫШП

. АГАР , МИНИМАЛЬНЫ!) ЦИТРАТШ-М ЛГЛ!>, '.ППШМЛЛКПЛП ДПТРЛТШ ?Й / •'*. АГАР С ЯОПАШ1ЕШ1ЕМ I '»« пХЬЮ.'''

VII этап i ОТБОР МУТАНТОВ t

ФЕНОТИП. РОСТ !-•■■•.'■' ОТСУТСТВИЕ РОСГЛ

с va ' ':'' v 1 глгохоззмшшнальимП 1 ■ г' .а? г 2 мнинмалыш;! цнтртггпгЛ агар+ !1ЛМФ мшшгпльицй цитрлтииЛ '....Г--.-

СПР ■. V '■•л .......•..•...: м'шшмальпмА цитратигш а г я 3. Р мишшальппЛ цптрзгимп агар+'длм'э;

И с X 0 Д'Н Ы Й ШТАММ ФЕНОТИП МУТАНТ . ФЕНОТИП

S. typhlmurium LT-2 ДИКИЙ S. typhlmurium D-13 CYA

S. typhlmurium 41S ДИКИЙ S. typhlmurium B-S. CRP

S. typhlmurium B-24 CYÁ

Vv' ' '' '. ' S. ' typhlmurium 14(2) CYA ILV

V' S. typhlmurium 21 CYA+ILV+

S.dùblin C-96 ; ДИКИЙ . S.dublin C-44(160) CS M

- .' - 11 -

деривата этого мутанта в.йурЫтиг1шп 14(2) бил получен изогенный штамм, который одноыоментно с восстановлением прототрофности по изолейиинвалину приобрел, дикий Генотип С7А+,з^урЬ1ииг1ия 21. Получение изогентого штамма Трансакцией (Гагом Р22 показало, что мутация, опосредующая СУА фенотип У 3^урЫтаг1ип В-24 ПБ^урМтиг1иа 14(2) котрансдуцируется о лок}оом 11т с частотой и оогласно генетической карте 8^урЫвиг1иа (рио.1) ямяется оуа адутатшей.

У гибридного штамма Б^урЫтиг1ип В-24/Р'ГС-4 . и у изогенного штамма в^урЬ1шиг1иа 21 ( суд" 11у+) произошло восстановление вирулентности: ЛД^д при внутрЕбрипип-Ном введении уменьшилось, соответственно до 2,5 х 10 и-7,9 х Ю^, тогда как у суа кутгнта 0^урь1виг1ит В-24-;: его деривата величина этого параметр равнялась

3,9 х 10® й 2,5 х 10 . Этот факт, хотя и доказал, что снижение вирулентности у суа мутанта fl.typhiauri.ua . .. В-24 п его 11?" деривата 3^урЫшцг1ип 14(2^ опосредовано Мутацией в гене суа, но.но давал, возможности ответить на вопрос, что ,?.е является яотянной причиной сшкения вирулентности: изменение абсолютного внутриклеточного уровня Ц-АМ5, как основного фенотигагческого проявления стации в гене суа ( Рег1аап п:,РааЪэл 1.» 1969), пли нарушение нормального функционирования комплекса, ц-ШЗ-ц-АМФ-рацеп-торного белка ( ц-АМ5-ЦРБ ). С этой целью бнло гТровздено .сравнительное.исследование внутриклеточного уровня ц-АМЭ в бактериальных штаммах клинического п лабораторного происхождения й их мутантов, о фенотипе!® СУА пин? Ре-зультата-представлеш п таблице 2, из данных которой'итно заключить, что абсолютный уровень ц-АМЭ.з бактериально:! ' Клетке но определяет степень экспрессии, вирулвнтностп. Так , как уровень ц-АШ> в бактериальной клетке зависит от условии культивирования:Я стадий .роста ( ЕерЬаоН А.,Ва1ег ,1. ¿1980) можно заключить, что каждый штамм" смеет .'свой характерный, ' вргсухий уровень внутриклеточного ц-ЛМС,' кйк показатель метаболиз?ла данного птамма, при котором полноценно работает комплекс ц-АМЗ-ЦРБ, осущейтвляя регуляцию экспрессии Катабо- ■

■ - 12" '. ■ ■■- — таблица 2

Соотношение внутриклеточного уровня и вирулентности

бактериальных культур

«■•■«п. i ■ m ■■ни»!« ■■»■i ni ш■ i

ШГШ ! ФЕНОТИП ! УРОВЕНЬ ц-АЫФ в ! дд_ •.

! !гшкоМ/2 xIO^XÓEi"""

13.typhlmurium 415!£ЩИЙ ! 224 + 5,5 ! 1,2 х 1СГ

a.typriimuriumfi_24! СУА ! 51 + 4,4 ! 3,9 х Ю6

a.typhimuriueiB-5 ! СЙР 1 502 ¿ 17,0 I 7,S х Ю7

S.typhiaurium 1Л2 ! ДИКИЙ ! 527 + 3,7 Í ï,0 X Ю5

a. typhlmuriumД-131 ' СУА t 150 + 14,0' ! 1,2 х Ю6-

литчувствителышх генов. Из этого следует, что абсолютный.. ; уровень ц-АШ в бактериальной клетке сальмонелл.не определяет' экспреостр вирулентности, a экспрессии вирулентности определяет полноценное фунйцЕсдаадькое состояние комплекса Ц-АМЫ1РБ, Это предположение доказывает факт понижения ькру-леитности у мутанта и.typhlmurium В-5, о фенотипом СЕР внутршлеточгаИ уровень ц-АМФ у которого в.два раза превшаа-еттаковой у ^сходного вирулентного-штамма s.typhimuriuai 415, а вирулентность этого мутанта по сравнении с родительским снике на в 100 тысяч раз i Следовательно, стжешс виру-, лен'тности у суа мутантов a.typUiBuriuni является следствием нарушения нереального функпмонировшпш комплекса ц-АМФ-ЦРБ.

Для изучения ншчинн снижения вирулентности у суа iíy-' тактов u.typhimurlujü . било проведено исследований их ии- , сазивной активности, т.е. способности после перорального инфицирования шаей'проникать и разиисшаться ь па ренте раль-ной лимйовдней вдали (селезенке: ), энтеротоксигенной активности и характер фагонетоза п культуре макрофагов in vitro ; Проьедошшв 3::cnc{>;;¡.',cuttí показали, что мутация в reno суа не ишлст на cnoso&to&t). салшснслл после перорнльного. ш'ЛтлдароЕатш прадщкатз, ri раздаваться в селезенке ( ркс.2). Однако характер разинсс&кия щгпктов и селезенке отличается от такового у исходного рзхап-ельсиого .шташа. Если суа ь'^г— ïuitï, a»typhimuriua Н-24, Сто llv" дерЛЕЗ?в G.typhiauri- .

ад ' 14(8) « уутапг,-' е феиояьаоа ООА» ,ü.i^pUimuriua В-5, начиюат tíiüeubítcü es coíiosetauí па 6 суткн в количества

' ПЕРСНСТЕНЦИЯ КУЛЬТУР СЯЛЬМОНЕЛ В СЕЛЕЗЕНКЕ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ЗАРЯЖЕНИЯ

ДОЗОЙ Юмлн.м.т.

10-20 КОЕ, максимально накапливало! в органе на 15 сутки в ■ концентрации, равной 1,2 + 0,73 х Ю4 КОЕ для В.ЪурМши-пиш В-24, 3,2 + 0,4 х 104 КСЕ'и 4,3 + 0,6 х Ю4. КОЕ для ; а.Ьури1шиг1ивд 14(2) и 3.1;урЬ1тих1и1!1 В_5, соответственно, п прекращая высеваться к 21 суткам после инфицирования, то исходный вирулентный штамк- о.£урЬ1тиг1ил 415, изо-гешшй-по локусу оуа 3.^рЫшиг1ип 21 (суа+) к гибридный штвш ¿^урЬ1иц.'.г1ит и-г^/рхъ-ч неограниченно разшоЕались в органе после заражения той Ее лозой, равной-10 . микробных тал, начиная виоеваться из селезенки на-3-4 сутки, достигая к ЮЛЗ суткам концентрации 10 КСЕ, при которой наступала гибель юшотных, Т.е. комплекс ц-АМа'-ЦРБ по контролирует процесс инвазии сальмонелл лимфоидиой ткани, а .ограничивает ; интенсивность размножения в ней. • . «

• Исследование эиторотоксигаииой активности изучаемых .. шташов показало, .что су а' вдгтапт ь.«урЬ1тиг1иш В-24 по вызывал выпота,жидкости и геморрагических поргшениЗ отенки кишечника пр! введении в изолированную петлю тонкого кишечника кролика в концентрациях' кН - 10микр.тсд. Инъекция исходного штата з.гурЫкиг1ид 4X15 в тех не дозах визина-ла выпот кздкоотп и сильные геморрагии стопки кишечника. Аналогичные результата были получены при проведении зкепери-. ментов с иэогенной по локусу суа пари - штаммов: оЛгрЫдаггиш 14(2) суа" и ь^урШвиг1шй 21'(суа+), что показывает, что ген суа контролирует экспрессию знтеротоксигекности у сальмонелл, аналогично таковому факту, отмечониоыу у \Г.е1ю1егс.с

( Хокойи :Г.,Кии£Ьага'С,, 1974)..

Исследование влияния■суа гена иа взаимодействие саль-., конелл с культурой «лакрофагов в системе 1п-/и-го доказало, что г^тация в суа гене не влияет.па фагоцитоз и размножение сальмонелл в макрофаге ( рас. 3 ).. Однако в отличие от штаглчов, обладающих аллелей суа4" дикого типа, З^урШпиг!-

иш 415 к 3.1-урЫшиг1ша 21, у которых размножение внутри макро^шга сопровождается разрушением последних, т.е. шряхепним ЦПД. У суа мутантов процесс размножения сальмонелл, в макрофаге не вызывает шракеннорэ разрушения последних, сопровождается незначительный -.¿проходящим ЦЦП."

ПОКАЗАТЕЛИ ФАГОЦИТОЗА ■. ХУЛЬТУРЫ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ

МАКРОФАГОВ МЬШ ЕЙ ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ ХУЛЬТУР

S.typhlmurlum 415 , S.typhlmurlum В-?-! , S.typhlmurluin 8-2-1/pTG--1 S.lyphlmürlum 11(2) , S.typhlmurlum 21.

■ А ряс.З

"> ä 4 6 ?7 & 24 • . -время Фагоцитоза — O.tjyphinurlua 'Я5 , «s» • 3 i byphlimrlua

"" r>

;I00 ■ 80' . .60 : 40 20 i

-f

'20 15

V4

-2-?-■ V ...;•'„;,

: врэг/л '|aröicifo3o ( час ); . ~ *I'l-(2) сух*'

^Vtyy.'jiiKuSian 21 07Й

не 128 188

РИ

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЦЙМФ В КУЛЬТУРЕ ПЕРИТОНЕЯЛЬНЫХ НЙКР01ЙГ08 В ПРОЦЕССЕ ФАГОЦИТОЗА Х.«урЬ1миг1ин 415а$ДурК1миг1ии В-24

рио.4

А

6В 18

га

2 4

время фагоцитоза (чао )

алзрыаии'1ит " контроль б.йурЫвиг^иш В-24 • ; ,

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ цАМФ В МАКРОФАГАХ СЕЛЕЗЕНКИ НЬШЕЙ I ПРОЦЕССЕ САМИЕЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

. ¿зв пМОф ; ,Т! . • •

21)

13) -

1«!

5)

'4 5 7 8 срок после заражения шми>

—1 14

ш

1 8.:£урЫдщв1шй 1-15 В;^рЬ1шиг1иа: В-24- + - контроль

"ЦгтолчтическиЯ э^Тект сальмонелл на млкроТ>агп спязысакт о 5ПС лпс: ( Peavy 2. at all, 197?), поэтому било проверено сравнение показателей Фагоцитоза гретых культур штамма зико-то та las. typhliuiu-ho 415 п его суа мутанта d, fcypiiiaur lúa В-24. Как показали результат!: ясслецозлн73, фагоцитоз гретых культур обеях атасов проте;<?л огсннакого: в течение 5 часов, ,ШШ отсутсгвозяло,- Черз: 4 часа farotnrnna ~Л 'зти.гла дикого типа раз!гялось 2,2 + 0,07, а у его суа :дутанта - 2,2 + 0,10. 3. дальнеteca прсзеходпло переБярлвз'гпо 'лпробсз. Зтя результата позволили предположить, что в процессе фагоцитоза исходный вирулентный итпглм и его суа кутан? по разному ¡жлет На бактерицидные своЯствл макрофага. Так как дзвзстяо, что я-АНФ в оЙратАо-пропорционггьной зависимости йлилет на бпа-терпцкднув актапность макрофага { Lohasyeí J., Johnston г:л„ 1978), было исследовано внутриклеточное изменение уровня 3-AHJ в. культура'кегрофагоэ. in v.itro я в макросах селезенки в процесса сальмонеллезноП imíe¡:inni( шзалшоЛ а.тзи.!сгл дикого тика3.typhlauriua 415 п его суа: ¡т/тгштои a.typhJ-:ijrlun В-24,- йсспара;енти показали ( рис. АХ ), что в процессе Фагоцитоза ii.typhlaurlua * происходи'? ярахогшцзе увеличена уровня ц-А-0 з yaKpcJarai в тзчэниэ ог СО жнут До 2 чз-аоз Фагчжятоза, Которое нз зягяся? о? шгр/лзкткоао езлшо-йелл. ÍaroiuíC3 пгрулейтного птогсла дикого типа, ü.byphinnriu-. 415 сизазае-г также эторатнеэ увеличение усозня t^-ass через 4 naca-farosaícsi* йсследбваЕйэзсуэкзк-я онутрийлзтотног i уровня а-ДШ в вдрофага^ .с'глз.ззнгл ара зарглзнип israrafl Ь^трнбргклнко догсЯ ít íoispcd ,т?л a ,ty?>J.~-xv , '415 и TiVj-*-

nc>-a£iura:'(:pó, •i3.j.> что ^¡»зэиха-Ш з séx^&ÍSI . casésaata- зёеззд&г з' йргсоярспз^зшязлой. зззг-рзгеата 'зз'гярулэдмсзЬ лззЗудатэлл. Зг^яоксггиз аоррз» ялру.ег а затвпеягиоотьа 1»змнсхй1Е!Я ззрУлзп-зногб• а,^урй1ааяса' •■.-115, прздэдздажм' за&м- я»5ая1Ш*:'Лз' зго-ro eAexfsii: что зтаглом.

длкого ,т Jita, виутрз.^зточизй; зощгктрацгг!; ii-^'í') май pojara' afomoxsxii попггэпав'ах'бгктзрпшлоЗ литяЕ-Узсга п.как следстляз - нзограпячзпяоз. вогйудптзл/и

- 18 - г.

То, что внутриклеточный уровень ц-АМФ макрофагов селезенки и перитонеальных регулирует размножение сальмонелл, показали .1 эксперименты по изучению влияния препаратов, модулирующих; ; внутриклеточный уровень ц-АШ на течение сальмонеллезной ' ' инфекции у 1/ышей, Введение мышам адреналина ( 2мг/кг ). \ ; ( Атаудлаханов Р.И., ТСочина И.О., 1985 ), повышающего внутриклеточный уровень уровень ц-амф в перитонеальных макрофагах с 62,0 + 6%,3 пикоМ/Ю клеток до 217,3. + .2,6 пикоМ/106кле-ток, а в макрофагах'селезенки с 51,8 + 1,1 до 96,0 + 2,3.С ' пикоМ/Ю клеток приводило к потенциированио инфекют, вып званной ведтрибргаинным введением а.аиЫ1п С-96 в дозе „у 10 микроб.тел и ускорению внутриклеточного размножения сальмонелл в селезенке ( рио;5 А ). Введение мышам троекратт но обзицана, в дозе 10 мг/кг ( Глазман О.М, о соавтор.,1983) приводило к понижению уровня ц-амф в макрофагах селезенки , о 51,8 + 1,1 пикоМ/Ю6 клёток до 34,0 + 4,'3 пиноМ/106клеток, а. в перитонейчьных макрофагах с 62,0 + 6,6 пикоМ/Ю6 клеток; до,35,0 + IпиксМ/ 10 клеток. При атом происходило торможение размножения в.аиЪИп С-96 з оелезенке мышей после , „-• яероарльного заражения дозой 10 микроб.тел ( рис.5 Б ).

■ Неспособность оуа мутантов 8.^рЬ1тиг1ит отимулиро--ваТ$ увеличение внутриклеточного уровня ц-АМФ макрофага, ■ который поникает его бактерицидные функции, по-видимому ; ■ > позволяет этим мутантам находиться более длительный срок ; V в фагоците, не оказывая цитопатического эффекта. ' V

,л Отсутствие повышения уровня ц-АМ в макрофагах селе- ' .зенки в процессе сальмонелле зной инфекции у мышей, "вызванной суа мутантом 8ЛурМаиг1ша , позволяет объяснить . особенность ограниченной персистенции этих мутантор в ' ^ органе в течение инфекции. Учитывая данные о том, что функ-. циональная активность некоторых органов,.в частности печени в селезенки ( 8сеуо:ив.^ «ах, 1980) определяется со^ держанием в я их циклшчэских нуклеотидов, можно предположить, что увзлкчение концентрации ц-АМФ в макрофаг&х се-лазейки при инфицировании мышей вирулентным штамме«: а,«}рь1ои.г1иа ; приводит к диофункции макроЬагов. Это в свою очередь, как отмечено ( $,,«1; ,1980), (

Иомт отрицательно.влиять на лим$окдные клетки и Форьшро-,

ВЛИЯНИЕ цАМФ , АДРЕНАЛИНА "оБЗЦДАНА НА РАЗМНОЖ ЕНИЕ Э^иЬИп С-96 В СЕЛЕЗЕНКЕ -

МЫШЕЙ.

/ - 20 - ' •'■■■'-•';■•". i ■ вание резиотентности. Б случае инфекции, сзшишой суа ; ь'у i а мт oti S. typhi Euiriua не происходит oTofctoPo повизеиия : ; уровня ii-AMI в макрофагах селезенки, при этой не сга&аьгся1 их Функциональная активность, а в результате отсутствуем ; неограниченное раэккакение оалыиопелл и гекарелкзацнн ин- . (Т-екштг. Как известно, только те шташн сальеокелх, которые обладают способностью перскстнрошть в тканях и устаиваю;-1 вать латоятцус инфекцию, способки индуцировать эфТ<ег«-ивш:8 шинный ответ ( ОЬШм ?Д9?4, ЕогвлесЫ. С.,et ti.ДSSI). Поэтому били исследованы ктуногенные свойства суа tyvaHfóe' в, typhimuriua - к роль суа гена в регуляцча .экапресскь о протектавпых свойств O.typhimiriua. ;. % :

Для определения .влияния дефекта в суь гбпе ,к& стшц,'-.' ля даю выработки 0-актктел била проведена г-йаер^згнЕэация =. кроликов живыми культураш птагллов, шепцзд суа иутацквг, E.typhiaairiun В-24 е S.typtatnurlue 44(2), с такге . штлг.'гок дикого типа fi.typhiiwiriua 415 t езсгькке: по,"! локусу суа гатакмоц E.typhiburiuc ,21 (суа+). Qnpexezeeaft в полученпих антпоывороткЕХ- титра ¿ " IOTA.; ,

показало, чтр титр всех аитасиворотог равняйся 1:5120, es— зависимо от кгаша, кспользуекого для югг.тукизащ'.к. Из отех результатов южно сделать эанлвчзние, что дефект в суа гене 'не влияет рй способность S.typhlamriua 'стн^ршровать образование 0-гштите'л. Для подтверддепкя syopo предполо- • не пет была изучена в опыте актявпоВ завить! протектавнзя ¿ ■ активность гретых культур, изогеккой.по лекуо? с»a п^ргг¡ ; nrraw:0B:S.typbiauriuÄ liiZ) (cya~) E e.typhimuíiua *'■ j. - , 21 (суд-1), . ' ' - ■

Проведенные эксперименты показали, что cía птан^а í j обладает протективиой активпоогьп, загадал csafl os ысспе-ртаоптшгьпой сн1е'кщж, вызванной внутрЕбрезадпл.! звадениса s.t'yphimuriua 415 в дозе- 100 DOL , ЕД^р гретой культура ß.typhlouriwa IfiCS) равнялась х Iü7 ¿ 0,85 , '

а £, typhlE'jríui 21 - 2,2 х + 0,8?.. Учитывая, ЧТО' 1:Ы~

1<7иитет np'í' осльконоллезо кооигекопнб, ведуда: компонентой Roioporo яьляоуоя клеточной иммунитет, предстаглеякнй ск- • с»:Е1!рои£1П«га макрофагам ( Обгодш A.A., Тсцчетнкк Ю.Я., 1С?''), бкль поолеЕ.овЕнь способпость оуа кутайта

• -21 - ■ в.*урЬ1гиг1иэ В-24 форкагровать про ЕьаогнкзаЦЕИ швей популяции активированных какрсфагов. Предварительно в опитах актсзкой запиты была установлено, что пероралькая ияууниза-цея взаюй а.typhiEuri.ua В-24 запоздала еивотшх от эксне-реканталытой кнфекшз», вызванной ЕкутрЕбрсктны» введение» $.1урЫсиг1из 415 в доза 10 ОСЬ , ЕД^ 3^урЫ«цг1иа В-24 равнялась 1,4 х 10 + 0,9-. Кдаутезахщя писай З.^р111гаиг1-шс В-24 прЕБОдзга к формирование популяция с&рсфагов, но-торйа в культуре клеток 1п гжЬго ограничивала размножение вирулентного штакма 3.typSiisan.ua 415 и; противостояли про-явленсв ег-о тйеязткчесяою с^зкта ( таблица 3 ). . ' ' тг)(1лиш>3

Пспазатзлп фзгсццтоза вирулентного Ета1*ыа Б.ЬурЫща-т,;- Пия 415 культуреЛ пере:окбйлызс: е^рр$агов, по-

лучгкнш от ькгзК, проиг^^ок ронянных суа кутавтом' \ з^рМсиг1ив В~2£ дозой 5 г 10 какроб.тел

Бреш ! Псказ/п-ела <f nroimrosa

фагоцитоза| 1Щ ! И ' .

i ? час ! 5 ♦ 1,23 : | 3,25 + 0,70

4 чао ! . 7 + 1,76 . ! - 6,55 + 0,43 ; • : ' í ' 1

; G чао ! G i 1.S0 t 13,20 + 0,47

4 7 чао 1 5 + 0,28 l 8,30 + 0,90 ' * 7

V Сроки очгйапия кмг.7нкога ергапязка от вогЗудктеля . вксперпиентальдоЯ ЕНЯевдг'Езучаги прп ЕпутркЗрггшшоЯ кк-куназацкг кигей s.typhicuriua В-24 дозой 10"* ыккроб:гел (100 Е%д). Чзрза 14 суток аоелг падугазэикя проЕЭводага гнрицнровакне {¿уунззпровзнннх виезтянх ЕнутркЗрггяннци введениэк исходного« стам^а S.typhiruriun 4IS в дозе 1о\сикроб.тел (. BOL ). Для изучения с ролов елкклнацга возбудителя и:гренцди s.typhinuriuií 415 es epr-ангзка км-' цуннух кашей, ^эгеяатн селеэекок, печзки, легких, почек, содереи«ой ?,елчкого'пузыря шеевадй на нитратный агар Сиы-ионса, на котором суа мутант не растет и окраски не изменяет. Эксперименты показали, что штемк S.typhimufdu-ís 415 начинал высеваться из органов па тротьи сутки посяе икфи-

пирования и поодолжал высеваться в течение. 7 суток. На 8 сутки все исследуемые органы были свободны от воэбу- ! дителя.

На основании этих данных была оформулирована гипотеза объяснчпцая причину -снижения .вирулентности у суа мутантов сальмонелл, суть которой сводятся к следушему.

При заражении животных вирулентным штаммом дикого типа вследствие наличия у него фактора эятеротоксигеннооти, происходит повышение внутриклеточной концентрации ц-АМФ в поглотивших его макрофагах, в результате понижается бак. терицидная активнооть последних» что ведет к неограниченному размножению микроба, приводящему к разрушению макрофага, накоплению сальмонелл в организме и развитию интоксикации. Происходит накопление необходимо уровня ЛПС, ко. то{ый запускает " каскад арахшшновой кислоты " ( Пак С,Г» о соавт.,1984), в результате чего.синтезируются проота-гландины которые -ингибируют иммунный ответ ( Ме-

ду ницин Н.В., о соавт.,1900), тем самым способствуя генерализации процесса.': . .

В олучае инф^кщм, вызванной суа мутантом сальмонелл, при попадания'последнего в макрофаги, не проиохсдит уве-7 лечения их внутриклеточной .концентрации ц-АМФ, и как • Следствий - понижения их бактертлдной ^активности, что : приводит к ограниченному размножению микроба п фагоците; . и более длительному пребывание в нем/ Пврсиствнпия оуа . •' мутантов в макрофа гах отимулирует формирование иммунного ответа. Поэтому в случае прорыва?ма-.рофагального барьера, ' микробы должна элиминироваться к:мпонентамиикму'!ного ют- ^ вета. Необходимого для запуска *каоквда арахвдоноэоЯ лоты" уровня ЛПС не накашгавается» .'"...';•.' ч

'."'.: Для оценки возмакности использования мутантов сальыо-■ у не;л, о дефектами в генах, опооредугаих оистему регуляции : ' бактериальной клетки при помощи д-АМФ-Ц-АКФ-рецепторного ■ т белка, суа, сгр /, в качестве ва:<пинных/штаммов был-получен • VдбоЯной кутант с^а, сур на эотзойтэтейкогр: дадоявотного(\ штамма з.аиьид\ С-96 - в.аиьш' С-44С160). V; • -'•^КУ ':. .Полученный мутант в.аиЬИп г (М4(160) по своим биохимическим характеристикам обладал сз\1 . Генотипом (суп-

еосией фенотитаческого проявления суа мутации ). Супрессия ыражалась гиперчувствительностью к экзогенному ц-АМ1> и пособностью восстанавливать цикий фенотип добавлением мЫ п-Ш5. Добавление к культуре S.dublln С-44 (150), астущей в жидкой минимально!! цлтартной среде I мМ ц-АГЛФ риводило к удлинению до 3 часов las-^фазы, которая в тсутствии ц-АМФ равнялась I часу ( рис. в ). Добавление Ш ц-ГМФ восстанавливало скооэсть размножения s.duhlin —44(160) -в жидкой митмальной среде до уровня размножения сходного штамма, s.dublln С-96 в этой среде. Ц-Г1Ю в кон-ентрации I мМ'восстанавливал также способность s.dublln -44(160) утилизировать рамнозу, как единственный источник глерода» Данное свойства не восстанавливалось этим пякло-уклеотидом у суа иутанта s.typtiimurlun B-J4. У s.dublln С-44(160) была также выявлена ауксотрофнооть по аминэ-ислотд цистеяну.

Основными критериями для сет (суа, сгр» ) мутантов s.coll являлись: I. фенотипическая реварсия фенотипа СУА дикому типу; 2. гипсрчувствательность к экзогенному ц-АМ5; . сохранение суа мутации ( Meitan ты. et *и. Поэто-у для получения генетической характеристики уутанта s.dub-

lln С—44(160) необходимо было установить: . "/■ •V -наличие суа мутации - V-..

- наличие мутации в сгр локуое, которая супресскрует, 7А. фенотип и делает м/тант гшперчувствптельным к окзоген-оку ц-AMS пра росте на цитрате. \ г ,

Проведенные по генетическому картированию методом -рансдукции фагом Pgg эксперименты покчзали, что суа мутация отрансдуцируется от мутанта' s.dublln С-44 (160) в штаны 3.typhlmurlum 57С:суа+ ilv" совместно с прототроф-

остью по изолейцинвалину с частотой 8?.

Для доказательства наличия у s.dublln •г- С-44(160) уташш в сгр гене, было обргшэно.внимание на ауксотррф-:ость этого мутанта по цкстеину, так как известно, что ■ утация суа g картируется на 72 минуте генетической кар- . и S.fcyphiiaarium и котрансдуцируется о локусом сгр о астотой 15-30^ ( ОоЬгозоаг V. et ell, 1983),- Поэтому были доведены трансдукционнь'е скрещивания, направленные на

л©

■iUíO

МГЧ'

л э ■о о!

* +

а. С «с и

S

s

■s

•о

, : 0 Табл. ,4 " .

РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КАРТИРОВАНИЯ МУТАЦИИ,

сгр*8.0ивиМ С-44

ДОНОР РЕЦИПИЕНТ ТРАНСДУКТАНТЫ С СЕЛЕКТИРУЕМЫМ МАРКЕ- КОТРАНСДУКТАНТЫ С НЕ СЕЛЕКТИРУЕМЫМ

РОМ МАРКЕРОМ

■ '!• - ШТАММ ГЕНОТИП ШТАММ ГЕНОТИП СЕЛЕКТИРУ ЕМЫП МАРКЕР ЧИСЛО ТРАН-СДУКТАНТОВ НЕСЕЛЕКТИ РУЕМЫЙ МАРКЕР ЧИСЛО ТРАН-СДУКТАНТОВ

Б.фрМтип ит СТ-2 А-20 сувА суа+ спН- 8.<«иЫтС-44 суасгр* су$С су$+{су$С+) 50 сгр+ 10

Э^иЫт С-44 суасгр*су5С агоВ+ вЛурЫтиН ил ЬТ-2 А-20 суа+сгр+агоВ- агоВ 50 сгр* 3

ФРАГМЕНТ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАРТЫ 8.1урЫтигшт

- 26 - . ;; ■ доказательство y.s.dablin С—44(160) мутаций в локусе сгр При использовании ".typhimuriuo 884 ( сув 6) как в качестве донора, так и реципиента при скрещиваниях о s.dublin _ С—44(160), трзнсдуктанты uks* не образовывались. При исноль^ зовапии 3.tyi>iiinurium . А20 '( сузЛ ), как в качестве донора, так и в качестве реципиента при скрещиваниях с '3.dubiin С-Л4(160), транпдуктакты с фенотипом crs+ образовывались о чистотой 5 х 10~ь. .При использовании S.typhiamrium А20 ( cysA ) л качестве донора в скрещиваниях cs«du1:)lib С-44 (160), в штамм s.dublin С-44(160) совместно с прототрофно-стью по цистеину, с частотой 20£ котрачсду!ировалось восстановление СУА фенотипа ( таблица 4 ). Гиперчувстяителыгость к экзогенному ц-АМФ котрансдуцировалась с частотой совиест но с локуссм агов от штамма s.dublin С-44(160) в штамм S.typhiuuriua IJT-2 (охоВ ) (табл.4). -..

На основатти этих данных было сделано заключение, что мутация, супрессируицая СУА фенотип в штамме s.dublin С-44 (160) котранеяуцируется с частотой 20% с суо G и о а1"015 и исходя из генетической карты, локализуется в локусе СГР'* ; Поэтому мутант s.dublin С-44 (ISO) имеет генетическую характеристику: cya,crr,e,cyo G.

Исследование вирулентных свойств S.dublin С-44(160) показало, что"мутен? резко снизил свою вирулентность. ЛИ^д' при .внутрябрхюянном ввеце1Г/.и составляла(3,1 4 0,96) х 10- , . тогда как у исходного родительского штамма эта .величина . •была менее 10 клеток. Максимальная .заражанцая доза, при.Ьнут-рибршинном введении которой набллдалаоь' 100% выживаемость-мышей составляла порядка'Юь микроб .-тел. Таккэ, как и суа", мутант S.typhimurium-'В-24, S.dublin. С-44(160) обладал': ограниченным размножением в селезенке мышей (.рис.7),,не-•' зависимо 'от способа инфицирования,- сохранил -способность. - размножаться в культуре макрофагов; без выратенного цитбла- " тическогэ эффекта,- тогда кск-этот.параметр у родительокого-' ; штамма,- S.dublin- С-96, равнялся 805? ( рис. 8. ).;■ Размножен •; нке .S.dublin С-44 (160) в культуре макрофагов "не' вызывало-', '"'увеличения'. внутриклеточного уровня ц-АМФ--макгофагов .на-прог. тяжении .всего срока фагоцитоза. Такке .не' происходило увели-.

1\П11ь1ГИ\П ГПУ1 щимишл Ч1»м«»*н V -5-3 д ЬЫ||;«Ы11\Ь П1ШЫ1 ИГП ГПиЛП1ПУ1Л ышьиипл

• СРОК ПОСЛЕ ЗАРЯЖЕНИЯ (ДНИ) --з.а-льип с-ъъ персрйлыш

---г.СиЬИп С-<81 ВНУТРМОРЮШИИКО

-С.ДиЬИп С-С4 подкожно

-З.аиЬНп С-44/,рТ6-4 ПЕРОРЙЛЬНО

; ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ КУЛЬТУР S.diiblin С-44 & S.diiblin С-96

рис.8

60

«

30

80

10

7 »

i i i 0 8 4 в

ЗРЕИЯ ФДКГОЦИТОЗД(ЧЯСЫ)

.¿М?л>1нп/т) , ----- SJui&n Мб

to

■ со

ченке уровня ц-АМ® в макрофагах селезенки мышей, инфицированных внугрибршинно В.йиЪИп 0-44(150) дозоп. Ю^нкроб. тел: на 4 сутки инфекции уровень ц-Ш1 в макрсфап:с селе-зеяхи равнялся 61,6 + 0,33 пикоМ/Ю клетск, а н<\ 14 сутки- ■ 62,0+1,00- пикоМДО5 клеток, несмотря на персгстекшю штамма.. Количество микробов в эти сроки в органе равнялось, соответственно 1,6 + 0,32 х 1СГ КОЕ и 4,3 + 0,65 у. Ю3 КОЕ, а уровень ц-АМ® в макроЪгдх селезенки неин^кпсрованных мышей составил 65,0 + 4,65 пиксЛ'/10оклеток. В случае инфекции, вызванной в.<1иЫ1п С-96, при тех ке- условиях заражения, происходило стойкое увеличение уровня ц-АМФ в макрофагах селезенки: на 4 сутки эта величина олвнялась.

Р *

123 + 8,35 пикоМ/Ю клеток, е.к 6 суткш увеличивалась до 142,6 + 1,83 пикоМ-'Л06клеток. . ' .

Мутант 8,<1иЪ11а С-44(160), такте к'.к и суа мутант В.Ъугф1тиг1ша В-24, не вызывал выпот жидкости и геморрагических изменений стенки кишечника после введения в изолированную петлг тонкого кишечгаим кролика, тогда как тпкосые изменения наблцгались при введении в изолированную петлю ' тонкого ккиечнпка кролика.

'Отличительной особенностью двойного мутанта, суа, сгр . З.аиЬПп С-4-Ц160) являлась стабильность аэирул гтного фе«*'; нотипа. Введение шгазг/зды, детерминирующей синтез ц-АЫФ, рта-ч-в штамм Б.йаЪИп 0-41(160) не восстанавливало полностью . авирулентный фенотип. --Дед З-Лиьип С-44(160),^ТС-4 арк внутрибрюшинном введении равнялось ч' 2,2 х Максимальная доза, после внутрирщанного введечня которой, наблюдалась 100$ выживаемость мышей равнялась Ю4 гик роб.тел,т.е. увеличение вирулентности у гибридного штамма 3.4иЫ1а С-44(160)/|)Те-4 произошло по сравнению сЗ.йиЬИп • 0-44(160) на 2 порядка. Низкая остаточная вирулентность гибридного штамма В.dubli.ii 0-44(160)'/;®*-^ подтверждается ограниченным характером лгрснстенцки этого пул.ума в селезенке мывгей после перорального заражения дозой 10° :.':гкрсб, тел в течение 30 суток от момента инфицирования с максимальным накоплением микроба на 15 суткс: 5,3 + 0,83 х Ю3 КОЕ ( ряс. 7 ); Стабильный авирулен-ЕыЗ Генотип двойной, суа, ■ сгр мутант ''

-30- . ■ ч--^::-;)^'

я.аиьип С-44(160) также продемонстрировал пойле 5 паоса-1 хей через организм мышеР. С этой целью группу в 6 шаей ин<£ фицкроваля внутрибршинно в.йаЪИп 0-44(150), ;озо'Л, после введения которой наблюдается 1С0Х выживььмостЬ животных: Ю£ мин роб. тел. Ир 7 сутки после заражения одну кшь из группы забивали, выделяли из нее селезенку, из которой гысевали З.АиЪИп С-44(160), которым дозой 1б6 микроб.тел заражали ' следующую партию шией. За мыками наблюдали в течение 30 суток поело инфицирования. Всего балб проведено 5 пассажей. Ре зультаты экспгршиг'нта показали, что при лерепассировании через организм мыши не происходило увеличения вирулентности В.аиЪИп 0-44(160), тт: как после 5 пассажа животные выживали после заражения дозой 10 микроб.тел.

Исследование иммуногенных свойств Э'.йиЪИп С-44 (160) показало, что этот штамм обладает протсктивноР активностью при внутрибршинном, пероральном и подкожно!/! способах иммунизации. 2Д5д, вычисленная по результатам опытов активной яещитй соответственно равняется 3,9 + 0,55 у. 10; 6,3 + 0,95 х 10® к 6,5.+ 0,3 х 10 . При внутоибршикной йэду низации мышей з.йиЪНп 0-44(160), дозой 10^ микроб.тел невосприимчивость животных к экспериментально!! инфекции начина ла формироваться через семь суток .после имм/нигеши. 100£ невосприимчивость наступала после 15 суток от момента иммунизации. После инфицирования иммунных мышей з.йиъип С-96 в дозе 100 ОСЬ этот штамм выделялся из организма в течение 7 суток; бактерионосительство у ивднных/мыпгей после перенесенной инфекции не формировалось.-':

Для изученм возможности использования суа, сгр мутанта в.аиъип С-44(130) в-'качестве, яивой'.-вакцины'против па-., рзтифл ( сальмзнеллеза ) телят была:.приготовлена экспериментальная партия вакцшш, которая.предотавлйла,-лиофильновису-шеичкй смыв агаровой.культур! обезжиренным молоком, который, разливался в ампулы, каждая ив которых содержала 2С0"млрд.; КОЕ, / у

/ , Эксперименты по изучению эффективности вакцинного. препЗ' рата .из.'штамма Б^иЬИп С-44'(160) проводились, на протяжении 1580 - 1938 годов в Эстонии,"на базе Эстонского.ЕНИ'."•'

- 31 -

¡ивотноводства и ветеринарии им. Мельдера сошеотно со старим научный сотрудником Ливдъярвом."

В предварительной серии экспериментов было установл:;-ю, что максимально переносимой дозой штамма а.ЗиЪПп С-44 ¡160) для С-10- дневных телят при перентерялыюм введении [вляется доза з 25 млрц.мякр.тел. Введение телятам в той хе юзе родительского штамул з.йиЬИп "С-Зб приводило к разш-?ию через один чао после введения кашля, одышки, в последуйте час» происходило понижение температуры тела, развиваюсь диарея, появлялись выделения из глаз. .На 6 сутки наспала гибель животных. Изучение безвредности препарата |'рн пероральном введении телятам проводилооь в 4 хоеяйст->ах бывшей ЗССР, неблагополучных по спльмонеллезу. Для опы-:ов отбирались клинически здоровые телята в воэрчств 4-6 су-•ок. Препарат растворяли в Физиологическом растворе до .тре-1уемо£ концентрации и давали телятам о молозивом.. При дву-¡ратноЯ иммунизации вторур" дозу давали через 3 дня после , трвой иммунизации. Всего было иммунизировано 153 телят, контрольная группа, не получавших вакцину, состояла из 12С ?елят. У всех"вакцинированных телят в течрние 3 дней после ¡ачи" вакцины проверяли состояние здоровья: наличие диареи, >ыделений из нсса, капля, измерение ректальной трмп=ратуш [ пооводилось бактериологическое исследование кала. За.все-ш животными наблщали в течение 3 месяцев после влкцинацга.

В процессе наблюдения за .животными установлено (табл.5) 1ТО вакцина из штамма Э.аиЬИп С-44(160) не оказывала на селят токсического эффекта: не отмечалось повышения темпе? затура, ухудшения общего состояния и функций кшпечника. ИВ Ьекальных проб вакцинный штамм не вусевался . При смене ре-1има питания у 8 телят опытной группы наблвдалась в течение здких суток диарея, которая прекращалась.без применения ле-1ебных мероприятий. Случаев заболевания саль.монеллезом в шытной туппе не было. В контрольной группе 4 теленка пали )т сальмонелле за, вызванного' з.с!иЫ1п , а у 43 наблша-юоь диарея. Эти результаты показали, что при пероральной 1аче с молозивом в дозах 50-200 млрд михр.тел вакцинный ••" 1репарат из йтамма .в.1иЪ11п 0-44(160) оказался безвредным

É." . »

" • "î -

s ë. • g *

5 в

6 a

m

. w ¡r

S'B ■

О M

К ai

П m . 8.«

» о

to a:

<u л

о (Ч

я а

. èi s.

dl 10

•=: «

o>

m К

s. &

г; о

г»1

ч

Л

О О H 10 К И

(Ü ^

g4>-к

■ « .

ь : ' te! ГО Рч

О К

s

к

Я5 Ю

<0

Е-< О О

а

в

<0 te

.Sa о

•Й

«

■Й . 'S

о

о

' Я ■ о.

О '

о -

g

о

я ф

>=; о -о га п

о

U ; О)

о m

о, M .

.. к

•■.а st;

м • а> О 01 н .

ик

0 ь>

WW

1 tj

t? <u ,

Of-" .- •

к . ■ ; cT.' ""r"

.PI о

«i .. ; . К '■ 1 to о

- и

онооюЬийбро

оншопмяинпн

осооююоо£>ююю NU со сч

!«•• «M . ••• »< te« «•« «•! »v* •><

О О О О О О О О ООО

0,H"Í OH0NOOO О

irj .O'O Ю СО 1-4 <л р СИ Ч) «о И Р5 t~< N H

88 8.8888 88 8 8

(И ' И И M ■ . M и см

К M И К « К X К К « M

M OJ M CM W 01 CM M CM CVJ cvj

m tn o o ó й m с- ri н н HI U) N. H M «D Л* M »H •-»

M M H 't-4 H Ol N NH H H

¿ ¿ еД А'4 4 Д <¿ А oY

in телят, катаная с трехдневного возраста.

Оценка протекг'.яннх свойств препарата была исслелова-1 в опытах активно!' зашктн от инфекции, вызванной введе-1ем через носоглоточны" зонд вирулентного штамма s.dub-л С-96, в дозе-, оказывгшеП 100% гибель телят, равной 30 млрд.КОЕ. .

В первых двух сериях экспериментов были изучали протек-1вные свойства препарата при двукратной и .троекратной им-гниэации-я диапозоне доз от 25 до 100 млрд.микр.тел пер-ра.пьно телят в возрасте от 3 дней до 8 дней. Кммунизап/я поводилась с интервалом в 3 дня. Инфицирование вирулент-щ штаммом осуществляли на 13 сутки по окончанию иммуниза-т. Результаты экопэрнментоа показали, что иммунизация те-* iTB возргсте от 3 до Я суток вакцинном препаратом из шиам-is.dubiin С—44(160) является неэффективной.

З^следуших 4 сериях экспериментов была изучена эффек-авность иммунизации вакциной из штамма s.dublln С-44(160) злят, начиная с двухнедельного возраста. Результат про-эденных экспериментов■( таблица 6 ) показали, что двукрат-ая вакцинация-телят'в возрасте 2-3 недели, вакциной из гам^а s.dublia 0-44(160), в диапозоне доз от 10 до 100 лрд.микр.тел, предохраняет животных от экспрриме"тальной ¡Секции. У иммунизированных животных после заражгикч виру-вптным штампом S.dublln С-96 наблюдалось заболевание в егкз?. йорме, которое проя-лялось в преходящем, в течение -6 суток повышении ректальной температуры. Вирулентный га мл выделялся о испражнениями в течение 4 суток после за-атения. К шестам суткам после заражения состояние животах нормализовалось. Контрольный забрй выживших животных а 30 сутки после заражения и бактериологическое исследоза-яе органов показало отсутствие в них сальмонелл. У конт-ольных ( н-зяммунизирозанкых ) телят после заражения атам-оц s.dublln С-96 развивалось заболевание з тяжелой.fopMe, аканчивээдееся гибелью жиеоткых.Один контрольный теленок стался кив, однако, бактериологическое исследование орга-ов показало их обсеменение s.dublln С-95,т.е. оформиро- 1 авшееся бактёояоносптедьство; В. отдельной серии экспери-

- 34 - • ;: . ■•:=•■

мзнтов было птодемонотрировано, что при двукратной пар- -оральной иммунизации т?лят, вакцинный штамм С—44(160 ограниченно персистирует в лямфоидн^ ткани теля и к II суткам после второй дата вак.шны происходит освобождение организма от вакцинного штамма.

таблица 6

Исследование кммуногенных свойств вакцины из штамма В.биЬИп 0-44(160) в опытах активно:! защиты на телятах 'в возрасте 14-21 день.

Доза и охема'я-во ! Исход экспериментальной инфекции ' иммунизации !телят!_;__!

млрд.микр.тел ! пало ! вшило 'нослтельство |

2 х 10 ! 3 !

2 х 50 ! 4'

2 х 100 ! 7

контроль ¡4 /невл-сцини-■ рованные телята/

0 J ; з ! 0 1

0 , ; f ■ 4 . ¡ 0 »

0 ; 7": t 0 »

3 ' ! I j •I : !

t ■ !

В результате оральной вакеи'нзияи у телят не отмэчалос: увеличения уровня 0-антител в йяюротке крови, но наблюдалось увеличение количества Т-лимфогатов ( рис»,.9).

Для оценки возможности широкого применения вачтшы . из штамма a'.dublin C-44(IG0) были проведены производственные опыты на территории Зстоноти Вахш'.ну готовили в лабора-тори; инфекционных болезней Эстонского "ШИ яивзтноводотва и ве те айна pira. Она представляла смыв. 18-24-ласовой агаро-г вой культуры s.dublia- С-44(160)г|л физиологическом растворе , в котором определяли количество яианеспособных бактерий, после чего доводили концентрацию'до 5 х 10 КОЕ g. производили разлив суспензии во флаконы, объемом 250 см , которые закупоривались стешльными резиновыми,пробками'с металлическими колпачками. До разлива во флаконы смыв хранили в холодильнике при + 4° C¿ Приготовленная вакцина-. . подлежала хранению в течение 10 суток при + 4°С.

(.иыьньннь шшяилнип 1-/1ш ^ицпша о пгиви 1слх1 иппзпиоисивнппил внлципци

ИЗ ШКЯ 5.йиЬНп С-44С160) 6 2озе 100млр8.м.т.

СРОК ПОСЛЕ ККМУНИЗйЦИИ

опит

ЕЗ КОНТРОЛЬ

Ирэпарат в объеме 5 мл ( доза - 5 млрд КОЕ ) или 2 мл ' ( 10 млрд КОЕ ) добавляли в порцию молока во время кормлен Производственные опыты были проведены в 1987-11,88 годах в 15 хозяйствах Тартуского района Эстонии сотрудниками Эстон ского Н/".И ^животноводства к ветеринарии. Было иммуниэирова-но 4470 телят е возрасте от 2 до 6 недель двукратно дозами 5 млрд. и 10 млрд.КОЕ о интервалом мгтду дачеЛ вакцины в 7 дней. За телятами наблюдали в течение 6 месяцев после ля чп вакци!1н. За пзриод наблюдения среди иммунизированных животных случаев заболевания сальмонеллезом и падежа .от не го не было. У 130 телят в о хозяйствах после Второй дачи вакцины в дозе Ш Млрд. КОЕ наблюдалась переходящая реакция в виде диареи и потер! аппетита, которая проходила на вторие сутки без применения медикаментозных средств. На ос нова)ти этих данных с разрешения Управления ветеринарии Эстонки были разработаны технические условия ТУ Ю ЭССР 1-41-90, утвержденные Министерством сельского хозяйства Эстонии на живую оухую вакцину против сальмонеллеЗа' толят из мутантного штамма Б.<1иЪ13п 160 (С-44) "Салоралвак телят а также временное наставление по применен}!» ч временная инструкция по изготовлению и контролю живой сухой вакцины , против сальмонеллезд молодняка крупного рогатого сксга

Согласно наставтеиию по применению: . - ''•

Вакцина, представляет собой .высушенную агаровую куль-'' •гуру мутантного птамма О.йиЬНп 160 в виде порошка бело' го'цвета. . • ■■''/.'

Показания к применению: Ва;<цг'.а применяется как специфическое кммунопроф'игактнчбгское средство в борьбе'с саль-1 монеллвзом телят, вызванным з.аиЪИп • , Кмкунизащй'.•:•'••'•; подлежат телята в.возрасте от 2 недель.. / уу •„ Противопоказания к применению: Противопоказаниями к .'.г, иммунизации являют йл расстройства пищеваренпя у телят, га : , также заболевания калибактериозом, паотврреялезом ,. дип-, лококковой инфекцией. ;"•'„"••У. ' >'..Способ применения Содерг.кмое.флакона. ■ ( 5 три.КОЕ) . раотворяют в 5 ш физиологического раствора. Разовую -дозу'препарата в количестве' 5, иг добавляют во 'время-корм-' ■ ленля в пор'лию молока. Телят игтнизиурют двукратно по

- 37 -

i иирнДОЕ с неделкдав интервале».

_хочнения ; Бйяцдку хранят в сухо» и т<?кнсв к?сте таг тмшеритурз ст * б°С до * 10°С. Растворенную ьакиипу ;ракят ш более 25- часов з хадодкльнгке п.св ■»■ 4°С. "едкость влкпука : Срон годности - года со дня ззготое— юншг..

Нз оокоелнеи телгачесятгх условяй Эстонский сельско-:озяйственкы£ бистг*нологвческий центр г. IS39-I?S0 гояах апустал Т07433 дозы, стоггкостьо 44 иоп. каждая.

Йспсьгоьиггб елкшн-щ m террЕюр.щ Эсто!яп! дало эко-(ОйЖчесгЕП sute?t на I рубль Еяоженгя Ю рублей.отдячг ! до pejopes ней I «пргля I3SI гсда ).

ЕВ ВОДЫ

1. Эксарсссгя гзрухентноста сальмонелл познтизно рз~» ■улнруется г.оугпвксои п-^З-с-АКЗ-рйцепторннЙ белок, де-■сркангрус-мга гьнакг суа к сер , !лутац?.ь в котореле лриЕО-дт к notmensp скрулектностк еяльконеял.

2. Е?*ацгя г - кно суа i:o плкяет па вигазивнув антве-оеть и способность салькокелл разккохаться п фагоците?:.

3; Ген суа контролируем пнтбпсявность рагкаптекся ¡ялькояелл в лих^оквкой укгда, проянленЕо с1Ггзрзто:-.сЕгекг«о& дтнвностг к цатслатечвского з?Ф&втй во oteoïsikc к фа гостам. ■ .

. 4. Сутзцня в гене суа не охазырлет маяпля ns ппоявле-е© лротектявгал: сесЕотв сальмонелл.'

5с Бпутггклеточный уровень ц-Ш" taxpefmra изкеняс-га i рряггопроасрцкокальнай sanscsvecm с? видолонпоета Фа-■оцнтаруеааг сальмонелл.

G. Еяугрнклеточный уровень ц-AMS в пврстонеальгал-и ¡елезвночннг ¿акро^агах определяем ¥еченга 'Л поход с&ль» :ог:с-ллс-зно6 Е.н$екцкк: повылепге янутркклеточной концентра^ ей ii-AMî ианрафаг&чькой «агетхй приводят п потепютравй-тв Екфекпионноро процесса.

7. Двойкой, суа, cri® мутант, S.dublia 0-44(160), о . ¡енотипои с® t обладаем' низкой остаточноД гарулектпостго,

; . -38 - . . , .....-„ .

высокой иммуногенноотьг, стабильностью ави.цулентного Фенотипа.

8. Нз основе штамма S.duWin C-44(I60). сконструирована кизая вакцина m роральчого пригленетш для активной ни мунизашта против сальмонеллеза ( паратифа ) молодняка круг ного рогатого скота.

9. Живая вакцина из штампа S.duMin С-44(160) яо овоей безвредности, иимуногенности и стабильности эффекта! на для профилактики сальмонеллеза ( паратиф« ) молодняка крупного рогатого скота при перорильной иммунизации телят в возраста 2-3 недели, двукратно, в диапозоне лоз от

5 до 100 млрд. микробных тел

10. По своей низкой остаточной вирулентности, способ-кооти ограниченно персистировать в лимфоидной ткани, после перорального введения, стабильности авирулентного фенотшк обусловленного двумя аттенуирупиими мутациями, суа и сгр, отсутствию маркера выраженной антибиотакорезистентностя суа и сгр кутанты сальмонелл являются перспективными для использования в качестве вектора мультивалентной вакциИ! орального применения. ;

Список опубликованных, по теме диссертации работ '

1. Бойченко М.Н., Ьткина С.И, Исследование вирулентных я иммуногенннх свойств п-ШЗ-дефппитиых мутантов s.typhiauri .ua /ДМЗИ-1980-Л12-С.47-49 ; у.';- ' О1

2.Бойчевко М.Н.,Ёлкина С.И.,\1ютша И.Л. Поведение ц-Ш--дефицитннх мутантов B.typhimurlúa в культуре макрофрго1 ЕМЭИ-1931-Я1-с.40-43 ■ . . Л'У'.ГУ'■.":.;.•

3. Бойченко М.Н. Длякна И.Л,; Левэшев В.С. О протективных ! свойствах ц-АМФ-дефицлтных мутантов энтеробактерий//■ Тез* . докл. 5 .Всесоюзной ю«унологической конференции, Талляяи-

1982-0.205 '. '"■.■' ^^-ÍV'^síV frli)' "i. ■

4. Бойченко К.Л. ,Дугашева Л.Г. Изменения уров! ц-АШ в макрофагах, при; фагоцитозе сальмонелл// Тез.доя*. ' 4 Всесоюзного оимпоаиуиа по гшлическим нуклеЬтидам.Минок-1982-0.22 ' " ■■•■•■.'•■:•• - - — ■ - ■

I Бойченко М.Н.филина И.Л. Елияние сальмонелл на уровень •ШЬ макрофагов в процессе Фагоцитоза// Тез.докл. I Вце-жйноЯ конференции по теоретической и прикладной ин?>ек-юнной иммунологии, Москва-I982-с.54

; Бойченко М.Н.филина И.Л, Изменение уровня ц-АМЗ в макросах при фагоцитозе b-typbiaurlua // I.K2I!-I382-.'UC-c. 79-81 , Бойченко М.Н. валика И.Л. Регуляция процесса фагоцитоза 1стемой циклических нуклеотидов//' МЗИ-1983-'»5-с.9-13 , Изменение Физической структуры мембранных fрчкцдС -АКФ-деФкштннх мутантов сальмонзлл/ Формазкн Б.Е., Бой-J.HKO М.Н., Леввшев B.C..Леев А.И.//Г;юЬ!Зика-1983-т.288-1-C.7I4.

. Бойченко М.Н., Жилина И.Л. Изменение уровня ц-АУФ в «ак-эфагах яри ^эгоцитоае сальмонелл ( сообщение 2")// ЕКОИ-383-;»I'J-c. 64-66 •

Э. Изучение тчуногенных и вирулентных свойств ц-А?Л1и.деЗи-итного мутанта s.typijimuriua на телятах/ Бойченко М.Н., евриёв B.C., Тилга В.В.,Кампуо Н.Я.// ЕМЭИ_1933-:»10-с.94

1. Тилга В.В.,Лиядьярв P.O., Бойченко H.H. Перораяьная нм-унпзсция телят претив эксперимеитлльного сальмонеллеза// олезни молодняка с/х животных и их профилактика в комплек-ах» Тзз.докл-1984-с.48-49- Таллинн

2. Хилина И.Л.,£лкина С.И.,Бойченко М.Н. Влияние инсулина изопрот?ринола на Уагоцктарнуп активность макрофагов//

МЭИ-1984-.Чб-с,98-101 .

3. Бойченко М.Н. Сальмонеллез:распространение сальмонелл' организме// 5МЭИ-1384-:И0-с.З-6

4. Казиахмедова Д.Б., Бойченко М.Н. Некоторое аспрктн орипропэния иьедунитета к сальмонеллезу// Тез.докл. У1 На-чно-практической кояТеренцгл молодых учены! Дагеотана Наука- практическому здравоохранении", Цахячяала-1985-а.52

5. Бойченко М.Н.Девзпев B.C., Казиахмедова Д.Б. Исследо*. ание роли яаритонеальных макрофагов в развитии эксперимен-'альной сальмонелле зной инфекции.// 5MSH-I935-}» 12-е. 67-68 'б. Бойченно М-.Н. Изшнейие уровня ц-АМЭ в макрофагах селе-1внки в процессе сальмонеллезной инфекции// ЖМЭЙ-198б-й 21.105-107 . • >:'4' ' ' ; W- ' ''

■ 40 -

17. Каэгазмедова Д.Б,,Бо?чзкко H.H. О какоторл свойствах' сальмонелл, обусловленных ц-АН5-це^щйтаоотнв//.Тез«аокя. 48-итоговой объединенной ваучно-пракчачлясоа к-етТяреиша молодих учетгах Дагестана, 12ахачхала-19в6-с.?8

18. Байченко а.Я.Девааев B.C. Наследован!» рсяи д-КяФ в раз виге;: салкаон&ялезноЯ инТакцнз в эксперименте// БЗйгй-I987-JJ2-C .130*192 . ' ' .

IS. Бойчанко У.Н. Иэучензэ ¡»гуяятоЕзег-о влвякая c-AMS ßa течение сальмонэллеза в экеаерачаднтв//2Ия1-1937~й6-в.118--IIS '

20. Бойчекко М.Н. ДсйбровскиЗ &,й.,Сивов И .Г. Ияиянгэ лда-лаческого 3,5-аденозикконо*оофата на варулентность a.tjphi-«urlua //üO-I9Sa-37-o. S-П

21. Бойчгнко H.H. .Воробьев A.A. Гечетачеокая рехуляши вирулентности сальмонелл// 3M<3-IS90-32-c. 68-74

52. Бойченко H.H. Разработка «ивой в^рордльноЭ вакцина • против оаяьмояеляеза молодняка KFC а когабактериоза свиней/ Тез.докл. I ВоеогланеЗ вяаяово-отчетной ксйТэрепши "Гея-нал и клеточная ^шекэркяяг1?ущянс-на 0к&- 1991, Москва-"1;■' о. 123-124 - '.■..!'-"

23. Бойченко И.Н., Леаащей З.С., Длкика С.И. Ет&<вл a.tjphi-aariua ; B-24-I, яспользуеьггй для изготовления ваквдна про тав оальйокеллеэа животках и птяц// Авторокое свидетельстве "й II2453G ОТ 15 ИМЯ ISS4ff ,/ .'■.■•!.;'. •■.-•..

• 24. Бойченко М,Н..Шт&яа S.dabllii' ICO. аспояьзуемый для• ; Y" заготовления вакшш поотиа сальмоиеллаза телят// Авторсока свидетельство Я 1378339 от I ноября 1937г.' <"•■' - . .V"": •:

25; Еойченло М.й. .Леваызв B.C. Способ отбора слабоаирулэйт-ннх, ямуяогэннах «утантоэ оальаонелл// Авторокоё. свяде-•