Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль Na+, K+-АТФазы в регуляции роста ткани печени и сердца

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль Na+, K+-АТФазы в регуляции роста ткани печени и сердца"

□□3484478

На правах рукописи

КИПЕНКО АННА ВИКТОРОВНА

РОЛЬ №+,К+-АТФа1Ь1 В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА ТКАНИ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА

03.00.13 - физиология 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 НОЯ 2009

Санкт-Петербург 2009

003484478

Работа выполнена в лаборатории физиологии возбудимых мембран Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Крылов Борис Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Лобов Геннадий Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Лгобашина Ольга Анатольевна Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

доктор биологических наук, профессор Крутецкая Зоя Иринарховпа

Санкт-Петербургский государственный университет

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Защита состоится «10» декабря 2009 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета (Д 002.020.01) по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан «10» ноября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.Э. Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из ключевых задач биологии клетки является изучение тонких механизмов передачи и усилеиия сигналов. Их знание необходимо для понимания функционального ответа клеток в норме и его коррекции при патологических состояниях. В последнее десятилетие особый интерес исследователей вызывает участие №\К+-АТФазы в процессах внутриклеточной сигнализации, то есть ее роль в организации ответа клетки на различные физиологические стимулы (Xie, Askari, 2002; Schoner, Schiener-Bobis, 2005; Apena, 2007; Liang et al., 2007).

Функции, которые выполняет Na*,К -АТФаза можно разделить на две большие группы: 1) насосная функция, связанная с переносом одновалентных катионов и процессами, зависимыми от величины градиентов концентрации ионов по обе стороны плазматической мембраны, 2) сигнальная функция, в этом случае №+,К*-АТФаза выступает как транедуктор сигнала.

В культуре клеток разного типа показано, что Ш+,КГ-АТФаза в качестве транедуктора сигнала запускает внутриклеточные сигнальные каскады, вызывает изменение экспрессии некоторых генов (Kometiani et al., 1998; Xie et al., 1999), внутриклеточной концентрации ионов Са:+ (Aizman et al., 2001; Zhang et al., 2006; Liu et al., 2007) и активных форм кислорода (Liu et al., 2000; Xie, Askari, 2002). Ка+,К'-АТФаза в качестве транедуктора сигнала модулирует рост клеток (Haas et al., 2002; Wang et al., 2004; Schoner, 2005; Manunta, Ferrandi, 2006; Tian et a!., 2006), апоптоз (Brodie et al., 1995; Huang et al., 2004; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007), клеточную адгезию и подвижность (Barwe et al., 2005; Larre et al., 2006; Apena, 2007).

В сенсорных нейронах млекопитающих фермент в качестве транедуктора участвует в передаче сигналов от опиоидоподобпых рецепторов к медленным натриевым каналам Navl .8 (Крылов и др., 1999). 1

Сигнальная функция Ка+,К+-АТФазы регулируется низкими дозами сердечных гликозидов, недостаточными для ингибировагшя ионной помпы (Xie, Askari, 2002; Xie, 2003; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007). Сердечные гликозиды (оуабаин, дигоксин, строфантин К), получаемые из растений, долгое время использовали и как инструмент для изучения насосной функции №+,К+-АТФазы. Дигоксин и строфантин К применяют для лечения хронической сердечной недостаточности. В 1990-х годах было обнаружено, что некоторые сердечные гликозиды синтезируются в гипоталамусе (оуабаин) и коре надпочечников млекопитающих (оуабаин, дигоксин, маринобуфогенпн) и выделяются в кровь в концентрациях, сопоставимых с дозами, модулирующими транедукторную функцию Ж'Д^-АТФазы in vitro (Schoner, 2002; Hamlyn, 2004). Однако, физиологическая

роль эндогенных дигиталисоподобных факторов остается малоизученной. Тот факт, что сердечные гликозиды влияют как на насосную, так и на сигнальную функцию Na+,K+-АТФазы, привел к формированию представления об этой мембранной структуре как о мишени для эндогенных сердечных гликозидов (Schoner, Scheiner-Bobis, 2007). Сайт связывания сердечных гликозидов находится на внеклеточной стороне ß-субъединицы Na+,IC-AT<t>a3bi (Bagrov et al„ 2009). Однако, во всех исследованиях, посвященных изучению взаимодействия №+,К+-АТФазы с дигиталисоподобными факторами использовались высокие концентрации последних. Таким образом, известные участки взаимодействия фермента с этими специфическими лигандами вовлечены в регуляцию насосной функции №+,К+-АТФазы. Сайт связывания сердечных гликозидов, активирующий передачу сигнала от поверхностной мембраны к внутриклеточным или мембранным эффекторам, не идентифицирован. Кроме того, неясно, какие изоформы каталитической субъединицы фермента участвуют в реализации сигнальной функции Na+,K"-AT®a3i,i.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение роли Na\K.+-AT®a3bi в регуляции роста ткани печени и сердца. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние селективных ингибиторов №+,К+-АТФазы оуабаина, строфантина К, дигоксина и оуабагенина на рост эксплантатов ткани печени и сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов.

2. Теоретически и экспериментально оценить возможность образования молекулой оуабаина хелатных комплексов с ионами Ca2' и участие этого комплекса в модуляции сигнальной функции Ка',К'-АТФазы.

3. Исследовать влияние и выявить возможный механизм действия коменовой кислоты на ткань печени и сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов в органотипической культуре.

4. Исследовать состояние антитоксической функции печени, параметров систолического давления и ЭКГ взрослых крыс в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения препарата «Аноцептин», действующей субстанцией которого является коменовая кислота.

Научная новизна результатов исследования. Для изучения сигнальной функции №+,К+-АТФазы впервые был использован метод органотипической культуры ткани печени и сердца. Впервые экспериментально доказано участие Na+,K -АТФазы как трансдуктора сигнала в регуляции роста ткани сердца в эмбриональный период онтогенеза. Впервые показано тканеспецифичпое действие оуабаина, строфантина К и

дигоксина, которое проявляется в механизме взаимодействия производных 1,2-циклопергидропентафенантрена с различными изоформами а-субъединицы Ка\К+-АТФазь;. Теоретически доказана возможность образования молекулой оуабаина хелагных комплексов с ионами Са:+. Впервые обнаружено, что хелатор ионов кальция ЭГТЛ (10"3 М) устраняет разнонаправленные эффекты оуабаина в отношении регуляции роста эксплантатов ткани сердца. Это свидетельствует о том, что комплекс Ка\К+-АТФаза-оуабаин-Са2+ может служить стимулом для активации транедукторной функции №+,К+-АТФазы. аЗ-изоформа фермента, чувствительная к низким, сопоставимым с эндогенными, концентрациям оуабаина, участвует в регуляции роста ткани сердца в эмбриональный период онтогенеза. Впервые показано, что действие оуабаина на рост ткани печени, в которой экспрессируется только «1-изоформа №+,К*-АТФазы, не связано с транедукторной функцией фермента. Впервые обнаружено, что регулирующее рост ткани печени и сердца действие агликона оуабаина оуабагенина не является тканеспецифичным. ГТо-видимому, рамнозильный остаток молекулы оуабаина повышает эффективность взаимодействия гликозида с транедукторным сайтом Кат,К+-АТФазы кардиомиоцитов. Впервые показано, что коменовая кислота не влияет на пролиферацию гепатоцитов и дозозависимо модулирует рост эксплантатов ткани сердца. Отсутствие влияния препарата «Аноцептин», действующей субстанцией которого является коменовая кислота, на электрические процессы в миокарде доказывает, что действие препарата не затрагивает электрогенную функцию № ,К+-АТФазы кардиомиоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. -АТФаза участвует в модуляции роста ткани печени и сердца.

2. а1-изоформа Ш"1 ,К+-АТФазы выполняет в гсиатоцитах печени только насосную функцию.

3. Сигнальная функция Ка+,К+-АТФазы в ткани сердца, по-видимому, зависит от присутствия свободных ионов Са2+ во внеклеточной среде и реализуется через активацию «3-изоформы каталитической субъедишщы фермента.

4. Вероятно, способность оуабаина модулировать транедукторную функцию №+,К+-АТФазы связана с возможностью образовывать хелатные комплексы с ионами Са2~ в различных конформациях и наличием в его молекуле рамнозильного остатка.

5. Коменовая кислота не влияет на пролиферацию гепатоцитов и дозозависимо модулирует рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов. Препарат «Аноцептин», действующей субстанцией которою является коменовая кислота, в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения не влияет на антитоксические свойства печени, состояние сердечно-сосудистой системы

взрослых животных и не затрагивает электрогениую функцию Ка+,К*-АТФазы мембраны кардиомиоцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание физиологической роли трансдукторной функции №+,К -АТФазы. Работа расширяет представления о роли эндогенных дигиталисоподобных факторов в регуляции пролиферации клеток различных тканей. Анализ полученных результатов позволил сформулировать гипотезу о механизме модуляции эндогенным оуабаином трансдукторной и насосной функций №+,К+-АТФазы. Сочетание квантово-химических расчетов и экспериментальных данных позволило оценить вклад ионов Са2~ и рамнозилыюго остатка в способность оуабаина модулировать трансдукторную функцию №+,К+-АТФазы. Экспериментально доказано, что лекарственный препарат «Аноцептин» не вызывает структурных изменений ткани печени, не влияет на ее антитоксическую функцию и не оказывает негативного влияния на состояние сердечно-сосудистой системы при хроническом введении взрослым крысам. Последнее позволяет рекомендовать назначать аноцептин пациентам с нарушенными функциями печени и сердечно-сосудистой патологией.

Материалы диссертации использованы в курсах лекций «Общая физиология» и «Нервно-мышечная физиология» на кафедре общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ; в курсе лекций и практических занятиях в разделах «Физиология возбудимых тканей» и «Физиология рецепторов, нервов и синапсов» на кафедре нормальной физиологии ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова Росздрава; в научно-клинической работе Института Мозга человека РАН; в научно-инновационной работе Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2007), Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург,

2007), 2-ой Санкт-Петербургской конференции фонда А. Гумбольдта: «Технологии 21-го века: биологические, физические, информационные и социальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2008), втором Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2008), II Съезде физиологов СНГ (Кишикэу (Молдова), 2008), Политехническом симпозиуме: «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург,

2008), 7-ой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» [Высокие технологии,

фундаментальные и прикладные исследования, образование] (Санкт-Петербург, 2009), Политехническом симпозиуме: «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2009). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает *)3\нсточников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Метод оргаиотипической культуры. Для исследования трофических свойств оуабаина (Sigma, США), оуабагенина (Sigma, США), строфантина К (Россия), дигоксина (Россия) и коменовой кислоты (Россия), а также для оценки возможного механизма влияния этих веществ на сигнальную функцию Ка+,К*-АТФазы применяли метод оргаиотипической культуры ткани печени и сердца. В части экспериментов использовали хелатор ионов кальция ЭГТА (Sigma, США). Эксперименты осуществляли на 10-12-дневных куриных эмбрионах. Исследования выполнены на 1500 эксплантатах, культивируемых в чашках Петри с коллагеновым покрытием дна. Эксплантаты культивировали в питательной среде в течение 3 суток в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония) при температуре 37° С и 5% содержании СОг. Контрольные эксплантаты культивировали в питательной среде стандартного состава (Лопатина и др,. 2005; Кипенко и др., 2009). В экспериментальных чашках в культуральную среду добавляли исследуемые вещества в различных концентрациях. Количественную оценку влияния исследуемых веществ на рост эксплантатов ткани печени и сердца осуществляли с помощью морфометрического метода. Интенсивность роста эксплантатов оценивали по величине индекса площади (ИП), рассчитывая его как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади исходного фрагмента ткани. За условную единицу площади принимали квадрат морфометрической сетки окуляра микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3.5x10 равна 150 мкм. Величину ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%. В каждой серии опытов "п" - количество культивируемых эксплантатов. Для визуализации использовали микротеленасадку для микроскопа (серия ¡0, МТН-13 «Альфа телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов ткани печени осуществляли с помощью программы «Photo М 1.2».

Методы квантовохимического анализа. Полную оптимизацию геометрических параметров возможных конформаций комплекса оуабаина с Са2+ проводили методом ab initio с применением базиса 6-3IG* в рамках программного комплекса GAMESS (Schmidt et al., 1993). Расчеты осуществляли в приближении газовой фазы.

Гистологические методы исследования. Рост эксплантатов ткани печени и сердца исследовали прижизненно с помощью светового микроскопа и на гистологических препаратах. Для приготовления последних кусочки тканей культивировали на покровных стеклах, помещенных в чашки Петри. Через 3-е суток стекла с прикрепленными эксплантатами фиксировали 70° этанолом, перед окраской ополаскивали дистиллированной водой. Препараты окрашивали свежеприготовленным раствором гематоксилина Вейгерга (BioVitrum) 3 минуты. Затем стекла ополаскивали в 2-х сменах водопроводной воды по 30 с. Для докраски цитоплазмы использовали 0,5 % спиртовой раствор эозина (BioVitrum), после чего стекла ополаскивали в 96° этаноле. Препараты просветляли в ксилоле (Aldrich) 20-30 с и заключали в полистирол (Sigma) (Меркулов, 1969), фотографировали при помощи установки, включающей в себя микроскоп LSM 710 Carl Zeiss (Германия), цифровую фотокамеру Axio Cam HRm Zeiss и персональный компьютер с пакетом программ для обработки изображений.

Хронические эксперименты in vivo. Эксперименты проводили на белых крысах линии Вистар обоего пола. Исследования выполнены на 160 животных из них 40 животных обоего пола составили контрольную группу.

Влияние коменовой кислоты на антитоксическую функцию печени определяли в условиях гексеналового сна (Хабриев, 2005). Продолжительность наркотического (гексеналового) сна отражает степень восстановления микросомальных ферментов клеток печени, метаболизирующих лекарственные препараты. Аноцептин (Россия) вводили ежедневно однократно внутривенно в течение 90 дней в дозах 5, 100 и 300 мг/кг (в пересчете на действующую субстанцию коменовую кислоту). Продолжительность гексеналового сна выражали в минутах от момента наступления наркоза (переход в боковое положение тела) до выхода из наркоза (переворачивание). Продолжительность гексеналового сна оценивали в фоне, па 30-й и 90-й дни от начала исследования. Через 6 и 12 часов после инъекции аноцептина, крысам экспериментальных групп внугрибрюшинно вводили раствор гексенала в дозе 90 мг/кг, в качестве растворителя использовати 0.9% раствор NaCl. Животным контрольной группы вместо аноцептина вводили 0.9% раствор NaCl.

Для оценки влияния аноцептина в дозах 5, 100 и 300 мг/кг (в пересчете на действующую субстанцию коменовую кислоту) на состояние сердечно-сосудистой

системы и насосную функцию №+Д+-АТФазы мембраны кардиомиоцитов проводили регистрацию систолического давления и электрокардиографическое исследование. Эксперименты проводили на ненаркотизированных крысах (Хабриев, 2005). Аноцептин вводили по схеме, описанной выше. Для измерения систолического давления (СД) и регистрации электрокардио1раммы (ЭКГ) крыс помещали в специальные пеналы. Для регистрации СД использовали пьезоэлектрический датчик («Регистратор артериального давления», Италия), закрепленный на хвосте крысы с помощью манжетки соответствующего размера. Запись ЭКГ осуществляли на полиграфе RM-6000 (Япония) во 2-ом стандартном отведении после стабилизации показателей. Показатели работы сердечно-сосудистой системы измеряли непосредственно после введения препарата, на 30-й и 90-й дни исследования.

Статистические методы обработки полученных результатов. Статистическую обработку данных производили с использованием /-критерия Стъюдента. Результаты представлены в виде средних значений и их стандартных отклонений (M±m), а также в процентах от значений в контрольных группах. Достоверными считали отличия при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование влияния селективного ингибитора 1Ча+,К-.\ТФазы оуабаина на рост эксплантатов ткани печени и сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов

Влияние оуабаина на рост ткани печени было исследовано в диапазоне концентраций 1*Ю4-1*Ю~10 М. Рост эксплантатов при введении в питательную среду ингибитора в концентрациях 1*10"4-5*10'7 M практически отсутствовал. При концентрации оуабаина 2*10"7 M ИП эксплантатов был ниже контрольного значения (п=27) на 74i2% (n=25, р<0.05), а при концентрации 1*10"7 M ИП был на 40±5% (п=27, р<0.05) меньше по сравнению с контролем (п=27). В концентрации 1*10'8 M уменьшение ИП экспериментальных эксплантатов составило 23±2% (п=26, р<0.05) по отношению к контролю (п=25). Дальнейшее снижение концентрации ингибитора не влияло на рост эксплантатов ткани печени, ИП не отличался от контрольного значения. Для того, чтобы оценить Ко (константу диссоциации) реакции блокирования Ыа*,Кт-АТФазы оуабаином, использовали уравнение Хилла. Расчеты показали, что величина Кд составила 1*10"' M, а коэффициент Хилла был равен 0,5.

При исследовании действия оуабаина на рост эксплантатов ткани сердца, гликозид вводили в питательную среду в диапазоне концентраций 1 *10~8-1*10"'3 М. В концентрации 1*10"8 M он полностью угнетал рост, в концентрации 1*10~9 M недостоверно стимулировал рост эксплантатов. При введении в питательную среду оуабаина в

концентрации 1*Ю"10 М наблюдали достоверный стимулирующий рост эффект. ИП эксплантатов был выше контрольного значения (п=25) на 33±3% (п=26, р<0.05). В концентрациях 1*10'"-1*10"13 М тликозид не влиял нарост ткани сердца, ИП не отличался от контрольного значения.

2. Изучение действии строфантина К и дигоксина на рост эксплантатов ткани печени и сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов

Влияние указанных сердечных гликозидов на рост ткани печени изучено в диапазоне концентрации от 1 * 1 0"*до 1 * 10*'1 М. Строфантин К (1 * 10"6 М) и дигоксин (1*10" 7 М) полностью блокировали рост эксплантатов. При введении в питательную среду строфантина К (1*10"7 М) или дигоксина (1*10"8 М) наблюдали достоверное ингибирование роста эксплантатов ткани печени и ИП был на 45±5% (п=25, р<0.05) ниже контрольного значения. Добавление в культуральиую среду строфантина К в концентрации 1*10"8 М достоверно уменьшало величину ИП эксплантатов на 29i3% (п=27, р<0.05) по сравнению с контролем (п=25). Дальнейшее снижение концентрации сердечных гликозидов на рост ткани печени влияло незначительно, ИП не претерпевал достоверных огличий от контрольных значений.

В следующей серии экспериментов было исследовано действие низких доз строфантина К (l*10"n-l*10"14 М) и дигоксина (1*10"!4-1*1016 М) на рост ткани сердца в органотипической культуре. В концентрации 1*10"'4 М дигоксин полностью угнетал рост эксплантатов. При добавлении в питательную среду строфантина К в концентрации 1*10" 11 М ИП эксплантатов был на 26*3% (ti=25, р<0.05) ниже контрольного (п~25). Строфантин К в концентрациях 1*10"12-1*10"14 М и дигоксин в концентрациях 1*10" -1*1016 М на рост экспериментальных эксплантатов практически не влияли, ИП незначительно отличался от контроля.

3. Оценка влияния оуабагенина на рост ткани печени и сердца 10-12-днсвнмх куриных эмбрионов

Молекулы исследованных гликозидов оуабаина, строфантина К и дигоксина характеризуются сходным строением стероидного кольца (агликона) и различным количеством сахарных остатков (гликонов), входящих в состав их молекул. Обнаруженное тканеспецифичсское действие гликозидов на рост ткани печени и сердца, а также различные действующие концентрации последних позволили предположить, что остатки Сахаров вносят свой вклад во взаимодействие молекулы гликозида с транедукторным сайтом №+,К+-АТФазы. Для проверки этой гипотезы было исследовано влияние агликона оуабаина - оуабагенина на рост эксплантатов ткани печени и сердца.

Влияние оуабагенина на рост ткани печени и сердца было исследовано в диапазоне концентраций 1*10^-1*10"9 М. В концентрации 1*10-4 М стероид практически полностью угнетал рост ткани печени. В этой же концентрации оуабагснин достоверно ингибировал рост эксплантатов ткани сердца, ИП был на 71*3% (п=25, р<0.05) ниже по отношению к контролю (п=26). Добавление в питательную среду оуабагенина в концентрации 1*10" М достоверно угнетало рост исследуемых тканей в среднем на 45±5% (п=26, р<0.05) по сравнению с контролем (п=26). Действие препарата носило дозозависимый, но не тканеспецифичный характер.

4. Теоретическая и экспериментальная оценка возможности образования молекулой оуабаина хелатных комплексов с ионами Са2+ и участия этого комплекса в модуляции сигнальной функции Na , К^-ЛТФазы Оуабаин в различных концентрациях модулирует как насосную, так и сигнальную функцию Ыа+,К+-АТФазы. Этот факт свидетельствует о существовании механизма специфического лиганд-рецепторного взаимодействия оуабаина с некоторыми аминокислотами в составе а-субъединицы. Конформационныс изменения, возникающие в ходе этого взаимодействия, регулируют либо функцию помпы, либо сигнальную функцию №+,КГ-АТФазы. Данные систематического кваптовохимического анализа поверхности потенциальной энергии системы оуабаин-Са2^ позволили выявить возможные конформации хелатных комплексов. Существует два принципиально различных способа хелатирования иона Са2+ молекулой оуабаина. В первом случае Са2+ образует координационные связи с пятыо атомами кислорода О1, О3, Os, О1' и О5 (рис. 1а): длины связей Са-0 составляют 2.34-2.49 А, заряд на атоме кальция q(Ca) = 1.56 а.е., кольцо А (С1С2С3С4С5СШ) принимает конформацию кресла. Во втором случае ион Са2+ связан с тремя атомами кислорода О1, 0й и О19 (рис. 16): величины расстояний Са-О лежат в диапазоне 2.28-2.48 Á, q(Ca) ~~ 1.67-1.69 а.е., при этом кольцо А может находиться как в конформации кресла, так и в конформации ванны. Энтальпийныс эффекты хелатирования

составляют в первом случае ~ -170 ккал/моль, во втором случае---130 и ~ -140

ккал/моль (кольцо А находится в конформации кресла и ванны соответственно). Геометрия комплекса оуабаин-Са2+ существенно отличается от пространственного строения свободной молекулы оуабаина.

Предположение об участии хелатных комплексов оуабаин-Са2+ в модуляции сигнальной функции №+,Ю-АТФазы исследовали экспериментально. В первой серии

Рис. 1. Пространственное строение возможных конформаций комплекса оуабаина-Са2'. Координационные связи Са-0 обозначены пунктирными линиями. Атомы водорода не приведены.

экспериментов исследовали влияние хелатора ионов Са2* ЭГТА на рост эксплантатов ткани печени и сердца ЭГТА исследован в диапазоне концентраций от 1*10"2 до I * 10 6 М. Действие препарата имело дозозависимый, но не тканеспецифичный характер. В концентрации 1 *103 М ЭГТА достоверно ингибировал рост исследуемых тканей в среднем на 50% по сравнению с контролем. При сочетанном введении оуабаина (1*106) и ЭГТА (1*10~3М) наблюдали полное ишибирование роста эксплантатов ткани печени (рис. 2а). При действии оуабаина на эксплантаты ткани сердца (1*10"8 (рис. 2в)/1*Ю"10 М (рис. 2г)) на фоне ЭГТА (1*10"' М) наблюдали снятие ингибируюшего/стимулирующего действия оуабаина, ИП экспериментальных эксплантатов не отличался от контрольного значения. По-видимому, разнонаправленные эффекты оуабаина в отношении регуляции пролиферации кардиомиоцитов связаны с его способностью образовывать хелатные комплексы в различных конформациях.

ИП, %

160 -

40 ■

о ■

S

k

Рис. 2. Сочетанное влияние оуабаина и ЭГТА (1*10"3 М) на рост эксплантатов ткани печени (а, б) и сердца (в, г) а - оуабаин (1 * I О*6 М), б-оуабаин (1*10"7 М), в-оуабаин (1*108 М), г-оуабаин (1*10"10 М).

Концентрация,М ■ контроль □ оуабаин В ЭГТА □ оуабашН-ЭГТА

5. Исследование влияния коменовой кислоты на ткань печени и сердца 10-12-

дневных куриных эмбрионов в органотнлической культуре

Производная гамма-пирона - коменовая кислота является действующей

субстанцией анальгетического препарата «Аноцегггин» (Лопатина, 2008; Лопатина и др.,

2008в). Регуляция коменовой кислотой сигнальной функции Иа^,}0-АТФазы при передаче сигнала в системе опиоидоподобный рецептор —>Ыа+,К*-ЛТФаза —>Ыау1.8-канал (Крылов и др., 1999) в мембране сенсорного нейрона позволила предположить, что она может обладать трофическими свойствами. Рост эксплантатов ткани печени при введении в культуральную среду коменовой кислоты в широком диапазоне концентраций (1*10"'-1*10"" М) не отличался от роста эксплантатов контрольной серии. Гистологических отличий от контрольных эксплантатов также не обнаружено.

Влияние коменовой кислоты на рост эксплантатов ткани сердца было изучено в диапазоне концентраций от 1*10"6 до 1*10"8 М. Выраженный стимулирующий эффект обнаружили при добавлении в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 1*10"6 М. ИП эксплантатов превышал контрольные значения (п=24) на 35±3% (п=25, р<0.05). Гистологические исследования показали, что зона роста была представлена кардиомиоцитами. В концентрациях 1*10'7-1*10"8 М достоверных отличий в величине ИП экспериментальных и контрольных эксплантатов обнаружено не было.

Полученные результаты свидетельствуют, что в регуляции роста ткани сердца в эмбриональный период онтогенеза участвует Ыа+,К+-АТФаза в качестве транедуктора сигнала. Тот факт, что в мембране кардиомиоцитов в этот период развития преобладает аЗ-изоформа №+,К+-АТФазы, которой нет в гепатоцитах печени, позволяет предположить, что сигнальная функция фермента в клетках сердца обусловлена активностью именно этой изоформы.

6. Механизм действия коменовой кислоты на ткань сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов

Для экспериментальной проверки гипотезы о возможности коменовой кислоты модулировать трапедукторную функцию №ч,К+-АТФазы исследовали сочетанное действие коменовой кислоты и специфического лиганда №~,К+-АТФазы оуабаина. Одновременное добавление в питательную среду оуабаина в концентрации полностью блокирующей рост эксплантатов ткани сердца (1*10"8 М) и коменовой кислоты стимулирующей рост ткани сердца приводило к снятию ингибирующего влияния оуабаина. ИП экспериментальных эксплантатов практически не отличался от контроля.

Результаты по исследованию действия сердечных гликозидов и коменовой кислоты на рост эксплантатов ткани сердца позволяют заключить, что существуют две возможности модуляции транедукторной функции №+,К+-АТФазы: 1. транедуктор-опосредованная (в этом случае фермент выступает в качестве модулированного рецептора к сердечным гликозидам и транедуктора сигнала); 2. рецептор-опосредованная, лигандом в этом случае служит коменовая кислота, а №^,К7-АТФаза играет роль транедуктора.

7. Оценка состояния антитоксической функции печени взрослых крыс в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения препарата «Аноцептин»

Поскольку в опытах с помощью метода органотипической культуры было обнаружено, что коменовая кислота не влияет на рост эксплантатов ткани печени 10-12-дневных куриных эмбрионов, было выдвинуто предположение, что препарат «Аноцептин», изготовленный на ее основе не должен оказывать токсического воздействия на печень. Исследование токсических свойств препарата в отношении печени проводили на взрослых крысах в условиях гексеналового сна. Лекарственная форма препарата «Аноцептин» представляет собой 1- и 2%-ный раствор для внутривенных инъекций. Каждая ампула содержит 10 или 20 мг действующей субстанции - коменовой кислоты.

Препарат в дозе 5 мг/кг (в пересчете на действующую субстанцию) не вызывал изменения продолжительности наркотического сна сразу после инъекции аноцептина, а также на 30-й и 90-й дни эксперимента. Ежедневное введение аноцептина в хвостовую вену крыс в дозе 100 мг/кг также не влияло на длительность гексеналового сна в фоне, на 30-й и 90-й дни от начала исследования. Аналогичные результаты были получены при действии препарата в дозе 300 мг/кг (табл. 1).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что коменовая кислота и препарат, разработанный на ее основе, при ежедневном внутривенном введении в течение 90 дней не оказывают негативного влияния на состояние ткани печени и антитоксическую функцию микросомальных ферментов гепатоцитов печени.

Таблица 1. Влияние препарата «Аноцептин» на продолжительность гексеналового сна у белых крыс (мин, М±ш)

Сроки исследования (ДНИ) Экспериментальная группа и пол

Контроль Аноцептин, мг/кг

5 100 300

М F М F М F М F

Фон 28.1 27.2 26.2 25.6 32.2 28.6 31.3 27.2

±1.6 ±2.3 ±2.4 ±1.8 ±2.5 ±1.7 ±3.2 ±2.7

30 день 30.1 29.4 25.2 27.1 28.2 26.5 27.9 25.1

±1.7 ±2.3 ±2.0 ±2.3 ±1.3 ±1.9 ±1.5 ±1.7

90 день 26.1 31.3 28.8 29.0 28.4 29.0 29.6 28.8

±2.4 ±3.2 ±2.5 ±2.1 ±1.8 ±1.1 ±1.3 ±1.4

Количество животных 20 20 20 20 20 20 20 20

М-самцы, F-самки.

8. Влияние хронического 90-дневного внутривенного введения аноцептина на параметры систолического давления и активный транспорт ионов !Уа+,К+-АТФазой клеток миокарда взрослой крысы в системных экспериментах

На фоне развивающегося болевого синдрома различной этиологии наблюдается повышение артериального давления. Для того чтобы оценить безопасность применения препарата «Аноцептин», в отдельной серии экспериментов исследовали его действие на параметры систолического давления. Обнаружено, что систолическое давление в группе контрольных животных не изменялось на протяжении 90 дней исследования и составило 113.0+7.4 и 115.0+7.4 мм рт.ст. у самцов и самок, соответственно. Ежедневное внутривенное введение аноцептина взрослым крысам обоего пола в дозах 5 и 100 мг/кг (в пересчете на действующую субстанцию) в течение 90 дней не влияло на величину систолического давления. Данные, полученные в экспериментальных группах непосредственно после введения препарата, на 30-й и 90-й дни исследования не отличались от контроля. Хроническое введение аноцептина в дозе 300 мг/кг достоверно снижало уровень давления на 90-й день исследования в среднем на 13% и составило 98.0±6.6 (самцы) и 97.0+6.3 (самки) мм рт. ст.

Изменение насосной функции Ш+,К+-АТФазы кардиомиоцитов вызывает нарушение трансмембранного распределения погенциалобразующих ионов, что отражается на процессе электрогенеза клеток проводящей системы сердца и рабочего миокарда. Электрические свойства миокарда оценивают с помощью метода электрокардиографии (Хабриев, 2005).

Ежедневное внутривенное введение аноцептина взрослым крысам обоего пола в дозе 5 мг/кг в течение 90 дней не влияло на параметры ЭГК (табл. 2) при измерении этих показателей сразу после первой инъекции, на 30-й и 90-й дни исследования. При 90-дневном введении препарата в дозе 100 мк/кт показатели ЭКГ не отличались от показателей интактных животных. Хроническое введение препарата в дозе 300 мк/кг не оказывало влияния на состояние электрических процессов в миокарде в фоне, на 30-й и 90-й дни эксперимента (табл. 2).

Отсутствие изменений параметров ЭКГ в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения аноиептина однозначно свидетельствует о том, что действие исследуемого препарата не затрагивает насосную функцию №+,К+-АТФазы.

Таблица 2. Влияние препарата «Аноцептин» на ЧСС и параметры ЭКГ крыс(М±ш). М-самцы, Р-самки.

Показатель Исследуемые группы пол и количество животных

Контроль 5 мг/кг | 100 мг/кг | 300 мг/кг

М(п=20) | Р(п-20) М(п~20) | Р(п=20) | М(п=20) | Р(п=20) М(п=20) | Р(п=20)

Фон

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ЧСС, уд/мин 406*8 419*15 501*21 464±32 461*26 479*32 483*33 436*28

Р, мВ 0.09*0.02 0.10*0.02 0.09*0.01 0.10*0.01 0.08*0.01 0.09*0.02 0.09*0.01 0.09*0.01

Я, мВ 0.55*0.16 0.63*0.12 0.56*0.11 0.61*0.10 0.62*8.85 0.64*0.14 0.61*0.11 0.61*0.10

Б, мВ 4.09*0.86 3.02*0.95 6.98*0.55 2.99*0.38 3.95*0.90 2.90*0.30 3.03*0.29 5.03*0.31

Т, мВ 0.14±0.01 0.18*0.02 0.11*0.02 0.17*0.03 0.14*0.03 0.18*0.03 0.15*0.01 0.13*0.02

РС>, мс 45.9*0.9 49.6±1.1 43.0*2.1 46.3*2.1 44.5*1.0 44.9*2.0 48.2*1.4 44.9*1.5

ОТ, мс 52.5*2.1 54.2*2.9 56.6*3.0 55.8*1.1 57.8*3.0 61.3*3.1 59.5*2.5 61.8*2.5

30 дней

ЧСС, уд/мин 428*22 439*15 477*24 509*12 506*5 501*12 459*17 542*24

Р, мВ 0.11 ±0.01 0.08±0.02 0.10*0.02 0.10*0.01 0.09*0.01 0.10±0.02 0.08*0.01 0.09*0.01

И, мВ 0.60+0.07 0.62±0.09 0.57*0.11 0.60*0.12 0.62*0.11 0.63*0.10 0.60*0.09 0.62*0.12

Б, мВ 4.01±1.19 10.0*1.05 4.98*0.73 3.80*0.29 2.95*0.30 3.90*0.43 4.16*0.24 4.81*0.42

Т, мВ 0.17*0.01 0.18±0.04 0.14*0.03 0.16*0.03 0.15*0.04 0.17*0.03 0.17*0.02 0.15+0.02

Р0,мс 47.8±1.0 44.9+1.1 43.5+1.1 47.2*1.1 47.2*2.1 45.9*2.2 46.0*1.9 45.8*1.7

С>Т, мс 60.7*4.2 67.6*3.0 65.3±3.2 63.7*4.2 60.6*3.2 64.9*2.9 63.3+3.5 58.8*3.8

90 дней

ЧСС, уд/мин 439*14 415*32 406*33 433*36 380*10 412*13 399*21 389*29

Р, мВ 0.13+0.02 0.12*0.03 0.09*0.01 0.08*0.01 0.08*0.02 0.11*0.03 0.10*0.04 0.05*0.02

Я, мВ 0.61±7.58 0.52*2.00 0.65*0.11 0.63*9.78 0.51*0.10 0.57*3.79 0.54*8.81 0.52*9.79

Б, мВ 5.93±0.62 2.02*0.20 8.12*0.64 3.98*0.38 8.27*0.27 6.67*0.48 5.80*0.28 7.86*0.31

Т, мВ 0.18*0.02 0.13*0.03 0.13*0.01 0.16*0.05 0.10*0.02 0.17*0.02 0.12*0.02 0.14*0.04

Р(3, мс 40.7*1.1 46.0*1.0 42.6*1.0 45.6*1.0 48.1*1.0 51.0*0.9 45.3*0.9 46.4*0.9

ОТ, мс 58.4*1.9 63.0*4.0 59.4*2.1 60.0*4.8 59.7*2.0 64.3*2.0 59.6*1.9 64.9*3.4

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено, что действие оуабаина, дигоксина и строфантина К на регуляцию роста ткани печени и сердца носит дозозависимый и тканеспецифичный характер. Препараты угнетают рост ткани печени к модулируют рост эксплантатов ткани сердца.

2. Теоретические расчеты показали, что оуабаин хелатирует ионы кальция. Разнонаправленные эффекты оуабаина при регуляции пролиферации кардиомиоцитов устраняет ЭГТА (10"3 М), что свидетельствует о том, что модуляцию сигнальной функции №+,К+-АТФазы кардиомиоцитов может осуществлять хелагный комплекс оуабаин- Са2т.

3. Экспериментально доказано, что Ыа+,К+-АТФаза гепатоцитов не участвует в модуляции их пролиферации в качестве транедуктора. Физиологическая роль эндогенного оуабаина заключается в трансдуктор-опосредованной модуляции Ка+,К+-АТФазы эмбриональных кардиомиоцитов. Гликозид полностью ингибирует деление

кардиомиоцитов в концентрации 10"8 М и на 33% достоверно стимулирует пролиферацию кардиомиоцитов в дозе Ю"10М.

4. Оуабагенин угнетает рост эксплантатов ткани печени и сердца в более высоких концентрациях, чем сердечные гликозиды, имеющие остатки Сахаров. Действие оуабагенина не является тканеспецифичным. Отсутствие углеводного компонента в молекуле гликозида приводит к утрате его способности регулировать транедукторную функцию №+,К.+-АТФазы, но сохраняет возможность влиять на насосную функцию фермента.

5. Коменовая кислота не влияет на рост эксплантатов ткани печени 10-12-дневных куриных эмбрионов. Лпоцептин (5, 100, 300 мг/кг в пересчете на действующую субстанцию коменовую кислоту) в условиях хронического внутривенного 90-дневного введения не оказывает негативного влияния на состояние ткани печени и се антитоксическую функцию.

6. Коменовая кислота в концентрации 10~6 М стимулирует рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов на 38%. Эффект обусловлен ее модулирующим влиянием на транедукторную функцию №+,К+-АТФазы кардиомиоцитов. Отсутствие изменений параметров ЭКГ в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения аноцептина (5, 100, 300 мг/кг в пересчете на коменовую кислоту) свидетельствует о том, что исследуемый препарат не влияет на электрогенную функцию №+,К+-АТФазы кардиомиоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кипенко A.B.. Лобов Г.И., Крылов Б.В. Влияние дигоксина на рост ткани печени в органотипической культуре // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2006. -№ 3. - С. 194-196.

2. Кипенко A.B. Влияние дигоксина на рост ткани печени в органотипической культуре // VI Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2007. - С. 114-115.

3. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А. Участие Na" ,К+-АТФазы в регуляции роста ткани печени в органотипической культуре // Материалы всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах». -Санкт-Петербург, 10-12 октября, 2007. - С. 177.

4. Kipenko A.V.. Penniyaynen V.A. Role of ouabain in regulation growth of difference tissue // Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects: The 2nd St.-Petersburg Humboldt-kolleg conference. - St.-Petersburg, Oktober 7-8, 2008. - P. 1415.

5. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина E.B. О возможности образования хелатного комплекса оуабаин-Са2+ // Материалы второго всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах». -Санкт-Петербург, 28-31 октября, 2008. - С. 172-173.

6. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Влияние сердечных гликозидов на рост эксплантатов ткани печени // Научные труды II съезда физиологов СНГ. -Кишинэу (Молдова), 29-31 октября, 2008. - С. 39-40.

7. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Роль Ыа",К*-АТФазы в регуляции роста тканей разных типов // Материалы конференций политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона». - Санкт-Петербург, 9 декабря, 2008. - С. 118-119.

8. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Плахова В.Б., Подзорова С.А., Кипенко A.B.. Крылов Б.В., Цырлин В.А. Физиологическая роль сигнальной функции Ка+,К+-АТФазы // Научные труды II съезда физиологов СНГ. - Кишинэу (Молдова), 29-31 октября, 2008. -С. 56.

9. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Рогачевский И.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Роль оуабаина в регуляции роста тканей разных типов // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2009. - Т. 95. -№ 2. - С. 137-142.

10. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование действия коменовой кислоты на состояние сердечно-сосудистой системы теплокровных животных // Материалы конференций политехнического симпозиума «Молодые ученые -промышленности северо-западного региона». - Санкт-Петербург, 22 мая, 2009. - С. 166-167.

11. Кипенко A.B.. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Крылов Б.В. Оценка действия препарата аноцептин на ткань печени и ее детоксицирующую фукнцию // Седьмая международная научно-нрактическая конференция «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» [Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование]. - Санкт-Петербург, 2830 апреля, 2009. - Т . 17. - С. 19.

12. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Кипенко A.B.. Цырлин В.А. Физиологическое значение рамнозильного остатка в молекулах сердечных гликозидов // VII Всероссийская конференция с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». - Санкт-Петербург, 29 сентября-02 октября, 2009.- С. 250-251.

Подписано в печать 27.10.2009. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. л. 0.625. Тираж 100 экз. Заказ № 265.

Отпечатано с готового оригинал -макета, предоставленного автором, в типографии ООО «Фирма «Стикс» 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кипенко, Анна Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА Na+,K+-ATOa3bi

2.2. СИГНАЛЬНАЯ ФУНКЦИЯ Na^K^-АТФазы

2.3. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ИЗ ГРУППЫ 33 СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

2.3.1. Химическое строение сердечных гликозидов

2.3.2. Физико-химические свойства и фармакокинетика 36 сердечных гликозидов

2.3.3. Фармакологические эффекты сердечных 37 гликозидов

2.4. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ 39 ЭНДОГЕННЫХ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДАХ

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1.1. Эмбриональная печень как тест-система

3.1.2. Тест-система эмбриональное сердце

3.2. ОРГАНОТИПИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНИ 50 ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА

3.3. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ ЭТАПЫ ДЛЯ 51 КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА

3.3.1. Состав и приготовление питательной среды

3.3.2. Получение коллагена и коллагеновой подложки

3.4. ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНИ 54 ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

3.5. МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 55 РАЗВИТИЯ ЭКСПЛАНТАТОВ

3.6. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.7. МЕТОДЫ КВАНТОВОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

3.8; ХРОНИЧЕСКИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ IN VIVO

3.9. СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ

ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. РАЗВИТИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И 61 СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНИ

4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО 65 ИНГИБИТОРА ОУАБАИНА НА РОСТ ЭКСПЛАНТАТОВ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ СТРОФАНТИНА К И 70 ДИГОКСИНА НА РОСТ ЭКСПЛАНТАТОВ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

4.4. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ОУАБАГЕНИНА НА РОСТ 77 ТКАНИ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

4.5. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ 80 ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ

МОЛЕКУЛОЙ ОУАБАИНА ХЕЛАТНЫХ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ Са2+ И УЧАСТИЯ ЭТОГО КОМПЛЕКСА В МОДУЛЯЦИИ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ Na+,K+-ATOa3bi

4.6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМЕНОВОЙ 90 КИСЛОТЫ НА ТКАНЬ ПЕЧЕНИ И СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ

4.7. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ КОМЕНОВОЙ КИСЛОТЫ НА 92 ТКАНЬ СЕРДЦА 10-12-ДНЕВНЫХ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

4.8. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ 94 ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ ВЗРОСЛЫХ КРЫС В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО 90-ДНЕВНОГО ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА «АНОЦЕПТИН»

4.9. ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО 90-ДНЕВНОГО 96 ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ АНОЦЕПТИНА НА ПАРАМЕТРЫ СИСТОЛИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ И АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ №1+,К+-АТФа*ой КЛЕТОК МИОКАРДА ВЗРОСЛОЙ КРЫСЫ В СИСТЕМНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль Na+, K+-АТФазы в регуляции роста ткани печени и сердца"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из ключевых задач биологии клетки является изучение тонких механизмов передачи и усиления сигналов. Их знание необходимо для понимания функционального ответа клеток в норме и его коррекции при патологических состояниях. В последнее десятилетие особый интерес исследователей вызывает участие Na+,K+-ATOa3bi в процессах внутриклеточной сигнализации, то есть ее роль в организации ответа клетки на различные физиологические стимулы (Xie, Askari, 2002; Schoner, Schiener-Bobis, 2005; Aperia, 2007; Liang et al., 2007).

Функции, которые выполняет Na+,K+-ATOa3a можно разделить на две большие группы: 1) насосная функция, связанная с переносом одновалентных катионов и процессами, зависимыми от величины градиентов концентрации ионов по обе стороны плазматической мембраны, 2) сигнальная функция, в этом случае Na+,K+-AT<X>a3a выступает как трансдуктор сигнала.

В культуре клеток разного типа показано, что Ыа+,К+-АТФаза в качестве трансдуктора сигнала запускает внутриклеточные сигнальные каскады, вызывает изменение экспрессии некоторых генов (Kometiani et у I al., 1998; Xie et al., 1999), внутриклеточной концентрации ионов Ca (Aizman et al., 2001; Zhang et al., 2006; Liu et al., 2007) и активных форм кислорода (Liu et al., 2000; Xie, Askari, 2002). №+,К+-АТФаза в качестве трансдуктора сигнала модулирует рост клеток (Haas et al., 2002; Wang et al., 2004; Schoner, Schiener-Bobis, 2005; Manunta, Ferrandi, 2006; Tian et al., 2006), апоптоз (Brodie et al., 1995; Huang et al., 2004; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007), клеточную адгезию и подвижность (Barwe et al., 2005; Larre et al., 2006; Aperia, 2007).

В1 сенсорных нейронах млекопитающих фермент в качестве трансдуктора участвует в, передаче сигналов от опиоидоподобных рецепторов к медленным натриевым каналам Nav1.8 (Крылов и др., 1999).

Сигнальная функция №+,К+-АТФазы регулируется низкими дозами сердечных гликозидов, недостаточными для ингибирования ионной помпы (Xie, Askari, 2002; Xie, 2003; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007). Сердечные гликозиды (оуабаин, дигоксин, строфантин К), получаемые из растений^ долгое время использовали и как инструмент для. изучения насосной функции Ш+,К+-АТФазы. Дигоксин и строфантин К применяют для лечения хронической сердечной недостаточности. В 1990-х годах было обнаружено, что некоторые сердечные гликозиды синтезируются в гипоталамусе (оуабаин) и коре надпочечников млекопитающих (оуабаин, дигоксин, маринобуфогенин) и выделяются в кровь в. концентрациях, сопоставимых с дозами, модулирующими трансдукторную функцию №+,К+-АТФазы in vitro (Schoner, 2002; Hamlyn, 2004). Однако,, физиологическая роль эндогенных дигиталисоподобных факторов остается малоизученной. Тот факт, что сердечные гликозиды; влияют как на насосную,- так и на сигнальную функцию. Ыа+,К+-АТФазы,. привел к формированию представления об этой мембранной структуре как о мишени для эндогенных сердечных гликозидов (Schoner, Scheiner-Bobis, 2007). Сайт связывания сердечных гликозидов находится на внеклеточной стороне а-субъединицы №+,К+-АТФазы (Bagrov et al., 2009). Однако, во всех исследованиях, посвященных изучению взаимодействия Na+,K+-АТФазы с дигиталисоподобными факторами использовались высокие концентрации последних. Таким образом, известные участки взаимодействия фермента с этими специфическими лигандами- вовлечены в регуляцию насосной функции №+,К+-АТФазы. Сайт связывания сердечных гликозидов, активирующий передачу сигнала от поверхностной мембраны к внутриклеточным или мембранным эффекторам, не идентифицирован. Кроме того, неясно, какие изоформы каталитической л субъединицы фермента' участвуют в реализации» сигнальной функции Na+,K+-АТФазы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение роли Ыа+,К+-АТФазы в регуляции роста ткани печени и сердца. Для достижения этой.цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние селективных ингибиторов' Na+,K+-АТФазы оуабаина, строфантина К, дигоксина и оуабагенина на' рост эксплантатов ткани, печени и сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов.

2. Теоретически и экспериментально оценить возможность образования молекулой оуабаина. хелатных комплексов с ионами Са и участие этого комплекса в модуляции сигнальной функции Na+,K+-АТФазы.

3. Исследовать влияние и выявить возможный механизм действия коменовой кислоты на- ткань, печени, и сердца^ 10-12-дневных куриных эмбрионов в органотипической культуре.

4. Исследовать состояние антитоксической функции1 печени, параметров; систолического давления и ЭКГ взрослых крыс в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения, препарата- «Аноцептин», действующей субстанцией которого являетсякоменовая кислота.

Научная новизна* результатов исследования. Для изучения сигнальной функции Na+,K+-АТФазы впервые был использован метод органотипической- культуры ткани печени и сердца. Впервые экспериментально доказано участие Na+,K+-АТФазы как трансдуктора сигнала в регуляции роста ткани сердца в эмбриональный период онтогенеза. Впервые показано тканеспецифичное действие оуабаина, строфантина К и дигоксина, которое проявляется-- в механизме взаимодействия производных 1,2-циклопергидропентафенантрена' с различными изоформами а-субъединицы №+,К+-АТФазы. Теоретически доказана возможность образования молекулой оуабаина хелатных комплексов с ионами Са2+. Впервые обнаружено, что хелатор ионов кальция ЭГТА (10" М) устраняет разнонаправленные эффекты оуабаина в отношении регуляции роста эксплантатов ткани сердца. Это свидетельствует о том, что комплекс Ка+,К+-АТФаза-оуабаин-Са2+ может служить стимулом для активации трансдукторной функции Na+,K+-АТФазы. аЗ-изоформа фермента, чувствительная к низким, сопоставимым с эндогенными, концентрациям оуабаина, участвует в регуляции роста ткани сердца в эмбриональный период онтогенеза., Впервые показано, что действие оуабаина на рост ткани печени, в которой экспрессируется только al-изоформа Ыа+,К+-АТФазы, не связано с трансдукторной функцией фермента. Впервые обнаружено, что регулирующее рост ткани печени и сердца действие агликона оуабаина оуабагенина не является тканеспецифичным. По-видимому, рамнозильный остаток молекулы оуабаина повышает эффективность взаимодействия гликозида с трансдукторным сайтом №+,К+-АТФазы кардиомиоцитов. Впервые показано, что коменовая кислота не влияет на пролиферацию гепатоцитов и дозозависимо модулирует рост эксплантатов ткани сердца. Отсутствие влияния препарата «Аноцептин», действующей субстанцией которого является коменовая кислота, на электрические процессы в миокарде доказывает, что действие препарата не затрагивает электрогенную функцию Ыа+,К+-АТФазы кардиомиоцитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. №+,К+-АТФаза участвует в модуляции роста ткани печени и сердца.

2. al-изоформа №+,К+-АТФазы выполняет в гепатоцитах печени только насосную функцию.

3. Сигнальная функция Ка+,К+-АТФазы в ткани сердца, по-видимому, зависит от присутствия свободных ионов

Са2+ во внеклеточной среде и реализуется через активацию аЗ-изоформы каталитической субъединицы фермента.

4. Вероятно, способность оуабаина модулировать трансдукторную функцию Na+,K+-ATOa3bi связана с возможностью образовывать

О I хелатные комплексы с ионами Са в различных конформациях и* наличием в его молекуле рамнозильного остатка.

5. Коменовая кислота не влияет на пролиферацию гепатоцитов и дозозависимо модулирует рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов. Препарат «Аноцептин», действующей субстанцией' которого является коменовая кислота, в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения не влияет на антитоксические свойства печени, состояние сердечно-сосудистой системы взрослых животных и не затрагивает электрогенную функцию Na+,K+-ATOa3bi мембраны кардиомиоцитов. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в понимание физиологической роли трансдукторной функции 1Ма+,К+-АТФазы. Работа расширяет представления о роли эндогенных дигиталисоподобных факторов в регуляции пролиферации клеток различных тканей. Анализ полученных результатов позволил сформулировать гипотезу о механизме модуляции эндогенным оуабаином трансдукторной и насосной функций Na+,K+-АТФазы. Сочетание квантово-химических расчетов и экспериментальных данных позволило оценить вклад ионов Са2+ и рамнозильного остатка в способность оуабаина модулировать трансдукторную функцию Na+,K+-АТФазы. Экспериментально доказано, что лекарственный препарат «Аноцептин» не вызывает структурных изменений ткани печени, не влияет на ее антитоксическую функцию и не оказывает негативного влияния на состояние сердечно-сосудистой1 системы при хроническом введении взрослым крысам. Последнее позволяет рекомендовать назначать аноцептин пациентам с нарушенными функциями печени и сердечно-сосудистой патологией.

Материалы диссертации использованы в курсах лекций «Общая физиология» и «Нервно-мышечная физиология» на кафедре общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ; в курсе лекций и практических занятиях в разделах «Физиология возбудимых тканей» и «Физиология рецепторов, нервов' и синапсов» на кафедре нормальной физиологии ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова Росздрава; в научно-клинической- работе Института Мозга человека РАН; в научно-инновационной работе Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2007), Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2007), 2-ой Санкт-Петербургской конференции фонда А. Гумбольдта: «Технологии 21-го века: биологические, физические, информационные и социальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2008), втором Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2008), II Съезде физиологов СНГ (Кишинэу (Молдова), 2008), Политехническом симпозиуме: «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2008), 7-ой' международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и' применение высоких технологий в промышленности» [Высокие технологии, фундаментальные И' прикладные исследования, образование] (Санкт-Петербург, 2009), Политехническом симпозиуме: «Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2009), VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2009). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 20 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 237 источников.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кипенко, Анна Викторовна

6. выводы

1. Впервые обнаружено, что действие оуабаина, дигоксина и строфантина К на регуляцию роста ткани печени и сердца носит дозозависимый и тканеспецифичный характер. Препараты угнетают рост ткани печени и модулируют рост эксплантатов ткани сердца.

2. Теоретические расчеты показали, что оуабаин хелатирует ионы кальция. Разнонаправленные эффекты оуабаина при регуляции пролиферации кардиомиоцитов устраняет

ЭГТА (10 М), что свидетельствует о том, что модуляцию сигнальной функции Na+,K+-АТФазы кардиомиоцитов может осуществлять хелатный комплекс оуабаин-Са2+.

3. Экспериментально доказано, что Иа+,К+-АТФаза гепатоцитов не участвует в модуляции их пролиферации в качестве трансдуктора. Физиологическая роль эндогенного оуабаина заключается в трансдуктор-опосредованной модуляции Na+,K+-АТФазы эмбриональных кардиомиоцитов. Гликозид полностью ингибирует деление кардиомиоцитов в концентрации 10"8 М и на 33% достоверно стимулирует пролиферацию кардиомиоцитов в дозе Ю10М.

4. Оуабагенин угнетает рост эксплантатов ткани печени и сердца в более высоких концентрациях, чем сердечные гликозиды, имеющие остатки Сахаров. Действие оуабагенина не является тканеспецифичным. Отсутствие углеводного компонента в молекуле гликозида приводит к утрате его способности регулировать трансдукторную функцию Na+,K+-АТФазы, но сохраняет возможность влиять на насосную функцию фермента.

5. Коменовая кислота не влияет на рост эксплантатов ткани печени

10-12-дневных куриных эмбрионов. Аноцептин (5, 100, 300 мг/кг в пересчете на действующую субстанцию коменовую кислоту) в условиях хронического внутривенного 90-дневного введения не оказывает негативного влияния на состояние ткани печени и ее антитоксическую функцию.

6. Коменовая кислота в концентрации 10"6 М стимулирует рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов на 38%. Эффект обусловлен ее модулирующим влиянием на трансдукторную функцию Ыа+,К+-АТФазы кардиомиоцитов. Отсутствие изменений параметров ЭКГ в условиях хронического 90-дневного внутривенного введения аноцептина (5, 100, 300 мг/кг в пересчете на коменовую кислоту) свидетельствует о том, что исследуемый препарат не влияет на электрогенную функцию Ыа+,К+-АТФазы кардиомиоцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кипенко, Анна Викторовна, Санкт-Петербург

1. Базисная и клиническая фармакология: Учебное пособие: в 2 т. / Под ред. Б.Г. Катцунга. Пер. с англ. под ред. Э.Э. Звартау. 2-е изд., перераб. - СПб.: Невский диалект, 2007. - Т.1. - 648 с.

2. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т. Хроническая сердечная недостаточность: избранные лекции по кардиологии / Ю.Н. Беленков, В.Ю. Мареев, Ф.Т. Агеев. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 432 с.

3. Гаврилюк Б.К., Сафронов В.Л. Органотипическое культивирование тканей / Б.К. Гаврилюк, В.Л. Сафронов. М.: Наука, 1983. - 128 с.

4. Гарбузенко Д.В., Попов Г.К. Механизмы регуляции регенерации печени // Росс. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -2001. Т.П. -№1. - С. 21-25.

5. Гичев Ю.П., Граудиня Ж.П. Культура ткани печени в гепатологии / Ю.П. Гичев, Ж.П. Граудиня. — Новосибирск: Наука, 1986. — 88 с.

6. Дербенев А.В., Крылов Б.В., Шурыгин А.Я. Действие миконовой и коменовой кислот на медленные натриевые каналы сенсорных нейронов // Биол. мембраны. 1999. - Т.16. — №3. - С. 310-317.

7. Елизарова О.Н., Рязанова Р.А. Клеточные культуры как биологическая модель в токсикологических исследованиях: Науч. Обзор / О.Н. Елизарова, Р.А. Рязанова. -М.: Изд-е ВНИИМИ, 1982. 60 с.

8. Калашникова М.М. Особенности ультраструктуры клеток печени в сравнительно-морфологическом ряду животных и их значение // Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1996. — №6. - С. 604-609.

9. Карецкий А.В., Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Влияние Q-134 на рост клеток сетчатки в органотипической культуре ткани // «Клеточные технологии в офтальмологии», Москва. 2005. — С. 22-23.

10. Кипенко А.В., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Рогачевский И.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Роль оуабаина в регуляции роста тканей разных типов // Рос. физиол. ж. -2009. Т.95. -№2. - С. 137-142.

11. Клиническая фармакология. Учебник для ВУЗов / Под ред. В.Г. Кукеса. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - С. 441-451.

12. Колесниченко Т.С., Попова Н.В. Сравнительное изучение органных культур эмбриональной печени человека, крыс, мышей и кур // Онтогенез. 1980.-Т. 11.-№ 6.-С. 635-638.

13. Колычев А.П., Лейбуш Б.Н. Связывание инсулина рецепторами плазматических мембран печени кур в онтогенезе // Онтогенез. — 1988. -Т. 19. — №1. С. 55-58.

14. Крамарь С.Б. Структурная организация сердца в онтогенезе птиц // Морфология развивающегося сердца (структура, ультраструктура, метаболизм). Днепропетровск, 1995. - С. 93-110.

15. Крылов Б.В., Дербенев А.В., Подзорова С.А., Людыно М.И., Кузьмин А.В., Изварина Н.Л. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Рос. физиол. ж. — 1999. -Т. 85.-№2.-С. 225-236.

16. Куценко С.А. Основы токсикологии / С.А. Куценко. СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2004. - 715 с.

17. Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. Участие сердечных гликозидов в регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки // Бюллетень эксперим. биологии и медицины 2008. — Т. 146.-№12.-С. 651-653.

18. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. Исследование участия Na+,K+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре // Бюллетень эксперим. биологии и медицины-2005.-Т. 140.-№8.-С. 150-153.

19. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Цырлин В.А. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов на рост эксплантатов ткани сердца // Рос. физиол. ж.-2005а.-Т. 91.-№11.-С. 1299-1304.

20. Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na+/K+-АТФазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами // Биохимия. 2001. - Т. 66. - №10. - С. 1389-1400.

21. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. М.: Медицина, 1969.-423 с.

22. Низамов Р.С., Киясов А.П., Алимов И.М., Ахметин Э.Ю., Орлова О.Е. Иммуногистохимическое изучение фенотипов клеток в органотипической культуре печени эмбрионов крыс // Цитология. -2001.-Т. 43. -№1. С. 92-98.

23. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование роли №+/К+-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов // Бюлл. эксп. биол. мед.-2005.-Т. 139.-№2.-С. 157-159.

24. Пол Дж. Культура клеток и тканей / Дж. Пол. — М.: Медгиз, 1963. — 347 с.

25. Руководство по фармакологии. В 2 т. / Под ред. Н.В. Лазарева. М.: Медгиз, 1961.-Т. 2.-612 с.

26. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих / Методы культивирования клеток: Сборник науч. трудов. Л.: Наука, 1988. - С. 44-63.

27. Терещенко С.Н. Возможности и перспективы инотропной терапии хронической сердечной недостаточности // Русский Медицинский Журнал. 1999. - Т. 7. - №2. - С.

28. Федорова О.В., Багров А.Я. Эндогенные дигиталисоподобные ингибиторы Ка+/К+-АТФазы в патогенезе солечувствительной артериальной гипертензии // Артериальная гипертензия. 2005. - Т. 11.-№2.-С. 8-14.

29. Федоряка А.В. Пролиферация кардиомиоцитов кур в пренатальном периоде онтогенеза // Карповские чтения: Материалы II

30. Всеукраинской научной морфологической конференции (Днепропетровск, 12-15 апреля 2005 г.). Под ред. проф. И.В. Твердохлеба. Днепропетровск: Пороги, 2005. — 93 с.

31. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. - 832 с.

32. Aizman O., Uhlen P., Lai M., Brismar H., Aperia A. Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-V. 98.-№23.-P. 13420-13424.

33. Anner B.M. The receptor function of the Na+,Reactivated adenosine triphosphatase system // Biochem. J. 1985. - V. 227. - №1. - P. 1-11.

34. Apell H.-J., Karlish S. J. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques // J. Membr. Biol.-2001.-V. 180.-№1.-P. 1-9.

35. Aperia A. New roles for an old enzyme: Na,K-ATPase emerges as an interesting drug target // Journal of internal medicine. 2007. - V. 261. -P. 44-52.

36. Bagrov Y.Y., Manusova N.B., Frolova E.V., Egorova I.A., Kashkin V.A., Tapilskaya N.I., Fedorova O.V., Bagrov A.Y. Endogenous sodium pump inhibitors, diabetes mellitus and preeclampsia // Pathophysiology. 2007. -V. 14.-№3-4.-P. 147-151.

37. Bagrov A.Y., Shapiro J.I., Fedorova O.V. Endogenous cardiotonic steroids: physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets // Pharmacol. Rev. 2009. - V. 61.-№1.-P. 9-38.

38. Balzan S., Nicolini G., Iervasi A., Di Cecco P., Fommei E. Endogenous ouabain and acute salt loading in low-renin hypertension // Am. J. Hypertens. -2005. — V. 18.-№7.-P. 906-909.

39. Bassas L., De Pablo F., Lesniak M.A., Roth J. Ontogeny of receptors for insulin-like growth factor over insulin receptor in brain // Endocrinology. — 1985.-V. 117.-№6. -P. 2321-2329.

40. Becker S., Schneider H., Scheiner-Bobis G. The highly conserved extracellular peptide, DSYG (893-896), is a critical structure for sodium pump function // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271. - №19. - P. 38213831.

41. Beguin P., Peitsch M.C., Geering K. Alpha 1 but not alpha 2 or alpha 3 isoforms of Na,K-ATPase are efficiently phosphorylated in a novel protein kinase С motif// Biochemistry. 1996. - V. 35. - №45. - P. 14098-14108.

42. Beguin P., Wang X., Firsov D., Puoti A., Claeys D., Horisberger J.D., Geering K. The у subunit is a specific component of the Na+,K+-ATPase and modulates its transport function // EMBO. J. 1997. - V. 16. - №14. -P. 4250-4260.

43. Beguin P., Crambert G., Guennoun S., Garty H., Horisberger J.D., Geering K. CHIF, a member of the FXYD protein family, is a regulator of Na+,K+-ATPase distinct from the y-subunit // EMBO. J. 2001. - V. 20. - №15. -P. 3993-4002.

44. Benzo C.A., Haba G. Development of chick embryo liver during organ culture; requirement for zink-insulin // J. Cell. Physiol. — 1972. V. 79. -№1. - P. 53-64.

45. Benzo C.A., Nemeth A.M. Factors controlling development of chick embryo liver cells during organ culture // J. Cell. Biol. 1971. - V. 48. - P. 235-247.

46. Bernstoin M.B. Reconstituted rat tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslip in Maximov slides and roller tubes // Lab. Invest. -1958.-V. 7.-P. 134-137.

47. Blanco G., Mercer R.W. Isozymes of the Na+,K+-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function // Am. J. Physiol. 1998. - V. 275. - №5. -P. F633-F655.

48. Blanco G. Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation // Semin. Nephrol. -2005. V. 25. - №5. - P. 292303.

49. Bogdanova A., Grenacher B.5 Nikinmaa M., Gassmann M. Hypoxic responses of Na+,K+-ATPase in trout hepatocytes // J. Exp. Biol. 2005. -V. 208.-№10.-P. 1793-1801.

50. Bovenkamp M., Groothuis G.M.M., Draaisma A.L. et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu // Toxicol. Sci. — 2005. V. 85. - №1. -P. 632-638.

51. Brodie C., Tordai A., Saloga J., Domenico J., Gelfand E.W. Ouabain induces inhibition of the progression phase in human T-cell proliferation // J. Cell. Physiol. 1995. -V. 165. -№2. - P. 246-253.

52. Buettner R., Straub R. H., Ottinger I., Woenckhaus M., Scholmerich J., Bollheimer L. C. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system // Horm. Metab. Res. 2005. - V. 37. -№3. - P. 127-132.

53. Capendeguy O., Chodanowski P., Michielin O., Horisberger J.D. Access of extracellular cations to their binding sites in Na+,K+-ATPase: role of the second extracellular loop of the alpha subunit // J. Gen. Physiol. 2006. -V. 127. -№3.- P. 341-352.

54. Cai H., Wu L., Qu W., Malhotra D., Xie Z., Shapiro J.I., Liu J. Regulation of apical NHE3 trafficking by ouabain-induced activation of the basolateral Na/K-ATPase receptor complex // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2008. -V. 294. - №2. - P. C555-C563.

55. Clausen T. Clinical and therapeutic significance of Na+,K+-pump // Clinical Science. 1998. - V. 95. - P. 3-17.

56. Clausen T. Role of Na+,K+-pumps and transmembrane Na+,K+-distribution in muscle function // Acta. Physiol. 2008. - V. 192. - P. 339-349.

57. Clausen Т., Nielsen O.B., Harrison A.P., Flatman J.A., Overgaard K. The Na+,K+-pump and muscle excitability // Acta. Physiol. Scand. 1998. - V. 162.-P. 183-190.

58. Costa С J., Gatto C., Kaplan J.H. Interactions between Na+,K+-ATPase alpha-subunit ATP-binding domains // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. -№11. -P. 9176-9184.

59. Crambert G., Hasler U., Beggah A.T., Yu C., Modyanov N.N., Horisberger J.D., Lelievre L., Geering K. Transport and pharmacological properties of nine different human Na+,K+-ATPase isozymes // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275. - №3. - P. 1976-1986.

60. Crambert G., Fuzesi M., Garty H., Karlish S., Geering K. Phospholemman (FXYD1) associates with Na+,K+-ATPase and regulates its transport properties // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. - №17. - P. 11476-11481.

61. Crambert G., Schaer D., Roy S., Geering K. New moleculars determinants controlling the accessibility of ouabain to its binding site in human Na+,K+-ATPase a isoforms // Mol. Pharmacol. 2004. - V. 65. - P. 335-341.

62. Crambert G., Li C., Claeys D., Geering K. FXYD3 (Mat-8), a new regulator of Na+,K+-ATPase // Mol. Biol. Cell. 2005. - V. 16. - №5. p. 2363-2371.

63. Dempski R.E., Friedrich Т., Bamberg E. The beta subunit of Na+,K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme // J. Gen. Physiol. 2005. - V. 125. - №5. - P. 505-520.

64. Dempski R.E., Hartung K., Friedrich Т., Bamberg E. Fluorometric measurements of intermolecular distances between the alpha- and beta-subunits of the Na+,K+-ATPase // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - №47. -P. 36338-36346.

65. De Pont J.J., Swarts H.G., Karawajczyk A., Schaftenaar G.> Willems P.H., Koenderink J.B. The non-gastric H,K-ATPase as a tool to study the ouabain-binding site in Na,K-ATPase // Pflugers. Arch. 2009. - V. 457. -№3. - P. 623-634.

66. Dmitrieva R.I., Doris P.A. Cardiotonic steroids: potential endogenous sodium pump ligands with diverse function // Experim. Biol. Medicine — 2002. V. 227. - P. 561-569.

67. Dmitrieva R.I., Lalli E., Doris P.A. Regulation of adrenocortical cardiotonic steroid production by dopamine and PKA signaling // Front. Biosci. 2005. - V. 10. - P. 2489-2495.

68. Dos Santos Mda.C., Burth P., Younes-Ibrahim M., Gon9alves C.F., Santelli R.E., Oliveira E.P., de Castro Faria M.V. Na/K-ATPase assay in the intact guinea pig liver submitted to in situ perfusion // Anal. Biochem. — 2009. -V. 385.-№1.-P. 65-68.

69. Dostanic-Larson I., Van Huysse J.W., Lorenz J.N., Lingrel J.B. The highly conserved cardiac glycoside binding site Na,K-ATPase plays a role in blood pressure regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. -44.-15845-15850.

70. Duncan S.A. Transcriptional regulation of liver development // Dev. Dyn. -2000. V. 219. -№2. -P. 131-142.

71. Eva A., Kirch U., Scheiner-Bobis G. Signaling pathways involving the sodium pump stimulate NO production in endothelial cells // Biochim. Biophys. Acta.-2006.-V. 1758.-№11.-P. 1809-1814.

72. Fair J.H., Cairns B.A., Lapaglia M., Wang J., Meyer A.A., Kim H., Hatada S., Smithies O., Pevny L. Induction of hepatic differentiation in embryonic stem cells by co-culture with embryonic cardiac mesoderm // Surgeiy. -2003.-V. 134.-№2.-P. 189-196.

73. Farkas D., Tannenbaum S.R. In vitro methods to study chemically-induced hepatotoxicity: a literature review // Curr. Drug. Metab. — 2005. — V. 6. — №2.-P. 111-125.

74. Feraille E., Doucet A. Sodium-potassium-adenosinetriphosphatase-dependent sodium transport in the rat kidney: hormonal control // Physiol. Rev. 2001. - V. 81. - №1. - P. 345-418.

75. Ferrandi M., Manunta P., Balzan S., Hamlyn J.M., Bianchi G., Ferrari P. Ouabain-like factor quantification in mammalian tissues and plasma: comparison of two independent assays // Hypertension. 1997. - V. 30. -№4.-P. 886-896.

76. Ferrandi M., Molinari I., Barassi P., Minotti E., Bianchi G., Ferrari P. Organ hypertrophic signaling within caveolae membrane subdomains triggered by ouabain and antagonized by PST 2238 // J. Biol. Chem. -2004. V. 279. -№32. - P. 33306-33314.

77. Feschenko M.S., Sweadner K.J. Conformation-dependent phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase A and protein kinase С // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - №48. - P. 30436-30444.

78. Francis M.J., Lees R.L., Trujillo E., Martin-Vassallo P., Heersche J.N., Mobasheri A. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2002. - V. 34. - №5. - P. 459-479.

79. Garty H., Karlish S.J. Role of FXYD proteins in ion transport // Annu. Rev. Physiol. 2006. - V.68. - P. 431-459.

80. Geering K. The functional role of P subunits in oligomeric P-type ATPases // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. -V. 33. - P. 425^138.

81. Geering K. Functional roles of Na,K-ATPase subunits // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2008. - V. 17. - №5. - P. 526-532.

82. Groneberg D.A., Grosse-Siestrup C., Fischer A. In vitro models to study hepatotoxicity // Toxicol. Pathol. 2002. - V. 30. - №3. - P. 394-399.

83. Haas M., Askari A., Xie Z. Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal transducing function of Na+/K+-ATPase // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - №36. - P. 27832-27837.

84. Hamburger V., Hamilton H.L. A series of normal stages in the development of the chick embryo // Dev. Dyn. 1992. V. 195. - №4. - P. 231-272.

85. Hamlyn J.M. Biosynthesis of endogenous cardiac glycosides by mammalian adrenocortical cells: three steps forward // Clin. Chem. — 2004. -V. 50.-№3.-P. 612-620.

86. Hamlyn J.M., Manunta P. Ouabain, digitalis-like factors and hypertension // J. Hypertens. Suppl. 1992. - V. 10.-№7.-P. 99-111.

87. Hasler U., Crambert G., Horisberger J.D., Geering K. Structural and functional features of transmembrane domain of Na+,K+-ATPase beta subunit revealed by tryptophan scanning // J. Biol. Chem. — 2001. V. 276. -№19.-P. 16356-16364.

88. Hauptman P.J., Kelly R.A. Digitalis // Circulation. 1999. - V. 99. - №9. -P. 1265-1270.

89. Hilgenberg L.G., Pham В., Ortega M., Walid S., Kemmerly Т., O'Dowd D.K., Smith M.A. Agrin regulation of alpha3 sodium-potassium ATPase activity modulates cardiac myocyte contraction // J. Biol. Chem. 2009. — V. 284. - №25. - P. 16956-16965.

90. Hilgenberg L.G., Su H., Gu H., O'Dowd D. K., Smith M. A. Alpa3 Na+,K+-ATPase is a neuronal receptor for agrin // Cell. 2006. - V. 125. - №2. -P.-359-369.

91. Horisberger J.D. Recent insights into the structure and mechanism of the sodium pump // Physiology 2004. -V. 19. - P. 377-387.

92. Huang L., Li H., Xie Z. Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997. - V. 29. - №2. - P. 429-437.

93. Jorgensen P.L. Transmission of E1-E2 structural changes in response to Na+ or K+ binding in Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986.-P. 22-30.

94. Jorgensen P.L., Hakansson K.O., Karlish S.J. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions // Annu. Rev. Physiol. -2003. — V. 65.-P. 817-849.

95. Jorgensen J.R., Houghton-Larsen J., Jacobsen M.D., Pedersen P.A. Amino acids in the TM4-TM5 loop of Na,K-ATPase are important for biosynthesis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003a. - V. 986. - P. 369-377.

96. Kaplan J.H. Biochemistry of Na,K-ATPase // Annu. Rev. Biochem. 2002. -V. 71.-P. 511-535.

97. Kaplan J.H. The sodium pump and hypertension: a physiological role for the cardiac glycoside binding site of the Na+,K+-ATPase // Proc. Natl Acad. Sci. USA.-2005.-V. 102.-№44.-P. 15723-15724.

98. Kazanietz M.G., Caloca M.J., Aizman O., Nowicki S. Phosphorylation of the catalytic subunit of rat renal Na+, K+-ATPase by classical PKC isoforms //Arch. Biochem. Biophys. -2001. V. 388. -№1. - P. 74-80.

99. Kometiani P., Li. J., Gnudi L., Kahn B.B., Askari A., Xie Z. Multiple signal transduction pathways link Na+,K+-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - №24. - P. 1524915256.

100. Kometiani P., Liu L., Askari A. Digitalis-induced signaling by Na+/K+-ATPase in human breast cancer cells // Mol. Pharmacol. — 2005. V. 67. — №3. - P. 929-936.

101. Kumar R., Chandra R., Shukla S.K. Isolation of etiological agent of hydropericardium syndrome in chicken embryo liver cell culture and itsserological characterization // Indian. J. Exp. Biol. 2003. - V. 41. -№8. -P.-821-826.

102. Larre I., Ponce A., Fiorentino R., Shoshani L., Contreras R.G., Cereijido M. Contacts and cooperation between cells depend on the hormone ouabain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103. - №29. - P. 10911-10916.

103. Lee J.Y., Gollamudi S., Ozelius L.J., Jeon B.S. ATP1A3 mutation in the first asian case of rapid-onset dystonia-parkinsonism // Mov. Disord. -2007. -V. 22. -№12. P. - 1808-1809.

104. Li C., Crambert G., Thuillard D., Roy S., Geering K. Role of the transmembrane domain of FXYD7 in structural and functional interaction with Na+,K+-ATPase // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - №52. - P. 42738-42743.

105. Li C., Grosdidier A., Crambert G., Horisberger J.D., Michielin O., Geering K. Structural and functional interaction sites between Na+,K+-ATPase and FXYD proteins // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - №37. - P. 3889538902.

106. Li J. Na,K-ATPase as a signaling transducer. Stockholm.: Karolinska Instituted 2007.-71 p.

107. Li J., Zelenin S., Aperia A., Aizman O. Low doses of ouabain protect from serum deprivation-triggered apoptosis and stimulate kidney proliferation via activation of NF-kappaB // J. Am. Soc. Nephrol. 2006. - V.17. - №. -P. 1848-1857.

108. Li Z., Xie Z. The Na/K-ATPase/Src complex and cardiotonic steroid-activated protein kinase cascades // Eur. J. Physiol. 2009. - V. 457. -P. 635-644.

109. Lian W.N., Wu T.W., Dao R.L., Chen Y.J., Lin C.H. Deglycosylation of Na+,K+-ATPase causes the basolateral protein to undergo apical targeting in polarized hepatic cells // J. Cell. Sci. 2006. - V. 119. - №1. - P. - 1122.

110. Liang M., Cai Т., Tian J., Qu W., Xie Z.J. Functional characterization of Src-interacting Na+/K+-ATPase using RNA interference assay // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281.-№28.-P. 19709-19719.

111. Liang M., Tian J., Liu L., Pierre S., Liu J., Shapiro J., Xie Z.J. Identification of a Pool of Non-pumping Na/K-ATPase // J. Biol. Chem. — 2007. V. 282. - №14. - P. 10585-10593.

112. Liu L., Mohammadi K., Aynafshar В., Wang H., Li D., Liu J., Ivanov A.V., Xie Z., Askari A. Role of caveolae in signal-transducing function of cardiac Na+/K+-ATPase // Am. J. Physio.l Cell Physiol. 2003. - V. 284. -P. C1550-C1560.

113. Liu X.L., Miyakawa A., Aperia A., Krieger P. Na,K-ATPase generates calcium oscillations in hippocampal astrocytes // Neuroreport. 2007. - V. 18.-№6.-P. 597-600.

114. McDonough A.A., Velotta J.B., Schwinger R.H., Philipson K.D., Farley R.A. The cardiac sodium pump: structure and function // Basic. Res. Cardiol. 2002. - V. 97. - Suppl. 1. - P. 119-124.

115. Maeno Т., Enomoto K. Chemical modification by maleimide of toxic and nontoxic ouabain actions on neuromuscular transmission in the frog // Jpn. J. Physiol. 1995. - V. 45. - №5. - P. 811-821.

116. Mahmmoud Y.A., Cornelius F. Protein kinase С phosphorylation of purified Na,K-ATPase: C-terminal phosphorylation sites at the alpha- andgamma-subunits close to the inner face of the plasma membrane // Biophys. J. 2002. - V. 82. - №4. - P. 1907-1919.

117. Mahmmoud Y. A., Cornelius F. Direct activation of gastric H,K-ATPase by N-terminal protein kinase С phosphorylation. Comparison of the acute regulation mechanisms of H,K-ATPase and Na,K-ATPase // Biophys. J. -2003.-V. 84.-P. 1690-1700.

118. Manunta P., Ferrandi M. Cardiac glycoside and cardiomyopathy // Hypertension. 2006. - V.47. - №3. - P. 343-344.

119. Manunta P., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. Structure-activity relationships for the hypertensinogenic activity of ouabain: role of sugar and lactone ring // Hypertension. 2001. - Y.37. - P. 472-477.

120. Manunta P., Hamilton J., Rogowski A.C., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. Chronic hypertension induced by ouabain but not digoxin in the rat: antihypertensive effect of digoxin and digitoxin // Hypertens. Res. — 2000. -V. 23.-Suppl.-P 77-85.

121. Mathias R.T., Cohen I.S., Gao J., Wang Y. Isoform-specific regulation of the Na+-K+-pump in heart // News Physiol. Sci. 2000. - V. 15. - P.176-180.

122. Minor N.T., Sha Q., Nichols C.G., Mercer R.W. The gamma subunit of Na+,K+-ATPase induces cation channel activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - №11. - p. 6521-6525.

123. Mohammadi K., Kometiani P., Xie Z., Askari A. Role of protein kinase С in the signal pathways that link Na+,K+-ATPase to ERK1/2 // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - №45. - P. 42050-42056.

124. Melero C.P., Medarde M., San Feliciano A. A short review on cardiotonic steroids and their aminoguanidine analogues // Molecules. — 2000. — №5. — P. 51-81.

125. Munhoz C.D., Kawamoto E.M., de Sa Lima L., Lepsch L.B., Glezer I., Marcourakis Т., Scavone C. Glutamate modulates sodium-potassium

126. ATPase through cyclic GMP and cyclic GMP-dependent protein kinase in rat striatum // Cell. Biochem. Funct. 2005. - V. 23. - №2. - P. 115-123.

127. Nagasue N., Yukaya H., Ogawa Y. Human liver regeneration after major hepatic resection. A Study of normal liver and livers with chronic hepatitis and cirrhosis. // Ann. Surg. 1987. -V. 206. - №1. - P. 30-39.

128. Nakagawa Y., Rivera V., Lamer A.C. A role for the Na+, K+-ATPase in the control of human c-fos and c-jun transcription // J. Biol. Chem. 1992. -V. 267. - №13. - P. 8785-8788.

129. Narkar V.A., Hussain Т., Lokhandwala M.F. Activation of D2-like receptors causes recruitment of tyrosine-phosphorylated NKA alpha 1-subunits in kidney // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2002a. - V. 283. -№6. - P. F1290-F1295.

130. Narkar V., Hussain Т., Lokhandwala M. Role of tyrosine kinase and p44/42 МАРК in D(2)-like receptor-mediated stimulation of Na(+), K(+)-ATPase in kidney // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 20026. - V. 282. - №4. - P. F697-F702.

131. Nishi A., Fisone G., Snyder G.L., Dulubova I., Aperia A., Nairn A.C., Greengard P. Regulation of Na+, K+-ATPase isoforms in rat neostriatum by dopamine and protein kinase С // J. Neurochem. 1999. - V. 73. - №4. — P. 1492-1501.

132. Olivey H.E., Barnett J.V., Ridley B.D. Expression of the type III TGFbeta receptor during chick organogenesis // Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 2003. - V. 272. - №1. - P. 383-387.

133. Palasis M., Kuntzweiler T.A., Argiiello J.M., Lingrel J.B. Ouabain interactions with the H5-H6 hairpin of the Na+,K+-ATPase reveal a possible inhibition mechanism via the cation binding domain // J. Biol. Chem. -1996. V. 271. - №24. - P. 14176-14182.

134. Parhami-Seren В., Haberly R., Margolies M.N., Haupert G.T.Jr. Ouabain-binding protein(s) from human plasma // Hypertension. — 2002. V. 40. -№2. - P. 220-228.

135. Peckham D, Holland E., Range S., Knox A.J. Na+,K+-ATPase in lower airway epithelium from cystic fibrosis and non-cystic- fibrosis lung // Biochem. Biophys. Research Communications 1997. - V. 232. - №2. -P. 464-468.

136. Pedemonte C.H., Pressley T.A., Lokhandwala M.F., Cinelli A.R. Regulation of Na,K-ATPase transport activity by protein kinase С // J. Membr. Biol. 1997. - V. 155. - №3. - P. 219-227.

137. Peng M., Huang L., Xie Z., Huang W.H., Askari A. Partial inhibition of

138. Na+/K+-ATPase by ouabain induces the Ca -dependent expressions of early-response genes in cardiac myocytes // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-№17.-P. 10372-10378.

139. Pierre S.V., Sottejeau Y., Gourbeau J-M., Sanchez G., Shidyak A., Blanco G. Isoform specificity of Na-K-ATPase-mediated ouabain signaling // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2008. - V. 294. - P. 859-866.

140. Pierre S.V., Xie Z. The Na/K-ATPase receptor complex: its organization and membership // Cell. Biochem. Biophys. 2006. - V. 46. - №3. - P 303-316.

141. Plourde D., Soltoff S.P. Ouabain potentiates the activation of ERK Vz by carbachol in parotid gland epithelial cells; inhibition of ERK Уг reduces Na+,K+-ATPase activity // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2006. - V. 290. -№3. - P. C702-C710.

142. Pu H.X., Cluzeaud F., Goldshleger R., Karlish S.J.D., Farman N., Blonstein R. Functional role and immunocytochemical localization of ya and yb forms of the Na+,K+-ATPase у subunit // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. -№23.-P. 20370-20378.

143. Rajasekaran S.A., Rajasekaran A.K. Na,K-ATPase and epithelial tight junctions //Front. Biosci. -2009. — V. 14.-P. 2130-2148.

144. Razani В., Woodman S.E., Lisanti M.P. Caveolae: From Cell Biology to Animal Physiology // Pharmacol. Rev. 2002. - V. 54. - №3. - P. 431467.

145. Repin V.S., Saburina I.N., Sukhikh G.T. Cell biology of fetal tissues and fundamental medicine // Bull. Exp. Biol. Med. 2007. - V. 144. - №1. - P. 108-117.

146. Reyns G.E., Venken K., Morreale de Escobar G., Kuhn E.R., Darras V.M. Dynamics and regulation of intracellular thyroid hormone concentrations in embryonic chicken liver, kidney, brain, and blood // Gen. Сотр. Endocrinol.-2003.-V. 134.-№1.-P. 80-87.

147. Reyns G.E., Verhoelst C.H., Kuhn E.R., Darras V.M., Van der Geyten S. Regulation of thyroid hormone availability in liver and brain by glucocorticoids // Gen. Сотр. Endocrinol. 2005. - V. 140. - №2. - P. 101-108.

148. Rice W.J., Young H.S., Martin D.W., Sachs J.R., Stokes D.L. Structure of Na+,K+-ATPase at 11-A resolution: comparison with Ca2+- ATPase in El and E2 states // Biophysical. J. -2001. -V. 80. -P.2187-2197.

149. Sanchez A., Fernandez M.E., Rodriguez A., Fernandez J., Torre-Perez N., Ниг1ё J.M., Garcia-Sancho J. Experimental models for cardiac regeneration // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2006. - №1. - P. 29-32.

150. Saunders R., Scheiner-Bobis G. Ouabain stimulates endothelin release and expression in human endothelial cells without inhibiting the sodium pump // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271. - №5. - P. 1054-1062.

151. Scavone C., Munhoz C.D., Kawamoto E.M., Glezer I., de Sa Lima L., Marcourakis Т., Markus R.P. Age-related changes in cyclic GMP and PKG-stimulated cerebellar Na,K-ATPase activity // Neurobiol. Aging. -2005. V. 26. - №6. - P. 907-916.

152. Scheiner-Bobis G. The sodium pump. 1st molecular properties and mechanics of ion transport // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - №10. -P. 2424-2433.

153. Scheiner-Bobis G., Eva A., Kirch U. Signalling pathways involving sodium pump stimulate endothelin-1 secretion and nitric oxide production in endothelial cells // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2006. - V. 52. -№8.-P. 58-63.

154. Schmalzing G., Ruhl K., Gloor S.M. Isoform-specific interactions of Na+,K+-ATPase subunits are mediated via extracellular domains and carbohydrates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - №4. - P. 1136-1141.

155. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A., Elbert S.T., Gordon M.S., Jensen J.H., Koseki S., Matsunaga N., Nguyen K.A., Su S.J., Windus T.L., Dupuis M., Montgomery J.A. GAMESS // J. Comput. Chem. 1993. - V. 14.-№11.-P. 1347-1363.

156. Schoner W. Ouabain, a new steroid hormone of adrenal gland and hypothalamus // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2000. - V. 108. - №7. -P. 449-454.

157. Schoner W. Endogenous cardiotonic steroids // Cell. Mol. Biol. 2001. -V. 47.-№2.-P. 273-280.

158. Schoner W. Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones // Eur. J. Biochem. 2002. - V.269. - №10. - P. 2440-2448.

159. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous cardiac glycosides: hormones using the sodium pump as signal transducer // Semin. Nephrol. 2005. - V. 25.-№5.-P. 343-351.

160. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous and exogenous cardiac glycosides: their roles in hypertension, salt metabolism, and cell growth // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2007. - V. 293. - №2. - P. C509-C536.

161. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous and exogenous cardiac glycosides and their mechanisms of action // Am. J. Cardiovasc. Drugs. -2007a.-V. 7. -№3. P. 173-189.

162. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Role of endogenous cardiotonic steroids in sodium homeostasis // Nephrol. Dial. Transplant. 2008. - V.23. - №9. -P. 2723-2729.

163. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous cardioactive steroids—a new class of steroid hormones // Dtsch. Med .Wochenschr. 2009. - V. 134. — №13.-P. 632-636.

164. Shah J.R., Laredo J., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. Different signaling pathways mediate stimulated secretions of endogenous ouabain and aldosterone from bovine adrenocortical cells // Hypertension. 1998. - V. 31. — №1. - P. 463-468.

165. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta 1957. - V. 23. - P. 394-401.

166. Strugatsky D., Gottschalk K.E., Goldshleger R., Karlish S J. D443 of the N domain of Na+,K+-ATPase interacts with the ATP-Mg2+ complex, possibly via a second Mg2+ ion // Biochemistry 2005. - V. 44. - №49. - P. 1596115969.

167. Sugimoto H., Yang C., Lebleu Y.S., Soubasakos M.A., Giraldo M., Zeisberg M., Kalluri R. BMP-7 functions as a novel hormone to facilitate liver regeneration // FASEB J. 2006. - V. - №. - P.

168. Suksaweang S., Lin C.M., Jiang T.X., Hughes M.W., Widelitz R.B., Chuong C.M. Morphogenesis of chicken liver: identification of localized growth zones and the role of beta-catenin/Wnt in size regulation // Dev. Biol. 2004. - V. 266. - №1. - P. 109-122.

169. Sweadner K.J. Na+/K+-ATPase and its isoforms // Neuroglia. 1995. - P. 259-272.

170. Taub R. Liver regeneration: from myth to mechanism // Nature Reviews Molecular Cell Biol. 2004. - V. 5. - №10. - P. 836-847.

171. Therien A.G., Blostein R. Mechanisms of sodium pump regulation // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2000. - V. 279. - №3. - P. C541- C566.

172. Vagin O., Tokhtaeva E., Sachs G. The role of the betal subunit of the Na,K-ATPase and its glycosylation in cell-cell adhesion // J. Biol. Chem. — 2006. V. 281. - №51. - P. 39573-39587.

173. Wang H., Haas M., Liang M., Cai Т., Tian J., Li S., Xie Z. Ouabain assemblies signaling cascades through the caveolar Na(+)-K(+)-ATPase // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. -№17. - P. 17250-17259.

174. Wang G., Kawakami K., Gick G. Divergent signaling pathways mediate induction of Na,K-ATPase alpha 1 and betal subunit gene transcription by low potassium // Mol. Cell Biochem. 2007. - V. 294. - №1-2. - P. 73-85.

175. Wang X.Q., Yu S.P. Novel regulation of Na, K-ATPase by Src tyrosine kinases in cortical neurons // J. Neurochem. 2005. - V. 93. - №6. - P. 1515-1523.

176. Wasserstrom J.A., Aistrup G. Digitalis: new actions for an old drug // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. -2005. -V. 289. P. H1781-H1793.

177. Xie Z., Kometiani P., Liu J., Li J., Shapiro J.I., Askari A. Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+,K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes // J. Biol. Chem. -1999. V. 274. - №27. - P. 19323-19328.

178. Xie Z. Ouabain interaction with cardiac Na/K-ATPase reveais that the enzyme can act as a pump and a signal transducer // Cell. Moll. Biol. -2001.-V. 47.-P. 383-390.

179. Xie Z. Molecular mechanisms of Na+/K+-ATPase-mediated signal transduction // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P. 497-503.

180. Xie Z. Membrane transporters and signal transduction // Cell. Moll. Biol. -2006.-V. 52.-№8.-P. 1-2.

181. Xie Z., Askari A. Na /K -ATPase as signal transducer // Eur. J. Biochem. -2002. V. 269. - №10. - P. 2434-2439.

182. Xie Z., Cai T. Na+/K+-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function // Molecular interventions 2003. - V. 3. — №3. — P. 157-168.

183. Xu G., Kane D.J., Faller L.D., Farley R.A. The role of loop 6/7 in folding and functional performance of Na,K-ATPase // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - №44. - P. 45594-45602.

184. Yanai M., Tatsumi N., Endo F., Yokouchi Y. Analysis of gene expression patterns in the developing chick liver // Dev. Dyn. 2005. - V. 233. — №3. -P. 1116-1122.

185. Yi J-H., Park S-W., Kapadia R., Vemuganti R. Role of transcription factors in mediating post-ischemic cerebral inflammation and brain damage // Neurochem. Int. 2007. - V. 50. - №7-8. - P. 1014-1027.

186. Yokouchi Y. Establishment of a chick embryo model for analyzing liver development and a search for candidate genes // Dev. Growth. Differ. -2005. V. 47. - №6. - P. 357-366.

187. Yuan Z., Cai Т., Tian J., Ivanov A.V., Giovannucci D.R., Xie Z. Na/K-ATPase tethers phospholipase С and IP3 receptor into a calcium-regulatory complex // Molecular Biology of the Cell. 2005. - V. 16. - P. 4034-4045.

188. Zaffran S., Frasch M. Early signals in cardiac development // Circ. Res. -2002. V.91. - №6. - P. 457-469.

189. Zahler R., Sun W., Ardito Т., Zhang Z.T., Kocsis J.D., Kashgarian M. The a3 isoform protein of the Na+/K+-ATPase is associated with the sites of cardiac and neuromuscular impulse transmission // Circ. Res. 1996. — V. 78.-№5.-P. 870-879.

190. Zaret K.S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis // Nature Reviews Genetics. 2002. - V. 3. - №7. - P. 499512.

191. Zhang S., Malmersjo S., Li J., Ando H., Aizman O., Uhlen P., Mikoshiba K., Aperia A. Distinct role of the N-terminal tail of the Na+/K+-ATPase catalytic subunit as a signal transducer // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. -№31.-P. 21954-21962.

192. Zhang W., Yatskievych T.A., Baker R.K., Antin P.B. Regulation of Hex gene expression and initial stages of avian hepatogenesis by Bmp and Fgf signaling // Dev. Biol. 2004. - V. 268. - №2. - P. 312-326.

193. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук, профессору, заведующему лабораторией физиологии возбудимых мембран Борису Владимировичу Крылову.

194. Искренне признательна кандидату биологических наук Екатерине Валентиновне Лопатиной и кандидату биологических наук Валентине Альбертовне Пеннияйнен за постоянное внимание и неоценимую помощь в работе.

195. Благодарю всех сотрудников лаборатории за поддежку и доброжелательное отношение.