Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль R-плазмид в формировании свойств госпитальных штаммов энтеробактерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль R-плазмид в формировании свойств госпитальных штаммов энтеробактерии"

российская академия медицинских наук ,

научко-исслвдовательскии институт эпидемиологии и микробиологии та. н. ф. гамалеи

"6 од

- Калвин Кирилл Викторович

6 ДПР 1993

на правах рукописи

роль я-1шзмид в формировании свойств госпитальных штлммов энтеробжгерш.

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1993

Работа выполнялась в Научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН РФ.

Научные руководители - доктор медицинских наук.

профессор, член-корреспон-' дент РАМН Г.Б. Смирнов, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.И. Глатман.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук С.Б. ВАКУ! КО, доктор медицинских наук. профессор С.Д. ВОРОПАЕВА.

Ведущее учреждение - Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

Специализированного Совета К.001.07.01. в Научно- исследователь > ком институте имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гама леи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.1 Гамалеи РАМН.

Защита состоится

993 г. в

час. на заседании

Автореферат разослан."

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

КОПТЕЛОВА Е.1

Актуальность проблемы. В настоящее время в детских стационарах отмечается рост внутрибольничных инфекций (ВИ), поразкавщих 15-20% госпитализированных детей. Одной из особенностей современной госпитальной инфекции является возрастание удельного веса условно-патогенных грамотркцательных бактерий, множественная ан-тибиотикорезистентность которых чаще всего детерминируется Я-плазмидами.

Плазмидная устойчивость является одним из факторов, определяющих рост внутрибольничкых инфекций. Помимо кодирования полире-зистеятностл Д-плазмиды обладают рядом свойств, которые могут способствовать формированию вирулентных штаммов, особенно опасных для' больных со сниженной иммунореактивностью, в том числе недоношенных, новорожденных и детей первого года кизни. Благодаря распространению в бактериальной популяции плазмид, влияющих на функции клетки, в одной клетке создаются оптимальные комбинации своЛств, обеспечивающие ей селективные преимущества. Такая клетка моэ:ет дать начало штамму или клону с особым клиническим, эпидемиологическим и экологическим значением.

В последнее десятилетие за рубежом появилось много работ по использованию плазмидного анализа в госпитальпом эпиднодзоре, что стало возможным благодаря ноеой молекулярной технике. В результате были выделены не только эпидемические птаммы, но и эпидемические плазмиди. Возник термин "плазмидная эпидемия". Klebsiella pneumoniae является наиболее выразительным воплощением феномена госпитальных плазмид. Однако, молекулярно-генетические свойства госпитальных Д-плазмид и их характерные особенности Есе еще не-цостаточкс изучены. Остаются также нерасшифрованными механизма ¡формирования госпитальных Я-плазмид и их вклад в формирование и распространение внутриболыичных штатов.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение молекулярно-генети-юских свойств госпитальных Я-плазмид энтеробактерий, оценка их ¡озмозкного влияния на формирование свойств госпитальных штаг,мов и [х вирулентность, а также использование плазмидных параметров 1таммоз в анализе состояния популяций F.. pneumoniae в детском :ташюнаре. Для достижения этой цели были поставлены следующие адачи:

I.Создать коллекцию клинических штаммов энтерсбактеркл, выде-снных в роддомах и детских стационарах некоторых городов страны.

Охарактеризовать штаммы по био- и серстшам, по структуре и генетическому контролю антибиотикорезистентности, плазмидкому профилю.

2.'Охарактеризовать выявленные Я-плазмиды по молекулярно-генетическим свойствам Дконъюгативность, молекулярная- масса, рес-трикционный профиль и др.).

3. Выявить наиболее распространенные, длительно персистирую-щие в стационарах и эпидемические Я-плазмиды. Изучить их влияние на фенотипические признаки и вирулентность штаммов-хозяев (про-дуция токсинов, адгезинов, гемолизинов, эндонуклеаз).

4. Осуществить длительный микробиологический мониторинг популяций К. pneumoniae в Российском Научно-исследовательский Центре по Акушерству, Гинекологии и Перинатологии РАШ (РНИЦ АГП РАМН), . с целью выявления доминирующих эпидемически опасных штаммов и возможного участия плазмид в их формировании.

5. Выявить штаммы К. pneumoniae, наиболее длительно персисти-рующие в РНИЦ АГП РАШ, с использованием предложенного критерия ("эффективного периода персиотенции").

6. Проследить динамику общей численности К. pneumoniae, высеваемых у детей в РШЩ АГП РАМН, с целью выявления тенденций в изменчивости данного параметра. Использовать плазмидные параметры популяции для оценки разнообразия популяции К. pneumoniae в целях слекения за развитием эпидемического процесса в стационаре.

Научная новизна.

Проведен сравнительный анализ молокулярно-генетических параметров конъкгативных Я-плазмид, выявленных в госпитальных- итаммах энтеробактерий, преимущественно К.pneumoniae и Serratia тагсез-сens, выделенных, в 9™ стационарах 4х городов бившего СССР. Показана способность госпитальных Я-плазмид к длительной пэрсистенщи в одном стационаре, распространении между стационарами, а также консервативность их структуры, что-является подтверждением возможности их использования в эпидемиологическом'анализе. Выявлены 3 группы конъюгатизных Я-плазмид, циркулировавших в штаммах К. pneumoniae, S. marcescens, Enterabacter cloaceae в шести детских стационарах г. Москвы.

Обнаружены и охарактеризованы Я-плазмиды, влиящие на вирулентность и фенотипические признаки госпитальных штаммов-хозязв (цитотоксичность, продукция термостабильного (ST) и термолабильного (Iff) токсинов и повышенная выживаемость в аэрозольном состо-

яшш). Впервые списана Д плазмида с молекулярной массой 40 Мега-дальтон (МГп), определяющая цитотоксичность бактерий по отношении к клеточной линии НЕр-2. Зта плазмида была выделена из двух различна штаммов К. рпеитогЛае, возбудителей двух независимых вспышек ВИ новорокдешых в РНИЦ АГП РАМН. Показано ее участие в формировании даншх штатах.

Показана высокая эффективность использования плазмидных параметров популяции К. рпеыпоп1са для оценки ее гетерогенности на основе предложенного критерия. Установлено, что в эпидемические периоды гетерогенность популяции К.рпситоп1ае достоверно менее шракена, чем з межэпидемические.

• ■ Выявлена тенденция постепенного замещения представителей грамотрицательннх бактерий на грамполояителькые в двух отделениях терапии новороаденпзлс в РНЩ АГП РАМН в течение 6ТИ лет наблюде-1ШЯ.

Выделена и охарактеризована новая рестрикциотшая эндонук-лэоза БсоН1 (ССС/вСС), кодируемая плагмндой.

Научно-практическая значимость.

Данные о структуре антибиотикорезистентности госпитальных птаммов энтеробактэрий моаяо использовать при разработке рациональных схем антнбиотикотератта в отделениях новорожденных. Опыт трехлетнего микробиологического мониторинга в РНЩ АГП РАМН свидетельствует также о необходимости постоянного эпиднадзора за распространением устойчивых итаммов и ¡к плазмяднмм составом, выявление доминирующей! эпидемически значимых штаммов и Я-плазмид, закономерностей их поведения в различные стадии эпидемического гроцесса позволило продлоаать еффзктивяне мары, позволившие предотвратить вспышку ВИ в РНКЦ АГП РА».Л (г. Москва)'.

Результаты использования плазмидных параметров бактериальных ггаммов и популяций в целом для анализа эпидемических ситуаций в }1Ш АГП РА?'Л позволяет рекомендовать данный подход для оцешси я [рогнозироватшя развития эпидемического процесса в детских стационарах -

Новая рестрикдаонная эндонуклеаза ЕсоН1 может быть использо--ана в молекулярной биологии и генетической инхзнсрки.

.Материалы диссертации апробированы на заседании научноЛ кон~ ерзнции отдела молекулярной_с,.!ологил и генетики бактерий НИ'А пидемиолйгии и Микробиологии мл. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Сделано 2 оклада: на Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и

медицина" (Ленинград-1990), на 17м Международном конгрессе по химиотерапии (Берлин-1991), опубликованы сообщения з материалах Всесоюзной конференции эпидемиологов и паразитологов (Барнаул-1988), Всесоюзном семинаре' "Бактериальные плазмиды" (Нальчик-1990), Международной конференции но предотвращению инфекционных заболеваний ( Ницца-1990).

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2х глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 190 страницах мапинописного текста, включая 4 таблицы и 23 рисунка. В списке литературы - 287 работ (53 - отечественных, 234 - иностранных).

М А Г Е Р И А Л Ы И МЕТОДЫ.

В работе были использованы 582 штамма знтеробзктерий, выделенные в девяти детских стационарах четырех городов бывшего СССР (Москва, Санкт-Петербург, Вильнюс и Киев). Штаг.мы были любезно предоставлены д.м.н. A.C. Алкирской (г. Москва), к.м.н. С.С. Ба-локрысенко (г. Москва), Л.А. Березиной (г. Санкт-Петербург), к.б.н. М.М. Баркусом (г. Вильнюс), д.м.н. О.П. Селышковой (г. Киев).

Штаммы бактерий выращивались на следующих питательных средах: минимальной среде МЭ, LB-бульоне и LB-arape (0.8-1%) (Миллер, 1976). а такие мясо-пептонкых бульоне и агаре (1£), изготовленных в НИКЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Конъюгации штаммов энтеробактерий с рецмпиентшми штаммами Б.coli J62 или E.ooll J53 проводили, как описано (Миллер. 1976). Анализ плазмидкой ДНК, включающий Еыделение и очистку плазшдной ДНК, рестрикцию и электрофорез ДНК в агарозном геле, вели в соответствии с методами, подробно описанными в (Manlatis, 1988). Гиб-' ридазацию колоний бактерий с ДНК-зондами проводили как описано в том же пособии.

Для определения токскгекности исследуемых культур энтеробзк-терий применялся метод иммуксферментного анализа (экзимоиммуноб-лот) (Wilson, ifatae, 1978).

Оценка адгезивнооти кчцитотоксичности исследуемых ктоммов • K.pneti-nanlae по отношении к клеточной культуре НЕр-2 проводили

как описано в (Калкип и др. ,1392), а -такие методом электронной сканирующей кккроскспии.

Определение эндонуклеазной активности в штатах Enterobacteri-асеае, з таюхз выделение и очистку рестриктазы EooSI проводили как описано в (Глатман и др., 1990).

Разнообразие бактериальной популяции по данному признаку -спектрам знтибиэтикорезистентности ("эффективное число спектров") и плязмидшм фенотипам" ("эффективное число плазмидшх фенотипов") - рассчитывалось по формуле, описанной в (Животовский, 1930).

"Эффективная продолжительность встречаемости спектров" (в месяцах) высчитысалась по той же, но несколько модифицированной формула. Достоверность различий мезду вычисляемыми параметра?® : !гшслялась по критерию Стыодента.

Для оценки степени связи мекду двумя отделениями терапии поторопленных в FHI-Щ АГП РАМН использовали данные о высеваемости

видов 1Я1кросргаш:змов (Esherichta colt, К.pneumonias, Staphylococcus spp. и Enterococcus зрр.) с последующи анализом матртщы корреляций высеваемости и ююгомерннм анализом главных кожонент (Torgeraan, 1952).

Для определения главных компонент по данным о вксевазмости 4х изучаемых видов мккроорганиз?лов было использовано обычное для та-сих случаев вычисление корреляционных матриц с последующи:-! нахождением собственных "значений и собствешшх векторов (Torgerson, 1952, Кивотовский! I9S4).

РЕЗУЛЬТАТЫ ¡1 ОБСУЖДЕНИЕ.

Коллекция ттаиыов энтеробактериЛ.

Была собрана коллекция из 582 клинических штаммов сем. Entera-'асгеПасеае, в основном состоящая из К. рпеитоп1аз и 5. ггагсез-епз, выделенных з 9™ детских стационарах 4х городов бывшего СССР Москва, Киев, Вильнюс,. Санкт-Петербург) (Табл.1). Штамм были характеризованы но био- и серотипу, структуре и генетическому снтролю антиокотгаорезистентности, ,пласш1дному профилю и некото-;;м молекулярно-генетическим свойствам выявленных конъюгатлада -плазмидч

У 85 % изученных госпитальных штаммов выявлено наличие шю-

ТаблЛ. Видовой состав коллекшт иташов £гг1егоЬас{еКасеае.

Гирод Стаци- . Время ВИД Количество

онзр выделения микроорганизма итьммов

Москва I ДКБ 7 ДКБ 10 ДКБ

13 ДКБ

3 РД го рд -

РНЩ

АГП

РАШ

Санкт-Петербург I ДГБ 1588-50 К. рпеитогЛае 96 '

Вильнюс ВРДБ 1982-86 К. рпеилгогЛаэ 25

К. охуХоса г

С. /геипйИ &

Киев 8 РД 1987 К. . рпеитоп1ас 22

Всего 532

Условные обозначения к таблице: 3. гагсезсепз - ВаггаТЧа паг-сезсегд, К. рглшоп1ае ~ К1еЪз1е11а рпеитап1аг, С. /геипй!С - С11-гооас!ег /геипсШ, ДКБ - детская клшическая больница, ДГВ- детс:;зя городская больница, РД - роддом. РНЩ АГП РА2Д1 - Рссс-дйсккй Научно-исследовательски? Центр .по Акукоротву, Гинвкололм Першатс-логд: РАМН, ВРДБ - шлышссхая республиканская дотекая болышца.

1937 ' К. рпеитоп1ао 5

1987 Б. 1гпгсеасет13 5

1981-87 К. рпеит,\ап1ае 7

5. кагсевсепз 3

1983-86 г. тагсезсепз 29

гг л.. рпехтоп1ае 3

771 . аегезепез 2

С. frexmd.it

1936 К. рпеипоп1ае 5

1987 К. рпеипопЮе 6

1333-87 К. рпеиъотае 18

1987-92 к. рпешоп1ае 327

Е. . сХоасеае 20

- О -

^ 4

явственной устойчивости к антибиотикам, главным образом к зэтш-цпллину, карбенкциллину, тетрациклину, хлорамфениколу, кангда^к-ну, гентэмишшу, тобрамицину.

Штаммы характеризовались, как правило, полиплазмидным с£>в-?а-вом. Показано, что у 75 % полирезистентных штаммов множестдемкая устойчивость кодируется конъюгативными Я-гишзмидами с молекулярной массой преимущественно от 40 до 120 Ш>д.

22 штамма К. ргеиъап1ае и I штамм 5. исгсезсепз оказали«^ активными продуцентами ХГ-токсинз, а I штамм К. рпешоп1ае -5Г-токскна.

Н-плазыиды госпитальных штаммов.

Сравнительный анализ молекулярно-генетических свойств Я-плазмид госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в В™ стационарах г. Москвы, позволил выявить Я-плазмиды, длительно нерсистирующие в стационарах. Посредством рестрикционного анализа их удалось подразделить на три группы. К первой груше относились 10 плазмид размером 56^14 КЬ, обнаруженные в госпитальных атаммах, выделенных в 10 и 13 ДКБ. Вторая группа была представлена 15 плазмидами размером 60 КЬ, обнаруженными в 13 ДКБ и ИНЦ АГП РАКИ (рисЛ). Третья группа состояла из 12 плазмид размером 114 КЬ, выделенных в 10 ДКБ, роддомах йй 3 и 20. Тагам образом была показана способность Я-плазмид госпитальных штаммов к распространению но только внутри, но и между стационарами.

Следует отметить, что Я-плазмиды первой и второй групп были выделены из разных родов сем. ЕяХегрЬас1ег1асеае: Е.' сегс^епез, 3. кагсезсепз, К. рпеитоп1ае, что монет свидетельствовать об их способности к межродовому обмену. В то не время Я-плазмиды треть-зй группы выделялись только из штаммов л. рггшоп'.ае.

В ходе данного исследования были выявлены, с одной стороны, значительная консервативность структуры коньюгативкых Я-плазмид, с кругой - тенденция к небольшим структурным перестройкам. В отдельных случаях зти перестройки коррелировали с добавлением новых детерминант антибиотикорезистентности, главным образом, к амино-

"ЛИКОЗИДСМ.

Способность Я-плазмид госпитальных штаммов к длительной пер-зистенции в стационаре была подтверждена так.^е результатами^ порченными при изучении штатов К. рла^.оШ^, выделенных в стаци-знарах гг. Киева, Вильнюса и Санкт-Петербурга.

Тагам образом, сравнительный анализ штатов энтеробактерий,

1 2 3 4 5

|—2.1 КЬ

I i

* „—1.2 кь

Рис.1. К шазмзда размером около 60 КЬ, выдолешшо в ?/' стационарах г. Москвы (обработка ундокухлеазой PstI):

1 •• R2Q (ГЗ ДКБ, 1981 г.)

2 - Ю8 (13 ДКВ, 1985 г.)

3 - R253 (13 ДКБ, 1937 г.)

4 - R6 (ВЕЩ АГП Ю Р5, 193? г.)

5 - RT (ВНМЦ ЛГИ МЗ РЗ, IS87 Г.)

Справа даны молекулярные веса фрогиенгоа ДИК фага х., оо-рзботгшшх рестриктазой PstI в кклобззах (КЪ).

выделенных в 9™. детских стационарах 4х городов бывшего СССР, позволил Еыделить конъюгативные Я-плазмиды, длительно персисти-рующие в стационарах. Были отмечены некоторые общие особенности этих плазмид: возможность существования в различных видах Enterobacter iaceae, консервативность структуры, на исключающая небольших изменений рестрикционного профиля с течением времени.

Для дальнейшего выяснения вопроса о роли й-плазмид в формировании свойств госпитальных штаммов было предпринято исследование госпитальных штаммов бактерий и их плазмид в динамике в условиях одного стационара. С этой целью был проведен длительный микробиологический мониторинг в РШЦ АГП РАМН.

Микробиологический мониторинг популяции К.pneumoniae.

В ходе Зх-летнего микробиологического мониторинга, проведенного в двух отделениях - отделении патологии новорожденных (ОПН) и отделении интенсивной терапии новорожденных (СИТН) РШЦ АГП РАМН, были получены следующие основные результаты:

1. Выявлены и охарактеризованы 2 госпитальных штамма К.pneumoniae, вызвавших 2 независимые вспышки ВИ в ОИТН с интервалом в один год. Эти штаммы различались по всем изученным параметрам (био- и серотипам, рестрикционному профилю хромосомной ДНК, типам агглютининов) кроме плазмидного состава: оба штамма содержали пла-змиды с молекулярными массами 105 и 40 UDa. Была отмечена общая тенденция в динамике численности этих штаммов, выразившаяся в возрастании относительного количества этих штаммов в диагностических анализах в период перед бспышками ВИ. Следует отметить, что в меж-вспышечные периоды штаммы с таким плазмидным фенотипом практически отсутствовали, в то время как штаммы, содержавшие одну неконъюгатив-ную'плазмиду 105 Ида, высевались в периоды, предшествовавшие обеим вспышкам.

2. Показано, что плазмида с молекулярной массой 40 UDa конью-гативна и кодирует устойчивость к ампициллину, аугментину, карбо-нициллину, тетрациклину. Во время второй вспышки к этим маркерам добавляется устойчивость к гентамицину. Выявлена высокая степень сходства между рестрикционными профилями Я-плазмид 40 UDa из обоих штаммов, вызвавших две вспышки ВИ, что позволило идентифицировать эти плазмиды как одну эпидемическую Я-плазмиду, длительно персистирувщую в данном стационаре п принимающую участие в формировании этих штаммов. Нам не удалось выяснить роль 105 К Da плазмиды, однако, полученные данные поззоляют предположить, что соче-

тание этих двух плазмид в одном штамме является важным условием формирования эпидемического варианта.

3 Проведен сравнительный анализ гетерогенности популяции К. pneumoniae в различные эпидемические периода с помощью предложенного критерия "эффективное число фенотипов". Показано, что гетерогенность популяции К. pneumonias в эпидемически опасные периоды (вспышки ВИ) достоверно ниже, чем в эпидемически благополучные периоды (рис.2). Использование плазмидных параметров популяции (плазмидных профилей) для расчета показателя разнообразия оказалось более эффективным, чем данных об антибиотикорозистоктиости штаммов. Так, если для получения достоверных различий по разнообразию популяций К. pneumoniae в различные эпидемические периоды по признаку антиОиотикорезистентности понадобился анализ всех штаммов, выделенных за 3х-летний период (1107 итаммов), то при использовании плазмидного профиля штаммов оказалась достаточной выборка из 327 штаммов.

Полученные данные о гетерогенности популяций клебсиелл в РНИЦ ДТП РАМН хорошо согласуются с теорией саморегуляции микробных популяций и их фазового преобразования, " Мотанной Беляковым (Беляков, 1987), согласно которой периоды эпидемического распространения (вспышки ВИ) характеризуются относительно более низкой гетерогенностью популяции возбудителя по сравнению с периодами ' эпидемического и резерззцконного преобразований (меиэпидемическиз периоды).

4. Предложен критерий - "эффективный период персистенции" (модифицированный критерий Животовского (Нивотовский, 1980)), вычисляемый на основе данных об антибистикорезистентности штаммов К. pneumoniae, выделенных за Зх-летний период наблюдения в

РНКЦ АГП РАМН. С его помощью показано, что наиболее длительно пэрсис-т1фуют в отделехшях штаммы со следующими спектрами антибиотик'оре-зистентности:

- чувствительные ко всем изучаемым антибиотикам,

- устойчивые к ампициллину и карбенициллшу,

- со спектром устойчивости, характерным для двух штаммов, вызвавших две независимые всшнски БИ.

5. Выявлена высокая степень обмена 4МЯ видами микроорганизмов между двумя отделениями по данным 6та-летнего ретроспективного анализа. Анализ матрицы корреляций высеваемости позволил выявить 2 тенденции в микробных системах двух отделений - достоверный положительный характер зависимости между К.pneumonia? и Е. coli, и высокодостоверный отрицательный - между представителями грамот-

■нонов число фенотнпоз (спектров антнбиогр&м и плазмиднка репотклса)

ВСПЫШЮ4-Ш4-

¡Г-Н Л

Спектры смтибиогрсым ЕЗ пл<

зиидн^о ренотили

л

Рис.' '. Гетерогенность популяции К.рпеитопЬае, выделении о? детей в различные периоды в хода Зхлэтнего микробиологического мониторинга во ВНИИ АГП МЗ РФ.

По оси абсцисс - временные периода, по оси ординат -эффективное число -фенотипов.

Показателем гетерогенности популяции служил критерий йшотовского ("эффективное число фенотипов"), т.е. число атаммов обладающих различным!! спектрами антибиогргмм или ТЛЭЗМВДННШ биотипами (ПрсфИЛЯМИ). •

- н -

рицательной и грамполокктельяой флоры в обоих отделениях.

6. Прослежена динамика общей численности К. pneumoniae, в Баемых у пациентов как за данный Зх-летний период наблюде;шя, и за весь период работы РНИЦ ДТП РАМН (6 лет). С помощью мате! тического анализа удалось выявить общие направления'временной изменчивости микробных популяций К. pnemoniae в двух отделен снижение среднегодовой численности К. pnemoniae в течение 6TI 'летнего периода и ежегодное повышение численности популяции Д) ного микрооргаш!зма в осенне-зимние периоды (т.е. в периоды, i да наблюдались вспышки ВИ). Методом главных компонент была noi зана одинаковая направленность общей временной изменчивости вь ваемости 4х видов микроорганизмов (E.coli, К.pneumoniae, Stapf lococcue йрр. и Enterocuccu3 spp.) в двух отделениях: постепе!: замещение представителей грамотрицательной флоры на грашолож: тельные виды бактерий, которые с течением времени становятся д минирующими колонизирующими агентами в отделении.

В последние года подобная смена возбудителей госпитальных инфекций уже была отмечена некоторыми исследователями и оценив лась ими как общая тенденция, обусловленная применением новых антибиотиков (Schaberg et al, 1991). Однако, мы склонны видеть этом не столько результат прессинга антибиотиков, сколько проя ление некоего общего циклического процесса, выражающегося в см. доминирующих вэдов бактерий. Так, в 60s годы основными возбуди1 лями ВИ являлись представители грамположительной флоры, в 70е ■ преобладали грамотрицательные бактерии, в 80е годы - вновь otmi чается увеличение удельного веса грамполоамтельных бактерий.

Влияние Я-плазмид госпитальных шташюв энтеробактерий на фенотип клеток-хозяев^

Задачей данного раздела работы являлось изучение влияния вь явленных госпитальных Я-плазмид на некоторые свойства клеток-хозяев.-При этом нас особенно интересовало появление у данных плазмид детерминант, способных изменять вирулентность штаммов-хозяев: способность к продукции ЗТ- и 1Г- токсинов, гомолизикое адгезйнов, цитотоксинов'. В эту серию экспериментов были отобран именно те Я-плазмиды, которые характеризовались способностью к длительной персиотенщы в стационарах, распространению между ст ционарамк, а твкке плазмиды, выделенные из штаммов, вызвавших вспышки В1г. В результате бал выявлен ряд плазмид с необычными свойствами, изменяющими фенотип бактерий.

Так, четыре Я-плазмиды, переданные посредством конъюгации в im Е. coli J6?., сообщали последнему способность продуцировать 'оксин, определяемую при помощи иммупо-фэрмэнткого анализа, из них (R449, R437 и Í1439) откосились к одной группе плазмид лэк.улярной массой 56+14 Kb и были выделены из штаммов S. таг~ с-пз (R449) и К. pneumoniae (R437 и R439) в двух московских сонарах з 1931, 1985 и 1937 гг. соответственно. Четвертая мкда R4T2 принадлежала к группе плазмид с молзкуляряой массой Kb и была выявлена в 1985 г. в 10 ДКЕ при вспышке энтероко-. Удалось так;« обнеружить одну генетически связанную пару моз допор-трансконъюгант, продуцирующую ST-токсин. Донорский К.pneumoniae 495 был выделен во время вспышки килечной ин-пи в роддоме 1! 8 г. Киева. Наличке гена Sí-токсина б обоих мпх было подтверждено в опытах по ДНК-ДНК гибридизации in , а тarase при бног.робе на наличие sr-токсиыа. Две ñ-плазкиды (R23 и R93) обнаружили способность определять ¡ионную устойчивость штамма-хозяина к азрозолировашш. Следует тить, что зти илаз:.'лды, характеризующиеся высокой степенью логии, были выделены из разных родов бгктэрий (Е. aerogenes и агеезерпз соответственно) в детском стационаре, где они пер-ировзли с IS3I по 192.5 гг.

Особенно интересные результаты получены пра изучении упомянутой й-плазм-да с молзкулярной кзссой 40 '/Da, выделение двух различных птгакоз K.pneu-'xnico 518 и 551, вызвавших независимые всшигкл BI! с интервалом в I год з ОПТ" РНЭД АГТ1 . Было поягсеко, что данная ляззквдз предавала -решашентному чу Е. coli J62 способность выраженному с-гтототссяческояу íBino на клетки НЕр-2. Бактерии ктеммэ Е. coli J52, содержащие '.гиды, вызывав! резкое увеличение числа нежизнеспособных кле-ЧЕр-8 по сраспс-кса с исходным Соспдзкзмдакм штаммом Е. coli Так, если после 24 часов согмеептой кхкубацкл для Е. coli исследуемый парилзтр составлял G.3S. то для Е. coli J 52 R518 coli JG2 R561 зтот показатель составлял 40.7% и 42. SS соот-гвонео. Шха-гин К. pneuasiice 518 и б51 такта цгазодоп к рэз-сянженто числа киснзспособпгс меток ЧЕр-2 (62.G % и 37.3%). j помощью светооптической и электронной шясроскошя: установ-, что варианты, несушз шшзэдда (Е. coli J62 R518 и £. eeli

вызывали цитолаткческие изменения в клетках НЕр-2, зые выражались в значительной вакуолизации цитоплазм;, выбуха-)тдельш1х ее участков, округлении, сморщивания Со.<п>П!вй части jспособных клеток и практически полном разрушении клеточного

-'Л

-i6-

Щ'рг,. -А

' Л. '

\ s 1-K~i ) ' .

р'J ^ЙШ

I ^ШРН

Ао.

£

■ - rv -.v . "»л- (

•í i

г

Рис.. 3. Монослой клеточной культуры НЕр-2 после 5ти-ч совой инкубации с бактериальными клетками (электронна сканирующая микроскопия): (А) - Е.cali J62 (контроль) (276G X), (Б) - K.pr^eiswniae 518 (3450 X), (В) - Е со J62 518 (3450 X), (Г) - Интактпые клетки НЕр-2.

лоя к концу инкубации. Ала логичным эффектом обладал свобод-т бактерий фильтрат штамма E.coli J62R518. Е!та,\ы 2. coll Jó? гивал никаких видащх изменений монослоя клеток НЕр—2 3).

лздует отметить, что факт детерминирования я-пла^ялой иодоб- • свойства описан впервые. Выяснение природы данного феномена от дальнейших исследований.

нологкчшо результата были получена Hlgabl с сотрудгсасами !■:{ ct al, 1991), списаззягс цитотоксяческ-гй эффект озсклоточ-ульонних фильтратов птеммов I. orytoca по отнопежзд к монос-«точной линии НЕр-2. Удалось установить, что растворимый зтссчческий агент Я. oxytcca имеет пестрзцеллшмряух» неОелко-рироду с молекулярной массой менее ЕООО Дальтон. Генетичес-готроль продукта! этого вещества авторами не изучался.

признаков, непосредственно связанных с пэтогекностью db, нас интересовал:! и другие шобичшге свойства ií-плэзмид, числе ire (йтособность к дотсрг.сззгрсванию синтеза рестршеци-зидонукдзаз. В результата бяла выявлена новоя специфическая наконяоя эндонуклеаза, кодируемая плазтдой и обозначенная :оН1. Узнаваемая псслздовзтслькость EcoHI била определена зтно с сотрудницами вд«и генетики и селекции промасленных организмов как CC(CG)(ÍG с точкой расщепления мззду 4'"' и 5м >тидамк. Из получепкнх дзншгх следует, что EcoHI лвляется 1 изеиизшером рестриктазн Canil (CG(C/G)GG) и отличается но расщепления от всех извзотигх фзрме«тов, узнаетда тачую г:е :тютую последовательность.

:шд образом, продставлзвшэ дняше о влшшии К-зл28»ад на *» гв:1. госпктаяьтсяс ате.в«эз язлявтея экспериментзлкаш подткэр-;м постулированной раное саособпосс.л госпитальных д-плазмнд ¡ть в езоя структуру гены, детеркширунзио пркпнккя патеген-

п этим слосоостеовать их зпидешгеоскону распросграпевж. •р^хлетпзго мониторинга в НИЦ ¿ГП РАМН неоспоримо евдде-зует о необходимости постоянного эппдиадзора за рэспрострс-i устойчивых штгммоз, дкнаыкой он'лгб:;от1-псорез.'1стеитности, а об офдекгяшюстк кешльзовгшия й-плазаад в качестве дополни;: зшгдокичзских "Маркеров при выявлении штшгоз-везбуди-ВН. связей модпу различными вспышками БИ как в одном, так и '• зтацкопзрамм. Использование дагаого подхода позволило претить.вспышку ВИ, вызвавшую К.pneumoniae, в РН5Щ МП РАМН, мостоятслыгнй талере представляет ишзешгогя здесь возкэк-;:ciíoj ь?сюп'л TúKoro ссраь-етюа кик плаз'дкяниЗ кроНъь ssw-

ков для оценки степени гетерогенности популяции возбудителя, i ражающзй различные фазы эпидемического процесса.

Использование плазмидпых параметров бактериальных штаммов популяций в целом в качестве 1шструмента для анализа и прогно; роваш:я эпидемических ситуаций в стационарах может оказаться ; сьма эффективным в комплексе с разработанными в последние год; новыми методами тигпгрования хромосом бактериальных штатов '(пульс-электрофорез, цепная полимеразная реакция, геномная да; лоскопия), позволяющими тонко дифференцировать штаммы (клоны) прослеживать пути их распространения.

Еключение в клон-формулу плазмид, однако, еще долго будет актуальным, поскольку клональное распространение плазмид идет независимо от клонального распространения штаммов.

ВЫВОДЫ.

I. Создана коллекция из 582 клинических штаммов энтеробакт ряй, прзииущзстезнно клебсиелл и серрацкй, выделенных в'9ги до кк стационарах 4х городов бывшего СССР. Установлено, что 85 изученных птаммов характеризуются множественной устойчивостью антибис-т£жам, в 75 % обусловленной наличием конъюгатизкых Д-плаз;.эд с молекулярной массой ст 40 до 120 UDa.

В микроорганизмах различных родов семейства Enterobacte riacr.js госпитального происхождения обнаружены Д-плазмиды, хар теризующиеся консервативностью структуры и способностью к длит лыюй персистепции внутри одаого и распространешпо между ста и нарами.

3. Выделена коныогативная Д-плазмида с молекулярной массой L'Da из двух различных госпитальных штаммов К. pneumoniae, вызв сих две независимые вспашки внутриболышчной инфекции шворозд. ных в РНЩ ЛТП РАМН. Установлено, что данная fl-плазмида с моле] лярной массой 40 UDa определяет цитотоксичность бактерий по от; шению к клеточной линии НЕР-2.

4. Обнаружены и охарактеризованы Д-плазмиды, влиявшие на е; рулентность к фенотшшческие признаки госпитальных штаммов-xosj (цитотоксичность, продукция LT и ST--токсинов и повышенная вылзп емость в аэрозольном состоянии).

5. Показана высокая эффективность использования плазмидпых профилей популяции Я. pneumoniae для оценки ее гетерогенности i материале двух стационаров. Установлено, что в эпидемические П; р:.;ды гетерогенность популяции К. pneumoniae достоверно менее

жэна, чем в меяэпидемическиэ.

6. Показан достоверный положительный характер корреляционных ей по высзвгемости у детей между К. pneumoniae и Е. coli, и цательный - между представителями грамположктельной phylococcus зрр. и Enteroco'ccus зрр.) и грамотрицатэльной (£.

и К. pneumoniae) флоры.

7. Выявлена тенденция постепенного замецекия представителей страдательных бактерий на грамположительше в двух отделениях пии в РНЩ АГП РАМН в течение 6га лет наблюдения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Конюхов В.®., Лкходед Л.Я., Глаткан Л.И., Калнин. К.В. Я-плззмид в выживаемости бактерий в воздухе// Журнал Минро-эгии, Эпидемиологии.и Иммунобиологии. - 1987. -К 8. - С. 7-

2. Алкирскзя A.C., Глптмэи Л.И., Калнин К.В., /Миронова Т.Г. ^мицин-резистентпыо штаммы Klebsiella .pneumoniae в специали-закных отделениях для недоношенных // Тезисы докладов II Все-гай конференции "Актуальные вопросы клинической микробиология шфекцлонной клинике", Барааул-1988. - С. 229-230.-

Калвин К.В., Терехов A.A., Глаткан Л.И. Д-плззкизи госпи-шх птаммоз знтеробактерпй, выделенных в дзтских стационарах ¡териалы XVIII Съезда Мш-сробиологоз, Эпидемиологов и Параыг-■ов. - Алма-Ата, I939: С. -175-177. . . Глатман Л.И., Терехов A.A., Калнин К.В., Болотин А.П., :тип В.А. Новая сайт-спецефическая эндодезскскрибонуклеаза '// Молекулярная генетика, микробиология п вирусология. --ИЗ,- С. 48-49.

. Кзлнкн К.В., Глатман Л.И., Ангарская A.C., Ершова Т.О., ов A.A. Использовс:п!Ч молзкулярно-генетических параметров змнд для оценки эпкдегяюлогической ситуации в стационаре для озденпзьс // Тезисы Всесоюзной Школн-Семинара "Молекулярная гия и Медицина". -Ленинград,1990. - С. 102. . Глатман Л.И., Калнин К.В., Терехов A.A., Ергсова Т.Ю., Ан-ая A.C. Иолекулярно-генетичзскяй анализ госпитальных штатов эбактерий в различные эпидемические периоды в детских стаци-

// Тезисы докладов Всесоюзного Совещания "Бактериальные лдо4.- Иальчж-1990. - С. 82-83.

, Калнин К.В., Глатман Л.И., Бондаренко В.М., Березина Терехов A.A., Ценева Г.Я. Плазмвдз резистентности Klebslel-

la pneumoniae контролирующая цитотсксическу» активность // Кур Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии. -I9S2. - I! 2. -12-14.

8. Anklrakaya A.S., Glatman L.I., Kalnln K.V.; Yershova T.Yu., Bondarenko V.M. Study of Klebsiella pneumoniae strains with multidrug resistance determined by R-plasmids In neonatal Intensive care unit. // Proceedings of the International Confe 1-ence of the Prevention of Infection. - FBI 015. - Nice, Franc

, 1990.

9. Kalnln K.V., Glatman L.I., Berezina L.A., Terechov A.A. Ankirskaya A.S., Ceneva G.Y. Hospital Plasmid Coding for Drug Resistance and.Cytoxicity to HEp-2 Cells. // Abstracts of the ■ International Congress of Chemotherapy.' - No. 131. - Berlin-IS!

10. Glatman L.I., Kalnln K.V., Dcmoradakaya T.I. Kolecular R-plasmid analysis oi Hospital Klebsiella and Serratia Strains Isolated in Different cites of Russia. // Proceedings of the 8-Kealterranean Congress of Chemotherapy. - No. 200. - Athens-Greece-1$92.

11. Kalnln X.V., Terechov A.A., Ershova T.J., Anklrskaya 4.S., Glatman L.I. Involvement oi Hospital R-plaomM coding for cytotoxicity to HEp-2 cells In tho Epidemic Process in the Neor tal Intensive Care *Jnlt. // Proceedings of the 8-th Mediterrane Congress of Chemotherapy. - No. 689. - Athens-Greece-1992.