Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль сопутствующей микрофлоры при производстве гаприна в районе Нижнего Поволжья

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Роль сопутствующей микрофлоры при производстве гаприна в районе Нижнего Поволжья"



г

НАУЧНО-ИСС Л ЕДОВАТЕЛ ЬСКИИ Г1РОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ХАРЧЕПКО ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Роль сопутствующей микрофлоры при производстве гаприна в районе Нижнего Поволжья.

Специальность 03.00. 23 — биотехнология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993 г.

Работа выполнена в Волгоградском филиале " - —г . ■ Научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ и в Институте микробиологии и вирусологии им. акад. Д.К. Забо-лотного АН Украины

Научные руководители: доктор биологических наук Романовская Виктория Александровна кандидат технических наук Титов Андрей Георгиевич

Официальные оппонента: доктор биологических наук,профессор Градова Нина Борисовна кандидат биологических наук Гаязов Ренат рапидсвич

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ ( Москва ) -

Защита состоится 1993 года в Уг ч

на заседании Специализированного совета Д 098.09.01 в Научно-исследовательской проектко-конструхторском институте прикладной биохюии ( 125299, Москва уз .Клары Цеткин, 4/6 )

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке Научно-исследовательского проектно-хонсгруеторско:'о института прикладной биохимии

Отзызы з 1-оы экз.., заверенни,; гербовой печатав, • просим направлять по адресу : 125299, Москва, ул.Клары Цеткин 4/6, Специализированный совет Научно-исследовательского ггроект-но-конструкторского института прикладной биохимии

УчекнЗ секретарь Слециаяизироэанного совета / И.И.Гусева

кандидат биологических наук

-3-

)БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Значительный прогресс в биотехнологии монет быть достигнут при использовании смешанных микробных культур, 1ричем не только естественных ассошапий , но и искусственно соз-*анных микробных ассошапий с известными полезными свойствами.Для доставления микробных сообществ и обеспечения их устойчивости в тропессе культивирования определяющими параметрами являются кинетические характеристики монокультур и их тропические связи.

Несмотря на очевидную перспективность использования в промыш-иенности микробных ассоциаций, утилизирующих сложные субстраты, зопросы устойчивого сосуществования различных видов микроорганизмов разработаны недостаточно. Это касается такте такого субстрата как природный газ, который, как правило, содержит метан , этан и цругие гомологи. Вчраядавание на природном газе микробных ассошапий с определенном составом монокультур и известными тропическими связями между ними- более перспективно , чем использование смешанных культур , видовой состав которых может меняться, взаимоотношения микробных монокультур складываются стихийно, что не гарантирует стабильность процесса биосинтеза. ;

. В связи с этим , цель налгах исследований - изучение микрог&ло-ри , конташнирувщей процесс синтеза микробного белка на природном газе на Опчтно-пр'омышленной установке (ОПУ) з Светлом Яре (Волгоградской области) и Нормирование искусственных микробных ассоциаций для производства гаприна (микробного белка , получаемого1 на природном газе). Для достижения этой пели решались следующие| задачи: - изучение состава сопутствующей микрофлоры при культивировании метанокисляющих бактерий (продуцентов гаприна) на ОПУ Све-тлоярского завода БВН ;

- определение инйишрованности технологических потоков (вода, воздух, природный газ ) , поступавших в Ферментеры на ОПУ

и ее влияния на процесс производства гаприна ;

- изучение мортолого-культуральнчх и Физиолого-биахимичес-ких сзойстз сопутствующих микроорганизмов и их идентификация ;

- исследование тропических взаимоотношений сопутствующих микроорганизмов и метанокисляющих бактерий ;

- разработка принципов подбора сопутствующих микроорганизмов в искусственные ассоциации для производства гаприна ;

- проверка устойчивости искусственных микробнчх ассоциаций в лабораторных и опнтно-лромышленшх условиях -

Научная новизна. На основании изученных моргРолого-культуральнчх и Физиолого-биохимических свойств сопутствующих бактерий , изолированных после длительной автоселекттаи в гЬерментере и растущих в симбиозе с метанокисляющими микроорганизмами

, они отнесены к видам

^щ/ешбО' (ШШгЗа-, ¿¿¡¿¡Жш , ¿Мм

. Определены кинетические параметру роста бактерий-спутников З&Я&биА- ¡¿¿¿иш&>на этаноле и апетате , а также константы ингибирования . (этанол , ацетат) в ростовых процессах на природном газе. Определены условия , при которых симбиоз

и ^^гмгл^Л' устойчив в течение длительного времени.

сопутствующей

Практическое значение работы. Изучен составГмифоФлоры штамма

и механизм взаимозависимости монокультур • в микробных ассоциациях при выращивании их на природном газе в опытно-промышленных Ферментерах. Составлены микробные ассопиаши для процесса синтеза гаприна (белка из природного газа). Продуктивность процесса при использовании данной Микробной ассоциации выше , чем у монокультуру М. Л^/гй^^ . Предложен способ стабилизации процесса биосинтеза гаприна (Приложения I и II). Разработанная математическая модель процесса культивирования в хемосгате микробной ассопиаши 01. + ^^я&г&Ь') проззолсэт рас-

-о- 1

читать скорость трансформации субстрата и роста биомассы на основании кинетических параметров роста штаммов.

Предложен чувствительней метод определения количественного содержания клеток микроорганизмов разных Физиологических групп в воде, воздухе и. природном газе. Изучен бактериальной состав входящих в Ферментер потоков! (вода, воздух, природный газ) изменение его в течение-года и влияние на ^оиесс йерментапии метанокисляпощих-бая-— терий в опытно-промышленных условиях в регионе Нижнего Поволжья. Разработанной метод определения количественного и качественного состава минро&лоры воду и воздуха может применяться для экологических ' исследований , для'оценки обсеменения воздуха и воды, используемых .й быту, на пищевых предприятиях , в линиях подачи их в. промышленные ферментеры при производстве микробных препаратов. Аггодбаиия работы. 'Материалы диссертаготи представлялись на Всесоюзной школе-конЯер'енши молодых ученых "Физиология, биохимия и ге-

I ' I .

нетика микроорганизмов - Фундаментальная основа биотехнологии" (Алушта , 1990) ; ^^ШЛ^/игЛ ^^/¿¿¡¿¿мх -¿ъ&^йу^Шратисла-ва , 1989) ; ¿¿ш&г/

(Киото , 1989).

Публикация материалов исследования. Материалы диссертационной работы опубликованы в 6 печатных работах. 1

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения , обзора литературы (2 главы) , экспериментальной части ( 7 глав) , заключения* выводов, списка литературы (117 источников, из них 42 работы зарубежных авторов ), приложений I и II . Работа изложена на 113 странинах машинописи, содержит 7 таблип и 17 рисунков. '

Объекты и методы исследования. Исследования проводились с облигат-ными метан окисляющими бактериями ВСВ-874,

"Рис.4. Количественное содержание ялеток метанокислящих (2) и сепутствущих (3) бактерий при различных коэМипиннтах-разбавления среды С® ). ш- логарифм числа клеток/мл, I- урбвень биомассы ,гАСВ/:а, 4- скорость окисления метана клетками 11. (Г q^) , нмвль/мгАСВ.мин.

тущих на природном газе , различна и определяет степень взаимозависимости монокультур в ассоциации и устойчивость данного симбиоза. -Для поддержания необходимого соотношения монокультур в микробной -ассоциации выращивание следует вести в

•условиях , оптимальных для .обеспечения максимальной удельной ско-

'v • ■ . i , "

; рости роста вбеих монокультур (например , при нрэ^ииианте разбавления среды не превышавшем 0,25-0,27 ц"*.).

Математическая модель процесса культивирования ассоциации метанокисляющих и гетеротрофных бактерий-спутников.

Предложенная нами модель процесса культивирования на природном газе микробной ¿ссоииации в режиме хемостата представляет собой систему из 12 уравнений , характеризующих |зависимость .скорости -микробиологических превращений субстратов , а также скорости роста биомассы от концентраций субстратов и продуктов метаболизма и. взаимозависимость концентраций клеток монокультур в ассоциаций. С помощью JBM проведено численное интегрирование системы дифференциальных уравнений , описывающих динамику шкробиологическогд_~проиес-

Для идентификации бактерий-спутников провопили окраску клеток ло Града, определяли наличие эндоспор и капсул, способ диссимиляции углезодов (О/Р -тест) , наличие каталазы, разжижение желатина, гидролиз крахмала, образование Hg^ , устойчивость к различным температурам и pH среды, осмотолерантность к глюкозе, галотолерант-кость ж MU / толерантность к этанолу. Реактао на оксидазу ставили по методу , описанном1/' /¿¿^¿¿i^i 1980>. Проверяли способность

использовать различные источники углеродного питания, а также способность исследуемых штаммов образовывать кислоту га ряда субстратов (10 г/л) - лактозы, галактозы, глюкозы, арабинозы,Фруктозы, ксилозы, ацетата, лактата, метанола, глицерина", маннита (1

,1984). Исследуемые штаммч высаливали также на иазлич-ных сложных питательных средах - '¿ПА, МНЕ, пептоне, сусле, моло-. ке, крахмале, дрожжезом экстракте. 5-гдэление ДНК и определение мо-лятзных тзопентоз rvаника л штозина Г-И'1 в ДНК проводили

по методу , GiJHcaHHOMyv^iX«^и(1962). Ультратонкие срезы клеток исследовали в электронном микроскопе (Методы ...,

1983). Окисление этанола (до уксусной кислоты'> и "сзерхокисление" этанола (до COg и HgO) , образование водорастворимого желто-коричневого пигмента проверяли на среде способность расти на средах с маннитолом facrf'^иМ/А~ методам*,! , используемыми для идентификации уксуснокислых бактерий .., ¿rtbto-af,.. ,1974,19844 Иленти-икапип штаммов проводили по

также по тзабстам

, 1950; ättt,

1968^/,1980; f/ebty* ¿/я/ ,1980;^^ &fа/. ,1989;

1987).

Для бактериологического исследования воздуха использовали ще-лезой прибор Крэтова (Справочник ...,1962 4 Воздух и природный газ отбирали также с помощью модифицированной каш склянки Дрекселя, барСотиоуя потоки четзез стетзильную сседу 3*. Of-ьем анализируемого

воздуха и природного газа определяли на барабанном газосчетчике ГСБ-400. Отбор проб воздуха, природного газа и воды проводили в течение года с периодичностью 1-2 раза з месян. Для культивирования бактерий применяли жидкие и агаризованные среды с различными источниками углеродного питания - белком (МПА, ШБ) , спиртом (0,05 % этанола) , углеводом (0,1 % глюкозы). Количество клеток .микроорганизмов определяли путем рассева последовательных десятикратных разведений образна методом предельных, разведений (метод МРУ ) в . пробирки, используя для учета результатов таблицы Мак-Креди ( ЛЬ Л$%,1977) , а также методом Коха (метод МУЗ) на агаризованные среду (Практикум ...,1976).

Математическую обработку данных проводили методами корреляционного и регрессионного анализов (Лакин, 1980 ;Королюк и др., 1985). Определяли удельную скорость роста ), максимальную удельную скорость роста ), константы Михаэлиса (Ку ), экономический коэффициент (У) (Перт , 1974), "приспособленность''(коэффициент) ) штамма к субстрату (Абросов и др.,1982); константа ингибиро-вания этанолом и ацетатом пропесса окисления метана клетками М.

вычисляли по Формулам для конкурентного либо бесконкурентного ингибирования (Келети, 1990),.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение микробного состава смешанных культур метанокисляздщих бактерий при культивировании их на природном газе на 0ПУ-10 Светлояр-ского завода БВК.

Изучали состав контаминиругащей микрофлоры метанокисляющих бактерий, культивируемых на природном газе. Микрофлора была условно разделена на три группы по выполняемым Функциям в биоценозе Ферментера: сопутствующая , случайная и инФиштаущая. В результате исследований из бактериальных суспензий метанокисляющих бактерий были

"9- ;

выделены штаммы В-5-2 и ВФ-17 (для М. ) и И Ж-7 и ИМВ-3

(для являющиеся сопутствующими бактериями , так

как постоянно присутствуют во всех анализируемых обрапттах бактериальной суспензии промышленных ферментеров ОПУ на протяжении всего исследуемого периода (в течение года) , количественно преобладают (Ю^-Ю® клеток/мл) среди прочей контамипирующей микрофлоры (10^-10^ клеток/мл) , используют в качестве источника углерода этанол и/или апетат (продукты метаболизма метанокисляятлх бактерий\ не являются антагонистами по отношению к метанокисляишим бактериям.

Сравнительный микробиологический ' анализ бактериальной суспе-, нзии из ферментеров ОПУ Светлоярского завода БВК : УФС-Р,9м3, УК ■ -З2м3 , УФС-400мэ показал , что количественное содержание клеток этанол- и аиетатиспользугащих бактерий-спутников з бактериальной суспензии всех Ферментеров в основном постоянно в течение года',

тогда как содержание случайной миквогЬловы , попадающей з Ферменте -

I

ры с входными.потоками воды, воздуха и природного газа ,, варьирует в течение года и наибольшее количество их обнаружено'|з зесенне

■ (

-летний период ¡ микробный биоиеноз , который Формируется-в~Ферме-нтерах , характеризуется идентичным составом и постоянством опред-

I

елейных видов сопутствующих бактерий.

Изучение микрофлоры воды , воздуха и природного газа з линиях подачи в промышленное Ферментеры.

Исследовали микрофлору водопроводной войч (из р.Волга), атмосферного воздуха и природного газа;, чтобы определить влияние

случайной микрофлоры на микробный состав биоиеноза Ферментеров

I _ * ' I "

ОПУ. Наиболее распространенным прибором для бактериологического

исследования воздуха является щелезой прибор Кротова. Однако, по

нашим данным , на аппарате Кротова были получены заниженные шФры

при определении количества микробных'клеток воздуха в исследуемом

регионе (табл.Т). Результаты количественного учета клеток мнкрооп-

ганизмов воздуха , природного газа и воды в течение года двумя методами показали преимущество метода МРУ (с использованием таблиц Мак-Креди) для количественной опенки микро^ишры по сравнении с методом Коха (ММВ), которое выявляется при сопоставлении результатов исследования."Однако. , метод МЫВ дает возможность опекить разнообразие микреНвлорч по морфологии колоний.

Таблица I.

Количественный учет микробных клеток воздуха , проведенный различными методами.

Используемые питательные среды 1 Количество клеток в 1л , чными методами определяемое разли-

Метод ММВ ' Метод МРУ Аппарат Кротова

Объем анализируемого воздуха ,л

50 50 7 20 40 50

Ш (МПБ) 1,2. Ю3 5,1.10^ 0,6 0,18 о,ое о,4;

ВФ с этанолом 1,7 ЛО3 9,1.10^ 4,3 0,9 0,24 0,21

Вф с глюкозой 8,0.10^ 2,7Л05 и.о. 1,0 и.о. н.о.

Примечание. Н.О.- не определяли.

В исследованных образцах воздуха и природного газа наибольшее количество микроорганизмов всех исследованных Физиологических групп

р О !

обнаружено осенью (от 10 до 10 клеток/л) (рисД). Количественное содержание микрофлоры в воде значительно выше , чем в воздухе и природном газе , и преобладают бактерии , ассимилирующие белок. Динамика количества микрофлоры такова , что пик наибольших значе-' ниЯ приходится на лето от 10^ до 10^ клеток/л. Значительные различия количества микробных клеток в воздухе и в воде в разные периоды времени отбора проб обусловлены как переменчивым направлением и непостоянством скорости воздушных потоков (что характерно для исследуемого региона особенно летом), так и нестабильностью периодичности поступления загрязняющих веществ (производственных и бы-

овых стоков") з речную воду, это приводит к изменению состава био-еноза водоема.

з

Рис.1.Количество клеток бактерий , ассимилирующих глюкозу (I) белок (II), этанол (III") в образттах'Природного газа (а), воздуха (б), воды (в) в течение года1 vi- весна, 2-лето, 3-осень, 4- зима). & - логарифм числа клеток (#) в 1л образна. J

I

Поскольку Факторы , влияющие- на количество и состав микроФло-ы воздуха и воды нерегулируемч и учитывая нестабильность проиес-а биосинтеза на природном газе, .целесообразно стерилизовать вхо-ящие е ферментер потоки (вода и воздух) при культивировании метант-кислящих бактерий.

дентиФикапия- бактерий-спутников метанокислташих бактерий . л "k.MjtJxf^t&tJ. | "

Изучали Физиолог,^биохимические и культуральные свойства штам-ов ВФ-2 , ВФ—17, ИШ-7, ИМВ-3. Установлено , что исследованные икроорганизмч - грамотригттельнче папочки , пэдзижчые или н-^поя-ижные, строгие аэробы , оксидазоотрипательные , наталазополпжи-ельные, нэ гллролиуот крахмал , не разжижает желатину- , рас?-/т

Таблица 2.

Изучение у исследованных штаммов ди'М'еренпир'/рщих признаков родов зъяЯеггыа-, УиЯ/Ог?**- и .

Признаки Исследуемые штаммы Бактерии родов*

-

ВФ-2 М-17 ИМВ-7 ИМВ-3

Окисление этанола до ацетата + + + + ' + + +

Окисление ацетата до С0^ • - - - - - + -

"Сверхокисление" этанола - - - - - +

Окисление лакта-та до СО£ + + - + + + • г-

"Сверхокисление" глюкозы - + - - +- - -!

Коричневый пигмент на среде Нет

— сл. роста ■ + — —

Максимальная"температура роста, С 42 42 50 50 37 30 30 1 , !

Рост при рН 3,6 + ' ¥ + + + - ! ;

Эбразование ¡^ + +■ - - + - 1

Збразование спор - - - + - 1 :1 " -

Г+Ц в ДНК, мол к 63,1 63,1 64,0 54,8 62-64 51-65 57-64

—Лримечан-ле. к Данные использованы из- определителя¿¿¡^ер^и-статей

(см. выше). '*+"'- положительный признак. - отоииательный признак, "сл." - признак выражен слабо, "+- - реакция (признак) V* штаммов-различна. • ■ :

^_на этаноле и/или ацетате , не используют в качестве единственного источника углерода метанол, растут при-рН 4,5 (аиидотолер^нтны), органогетеротроЛы. Температурный диапазон роста варьирует. Все штаммы растут в диапазоне 30-42 °С , слабо - при 20°С. Все штаммы растут на среде ¿лга^А**-, содержащей маннит в качестве един-'

ственного источника углерода , а также на среде-^Й^^^с манни-< том, образуя пигментированные колонии,. Согласно полученным резуль-

татам , приведены™ в таблице 2 , штамм И!®-"7 можно отнести к ро- • ду , штаммы 8Ф-2 и ВФ-17-- к сод-' .

При идентификации бактерий на уровне вид?з использовали пред- • ложенные минимальные стандарты для определения рода основанного на одном виде ., 1960) и опи-

сание рода ^¿»/^Иййй^&й^ , основанное на одном виде

/ЬМ&ирсй!..., 198Г). Исследованные нам;? лтаммы ЗФ-2 и ВФ-17 отличаются от описания .отсутствием лоричнетэго водо-

растворимого пигмента , но по Фенотипическим признакам , а также содержанию Г+Ц'в ДНК (63,1 жл.%) штамм ВФ-2 можно отнести к виду ■

I

.1980, 547..Некоторые свойства штамма ЗФ-17 отражают особенности его метаболизма и позволяет его считать четипичк-м зтаммом поскольку Ао остальном дцф^ерекгиру-сзим признакам и содержание Г+11 в ДНК (63,1 мол.$) штамм ВФ-17 идентичен Зпю&^^аг- аицгу^г-СЬ&и , ¿Ш&и , ¿ш^&Лй? 1980, 547.

Отличия штамма ИШ-7 от незначительны. И по- основн-

ым признакам штамм ИМВ-7 можно отнести к вид-/ МрсбШ&Лф 1961 , 47.

Штамм ИМВ-3,в отличие от вышеуказанных бактерий, по характерной морфологии.клеток (выраженное спорообразование) можно-раесмат-ривать как представителя ■ сем. , рода ^гг&.и ,

поскольку штамм аэроб. Несмотря на то , что клетки штамма ИМВ-3 -грамотрииательные (при окрашивании по Грану^ , изучение строения клеточкой|стенки на ультратонких срезах клет-л! показало , что штамм ИМВ-3 принадлежит к группе грамположигельяых бактерий (клеточная стейка -трехслойная). По основным ди^еренпируюшим свойствам штамм.ИМВ-3 можно, сравнить с недазно опи:анным представителем рода , Яняр , 1967) , у ко-

торого содержание Г+Ц в'ДНК - 52-58 мол.З. Стличия каса:отся только

-14-

р^сположемйя спор : у штамма ИМВ-3 расположение элипсовидних спор .. _от центрального до терминального (клетки-спорангии могут быть раздуты ), у терминальное. Исходя из изложенного выше , мы полагаем , что штамм ИМВ-3 принадлежит к виду ¿^«¿¿¿^йг

Таким образом , исследованные наш этанолиспольаушие бактерии -спутники отнесены к видам ^О^гиО'и ВФ-17) ,

и ¿¡¿¿¿/"¿я (ИШ-3).

Взаимозависимость монокультур в микробных ассоциациях Ш и Яга/еиыл- ааудл//а{, штамма ВФ-2 и ВФ-17). ;

. . Определены в ростовых условиях константы ингибирования роста Мэтанолом и ацетатом , которые , соответственно состав-_ ляли 0,299 и 0,167 г/л. Этанол и анетат являются субстратами для ■ бактерий-спутников ТСаиг&'/^&лж. концентрация определяет интенсивность ^роота Ои&г/гЖО'. Были определенн субстратные константы (Кэ ) и максимальная удельная скорость роста исследуемых штаммов . "ВФ-2 и ВФ-17 на среде с этанолом и ацетатом (см. табл.3). Установлено. , что коэ^иииенты "приспособленности" С^НАбросов и др., . , 1982) к субстратам у бактерий-спутников различна , так штамм ВФ-2 более"приспособлен" к аиетату , штамм ВФ-17 к этанолу. Однако , "приспособленность" штамма ВФ-2 превышает таковую штамма ВФ-17 и к

• этанолу и к аиетату. По нашим расчетам при использовании двух' штаммов Т/г&ъал^М-, растущих на одних и тех же субстратах (этаноле , ацетате) , в микробной ассоциации , растущей на природном газе в режиме хемостата , после начального переходного процесса штамм .' ВФ-2 , имеющий большие скорости роста на этаноле и ацетате , будет вытеснять штамм ВФ-17 при любой скорости разбавления среды.

Изучали влияние этанола и ацетата на рост чистой культуры . М. различных вариантов микробной ассоциации ( М.

+ . Наиболыаа#.удельная скорость роста микробной

Таблипа 3.

Характеристика роста штаммов у^Д^иг/сЙЯ-на двууглерод-' нчх субстратах.

Показатель . .'(• штамма

ВФ-2 ВФ-17

Субстрат

Этанол Аиетат Этанол Ацетат

- Э кономический. коэФ-. Фиииент, У , Гу/ гАСВ ~ 0,33 0,14 0,25 0,12

Максимальная удельная скорость.роста , /мах. * . 0,27 0,667 0,21 0,318

Субстратная константа , К . 0,33 0,4 0,28 0,62

Коэффициент "приспособленности" к субстрату , £' . 0,818 1,667 0,75 0,513

ассоииаши была получена при концентрации этанола в среде 0,3-0,5 I

г/л (/=» 0,121-0,132 ч-1) и ацетата 0,4 г/л (/= 0,124-0,147 ч"1)' (рис.2.)..Согласно полученным данным , микробные ассоциации , состоящие из монокультур М. У^иЖг^ и Т'&и&л^&Ь' ВФ-2 более продуктивны (удельная скорость роста наибольшая).

Исследовано изменение соотношения монокультур в искусственной микробной.ассоциации при росте на природном газе (рис.3.). При подсеве гатаммов-спутников монокультуре М. СО^Ие&Жм

(примерно в середине экспоненциальной Фазы роста) и в течение выращивания (24 часа) микробной ассоциации М. ¿й^Ли^а^^. соотношение клеток и клеток спутников (штаммы ВФ-2 и

ВФ-17) не изменилось (10:1) Установлено , что прирост биомассы искусственной ассоциации микроорганизмов на природном газе выше в 1,3-1,5 раз, чем чистой культуры

что подтверждает

литературные сведения о преимуществе культивирования на природном газе микробных ассоциаций. . '

Тс'

и.

Рис.2. Зависимость удельной скорости поста на природном газе монокультуры М.ЩЬлиш--¿си (I) и различных вариантов искусственных микробных ассоциаций (2, 3,4) , в состав которых входят И.&р-и

(2- штамм ВФ-2, 3- штамм ВФ-17, 4-штаммы Вф-2 + ВФ-Г

от заданных концентраций этанола (а) и ацетата (б)' в среде.

| - Таким-образом, определены варианты микробной ассопиагаи — ( М. + Т'сшмл^&г-} наиболее перспективные для выращива-

I '

ния их на природном газе. Взаимозависимость монокультур в данных микробных ассоциациях основана на тропических взаимоотношениях. Субстратные константы (этанол, аоетат) для .Я^АЙ^^^эначительно выше , чем ингйбиторные константы:(те же соединения)'для

1111

Рлс.З. Некоторые показатели поста и микробных ассо-

циаций пли выращивании их ча ппйподном газе. I- уровень биомассы, гАСВ/л ,,2,3,4 - логарифм числа (к ) клеток монокультур Ди : 2- М. т/И^О-^ \ 3-ВФ-2 , 4

' ВФ-17. I, II, III - различные варианты микробной ассопиа^ия 1У- монокультура М. ^АзиЛ.^ . Стрелкой обозначен моментчподсеза

зазличных" штаммов ¿там&гл?!^ (на 24 ч роста

\

, что свидетельствует о том I, что при совместном культивировании М. еЯЛЛи/аЖ^ и ТалгЛ^^ , рост лимитироваться концентрациями этанола и ацетата , которые в реальных условиях культивирования не превышают значений для данных штаммов Я'цитДЛ^й^, поэтому эти зггаммн не могут расти с максимальной для -тих скоростьо.

Изучение устойчивости симбиоза М. и 5Г

три непрерывном культивировании в промышленном Ферментере на при-

тодном газе.

' Определяли устойчивость симбиоза М. ЩИи^^-^ ^¿ги-т^лЯЛ" з экстремальных условиях (экспозишя клеток с /Нд и /С? ) , з результате чего в периодическом процессе наблюдали увеличение лаг-зазы роста ъмкробной ассот/аши до 10 часов. Экстремальные условия три в ели к частичном*' лизис клеток л поязлекто з среде '«зов-

ня органических зедеств , который тормозят пост М. Соотношение клеток монокультур в микробной ассоциации меняется в сторону увеличения клеток потребляющих эти вещества.

По мере удаления спутниками ингибиторов метанокислягащих бактерий из среды , возрастает скорость окисления метана клетками М. -fadz&J и изменяется соотношение клеток М. Wfä&Jiz&J ц ^¿¿¿¿яг/^бЛ' в сторону увеличения содержания клеток метанокислящих бактерий. Установившееся соотношение монокультур устойчиво в течение всего дальнейшего культивирования.

Исследовала ряд параметров выращивания микробной ассошаши при различном коэтеипиенте разбавления среды (различной скорости роста клеточной популяши) (рис.4.). Установлено, что удельная скорость, окисления метана клетками Ммаксимальная в области значений от 0,125 до 0,25 (при = 0,2 составляет 306 нмоль/мгАСЗ.мин). С увеличением^скорость окисления метана снижается и при-,/ = 0,375 ч-^ достигает минимальных значений III-120 нмоль/мгАСВ.шя. Микроскопический анализ культуральной жидкости показал , что с увеличением коэффициента разбавления среды от 0,1 до 0,4 ч"1 количество клеток М./5fyiju&iiaa уменьшилось в 5-8 раз, а тиглейZ<_ в IOQ-200 раз , в то время как при $=0,2-0,25 ч"1 соотношение клеток обеих культур, практически не изменилось . Снижение содержания клеток сопутствующей микрофлоры приводят к повышению уровня экзометаболитов в культуральной жидкости и к снижению скорости окисления метана клетками М. . в .неп-

рерывном рекиме культивирования при "вымывании" клеток максимальная удельная скорость роста (/^мах ) микробной ассопиаииии равна 0,467 ч"1.

Таким образом , уровень экзометаболитов метанотрсФных бактерий в среде -Нормирует количественное соотношение монокультур в микробной ассоииашя. Удельная скорость роста монокультур , рас-

-6-i

выделенными и описанными Горской и др. (1987) и

ИМВ-П1п/б , выделенными и описанными Малашенко и др. \ (1975). Штаммы были пол'/ченч из коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украины. j Исследовали также смешанные культуру метанокисляющих бактерий М. \fftfottfofcf й U., селекционированные при выращивании на природном газе при непрерывном режиме в промышленных Ферменте- j pax ОПУ Све'тлоярского завода БВК.

Выращивание мётанокислящих бактерий осуществляли в атмосфере

... i

цриродного газа и воздуха (1:3) в жидких и на. агаризованных средах.

К (Малашенко и др'^,1975э) и ВФ (Романовская и др.,1988). Сопутству-

г . ■• "I

пщую микрофлору метанокислящих бактерий выращивали на среде ВФ с добавлением различных источников углеродного питания : этанол, апе- ' тат, 'глюкоза - 0,05 % и выше. Выделение чистых культур бактерий-

I

спутников и проявление микробного антагонизма осуществляли обие-принятыми методами.

Для непрерывного культивирования микроорганизмов использовали ферментер струйного типа с рабочим объемом 950 л. Количество подаваемого в Ферментер воздуха - 100-120 м3/ч , количество природного газа - 30 м3/ч. U. M/UvJtfai выращивали при температуре 43°С , рН 5,0-5,2 , - при 50°С , рН 6,0-6,8. Содержание

азота в культуральной жидкости определяли методом Несслера , фосфора - методом Суббароу (Баславская, Трубеикова ,1964). Мётан и кислород определяли газохроматографически (хроматограф ЛХМ-8МД), этанол и ацетат в культуральной жидкости - на хроматографе ¿titsz? -5 с хроматографичоскими колонками, наполненными сорбентом "Полисорб -I" . Скорость окисления метана клетками определяли полярографическим методом (полярографический анализатор , модель РА-4) с применением электрода закрытого типа (Малашенко и др.,1978). Абсолютно сухой вес (АСВ) клеток определяли спектроФотометрически на

: ' -го- • .

са культивирования. Полученные графические результаты расчетов , для которых были взяты характеристики штаммов ВСБ-

874 (метанокислящие бактерии) и и ВФ-Г7) ■ Сбакте-

рии-спутники) и заданы начальные условия культивирования микробной ассоциации в режиме хемостата, согласуются с полученными ранее экспериментальными данными и свидетельствуют о том , что для стаби диэаиии процесса биосинтеза на природном газе в качестве спутника ; метанокислдащей микробной ассоциации достаточно использовать един штамм РОииШЬл-Ш-г. Однако, подсев двух штаммов

(ВФ-2 и ВФ-17) ускорит процесс удаления экзометаболитов

(этанола, ацетата) из культуральной жидкости (особенно при нарушении процесса культивирования). Выводы.

I. Микробные биоценозы , растущие на природном газе , которые Формируются в различи« Ферментерах исследуемого региона Нижнего Поволжья характеризуются идентичным составом и постоянот- ■ вом определенных видов сопутствующей микрофлоры. 1

• 2. Содержание случайной микрофлоры , попадающей в Ферментеры с входящими потоками , значительно ниже сопутствующей микрофлоры. I Микроорганизмы , поступающие в ферментеры с воздухом и природным газом , практически не влияют на состав биоценоза Ферментеров , то: гда как высокое содержание их в воде способствует изменению био-пеноза в Ферментерах (особенно летом). . , ,

3. Предложенный метод "количественного учета микробных клеток в воздухе и природном газе позволяет определить содержание различ!-ных Физиологических групп микроорганизмов и более чувствителен , чем аппарат Кротова и другие.

' 4. Бактерии-спутники , изолированные из ферментеров.при. куль? тивировании ВСБ-Э74 и М. ^баМрА^Зу,

ИМВ-Шп/6 отнесену к видам ¿Зй^яый?' ,

аяУЛ&Л^гШ, 547 (штаммы 35-2 и 3-3-17) ;

&Лр 1951 > 47 (штаммы ШЗ-7) и сХ/ги-ЗЗ? алег?/ёяр^сог?) 258 (зтамм ИМВ-З). Отличительные свойства бактерий-спутников - способность ассимилировать этанол и/или ацетат (экзометаболиты метанокисляющих бактерий) и тем самым устранять их ингибирутощее действие на репродуктивные свойства метанокисляющих бактерий.

5. В ростовых условиях субстратные константы (этанол, ацетат) для ^¿¿Р&б&г- (з?ак,1 35-2 : К|= 0,33 г/л, К|= 0,4 г/л ; штамм ВФ-17 : 0,62 г/л , К$= 0,28 г/л) значительно зыше , чем инги- • биторные константы (этанол, агтетат) для У. ¿¿^И^^^ (Ка= 0,299 г/л, К|.» 0,167 г/л ), поэтому при культивировании искусственной микробной ассоциации ± ) на природное газе

з среде не будет происходить накопление С^-соединени-?..

6. Продуктивность процесса при зыразгязакии микробной ассоциации , состоящей из Ми^¿^Ш/ф^- йФ—С выше. , "Ч6М ГТСИ ' выращивании монокультуры ш. ауииЫЬ* . лоличесгзеккое соотнозе-ние монокультур в искусственных микробных ассоциациях стабильно в течение всего процесса культивирования на природном газе и основано на трофической взаимосвязи монокультур в биоценозе.

7. Удельная скорость роста монокультур , растущих з симбиозе' на природном газе , различна и определяет степень взаимозависимости монокультур в ассоциации и устойчивость данного симбиоза. Для поддержания необходимого соотношения монокультур в микробной ассоциации М. са+• выращивание следует вести в условиях , оптимальных для обеспечения максимальной удельной скорости роста обеих монокультур.

8. Предлагаемая математическая модель культивирования микробной ассоциации метанокисляющих и гетеротрофных бактерий-спут-:-глков может служить основой для газпаботки управления процессом

-22- ;

производства белка из природного газа, (гаприна). Список публикапий по материалам диссертации:

1. Романовская В.А. .Власов A.C. ,Спишн A.B., Харченко И.В. и ; др. Изучение устойчивости симбиоза vföffyiCQjiiuJk&J wjfe- '' -йЗафЬ- . // Микробиол.журн. - 1988.-Т.50, №5.- С.3-7.

2. Романовская В.А..Власов А.С.,Харченко И.В. Количественный учет микрофлоры воздуха и воды д районе Нижнего Поволжья. // Микробиол.журн.- I9S8.- Т.50, 15.- С.93-97.

3. Романовская-В.А., Харченко И.В., Шатохина Э.С. и др. Таксономическое положение некоторых атанолиспользующих бактерий. //. \

. .. . j

Микробиол.журн. - 1990,- Т.52,»4,- С.3-9.

4. Романовская В.А.,Титов А.Г.,Харченко.И.В. и др. Взаимозависимость монокультур в микробных ассоциациях ¿(¿¿fö^&^te&yJßfätf- • -fafaj и ¿гшгяг'й?. f[ Микробиол.журн. - 1992.- Т.54, №2.-C.3-9. i .

¿/¿Ätaeä. tt/ZC ¿¿¿ebb /Ш. Р. ¿30.

ъш /¿¿¿s. </ *

/kS/^ - e. -

. £ Sc? f-