Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе

Межевикина, Людмила Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе"

Межевикина Людмила Михайловна

РОЛЬ ЛЕЙКЕМИЯ ИНГИБИРУЮЩЕГО ФАКТОРА В ПРОЦЕССАХ РОСТА И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И В РАННЕМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 3 ОКТ 2011

Пущино - 2011

4857005

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук институте биофизики клетки РАН (ИБК РАН)

Научный консультант: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Фесенко Евгений Евгеньевич

Официальные доктор биологических наук,

оппоненты: профессор Зшгченко Валерий Петрович

доктор биологических наук,

профессор Гривенников Игорь Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Гаврилюк Борис Карпович

Ведущая организация: Биологический факультет Московского

государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 27 » октября 2011 года в 14°° часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д. 3, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН

Автореферат разослан « 27 » сентября 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сложность функционирования внутриклеточных систем, участвующих в передаче игналов клеточного деления и/или клеточной дифференцировки, интерференция между ими являются одной из центральных проблем клеточной биологии и медицины. Для зучения таких сложных систем необходима разработка новых экспериментальных оделей, позволяющих контролировать последовательные этапы передачи сигнала от lepeoro контакта с индуктором до фенотипического проявления его эффектов, сследование механизмов действия фактора, ингибирующего лейкемию,- LIF (Leukemia nhibitory Factor) на культурах эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и в раннем мбриогенезе мышей позволяет приблизиться к формированию таких моделей и выявить екоторые этапы реализации его сигнальных эффектов. Актуальность таких сследований несомненна как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку IF является одним из ключевых цитокинов семейства интерлейкинов (IL-6), беспечивающих согласованность иммунной, эндокринной и нервной систем в ормальных условиях и в ответ на действие воспалительного и эмоционального стресса, аибольшее распространение LIF получил как фактор, поддерживающий ЭСК животных человека в недифференцированном плюрипотентном состоянии, а также в терапии нкологических заболевании и репродуктивной медицине (Gunawardana et al., 2003; uney et al., 2008; Novatny et al., 2009; Aghajanova, 2010).

В настоящее время известно, что для передачи сигнала LIF необходимо заимодействие лиганда с LIF-рецептором (LIF-R) и трансмембранным переносчиком -ликопротеином gpl30 с последующей активацией внутриклеточных сигнальных аскадов, регулирующих клеточный рост, размножение и дифференцировку разных ипов клеток. В ЭСК мыши наиболее изученными являются JAK-STAT3 Ras-независимый и МАРК Ras-зависимый сигнальные пути (Huyton et al., 2007; Skiniotis et al., 2008 Jeong et al., 2007; Niwa et al., 2009). В одном случае LIF поддерживает стволовые клетки в недифференцированном плюрипотентном состоянии (JAK-STAT3), в другом, напротив, его действие направлено на активацию процессов цитодифференцировки (МАРК-путь). Установлена прямая корреляция между высокой активностью транскрипционного фактора STAT3 и плюрипотентным потенциалом ЭСК мыши in vitro (Niwa et al., 1998; Raz et al., 1999). Известны и другие молекулярно-генетические системы, тесно связанные с поддержанием плюрипотентных свойств ЭСК in vitro. К ним относятся, в частности, ВМР4 (Ying et al., 2003; Qi et al., 2004), Wnt-1 (Ogawa et al., 2006; Wagner et al., 2010) и PI3K сигнальные пути (Jirmanova et al., 2002; Watanabe et al., 2006). Результатом действия LIF на ЭСК мыши является усиление экспрессии транскрипционных факторов плюрипотентности Oct3/4 и Nanog (Hamazaki et al., 2006; Niwa et al., 2009). Возможно также и независимое от LIF прямое влияние 1АК2-сигнала на хроматин с последующей активацией в ЭСК мыши STAT3 и Nanog (Griffiths et al., 2011).

Множественность путей LIF-регуляции стволовых клеток наглядно продемонстрирована в работах на мутантных линиях ЭСК мыши с нокаутами по генам

основных компонентов передачи сигнала /;/-/-, li/r-/-, gpl30-/-, stat3-/- (Ware et al., 1995; Li et al., 1995; Yoshida et al., 1996; Dani et al., 1998). При этом для стволовых клеток, у которых отсутствуют рецепторные белки LIF-R и/или gpl30, как и для клеток дикого типа, требуется присутствие LIF в среде культивирования для поддержания их в плюрипотентном состоянии (Takeda et al., 1997; Dani et al., 1998). Однако в условиях i vivo эмбрионы мышей с дефицитом LIF и основных посредников этого лиганда при действии на клетки (LIF-R, gpl30, STAT3, Oct3/4 и Nanog) могут развиваться в организме приемных матерей, вплоть до рождения (Boiani, Scholer, 2005).

Пока точно не установлено, какие из LIF-сигнальных путей доминируют в процессах поддержания плюрипотентного потенциала ЭСК и эмбриональных клеток в составе зародыша in vitro, а какие in vivo. Остаются до сих пор недостаточно исследованными последствия контакта LIF с его рецепторами и липидным матриксом клеточных мембран. Не выявлены различия в эффектах LIF при экзогенном и/или эндогенном поступлении сигналов в цитоплазму, функциональная полидоменность этого белка при действии на темпы клеточных делений и на генетический аппарат клеток в целом.

Выделение отдельных этапов передачи сигнала LIF и изучение его «веерных» эффектов на разных типах эмбриональных клеток общего происхождения может способствовать развитию адекватных моделей для исследования систем передачи сигнала на клеточном уровне с целью эффективного управления процессами роста и дифференцировки in vitro и в раннем эмбриогенезе. Для выделения разных этапов передачи сигнала LIF нами был разработан комплекс экспериментальных моделей, начиная от контакта LIF с клеточными мембранами и его влияния на цитоплазму и кончая генетическими изменениями клеточного состава в различных популяциях ЭСК мыши с оценками сохранения плюрипотентного потенциала и пролиферативной активности. Разрабатываемые нами подходы в решении проблемы управления процессами развития ЭСК in vitro, основанные на изучении мембранных, внутриклеточных и популяционных эффектов LIF, могут способствовать пониманию механизмов перехода плюрипотентных клеток в дифференцированное состояние и созданию эффективных и безопасных ЭСК-технологий для современной медицины.

Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования состояла в сравнительном изучении молекулярных и клеточных механизмов передачи сигнала LIF в эмбриональных стволовых клетках и в раннем эмбриогенезе мышей для установления роли этой сигнальной системы и характера ее влияния на процессы пролиферации, дифференцировки и поддержания кариотипической стабильности стволовых клеток in vitro.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1. Провести сравнительную оценку биологической активности рекомбинантных белков LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии для выяснения возможных эффектов посттрансляционных модификаций белков при их взаимодействии с бислойными липидными мембранами (БЛМ).

2. Выявить эффективность действия LIF в зависимости от его продуцента (прокариоты - эукариоты) на процессы пролиферации и/или дифференцировки ЭСК мыши, а также оценить характер влияния LIF на активность митохондриапьных дегидрогеназ, прохождение клеточного цикла и выход стволовых клеток в апоптоз.

3. Получить ///-трансфицированные клоны ЭСК мыши с экспрессией белка LIF и установить роль эндогенного LIF в поддержании плюрипотентных свойств, колониеобразования и способности ЭСК дифференцироваться в эмбриоидные тела.

4. Оценить влияние экзогенного и эндогенного LIF на мутационные спектры ЭСК мыши и дать теоретическое обоснование кариотипической эволюции стволовых клеток в системе in vitro.

5. Разработать экспериментальные подходы для индукции миокардиалышй дифференцировки ЭСК мыши, оценить перспективы использования эмбриональных кардиомиоцитов для тестирования кардиоактивных фармакологических препаратов.

6. Выявить чувствительные к действию LIF стадии доимплантационного развития, а также мишени для повышения эффективности выделения из бластоцист первичных колоний эмбриональных клеток - предшественников ЭСК.

Научная новизна работы

1. Впервые проведено всестороннее исследование разных этапов передачи сигнала LIF и сравнительный анализ биологической активности этого регуляторного белка в зависимости от систем экспрессии (эукариоты-прокариоты) при действии на клеточные мембраны, культуры ЭСК и ранние зародыши мыши. Предложены теоретические и экспериментальные обоснования выявленных различий, обусловленные биохимическими модификациями молекул зрелого белка в эукариотических продуцентах. Показано, что такие модификации важны для повышения выживаемости ЭСК мыши in vitro и для индукции процессов миокардиальной дифференцировки.

2. Разработан новый экспериментальный подход для получения из ЭСК мыши клеток с сократительной активностью по типу кардиомиоцитов в условиях пролонгированного культивирования с рекомбинантным белком LIF эукариотического происхождения. Исследованы свойства кардиомиоцитов in vitro и показано, что такие клетки дают положительную реакцию на /?-адренергическую стимуляцию и могут быть использованы как тест-системы для исследования механизмов миокардиальной дифференцировки in vitro и скрининга с высокой пропускной способностью кардиоактивных фармакологических препаратов. Впервые регуляторный белок LIF охарактеризован как индуктор дифференцировки ЭСК мыши в кардиомиоциты.

3. Доказано существование принципиально нового молекулярного механизма передачи информации рекомбинантным белком LIF мыши путем формирования в липидной мембране ионного канала. Канал отличается сложным поведением, зависящим от знака и величины мембранного потенциала, ионной силы раствора и состава липидного бислоя. Получены данные о возможных различиях в работе ионного канала LIF в зависимости от продуцента этого белка про- или эукариотического происхояадепия. Впервые показано, что молекулы LIF могут задействовать для передачи сигнала в клетки

рецепторный механизм и ионные каналы, что объясняет функциональную избыточность этого белка.

4. Установлены основные принципы LIF-регуляции эмбриональных и стволовых клеток мыши in vitro и найдены наиболее чувствительные процессы, отвечающие на действие этого фактора усилением пролиферативной активности за счет изменения соотношения клеток в популяциях по фазам клеточного цикла. Выявлены антиапоптотические свойства рекомбинантного белка LIF, что, по нашему мнению, является необходимым условием для поддержания высокой пролиферативной активности и сохранения плюрипотентного потенциала ЭСК.

5. Получена плазмидная конструкция pcDNA3 со встроенным геном Л/мыши для трансфекции ЭСК мыши, получены ///-трансфицированные клоны с экспрессией белка L1F для повышения стабильности плюрипотентных свойств и изучения LIF как аутокринного регулятора процессов клеточного роста и дифференцировки. Проанализирована возможность использования ///"-трансфицированных клонов в качестве модельных объектов для исследования молекулярных механизмов дифференцировки.

6. Предложена схема «цепной» кариотипической эволюции плюрипотентных линий ЭСК мыши под влиянием экзогенной и эндогенной LIF-регуляции, объясняющая нестабильность хромосомного аппарата этих клеток при разных условиях культивирования in vitro. Впервые описана гетерогенность ЭСК мыши по наличию таких эпигенетических характеристик, как спонтанные G-банды и деспирализация перицентромерных районов метафазных хромосом, а также динамика частоты их возникновения при увеличении возраста культуры. Доказано, что эволюционные процессы в различных популяциях ЭСК мыши связаны с селекцией плюрипотентных клеток по их чувствительности к регуляторному белку LIF.

7. Впервые оценена перспектива использования метода микроинъекции как дополнительного инструмента для получения первичных колоний эмбриональных клеток из бластоцист мышей с разным генотипом, а также показана возможность использования первичных колоний в качестве экспериментальной модели для изучения трофобласт-эндометриальных взаимодействий в системе in vitro и выделения новых линий ЭСК. Выявлено стимулирующее влияние рекомбинантного белка LIF на Са2+-зависимые морфогенетические процессы на стадии формирования бластоцисты.

Научно-практическое значение работы

Разработанные и изученные в данной работе экспериментальные модели перспективны для исследования сложных систем передачи регуляторных сигналов от плазматической мембраны клеток до динамики изменения состава клеточных популяций, молекулярных и клеточных механизмов дифференцировки, изучения функций регуляторных молекул и биологически активных веществ. В частности, разработанная на основе ЭСК тест-система для скрининга кардиоактивных фармакологических препаратов может быть использована как для исследовательских целей, так и иметь практическое значение для идентификации и определения биологической активности новых лекарственных препаратов. Данные о ключевой роли LIF в трофобласт-эндометриальных взаимодействиях и повышении выживаемости доимплантационных зародышей in vitro за

чет усиления пролиферативной активности клеток трофобласта могут представлять нтерес для решения проблем репродукции человека.

Результаты работы могут быть использованы как в научно-исследовательских, так образовательных учреждениях биологического и медицинского профиля для подготовки специалистов к работе с клеточными культурами и ранними зародышами.

Конкурсная поддержка работы

Работа выполнена в ИБК РАН по теме НИОКР «Роль цитокинов и ростовых факторов в регуляции роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей» (№ 0120.0 403628), а также при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований: грант № 97-04-48398 «Трансформация эмбриональных стволовых клеток мыши геном lif с целью изучения механизмов регуляции развития», грант № 00-04-48135 «Роль цитокина LIF в поддержании плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток in vitro и in vivo», грант № 04-04-48904 «Изучение пролиферации, жизнеспособности и направленной дифференцировки в генетически модифицированных линиях ЭСК мыши», грант № 05-04-49521 «Механизмы действия физических факторов на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей», Программы Президиума РАН «Разработка тест-системы для скрининга кардиоактивных препаратов на основе использования стволовых клеток» и грантов Президента РФ ведущих научных школ № НШ - 1842. 2003.4 «Механизмы рецепции химических и физических сигналов», № НШ - 2741. 2008.4, № НШ - 3202. 2010.4 «Рецепция сигналов химической и физической природы».

Личный вклад автора

Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Клеточная биология на пороге XXI века», Санкт-Петербург (1998, 20062007), международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва (2003), междисциплинарном семинаре по проблемам использования стволовых клеток в медицине, Минск (2004), Съездах биофизиков России (1999, 2004), школе по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии», Звенигород (2005), международных конференциях: «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород (2005, 2009); «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи (2007); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино (2009), International Congress «Gene diagnostics, gene therapy, and informational in Biotechnology», Ankara (1995), International Congress of Ecology, Voronezh (1996), Microinjection and Détection of Probes in Cell, Germany (2005), Biophysical chemistiy meets molecular medicine, Portugal (2005), Workshop in Association with the European Commission «Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union -

Russian Federation Perspectives», Moscow (2007), International Schools «Molecular Mechanisms of Regeneration: From Stem Cells to Organ Development, Function and Regeneration», «From Pluripotency to Senescence Molecular Mechanisms of Development, Disease and Ageing», Greece (2007, 2010), International Heinrich F.C. Behr Symposium «Stem Cells and Cancer», Germany (2010), ежегодных школах-конференциях «Биология -наука 21 века», Пущино (2001-2010), международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск (2010).

Материалы опубликованы в печати в виде тезисов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 50 статей, из них 28 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для защиты докторских диссертаций, и 22 статьи в сборниках и журналах, не вошедших в список ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и П. таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментального раздела собственных исследований с дополнительным анализом литературы и обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы.

ОБЪЕКТЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. ЭСК мыши линия R1, ЭСК человека линия HI (Центр исследований стволовых клеток при университете Финберга, Чикаго, США), доимплантационные зародыши мышей линии SHK, NMRI (питомник филиала Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино, Московская обл.) и 129/Sv (НИЛ биомоделей, Светлые Горы, Московская обл.).

Выделение и культивирование зародышей. Для выделения и культивирования зародышей использовали модифицированную среду Виттена (МСВ) с 20 мМ Hepes (Березовская и др., 1986). Культивирование зародышей проводили в 100 мкл МСВ в 4-х луночных эмбриологических чашках (Nunc). Длительность культивирования составляла 96-120 ч. На каждом этапе оценивали изменение морфологии зародышей. Поврежденные и нежизнеспособные зародыши выявляли с помощью витального красителя 0.2 % трипанового синего (Fluka, Швейцария).

Культивирование ЭСК мыши проводили в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 15 % инактивированной фетальной сыворотки коров (Gibco, Sigma), 1 мМ L-глютамина (Sigma) и 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола (Sigma). Дополнительно в среду вносили по 1 мкл/мл комплексного антибиотика-антимикотика (Sigma), заменимые аминокислоты (Gibco), витамины (Gibco), нуклеозиды (ЮОх раствор, содержащий в 100 мл деионизованной воды 80 мг аденозина, 80 мг гуанеозина, 73 мг цитидина и 24 мг тимидина). ЭСК человека культивировали по стандартной методике (Dravid et al., 2006) с добавлением в среду фактора роста фибробластов - 4 нг/мл FGFß (PeproTech.inc.). Клетки культивировали в чашках Петри диаметром 35 и 60 мм (Nunc), предварительно

обработанные 0.1 % раствором желатина (Sigma) или на 48 ч фидере из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши, приготовленном по стандартной методике (Савченкова, 1999). ЭСК вносили в среду из расчета 0.5x10s кл/мл. В среднем длительность культивирования составляла 48-72 ч с ежедневной полной сменой среды. Для поддержания роста и размножения ЭСК мыши колониями использовали рекомбинантные белки LIF мыши и человека в концентрациях 5-20 нг/мл.

Иммуноцитохимический анализ ЭСК проводили с помощью первичных антител на выявление фактора плюрипотентности Nanog (мышиные, Sigma, 1:500), тканеспецифичного белка Nestin (крысиные, «Chemicon», 1:200) и кардиального а-актина (мышиные, Chemicon, 1:200). После фиксации охлажденным ацетоном ЭСК инкубировали в течение ночи при 4°С в растворах первичных антител, затем промывали в PBS и 2 ч инкубировали при комнатной температуре в растворах вторичных козьих антител против Ig мыши, конъюгированных с флуоресцентным красителем FITC (ИМТЭК, 1:300). Препараты заключали под покровное стекло в глицерин (Sigma) и анализировали под инвертированным микроскопом Axiovert 40CFL (Zeiss) при длине волны 488 нм.

Выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ). Колонии ЭСК фиксировали охлажденным ацетоном, инкубировали 1 ч в С02-инкубаторе при 37сС с а-нафтол-А8-В1-фосфатом (ICN) и азокрасителем ВВ синим прочным (ICN) по методу Лойда (1984). Цитохимические реагенты готовили перед началом фиксации колоний из расчета 5 мг а-нафтол-А8-В1-фосфата, 0.25 мл DMSO, 25 мл деионизованной воды, 25 мл Трис-НС1-буфера (рН 8.5), куда вносили 25 мг ВВ синего прочного. Раствор перед использованием фильтровали через нитроцеллулозные фильтры .

Определение пролиферагивной и метаболической активности ЭСК проводили путем прямого подсчета клеток в камере Горяева и методом МТТ, основанным на способности митохондриальных дегидрогеназ редуцировать жёлтую водорастворимую соль бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Оптическую плотность определяли при X 600 нм (область поглощения МТТ-формазана) на мультисканере (Labsystems Multiskati Plus). Результаты сопоставляли с оптической плотностью клеток в контроле. Достоверными считали различия по оптической плотности, составляющие более 20 %. Дыхание ЭСК определяли полярографическим методом по убыли кислорода из клеточной суспензии через 30 мин после перевода клеток в PBS. Внутриклеточное содержание АТФ измеряли на хемилюминометре (TD-20/20 Turner Biosystems) по интенсивности свечения АТФ-зависимой люцеферин-люциферазной реакции в 0.1 М трис-ацетатном буфере (рН 7.8).

Определение вязкости мембранных липидов проводили с помощью незаряженного липофильного флуоресцентного зонда ДФГТ (1.6-дифенил-1.3-гексатриен), коэффициент поляризации которого (Рдфгт) коррелирует с микровязкостью липидного бислоя. Перед анализом ЭСК отмывали от питательной среды путем центрифугирования и переносили в концентрации 1-1.5х106 кл/мл в солевой раствор PBS. Вязкость мембранных липидов тестировали по степени поляризации

флуоресценции зонда ДФГТ, локализующегося в центре липидного слоя. Зонд вносили в клеточную суспензию в концентрации 2 мкМ, инкубировали (90 мин, 37°С), флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Solar СМ 2203 (РБ) при ХВ03б 357 нм, Хрсг 430 нм.

Распределение клеток по клеточному циклу и апоптоз регистрировали по каналу F1-2 в красной области спектра на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson). В качестве источника возбуждения служил аргон-неоновый лазер мощностью 15 мВт с длинной волны 488 нм. Клетки фиксировали в 0.5 мл ледяного этилового спирта (1 ч), затем отмывали в PBS, центрифугировали и к осадку добавляли 25 мкг/мл пропидия иодида, 1 мкг/мл РНКазы, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, после чего выполняли измерения. Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest и ModFit2. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами вариационной статистики с использованием компьютерных программ Sigma Plot и Microsoft Office Excel.

Исследование вне- и внутриклеточного кальция и фосфоинозитольной сигнальной системы (PI). В этих экспериментах в среду добавляли буферные растворы Ca2+-EGTA (Sigma) в концентрациях 10'5 и 10"7 М, приготовленные по программе Sliders. PI сигнальную систему исследовали с помощью блокаторов и активаторов фосфолипазы С (PLC) и протеинкиназы С (РКС). Для блокирования PLC использовали 0.5, I, 5 и 10 мкМ U73122 (Biomol), для подавления активности РКС - 0.5, 5 и 10 мкМ BisII (Sigma). В качестве активатора РКС использовали форболовый эфир (Fluka) в концентрациях 1, 10 и 50 нМ. Для измерения внутриклеточного кальция колонии ЭСК экспонировали 40 мин в 5 мкМ флуоресцентного зонда Fura-2 (Molecular Probes), после чего отмывали 15 мин в растворе Хенкса и исследовали под инвертированным микроскопом Zeiss LSM510. Максимум возбуждения флуоресценции Fura-2 при длине волны 340-380 нм, регистрация - при 510 нм. Съемку проводили в режиме непрерывного сканирования. Для зародышей использовали флуоресцентный зонд Fluo-ЗАМ (Biotium) в концентрации 5 мкМ (60 мин, 37°С). После удаления зонда зародыши переносили в 10 мкл МСВ на предметные стекла и регистрировали флуоресценцию под инвертированным микроскопом Axiovert 200М (Zeiss) при длине волны 506 нм. Добавку 1 мкМ ионофора А23187 (Sigma) вносили во время непродолжительной паузы в ходе сканирования. Концентрацию кальция рассчитывали по формуле: [Са2+] = Kd (F-Fmin) / (Fmax-F), где Kd - константа диссоциации Fluo-3 для Са2+ (316 нМ), F - интенсивность флуоресценции, Fmin -флуоресценция темного фона, Fmax - максимальная флуоресценция полученная калибровкой ионофором А23187. Обработку изображений проводили в программе LSM 5 Image Browser, графические построения - с помощью программы Origin 8.0.

Трансфекция ЭСК. Для трансфекции использовали плазмидный вектор pcDNA3 со встроенным геном lif мыши и бактериальным геном neo+ для повышения резистентности к селективному антибиотику генетицину (G418). Кодирующая последовательность гена lif была выделена из лимфоцитов мыши с помощью полимеразной цепной реакции в варианте с обратной транскрипцией (RT-PCR) и клонирована в pcDNA3 по сайтам рестрикции BamHI и Hinds III. Клетки

трансфицировали с помощью электропорации (СУМ-4, ИМГ РАН, Москва) в режиме 960 мкФ, 400 В, 1.5 мсек в камере объемом 55 мкл, затем переносили в среду для культивирования с селективным антибиотиком G418. Уровень экспрессии гена li/в neo' клонах определяли методом RT-PCR с применением 20-членного прямого и обратного праймеров. Праймеры подобрали к участку гена life 2691 по 3577 п.о. включительно, содержащему интрон с 2722 по 3280 п.о., с целью отделить амплификацию, идущую по примеси ДНК от амплификации по кДНК. В качестве маркера использовали метчик, содержащий 12 фрагментов от 170 п.о. до 940 п.о., в котором все последующие фрагменты увеличивались на 70 п.о. Идентичность нуклеотидной последовательности рекомбинантной ДНК pcDNA3-/;/K последовательности гена ///мыши оценивали путем секвенирования (Applied Biosystems). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили по программе GENEPRO (Riverside Scientific Enterprises, 1988) и Omiga (Oxford Molecular Ltd., 1999).

Получение эукариотического белка LIF(eu). Клетки линии Cos-1 высевали из расчета 5х104 на мл питательной среды и культивировали 24 ч до 70 % монослоя, после чего трансфицировали 1 мкг/мл ДНК pcDNA3-/// с помощью липофектамина 2000 (Invitrogene) по методу (http://www.invitrogen.com). Эффективность трансфекции контролировали pVAXl//acZn pEGFP-Cl (Invitrogen), экспрессирующих гены lacZngfp, кодирующие бактериальную /?-галактозидазу и флуоресцентный зеленый белок GFP соответственно. Селекцию ///-трансфицированных клонов проводили в течение 2 недель в с 300 мкг/мл G418 (Sigma). Позитивные клоны Cos-1 анализировали с помощью RT-PCR. Продукты амплификации LIF кДНК выявляли электрофоретическим методом в 1 % агарозном геле. Рекомбинантный белок определяли с помощью моноклональных антител к LIF мыши (Chemicon, 1:1000) и вторичных козьих антител, меченых FITC (ИМТЭК). Препараты анализировали под микроскопом Axiovert40 CFL (Zeiss).

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили на иммуноферментных планшетах (Fluka) с использованием антител к LIF мыши (Chemicon) в разведениях 1:200, 1:600, 1:1800 и раствора козьих антимышиных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (ИМТЭК) в разведении 1:1500. После 1 ч инкубации при 37°С и удаления коньюгата препараты обрабатывали 0.5 мг/мл ортофенилендиамином и 0.05 % перекисью водорода (pH 5.0) до появления окраски. Реакцию останавливали 1 М H2SO4, после чего оценивали результаты по оптической плотности при длине волны 492 нм (LabSystems). Концентрацию рекомбинантного белка LIF в клеточном лизате и в среде культивирования рассчитывали по калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации коммерческого препарата LIF мыши (ICN).

Микроинъекция (МИ). Метод использовали для введения в полость бластоцисты рекомбинантного белка LIF в концентрациях 0.65, 0.33, 0.15 и 0.07 пг/нл (опыт). Контрольной группе бластоцист вводили 7-10 нл МСВ. Процедуру проводили на микроманипуляторе TransferMan NK (Eppendorf) с использованием инъекционных капилляров TransferTip-XR и VacuTip (Eppendorf) под контролем инвертированного микроскопа IX-70 (Olympus), оснащенного объективами в модификации Хоффмана.

Электрофизиологические исследования проводили на бислойных липидных мембранах (БЛМ) из фоефатидилхолина сои (Sigma) и холестерина (Sigma), растворенных в гептане в концентрации 20 мг/мл. Проводимость БЛМ по постоянному току регистрировали с помощью электрометрического операционного усилителя ОРА2111В в режиме фиксации потенциала с программным обеспечением БЛМ, разработанным А.Я. Зильберштейном. Измерения проводили в растворах КС1 различной ионной силы при рН 7.2. В качестве буфера использовали Tris-Hepes (Sigma).

Дифференцировка ЭСК в кардиомиоциты. Идентификацию кардиомиоцитов в колониях ЭСК проводили в условиях пролонгированного культивирования с белком LlF(eu) с помощью моноклональных антител к кардиальному а-актину (Chemicon, 1:200) и коньюгата, меченого FITC (ИМТЭК). Наличие в дифференцированных ЭСК /?-адренорецепторов выявляли после обработки колоний ЭСК кардиоактивным препаратом изопротеринолом (ИП). Ответную реакцию дифференцированных ЭСК на действие ИП оценивали по изменению частоты и амплитуды сокращений колоний с помощью цифровой видеосистемы и последующей компьютерной обработкой результатов в программе Origin и AVIedit.

Цитогенетический анализ ЭСК. Суспензию клеток 40 мин инкубировали в 0.54 % КС1 при 37°С, фиксировали смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), трижды меняя фиксирующий раствор, раскапывали на холодные мокрые стекла, высушивали и окрашивали по Гимза (Merck). Окрашенные препараты анализировали под микроскопом (Zeiss, увеличение объектива ЮООх). Оценивали следующие характеристики: наличие анеуплоидии (А) и полиплоидии (П), частоту встречаемости метафаз с хромосомными аберрациями (хромосомные, хроматидные разрывы, фрагменты, кольцевые хромосомы - ХА), межхромосомные ассоциации по типу робертсоновских транслокаций (РТ) и с асинхронностью расщепления центромерных районов хроматид (АРЦХ). Частоту встречаемости метафаз с ХА, РТ и АРЦХ рассчитывали относительно всей выборки просмотренных метафаз. Количество двуядерных клеток, клеток с микроядрами и апоптозных ядер подсчитывали на тех же препаратах в клетках с сохраненной цитоплазмой. Митотический индекс и частоту встречаемости перечисленных аномалий рассчитывали на 1000 клеток. Долю анеуплоидных клеток рассчитывался в двух вариантах: клетки с утратой или приобретением хромосом, больше чем одна (А1) и клетки с числом хромосом по типу 2n+l (А2). В случае проявления спонтанных G-бандов составляли кариограммы с использованием техники типирования индивидуальных хромосом в соответствие с общепринятым методом (Covvell, 1984). Статистическую обработку результатов проводили с помощью /-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Механизмы действия рекомбинантного LIF на клеточные мембраны Рекомбинантные белки LIF мыши и человека из прокариотических систем экспрессии имеют молекулярную массу порядка 20 kDa, что соответствует теоретическим расчетам нуклеотидной последовательности кДНК LIF (Gearing et al.,

1989; Hinds et al., 1998; Tomala et al., 2010). В эукариотических продуцентах LIF синтезируется с более высокими значениями молекулярной массы 32-67 kDa в результате гликозилирования молекул на посттрансляционном уровне (Hilton, 1992; Robinson et al., 1995; Hilton, Gough, 1998; Haines et al., 2000; Heinrich et al., 2003). Молекулы рекомбинантного LIF из дрожжевых экспрессионных систем гипергликозилированы и достигают 250-350 kDa (Williams et al., 1988). Биохимические различия между молекулами LIF из разных систем экспрессии не затрагивают первичной структуры и не влияют на эффективность связывания лиганда с рецепторами и, следовательно, на передачу сигнала в клетки (Moreau et al., 1988; Williams et al., 1988; Robinson et al., 1995; Hilton, Gough, 1998; Hirano et al., 2000). И в то же время известно, что в клетках животных и человека LIF синтезируется в трех изоформах, различающихся между собой не только по уровню гликозилирования или отсутствию такового, но и по биологической активности (Voyle et al., 1999; Haines et al., 1999, 2000). Например, усеченная (truncated) t-изоформа LIF обладает внутриклеточной активностью в пределах ядра и цитоплазмы и не взаимодействует с рецепторными белками LIF (Haines et al., 1999).

Возможность LIF-регуляции без участия белков рецепторного комплекса (LIF-R и gpl30) была подтверждена в наших исследованиях на бислойных липидных мембранах (Серышева и др., 2002; Межевикина и др., 2003; Борисова и др., 2009, 2010). В этих работах мы попытались ответить на вопросы: 1) как влияет рекомбинантный белок LIF мыши на липидный бислой и 2) есть ли различия в механизмах действия в зависимости от источника происхождения (прокариот -эукариот).

Проведенный нами сравнительный анализ белков LIF мыши из разных систем экспрессии однозначно свидетельствует об увеличении электропроводимости искусственной мембраны (рис. 1-3).

Рис. 1. Скачки тока (А) при действии рекомбинантного белка LIF(eu) в концентрации 0.65 нг/мл в 0.1М KCl при 100 мВ (цис) и интегральные вольтамперные характеристики при той же концентрации LIF(eu) в растворах 0.1, 0.2 и 1 М KCl, (Б). Липид -фосфатидилхолин 20 мг/мл.

-0.2 mkci -100 -50 о 50 100 -ЮМКС11 Напряжение, мВ

Причем действующие концентрации LIF были на порядок ниже (0.65 и 2.0 нг/мл), чем при работе с клеточными культурами in vitro (10-20 нг/мл). Более того, в этих исследованиях были выявлены различия в механизмах действия LIF на липидные мембраны в зависимости от продуцента. Так, эукариотический белок LIF(eu), выделенный из /;/-трансфицированных клеток линии Cos-1 (Петрова и др., 2006а),

встраивался в липидный матрикс с образованием ионного канала (рис. 1, 2). Рекомбинантные белки из прокариотических систем экспрессии ЫР(рго) такой способностью не обладали (рис. 3).

В качестве примера на рис. 3 представлены фрагменты записи тока (А) и вольт-амперная характеристика мембраны (Б) в присутствии 2.0 нг/мл 1ЛР мыши (1СЫ). Видно, что при напряжении 100 мВ ток через липидную мембрану меняется хаотично и не вызывает стабильных уровней проводимости в миллисекундном диапазоне измерений, но вольт-амперная характеристика имеет 8-образный вид (рис. 3 Б), как и при действии рекомбинантного белка ПР(еи) (рис. 1 Б).

20 -]

10 -

< 0 -

о ь- -10 -

-20 -

-30 -

-40 -

20 с

100

о Ь

-50

-100

< 6 о/>

с 4 У

i¿

о 2 j

о/ ■ -2

-4

-6

-8

о ■ -10

-100 -50 0 50 100

Напряжение, мВ

Рис. 2. Флуктуации тока при Рис. 3. Флуктуации тока (А) и вольт-амперная

действии 19.5 нг/мл LIF(eu) в характеристика мембраны (Б) га

растворе 1М КС1, 40 мМ Tris- фосфатидилхолина (20 мг/мл) в присутствии 2

Hepes, рН 7.2 (уис). Напряжение "г/мл Рекомбинантного белка LIF(pro)^

ШП тп D я Окружающий раствор -1 М КС1, 10 мМ СаСЬ 40

100 и -100 мВ, мембрана из тГ ,„„ „

• мм Tris-Hepes, рН 7.2, напряжение 100 и -100 мВ. фосфатидилхолина (20 мг/мл).

Отличительной особенностью LIF(eu) было нарастание тока скачками разной величины после добавления 0.65 нг/мл белка в раствор электролита, что характерно для прохождения тока через ионные каналы (рис. 1 А). Величина скачков зависит от ионной силы окружающего раствора и, чем меньше концентрация соли, тем больше ток, проходящий через одну токопроводящую единицу. Так, в 0.1 М КС1 при 100 мВ подаваемого напряжения средняя величина тока составляла 90±20 пА, в 0.2 М КС1 -22±6 пА, в 1 М КС1 - 7±1 пА. Средняя проводимость одиночного канала зависит также и от знака потенциала - при отрицательном значении средняя амплитуда одиночных скачков тока была выше (в 0.1 М КС1 - 175±19 пА и 1 М КС1 - 16±1 пА), чем при положительном (90 и 7 пА соответственно).

Необходимо отметить, что при использовании про- и эукариотического LIF мыши в диапазоне концентраций 0.65 - 19.5 нг/мл невозможно было достигнуть стационарной проводимости или же относительно невысокой скорости ее нарастания, поэтому мы оценивали характер влияния LIF на липидный бислой по качественным характеристикам изменения интегрального тока через мембрану. Приведенные на рис. 1Б вольт-амперные характеристики сняты в одной области величин интегрального тока в присутствии 0.65 нг/мл рекомбинантного белка LIF(eu). Они свидетельствуют о том, что в растворах 0.1 М

КС1 зависимость тока от напряжения носит линейный характер, в 0.2 М КС1 наблюдается гиперфункция в условиях положительного потенциала с транс-стороны, и суммарный ток при 100 мВ почти в 2 раза больше, чем при таком же потенциале обратного знака. В условиях 1 М КС1 интегральная зависимость тока имеет обратный характер, но и в этом случае проводимость одного и того же канала оставалась выше при отрицательном потенциале (рис. 2).

В экспериментах с использованием эукариотического белка LIF(eu) было установлено, что добавление 10 мМ СаС12 в окружающий раствор не влияет на интегральные характеристики тока и работу одиночных ионных каналов. Величина одиночных скачков оставалась в растворах 1 М КС1 с 10 мМ СаС12 практически без изменений (при 100 мВ - 11±5 пА, при -100 мВ -20±1 пА). В то же время, изменение состава липидной мембраны путем добавления холестерина в раствор липида в соотношении 1:20 оказывало существенное влияние на каналоформирующую способность эукариотического белка LIF мыши. При наличии 5 % холестерина в липиде регистрировали хаотичные изменения тока и устойчивых уровней проводимости не наблюдали, хотя интегральная зависимость тока от напряжения сохраняла прежний S-образный вид. Кроме того, в присутствии холестерина повышалась на порядок (6.5 нг/мл) действующая концентрация рекомбинантного белка LIF(eu) по сравнению с действием этого же фактора на мембраны, не содержащие холестерин (0.65 нг/мл, рис. 1 А).

Из приведенных данных следует, что рекомбинантные белки LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии обладают выраженными мембранотропными свойствами. Они взаимодействуют с липидным матриксом, в результате чего изменяется проводимость липидного бислоя (рис. 1-3). Одним из возможных механизмов действия рекомбинантных молекул LIF на клеточные мембраны является образование ионных каналов (рис. 1, 2). Каналы LIF отличаются сложным поведением, зависящим от знака и величины потенциала, ионной силы раствора и состава липидного бислоя. Исходя из этих данных, можно сделать заключение о том, что передача сигнала LIF в стволовые и эмбриональные клетки может осуществляться не только через рецепторы LIF-R и gpl30, но и путем образования ионных каналов, что может вносить серьезные коррективы в процессы их жизнеобеспечения и функционирования в системе in vitro.

Морфофункциональные характеристики ЭСК мыши in vitro

Сравнительный анализ биологической активности рекомбинантного L1F мыши из разных систем экспрессии показал, что оба белка в концентрации 10 нг/мл стимулируют пролиферативную активность ЭСК мыши линии R1 в культуре in vitro (табл. 1, рис. 4). Различия между рекомбинантными белками выявлялись только при увеличении длительности культивирования стволовых клеток до 72 ч (табл. 1).

Рекомбинантный LIF(eu) эффективнее влиял на скорость роста и выживаемость стволовых клеток в колониях по сравнению с бактериальным белком LIF(pro) (Р<0.05). В то же время на плюрипотентный потенциал ЭСК мыши белки из разных систем экспрессии действовали с одинаковой эффективностью (рис. 5). Они поддерживали

отношение дифференцированных и недифференцированных плюрипотентных колоний ЭСК примерно на одном уровне. При их использовании в концентрации 10 нг/мл в течение 48-72 ч культивирования формировалось более 70 % колоний без видимых признаков спонтанной морфологической дифференцировки и с высокой активностью ЭЩФ (рис. 5 а-е).

Таблица 1

Влияние рекомбинантного 1ЛР на пролиферативную активность эмбриональных

Среда культивирования Количество клеток (х105) Скорость роста Время удвоения популяции ЭСК (ч)

48 ч 72 ч

LIF(eu) 2.0 ±0.52 3.4 ±0.85* 4.0 ± 0.31 13.6 ±2.4

LIF(pro) 2.05 ±0.40 2.1 ±0.43 3.7 ±0.25 13.2 ± 2.7

Без LIF 1.1 ±0.20 1.2 ±0.80 2.4 ±0.17 22.2 ±6.3"

Примечание. Рекомбинантные белки ЬШ добавляли в среду в конечной концентрации 10 нг/мл. -достоверность различий в зависимости от длительности культивирования с разными белками (Р<0.05), '- достоверность различий по времени удвоения клеточных популяций в средах с ЫИ и без добавления Ш (Р<0.01).

Отсутствие рекомбинантного ЬИ7 в среде приводило к снижению пролиферативной активности стволовых клеток линии Я1 (табл. 1). ЭСК быстро теряли способность размножаться колониями, увеличивалось время их удвоения с 13 до 22 ч. Через 72 ч культивирования в средах без Ы¥ обнаруживались в большом количестве колонии с морфологическими признаками дифференцировки, а также ЭТ (рис. 5 д). К этому времени значительная часть стволовых клеток теряла способность к адгезии, переходила в суспензию. В культуре оставалось не более 30 % недифференцированных колоний (рис. 4).

80,%

Рис, 4. Процентное соотношение дифференцированных (1) и недифференцированных (2) колоний ЭСК мыши линии II1 при развитии на 0.1 % желатине в среде с добавлением 10 нг/мл рекомбинантного ЫР из разных систем экспрессии.

48ч 72ч 48ч LIF(pro) -LIF

Такая же высокая зависимость ЭСК линии R1 от рекомбинантного LIF выявлялась при культивировании на фидере ПЭФ, хотя известно, что фибробласты сами продуцируют LIF и насыщают культуральную среду этим фактором (Evans, Kaufman, 1983; Williams et al., 1988). Судя по нашим наблюдениям, фидерный слой ПЭФ больше необходим для адгезии ЭСК и формирования колоний, а не как дополнительный источник LIF. По форме и размерам колонии ЭСК на фидере ПЭФ (рис. 5 а) отличаются от колоний, выращенных на желатине (рис. 5 в). При непосредственном контакте с клетками фидера стволовые клетки располагаются по направлению роста фибробластов и их колонии имеют слегка вытянутую неправильную форму с четкими очертаниями по периферии. Такой же характер роста колоний выявляется при культивировании ЭСК человека на фидере ПЭФ мыши (Choo et al., 2004 ). Решающую роль во взаимодействиях

IЭСК с фибробластами играет ростовой фактор фибробластов - FGF, активирующий как пролиферацию, так и миграцию клеток in vitro (Reubinoff et al., 2000; Uliman et al., 2007).

Рис. 5. Морфология колоний эмбриональных стволовых клеток линии II1 в среде с рекомбинантным ир(рго) через 48 ч культивирования на фидере ПЭФ (а) и 0.1% желатине (б). Выявление плюрипотентных колоний по активности ЭЩФ (в), эмбриоидное тело через 72 ч культивирования в среде без

Судя по нашим данным, этот фактор необходим стволовым клеткам, прежде всего, | для активации роста и размножения колониями in vitro (табл. 1, рис. 4, рис. 5 а-в). Независимо от условий культивирования ЭСК мыши (желатина или фидер ПЭФ мыши) j рекомбинантный LIF мыши из разных систем экспрессии стимулирует процессы клеточной пролиферации, действуя на стволовые клетки как митогенный активатор. При его отсутствии в среде культивирования пролиферативная активность стволовых клеток ' мыши снижается, значительно увеличивается время их удвоения (табл. 1). LIF мыши из разных продуцентов (прокариоты-эукариоты) способствует монослойному росту ЭСК в виде колоний в дозовой зависимости: при использовании LIF в концентрации 5.0 нг/мл формируется около 40 % недифференцированных плюрипотентных колоний, в 1 концентрациях 10 и 20 нг/мл - 70 и 80 % соответственно. При увеличении длительности культивирования более высокую активность при действии на ЭСК мыши обнаруживает I эукариотический белок LIF(eu).

Апоптоз и клеточные циклы

В условиях, когда затруднена спонтанная дифференцировка ЭСК мыши (присутствие LIF в среде культивирования), соотношение двух форм ответа клеток «пролиферация/апоптоз» может служить важным параметром их реакции на действие ростовых факторов и, в целом, отражать потенциал популяции к самообновлению. Большинство из известных в настоящее время ростовых факторов и цитокинов (свыше 40 соединений) являются блокаторами апоптоза (Робинсон, Труфакин, 1999). В этой связи нам представлялось интересным исследовать влияние LIF на процессы апоптоза в ЭСК мыши. В экспериментах использовали в основном рекомбинантный белок LIF мыши из бактериальных систем экспрессии (Pepro.Tech., Sigma).

Роль LIF в процессах клеточной адгезии мало исследована.

" ' ' '7 15 t; Щ0 Г" А - Я ■ г , - Щг ~ ——

.ьШ'Ш. IHI :: 100 мкм '

Было установлено, что высокая пролиферативная активность стволовых клеток линии R1 в присутствии рекомбинантного LIF коррелирует с низкими показателями их гибели по механизмам апоптоза и некроза. После 18 ч инкубирования с 5.0 и 10.0 нг/мл LIF доля апоптозных клеток в популяциях R1 была достоверно ниже (1.5 ±0.11 и 1.9 ± 0.15 % соответственно), чем в среде без LIF (3.7 ± 0.10 %). Причем в концентрации 5.0 нг/мл рекомбинантный LIF мыши эффективнее блокировал апоптоз в стволовых клетках, чем при его использовании в концентрации 10 нг/мл. По-видимому, это обусловлено тем, что апоптоз представляет собой активную форму реакции клеток не только на неблагоприятные воздействия, такие как дефицит факторов роста в среде (Vaux, Korsmeyer, 1999; Робинсон, Труфакин, 1999), но и на физиологические концентрации, активирующие рост клеток. В случае с ЭСК мыши такой концентрацией является 10 нг/мл LIF (табл. 1, рис. 5).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в активно пролиферирующих популяциях ЭСК мыши апоптоз не является инструментом для выбраковки дефектных клеток, поскольку селекция этих клеток in vitro осуществляется в средах с LIF по пролиферативной активности. После 18 ч инкубирования без LIF в популяциях R1 обнаруживалось не более 4.0 % апоптозных клеток и около 9.0 % клеток повреждалось в результате некроза. В присутствии 5 и 10 нг/мл LIF эти показатели снижались в среднем в 2-3 раза. Из этого следует, что пролиферативное действие LIF реализуется in vitro путем подавления в ЭСК мыши процессов апоптоза и направлено на защиту плазматических мембран от повреждающих факторов среды. Наиболее вероятным посредником в пролиферативном и антиапоптотическом действии LIF на ЭСК мыши является транскрипционный фактор STAT3, индуцируемая экспрессия которого напрямую связана с усилением клеточной пролиферации и повышением устойчивости стволовых клеток к апоптозу (Bromberg, 1999; Raz et al., 1999; Schuringa et al., 2002).

Сочетанное пролиферативное и антиапоптотическое действие рекомбинантного белка LIF мыши на ЭСК мыши согласуется со стимулирующим влиянием этого фактора на клеточные циклы (рис. 7). Представленные гистограммы: G1/0 (содержание ДНК 2С), S (от 2 до 4С) и G2-M (4С) свидетельствуют о том, что в активно пролиферирующих популяциях R1 распределение клеток по фазам клеточного цикла является важной характеристикой ответной реакции на действие LIF.

В этих экспериментах было показано, что после 18 ч инкубирования как с 5.0 нг/мл, так и с 10 нг/мл рекомбинантного белка LIF в популяциях R1 снижается доля стволовых клеток в синтетической S-фазе соответственно на 10 и 15 % по сравнению с контролем (рис.6). В присутствии LIF стволовые клетки мыши быстрее проходят S фазу и митоз, увеличивается скорость движения по клеточному циклу в зависимости от концентрации LIF в среде культивирования. При использовании LIF в концентрации 10 нг/мл в популяциях R1 наблюдается увеличение доли стволовых клеток в подготовительной к репликации фазе G1 (рис. 6).

80 60 40 20

rfn

ríi

IZZl -1

Рис. 6. Влияние белка ЫР(рго) на распределение ЭСК мыши линии Ш по фазам клеточного цикла через 18 ч культивирования на фидере ПЭФ. 1 -контроль (без 1ЛР), 2 -5 нг/мл ЫИ, 3-10 нг/мл

G2+M

Следует отметить, что в ЭСК и клетках эпибласта мыши фаза G1 слишком короткая и механизмы трансдукции пролиферативного ответа на действие LIF могут быть не столь многочисленными, как в соматических клетках. Большую часть своего времени ЭСК проводят в S фазе (Smith, 2001а). Поскольку в присутствии LIF возможно изменение соотношения ЭСК по фазам клеточного цикла в результате задержки клеток на одной из стадий (рис. 6), то увеличение доли стволовых клеток в синтетической S фазе не всегда будет отражать пролиферативную активность популяции в целом. В связи с этим пролиферативный потенциал ЭСК мыши линии R1 в средах с разным содержанием LIF мы оценивали по отношению в популяциях доли клеток в S фазе к G2+M как S/(G2+M).

Было установлено, что в средах без LIF(pro) большинство стволовых клеток R1 (более 70 %) находятся в S фазе и отношение S/(G2+M), отражающее их пролиферативный потенциал, равно 10.9. Под влиянием 5 нг/мл рекомбинантного белка LIF данный параметр снижался до 4.7, при использовании 10 нг/мл - только до 8.3. Подобная картина обусловлена тем, что в присутствии 10 нг/мл LIF только часть плюрипотентных клеток быстрее проходит S фазу и около 10-15% клеток задерживается в G1/0. Тогда как в небольшой концентрации (5 нг/мл) рекомбинантный белок LIF влияет на выход ЭСК мыши из S-фазы, увеличивая тем самым пролиферативный индекс популяции и долю стволовых клеток с содержанием ДНК > 2С.

Таким образом, полученные нами данные однозначно свидетельствуют о том, что основная функция LIF - сохранение плюрипотентного потенциала ЭСК мыши in vitro, реализуется путем ингибирования клеточной гибели по механизму апоптоза, снижения отношения клеток S/(G2+M) и времени удвоения популяции. Существует тесная связь между стимулирующим действием этого фактора на клеточные циклы и сигнальными путями, обеспечивающими рост и размножение стволовых клеток мыши в культуре. А это означает, что система LIF-регуляции, настроенная на постоянную пролиферацию, не только ограничивает спонтанную дифференцировку стволовых клеток, но и контролирует плюрипотентный статус стволовых клеток in vitro.

Влияние концентрации внеклеточного кальция на пролиферативную

метаболическую активность ЭСК мыши и человека

Сочетанное действие рекомбинантного LIF мыши на пролиферацию, клеточные циклы и апоптоз в ЭСК мыши (табл. 1, рис. 4, 6) подтверждает широко обсуждаемый в источниках литературы факт перекрестных эффектов между сигнальными путями LIF

(Вигс1оп е1 а1., 1999а, 2002). В наших исследованиях показано, что посредниками в перекрывающихся сигнальных каскадах ЫР, ответственных за клеточную пролиферацию ЭСК мыши, являются ионы кальция (Осипенко и др., 2007; Оз1репко е1 а!., 2007). Кальций как вторичный мессенджер участвует во многих процессах, связанных с поддержанием гомеостаза, митотических делений и пролиферативной активности стволовых клеток. Изменение концентрации кальция может приводить как к подавлению, так и к активации клеточного роста (Вегпс^, 1995, Кариг й а1., 2007; ОарИат, 2007).

В связи с этим мы сравнили, как меняется характер роста и пролиферативная | активность ПР-зависимых ЭСК мыши линии Я1 и ПР-независимых ЭСК человека линии Н1 от содержания свободного кальция в среде культивирования (рис. 7, 8). Было показано, что культивирование стволовых клеток мыши в средах, не содержащих свободный кальций после добавления хелатирующего агента 3 мМ ЕСТА, приводит к резкому снижению пролиферативной (рис. 7 А, кривая 5) и метаболической активности митохондриальных дегидрогеназ (рис. 8 Б, тест МТТ).

Рис. 7. Пролиферативная (А) и метаболическая (Б) активность ЭСК мыши в зависимости от концентрации кальция в среде культивирования и при повышенной внутриклеточной

концентрации Са1+ (ионофор). 1-ионофор А23187 (0.1мкМ); 2 - контроль; 3 - 10"5М Са2+; 4 - 1(Г7М Са2+; 5 - 3 мМ ЕСТА (п=8;Р< 0.05).

Время, ч

В бескальциевых средах с 3 мМ EGTA увеличивалось время удвоения популяций R1 до 18.1±0.4 ч по сравнению с 13.6±2.4 ч в контроле (табл. 1). Более того, клетки линии R1 быстро теряли способность к адгезии и не формировали монослойные колонии, а также не объединялись в сложные по морфологии многоклеточные агрегаты наподобие ЭТ, что свидетельствовало о снижении плюрипотентного потенциала (Robertson et al., 1983, Robertson, 1986, 1987). Гибель ЭСК мыши в бескальциевых средах через 72 ч инкубирования достигала 76.5±2.3 % (Осипенко и др., 2007).

В физиологической концентрации кальций необходим для поддержания

общего пула депонированного кальция и пролиферативной активности клеток животных и человека in vitro (Beridgge, 1995, 2007). В отличие от CK взрослого организма, LIF-зависимые клетки линии R1 сохраняли способность к пролиферации и росту в виде колоний при низких значениях внеклеточного кальция 10"5 и 10"7М (рис. 7 А). Другой характерной особенностью ЭСК мыши было отсутствие строгой корреляции между высокой пролиферативной активностью, особенно в первые сутки их культивирования, и активностью митохондриальных дегидрогеназ (рис. 7 Б). ЭСК мыши обнаруживали независимость прохождения клеточных циклов от содержания свободного кальция в

О 20 40 60 80

Са2+-ЕСТА буферной среде в пределах концентраций 10"5 - 10"3 М (рис. 7 А, кривые 2 и 3). Культивирование этих клеток в средах с постоянно низким содержанием внеклеточного кальция 10"5М не приводило к какому-либо заметному снижению функциональной активности в течение 72 ч по сравнению с контролем. В средах с 1(ГМ Са2+-ЕСТА клетки линии Ш не только активно пролиферировали, но и формировали колонии без видимых признаков спонтанной дифференцировки и образования ЭТ. Снижение скорости их роста и размножения колониями наблюдалось только при концентрации свободного кальция 10"7 М (рис. 7 А, кривая 4). При этом активность митохондриальных дегидрогеназ оставалась практически без изменений на достаточно высоком и стабильном уровне, как в контроле (рис. 7 Б).

Такая ситуация возможна только в том случае, когда дефицит ионов кальция в среде компенсируется за счет запасенного Са2+ в эндоплазматическом ретикулюме и митохондриях ЭСК. При искусственном повышении внутриклеточного Са2+ до 10"5 М путем добавления в среду кальциевого ионофора 0.1 мкМ А23187 наблюдалось усиление пролиферативной активности ЭСК мыши только в первые 24 ч инкубирования с 1ЛР, после чего клетки возвращались в исходное состояние и росли, как в контроле (рис. 7 А, кривая 1). Повышение концентрации внутриклеточного кальция было сигналом для активации Са2+-транспортирующих систем, о чем можно было судить по отсутствию эффектов ионофора А23187 при увеличении длительности культивирования ЭСК мыши до 72 ч.

Несколько иная ответная реакция на действие низких концентраций свободного кальция в среде культивирования была у ЭСК человека линии Н1 (рис. 8). В отличие от ЭСК мыши, независимые от 1ЛР клетки человека, обладали чувствительностью к снижению внеклеточного кальция или же его отсутствию в среде культивирования (рис. 8 А, Б). В средах с низким содержанием Са2+ они теряли способность расти и размножаться колониями и погибали (рис. 8 А, кривые 4, 5).

160

£ 120 ф

s С

40-

0.00

-ь

Г4!

о п

Рис, 8. Пролиферативная (А) и метаболическая (Б) активность ЭСК человека линии Н1 в зависимости от концентрации кальция в среде культивирования и при повышенной внутриклеточной концентрации Са2+ (ионофор). 1 - контроль, 2 - ионофор А23187 (0.1 мкМ); 3 - №5МСа2+;4-10"7 М Са2+; 5 - 3 мМ ЕСТ А (п = 8; Р< 0.05).

1 2 3 4 5

0 20 40 60 80

Время, ч

В этих экспериментах было установлено, что снижение пролиферативной

активности стволовых клеток человека при низком содержании свободного кальция в

среде напрямую зависит от активности митохондриальных дегидрогеназ (рис. 9 Б). Для

ЭСК человека поступление ионов кальция из среды играет исключительно важную роль как для обеспечения их выживаемости, так и энергетического обмена в культуре in vitro.

В то же время, стволовые клетки мыши, пролиферативная активность которых регулируется с помощью LIF (табл. 1, рис. 4, 6), слабо зависят от внеклеточного кальция (рис. 7 А, Б).

Известно, что ЭСК мыши могут совершать деления при участии депонированного в цитоплазме Са2+, спонтанные осцилляции которого вызывают продвижение этих клеток из G1 в S фазу клеточного цикла и контролируются фосфоинозитольной сигнальной системой (Quinlan et al., 2003; Yanagida et al., 2004; Kapur et al., 2007). Причем внеклеточный кальций слабо влияет на внутриклеточные осцилляции, но он необходим для поддержания уровня Са2+ в депо в стволовых клетках. Есть все основания полагать, что повышение концентрации внутриклеточного Са2+ в ЭСК мыши может происходить при посредничестве потенциал- и/или рецептор-управляемых кальциевых каналов (Fiorio et al., 2001; Ryu et al., 2003; Zahanich et al., 2005; Loeb, 2005; Wang et al., 2005a; Heo et al., 2005; Асташкин и др., 2005; Li, Deng, 2011). Рекомбинантный белок LIF как модификатор мембранных липидов и потенциальный каналоформер (рис. 1, 2) является вполне подходящим претендентом на участие в процессах регулирования потоков кальция в ЭСК мыши.

Следует также отметить, что выявленные нами различия между ЭСК мыши и человека по уровню активности митохондриальных дегидрогеназ в средах с низким содержанием кальция (рис. 7 Б, 8 Б) обусловлены, по всей видимости, видовыми особенностями строения и функционирования митохондрий, а также зависимостью от разных регуляторных факторов (LIF и FGFp соответственно). Согласно нашим представлениям, рекомбинантный белок LIF (а не изменение концентрации Са2+ в среде) вызывает в ЭСК мыши функциональные сдвиги на уровне ферментных ансамблей митохондрий (Лобанок и др., 2008; Lobanok et al., 2009). В частности, LIF подавляет в ЭСК мыши такие интегральные показатели функциональной активности, как клеточное дыхание и синтез АТФ. Снижение энергетического потенциала стволовых клеток в ходе культивирования с LIF, на наш взгляд, имеет прямое отношение к основной функции этого белка - сохранению клеток в плюрипотентном состоянии и, возможно, служит одним из механизмов адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды, в частности, низкой концентрации кальция в среде.

Структурно-функциональные изменения в ЭСК при совместном действии

фактора стволовых клеток (SCF) и LIF

В настоящее время известно, что плюрипотентный потенциал и пролиферативная активность ЭСК животных и человека определяются экзогенными факторами, регулирующими клеточный рост, межклеточные взаимодействия, апоптоз и самовоспроизведение этих клеток in vitro. На поверхности плазматических мембран ЭСК имеются соответствующие рецепторы, распознающие эти вещества, сигналы от которых передаются в специальные зоны хроматина, ответственные за скорость клеточного цикла и пролиферацию. Фактор стволовых клеток (Stem Cells Factor, SCF) является мембранотропным регулятором гематопоэтических стволовых клеток, эндотелиальных и тучных клеток, мегакариоцитов, меланоцитов, астроцитов и фибробластов. Установлен

рецептор SCF, так называемый C-Kit (CD 117), отсутствие которого приводит к ранней гибели мутантных мышей (Broudy, 1997; Jiang et al., 2000), что свидетельствует о значении C-Kit-сигнализация в эмбриогенезе. Особенно наглядно это проявляется в синергическом действии SCF с молекулами интерлейкинов (IL-3 и IL-6) и эритропоэтина (Ashman, 1999).

Нам представлялось интересным исследовать влияние SCF на негематопоэтические стволовые клетки мыши при совместном действии с регуляторным белком LIF, что важно для понимания механизмов управления процессами клеточного роста и дифференцировки, а также создания новых методов клеточной инженерии. Целью этих исследований было получение сведений об эффектах SCF при действии на мембранные липиды и на функциональную активность ЭСК мыши линии R1 в культуре in vitro. Структурно-функциональные характеристики этих клеток оценивали в двух вариантах культивирования: в присутствии одного SCF и в сочетании с LIF (рис. 9, 10).

Рис. 9. Влияние SCF и LIF на интенсивность поляризации флуоресценции липофильного зонда ДФГТ, встроенного в мембраны ЭСК мыши линии R1 после 24 ч культивирования в среде с 1 % фетальной сыворотки телят (Sigma). 1 - контроль, 2-10 нг/мл SCF, 3 - 10 нг/мл SCF и Юнг/мл LIF.

0.4

. 0.3

о 0.2

§ 0.1

а."

0.0

1 2 3

Для оценки влияния SCF на физическое состояние клеточных мембран мы использовали незаряженный липофильный зонд ДФГТ (1,6-дифенил-1,3-гексатриен), коэффициент поляризации которого (Рдфгг) коррелирует с микровязкостью липидного бислоя (Добрецов, 1989). Полученное значение Рдфгт для плюрипотентных клеток линии R1 было равно 0.252±0.019 (рис. 9), что в 1.4 раза выше Рдфгт Для липосом, состоящих из яичного фосфатидилхолина, холестерина, стеариновой кислоты, а-токоферола и не содержащих белков (Бушмакина и др., 2005). В то же время Рдфгт мембранных липидов в специализированных клетках, например, спленоцитах был в 1.7 раз выше, чем в ЭСК мыши. Полагаем, что более высокое значение коэффициента поляризации Рдфгг в недифференцированных плюрипотентных клетках мыши по сравнению с липосомами обусловлено наличием интегральных мембранных белков, а снижение по отношению к специализированным клеткам, возможно, связано с высокой пролиферативной активностью стволовых клеток.

В стволовых клетках R1 после 24 ч инкубирования с 10 нг/мл SCF Рдфгт увеличивается на 54 % по сравнению с контролем (без добавления SCF), что свидетельствует о появлении в популяции достаточно большого числа клеток с повышенной вязкостью мембранных липидов (рис. 9). При совместном действии SCF и LIF достоверных изменений Рдфгт не было зарегистрировано в результате блокирования мембранных эффектов SCF в присутствии 10 нг/мл LIF (рис. 9).

Недифференцированные плюрипотентные клетки линии R1 характеризуются низкими значениями микровязкости мембранных липидов (0.252±0.019) по сравнению с соматическими клетками ткани. Увеличение этого показателя в присутствии 10 нг/мл

SCF свидетельствует как о снижении плюрипотентного потенциала ЭСК мыши, так и о переходе значительной части стволовых клеток (54 %) в более дифференцированное состояние. В ходе этих экспериментов было установлено, что индуцируемое SCF повышение микровязкости клеточных мембран коррелирует с изменениями таких интегральных показателей функциональной активности ЭСК мыши in vitro, как интенсивность клеточного дыхания и синтез АТФ (рис. 10 А, Б).

Рис. 10. Влияние ростовых факторов SCF и L1F на скорость потребления кислорода (А) и содержание АТФ (Б) в ЭСК мыши линии R1 после 24 ч инкубирования в среде с 1 % эмбриональной сыворотки телят (Sigma). 1 -контроль, 2-10 нг/мл SCF, 3-10 нг/мл SCF + 10 нг/мл LIF.

После 24 ч инкубирования ЭСК с 10 нг/мл БСР наблюдалось усиление потребления кислорода более чем в 2 раза (рис. 10 А). В то же время, при одновременном действии двух факторов дыхание активировалось лишь на 30 %. И в этом случае 1ЛР подавлял 8СР-индуцированную стимуляцию клеточного дыхания, как снимал эффект вСР на вязкость липидного компонента мембран (рис. 9). Как известно, клеточное дыхание напрямую связано с синтезом АТФ, по содержанию которого можно судить о характере функциональных сдвигов, происходящих в популяции ЭСК в ответ на внешние воздействия, включая действие регуляторных факторов и вСР.

Оказалось, что добавление в среду культивирования 8СР приводит к увеличению содержания АТФ в 3.6 раза (рис. 10 Б), что хорошо согласуется с активацией дыхания в присутствии этого же фактора (рис. 10 А). При одновременном использовании 8СР и ЫР, как можно было ожидать, принимая во внимание представленные выше данные, уровень АТФ в стволовых клетках снижался. Интересно отметить, что полноценный рост и размножение ЭСК разных видов животных и человека происходит в средах с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/мл), которая выступает в роли разобщителя, угнетающего окислительное фосфорилирование и не влияющего на скорость переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий (Евтодиенко, Теплова, 1996). Можно предположить, что 8СР модифицирует эффект глюкозы при действии на ЭСК мыши, стимулируя окислительное фосфорилирование и дыхание, повышая тем самым энергетический потенциал клеток.

Таким образом, полученные нами результаты характеризуют ЭСР как соединение, влияющее на структурно-функциональное состояние ЭСК мыши. Опосредованное БСР увеличение вязкости липидного бислоя мембран, содержания АТФ и активности клеточного дыхания играют значительную роль в поддержании жизнеспособности стволовых клеток в культуре. И в то же время, очевидно, что ЫР частично нейтрализует эффекты БСР при действии на ЭСК мыши, что, как мы полагаем, связано с сохранением

[АТФ], нМ JL 25-

плюрипотентных свойств и повышением резистентности стволовых клеток к условиям in vitro.

Дифференцировка ЭСК мыши в кардиомиоциты

В настоящее время известны некоторые методические приемы, позволяющие индуцировать переход ЭСК животных и человека из состояния плюрипотентности к дифференцировке. В частности, выявлены химические индукторы дифференцировки ЭСК, однако в целом проблема получения из ЭСК однородной популяции клеток определенного фенотипа остается не решенной. Значительный прорыв в этих I исследованиях был сделан, когда впервые удалось выделить из смешанной популяции ЭСК человека кардиомиоциты и охарактеризовать их как нодальные, атриапьные, вентрикулярные клетки и клетки Пуркинье (Caspi, Gepstein, 2006).

Другой важный момент в этих исследованиях состоит в том, что доля кардиомиоцитов в гетерогенных популяциях ЭСК невелика и составляет 3-5% (Boheler et al., 2002; Не et al., 2003; Ventura et al., 2004; Trounson, 2006). Проблема эффективного использования ЭСК-технологий для восстановительной/заместительной терапии решается путем поисков специфических индукторов кардиальной дифференцировки в сочетании с методами генетической трансфекции. По мнению ряда авторов, такой подход позволит значительно повысить выход функционально активных кардиомиоцитов in vitro (Reubinoff, 2000; Boheler et al., 2002, Wobus, Boheler, 2005; 1 Keller, 2005).

В наших исследованиях показано, что рекомбинантный белок LIF(eu) может индуцировать кардиомиоцитарную дифференцировку ЭСК мыши в условиях пролонгированного культивирования (Петрова и др., 2005, 20066, Petrova et al., 2007). Показано, что LIF(eu) обладает высокой эффективностью действия на стволовые клетки линии R1. Он поддерживает их в плюрипотентном состоянии в течение более длительного периода времени in vitro, чем такой же белок LIF(pro) (табл. 1, рис. 11 а-в).

Рис. 11. Динамика развития и морфология колоний ЭСК линии R.1 в среде с 10 нг/мл белка LIF(eu). а -общий вид и размеры колоний после 3 и б - 7 суток культивирования, в -очаги сократительной активности на 21 сутки культивирования (показаны стрелками) и г - локализация в колониях эмбриональных

кардиомиоцитов со сниженной активностью эндогенных щелочных фосфатаз (показаны стрелками).

На 20-26 сутки культивирования с LIF(eu) в колониях R1 появляются очаги с сократительной активностью (рис. 11 в, г), куда входят как ранние, так и более поздние предшественники кардиомиоцитов с саркомерной организацией цитоскелета (рис. 12) и

_ -i щф- * ШЖ ¡

автономными сокращениями, отвечающими на уЗ-адренергическую стимуляцию (рис. 13). Сокращения обнаруживаются на границе раздела более плотной центральной части колонии, представленной в основном стволовыми клетками с высокой активностью ЭЩФ, и периферического монослоя (рис. 11 в, г).

Рис. 12. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши линии Ю на 24 сутки культивирования в среде с рекомбинантным белком ЫР(еи): а - недифференцированная колония плюрипотентных клеток, б-в - выявление кардиомиоци-тарного а-актина в очагах с сократительной активностью (увеличение 20х), г эмбриональные кардиомиоциты с сократительной активностью (показаны стрелками; увеличение 40х).

Рис. 13. Определение оптимальной концентрации изопротеренола (ИП) при действии на ЭСК мыши линии II1 с сократительной активностью в присутствии эукариотического белка ЫР, 1 - до обработки ИП (контроль), 2, 3, 4 - сократительная активность в локальных очагах через 3 мин после добавления в среду культивирования 10"9, 10"8 и 10"7 М ИП соответственно.

2 3 4 0 20 40 60 80 100

Время, мин

К началу появления сократительной активности на 21 сутки размеры колоний ЭСК достигают 1.55±0.4 мм2 и насчитывают порядка 1.6х104±0.29 клеток. В одной колонии может выявляться несколько автономных очагов с ритмичными сокращениями, различающиеся между собой по размерам, амплитуде и частоте сокращений. В местах их локализации обнаруживается более низкий уровень ЭЩФ, чем в центре колонии, где сосредоточены плюрипотентные ЭСК мыши с высокой активностью ЭЩФ (рис. 11 г).

Принадлежность ЭСК мыши к кардиомиоцитам подтверждена с помощью моноклональных антителел к кардиальному а-актину мыши (рис. 12 б, в). Показано, что на 24 сутки культивирования в колониях ЭСК обнаруживаются как ранние предшественники кардиомиоцитов, имеющие небольшие размеры и округлую форму (рис. 12 б), так и более зрелые кардиальные клетки с четко выраженной саркомерной организацией цитоскелета (рис. 12 в, г).

После удаления ИП из среды эмбриональные кардиомиоциты сохраняют в составе колоний свою активность и сокращаются в течение 7-10 суток при оптимальных условиях культивирования (температура, газовая фаза). Частое микрокопирование, а также увеличение продолжительности регистрации сокращений при комнатной

емпературе приводят к подавлению двигательной активности кардиальных клеток, плоть до полного затухания колебаний. Максимальное время пребывания ардиомиоцитов на открытом воздухе не превышает 2-3 час.

Следует отметить, что в эмбриогенезе мышей предшественники миокардиальных леток приобретают компетентность и терминально дифференцируются на 7.5 сутки азвития при взаимодействии мезодермы с передней эндодермой и, возможно, при частии специального организатора миокардиальной дифференцировки (Wobus et al., 002). В нашем случае LIF-индуцируемая дифференцировка в клетки с сократительной ктивностью происходит при достижении определенных размеров колонии (порядка 16000 клеток). В таких больших колониях ритмичные сокращения регистрируются в сновном на границе раздела центральной части колонии и окружающего монослоя (рис.

в). Эти зоны различаются по морфологии и интенсивности межклеточных заимодействий, что может соответствовать разным типам эмбриональной ткани, при заимодействии которых LIF(eu) активирует процессы миокардиальной ифференцировки in vitro (Петрова и др., 20066). При непродолжительном ультивировании (2-3 суток), когда размеры колоний ЭСК мыши не столь велики и нет асслоения на соответствующие зоны, регуляторная функция LIF ограничивается лиянием на процессы клеточной пролиферации (табл.1, рис. 12 а), в которых ешающую роль играет JAK-STAT3-сигнализация (Raz et al., 1999).

Последовательная смена направлений LIF-регуляции возможна за счет бинарного механизма действия этого белка как на рецепторы LIF-R-gpl30, так и ионные каналы с последующим изменением свойств мембранных липидов и проводимости клеточных ембран (рис. 1-3). Результатом бинарного действия LIF на плюрипотентные клетки может быть активация МАРК сигнального пути, в частности, одной из киназ, МЕК-5, участвующей в сборке саркомеров (Hicol et al., 2001), а также активация кальциевых каналов L-типа, регулирующих потоки ионов кальция в кардиомиоцитах (Nakahashi et al., 2004; Anderson et al., 2007). Поскольку по своим физиологическим свойствам LIF является аналогом нейронального фактора, выделенного из клеток сердечной мышцы, и фактора дифференцировки холинергических нейронов сердца (Yamamon et al., 1989), избирательность его действия на миокардиальный тип дифференцировки становится более очевидной.

Таким образом, наши исследования свидетельствуют об избыточной функциональной активности LIF(eu). Этот белок активирует в ЭСК мыши как процессы пролиферации (рост и размножение колониями), так и миокардиальной дифференцировки. Дифференцированные стволовые клетки с сократительной активностью дают положительную реакцию на выявление кардиального а-актина и ß-адренергическую стимуляцию (рис. 12, 13). Согласно нашим представлениям, синтез кардиальных белков осуществляется параллельно с наработкой /J-адренорецепторов (рис. 12). Колонии ЭСК мыши с сократительной активностью - это не только экспериментальная модель для изучения миокардиальной дифференцировки в эмбриогенезе, но и тест-система для скрининга с высокой пропускной способностью фармакологических препаратов и биологически активных веществ синтетического и

природного происхождения. Бесспорным преимуществом такой модели являются простота и надежность в проведении прямых наблюдений за динамикой превращения плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, воспроизводимость результатов (до 60 %) и меньшая вариабельность клеточных типов в колониях по сравнению с ЭТ„ которые обычно используются в подобных экспериментах.

Эндогенный LIF и его значение для поддержания плюрипотентных свойств ЭСК

Методом RT-PCR было показано, что в плюрипотентных ЭСК мыши линии R1 ген, ///не экспрессируется. Транскрипты LIF обнаруживаются в клетках с морфологическими, признаками дифференцировки и в ЭТ, что свидетельствует о корреляции ///-экспрессии о началом эмбриональной дифференцировки. Для ответа на вопрос, влияет ли эндогенный белок LIF на клеточный рост, воспроизводство и цитогенетические характеристики ЭСК, мыши, были получены клоны R1, экспрессирующие плазмидный ген /// Из 7-ми' устойчивых к G418 клонов с фенотипом пео+ только у двух (28 %) обнаруживалась! экспрессия плазмидного гена ///(клоны R1.2 и R1.3). l

Оказалось, что их клональные потомки neo*/lif растут и размножаются колониями в средах без добавления рекомбинантного белка LIF, обнаруживают маркеры плюрипотентности и способность к дифференцировкам в ЭТ. Были выявлены отличительные характеристики ///-трансфицированных клонов от клеток исходной линии! Rl: 1) существенное замедление скорости роста колониями и 2) образование1 «фиксированных» ЭТ. В составе «фиксированных» ЭТ на 11-14 сутки культивирования обнаруживались плюрипотентные клетки с высокой активностью ЭЩФ (рис. 14 д, е). Клональные потомки ///-трансфицированных ЭСК сохраняли свои свойства и способность расти колониями в средах без LIF на протяжении 5-7 пассажей.

;

Рис. 14. Морфология колоний ///-трансфицированных клеток линии Я1 при развитии на желатине в среде без добавления ИР: а - начало ■ШЁ] е и"."!, формирования колонии на 3, б- 5, в - 7,

*'. * * ' г - 9 сутки культивирования, д -

дифференцировка колонии и образование «фиксированного» ЭТ на 11 сутки культивирования и е - ЭТ на 14 сутки культивирования.

Во всех проанализированных метафазах обнаруживалась одна общая особенность наличие метафаз с хромосомами, в которых выявлялись в-банды без обработки рипсином, что позволило нам типировать индивидуальные хромосомы, а также ценивать происхождение перестроенных хромосом. Анализ 3-х популяций III, бозначенных по мере удаления от исходной линии как Ш.5, Ш.7 и ШЛО, и 5-ти опуляций трансфицированных клеток клона Ш.2 (Ш.2.1 и Ш.2.2) и клона Ш.З (Ш.3.6, Л.3.8 и Я 1.3.9), показал, что по встречаемости метафаз с анеуплоидией (А1 и А2) опуляции Ш оказались сходными с клональными потомками обоих рансфицированных клонов (табл. 2).

Следует также отметить, что встречаемость метафаз со спонтанными в-бандами ыла достоверно выше (Р<0.05) в популяциях исходной линии (49.3±4.0 %) по равнению с /(/-трансфицированными клонами 111.2 (17.0±5.0 %) и Ш.З (25.0±2.0 %). [опуляции исходной линии различались между собой по наличию перестроенных ромосом, как правило, в составе РТ, количеству анеу- и полиплоидных клеток, [апример, популяция Ш.5, которая на момент проведения цитогенетических сследований прошла меньшее число пассажей, имела более низкую частоту стречаемости метафаз с анеуплоидией А2 (2п±1), т.е. имела большее диплоидных леток, чем две другие популяции, Ш.7 и ШЛО, прошедшие большее число пассажей табл. 2).

Таблица 2

[итогенетические аномалии в популяциях ЭСК мыши линии Шив потомстве /(/-

количество А1 А2 РТ ХА АРЦР, п, на 1000 клеток

банд %

метафаз % % % % % % МИ ДЯ мя АК

111.2.1 60 71.7 35.7 23.3 15.0 18.3 11.7 11.7 7.0 3.3 1.3 1.0

Ш.2.2 45 66.7 31.3 26.7 35.6 15.6 6.7 22.2 3.7 2.7 1.3 0.7

среднее 69.2 33.5 25.0 25.3 16.9±1 9.2± 17.0 ±5.0 6! 5.4± 3.0± 1.3 0.9

±2.5 ±2.2 ±1.7 ±0.3 .4" 2.5 1.7 0.3 ±0 0.2

Ш.З.б 100 77.0 46.7 6.0 4.0 2.0 6.0 23.0 20.0 2.0 1.7 0.3

111.3.8 100 77.0 32.0 17.0 3.0 6.0 6.0 28.0 5.3 1.0 1.3 0.7

Ш.З .9 25 76.0 28.6 4.0 0 8.0 4.0 24.0 3.0 3.0 2.0 1.0

среднее 76.7 ±0.3 35.8 ±5.6 9.0 ±4.0 2.3 ±1.2 5.3 ± 1.8"2 5.3 ±0.7 25.0 ±2.0 62 9.4 ± 5.3 2.0 ± 0.6 1.7± 0.2 0.7 ± 0.2

Ш.5 100 90.0 14.3 11.0 17.0 2.0 4.0 51.0 6.3 2.3 1.0 0

Ш.7 100 67.0 35.9 11.0 3.0 2.0 8.0 55.0 16.0 2.0 1.3 0.7

Ш.10 60 76.7 47.8 8.3 10.0 5.0 5.0 41.7 11.5 2.5 1.5 0.5

среднее 77.9 ±6.7 32.6 ±9.8 10.1 ±0.9 и! 10.0 ±4.0 3.0± 1.0 5.6± 1.2 49.3 ±4.0 11.3 ±2.8 2.3± 0.1 1.3± 0.1 0.4 ± 0.2

Примечание. " Достоверность различий между популяциями одного клона Ш.2 (/,= 8.2; /><0.01). То же между клетками клонов Ш.2 и Ш.З (I, = 5.2; Р<0.01).61 Достоверность различий между популяциями Ш и потомками клона Ш.2 ((,= 7.0; Р <0.01). и То же между популяциями Ш и клональными потомками Ш.З (/, = 5.4; Р <0.01). "Достоверность различий между популяциями Я 1.2 и Ш.З (/,= 16.1; /'<0.001).

Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что ///-трансфекция приводит к увеличению цитогенетических аномалий и, следовательно, к дестабилизации

генетического материала. Однако между популяциями разных клонов наблюдались различия в зависимости от того, из какой колонии они происходили. Популяции с общи\( происхождением были больше похожи не только по частоте встречаемости хромосомны, повреждений, но и другим цитогенетическим характеристикам. У клональных потомко' R1.3 выявлялись клетки с деспирализацией перицентромерных районов хромосом i опережающим расхождением центромерных районов хроматид в конце метафазы (рис. 1: А), что характерно для половых клеток (Suzuki et al., 1997; Bernardino-Sgherri et al., 2002).| В таких метафазах обнаруживались сложные межхромосомные перестройки п центромерным районам (рис. 15 Б), а также метафазы и анафазы с выраженнымJ дефектами организации хромосом в виде кольцевого распределения метафазны;" хромосом и формирования в анафазе структур, подобных метафазным пластинкаЦ автономно лежащим относительно друг друга (рис. 16). i

19 --

Рис. 15. Метафазная пластинка (А) кольцевой формы с опережением в расщеплении центромерных районов хроматид (примеры показаны стрелками) и начало формирования РТ 5;3 и 5;19 (стрелками указаны номера хромосом) между хромосомами с ранним расщепле-нием центромерных районов (Б) в ///-трансфицированных ЭСК мыши.

Рис. 16. Примеры метафазных пластинок в /</- | трансфицированных ЭСК мыши: А - метафазная пластинка кольцевой формы и необычайно большого размера (стрелкой указана робертсоновская транслокация 8; 15), Б -формирование хроматидами метафазоподобных ! пластинок большой разобщенности между ними I в анафазе.

Примеры метафазных пластинок свидетельствуют о гетерогенности lif-1 трансфицированных клеток R1.3 и их потенциальной возможности формировать клоны с' разной стабильностью хромосом, разной организацией цитоскелета и с характеристи-1 ками, близкими к клеткам генеративного ряда. Природа такой гетерогенности может-быть как генетической, так и эпигенетической. Следует отметить, что перестроенные | хромосомы обнаруживались и в трех популяциях исходной линии R1, различающихся между собой по числу пассажей и длительности культивирования (табл. 2).

Проведенный нами цитогенетический анализ указывает на кариотипическую нестабильность ЭСК мыши in vitro (табл. 2, рис. 15, 16). Несмотря на то, что в популяции| R1.5 с меньшим числом пассажей обнаруживались в основном диплоидные клетки,? детальный анализ метафазных пластинок выявил перестроенные хромосомы. Общим для I всех трех популяций исходной линии были РТ 8; 15, которые также встречались в трансфицированных ЭСК. Интересным оказалось то, что такие нарушения как анеу- и полиплоидия, асинхронность расщепления хромосом, аберрации и транслокации ^ хромосом не препятствовали сохранению плюрипотентных свойств ЭСК в культуре in vitro. Судя по нашим данным, трансфекция плазмидным вектором pcDNA3 с геном lif и,

ледовательно, продукция эндогенного белка LIF не приводят к общей дестабилизации <ариотипа ЭСК. При отсутствии рекомбинантного LIF в среде культивирования lif-рансфицированные ЭСК мыши сохраняют «стволовый» фенотип в течение 7-10 суток <ультивирования по типу аутокринного регулятора (рис. 14).

Специфической особенностью ЭСК мыши является то, что разные популяции дного клона могут существенно различаться по частоте встречаемости тех или иных енетических аномалий (табл. 2). Наши результаты свидетельствуют о том, что охранение свойств ЭСК связано не столько с количеством накопленных генетических ефектов в ходе культивирования, сколько с исходной гетерогенностью и нутрилинейной изменчивостью стволовых клеток, в результате чего их потенциал к ифференцировкам может существенно варьировать от одной клеточной популяции к ругой. В гетерогенных популяциях не все стволовые клетки будут обладать равными озможностями in vitro.

Кариотипическая эволюция ЭСК in vitro

В настоящее время преобладает мнение о том, что причиной снижения люрипотентного потенциала ЭСК является накопление цитогенетических аномалий на олее поздних пассажах. С увеличением числа проведенных пассажей ЭСК мыши еряют способность развиваться в составе целого зародыша и дифференцироваться в оловые клетки (Nakagawa et al., 2000; Gao et al., 2003). В наших исследованиях показано, что способность ЭСК мыши к цитодифференцировкам может снижаться не олько за счет увеличения числа проведенных пассажей но и продолжительности ультивирования (табл. 3). В частности, при увеличении времени экспозиции клеток R1 в культуре с 48-72 ч до 8-10 суток в различных популяциях, включая lif-1рансфицированные клоны, наблюдается достоверное нарастание разрушенных метафаз и апоптозных клеток.

Таблица 3

Частота встречаемости апоптозных клеток и разрушенных метафаз в популяциях R1 и /(/-трансфицированных клонах R1.2 и R1.3 в зависимости от

продолжительность культивирования количество рабочих полей микроскопа с разрушенными метафазными пластинками от числа просмотренных, % частота встречаемости апоптозных клеток

8-10 суток (популяции R1.10, R1.2.1, Rl.2.2, R1.3.9) 50.0 ±5.7 0.9 ±0.1

48 - 72 ч (популяции R1.5, R1.7, Rl.3.6, R1.3.8) 15.0 ± 3.1" 0.4 ±0.1*

Примечание. "Разрушенные метафазы, 5.3 (Р = 0.01); апоптозные клетки, ^ = 3.6 (Р = 0.01).

Культивирование проводили в среде с добавлением 10 нг/мл ЫР(рго).

Длительная экспозиция стволовых клеток Rl в среде с Ь1Р (8-10 суток) приводит к увеличению гетерогенности популяции. Среди 3-х кариотипированных популяций Rl наименьшее количество клеток с хромосомными аберрациями и транслокациями, а также наибольшее количество делящихся и полиплоидных клеток наблюдалось в популяции Ш.7, формирующей через 72 ч культивирования ЭТ. Популяция .10, время

культивирования которой увеличивалось до 8 суток, несла заметно больш перестроенных хромосом (РТ, моносомий и избытка материала ряда хромосом), хотя oir находилась на том же пассаже, что и популяция R1.7.

В популяциях R1.5 и R1.7 встречались в основном метафазы с избытком одно> копии хромосомы 8 и только изредка хромосомы 19. В популяции R1.10 с признакам морфологической дифференцировки во всех метафазах обнаруживался избыто материала хромосомы 19 и всего 2-3 избыточные копии материала хромосомы 8. 1 целом, метафазные пластинки дифференцированных клеток несли заметно больш перестроенных хромосом по сравнению с плюрипотентными клетками. Наименьше количество вариантов РТ выявлялось в популяции R1.7 (4), наибольшее - в популяци R1.10 (17) и промежуточное (7) - в популяции R1.5 (табл. 4). В большинстве метафа наблюдались РТ 8;8, 8;15 и 8; 19, что приводило к избытку материала по этт хромосомам. Для линии R1 увеличение цитогенетических аномалий совпадало увеличением избыточности материала хромосом 8 и 19.

Если принять во внимание, что экзогенный белок LIF ведет к селекции ЭСК мыш путем увеличения копийности определенных хромосом, в частности, 8 и 19, можно был ожидать снижения интенсивности такой избирательной селекции после введени плазмидного гена lif. Однако в большинстве кариотипированных метафаз у iif трансфицированных клонов и даже у тех, которые имели нормальный диплоидны" кариотип 2п=40, обнаруживалась трисомия по хромосомам 8 и 19 в составе различны РТ, как и в клетках исходной линии. Причем из 19-ти вариантов РТ в 9-ти из ни принимала участие хромосома 8, в 6 - хромосома 19 и в 4 вариантах эти хромосомы н участвовали.

Среди выявленных аномалий в ///трансфицированных клонах только п хромосомам 8 и 19 наблюдались изохромосомы (8;8 и 19;19). Избыточное количество материала хромосом 8 и 17 в клетках клона R1.3 совпадало с феноменом опережающего расщепления центромерных районов хроматид (рис. 15 А). Вовлечение центромерных районов в межхромосомные транслокации (рис. 15 Б) сопровождалось формированием последующих РТ, а увеличение на этом фоне копийности хромосомы 17, несущей ген tbn (taube nuss), экспрессия которого является обязательным условием сохранения плюрипотентных клеток в эмбриогенезе мышей, приводило к дальнейшей дестабилизации хромосомного аппарата.

Из наших данных следует, что эндогенный LIF не вызывает общей дестабилизации кариотипа ЭСК мыши, но и не препятствует селекции клеточных клонов с увеличенным количеством материала хромосом 8 и 19. Трисомию по хромосоме 8 связывают с присутствием в этой хромосоме онкогенов, повышающих пролиферативную активность ЭСК мыши (Sugawara et al., 2006). Однако при этом не учитывается зависимость ЭСК мыши от регуляторного фактора LIF, действие которого на плюрипотентные клетки реализуются посредством активации гена jak3, локализованного в хромосоме 8, и stat3, локализованного в хромосоме 11 (Endo et al., 1997; Raz et al., 1999; Frost et al., 2002). В хромосоме 19, копийность которой также увеличивается в ходе культивирования, находится ген jak2, участвующий в активации stat3 и stat5, локализованных в хромосоме

1 (Frost et al., 2002). Очевидно, что под влиянием экзо- и/или эндогенного LIF в ЭСК ыши будут достигаться сходные эффекты как при увеличении копийности хромосомы 8 ген jak3), так и хромосомы 11 (ген stat3) и хромосомы 19 (ген jak2), поскольку продукты тих генов участвуют в одном и том же сигнальном каскаде JAK-STAT3, ответственном а плюрипотентность и пролиферативную активность ЭСК мыши.

Пассивное вовлечение в отбор генов, сцепленных с локусом, который является ишенью селекции, известно как «путешествие автостопом» (hitch-hikc). Судя по анным цитогенетического анализа, такие же механизмы реализуются в ЭСК мыши при ультивировании с рекомбинантным белком LIF. Одним из ее признаков служит оявление в ЭСК различных вариантов РТ, что может ускорить кариотипическую волюцию этих клеток, если партнерами по траслокациям являются хромосомы, онтролирующие клеточные деления. Запуск такой схемы изменчивости не связан с енетической трансфекцией или дифференцировкой ЭСК мыши.

Наблюдаемая в условиях культивировании кариотипическая нестабильность ЭСК ыши (табл. 2) является результатом селекции клеток с избыточным количеством копий ромосом с локализованными в них генами - посредниками действия LIF на стволовые слетки. Клетки с трисомией по хромосомам, в которых сосредоточены такие гены, будут первую очередь подхватываться отбором, поскольку повышается их чувствительность LIF. Следует подчеркнуть, что в пользу сформулированной нами концепции о еханизмах эволюции ЭСК in vitro свидельствуют сходные данные о гетерогенности ндуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) человека по различным омпонентам мутационных спектров и о динамике их представленности в отдельных юпуляциях (Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011).

Влияние LIF на развитие зародышей мыши in vitro

Многочисленные источники свидетельствуют о том, что ростовые факторы и итокины, в том числе LIF, влияют на развитие зародышей млекопитающих в период мплантации. Считается, что основная функция LIF в раннем эмбриогенезе состоит в одготовке эндометрия к имплантации зародышей (Stewart, Cullinan, 1997; Vogiagis, alamonsen, 1999; Kimber, 2005; Horita et al., 2007; Aghajanova, 2010).

В наших исследованиях показано, что у мышей транскрипты LIF обнаруживаются яйцеводе и матке с 1 по 4 день беременности (Межевикина и др., 2006). Присутствие IF в репродуктивном тракте мышей на протяжении всего доимплантационного периода предполагает участие этих молекул в процессах эмбрионального развития, что нашло подтверждение в экспериментах in vitro (табл. 4). В средах с 10 нг/мл рекомбинантного LIF мыши 2-клеточные зародыши мышей линии SHR развиваются более синхронно, снижается в 2 раза гибель в результате остановки развития и деградации бластомеров (22.6 % против 48.6% в контроле). Другое важное наблюдение в ходе этих исследований - стимулирующее влияние LIF через 72-96 ч культивирования (табл. 4). К этому времени и в опыте и контроле большинство 2-клеточных зародышей достигают стадий компактной морулы и бластоцисты. Наибольшие расхождения регистрировались через 96 ч культивирования на стадии бластоцисты (81.2±1.6 против 36.712.3 % в контроле).

Таблица 4

Эффективность культивирования 2-х клеточных зародышей мыши линии вНК до стадии бластоцисты._

среда количество зародышей развившихся зародышей в зависимости от длительности культивирования, %

24 ч 4-6 кл. 48 ч 8-16 кл. 72 ч морула 96 ч бластоциста

МСВ (контроль) 64 (п=4) 86.7 ±1.9 93.3 ±1.1 82.9 ±2.4* 36.7 ±2.3"

МСВ + LIF (опыт) 84 (п=7) 95.5 ±1.0 98.9 ±0.7 93.8 ±1.2' 81.2 ±1.6"

Примечание. МСВ - модифицированная среда Витгена, п - количество повторов каждого эксперимента. Использовали LIF(pro) в концентрации 10 нг/мл (Sigma, ICN). * - достоверность различий между опытной и контрольной группами зародышей, ** - то же самое (Р < 0.01).

Для ответа на вопрос, какие из клеток в составе бластоцисты являются мишеням LIF, была проведена серия экспериментов на бластоцистах мышей линии NMRI условиях пролонгированного культивирования in vitro (табл. 5). Было установлено, чт рекомбинантный LIF в концентрации 10 нг/мл стимулирует выход бластоцист из z pellucida, адгезию (35.3 % адгезивных бластоцист против 17.1 % в контроле) последующее развитие бластоцист в виде колоний, представляющих собой едину] популяцию клеток ВКМ и ТБ (рис. 17 г, д, е).

Таблица 5

Количество клеток в бластоцистах мышей линии ЫМШ в зависимости от длительности культивирования. ___

МСВ число бластоцист из них адгезивных через 48 ч in vitro, % число клеток в одной бластоцисте в ходе развития

2 суток 5 суток 7 суток

LIF (10 нг/мл) 111 35.3 139.6±6.3 302.4±32.5' 412.2±56.4"

без LIF (контроль) 241 17.1 138.2±5.8 237.1±13.0* 294.7±18.4"

Примечание. МСВ - модифицированная среда Витгена. LlF(pro) мыши (Sigma, ICN) Достоверность различий между двумя группами сравнения: 4=2.3, Л <0 03; "/,=2.6, Я < 0,01.

При отсутствии LIF в среде культивирования у значительной части бластоцис (47.4±3.0 %) возникают аномалии морфологии и гибель в течение 96 ч. Кроме того, среде без LIF происходит задержка бластоцист в z. pellucida, увеличивается объе перивителлиного пространства, нарушается структурно-пространственная организаци клеток ВКМ и ТБ относительно друг друга (рис. 17 ж).

При этом повреждаются и необратимо гибнут преимущественно клетки ТБ. У ни нарушены барьерные свойства плазматических мембран, о чем свидетельствус проникновение витального красителя 0.1 % трипанового синего (рис. 17 и). В средах без LIF клетки ВКМ сохраняют жизнеспособность и пролиферативную активность, но у ни нарушается способность расти и размножаться колониями из-за слабой адгезии субстрату (рис. 17 з, и). Приведенные данные свидетельствуют о том, что участие L1F в морфогенетических процессах на стадиях морулы и бластоцисты может быть опосредовано через клетки ТБ. После выхода бластоцисты из z. pellucida они первыми прикрепляются к субстрату, распластываются и образуют монослойную подложку для последующей адгезии клеток ВКМ (рис. 17 г, д).

т ¡I /

щт

йшШИ

V-f./'

Г' MesS'v (

w ж i

.......................—№■« *

а _ о - в -

v -

' n,

кк'гб ■

г - д ■ -

яштт ■

УШ

ТБ

о г-*

4 ?£ Л/я

i %

*4г.

^ис. 17. Морфология зародышей мыши линии NMRT на стадии бластоцисты при культивировании в ;реде Витгена с 10 нг/мл LIF (a-e) и без добавления LIF (ж-и). Цитохимическое выявление в первичных ' олониях активности эндогенной щелочной фосфатазы (е) и оценка жизнеспособности бластоцист с [гомощью витального красителя 0.2 % трипанового синего (и). ВКМ - клетки внутренней клеточной 1ассы; ТБ - трофобласт; ЗП - зона пеллюциды (z. pellucida); ПП - перивителлиновое пространство; ПБ полость бластоцисты; КЭК - колония эмбриональных клеток ВКМ; ККТБ - колония клеток ^рофобласта. Масштаб -100 мкм.

В центре таких сложных по морфологии колоний, как правило, располагается _ролее компактная группа ВКМ с высокой активностью ЭЩФ и экспрессии транскрипционного фактора Nanog, окруженная по периферии более крупными и распластанными клетками ТБ, не дающими реакции с маркерами плюрипотентности. Эффективность культивирования зародышей до стадии бластоцисты и после выхода Бластоцисты из z. pellucida была достоверно выше в средах с LIF(pro), чем в контроле. При этом усиление клеточной пролиферации обнаруживалось только после выхода йластоцисты из z. pellucida (табл. 5).

i Было установлено, что увеличение клеточной численности под влиянием |рекомбинантного LIF происходит в основном за счет более интенсивного роста клеток ТБ (рис. 18 Б). В то же время количество клеток ВКМ в средах с L1F поддерживалось на ртносительно высоком, но практически постоянном уровне в течение всего периода культивирования (рис. 18 А).

Рис. 18. Динамика увеличения числа клеток внутренней клеточной массы (А) и трофобласта (Б) из расчета на одну бластоцисту при культивировании зародышей мыши в модифицированной среде Виттена с 10 нг/мл ЬШ (1,2) и без добавления (3).

I-

Время культивирования, сутки 1

Достоверное увеличение числа клеток в первичных колониях свидетельствует I пользу избирательного действия LIF на процессы пролиферации ТБ. Увеличений численности клеток ТБ, контролирующих перенос воды и ионный транспорт, а такж»1 адгезию и взаимодействие зародышей с эндометрием, является существенным моментом в LIF-регуляции раннего эмбриогенеза. Основная функция ТБ на этом этапе развита* заключается в обеспечении плотных контактов и создании проницаемого барьера для1 доступа иммунологически компетентных материнских клеток и сигнальных молекул ij зародышам. В источниках литературы обсуждается возможность влияние эндометриального LIF на пролиферативную активность эмбриональной эктодермы (Fry 1992; Vogiagis, Salamonsen, 1999). Предшественниками эктодермы являются клетки ВЮ и отсутствие стимулирующего влияния LIF на их рост в составе бластоцист и первичны; колоний (рис. 17 з, и, 18 А) свидетельствует о том, что функции регуляторного белка LIF] in vitro и in vivo совпадают.

Значение внутриклеточного кальция и фосфоинозитольной (PI) сигнальной;

системы на ранних стадиях развития

Избирательное действие LIF на клетки ТБ (рис. 18 Б) предполагает активацию; кальций-зависимого PI сигнального пути, связанного как с клеточной пролиферацией так и первичными морфогенетическими процессами (Quinlan et al., 2003). Полярны' клетки - предшественники ТБ, появляются в раннем эмбриогенезе на 8-клеточной стадии и характеризуются тем, что они синтезируют специальные белки и факторы адгезии, необходимые для компактизации и образования полости на стадии бластоцисты. В связи! с этим была проведена серия экспериментов, в которых установлено, что увеличение в1 3.5 раза концентрации цитоплазматического кальция в присутствии кальциевой ионофора А23187 (рис. 19 А, Б) приводит к появлению на стадии 8-ми бластомеров, морфологических признаков компактизации (рис. 19 В).

После 2 мин экспозиции с ионофором А23187 у 8-клеточных зародышей мыши' исчезают видимые границы между отдельными бластомерами, увеличивается площадь1 их контактов. По своей морфологии такие зародыши соответствуют стадии компактной, морулы (рис. 19 В). Кроме того, оказалось, что зародыши с индуцируемой ионофором( А23187 компактизацией после переноса в культуральную среду развиваются и достигают! стадии поздней бластоцисты быстрее, чем интактные зародыши в контроле (рис. 19 Г). У

их раньше по времени начинает формироваться внутренняя полость, увеличивается 'корость кавитации (п=8; Р < 0.05).

ь р

Е 4

200 400 600

время,сек

0' * .17'

"Ш 5'

\2Л1S"

■вимд»

30 40 SО

время, ч

¡"ис. 19. Влияние изменения концентрации внутриклеточного кальция под действием ионофора А23187 la процессы компактизации и кавитации зародышей мыши. А - интенсивность флуоресценции ародыша под действием ионофора (1мкМ, 2 мин). Б - уровень кальция в окрашенных Fluo-ЗАМ !ародышах в соответствии со шкалой, рассчитанной по интенсивности флуоресценции Fluo-ЗАМ 506/526). В - компактизация 8-клеточного зародыша после обработки ионофором. Г - скорость авитации зародышей в контроле (1) и после предварительной 2 мин экспозиции с ионофором А23187 |2)-

Резкое повышение концентрации внутриклеточного кальция в результате Непродолжительного действия (2 мин) ионофора А23187 может служить мощным стимулом для запуска первичных морфогенетических процессов, связанных с «омпактизацией бластомеров и образованием полости на стадии бластоцисты. г Ранее нами было показано, что аналогичным способом на 8-клеточные зародыши яыши действует непрерывное и модулированное электромагнитное излучение низкой гатенсивности (Межевикина и др., 1990; Koltun, Mezhevikina, 1993; Галат и др., 1998, 999; Межевикина и др., 2000). После кратковременной (15-30 мин) экспозиции в слабом магнитном поле происходят морфологические изменения, имитирующие процессы jaомпактизации. Такие структурные перестройки носят обратимый характер и сопровождаются повышением уровня свободного внутриклеточного кальция, что служит Дополнительным сигналом к активации процессов развития in vitro (Межевикина и др., ■000). Блокаторы кальциевых каналов, напротив, препятствует компактизации и j бразованию стадии бластоцисты in vitro (Аршавский, Межевикина, 1992).

В раннем эмбриогенезе млекопитающих управление этими процессами .осуществляется посредством входа кальция в клетки, либо путем его высвобождения из внутриклеточных депо. В наших исследованиях показано, что кальциевая сигнализация на стадии формирования бластоцисты генерируется через гидролиз инозитольных липидов путем IP сигнальной трансдукции. С помощью приемов ингибиторного анализа

основных компонентов IP сигнального пути, протеинлипазы С (PLC) и протеинкиназы С (РКС), оценен их вклад в процессы формирования полости бластоцисты (рис. 20 А, Б). А Б

а с ю s (1) fi ю О

500

с 300 s"

я 200-

Рис. 20. Влияние блокатора PLC -U73122 (А) и РКС - Bis II (Б) на объем полости зародыша мыши на стадии бластоцисты: 1 - контроль, 2, 3, 4 - 1.0, 5.0 и 10.0 мкМ блокаторов соответственно (n=10; Р <0.05).

0 12 24 36 48 Время, ч

12 24 36 48 60 Время, ч

В этих исследованиях показано, что при использовании блокаторов, подавляющий синтез PLC (U73122) и РКС (Bis II) происходит: 1) сдвиг по времени начала кавитации 2; доза-зависимое снижение скорости кавитации или же отсутствие таковой npj-культивировании зародышей с блокатором PLC, а также 3) задержка выхода бластоцис^, из z. pellucida. Потеря у зародышей способности выходить из z. pellucida на стади бластоцисты является существенным нарушением и свидетельствует о том, что такие бластоцисты в дальнейшем не смогут имплантироваться в матку и продолжать сво развитие.

В раннем эмбриогенезе зависимая от PLC IP сигнальная трансдукция регулируе^ осцилляции внутриклеточного кальция и деления бластомеров, причем роль РКС в эти;, процессах не столь однозначна. Однако судя по нашим данным, молекулы РКС и PLCj вовлечены в регуляцию ранних морфогенетических процессов при непосредственном участии полярных клеток ТБ. Увеличение численности клеток ТБ, а также активаций, морфогенетических процессов в средах с LIF свидетельствуют о том, что этот белок] может осуществлять свое регуляторное действие на ранних стадиях развития при посредничестве ионов кальция и IP сигнальной системы. Нельзя исключить влияние LIF на липидный матрикс плазматических мембран клеток ТБ (рис. 1-3), а также Ха/К-АТФ-азы и белки-аквапорины, формирующие специализированные каналы для быстроГО| движения молекул воды в межклеточное пространство на этапе формирования полости бластоцисты (Watson, Barcroft, 2001; Barckroft et al., 2003; Yamanaka et al., 2006).

Первичные колонии эмбриональных клеток как модель для исследования!

регуляторных факторов в период имплантации

Несмотря на огромный фактический материал, функции LIF в трофобласт-эндометриальных взаимодействиях изучены недостаточно. Прежде всего, это связано со сложностью культивирования клеток интактного эпителия матки, которые способны отвечать на сигналы гормонов, ростовых факторов и цитокинов, а также способны сами1 продуцировать эти регуляторные молекулы in vitro. В частности, стромальные клетки1

ыши после эксплантации в культуру могут спонтанно децидуализироваться и ырабатывать в большом количестве LIF (Arici et al., 1995). Показано также, что при обавлении рекомбинантного LIF в культуру плацентарного цитотрофобласта человека ктивируется синтез хорионического гормона (Nachtigall et al., 1996; Sawai et al., 1997), оторый продуцируют клетки ТБ вначале беременности. С учетом этих замечаний сследования механизмов LIF на клеточных культурах эндометрия становятся крайне роблематичными. Непонятно также, могут ли такие культуры точно или с большим риближением дублировать процессы имплантации in vitro без изменения активности рмонов и ростовых факторов, действующих в пределах репродуктивного тракта, редложенная нами экспериментальная модель предимплантационного развития ародышей мыши в условиях пролонгированного культивирования с рекомбинантным елком LIF включает взаимодействие клеток ТБ и ВКМ в составе единой клеточной опуляции - колонии, имитирующей процессы имплантации in vitro. Наблюдаемые при ормировании первичной колонии структурные и функциональные изменения ародышей: выход из z. pellucida, адгезия, рост и взаимодействие клеток ВКМ и ТБ тражают последовательность событий в организме матери во время имплантации.

В модельных экспериментах выявлено влияние регуляторного белка LIF на ормирование стадии бластоцисты и последующий рост бластоцист в виде первичных олоний эмбриональных клеток (рис. 17 г-е). Установлено, что первые признаки ифференцировки ВКМ по снижению активности ЭЩФ и Nanog появляются в ервичных колониях на 5-7 сутки культивирования. При увеличении длительности ультивирования и, следовательно, - увеличении размеров первичных колоний за счет реимущественного разрастания ТБ (рис. 18 Б) белок LIF не останавливает спонтанную ифференцировку ВКМ. Фактически это означает, что запуск процессов ифференцировки в тотипотентных клетках ВКМ происходит под влиянием окружения >. Схожие процессы происходят с клетками ВКМ в составе целого зародыша в ависимости от места их расположения и локальных взаимодействий с ТБ (Tam, Zhou, 996; Mitsui et al., 2003; Chazaud et al., 2006). Доказательством ранней детерминации пибласта у мышей служат Nanog-позитивные клетки ВКМ и клетки, продуцирующие елок Gata6, характерный для первичной внезародышевой эндодермы (Chazaud et al., 006).

Согласно нашим данным, в раннем эмбриогенезе LIF поддерживает свойства и исленность клеток ВКМ на высоком, но относительно постоянном уровне даже после ыхода бластоцист z. pellucida (рис. 18 А). Стимулирующее действие LIF на клетки ТБ рис. 18 Б) схоже с действием этого фактора на трофобластную линию клеток человека TR-8/Svneo (Horita et al., 2007). Клетки ТБ не только связывают LIF на своей оверхности (Charnock-Jones et al., 1994; Chen et al., 1999), но продуцируют этот белок ■амостоятельно (Stewart, Cullinan, 1997; Sun et al., 1998). Причем самый высокий уровень РНК и белка LIF обнаруживается в клетках ТБ, окружающих полость бластоцисты. Для роверки возможного влияния эндогенного LIF на рост и дифференцировку ВКМ мы спользовали технику микроинъекции (МИ) растворов рекомбинантного белка LIF(pro) в

полость бластоцисты (рис. 21). Контролем служили бластоцисты мышей, в полост которых вводили аналогичные объемы МСВ.

100

70-

среда МСВ без LIF

среда МСВ с UF

Рис. 21. Эффективность пролонгированного культивирования бластоцист мышей линии NMRI после микроинъекции в полость рекомбинантного белка LIF: ( >-0.65, ( )-0.33, ( )—0.15 и ( Н3.07 nr/нл в среде Виттена с 10 нг/мл L1F и без добавления LIF.

1 2

34567 1234567 Время культивирования, сутки После инъекции LIF в полость бластоцисты (0.07 - 0.65 пг/нл) активирование процессы выхода бластоцист из z. pellucida (80 % адгезивных бластоцист против 53 % контроле). Увеличение концентрации LIF в полости бластоцисты до 0.65 пг/н приводило к временной задержке зародышей в оболочках на одни сутки, но дальнейшем это не отражалось на эффективности развитии in vitro.

Таблица

Площадь первичных колоний эмбриональных клеток, развившихся из бластоцист мыше линии NMRI.

инъекция МСВ клетки изменение площади колонии (х104 мкм2)

48 ч 72 ч 96 ч

0.3 пг/нл LIF (опыт) ТБ 3.04±0.21и) 6.03±0.31ll) 8.18±0.48(l)

ВКМ 0.43±0.04w 0.48±0.05w 0.41±0.06(J)

без LIF (контроль) ТБ 2.01±0.41w 3.92±0.23ll) 5.92±0.21(1)

ВКМ 0.59±0.06w 0.57±0.05w 0.29±0.05(3)

Примечание. В опыте использовано 109 бластоцист, в контроле - 120 бластоцист. Площадь клеток в колониях рассчитывали по программе Photo М. - различия между двумя группами бластоцист по площади ТБ (/, = 3 9, Р < 0.01),<2) то же по площади клеток ВКМ через 48 и 72 ч ((, = 2.1, Р <0.06),т -через 96 ч культивирования (J, = 1.4, Р > 0.2).

Для LIF-инъецированных бластоцист добавление экзогенного белка LIF в ере; культивирования не было строго обязательным. В обоих вариантах сред (с LIF и без LIF после процедуры МИ обнаруживалась общая тенденция увеличения числа первичны колоний и их размеров при увеличении длительности культивирования (рис. 21, табл. 6).

Было установлено, что присутствие LIF в полости бластоцисты необходимо дл повышения пролиферативной активности ТБ и выживаемости клеток ВКМ (0.57±0.0 против 0.29±0.05*104 мкм2 в контроле). Это означает, что белок LIF, которы продуцируют клетки ТБ на стадии бластоцисты, может оказывать влияние по тип паракринного регулятора на ВКМ и одновременно действовать как аутокринны регулятор пролиферативной активности клеток ТБ. Мы не исключаем, что одним и наиболее вероятных механизмов LIF на стадиях формирования бластоцисты являете

;тивация Са2+-зависимого IP сигнального каскада, сопряженного с регулированием роцессов раннего морфогенеза (рис. 19,20)

Таким образом, представленные нами результаты свидетельствуют о том, что в рганизме матери зародыши мыши находятся под двойным контролем со стороны LIF. ни сами продуцируют этот белок для сохранения свойств и постоянной численности ieTOK ВКМ в составе бластоцисты и после выхода бластоцист из z. pellucida.

Эндометриальный белок LIF, продукция которого резко увеличивается у лекопитающих, когда их зародыши достигают стадии бластоцисты (Stewart et al., 1992; ogiagis et al., 1996; Cullinan et al. , 1996), с одной стороны, подготавливает матку к мплантации (Fouladin-Nashta et al., 2005; Kimber, 2005; Horita et al., 2007), с другой, как оказывают наши исследования, - стимулирует пролиферативную активность ТБ, что акже важно для успешной имплантации. Такая сложная система LIF-регуляции в аннем эмбриогенезе направлена на установление тесных взаимодействий между ТБ и КМ, а также синхронизацию эмбрионального и эндометриального развития.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненный нами комплексный анализ механизмов действия рекомбинантных елков LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии позволил впервые аглядно показать их полифункциональность, выявить разные клеточные мишени путем ценки влияния как на искусственные липидные мембраны, так и на разные типы мбриональных клеток, имеющих общее происхождение, такие как ЭСК и ранние ародыши мыши. Актуальность исследования разных клеточных мишеней LIF бусловлена потенциальной значимостью этого белка в решении проблем создания ффективных и безопасных для человека ЭСК-технологий, с одной стороны, и юлучением новых знаний о механизмах LIF-регуляции в период раннего эмбриогенеза «лекопитающих, с другой.

Широкий спектр эффектов рекомбинантного LIF при действии на эмбриональные стволовые клетки позволил обнаружить общие закономерности в регулировании фоцессов прохождения клеток по клеточному циклу, пролиферации и апоптоза. Наряду этим, выявлены различия в мембранных механизмах действия LIF в зависимости от родуцента (эукариоты-прокариоты), связанные, прежде всего, с каналоформирующей пособностью эукариотического белка LIF. При взаимодействии с липидным матриксом [еточных мембран такой белок формирует сложные каналы, зависящие от знака и еличины потенциала, ионной силы раствора, состава мембранных липидов. Полученные гам и результаты однозначно свидетельствуют о том, что белки LIF мыши из разных истем экспрессии обладают выраженной способностью прямого влияния на липидный атрикс без участия соответствующих рецепторов LIF-R и gpl30. Они схожим образом одифицируют мембранные липиды, увеличивая поверхностный потенциал и роводимость мембран. Важно подчеркнуть, что изменение физических параметров еточных мембран является существенным моментом в поддержании плюрипотентного отенциала стволовых клеток при их коммуникациях в колониях и в составе целого ародыша.

В данном исследовании сделаны первые шаги, позволяющие связать структурнь и функциональные изменения в ЭСК и в ранних зародышах с избыточно функциональной активностью LIF, которая, на наш взгляд, обусловлена бинарны механизмом действия этого фактора как на мембранные рецепторы, так и на липидны матрикс клеточных мембран. Такая пластичная система регуляции позволж активировать в стволовых и эмбриональных клетках различные цитоплазматичесм сигнальные каскады (JAK-STAT3, МАРК и др.), ответственные за активацию факторе транскрипции генных ансамблей, контролирующих пролиферацию и выживаемое! клеток в неблагоприятных условиях (дефицит трофических факторов, низк: концентрация свободного кальция в среде). И в то же время, LIF оказывает определение влияние на межклеточные коммуникации, существенные как для контроля клеточны делений, так и для сохранения плюрипотентности стволовых клеток. Таким образол благодаря наличию разных клеточных мишеней для LIF (специализированны сигнальные пути и влияние на физико-химические свойства плазматических мембра клеток), этот регуляторный белок активирует целый комплекс разны цитоплазматических факторов, необходимых для сохранения свойств ЭСК в культуре / vitro. Причем он действует только на те линии ЭСК животных и человека, которы выделены из клеток ВКМ, а не эпибласта, что свидетельствует о ключевой роли LIF именно период формирования стадии бластоцисты.

Наглядным свидетельством обнаруженного нами бинарного механизма действи LIF является его способность активировать процессы миокардиальной дифференцировк ЭСК мыши в условиях пролонгированного культивирования без образования ЭТ. Важн подчеркнуть, что в многочисленных источниках литературы LIF рассматривается ка фактор, блокирующий процессы спонтанной дифференцировки ЭСК, что позволяет эти клеткам сохранять свои свойства in vitro. Однако результаты экспериментальны исследований наглядно свидетельствуют о том, что LIF блокирует не дифференцировк ЭСК, а агрегацию этих клеток в эмбриоидные тела. В этом факте отражаютс принципиальные различия, поскольку при развитии ЭСК в колониях этот белок н подавляет дифференцировку в миокардиальном направлении, как и не препятствуе дифференцировке тотипотентных клеток зародыша in vitro в специализированные клетк трофобласта на стадии формирования бластоцисты и даже, напротив, активирует эт процессы.

Необходимо отметить, что исследование фундаментальных задач биофизики связанных с изучением мембранных и клеточных механизмов действия LIF в ранне эмбриогенезе, позволило нам выявить эффекты этого регуляторного фактора и на уровн клеточных популяций. Так, обнаружено, что поддержание клеточной пролиферации использованием LIF сопровождается накоплением клеток, несущих увеличенное числ копий хромосом, в которых локализованы гены - посредники LIF-сигнально транедукции (ген jak3 - хромосома 8 и ген stat3 - хромосома 11). Полученные данны свидетельствуют о наличии процессов клеточной селекции, направленных н преимущественное размножение клеточных клонов с относительно повышенно" чувствительностью к LIF. Поскольку в этих же хромосомах локализованы гены

бъединиц анафаза-промотирующего комплекса, участвующего в контроле сегрегации юмосом, можно ожидать, что такой отбор клеток с повышенной чувствительностью к IF способствует увеличению генетической нестабильности в популяциях ЭСК in vitro.

Выявление механизмов и направленности кариотипической эволюции ЭСК мыши, язанных с отбором стволовых клеток на повышенную чувствительность к ».одерживаемой LIF клеточной пролиферации, вносит существенный вклад в развитие ундаментальных представлений о возможностях и рисках использования таких [еточных культур в терапевтических целях. Очевидно, что выяснение эффектов на ювне клеточных популяций, связи регуляторов клеточной пролиферации, таких как IF, с накоплением генетически нестабильных клеточных клонов ЭСК, является щественным препятствием для широкого внедрения в практику так называемых биовакцин» - специально выращенных в культуре эмбриональных стволовых клеток, [ресованных патологически измененным органам.

Исследования мембранных, внутриклеточных и популяционных эффектов LIF огут способствовать в последующем разработкам методов уменьшения потенциальных исков, связанных с генетической нестабильностью ЭСК, а также пониманию еханизмов перехода плюрипотентных клеток в дифференцированное состояние.

ВЫВОДЫ

. При исследовании про- и эукариотического белков LIF мыши установлена высокая активность эукариотического LIF, обусловленная модификациями молекулы на посттрансляционном уровне, что позволяет активировать в колониях ЭСК мыши как процессы пролиферации, так и кардиомиоцитарной дифференцировки. Разработана и исследована экспериментальная модель эмбриональных кардиомиоцитов для изучения механизмов дифференцировки in vitro и быстрого скрининга кардиоактивных фармакологических препаратов.

. На модели бислойной липидной мембране выявлены поверхностно-активные свойства рекомбинантных белков LIF мыши из разных систем экспрессии (увеличение положительного заряда и проводимости мембраны). При этом эукариотический белок модулирует ионные каналы. Изменения параметров липидного бислоя липидного бислоя указывают на возможность влияния молекул LIF на внутриклеточную сигнализацию без участия белков рецепторного комплекса.

. Установлено, что способность LIF поддерживать ЭСК мыши в плюрипотентном недифференцированном состоянии реализуется in vitro путем подавления апоптоза, снижения в популяциях отношения S/(G2+M) и времени удвоения числа стволовых клеток. Сигналы LIF могут поступать в специальные зоны хроматина, контролирующие прохождение ЭСК по фазам клеточного цикла, что указывает на тесную связь между клеточными циклами и LIF-сигнальными путями, обеспечивающими пролиферативную активность стволовых клеток in vitro.

. Получены клоны ЭСК мыши с экспрессией плазмидного гена lif, на которых показано, что продукт экспрессии поддерживает плюрипотентность ЭСК и определяет

направление развития в «фиксированные» ЭТ как эндогенный регулятор без учасп экзогенного фактора LIF. Клоны ЭСК, продуцирующие LIF, представляют интерн как модели для изучения динамики переходных состояний от плюрипотентности дифференцировке.

5. Влияние LIF на ЭСК сопровождается накоплением клеточных клонов с увеличение копийностью хромосом 8, 11 и 19, в которых локализованы гены-посредники LI] зависимой индукции клеточной пролиферации {jak3, stat3 и jak2 соответственно Клональная селекция на повышенную чувствительность к LIF может сопровождать« увеличением генетической гетерогенности ЭСК в связи с колокализацией в эп хромосомах генов контроля сегрегации хромосом (в частности, субъединиц анафаз промотирующего комплекса). Повышению стабильности хромосомного аппарата ЭС может способствовать трансфекция генами, продукты которых являются ключевым посредниками действия LIF на генетический аппарат.

6. Установлено, что доимплантационный период развития у мышей проходит по контролем LIF. В раннем эмбриогенезе LIF оказывает стимулирующее действие i Са2+-зависимые морфогенетические процессы, связанные с образованием стади бластоцисты и выходом из z. pellucida. Выявлена избирательность LIF по отношенш к клеткам ТБ в составе многоклеточного зародыша.

7. Разработаны новые экспериментальные подходы для получения из бластоцист мыше с разным генотипом первичных колоний эмбриональных клеток с использование техники микроинъекции и пролонгированного культивирования с рекомбинантны белком LIF. В системе in vitro первичные колонии эмбриональных клето представляют интерес для изучения межклеточных взаимодействий, а также являютс источниками для получения новых линий ЭСК мыши.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзоры

1. Mezhevikina L.M., Petrova L.M., Borisova М.Р., Seraya O.Y., Fesenko E.E. Effects о recombinant Leukemia Inhibitoiy Factor (LIF) on functional status of mouse embryoni stem cells. Stem Cells: The Hormonal Regulation of Pluripotency and Embryogenesis / e Crag Atwood. Vienna: INTECH - Open Access Publisher, 2011. P. 79-90.

В журналах, рекомендуемых ВАК РФ

2. Березовская О.П., Межевикина JI.M., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранни

эмбрионов линейных мышей // Онтогенез. - 1986,- Т. 17.- № 5. - С. 553-555.

3. Межевикина JI.M., Колтун C.B., Горюшкин Г.Е., Тигранян Р.Э. Действие ЭМИ СВ

на морфофункциональное состояние зародышей лабораторных мышей // Биофизика. 1990. - Т. 35. - вып. 5.- С. 813-816.

4. Аршавский И.А., Межевикина JI.M. К анализу причин и механизмов, определяющи

возникновение индивидуального развития животных, начиная с зиготы (рол цитоскелета) И Биофизика. - 1992. - Т. 37. - вып. 5. - С. 969-982.

5. Межевикина JI.M., Каранова М.В. Использование антифризных гликопротеинов пр

замораживании в жидком азоте ранних эмбрионов мыши // Известия Академии Hay (серия биологическая). - 1995. - № 2. - С. 172-177.

Каранова М.В., Межевикнна Л.М., Петропавлов H.H. Исследование криозащитных свойств антифризных гликопротеинов из беломорской трески Gadus morhua при низкотемператуном замораживании ранних эмбрионов мыши // Биофизика. - 1995. -Т. 40.-вып. 6.-С. 1341-1347.

Сахарова Н.Ю., Малашенко A.M., Межевикнна JI.M., Лепихов К.А., Фиалковская JI.A. Влияние мутантных генов Та, Ra, Sd на ранний эмбриогенез мышей // Онтогенез. - 1996. - Т. 27. - № 3. - С. 232-235.

Сахарова Н.Ю., Межевикииа Л.М., Лепихов К.А. Эмбриональная гибель мышей с мутантными генами Та, Ra, Sd, N, Sp // Генетика. - 1994. - Т. 30. - С. 140-145. Галат В.В., Ротт H.H., Межевикнна Л.М. Работы лаборатории биофизики клетки по использованию методов криоконсервации и биологии развития для сохранения биоразнообразия // Онтогенез. - 1998. - Т. 29. - № 1.- С. 66-69. . Галат В.В., Межевикнна Л.М., Зубин М.Н., Лепихов К.А., Храмов Р.Н., Чайлахян Л.М. Действие миллиметровых волн на раннее развитие зародышей мышей и морских ежей // Биофизика. - 1999. - Т. 44. - вып. 1. - С. 137-140. 1. Межевикнна Л.М., Храмов Р.Н., Лепихов К.А. Имитация кооперативного эффекта развития в культуре ранних зародышей мыши после облучения электромагнитными волнами миллиметрового диапазона// Онтогенез. - 2000. - Т. 31. - № 1. - С. 27-31. . Серышева В.В., Борисова М.П., Межевикнна Л.М., Полтавцева P.A., Сухих Г.Т. Действие лейкемияингибирующего фактора на бислойную липидную мембрану // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134. - № 12. - С. 620-623.

. Сахарова Н.Ю., Вихлянцева Е.Ф., Малашенко A.M., Межевикнна Л.М. Повышение выживаемости ранних зародышей мышей после криоконсервации с помощью предварительного воздействия на них повышенной температуры // Цитология. - 2004. -Т. 46.-№10.-С. 852-854.

4. Глазко Т.Т., Межевикнна Л.М., Бойко A.B. Кариотипическая гетерогенность эмбриональной стволовой клеточной линии мыши ES R1 // Цитология. - 2004. - Т. 46. - № 9. - С. 780-782.

5. Глазко Т.Т., Межевикнна Л.М., Бойко A.A., Фесенко Е.Е. «Цепная» кариотипическая эволюция эмбриональных стволовых клеток линии R1 in vitro // Цитология. - 2005. - Т. 47. - К» 8. - С. 679-685.

6. Петрова P.P., Межевикнна Л.М., Фесенко Е.Е. Положительный ответ дифференцированных эмбриональных стволовых клеток с сократительной активностью на действие изопротеренола // Онтогенез. - 2005. - Т. 36. - № 5. - С. 389390. . '

7. Межевикнна Л.М., Федорова В.В., Капралова И.В., Фесенко Е.Е Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши в среде с рекомбинантным цитокином LIF// Онтогенез. - 2006. - Т. 37. - № 1. - С. 55-62.

8. Петрова P.P., Межевикнна Л.М., Фесенко Е.Е. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты с помощью цитокина LIF (Leukemia Inhibitory Factor) // Биофизика. - 2006. - Т. 51. - вып. 2. - С. 310-315.

9. Петрова P.P., Межевикнна Л.М., Калошин A.A. Экспрессионная система для получения рекомбинантного белка со свойствами цитокина LIF в клетках линии Cos-1 // Биотехнология. - 2006. - № 5. - С. 3-11.

0. Осипенко М.А., Петрова P.P., Межевикнна Л.М., Жерелова О.М. Влияние ионов свободного кальция на пролиферативную активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток в культуре in vitro // Цитология. - 2006. - Т. 48. - № 9. - С. 786-787.

1. Межевикнна Л.М., Капралова И.В., Фесенко Е.Е. Стимулирующее действие рекомбинантного цитокина LIF на бластоцисты мыши в период имплантации // Биомедицинская химия. - 2006. - Т. 52. - вып. 6. - С. 620-626.

22. Осипенко М.А., Жерелова О.М., Петрова P.P., Межевикина JI.M., Фесенко E.I Влияние ионов свободного кальция на пролиферативную активность жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток мыши // Доклады АН. - 2007. Т. 412. -№ 1. - С. 123-125.

23. Межевикина JI.M, Капралова И.В., Храмцова Е.А., Федюкин B.C. О возможност использования рекомбинантного белка LIF (Leukemia Inhibitory Factor) a¡ повышения выживаемости зародышей млекопитающих в период имплантации матку // Иммунология. - 2007. - Т. 9. - № 4. - С. 146-147.

24. Осипенко М.А., Межевикина JI.M., Крастс И.В., Новиков В.В., Фесенко Е. Влияние «нулевого» магнитного поля на рост эмбриональных клеток и ранни зародышей мыши в культуре in vitro //Биофизика. - 2008. - Т. 53. - вып. 4. - С. 70 712.

25. Лобанок Е.С., Белянович Л.М., Межевикина J1.M., Волотовский И.Д., Фесенко Е. Влияние фактора стволовых клеток (SCF) на структурно-функциональное состояни мышиных эмбриональных стволовых клеток // Биофизика. - 2008. - Т. 53. - вып. 4. - ( 646-654.

26. Лобанок Е.С., Межевикина JI.M., Белянович Л.М., Петрова P.P., Василевич И.Б Волотовский И.Д., Фесенко Е.Е. Влияние цитокина LIF (Leukemia Inhibitory Facto на функциональное состояние эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1 Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54. - вып. 5. - С. 570-576.

27. Борисова М.П., Межевикина Л.М., Петрова P.P., Фесенко Е.Е. Действие фактора LI на липидный бислой // Биофизика. - 2009. - Т. 54. - вып. 4. - С. 688-692.

28. Смирнов А.А, Сахарова Н.Ю., Межевикина Л.М., Фиалковская Л.А., Стасенко Д.] Эмбриональное развитие мышей линии C57BL/6-Tgn(ACTbEGFP)10sb/J, несущи трансген улучшенного зелёного флуоресцирующего белка EGFP // Генетика. - 2011. Т. 47.-№6. -С. 821-827.

В научных сборниках и других изданиях

29. Ситько С.А., Межевикина Л.М., Храмов Р.Н., Лепихов К.А. Кооперативный эффек развития зародышей мыши в культуре in vitro // Физика живого. - 1994. - № 1. - С. 9 15.

30. Межевикина Л.М., Мануйлова Е.С., Попов В.И., Савченкова И.П. Физико химические аспекты роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток условиях культуры. Консервация генетических ресурсов. Пущино: ОНТИ ПЦН PAI 1998. С. 182-186.

31. Капралова И.В., Серышева В.В., Петрова P.P., Межевикина Л.М. Действие цитокин LIF на развитие доимплантационных зародышей мыши in vitro. Основы современног развития в аграрной области знания. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологи У А АН, 2002. С. 67-72.

32. Межевикина Л.М., Серышева В.В., Борисова М.П. Эмбриональные стволовы клетки в биотехнологических исследованиях (роль цитокина ЛИФ) // Биофизик живой клетки. - 2003. - Т. 7. - С. 103-106.

33. Межевикина Л.М., Серышева В.В., Капралова И.В., Петрова P.P. Влияние цитокин LIF (Leukemia Inhibitory Factor) на развитие доимплантационных зародышей мыши условиях in vitro. Горизонты биофизики. От теории к практике. Пущино: ОНТИ ПН РАН, 2003. С. 240-244.

34. Глазко Т.Т., Бойко A.A., Межевикина Л.М., Серышева В.В. Популяци эмбриональной стволовой клеточной линии мыши R1 и их кариотипичесю гетерогенность. Факторы экспериментальной эволюции организмов / под редакцие акад. Н.В. Ройка. Киев: Аграрна Наука, 2003. С. 33-37.

35. Глазко Т.Т., Межевикина Л.М., Бойко A.B. Кариотипическая гетерогенност эмбриональной стволовой клеточной линии ES R1 // Клеточные культуры. - 2005. вып. 20. - С. 19-25.

. Сахарова Н.Ю., Межевикина Л.М., Вихлянцева Е.Ф., Суханова Т.В., Смирнов А.А., Поцелуева М.М., Шубина B.C., Малашенко A.M. Влияние ДМСО на жизнеспособность зародышей мутантных мышей Kitw'Y в условиях in vitro и после криоконсервации // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С. 221-223.

. Борисова М.П., Межевикина JT.M., Петрова P.P. ЛИФ как порообразующий белок. Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2009, с. 20-24.

. Борисова М.П., Межевикина JI.M., Петрова P.P. Взаимодействие цитокина LIF с липидным матриксом мембран // Компьютерные исследования и моделирование. -2010.-Т. 2.-№1.-С. 43-49.

. Храмцова Е.А., Капралова И.В., Межевикина JI.M. Предсказание имплантационного потенциала эмбрионов на основе морфологической оценки // Компьютерные исследования и моделирование. - 2010. - Т. 2. - № 1. - С. 111-116.

. Фесенко Е.Е., Межевикина Л.М., Осипенко М.А., Гордон PJL. Влияние экранирования геомагнитного поля на эмбриональное развитие. Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования живых систем. Минск: Издательский центр БГУ, 2010. С. 307-309.

. Смирнов А.А., Сахарова Н.Ю., Межевикина JI.M., Фиалковская JI.A., Малашенко А.А. Использование мышей с генотипом улучшенного зеленного флуоресцентного белка для изучения раннего развития млекопитающих. Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Боровск: ИНИИФБиП, 2010. С. 267-269.

. Крастс И.В., Осипенко М.А., Межевикина JI.M., Фесенко Е.Е. Малогабаритный С02-инкубатор. Опыт создания // Приборы и техника эксперимента. - 2010. - № 1. - С. 147-151.

. Храмцова Е.А., Капралова И.В., Межевикина JI.M. Роль клеток трофобласта при действии осмотического шока. Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования живых систем. Минск: Издательский центр БГУ, 2010. С. 148-150.

. Koltun S.V., Mezhevikina L.M. Effect of radiofrequency electromagnetic radiation on the morphological state of mice embryos // Microwaves Medicine. - 1993. - P. 297-300.

. Galat V.V., Mezhevikina L.M., Chailakhyan L.M., Arslan A. Realization of genetic information by microsurgency methods. Gene diagnostics, gene therapy, and informational in Biotechnology. Ankara: Biotech., 1995. P. 167-174.

6. Karanova M.V., Andreev A.A., Petropavlov N.N., Mezhevikina L.M. The used of natural cryoprotectors for cryopreservation // Cryo-Letters. - 1998. - № 3. - P. 66-69.

7. Petrova R.R., Mezhevikina L.M., Osipenko M.A., Fesenko E.E. The induction of differentiation of mouse embryonic stem cells in conditions of prolonged cultivation with LIF (leukemia inhibitory factor) recombinant protein. Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union - Russian Federation Perspectives, 2007. P. 29-30.

8. Osipenko M.A., Mezhevikina L.M., Petrova R.R. Role of calcium ions in regulation of growth of mouse embryonic stem cells in vitro. Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union - Russian Federation Perspectives, 2007. P. 2-4.

9. Lobanok E.S., Belyanovich L.M., Vasilevich I.B., Volotovski I.D., Mezhevikina L.M., Petrova R.P., Fesenko E.E. The influence of cytokine LIF on the functional state of mouse embryonic stem cells // Вести HAH Беларуси. - 2009. - № 1. - P. 79-82.

0. Fesenko E.E., Mezhevikina L.M., Osipenko M.A., Gordon R.Ya., Khutzian S.S. Effect of the «Zero» Magnetic Field on the Early Embryogenesis in Mice // Electromagnetic of Biology and Medicine. - 2010. - V. 29. - P. 1-8.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АК - апоптозные клетки. АРЦР - асинхронное расщепление центромерных районов хроматид БЛМ - бислойная липидная мембрана ВКМ - клетки внутренней клеточной массы

ДФГТ - 1,6-дифенил-1,3-гексатриен

(липофильный зон)

ДЯ - двуядерные клетки

ИП - изопротеренол

ИФА - иммуноферментный анализ

КМЯ - клети с микроядрами

МСВ - модифицированная среда Виттена

МИ - микроинъекция

ПЭФ - первичные эмбриональные

фибробласты

РТ - робертсоновская транслокация

СК - стволовые клетки

ТБ - клетки трофобласта

ХА - хромосомные аберрации

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЭТ - эмбриоидные тела

ЭЩФ - эндогенная щелочная фосфатаза

ВМР4 - морфогенетический белок 4 (Bone morphogenetic Protein 4) FGFb - фактор роста фибробластов р gpl30 - трансмембранный переносчик LIF IL-6 - интерлейкин-6

JAK -Янус киназа (Janus Associate tyrosine Kinase)

LIF - лейкемия ингибирующий фактор LIF-R - рецептор LIF

МАРК - сигнальный каскад Mitogen

Activated Protein Kinase

PBS - фосфатно-солевой буфер

PI - фосфоинозитольная сигнальная

система

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа РКС - протеинкиназа С PLC -фосфолипаза С

STAT3 - транскрипционный фактор (Signal Transducer and Activator of Transcription-3)

Wnt - сигнальный путь через ингибитор BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime) фермента GSK3 (Glycogen Synthase Kinase)

Подписано в печать:

20.09.2011

Заказ № 5967 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Межевикина, Людмила Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Соматические и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)

1.1.1. Способы выделения ЭСК из ранних зародышей

1.1.2. Морфофункциональные характеристики ЭСК мыши

1.1.3. Поддержание плюрипотентного потенциала ЭСК in vitro

1.1.4. Факторы, определяющие плюрипотентный статус ЭСК

1.1.5. ЭСК приматов и человека

1.1.6. Спонтанная дифференцировка в эмбриоидные тела (ЭТ)

1.1.7. Индукция дифференцировки в ЭСК in vitro

1.2. Цитокины семейства интерлейкина-б (IL-6)

1.2.1. Механизмы действия на стволовые клетки

1.2.2. Свойства цитокина LIF

1.2.3. Молекулярная структура LIF

1.2.4. Изоформы LIF, взаимодействие с мембранными рецепторами

1.2.5. Молекулярные механизмы LIF

1.2.6. Пути передачи сигнала LIF в стволовые клетки

1.3. Функции LIF в эмбриогенезе млекопитающих

1.3.1. Участие в процессах имплантации

1.3.2. Механизмы действия LIF в трофобласт-эндометриальной ^ области

1.3.3. Влияние LIF на эмбриональное развитие

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования

2.2. Клонирование кДНК гена lif мыши

2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.2. Определение последовательности гена lif

2.3. Получение LIF мыши в бактериальных системах экспрессии

2.3.1. Белковый электрофорез в ПААГ

2.3.2. Диализ рекомбинантного белка L1F

2.3.3. Иммуноблоттинг (WESTERN-блот)

2.3.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.4. Трансфекция клеток линии Cos-1 плазмидным вектором со встроенным геном /г/мыши

2.5. Трансфекция ЭСК мыши плазмидным геном /г/мыши

2.5.1. Выявление мРНК LIF в трансфицированных ЭСК, зародышах и ^ тканях матки

2.5.2. ОТ ПЦР и подбор праймеров

2.5.3. Режим ОТ ПЦР

2.5.4. Оценка продуктов ПЦР-амплификациН'

2.6. Выделение и культивирование зародышей мыши

2.6.1. Оценка жизнеспособности in vitro

2.6.2. Выделение из бластоцист мышей эмбриональных клеток (ЭК)

2.6.3. Первичные эмбриональные фибробласты (ПЭФ) мыши

2.7. Культивирование ЭСК

2.8. Оценка плюрипотентного потенциала ЭСК

2.8.1. Морфологический критерий

2.8.2. Пролиферативная и метаболическая активность

2.8.3. Выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ)

2.8.4. Иммуноцитохимический анализ

2.9. Оценка структурно-функционального состояния ЭСК

2.9.1. Определение вязкости плазматических мембран

2.9.2. Скорость потребления кислорода и содержание АТФ

2.9.3. Распределение ЭСК по фазам клеточного цикла

2.9.4. Исследование вне- и внутриклеточного кальция и фосфоинозитольной сигнальной системы (PI)

2.10. Цитогенетический анализ

2.11. Индукция дифференцировка ЭСК мыши в кардиомиоциты

2.12. Микроинъекция (МЙ) растворов LIF в полость бластоцисты

2.13. Электрофизиологические на бислойных липидных мембранах (Б JIM)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Рекомбинантные белки LIF мыши из бактериальных и эукариотических продуцентов

3.1.1. Экспрессия гена /г/мыши в бактериальных клетках

3.1.2. Продукция рекомбинантного LIF мыши в эукариотических клетках линии Cos

3.2. Сравнение биологической активности LIF из разных систем экспрессии

3.2.1. Механизмы действия LIF на клеточные мембраны

3.2.2. Влияние LIF на морфофункциональные свойства ЭСК в системе t ^ vitro

3.2.3. Апоптоз и клеточные циклы ЭСК

3.3. LIF-сигнальная трансдукция в ЭСК

3.3.1. Роль ионов кальция в процессах пролиферации ЭСК мыши и ^ человека

3.3.2. Структурно-функциональные изменения в ЭСК мыши при ^ совместном действии LIF и фактора стволовых клеток (SCF).

3.3.3. Индукция дифференцировки в кардиомиоциты

3.4. Кариотипическая эволюция ЭСК мыши in vitro

3.4.1. Эндогенный LIF и его значение для поддержания плюрипотентнь ^ свойств ЭСК

3.4.2. Нарушение хромосомного баланса

3.5. Оценка роли LIF в раннем эмбриогенезе

3.5.1. Влияние LIF развитие зародышей мыши in vitro

3.5.2. Значение внутриклеточного кальция и фосфаинозитольной (PI) ^^ сигнальной системы на ранних стадиях развития

3.5.3. Первичные колонии ЭК как модель для исследования ^ gg регуляторных факторов в период имплантации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе"

Сложность функционирования внутриклеточных систем, участвующих в передаче сигналов клеточного деления и/или клеточной дифференцировки, интерференция между ними являются одной из центральных проблем клеточной биологии и медицины. Для изучения таких сложных систем необходима разработка новых экспериментальных моделей, позволяющих контролировать последовательные этапы передачи сигнала от первого контакта с индуктором до фенотипического проявления его эффектов. Исследование механизмов действия фактора, ингибирующего лейкемию, -LIF (Leukemia Inhibitory Factor) на культурах эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и в раннем* эмбриогенезе мышей позволяет приблизиться к формированию таких моделей, и выявить некоторые этапы реализации его сигнальных эффектов. Актуальность таких исследований несомненна как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку LIF является одним из ключевых цитокинов семейства интерлейкинов (IL-6), обеспечивающих согласованность иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на действие воспалительного и эмоционального стресса. Наибольшее распространение LIF получил как фактор, поддерживающий ЭСК животных и человека в недифференцированном плюрипотентном состоянии, а также в терапии онкологических заболевании и репродуктивной медицине (Gunawardana et al., 2003; Guney et al., 2008; Novatny et ai., 2009; Aghaj anova, 2010).

В настоящее время известно, что для передачи сигнала LIF необходимо взаимодействие лиганда с LIF-рецептором (LIF-R) и трансмембранным переносчиком - гликопротеином gpl30 с последующей активацией внутриклеточных сигнальных каскадов, регулирующих клеточный рост, размножение и дифференцировку разных типов клеток. В ЭСК мыши наиболее изученными являются JAK-STAT3 Ras-независимый и МАРК Ras-зависимый сигнальные пути (Huyton et al., 2007; Skiniotis et al., 2008 Jeong et al., 2007; Niwa et al., 2009). В одном случае LIF поддерживает стволовые клетки в недифференцированном плюрипотентном состоянии (JAK-STAT3), в другом, напротив, его действие направлено на активацию процессов цитодифференцировки (МАРК-путь). Установлена прямая корреляция между высокой активностью транскрипционного фактора STAT3 и плюрипотентным потенциалом ЭСК мыши in vitro (Niwa et al., 1998; Raz et al., 1999). Известны и другие молекулярно-генетические системы, тесно связанные с поддержанием плюрипотентных свойств ЭСК in vitro. К ним относятся, в частности, ВМР4 (Ying et al., 2003; Qi et al., 2004), Wnt-1 (Ogawa et al., 2006; Wagner et al., 2010) и PI3K сигнальные пути (Jirmanova et'al., 2002; Watanabe et al., 2006). Результатом действия LIF на ЭСК мыши является усиление экспрессии транскрипционных факторов плюрипотентности Oct3/4 nNanog (Hamazaki et al., 2006; Niwa et al., 2009). Возможно также и независимое от LIF прямое влияние 1АК2-сигнала на хроматин с последующей активацией в ЭСК мыши STAT3 и Nanog (Griffiths et al., 2011).

Множественность путей LIE-регуляции стволовых клеток наглядно продемонстрирована в работах на мутантных линиях ЭСК мыши с нокаутами по генам основных компонентов передачи сигнала lif-/-, lifr-/-, gp!30-/-, stat3-/- (Ware et al., 1995; Li et al., 1995; Yoshida et al., 1996; Dani et al., 1998). При этом для стволовых клеток, у которых отсутствуют рецепторные белки LIF-R и/или gpl30, как и для клеток дикого типа, требуется присутствие LIF в среде культивирования для поддержания их в плюрипотентном состоянии (Takeda et al., 1997; Dani et al., 1998). Однако в условиях in vivo эмбрионы мышей с дефицитом LIF и основных посредников этого лиганда при действии на клетки (LIF-R, gpl30, STAT3, Oct3/4 и Nanog) могут развиваться в организме приемных матерей, вплоть до рождения (Boiani, Scholer, 2005).

Пока точно не установлено, какие из LIF-сигнальных путей доминируют в процессах поддержания плюрипотентного потенциала ЭСК и эмбриональных клеток в составе зародыша in vitro, а какие in vivo. Остаются до сих пор недостаточно исследованными последствия контакта LIF с его 8 рецепторами и липидным матриксом клеточных мембран. Не выявлены различия в эффектах LIF при экзогенном и/или эндогенном поступлении сигналов в цитоплазму, функциональная полидоменность этого белка при действии на темпы клеточных делений и на генетический аппарат клеток в целом.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования состояла в сравнительном изучении молекулярных и клеточных механизмов передачи сигнала LIF в эмбриональных стволовых клетках и в раннем эмбриогенезе мышей для установления роли этой сигнальной системы и характера ее влияния на процессы пролиферации, дифференцировки и поддержания кариотипической стабильности стволовых клеток in vitro.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку биологической активности рекомбинантных белков LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии для выяснения возможных эффектов посттрансляционных модификаций белков при их взаимодействии с бислойными липидными мембранами (БJIM).

2. Выявить эффективность действия LIF в зависимости от его продуцента (прокариоты — эукариоты) на процессы пролиферации и/или дифференцировки ЭСК мыши, а также оценить характер влияния LIF на активность митохондриальных дегидрогеназ, прохождение клеточного цикла и выход стволовых клеток в апоптоз.

3. Получить /¿/-трансфицироваиные клоны ЭСК мыши с экспрессией белка LIF и установить роль эндогенного LIF в поддержании плюрипотентных свойств, колониеобразования и способности ЭСК дифференцироваться в эмбриоидные тела.

5. Разработать экспериментальные подходы для индукции миокардиальной дифференцировки ЭСК мыши, оценить перспективы использования эмбриональных кардиомиоцитов для тестирования кардиоактивных фармакологических препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Межевикина, Людмила Михайловна

ВЫВОДЫ

1. При исследовании про- и эукариотического белков LIF мыши установлена высокая активность эукариотического LIF, обусловленная модификациями молекулы на посттрансляционном уровне, что позволяет активировать в колониях ЭСК мыши как процессы пролиферации, так и кардиомиоцитарной дифференцировки. Разработана и исследована экспериментальная модель эмбриональных кардиомиоцитов для изучения механизмов дифференцировки in vitro и быстрого скрининга кардиоактивных фармакологических препаратов.

2. На модели бислойной липидной мембране выявлены поверхностноI активные свойства рекомбинантных белков LIF мыши из разных систем экспрессии (увеличение положительного заряда и проводимости мембраны). При этом эукариотический белок модулирует ионные каналы. Изменения параметров липидного бислоя указывают на возможность влияния молекул LIF на внутриклеточную сигнализацию без участия белков рецепторного комплекса. t

3. Установлено, что способность LIF поддерживать ЭСК мыши в плюрипотентном недифференцированном состоянии реализуется in vitro путем подавления апоптоза, снижения в популяциях отношения S/(G2+M) и времени« удвоения числа стволовых клеток. Сигналы LIF могут поступать в специальные зоны хроматина, контролирующие прохождение ЭСК по фазам клеточного цикла, что указывает на тесную связь между клеточными циклами и LIF-сигнальными путями, обеспечивающими пролиферативную активность стволовых клеток in vitro.

4. Получены клоны ЭСК мыши с экспрессией плазмидного гена lif, на которых показано, что продукт экспрессии поддерживает плюрипотентность ЭСК и определяет направление развития в «фиксированные» ЭТ как эндогенный регулятор без участия экзогенного фактора LIF. Клоны ЭСК, продуцирующие LIF, представляют интерес как модели для изучения динамики переходных состояний от плюрипотентности к дифференцировке.

5. Влияние LIF на ЭСК сопровождается» накоплением клеточных клонов с увеличенной копийностью хромосом 8, 11 и 19, в которых локализованы гены-посредники LIF-зависимой индукции клеточной пролиферации.(Jak3, stat3 и jak2 соответственно). Клональная селекция на повышенную чувствительность к LIF может сопровождаться увеличением генетической гетерогенности ЭСК в связи с колокализацией в этих хромосомах генов контроля сегрегации хромосом (в частности, субъединиц анафаза-промотирующего комплекса). Повышению стабильности хромосомного аппарата ЭСК может способствовать трансфекция генами, продукты которых являются ключевыми посредниками действия LIF на генетический аппарат.

6. Установлено, что доимплантационный период развития у мышей проходит под контролем LIF. В раннем эмбриогенезе LIF оказывает стимулирующее действие на Са2+ -зависимые морфогенетические процессы, связанные с образованием стадии бластоцисты и выходом из z. pellucida. Выявлена избирательность LIF по отношению к клеткам ТБ в составе многоклеточного зародыша.

7. Разработаны новые экспериментальные подходы для получения из бластоцист мышей с разным генотипом первичных колоний эмбриональных клеток с использованием техники микроинъекции и пролонгированного культивирования с рекомбинантным белком LIF. В системе in vitro первичные колонии эмбриональных клеток представляют интерес для изучения межклеточных взаимодействий, а также являются источниками для получения новых линий ЭСК мыши.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненный нами комплексный анализ механизмов действия рекомбинантных белков LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии позволил впервые наглядно показать их полифункциональность, выявить разные клеточные мишени путем оценки' влияния как на искусственные липидные мембраны, так и на разные типы эмбриональных клеток, имеющих общее происхождение, такие как ЭСК и ранние зародыши мыши. Актуальность исследования разных клеточных мишеней LIF обусловлена потенциальной значимостью этого белка в решении проблем создания эффективных и безопасных для человека ЭСК-технологий, с одной стороны, и получением новых знаний о механизмах LIF-регуляции в период раннего эмбриогенеза млекопитающих, с другой.

Широкий спектр эффектов рекомбинантного LIF при действии на эмбриональные и стволовые клетки позволил обнаружить общие закономерности в регулировании процессов прохождения клеток по клеточному циклу, пролиферации и апоптоза. Наряду с этим, выявлены различия в мембранных механизмах действия LIF в зависимости от продуцента (эукариоты-прокариоты), связанные, прежде всего, с каналоформирующей способностью эукариотического белка LIF. При взаимодействии с липидным матриксом клеточных мембран такой белок формирует сложные каналы, зависящие от знака и величины потенциала, ионной силы раствора, состава мембранных липидов. Полученные нами результаты однозначно свидетельствуют о том, что белки LIF мыши из разных систем экспрессии обладают выраженной способностью прямого влияния на липидный матрикс без участия соответствующих рецепторов LIF-R и gpl30. Они схожим образом модифицируют мембранные липиды, увеличивая поверхностный потенциал и проводимость мембран. Важно подчеркнуть, что изменение физических параметров клеточных мембран является существенным моментом в поддержании плюрипотентного потенциала стволовых клеток при их коммуникациях в колониях и в составе целого зародыша.

В данном исследовании сделаны первые шаги, позволяющие связать структурные и функциональные изменения в ЭСК и в ранних зародышах с избыточной функциональной активностью LIF, которая, на наш взгляд, обусловлена бинарным механизмом действия этого фактора как на мембранные рецепторы, так и- на липидный матрикс клеточных мембран. Такая пластичная система регуляции позволяет активировать в стволовых и эмбриональных клетках различные цитоплазматические сигнальные каскады (JAK-STAT3, МАРК и др.), ответственные за активацию факторов транскрипции генных ансамблей, контролирующих пролиферацию и выживаемость клеток в неблагоприятных условиях (дефицит трофических факторов, низкая концентрация свободного кальция в среде). И в то же время, LIF оказывает определенное. влияние на межклеточные коммуникации, существенные как для контроля клеточных делений, так и для сохранения, плюрипотентности стволовых клеток. Таким образом, благодаря наличию разных клеточных мишеней для LIF (специализированные сигнальные пути и влияние на физико-химические свойства плазматических мембран клеток), этот регуляторный белок активирует целый комплекс разных цитоплазматических факторов, необходимых для сохранения свойств ЭСК в культуре in vitro. Причем он действует только на те линии ЭСК животных и человека, которые выделены из клеток ВКМ, а не эпибласта, что свидетельствует о ключевой роли LIF в период формирования стадии бластоцисты.

Наглядным свидетельством обнаруженного нами бинарного механизма действия LIF является его способность активировать процессы миокардиальной дифференцировки ЭСК мыши в условиях пролонгированного культивирования без образования ЭТ. Важно подчеркнуть, что в многочисленных источниках литературы LIF рассматривается как фактор, блокирующий процессы спонтанной

196 дифференцировки ЭСК, что позволяет этим клеткам сохранять свои свойства in vitro. Однако результаты экспериментальных исследований наглядно свидетельствуют о том, что LIF блокирует не дифференцировку ЭСК, а агрегацию этих клеток в эмбриоидные тела. В этом факте отражаются принципиальные различия, поскольку при развитии ЭСК в колониях этот белок не подавляет дифференцировку в миокардиальном направлении, как и не препятствует дифференцировке тотипотентных клеток зародыша in vitro в специализированные клетки трофобласта на стадии формирования бластоцисты и даже, напротив, активирует эти процессы.

Необходимо отметить, что исследование фундаментальных задач биофизики, связанных с изучением мембранных и клеточных механизмов действия LIF в раннем эмбриогенезе, позволило нам выявить эффекты этого регуляторного фактора и на уровне клеточных популяций. Так, обнаружено, что поддержание клеточной пролиферации в среде с использованием LIF сопровождается накоплением клеток, несущих увеличенное число копий хромосом, в которых локализованы гены — посредники LIF-сигнальной трансдукции (ген jak3 - хромосома 8 и ген stat3 - хромосома 11). Полученные данные свидетельствуют о наличии процессов клеточной селекции, направленных на преимущественное размножение клеточных клонов с относительно повышенной чувствительностью к LIF. Поскольку в этих же хромосомах локализованы гены субъединиц анафаза-промотирующего комплекса, участвующего в контроле сегрегации хромосом, можно ожидать, что такой отбор клеток с повышенной чувствительностью к LIF способствует увеличению генетической нестабильности в популяциях ЭСК in vitro.

Выявление механизмов и направленности кариотипической эволюции ЭСК мыши, связанных с отбором стволовых клеток на повышенную чувствительность к поддерживаемой LIF клеточной пролиферации, вносит существенный вклад в развитие фундаментальных представлений о возможностях и рисках использования таких клеточных культур в терапевтических целях. Очевидно, что выяснение эффектов на уровне

197 клеточных популяций, связи регуляторов клеточной пролиферации, таких как LIF, с накоплением генетически нестабильных клеточных клонов ЭСК, является существенным условием для широкого внедрения в практику так называемых «биовакцин» - специально выращенных в культуре эмбриональных стволовых клеток, адресованных патологически измененным органам.

Исследования мембранных, внутриклеточных и популяционных эффектов LIF могут способствовать в последующем разработкам методов уменьшения потенциальных рисков, связанных с генетической нестабильностью ЭСК, а также пониманию механизмов перехода плюрипотентных клеток в дифференцированное состояние.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Межевикина, Людмила Михайловна, Пущино

1. Аршавский И.А., Межевикина Л.М. К анализу причин и механизмов, определяющих возникновение индивидуального развития животных, начиная с зиготы (роль цитоскелета). Биофизика, 1992, т. 37, вып. 5, с. 969-982.

2. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов линейных мышей. Онтогенез, 1986, т. 17, №5, с.553-555.

3. Борисова М.П., Межевикина Л.М., Петрова P.P., Фесенко Е.Е. Действие фактора LIF на липидный бислой. Биофизика, 2009, т. 54, вып. 4, с. 688692.

4. Борисова М.П., Межевикина Л.М., Петрова P.P. Взаимодействие цитокина LIF с липидным матриксом мембран. Компьютерные исследования и моделирование, 2010, т. 2, № 1, с. 43-49.

5. Бушмакина И.М., Скоринко Е.В., Мартынова М.А., Конев С.В. О стабилизации рифампицина в составе липидных везикул. ДАН'Беларуси, 2005, т. 49, №4, с. 88-91.

6. Галат В.В., Ротт H.H., Межевикина Л.М. Работы лаборатории биофизики клетки по использованию методов криоконсервации и биологии развития для сохранения биоразнообразия. Онтогенез, 1998, т. 29, № 1, с. 66-69.

7. Галат В.В., Межевикина Л.М., Зубин М.Н., Лепихов К.А., Храмов Р.Н., Чайлахян Л.М. Действие миллиметровых волн на раннее развитие зародышей мышей и морских ежей. Биофизика, 1999, т 44, вып. 1, с. 137140.

8. Глазко Т.Т., Межевикина Л.М., Бойко A.B. Кариотипическая гетерогенность эмбриональной стволовой клеточной линии мыши ES R1. Цитология, 2004, т. 46, № 9, с. 780-782.

9. Глазко Т.Т., Межевикина JIM., Бойко A.A., Фесенко Е.Е. «Цепная» кариотипическая эволюция эмбриональных стволовых клеток линии R1 in vitro. Цитология, 2005, т. 47, № 8, с. 679-685. ■

10. Глазко Т.Т., Межевикина Л.М., Бойко A.B. Кариотипическаягетерогенность эмбриональной стволовой клеточной линии ES R1.i

11. Клеточные культуры, 2005 б, вып. 20, с. 19-25.

12. Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Гуляева Д.В., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Морфологические аспекты дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Цитология, 2001, т.43, № 9, с. 850-851.

13. Гривенников И.А., Мануйлова Е.С. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития: В кн.: Проблемы и перспективы молекулярной генетики, т. 1 (отв. редактор акад. Е.Д.Свердлов), М., Наука, 2003, с. 290-307.

14. Гривенников И.А. Эмбриональные стволовые клетки и проблема направленной дифференцировки. Успехи биол. хим., 2008, т. 48, с. 181220.

15. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989, 276 С.

16. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Л., Наука, 1988, 228 С.

17. Евтодиенко Ю.В., Теплова В.В. Биологическое значение и механизмы реализации эффекта Кребтри в быстро пролиферирующих клетках. Роль ионов Са2+. Биохимия, 1996, т. 61, вып. 11, с. 1995-2004.

18. Капралова И.В., Межевикина Л.М. Функциональное значение трофобласта для получения колоний плюрипотентных эмбриональных клеток из бластоцист мыши. Цитология, 2006, т. 48, № 9, с. 766-767.

19. Капралова И.В. Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток. Диссертация на соискание кандидатской степени, Пущино, Институт биофизики клетки РАН, 2009, 131 С.

20. Лобанок Е.С., Белянович Л.М., Межевикина Л.М., Василевич' И.Б., Волотовский И.Д., Фесенко Е.Е. Влияние фактора стволовых клеток наструктурно-функциональное состояние мышиных эмбриональных стволовых клеток. Биофизика, 2008, т. 53, вып. 4, с. 646-651.

21. Лойд 3., Госсрау 3., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Под редакцией проф. Рахлина Н.Т. Москва, Мир, 1982, с. 64-67.

22. Лянгузова М.С., Чуйкин И.А., Нордхайм В.А., Поспелов В.А. Исследование роли Р13-киназного каскада в пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши. Цитология, 2004, т. 46, № 10, с. 926-927.

23. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. В сб.: Методы культивирования клеток. Ленинград, Наука, 1988, с. 78-98.

24. Межевикина Л.М., Колтун С.В., Горюшкин Г.Е., Тигранян Р.Э. Действие ЭМИ СВЧ на морфофункциональное состояние зародышей лабораторных мышей. Биофизика, 1990, т. 35, вып. 5, с 813-816.

25. Межевикина Л.М., Храмов Р.Н., Лепихов К.А. Имитация кооперативного эффекта развития в культуре ранних зародышей мыши после облучения электромагнитными волнами миллиметрового диапазона. Онтогенез, 2000, т. 31, № 1, с. 27-31.

26. Межевикина Л.М., Григорьев П.А., Фесенко Е.Е., Серышева В.В. Влияние фактора, ингибирующего лейкемию, на состояние бислойной липидной мембраны. Цитология, 2001, т.43, № 9, с. 878.

27. Межевикина Л.М., Серышева В.В., Борисова М.П. Эмбриональные стволовые клетки в биотехнологических исследованиях (роль цитокина ЛИФ). Биофизика живой клетки, 2003, том 7, с. 103-106.

28. Межевикина Л.М., Серышева В.В., Капралова И.В., Петрова P.P. Влияние цитокина LIF (Leukemia Inhibitory Factor) на развитие доимплантационных зародышей мыши в условиях in vitro. Горизонты биофизики. От теории к практике, ОНТИ ПНЦ РАН, 2003, с. 240-244.

29. Межевикина Л.М., Федорова В.В., Капралова И.В., Фесенко Е.Е Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши в среде с рекомбинантным цитокином LIF. Онтогенез, 2006а, т. 37, № 1, с. 55-62.

30. Межевикина JI.M., Капралова И.В., Фесенко Е.Е. Стимулирующее действие рекомбинантного цитокина LIF на' бластоцисты мыши в период имплантации. Биомедицинская химия, 20066, т. 52, вып. 6, с. 620-626.

31. Осипенко М.А., Жерелова О.М., Петрова P.P., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Влияние .ионов свободного кальция на пролиферативную активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток мыши. ДАН, 2007, т. 412, № 1, с. 123-125.

32. Осипенко М.А. Роль ионов Са2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Пущино, ИБК РАН, 2008, 23 С.

33. Пенков Л.И., Платонов Е.С., Кондрахина М.С., Конюхов Б.В. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) улучшает и пролонгирует развитие партеногенетических зародышей мыши. Онтогенез, 2003, т. 34, № 4, с. 301-305.

34. Петрова P.P., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Положительный ответ дифференцированных эмбриональных стволовых клеток с сократительной активностью на действие изопротеринола. Онтогенез, 2005, т. 36, №5, с. 389-390.

35. Петрова P.P. Исследование активности рекомбинантного белка LIF про- и эукариотического происхождения на культуре эмбриональных стволовых клеток мыши. Дисср. канд. биологич. наук (специальность 03.00.04 биохимия), Пущино, ИБК РАН, 2006, 135 С.

36. Петрова P.P., Межевикина Л.М., Калошин A.A. Экспрессионная система для получения рекомбинантного белка со свойствами цитокина LIF в клетках линии Cos-1. Биотехнология, 2006а, № 5, стр. 3-11.

37. Петрова P.P., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты с помощью цитокина LIF (Leukemia Inhibitory Factor). Биофизика, 20066, т. 51, вып. 2, с. 310-315.

38. Репин B.C. Стволовые клетки и старение: идеи и реальности. Клиническая геронтология, 2001, т. 7, № 12, с. 29-36.

39. Робинсон М.В., Труфакин В. А. Апоптоз и цитокины. Успехи соврем.биологии, 1999, т. 119, №4, с. 359-367.

40. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. РАСХН: Дубровицы, Московской обл., НИИ животноводства, 1999, 93 С.

41. Серышева В.В., Борисова М.П., Межевикина JI.M., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т. Действие лейкемияингибирующего фактора на бислойную липидную мембрану. Бюлл. Экспер. Биол. Мед. , 2002, т. 134, № 12, с. 620-623.

42. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Москва, Мир, 1998, т. 1, с. 262-265.

43. Чуйкин И.А., Лянгузова М.С., Поспелов В.А. Сигнальные пути, определяющие пролиферативную активность эмбриональных стволовых .клеток мыши. Цитология, 2007, т. 49, № 5, с. 370-384.

44. Acosta A.A., Elberger L., Borghi M. Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthily fertile women. Fertil. Steril., 2000, v. 73, № 4, p. 788-798.

45. Aberdam E., Barak E., Rouleau M., de LaForest S., Berrih-Aknin S., Suter D.M. et al. A pure population of ectodermal cells derived from human embryonic stem cells. Stem Cells, 2008, v. 26 № 2, p. 440-444.

46. Adamson E.D. Activities of growth factor in preimplantation embryos. J. Cell. Biochem., 1993, v. 53, p. 280-287.

47. Agarwal S., Holton K.L., Lanza R. Efficient differentiation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells, 2008, v. 26, № 5, p. 1117-1127.

48. Aghajanova L., Stavreus-Evers A., Nikas Y., Hovatta O., Landgren B.M. Coexpression of pinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor, inhuman endometrium. Fertil. Steril., 2003, v. 79, Suppl. 1, p. 808814.v s

49. Aghajanova L., Skottman H., Stromberg A.M., Inzunza J., Lahesmaa R., Hovatta O. Expression of Leukemia inhibitory Factor and its receptor in increased during differentiation of human embryonic stem cells. Fertil. Steril., 2006, Suppl. 4, p. 1193-1209.

50. Aghajanova L., Altmae S., Bjuresten K., Hovatta O., Landgren B.M., Stavreus-Evers A. Disturbances in the LIF pathway in the endometrium among women with unexplained infertility. Fertil. Steril., 2009, v. 91, № 6, p. 2602-2610.

51. Aghajanova L. Update on the role of leukemia inhibitory factor in assisted reproduction. Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 2010, v. 22, № 3, p. 213-219.

52. Akerstrom T., Steensberg A., Keller P., Keller C., Penkowa M., Pedersen B.K. Exercise induces interleukin-8 expression in human skeletal muscle. J. Physiol., 2005, v. 563, p. 507-516,

53. Alexander W.S. Suppressors of cytokine signalling (SOCS) in the immune system. Nat. Rev. Immunol., 2002, v. 2, p. 410—416.

54. Amit M., Shariki K., Margulets V., Itskovitz-Eldor J. Feeder layer- and serumfree culture of human embryonic stem cells. Biol. Reprod., 2004, v. 70, p. 837-845.

55. Amit M., Chebath J., Margulets V., Laewshy I., Miropolsky Y., Shariki K., Peri M., Biais I. et al. Suspension culture of undifferentiatedhuman embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev., 2010, v. 6, № 3, p. 248-259.

56. Anderson J.L., Cariguist J.F., Home B.D., Hopkins P.N. Progress in unnaveling the genetics of coronary artery disease and end myocardial infartion. Curr. Atheroscer. Res., 2007, v. 9, № 3, p. 179-186. 2

57. Annere'n C., Cowan C. A., Melton D. A. The Src family of tyrosine kinases is important for embiyonic stem cell self-renewal. J. Biol. Chem., 2004, v. 279, №30, p. 31590-31598.

58. Aplin A.E., Howe A., Alahari S.K., Juliano R.L. Signal Transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectens. Pharmacol. Rev., 1998, v. 50, p. 197-263.

59. Aplin J.D. Review: implantation, trophoblast differentiation and hemochorial placentation, mechanistic evidence in vivo and in vitro. J. Cell Sci., 1991, v.99, p. 681-692.

60. Aplin J.D., Kimber S J. Trophoblast-uterine interactions at implantation. Reprod. Biol. Endocrinol., 2004, v. 2, p. 1-12.

61. Argetsinger L.S., Hsu G.W., Myers M.G., Billestrup N., White M.F., Carter-Su C. Groth hormone, interferon-y, and leukemia inhibitory factor promoted tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1. J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 14685-14692.

62. Arid A., Engin O., Attar E., Olive D.L. Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in human endometrium. J. Clin. Endocrinol., 1995, v. 80, p. 1908-1915.

63. Ashman L.K. The biology of stem cell factor and its receptor C-Kit. Int. J. Biohem. Cell Biol., 1999, v. 31, № 10, p. 1037-1051.

64. Auernhammer C.J., Melmed S. Leukemia-inhibitory factor neuroimmune modulator of endocrine function. Endocrine Rev., 2000, v. 21, № 3', p. 313345.

65. Axelrod H.A. Embryonic stem cell lines derived from blastocysts by simplified technique. Develop. Biol., 1984, v. 101, p. 225-228.

66. Bader A., Al-Dubai H., Weitzer G. Leukemia Inhibitory Factor modulates cardiogenesis in embryoid bodies in opposite fashions. Circ. Res., 2000, v. 86, p. 787-794.

67. Bagutti C., Wobus A.M., Fassler R., Watt F.M. Differentation of embryonal stem cells into keratinocytes: comparison of wild-type and (31 integrin-dificient cells. Dev. Biol., 1996, v. 176, p. 184-196.

68. Bain G., Ray W.J., Yao M., Gottlieb D.L Retinoic acid promoters neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, v. 223, p. 691-694.

69. Baker D.E., Harrison N.J., Maltby E., Smith K., Moore H.D., Shaw P.J. et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat. Biotechnol., 2007, v. 25, p. 207-215.

70. Balmer J.E., Blomhoff R. Gene expression regulation by retinoic acid. J. Lipid Res., 2002, v. 43,' p. 1773-1808.

71. Banner L.R., Patterson P.H., Allchorne A., Poole S., Woolf C.J. Leukemia inhibitory factor is an anti-inflarnmatory and analgesic cytokine. J. Neurosci., 1998, v. 18, № 14, p. 5456-5462.

72. Barberi T., Willis L.M., Socci N.D., Studer L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Med., 2005, v. 2, №6, p. 161-1721

73. Barcroft L.C., Offenberg H., Thomsen P., Watson A.J. Aquaporin proteins in murine trophectoderm mediate transepithelial water movements during cavitation. Dev. Biol., 2003; v. 256, p. 342-254.

74. Baumann H., Wong G.G. Hepatocyte-stimulating factor III shares structural and functional identity with leukemia- inhibitory factor. J. Immunol., 1989, v. 143, p. 1163-1167.

75. Baumann Hi, Ziegler S.G., Mosley B., Morella K.K., Pajovic S., Gearing D.P. Reconstitution of the response to leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor in hepatoma cells. J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 8414-8417.

76. Bavister B.D. The mitochondrial contribution to stem cell biology. J. Reprod. Fertil. Devel., 2006, v. 18, p. 829-838.

77. Bazan J.F. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, p. 6934-6938.

78. Bechard M., Dalton S. Subcellular localization of glycogen syntase kinase 3 controls embryonic stem cell self-renewal. Mol. Biol., 2009, v. 29, p. 20922104.

79. Berdge D., Koole Fuerer C., Fish M., Eroglu E., Nusse R. Wnt signaling mrdiaters self-jrganization and axis formation in embryoid bodies. Cell Stem Cell, 2008, v. 3, p. 508-518.

80. Bernardino-Sgherri J., Chicheportiche A., Niveleau A., Dutrillaux B. Unusual chromosome cleavage dynamic in rodent neonatal germ cells. Chromosome, 2002, v. Ill,p. 341-347.

81. Berridge M.J. Calcium signaling and cell proliferation. Bioassays, 1995, v. 17, № 6, p. 491-500.

82. Berridge M. J. Inositol trisphosphate and calcium oscillations. Biochem. Soc. Symp., 2007, v. 74, p. 1-7.

83. Bhatt H., Brunet L.J., Stewart C.L. Uterine expression of leukemia inhibitory factor coincides with the onset of Blastocyst implantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 11408-11412.

84. Bitard J., Daburon S., Duplomb L. et al. Mutations in the Immunoglobulin-like Domain of gpl90. The Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Receptor. Increase or Decrease Its Affinity for LIF. J. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 16253-16261.

85. Boeuf H., Hauss C., De Graeve F. et al. Leukemia Inhibitory Factor-dependent Transcriptional Activation in Embryonic Stem Cells. J. Cell Biol., 1997, v. 138, p. 1207-1217.

86. Boheler K.R., Czyz J., Tweedie D., Yang H.-T., Anisimov S.V., Wobus A.M. Differentation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Res., 2002, v. 91, p. 189-201.

87. Boheler K.R. Stem cell pluripotency: a cellular trait that depends jn transcription factors, chromatin state and chechpoint deficient cell cycle. J. Cell Physiol., 2009, v. 221, № l,p. 10-17.

88. Boiani M., Scholer H.R. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells. Molecular Cell Biol., 2005, v. 6, p. 872-884.

89. Bolce M.E., Hemmati-Brivanlou A., Kushner P.D., Harland R.M. Ventral ectoderm of Xenopus forms neural tissue, including hindbrain, in response to activin. Development, 1992, v. 115, p. 681-688.

90. Bongso A. Behaviour of human embryos in vitro in the first 14 days: blastocyst transfer and embryonic stem cell production. Clinical Science Regional Series, 1993, p. 248-249.

91. Bongso A., Tong C.Y., Ng S.C. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod., 1994, v. 9, p. 2110-2117.

92. Bonni A., Sun Y., Yancopoulos G.D;, Greenberg M.E. Regulation of gliogenesis in the central nervous system by the JAKrSTAT signaling pathway. Science, 1997, v. 278, p. 477-483.

93. Bradley A., Evans M., Kaufman M.N., Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature, 1984, v.309, p.255-256.

94. Bradley A. Production and analysis of chemeric mice. In: Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach (ad. Robertson E.J.), 1987, Oxford, Washington, DS: IRE Press, p. 113-152.

95. Bradley A., Hasty P., Davis A., Ramirez-Solis R. Modifying the mouse: design and desire. BioTechnology, 1992, v. 10, p. 534-539.'

96. Brandon E.P., Idzerda R.L., McKnight G.S. Targeting in mouse genome: a compendium knockouts. Gurr. Biol., 1995, v. 5, p. 625-634.

97. Braunstein J., Brutsaert S., Olson M.,, Schindler G. STATs dimerize in the absence of phosphorilation. J. Biol. Ghem., 2003, v. 278, p. 34133-34140.

98. Brizon D.R., Schultz R.M. Apoptosis during mouse blastocyst formation: Evidence for a role for survival factor including transforming growth factor alpha. Biol. Reprod., 1997, v. 56, p. 1088-1096.

99. Broholm C., Mortensen O.H., Nielsen S., Akerstrom T., Zankari A., Dahl B., Pedersen B.K. Exercise induces expression of leukaemia inhibitory factor in human skeletal muscle. J. Physiol., 2008, v. 586, p. 2195-2201.

100. Bromberg J.F. Activation of STAT proteins and growth control. BioEssays, 2001, v. 23, №2, p. 161-169.

101. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 5709-5712.

102. Broudy V. Stem cell factor and hematopoiesis. Blood, 1997, v. 90^ p. 1345-1364.

103. Brown D.G., Willington M.A., Findlay I., Muggleton-Harris A.L. Criteria that optimize the potential of murine embryonic stem cells for in vitro and in vivo developmental studies. In vitro Cell Dev. Biol., 1992, v. 28A, p. 773-778.

104. Burdon Т., Stracey C., Chambers I., Nichols J. Smith A. Suppression of SHP-2 and ERK signaling promoters self-renewal of mouse embryonic stem cells. Dev. Biol., 1999, v. 210, № 1, p. 30-43.

105. Burdon Т., Chambers I., Stracey C., Niwa H., Smith A. Signaling mechanismsregulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells. Cells Tissues Organs, 1999a, v. 165, p. 131-143.

106. Burdon Т., Smith A., Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends in Cell Biology, 2002, v. 12, p. 432-438.

107. Chadwick K., Wang L., Li L., Menendez P., Murdoch В., Roleau A., Bhatia M. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood, 2003, v. 102, p. 906-915.

108. Carlson H., Ota S., Song Y., Chen Y., Hurlin P.J. Tbx3 impinges on the p53 pathway to suppress apoptosis, facilitate, cell transformation and block myogenic differentiation. Oncogene, 2002, v. 21, p. 3827-3835.

109. Carpenter M.K., Rosier E.S., Fisk G.J., Brandenberger R., Ares X., Miura Т., Lucero M., Rao M.S. Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a feeder-free culture system. Dev. Dyn., 2004, v. 229, p. 243258.

110. Cartwright P., McLean C., Sheppard A., Rivett D., Jones R., Dalton S. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by Myc-dependent mechanism. Dev., 2005, v. 132, p. 885-896.

111. Caspi O., Gepstein L. Stem cells for myocardial repair. Europ. Heart J. CSuppl.), 2006, v. 8. p. E43-E54.

112. Chadwick K, Wang L., Li L.3 Menendez P., Murdoch В., Rouleau A., Bhatia M. Cytokines and BMP-4 promote hematopietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood, 2003, v. 102, p. 906-915.

113. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell, 2003, v. 113, p. 643-655.211

114. Chang K.H., Zandstra P.W. Quantitative screening of embryonic stem cell differentiation: endoderm formation as a model. Biotech. Bioeng., 2004, v. 88, №. 3, p. 287-298.

115. Chazaud C., Ymanaka Y., Rossant T. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in muse blastocyst through the Crb2-MAPK pathway. Devel. Cell, 2006, v. 10, № 5, p. 615-624.

116. Chen F.M., Yamamura H.I., Roeske W.R. Ontogeny of mammalian myocardial/2-adrenergic receptors. Eur. J. Pharmacol., 1979, v. 58, p. 255264.

117. Chen X., Vinkemeier U., Zhao Y., Jeruzalmi D., Darnell Jr.J.E., Kuriyan J. Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT-1 dimer bound to DNA. Cell, 1998, v. 93, p. 827-839.

118. Chen -H.F., Shew J.Y., Ho H.N.,' Hsu W.L., Yang Y.S. Expression of leukemia inhibitory factor and its receptor in preimplantation embryos. Fert. Steril., 1999, v. 72, №4, p. 713-719.

119. Chen H., Qian K., Hu J., Liu D., Lu W., Yang Y., Wang D., Yan H., Zhang S., Shu G. The derivation of two additional human embryonic stem cells lines from day 3 embyos with low morphological scores. Hum. Reprod., 2005, v. 20, p. 2201-2206.

120. Chen X., Hu H., Yuan P., Fang F., Huss bM., Vega V.B., Wong E., Orlov Y.L., Zhang W., et al. Integration of external signaling pathways the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell, 2008, v. 133, p. 11061117.

121. F expression and LIF receptor function regulate Stat3 activation at the onset of uterine receptivity and embryo implantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2001, v. 98, p. 8680-8685.

122. Cheng J.G. Control of uterine receptivity and embryo implantation by steroid hormone regulation of LIF production and LIF receptor activity: towards a molecular understanding of "window of implantation". Rev. End. Met. Dis.,2002, v. 3,p. 119-126.

123. Cheng L., Hammond H., Ye Z., Zhan X., Dravid G. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells, 2003, v. 21, p. 131-142.

124. Cheng T.C., Huang C.C., Chen C.L., Liu C.H., Hsieh Y.S., Huang C.Y., Lee M.S., Liu J.Y. Leukemia inhibitory factor antisense oligonucleotide inhibits the development of murine embryos at preimplantation stages. Biol. Reprod., 2004, v. 70, p. 1270-1276.

125. Choo A.B.H., Padmanabhan J., Chin A.C.P., Oh S.K.W. Expression of pluripotent human embryonic stem cells on human feeders. Biotech. Bioeng., 2004, v. 88, №3, p. 321-331.

126. Chung Y., Klimanskaya I., Becker S., Marh J., Lu S.-J., Johnos J, Meisner L., Lanza R. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature, 2006a, v. 439, p. 216-219.

127. Clapham D.E., Calcium signaling. Cell, 2007, v. 131, № 6, p. 1047-1058.

128. Clark A.T., Rodriguez R.T., Bondar M.S. et al. Human STELLAR, NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12pl3 a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells, 2004, v. 22, p. 169-167.

129. Clegg K.B., Piko L. Poly(A) length, cytoplasmic adenilation and synthesis of poly(A)+ RNA in early mouse embryos. Dev. Biol., 1983, v. 95, p. 331-341.

130. Cohen P.E., Pollard J.W. Cytokines and growth factors in reproduktion. In: Reproductive Immunology (eds. Bronson R.A., Alexander N.J., Anderson D., Branch D.W., Kutteh W.H), Oxford: Blackwell Science, 1996, p. 52-104.

131. Conover J.C., Ip N.Y., Poyemirou W.T. et al. Ciliary neurotrophic factor maintains the pluripotentiality of embryonic stem cells. Development, 1993, v. 119, p. 559-565.

132. Conquet F., Brulet F. Developmental expression of the myeloid leukemia inhibitory factor gene in preimplantation blastocysts and in extraembryonic tissue of mouse embryos. Mol. Cell Biol., 1990, v. 10, p. 3801-3805.

133. Conquet F., Peyrieras N., Tiret L., Brulet Ph. Inhibited gastrulation in mouse embryos overexpressing the leukemia inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, v. 89, p. 8195-8199.

134. Cowell J. K. A photographic representation of the variability in* the G-banded structure of the chromosomes in the mouse karyotype. Chromosoma, 1984, v. 89, p. 294-320.

135. Crolla J.A., Brown D., Whittingham D.G. Spontaneous induction of an homologous robertsonian translocation, Rb (11.11) in a murine embryonic stem cell line. Gen. Res., 1990, v. 55, № 2, p. 107-110.

136. Cross J.C., Werb Z., Fisher S,J. Implantation and the placenta: Key pieces of the developmental puzzle. Science, 1994, v. 266, p. 1508-1518.

137. Cuthbertson K.S.R., Cobbold P.H. Phorbol ester and sperm activate mouse04oocytes by induction sustained oscillations in cell Ca . Nature, 1985, v. 316, p. 541-542. 1

138. Darnell J.E. STATs and gene regulation. Science, 1997, v. 277, p. 1630-1635.

139. Davis S., Aldrich T.H., Stahl N., Pan L., Taga T., Kishimoto T., Ip N.Y., Yancopoulos G.D. LIFR|3 and gpl30 as heterodimerizing signal transducers of the tripartite CNTF receptor. Science, 1993, v. 260, p. 1805-1808.

140. Delage G., Moreau J.F., Letur-Konirsh H., Frydman R., Chaouat G. In vitro endometrial secretion of human interleukin for DA cells/leukaemia inhibitory factor by explants culture from fertile and infertile women. Human Reprod., 1995, v. 10, p. 2483-2488.

141. Delhaise F., Bralion V., Schuurbiers, Dessy F. Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos. Eur. J. Morph., 1996, v. 34, №. 4, p. 237-243.

142. Desai N.N., Goldfarb J.M. Growth factor/cytokine secretion by a permanent human endometrial cell line with embryotrophic properties. J. Assist Reprod. Genet., 1996, v. 13, № 7, p. 546-550.

143. Diao Y., Wang X., Wu Z. SOCS1, SOCS3, and PIAS1 promote myogenic differentiation by inhibiting the leukemia inhibitory factor-induced JAK1/STAT1/STAT3 pathway. Mol. Cell Biol., 2009, v. 29, p. 5084-5093.

144. Dick J.E., Kamel-Reid S., Murdoch B., Doedens M. Gene transfer into normal human hematopoietic cells using in vitro and in vivo assays. Blood, 1991, v. 78, № 3, p. 624-634.

145. Dieddrich K., Fauser B.C.J.M., Devroey P., Griesinger G. The role of the endometrium and embryo in human implantation. Human Reprod., 2007, v. 4, p. 1-13.,

146. Dimitriadis E., White C.A., Jones R.L., Salamonson L.A. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation. Hum. Reprod., 2005, v. 11, №6, p. 613-630.

147. Dinsmore J., Jacoby D., Ratliff J. High efficiency differentiation of mouse embryonic stem cells into either neurons or skeletal muscle in vitro. J. Cell Biochem. Suppl., 1994, v. 18 B, p. 177.

148. Dinsmore J., Ratliff J., Deacon T., Pakzaban P., Jacoby D., Galpern W., Isacson O. Embryonic stem cells differentiated in vitro as novel source of cells for transplantation. Cell Transplantation, 1996, v. 5, № 2, p. 131-143.

149. Do J. T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells, 2004, v. 22, p. 941-949.

150. Doetschmann T., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood, islands and myocardium. J. Emb. Exp. Morph., 1985, v. 87, p. 27-45.

151. Doetchmann T. Gene transfer in embryonic stem cells. Trans. Anim. Technol., 1994, p. 115-146.

152. Draper J.S., Smith K., Gokhale P., Moore H.D., Maltby E., Johnson J., Meisner L., Zwaka T.P., Thompson J.A., Andrews P.W., Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cell. Nat. Biotech., 2004, v. 22, p. 53-54.

153. Dravid G., Hammond H., Cheng L. Culture of Human Embryonic Stem Cells on Human and Mouse Feeder Cells. Humana Press. Human Embryonic Stem Cell Protocols, 2006, v. 331, p. 91-104.

154. Dunglison G.F., Barlow D.H., Sargent I.L. Leukemia inhibitory factor significantly enhances the Blastocyst formation rates of human embryos culture in serum-free medium. Human Reprod., 1996, v. 11, p. 191-196.

155. Duval D., Reinhardt B., Kedinger C., Boeuf H. Role of supressors of cytokine signaling (SOCS) in leukemia inhibitory factor (LIF)-dependent embryonic stem cell survival. FASEB J., 2000, v. 14, p. 1577-1584.

156. Eistetter H.R. Pluripotent embryonal stem cell lines can be established from diaggregated mouse morulae. Dev. Growth. Differ., 1989, v. 31, p. 275-282.

157. Ernst M., Gearing D.P., Dunn A.R. Functional and biochemical association of Hck with the LIF/IL-6 receptor signal transduction subunit gpl30 in embryonic stem cells. EMBO J., 1994, 13, p. 1574-1584.

158. Ernst M., Oates A., Dunn A.R. Gpl30-mediated signal transduction in embryonic stem cells involves activation Jak and Ras/mitogen activated protein kinase pathways. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 30136-30143.

159. Escary J.L., Perreau J., Dumenil D., Ezine S., Brulet P. Leukemia inhibitory factor is necessary for maintenance of hematopoietic stem cells and thymocyte stimulation. Nature, 1993, v. 363, p. 361-364.

160. Evans M. Origin of mouse embryonal carcinoma cells and possibility of their direct isolation into tissue culture. J. Reprod. Fert., 1981, v.62, p.625-631.216

161. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotental cells from mouse embryos. Nature (London), 1981, v. 292, p. 154-155.:

162. Evans M.J., Kaufman M.H; Pluropotential cells grown directly from normal mouse.embryos. Cancer Surveys, 1983, v. 2, № 1, p. 185-207.

163. Fan Y., Luo Y., Chen X., Sun X. A modified culture medium increases blastocyst formation and, the efficiency of human embryonic stem cell, derivation from poor-quality embryos. J. Reprod. Fertil., 2010, v. 56, p. 533-539.

164. Faast R., White J., Cartwright P., Crocker L., Sarcevic B., Dalton S. Cdk6-cyclin D3 activity in murine ES cells is resistant to inhibition by pl6(lNK4a). Oncogene, 2004, v. 23, № 2, p. 495-502.

165. Fedorov L.M, Haegel-Kronenberger H., Hirchenhain J. A comparison of the germline. potential of differently aged ES . cell lines and their transfected descend. Transgenic Research, 1997, v. 6, p. 223-231.

166. Finn C.A., McLaren A. A study of the early stages of implantation. J. Reprod. Fertil., 1967, v. 13, p. 259-267.

167. Finn C.A. Species variation in implantation. Prog; Reprod. Biol., 1980, v. 7, p; 253-261. .

168. Fiorio P.A., Munaron L., Marie D., Brazer S.C. Calcium influx, arachidonic acid, and control of endothelial cell proliferation. Cell Calcium, 2001, v. 30, p: 235244'. '

169. FischbachG.D., Fischbach R.L. Stem cells: science, policy, and; ethics. J. Clin. Invest., 2004, v. 114, p; 1364-1370.

170. Fisher J.P., Hope S.A., Hooper M.L. Factors effecting the differentiation of embryonal carcinoma and embryonal stem cells.Exp. Cell Res., 1989, v. 132, p. 403-414.

171. Fischer P., Hilfiker-Kleiner D. Survival.pathway in hypertrophy and heart failure: The gpl30-STAT3 axis. Basic Res. Cardiol., 2007, v. 102, p. 279-297.

172. Forrai A., Boyle K., Hartley Li, Rakar S., Willson T.A., Simpson K.M. et al. Absebce of suppressor, of cytokine signling 3 reduses self-renewal and promoters differentiation in murine embryonic stem cells. Stem Cells, 2006; v. 24, p. 604-614.

173. Fouladin-Nashta A.A., Jones C.J., Nijjar N., Mohamet L., Smith A, Chambers I., Kimber S.J. Characterization of the uterine phenotype during the periimplantation period for LIF-null, MF1 strain mice. Dev. Biol., 2005, v. 281, p. 1-21.

174. Fraidenraich D., Stillwell E., Wilkes D., Manova K., Basson C.T., Benesra R. Rescue of cardiac defects Id knockout embryos by embryonic stem cells. Science, 2004, v. 306, № 5694, p. 247-253.

175. Fry R.C. The effect of leukaemia inhibitory factor (LIF) on embryogenesis. Reprod. Fert. Dev., 1992, v. 4, № 4, p. 449-458.

176. Frost R.A., Nystrom G.J., Lang C.H. Regulation of IGF-I mRNA and signal transducers and activators of transcription-3 and -5 (Stat-3 and -5) by GH in C2C12 myoblasts. Endocrinology, 2002, v. 143, № 2, p. 492-503.

177. Fujio Y., Kunisada K., Hirota H., Yamauchi-Takihara K., Kishimoto T. Signals through gpl30 upregulate bcl-x gene expression via STATl-binding cis-element in cardiac myocytes. J. Clin. Invest., 1997, v. 99^ № 12, p. 28982905.

178. Fukuda M. N., Sato T., Nakayama J., Klier G., Mikami M'., Aoki D., Nozawa S. Trophinin and.tastin, a novel cell adhesion molecule complex with potential involvement in embryo implantation. Genes Dev., 1995, v. 9, p. 1199-1210.'

179. Gajovic S., Chowdhury K., Gruss P. Genes expressed after retinoic acid-mediated differentiation of embryoid bodies are likely to be expressed during embryo development. Exp. Cell Research, 1998, v. 242, p. 138-143.

180. Gallicano G.I., Yousef M.C., Capco D.G. PKC a pivotal regulator of early development. Bioessays, 1997, v. 19, p. 29-36.

181. Garbade J, Schubert A, Rastan AJ, Lenz D, Walther T, Gummert IF, Dhein S, Mohr FW. Fusion of bone marrow-derived stem cells with cardiomyocytes in a heterologous in vitro model. Eur. J. Card. Surg., 2005, v. 28, № 5, p. 685691.

182. Gearing D.P., Gough N.M., King J.A., Hilton D.J., Nikola N.A., Simpson R.J., Nice E.C., Kelso A., Metcalf D. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). EMBO J., 1987, v. 6, p. 3995-4002.

183. Gearing D.P., King J.A., Gough N.M. Complete sequence of murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, p. 9857.

184. Gearing D., Nicola N.A., Metcalf D., Foote S., Gough N.M., Williams R.L. Production of leukemia inhibitory factor (LIF) in Escherichia coli and its use in embryonic stem (ES) cell culture. Biotechnology, 1989, v. 7, p. 1157-1161.

185. Gearing D.P., Thut C.J., VandenBos T., Gimple S.D., Delaney P.B., King J., Price V., Cosman D.', Beckman M.P. Leukemia inhibitory factor receptor is structurally related to the IL-6 signal transductor, gpl30. EMBO J., 1991, v. 10, p. 2839-2848.

186. Gearing D.P. The leukemia inhibitory factor and its receptor. Adv. Immunology, 1993, v.53, p. 31-58.

187. Geisse S., Gram H., Kleuser B., Kocher, H.P. Eukaryotic expression systems: A comparison. Protein expression and purification, 1996, v. 8, p. 271-282.

188. Gerrard L., Zhao D., Clark A.J., Cui W. Stably transfected human embryonic stem cell clones express OCT4-specific green feeder fluorescent protein and maintain self-renewal and pluripotency. Stem Cells, 2005, v. 23, p. 124-133.

189. Getchell T.V., Shah D.S., Partin J.V., Subhedar N.K., Getchell M.L. Leukemia inhibitory factor mRNA expression is upregulated in macrophages and219olfactory receptor neurons after target ablation. J. Neurosci. Res., 2002, v. 67, p. 246-254.

190. Giese B., Roderburg C., Sommerauer M., Wortmann S.B., Metz S., Heinrich P.C., Muller-Newen G. J. Dimerization of the cytokine receptors gpl30 and LIFR analyzed in single cells Cell Sci., 2005, v. 118, p. 5129-5140.

191. Gilbert S.F., Solter D. Onset of paternal and maternal Gpi-2 expression preimplantation mouse embryos. Dev. Biol., 1985, v. 109, p. 515 517.

192. Ginis I., Luo Y., Muira T., Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J. Differences between human and mouse embryonic stem cells. Dev. Biol., 2004, v. 269, p. 360-380.

193. Giovannini M., Djabali M., McElligott D., Selleri L., Evans G.A. Tandem linkage of genes coding for leukemia inhibitory factor (LIF) and oncostatin M (OSM) on human chromosome 22. Cell Genet., 1993, v. 64, p. 240-244.

194. Glasser S.R., Mulholland J., Mani S.K., Julian J., Indrees M.M., Lampelo S., Soares M.J. Blactocyst-endomrtrial relationships: Reciprocal interactions between uterine epithelial and stromal cells and blastocysts. Troph. Res., 1991, v. 5, p. 229-280.

195. Glozak M.A., Rogers M.B. Specific induction of apoptosis in PI9 embryonal carcinoma cells by retinoic acid and BMP2 or BMP4. Dev. Biol., 1996, v. 179, №2, p. 458-470.

196. Goodfellow P.N., Darling S.M. Genetics of sex determination in man and mouse. Development, 1988, v. 102, p. 251-258.

197. Gough N.M., Gearing D.P., King J.A., Willson T.A., Nicola N.A., Metcalf D. Molecular cloning and expression of human homologue of murine gene encoding myeloid leukemia-inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1988, v. 85, p. 2623-2627.

198. Gough N.M., Williams R.L., Hilton D.J. LIF: a molecule with divergent actions on myeloid leukemia cells and embryonic stem cells. Reprod. Fertil. Devel.,1989, v. 1, p. 281-288.

199. Gough N.M., Willson T.A., Stahl J., Brown M.A. Molecular biology of the leukemia inhibitory factor gene. Polyfunctional Cytokines: IL-6 and LIF,1992, Ciba Foundation Symposium, eds. G.R. Bock and K. Widdows, West Sussex, 1992, p. 24-46.

200. Graham C.F. Teratocarcinoma cells and normal mouse embryogenesis. Conceptes in mammalian embryogenesis (ed. MJ. Shuman), N.-Y., 1977, p. 315-395.

201. Griffiths D.S., Li J., Dawson M.A., Trotter M.W.B., Cheng Y.-H.,'Smith A.M., et al. LIF-independent JAK signaling to chromatin in embryonic stem cells uccoveres from an adult stem cell disease. Nature Cell Biol., 2011, v. 13, № 1, p. 13-21.

202. Gu Y., Jayatilak P.G., Parmer T.G., Gauldie J., Fey G.H., Gibori G. Alpha 2-mecroglobulin expression in the mesometrial decidua and its regulation by decidual luteotrophin and prolactin. Endocrinology, 1992, v. 131, p. 13211328.

203. Guan K., Rohwedel J., Wobus A. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro. Cytotech., 1999, v. 30, p. 211-226.

204. Guney M., Erdemoglu E, Oral B., Karahan N., Mungan T. Leukemia inhibitory factor (LIF) is immunohistochemically localized in tubal ectopic pregnancy. Acta Histochem., 2008, v. 110, № 4, p. 319-323.

205. Guo J., Jauch A., Holtgreve-Grez H., Schoell B., Erz D., Schrank M., Janssen J.W.G. Multicoller karyotipe analyses of mouse embryonic stem cells. In vitro Cell Devel. Biol. Animal., 2005, v. 41, p. 278-283.

206. Haines B.P., Yoyle R.B., Peiton T.A., Forrest R., Rathjen P.D. Complex conserved organization of the mammalian LIF gene: a novel mechanism for regulated expression of intracellular and extracellular cytokines. J. Immunol., 1999, v. 162, p. 4637-4646.

207. Haines B.P., Voyle R.B., Rathjen P.D. Intracellular and extracellular leukemia inhibitory factor proteins have different cellular activities that are mediated by distinct protein motifs. Mol. Biol. Cell, 2000, v. 11, № 4, p. 1369-1383.

208. Hamaguchi-Tsuru E., Nobumoto A., Hirose N., Kataoka S., Fujikawa-Adachi K., Furuya M., Tominaga A. Development and functional analysis of eosinophisfrom murine embryonic stem cells. British J. of Hematology, 2004, v. 124, p. 819-827.

209. Hamazaki T., Iboshi Y., Oka Mi, Papst P.J., Meacham A.M., Zon L.I., Terada N. Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro. FEBS letters, 2001, v. 497, № 1, p. 15-19.

210. Hamazaki T., Kehoe S.M., Nakano T., Terada N. The Grb2/Mek pathway represses Nanog in murine embryonic stem1 cells. Mol. Cell. Biol., 2006, v. 26, №<20; p. 7539-7549:

211. Hambartsoumian E. Endometrial leukemia inhibitory factor (LIF)< as a possible cause of unexplanted infertility and! multiple- failures- of implantation-. American J*. Reprod: Immunology, 1998, v. 39, p. 137-143.

212. Handyside A.H., O'Neill G.T., Jones M., Hooper M-.L. Use of conditioned medium in combination with feeder layers to isolate a diploid embryonic stem cell line. Roux's Arch. Dev. Biol., 1989, v. 198, p. 48-55.

213. Hanley J., Rastegarlari G., Nathwani A.C. An introduction to induced pluripotent stem cells. J. Haematol., 2010, v. 51, p. 16-24.

214. He J., Furmanski P. Sequence specificity and transcriptional activation in' the binding of lactoferin to DNA. Nature, 1995, v. 373, p. 721-724.

215. He J.Q., Ma Y., Lee Y., Thomson J.A., Kamp T.J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes. Circ. Res., 2003, v. 93, № 1, p. 1-3.

216. He Z., Li J.J., Feng L.Y., Ding X.Y. Effect of leukemia inhibitory factor on embryonic stem cell differentiation: implications for supporting neuronal differentiation. Acta Pharm. Sin., 2006, v. 27. № 1, p. 80-90.

217. Heath J.K., Smith A.G. Regulatory factors of embryonic stem cells. J. Cell Sci. (Suppl.), 1988, v. 10, p. 257-266.»

218. Heinrich P.C., Behrmann I., Muller-Newen G., Schaper F., Graeve L. Interleukin-6-type cytokine signaling through the gpl30/JAK/STAT pathway. Biochem. J., 1998, v. 334, p. 297-314.

219. Heinrich P.C., Behrmann I., Haan S., Hermanns H.M., Multer-Newen G., Schaper F. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signaling and its regulation. Biochem. J., 2003, v. 374, p. 1-20.

220. Heo J.S., Lee Y.J., Han H.J. EGF stimulates proliferation of mouse embryonic stem cells: involvement of Ca2+ influx and p44/42 MAPKs. J. Physiol. Cell Physiol., 2005, v. 290, p. 123-133.

221. Hermsmeyer K., Mason R., Griffen S.H., Becker P. Rat cardiac muscle single cell automaticity responses to a- and /^-adrenergic agonists and antagonists. Circ. Res., 1982, v. 51, p. 532-537.

222. Hey N.A., Graham R.A., Seif M.W., Aplin J.D. The polymorphic epithelial mucin MUC1 in human endometrium is regulated with maximal expression in the implantation phase. J. Clin. Endocrin., 1994, v. 78, p. 337-342.

223. Hibi M., Nakajima K., Hirano T. IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system. J. Mol. Med., 1996, v. 74, p. 74-81.

224. Hilton D.J. Nicola N.A., Metcalf D. Purification of a murine leukemia inhibitory factor from Krebs ascites conditioned cells. Anal. Biochem., 1988b, v. 173, p. 359-367.

225. Hilton D.J. LIF: lots of interesting functions. Trends Biochem. Sci., 1992, v. 17, p. 72-76.

226. Hilton D.J., Gough N.M. Leukemia inhibitory factor. Cytokines, 1998, Acad. Press Lim., p. 277-296.

227. Hinds M.G., Maurer T., Zhang J.-G., Nicola N.A., Norton R.S. Solution structure of leukemia inhibitory factor. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, № 22, p. 13731378.

228. Hirai H., Karian P., Kikyo N. Regulation of embryonic stem cell self-renewal and pluripotency by leukaemia inhibitory factor. Biochem. J., 2011, v. 438, № 1, p.11-23.

229. Hirano T., Nakajiama K., Hibi M. Signaling mechanisms through gpl30: A model of the cytokine system. Cytokine Growth Factor Rev., 1997, v. 8, p. 241-252.

230. Hirano T., Ishihara K., Hibi M. Roles STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptor. Oncogene, 2000, v. 19, p. 2548-2556.

231. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear from mature B and T donor cells. Nature, 2002, v. 415, № 6875, p. 1035-1038.

232. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. Engl. J. Med., 2003, v. 349, № 3, p. 275-286.

233. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature, 2006, v. 441, p. 1061-1067.

234. Hogan B., Beddington R'., Constantini F., Lacy E. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., 1994, p. 132134.

235. Hori Y., Rulifson I.C., Tsai B*.C., Heit J.J., Gahoy J.D., Kim S.K. Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing from embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, v. 99, No 25, p. 16105-16110.

236. Hovatta O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod., 2003, v. 18, p. 1404-1409.

237. Hsu L.W., Heath J'.K. Identification ogf two elements involved in regulating expression of murine leukemia inhibitory factor gene. Biochem. J1.,* 1994, v. 302, p. 103-110.

238. Hu X., Shang K. Establishment and characterization of Six ES cell lines from mouse 129/ter strain. Acta Sci. Natl. USA, 1996, v. 32, № 2, 248-253.

239. Hubner K., Fuherman G., Christenson L.K., Kehler J., Reinbolt R., Wood J., Strass J.F., Bouani M., Scholer H.R. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science, 2003, v. 300, № 5623, p. 1251-1256.

240. Hudson K.R., Vernallis A.B., Heath J.K. Characterization of the receptor binding sites of human leukemia inhibitory factor and creation of antagonists. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, №20, p. 11971-11978.

241. Hussein S. M., Batada N.N., Vuoristo S. et al. Copy number variation and selection during reprogramming pluripotency. Nature, 2011, v. 471, p. 58-62.

242. Huyer G., Alexandr D.R. Immune signaling: SHP-2 docks at multiple ports. Curr. Biol., 1999, v. 9, № 4, pl29-132.

243. Jackson M., Baird J.W., Cambray N., Ansell J1., Forrester L.M., Graham G.J; Cloning and characterization of Ehox, a novel homeobox gene essential for embryonic stem cell differentiation. J. Biol. Chem., 2002, v. 227, № 41, p. 38683-38692:

244. Jaenicke R., Rudolph R. Folding proteins. Protein: structure a practical approach (ed. CreightonT.E.),N.-Y.:IRL Press, 1990; p: 191-224.

245. Jans D;A., Hassan G. Nuclear targeting by factors, cytokines, and their'receptors; role in signaling. Bioessays, 1998, v. 20, p. 400-411.

246. Jiang X., Gurel O., Mendiaz E et al. Structure of the active core of human stem cell factor and analysis of binding its receptor c-Kit. EMBO J., 2000, v. 19, p. 3192-3203.

247. Johansson B.M., Wiles. M.V. Evidence; for involvement: of activin A and; bone morphogenetic protein 4 in mammalian; mesoderm and hematopoietic: development. Мої. Cell Biol., 1995, v. 15, p. 141-151.

248. Jones-Villeneuve E.M.V.,. McBurney M.W., Rogers K.A., Kalnins V.I. Retinoic acide induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neuronsr and-glial cells. J. Cell BioL, 1982, v. 94, p. 253-262.

249. Kahan B.W., Jacobson L. M., Hullett D:A. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types irom murine embryonic stem cells an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes, 2003, v. 52, p. 2016-2024.

250. Kapur N., Mignery G. A., Banach K. Cell cycle-dependent calcium oscillations in mouse embryonic stem cells. Cell Physiol., 2007, v. 292, p. 1510-1518.

251. Kaufman M.H. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryos following activation by ethanol treatment. J. Embryol. Exp. Morph. 1982, v. 71, p. 139-154.

252. Kaufman MTL, Robertson E.J., Handyside N.N. Establishment of pluripotental cell lines from haploid mouse embryos. J. Embryol. Exp. Morph., 1983, v. 73, p. 249-261.

253. Kaufman D.S., Hanson E.T., Lewis ' R.L., Auerbach R., Thomson J.A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, v. 98, № 19, p. 10716-10721.

254. Kawase E., Suemori H., Takahashi N., Okazaki K., Hashimoto K., Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol., 1994, v. 38, № 2, p. 385-390.

255. Kawase E., Yamazaki Y., Yagi T., Yanagimachi R., Pedersen R.A. Mouse embryonic stem cell lines established from neuronal cell-derived cloned blastocysts. Genesis, 2000, v. 28, p. 156-163.

256. Kay G.F., Penny G.D., Patel D:, Ashworth A., Brockdorf N., Rastan S. Expression of Xist during mouse- development suggests a role in the initiation-of X-chromosome inactivation. Cell, 1993, v. 72, p. 171-182.

257. Kehat I., Khimovich L., Caspi J., Gepstein A., Softi R., Arbel G., Huber I., Satin J., Itskovitz-Eldor J., Gepstein L. Electomechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nature Biotech., 2004, v. 22, p. 1282-1289.

258. Keller G., Kennedy M., Papayannopoulou T., Wiles M.V. Hematopoietic commitments during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol. Cell Biol., 1993, v. 13, p. 473-486.

259. Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biologyand medicine. Gen. Dev., 2005, v. 19, p. 1129-1155.t

260. Kelly D., Rizzino A. DNA microarray analyses of genes regulated during the differentiation of embryonic stem cells. Mol. Rep. Devel:, 2000, v. 56, p. 113123.

261. Keoliane A.M., O'Neill L.P., Belyaev N.D., Lavender J.S., Turner B.M. X-inactivation and histone H-4 acetylation in embryonic stem cells. Devel. Biol., 1996, v. 180, p. 618-630.

262. Khillan J.S., Bao Y. Preparation of animals with a high degree of chimerism by one-step coculture of embryonic stem cells and preimplantation embryos. BioTech., 1997, v. 22, № 3, p. 544-549.

263. Kim J.M., Nakao K., Nakamura K., Saito I., Katsuki M., Arai K., Masai H. Inactivation of Cdc7 kinase in mouse ES cells results in S-phase arrest and p53-dependet cell death. The EMBO J., 2002, v. 21, №. 9, p. 2168-2179.

264. Kim H.S., Oh S.K., Ahn H.J., Sung K.C., Kang M.J., Lee L.A., Suh C.S., Kim S.H., Kim D.-W., Moon S.Y. Methods for derivation of human embryonic stem cells. Stem Cells, 2005, v. 23, p. 1228-1233.

265. Kimber S.J. Leukemia inhibitory factor in implantation and uterine biology. Reprod., 2005, v. 130, p. 131-145.

266. Kishimoto T., Taga T., Akira S. Cytokine signal transduction. Cell, 1994, v. 76; p. 253-262.

267. Kohlhuber F., Hermeking H., Graessmann A., Eick D. Induction of apoptosis by the c-Myc helix-Ioop-helix/leucine zipper domain in mouse 3T3-L1 fibroblasts. J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 28797-28805.

268. Kojima K., Kanzaki H., Iwai M., Hatayama H., Fujimoto M., Inoue T., Horie K., Nakayama H., Fujita J., Mori T. Expression of leukemia inhibitory factor in human endometrium and placenta. Biol. Reprod., 1994, v. 50, p. 882-887.

269. Kola I., Davey A., Gough N.M. Localization of the murine leukemia inhibitory factor gene near the centromere on chromosome 11. Growth Factors, 1990, v. 2, p. 235-240.

270. Koltun S.V., Mezhevikina L.M. Effect of radiofrequency electromagnetic radiation on the morphological state of mice embryos. Microwaves Med., 1993, v. 2, 297-300.

271. Koopman P., Gubbay J., Vivian N.,. Goodfellow P., Loveell-Badge R. Male development of chromosomally femalemice transgenic for Sry. Nature, 1991, v. 351, p. 117-121,

272. Kristensen D.M., Kalisz M., Nielsen J.H. Cytokine signaling in embryonic stem cells. APMIS; 2005, v; 113; № 11-12, pi 756-772:

273. Kurek J.B., Bower J.J., Romanella M., Roentgen F., Murphy M., Austin E. The role: of leukemia inhibitory factor in skeletal muscle regeneration: Muscle: Nerve, 1997, v. 20, p. 815-822.

274. Kurek J. AM424: history of a novel drug candidate; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol:,,2000; v. 27,.p: 553-557.

275. W., Nishimura R., Kashishian A., Batzer A.G., Kim W.J., Cooper J.A., Schlessinger J. A new function for a. phosphotyrosine phosphatase: Linking . GRB2-Sos to a receptor tyrosine kinase. Mol. Cell Biol., 1994, v. 14, p. 509517

276. M., Sendtner M., Smith A. . Essential function of LIF receptor in motor neurons. Nature, 1995, v. 378, p. 724-727. 1

277. Maitra A., Arking D.E., Shivapurkar N. et al. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat. Genet., 2005, v. 37, № 10, p. 1099-1103.

278. Mao Y., Lee A. W.-M. A novel role for Gab2 in bFGF-mediate cell survival during retinoic acid-induced neuronal differentiation. J. Cell Biol., 2005, v. 170, №2, p. 305-316.

279. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 7634-7638.

280. Matsuda T., Nakamura T., Nakao K., Arau T., Katsuki Ml, Heike T., Yokota T. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J., 1999, v. 18, p. 4261-4269.

281. McBurney M.W., Jones-Villeneuve E.M.V., Edwards M.K.S., Andersen P.J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonic carcinoma cell line. Nature, 1982, v. 299, p. 165-167.

282. McDonald N.Q., Panayotatos N., Hendrickson W.A. Structures LIF and CNTF. EMBO J., 1995, v. 14, p. 2689-2699.

283. McLaren A. Sex determination in mammals. Trends Genet., 1988, v. 4. p. 153157.

284. McMahon A.P., Bradley A. The Wnt- (int-1) protooncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell, 1990, v. 62, p. 10731085.

285. Menasche P. Embryonic stem cells pace the heart. Nature Biotech., 2004, v. 22, № 10, p. 1237-1238.

286. Metcalf D., Hilton D.J., Nicola N.A. Clonal analysis of the actions of the murine leukemia inhibitory factor on leukemia and normal murine hemopoietic cells. Leukemia, 1988, v. 2, pi 216-221.

287. Metcalf D., Gearing D.P. Fatal syndrome in mice engrafted with cells predicting high levels of the leukemia inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 5948-5952.

288. Metcalf D. The unsolved enigmas of leukemia inhibitory factor. Stem Cells, 2003, v. 21, № 1, p. 5-14.

289. Mitalipova M., Calhoun J., Shin S., Wininger D., Schultz T., Noggle S., Venable A., Lyons I., Robins A., Stice S. Human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos. Stem Cells, 2003, v. 21, p. 521-526.

290. Mitalipova M.M., Rao R.R., Hoyer D.M., Johnson J.A., Meisner L.F., Jones K.L. et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol., 2005, v. 23, № 1, p. 19-20.

291. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES Cells. Cell, 2003, v. 113, p. 631-642.

292. Miyamoto K., Huyashi K., Suzuki T., Ichihara S., Yamada T., Kano Y., Yamabe T., Ito Y. Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells. Stem Cells, 2004, v. 22, p. 433-440.

293. Mohn A., Koller B.H. Genetic manipulation of embryonic stem cells. In: DNA Cloning 4 (eds.Glover, D.M., Hames B.D), Oxford: IRL Press; 1995, p. 143184.

294. Moreau L-F., Donaldson D:D., Bennett F., Witek-Giannotti J., Clark S.C., Wong G.G. Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells. Nature, 1988, v. 336, p. 690-692.

295. Mori M., Yamaguchi K., Abe R. Purification of a lipoprotein lipase-inhibiting protein produced by a melanoma cell line associated with cancer cachexia. Bichem. Biophys. Res. Comm., 1989, v. 160, p. 1085-1092.t

296. Mroz K., Hunt P:A. Germ cell development in the XXY mouse: evidence the X chromosome reactivation is independent of sexual differentiation. Devel. Biol., 1999, v. 207, № 1, 229-238.

297. Munsie M.J., Michalska A.E., O'Brien C.M., Trounson A.O., Pera MiF., Mountford P.S. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. Curr. Biol., 2000, v. 10, p: 989-992.

298. Murakami K., Hibi M., Nakagawa N., Nakagawa T., Yasukawa K., Taga T., Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gp 130» and associated activation of tyrosine kinase. Science, 1993, v. 260, p. 1808-1810:

299. Murashov A.K., Pak E.S., Katwa L.C. Parallel development of cardiomyocytes and neurons in embryonic stem cell culture. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, v. 332, p. 653-656.

300. Murray R, Edgar D; The regulation of embryonic stem cell differentiation by leukemia inhibitory factor (LIF). Differentiation, 2001', v. 68, pi 227-134.

301. Nachtigall M.J., Kliman H.J., Feinberg R.F., Olive D.L., Engin O., Arici A. The effect of leukemia inhibitory factor (LIF) oh trophoblast differentiation: a potential role in human implantation. J. Clin. Endoc. Metab., 1996, v. 81, p. 801-806.

302. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, № 18, p. 8424-8428.

303. Nakagawa S., Saburi S., Yamanouchi K., Tojo H., Tachi C. In vitro studies on PGC or PGC-like cells in cultured yolk sac cells and embryonic stem cells of the mouse. Arch. Histol. Cytol., 2000, v. 63, № 3, p. 229-241.

304. Nakahashi T., Morimoto S., Matsumoto M. Aging and senescence in the delopment of hypertensive target organ damage. Nihon Rinsh, 2004, v. 62, Suppl. 3, p. 51-55.

305. Nakaijama K., Yamanaka Y., Nakae K., Kojima H., Ichba M., Kiuchi N., Kitaoka T., Fukada T., Hibi M., Hirano T. A central role of STAT3* in IL-6-induced regulation of growth and differentiation in Ml leukemia cells. EMBO J., 1996, v. 15,3651-3658.

306. Nakajiama S., Tanaka T., Umesaki N., Ishiko O. Leukemia inhibitory factor regulates cell survival of normal human endometrial stromal cells. International J. Mol. Med., 2003, v. 11, p. 353-356.

307. Nakamura H., Nakamura K., Yodoi J. Redox regulation of cellular activation. Ann. Rev. Immunol., 1997, v. 15, p. 351-369.

308. Nakamura T., Arai T., Takagi M., Sawada T., Matsuda T., Yokota T., Heike T. A selective switch-on system for self renewal of embryonic stem cells using chimeric cytokine receptors. Bioch. Bioph. Res. Comm., 1998, v. 248, №1, p. 22-27.

309. Nicol R.L., Frey N., Pearson G., Melanie C., Richardson J:, Olson J. Activated MEK5- induces serial assembly of sarcomeres and eccentric cardiac hypertrophy. The EMBO J., 2001, v. 20, p. 2757-2767.

310. Nichols J., Chambers I., Smith A. Derivation of germline competent embryonic stem cells with a combination of interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor. Exp. Cell Res., 1994, v. 215, № 1, p.237-239.t

311. Nichols J., Davidson D., Taga T., Yoshida K., Chambers I., Smith A. Complementary tissue-specific expression of LIF and LIF-receptor mRNA in early mouse embiyogenesis. Mech. Dev., 1996, v. 57, p. 123-131.

312. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell, 1998, v., 95, p. 379-391.

313. Ning H.X., Chen Y., Rong Y., Zhang X.F., Chang Z.J. Cloning, eukaryotic expression and function assay of recombinant leukemia inhibitory factor gene LIF. Sheng Wu (Shanghai), 2003, v. 35, № 12, p. 1123-1127.

314. Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev., 1998, v. 12, p. 2048-2060.

315. Niwa H., Miyazaki J.-I., Smith A.G. Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Natl. Genet., 2000, v. 24, p. 372-376.

316. Niwa H. Molecular mechanism to maintain stem sell renewal of ES' cells. Cell Structure and Function, 2001, v. 26, p. 137-148.

317. Niwa H., Ogawa K., Shimosato D., Adachi K. A parallel circuit of LIF signalling pathways maintains pluripotency of mouse ES cells. Nature, 2009; v. 460, p. 118-122*.

318. Novatny Z., Krizan J1., Sima R., Sima P., Uher P., Zech N. et al. Diagnosed with unexplained infertility and endometriosis have a negative impact on the IVF outcome a pilot study. Folia Biol. (Praha), 2009, v. 55, p. 92-97.

319. Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells, 2001, v. 19, p. 193-204.

320. Offenberg H, Thomsen PD. Functional challenge affects aquaporin mRNA abundance in mouse blastocysts. Mol. Reprod. Dev., 2005, v. 71, № 4, p. 422430.

321. Ogawa K., Nishinakamura R., Iwamatsu Y., Shimosato D., Niwa H. Synergistic action of Wnt and LIF in maintaining pluripotency of mouse ES> cells. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2006, v. 343, № 1, p. 159-66.

322. Ohkubo Y., Shirayaoshi Y., Nakatsuji N. Autonomus regulation of proliferation and growth in mouse primordial germ cells studied by mixed and clonal culture. Exp. Cell Res., 1996, v. 222, p. 291-297.

323. Oka M., Tagoki K., Russell T. CD9 is associated with leukemia inhibitory factor-mediated maintenance of embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol., 2002, v. 13, p. 1274-1281.

324. Okada H., Woodcock-Mitchell J., Fujii S. Leukaemia inhibitory factor and oncostatin M modulate expression of urokinase plasminogen activator and fibrinogen. Coron. Artery Dis., 1996, v. 7, № 8, p. 561-567.

325. Osipenko M.A., Mezhevikina L.M., Petrova R.R. Role of calcium ions inregulation of growth of mouse embryonic stem cells in vitro. Stem* cells:235

326. Policy, Research, and Innovations. European Union Russian Federation Perspectives, 2007, p. 2-4.

327. Otero J.J., Fu W., Kan L., Cuadra A.E., Kessler J.A. p-Catenin signaling is required for neuronal differentiation of embryonic stem cells. Dev., 2004, v. 131, p. 3545-557.

328. Owczarek C.M., Layton MJ., Metcalf D:, Lock P., Willson T.A., Gough N.M., Nicola" N.A. Inter-species chimeras of leukaemia inhibitory factor defines a major human receptor-binding determinant. EMBO J., 1993-, v. 12, p. 34873495.

329. Paling N. R. D., Wheadon Bone H.K., Welham M. J. Regulation of embryonic stem cell self-renewal by phosphoinositides 3-Kinase-dependent signaling. J. Biol. Ghem., 2004, v. 279, № 46, p. 48063-48070.

330. Palmieri S.L., Peter W., Hess H., Scholer H.R. Oct-4 transcriptional factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineage involved in implantation. Dev. Biol., 1994, v. 166, p. 259-267.

331. Papaioanou V., Johnson1 R*. Production of chimeras and genetically defined offspring from targeted ES cells. In: Gene Targeting: a Practical Approach, ed. A.L. Oxford, UK, IRL Press, 1993, p. 107-146.

332. Paria B.C., Zhao X., Das S.K., Dey S.K., Yoshinaga K. Zonula occludens-1 and E-cadherin are coordinately expressed in the mouse uterus with the initiation of implantation and decidualization. Devel. Biol., 1999, v. 208, № 2, p. 488501.

333. Paria B.C., Ma W., Tan Ji, Raja S., Das S.K., Dey S.K., Hogan B.L. Cellular and-molecular responses of the uterus to embryo implantation can be elicited by locally played growth factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, v. 98, p. 1047-1052.

334. Park J.-I., Yoshida I., Tada T., Takagi N., Takahashi Y., Kanagawa H. Trysomy 8 does not affect differentiative potential in a murine parthenogenetic embryonic stem cell line. Jpn. J. Vet. Res., 1998, v. 46, № 1, p: 29-35.

335. Park J.-I., Kim S.J., Lee J.B., Song J.M., Kim C.G., Roh Sung II, Yoon H.S. Establishment of a human embryonic germ cell line and comparison with mouse and human embryonic stem cells. Mol. Cells, 2004, v. 17, № 2, p. 309 -315.

336. Park I.H., Zhao R., West J.A., Yabuuchi A., Huo H., Ince T.A., Lerou P.H., Lensch M.W., Daley G.Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature, 2008, v. 451, p. 141-166.

337. Pascoe W.S., Kemler R., Wood S.A. Genes and functions: trapping and targeting in embryonic stemcells. Biochim. Biophys. Acta, 1992, v. 1114, p. 209-221.

338. Pease S., Braghetta P., Gearing D., Grail D., Williams R.L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor (LIF). Dev. Biol., 1990, v. 141, p. 344-352.

339. Pera M.F., Trounson" A.O. Human embryonic stem cells: prospects for development. Development, 2004, v. 131, p. 5515-5525.

340. Pesce M., Wang X., Wolgemuth D.J., Scholer H. Differential expression of the Oct-4 transcription factor during mouse germ cell differentiation. Mech. Dev., 1998, v. 71, p. 89-98.

341. Pesce M., Gross M.K., Scholer H.K. In line with our ancestors: Oct4^ and- the mammalian germ. BioEssays, 1998a, v. 20, p. 722-732.

342. Pesce M., Anastassiadis K., Scholer H.R. Oct-4 lessons of totipotancy from embryonic stem cells. Cell Tissues Organs, 1999; v. 165, p. 144-152.

343. Piedrahita J.A., Anderson* G.B., Bon Durant R.H. On the isolation of embryonic stem cells: comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos. Theriogenology, 1990; v. 34, № 5, p. 879-902.

344. Piotrowich R.S., Maher P.A., Levin G. Dual activities of 22-24 kDa basic fibroblast growth factor: inhibition of migration and stimulation of proliferation. J. Cell. Physiol., 1999, v. 178, p. 144-153".

345. Plachta N., Bollenbach T.} Pease S., Faser S.E., Pantazis P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol., 2011, v. 13, №2, p. 117-123.

346. Plescia C., Rogler C., Rogler L. Genomic expression analysis implicate Wnt signaling pathway and extracellular matrix alteration in hepatic specification and differentiation of murine hepatic stem cells. Differentation, 2001, v. 68, p. 254-269.

347. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species: present status and future prospects. Cells Tis. Org., 1999, v. 165, p. 220-236.

348. Psychoyos A. Endocrine control of egg implantation. In: Handbook of Physiology, v, 2, eds. R.O. Greep and E.B. Astwood, Baltimore: Williams and Wilkins, 1973, p. 187-215.

349. Psychoyos A., Nikas G., Gravanis A. The role of prostaglandins in blastocyst implantation. Hum. Reprod., 1995, v. 10 (Suppl. 2), p. 30-42.

350. Qu C.K., Feng G.S. Shp-2 has a positive regulatory role in ES cell differentiation and proliferation. Oncogene, 1998, v. 17, p. 433-439:

351. Qi X., Li T., Hao J., Hu J., Wang J., Simmons H., Miura S., Mishina Y., Zhao G. BMP supports self-renewal of embryonic stem cells by inhibiting mitogen activated protein kinase pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, v. 101, p. 6027-6032.

352. Quinlan L. R., Faherty S., Kane M. T. Phospholipase C and protein kinase C involvement in mouse embryonic stem-cell proliferation and apoptosis. Reproduction, 2003, v. 126, p. 121-131.

353. Raab G., Kover K., Paria B.C., Dey S.K., Ezzell R.M., Klagsbrum M'. Mouse preimplantation blastocysts adhere to cells expressing the transmembrane from of heparin-binding EGF-like growth factor. Development, 1996, v. 122, p. 637-645.

354. Rao R.R., Calhoun J.D., Qin X., Rekaya R., Clark J.K.m Stice S.L. Comparative transcriptional profiling of two human embryonic stem cell lines. Biotech. Bioeng., 2004, v. 88, No. 3, p. 273-286.

355. Rasmussen H. Cellular calcium metabolism. Ann. Intern. Med., 1983, v. 98, p. 809-816. .

356. Rathjen P.D., Nichols J., Toth S., Edvards D.R., Heath J.K., Smith A.G. Developmentally programmed induction of differentiation inhibiting activity and the control of stem cell populations. Genes Dev., 1990a, v. 4, p. 23082318.

357. Rathjen P.D., Toth S., Willis A., Heath J.K., Smith A.G. Differentation inhibiting activity is produced in matrix-associated and' diffusible from that are generated by alternate promoter usage. Cell,. 1990b, v. 62, p. 1105-1114.

358. Raz R., Lee C.-K., Cannizzaro L.A., d'Eustachio P., Levy D.E. Essential role of STAT3-for embryonic stem cell pluripotency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, № 6, p. 2846-2851. '

359. Reid I:R1, Lowe C., Cornish J., Skinner S.J.M., Hilton D.J:, Willson T.A., Gearing D.P., Martin T.J. Leukemia inhibitory factor: a novel bone-active cytokine. Endocrinology, 1990, v. 1416-1420:

360. Reppel Mi, Boettinger C.,. Hescheler J. Beta-adrenergic and muscarinic modulation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Cell , Physiol. Biochem., 2004, v. 14, p. 187-196.

361. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.Y., Trounson A., Bongso A. Embryonic stem : cell lines from human blactocysts: somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnol., 2000, v. 18, № 4, p. 399-404.

362. Reubinoff B.E., Itsykson P., Turetsky T., Pera M.F., Reinhartz E., Itzik A. et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol;, 2001,. v. 19, №12, p. 1134-11401

363. Reya T., Morrison S.R., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 2001, v. 414, p. 105-111.

364. Reynolds B.A., Weiss S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Devel. Biol., 1996, v. 175, p.1-13.

365. Richards C.D., Shoyab M., Brown T.J., Gauldie J. Selective regulation of metalloproteinnase inhibitor (TIMP-1) by oncostatin M in fibroblasts in culture: J. Immunol., 1993, v. 150, p. 5596-5603.

366. Richards M., Fong C.Y., Chan W.K., Wong P.C., Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotech., 2002, v. 20, p. 933-936.

367. Richards M., Tan S., Fong C.Y.? Biswas A., Bongso A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells, 2003, v. 21, p. 546-556.

368. Rideout W.M, Eggan K., Jaenish R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science, 2001, v. 293, p. 1093-1098. 1

369. Rideout W.M., Hochedlinder K., Kyba M., Daley G.Q., Jaenisch R. Correction of genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. Cell, 2002. v. 109, p. 17-27.

370. Robb L., Dimetriadis E., Li R., Salamonsen L.A. Leukemia inhibitory factor and interleukin-11: cytokines with key roles in implantation. J. Reprod. Immun., 2002, v. 57, № 1-2, p. 129-141.

371. Robertson E J. Pluripotential stem cell line as a route into the mouse germ line. Trends Gen., 1986, v. 2, p. 9-13.

372. Robertson E.J., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotental cells by retroviral vector. Nature, 1986a, v. 233, p. 445-448.

373. Robertson E.J., Evans M.J., Kaufman M.H. X-chromosome instability in pluripotential stem cell lines derived from partenogenetic embryos. J. Embryol. Exp. Morphol., 1986b, v. 74, p. 297-309.

374. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (ed. Robertson E.J.). Oxford, UK: IRL Press, 1987, p. 71-112.

375. Robertson M., Chambers I., Rathjen P., Nichols J. Expression of alternative forms of differentiation inhibiting activity (DIA/LIF) during murine embryogenesis and in neonatal and adult tissues. Dev. Genet., 1993, v. 14, p. 165-173.

376. Robinson R.C., Grey L.M., Staunton D., Stuart D.I., Heath J.K., Jones E.Y. The crystal structure of murine leukemia inhibitory factor. Arm. N.Y. Acad. Sci.,1995, v. 762, p. 179-188.

377. Rose T.M., Weiford D.M., Gunderson N.L., Bruce A.G. Oncostatin № (0SM> inhibits the differentiation of pluripotent embryonic stem cells in vitro. Cytokine, 1994, v. 6, p. 48-54.

378. Rosier E.S., Fisk G.J., Ares X., Irving J., Miura T., Rao M.C., Carpenter M'.K. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev. Dyn., 2004, v. 229, p. 259-274.

379. Rossant J., Spence A. Chimeras and mosaic in mouse mutant analysis. Trends in Genetics, 1998, v. 14, № 9, p. 358-363.

380. Rossant J. Stem cells from mammalian blastocyst. Stem Cells, 2001, v. 19, № 6, p. 477-482.

381. Rossant J., Cross J. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics, 2001, v. 2, p. 538-548.

382. Ryu J. K., Choi H. B., Hatori K. Adenosine triphosphate induces proliferation of human neural stem cells: role of calcium and p70 ribosomal protein S6 kinase. J. Neurosci. Res., 2003, v. 72, p. 352-362.

383. Salamonsen L.A., Nie G. Proteases at the endometrial-trophoblast interface: their role in implantation. Rev. Endocr. Metab. Disord., 2002, v. 3, №. 2, p. 133143.N

384. Sawai K., Matsuzaki N., Kameda T., Hashimoto K., Okada T., Shimoya K.,

385. Schiemann W.P., Nathanson N.M. Raf-1 independent stimulation of mitogen-activated protein kinase by leukemia inhibitory factor in 3T3-L1 cells. Oncogene, 1998, v. 16, p. 2671-2679.

386. Schmitt R.M., Bruyns E., Snodgrass H.R. Hematopoietic development of embryonic stem cells in vitro: Cytokine and receptor gene expression. Genes Devel., 1991, v. 5, p. 728-740.

387. Schuldiner M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J., Melton D.A., Benvenisty N. Effect if eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, v. 97, № 21, p. 11307-11312.

388. Schuringa J.J., van" der Schaaf S., Vellenga E., Eggen B.J., Kruijer W. LIF-induced STAT3 signaling in murine versus human embryonal carcinoma (EC) cells. Exp. Cell Res., 2002, v. 274, № 1, p. 119-129.

389. Segev H., Fishman B., Ziskind A., Shulman M., Itskovitz-Eldor J. Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells, 2004, v. 22, № 3, p. 265-274.

390. Senturk L.M., Arici A. Leukemia inhibitory factor in human reproduction. American J. Reprod. Immun., 1998, v. 39, p. 144-151.

391. Seshagiri P.B., Lalitha H.S., Mishra A., Sireesha G.V. Embryo-endometrial proteases during early mammalian development. J. Exp. Biol., 2003, v. 41, №. 7, p. 756-763.

392. Seshagiri P.B., Sen Roy S., Sireesha G., Rao R.P. Cellular and molecular regulation of mammalian blastocyst hatching. J. Reprod. Immunol., 2009, v. 29 (in pub).

393. Sharkey A.M., Dellow K., Blayney M., Macnamee M., Charnock-Jones S., Smith S.K. Stage-specific expression of cytokine and receptor messenger ribonucleinic acids in; human preimplantation embryos. Biol. Reprod., 1995,. v. 53, p. 974-981.

394. Sharma N., Liu S;, Tang L., Irwin J., Meng G., Rancourt D;E. Implantation Serine Proteinases heterodimerize and are critical in hatching and implantation. Dev. Biol.,.2006, v. 11. №. 6, p. 61 -72.

395. Sharov A.A., Plao Y., Matoba R., Dudekula D.B., Qian Y., VaBuren V., Falco G., Martin P.R., Stagg C.A. et al. Transcription analysis of mouse stem cells and early embryos. PloS Biol., 2003, v. 1, № 3, p E74.

396. Shen M.M., Leder P. Leukemia inhibitory. factor is expressed by the preimplantation uterus and! selectively blocks primitive ectoderm formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, p. 8240-8244.

397. Shmelzer C.H., Hams R.J., Butler D. Ydinak C.M., Wagner K.L., Burton L.F. Glycosilation pattern and disulfide;, assignments of recombinant human differentiation-stimulating factor. Arch. Biochcm. Biophys., 1993, v. 302, № 2, p. 484-489.

398. Simpson E.M., Linder C.C., Sargent E.E., Davisson M.T., Mobraaten L.E., Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for targeted mutagenesis in mice. Nature Genet., 1997, v. 16, p. 19-27.

399. Singh A.M., Hamiazaki T., Hankowski K.E., Terada N. A heterogeneous expression pattern for Nanog in embryonic stem cells. Stem Cells, 2007, v. 25, № 10, p. 2534-2542.

400. Skiniotis G., Lupardus P., Martick M.3 Walz T., Garcia K.C. Structural organization of a full-length gpl30/LIF-R cytokine receptor transmembrane complex. Mol. Cell., 2008, v. 31, № 5, p. 737-748.

401. Smith A.G., Hooper M.L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev. Biol., 1987, v. 121, p. 1-9.

402. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D.,. Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotental embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature; 1988, v. 336, p. 688-690.

403. Smith A.G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. J. Tiss. Cult. Method, 1991, v. 13, p. 89-94.

404. Smith A.G. Mouse embryo stem cells: Their identification, propagation and manipulation. Cell'Biol., 1992, v. 3, p. 385-399.

405. Smith A., Metcalf D:, Nicola N.A. Differentiation inhibiting activity (DIA/LIF) and mouse development. EMBO J, 1997, v. 16, p. 451-464.

406. Smith S.K., Charnock-Jones D.S., Sharkey A.M. The role of leukemia inhibitory factor and interleukin-6 in human reproduction. Hum. Reprod., 1998, v. 13, Suppl. 3, p. 237-243.

407. Smith A.G. Embryo-derivedi stem cells: Of Mice and Men. Ann. Rev. Cell. Dev. Biol., 2001, v. 17, p. 435-462.

408. Solter Di Mammalian cloning advances and limitations. Nature Rev. Genet., 2000» v. 1, p. 199-207.

409. Soria B:, Skoudy A., Martin F. From stem cells to beta cells: new strategies of stem cell therapy of diabetes miletus. Diabetologia, 2001, v. 44, p. 401-415.

410. Soriano P., Montgomery 0., Geske R., Bradley A. Targeted disruption of the c-src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. Cell, 1991, v. 4, p. 693-702.

411. Spangenburg E.E., Booth F.W. Multiple signaling pathways mediate LIF-induced skeletal muscle satellite cell proliferation. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 20021, v. 283, p. C204-C211.

412. Stachecki J. J., Yelian F. D., Schultz J. F., Leach R. E., Armant D. R. Blastocyst cavitation is accelerated by etanol- or ionofore-indused elevation of intracellular calcium. Biol. Reprod., 1994, v. 50, p. 1-9.

413. Stachecki J.J., Armant D.R. Transient release of calcium from inositol 1,4,5-trisphosphate-specific stores regulates mouse preimplantation development. Development, 1996, v. 122, p. 2485-2496.

414. Stahl J., Gearing D., Willson T., Brown M., King J., Gough N. Structural organization of genes for murine and human leukemia inhibitory factor: Evolutionary conservation of coding and non-coding regions. J. Biol. Chem, 1990, v. 265, № 15, p. 8833-8841.

415. Stahl J., Gough N.M. Delineation of positive and negative control elements within the promoter region of the murine leukemia inhibitory factor (LIF) gene. Cytokine, 1993, v. 5, p. 386-393.

416. Stahl et al., Farrugegella TJ, Boulton T.G., Zhong Z., Darnell J.E., Yancopoulos G. D. Choice of STATs and other substrates specified by molecular tyrosine-basedimotifsin cytokine receptors. Science, 1995, v. 267, p. 1349-1353;

417. Steensberg A., Osada T., Sacchetti M., Saltin B., Klarlund P.B. Production of interleukin-6 in contracting human skeletal muscles can account for the. exerciseinduced increase in plasma interleukin-6. J: Physiol., 2000; v. 529, № 1, p. 237-242.

418. Stewart C.L., Mintz B. Successive generations of mice produced, from an established culture line of emploid teratocarcinoma cells. Proc. Natl: Acad. Sci USA, 1981, v. 78, p; 6314—6318.

419. Stewart C.L., Kasoar P., Brunet L.J., Bhatt II., Gadi I., Kontgen F., Abbondanzo S.J. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. Nature, 1992, v. 359, p. 76-79.

420. Stewart C.L. Leukemia inhibitory factor and the regulation of pre-implantation development of the mammalian embryo. Mol. Reprod. Dev., 1994, v. 39, p. 233-238.

421. Stewart C.L., Cullman E.B. Preimplantation development of the mammalian embryo and its regulation by growth factor. Dev. Genet., 1997, v. 21, № 1, p. 91-101.

422. Stojkovic M., Lako M., Stojkovic P., Stewart R., Przyborski S., Armstrong L., Evans J., Herbert M., Hyslop L., Ahmad S., Murdoch A., Strachan T.

423. Derivation of human embryonic stem cells from day-8 blastocysts recovered after three-step in vitro culture. Stem Cells, 2004, v. 22, p. 790-797.

424. Strelchenko N., Niemann A. Effects of T3-cell line conditioned medium on the formation of embryonic stem cell (ES) like cells in domestic animals. Theriogenology, 1993, v. 39, p.319.

425. Sugawara A., Gato K., Satomaru Y., Sofuni T., Ito T. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan. Comp. Med., 2006, v. 56, № 1, p. 33-36.

426. Sulkowski E. Purification of proteins by IMAG. Trends Biotech., 1985, v. 3, p. 1-7.

427. Sun H., Shi W.K. Expression of LIF gene during early development of mouse embryo. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao, 1998, v. 31, № 1, p. 105-109. 1

428. Sun L., Ma K., Wang H., Xiao F., Gao Y., Zhang W., Wang K., Gao«X„ Ip N., Wu Z. JAK1-STAT1-STAT3, a key pathway promoting proliferation and preventing premature differentiation of myoblasts. J.Cell Biol., 2007, v. 179, p. 129-138.

429. Surveyor G.A., Gendler S.L., Pemberton L., Das S.K., Chakraborty I. Expression and steroid hormonal control of Muc-1 in the mouse uterus. Endocrin., 1995, v. 136, p. 3639-3647.

430. Sutherland G.R., Baker E., Hyland V.J., Callen D.F., Stahl J., Gough N.M. The gene for human leukemia inhibitory factor (LIF) maps to 22ql2. Leukemia, 1989, v. 3, p. 9-13.

431. Sutherland A.E., Galarco P.G., Damsky C.H. Developmental regulation of integrin expression at the time of implantation in the mouse embryos. Development, 1993, v. 119, p. 1175-1186.

432. Suzuki O., Matsuda J., Takano K., Yamamoto Y., Asano T., Naiki M., Kusanagi M. Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells. Exp. Anim., 1999, v. 48, № 3, p. 213-216.

433. Tada H., Shito 0., Kuroshima K., Koyama M., Tsukamoto K. An improved colorimetric assay for interleukin-2. J. Immunl. Meth., 1986, v. 93, p. 157165.

434. Taga T., Hibi M., Hirata Y. et al. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer. gpl30. Cell, 1989; v. 58, p. 573-81.

435. Taga T. The signal transducer gpl30 is shared by interleukin-6 family of haemapoetic and neurotrophic cytokines. Ann. Med.,. 1997, v. 29, p. 63-72.

436. Taga T., Kishimoto T. Gpl30 and interleulin-6 family of cytokines. Annu. Rev. Immunol., 1997, v. 15, p. 797-819.

437. Tagaya Y., Kurys G., Thies T.A., Losi J.M1., Azimi N., Hanover J.A., Bamford R.N., Waldmann T.A. Generation of nonsecretable interleukin- 15 isoforms through alternate usage of signal peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 14444-14449.

438. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by diffined-factors. Cell, 2006, v. 126, p. 663-676.

439. Takeda K., Noguchi K., Shi W., Tanaka T., Matsumoto M., Yoshida N., Kishimoto T., Akira Sh. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc. Natl. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 3801-3804.

440. Tam P.P.L., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal' and germline liniages is influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo. Dev. Biol., 1996, v. 178, № 2, p. 124-132.

441. Tang L., Rancourt D.E. Murine implantation serine proteinases 1" and 2: structure, function and evolution. Gene, 2005, v. 30, № 364, p: 30-36.

442. Tasar P.J. Derivation of germ-line-competent embryonic stem cell* lines from preblastocyst mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, v. 102, № 23, p. 82-39-8244.

443. Taupin' J.-L., Pitard V., Dechanet J., Godart A., Jacques Y., Moreau J.-F. Leukemia inhibitory factor: part of a large ingathering family. Int. Rev. Immunol., 1998, v. 16, p. 397-426.

444. Tewari M., Dixit V. Fas- and tumor necrosis factor-induced apoptosis is inhibited by the poxvirus CrmA gene product. J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 32553260.

445. Thie M., Denker H.W. Endometrial receptivity for trophoblast attachment: Model studies using cell lines. In: "Microskopy of Reproduction and.Development: A dynamic approach. Ed. P.M. Motta, Antonio Delfino Editor, Rome, 1997, p. 241-249.

446. Thomson I.A., Iskoviz-Elor J., Sharipo S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J'., Marshall Y.S., Jones J.M. Embryonic cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998, v. 282, v. 5391, p. 1145-1147.

447. Thomson J.A., Marshal V.S. Primate embryonic stem cells. Current Topics in Dev. Biol., 1998, v. 38, p. 133-165.

448. Thomson M!, Liu S.J., Zou L.-N., Meissner A.m Ramanathan S. Pluripotency factor in embryonic stem cells regulate differentiation1 into germ layers. Cell, 2011, v. 145, p. 875-889.

449. Tian L., Catt J.W., O'Neill C., King N.J. Expression of immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules on murine embryonic stem cells. Biol. Reprod., 1997, v. 57, № 3, p. 561-568.

450. Tokito J., Al-Awqati Q. Conversion of ES cells to columnar epithelia by hensin and to squamous epithelia by laminin. J. Cell Biol., 2004, v. 166, № 7, p. 1093-1102.

451. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse, myeloid leukemia Ml cells from conditioned of mouse fibroblast L929 cells. J. Biol. Chem., 1984, v. 259; p. 10978-10982.

452. Tomida M., Heike T., Yokota T. Cytoplasmic domains of the leukemia inhibitory factor receptor required for STAT3 activation, differentiation, and growth arrest of myeloid leukemic cells. Blood, 1999, v. 93, p. 1934-1941.

453. Tomida M. Structural and functional studies on the leukemia inhibitory factor receptor required for differentiation and growth arrest of myeloid leukemic cells. Leuk. Lymphoma, 2000, v. 37, p. 517-25.

454. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cell can from germ cell in vitro. Pro'c. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, v. 100, № 20, p. 1145711462.

455. Tropea J.E., Cherry S., Waugh D.S. Expression and purification of soluble / His(6)-tagget TEV protease. Methods Mol. Bio., 2009, v. 298; p. 297-307. 1

456. Trounson A. The .Production and Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells, 2006, v. 27, p. 208-219.

457. Ueda O., Jishage K., Kamada N., Uchida S., Suzuki H., Prodaction of mice cnterely derived from embryonic stem (ES) cells with many passages by coculture of ES cells with cytochalasin B induced tetraploid embryos. Exp. Anim., 1995, v. 44, p. 205-210.

458. Uhlmann" F. Secured cutting: controlling separase at the metaphase to anaphase transition. EMBO reports, 2001, v. 21, № 61, p. 487-492.

459. Varki A. Loss of N-glycolylneuraminic acid in humans: mechanisms, consequences and implications for hominid evolution. Yearb. Phys. Anthropol., 2002, v. 44, p. 54-69.

460. Vassilopoulos G., Russell D.W. Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity . and.its therapeutic implications.: Gurr. Opin Genet. Dev., 2003; v. 13; №5; p. 480-485. , ,

461. Vaux D., Korsmeyer S.J; Cell death in development. Cell, 1999, v. 96« p. 245254.

462. Vazin T., Chen J., Lee C.T., Amable R., Freed W.J. Assessment of stromal derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells, 2008; v. 26, № 6, p. 1517-1525.

463. Vesela I., Kotasova H., Jankovska S., Prochazkova J., Pachernik J. Leukaemia Inhibitory Factor inhibits cardiomyogenesis of mouse embryonic stem cells via STAT3 activation. Folia Biol., 2010, v. 56, p. 165-172.

464. Vodyanik M.A., Bork J.A., Thomson J.A., Slukvin I.I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood, 2005, v. 105, №2, p. 617-626.

465. Vogiagis D., Marsh M.M., Fry R.C., Salamonsen L.A. Leukemia inhibitory factor in human endometrium throughout the menstrual cycle. J. Endocrinology, 1996, v. 148, p. 95-102.

466. Vogiagis D., Salamonsen L.A. The role of leukemia inhibitory factor in the establishment of pregnancy. J. Endocrinol., 1999, v. 160, p. 181-190.

467. Voss A.K., Thomas T., Petrou P., Anastassiadis K., Scholer H., Gruss P. Taube nuss is a novel gene essential for the survival of pluripotent cells of early mouse embryos. Development, 2000, v. 127, № 24, p. 5449-5461.

468. Voyle R.B., Haines B.P., Pera M.F., Forest R., Rathjen P.D. Human germ cell tumor lines express novel leukemia inhibitory factor transcripts and differentially localized proteins. Exp. Cell Res. 1999, v. 249, p. 199-211.

469. Voyle R.B., Rathjen P.D. Regulated expression of alternate transcripts from the mouse oncostatin M gene: implications for interleukin-6 family cytokines. Cytokine, 2000, v. 12, p. 134-141.

470. Wagner R.T., Xu X., Fei Yi., Bradley J.M., Cooney A.J. Canonical Wnt/b-catenin regulation of liver receptor homolog-1 mediates pluripotency gene expression. Stem Cells, 2010, v. 28, p. 1794-1804.

471. Wakayama T., Yanagimachi R. Dependent of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nature Biotech., 1998, v. 16, p. 639-641.

472. Wakayama T., Rodriguez I., Perry A., Yanagimachi R., Mombaerts P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v.96, p.109-110.

473. Wakayama T., Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol. Reprod. Dev., 2001, v.58, p.376-378.

474. Wakayama T., Tabar V., Rodriguez I., Perry A.C., Studer I., Mombaets P. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science, 2001, v. 297, p. 740-743.

475. Wang Y., Kinzie E., Duplomb L., Godart A., Baumann H. Oncostatin M regulates the synthesis and turnover of gp 130, Leukemia inhibitory factor

476. Receptor, and Oncostatin M Receptor by distinct mechanisms. J. Biol. Chem., 2001, v. 276, № 50, p. 47038-47045.

477. Watanabe S., Umehara H., Murayama K., Okabe M., Kimura T., Nakano T. Activation of Akt signalling is sufficient to maintain pluripotency in mouse and primate embryonic stem cells. Oncogene, 2006, v. 25, p. 156-163.

478. Watson AJ, Barcroft LC. Regulation of blastocyst formation. Front. Biosci., 2001, v. 6, p. 708-730.

479. Vazin T., Freed W. Human embryonic stem cells: derivation, culture, and differentiation. Restor. Neurol. Neurosci., 2010, v. 28, № 4, p. 589-603.

480. Weber J.D., Raben D.M., Phillips P.J., Baldassare J.J. Sustained activation of extracellular-signal-regulated kinase 1(ERK1) is regulated for the continued expression of cyclin D1 in G1 phase. Biochem. J., 1997, v. 326, p. 61-68.

481. Wen Z., Darnell Jr. J.E. Mapping of Stat3 serine phosphorylation to a single residue (727) and evidence that serine phosphorylation has no influence on DNA binding of Statl and Stat3. Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, p. 20622067.

482. Wey Y., Harris T., Childs G. Global gene expression patterns during neural differentiation of PI 9 embryonic carcinoma cells. Differentation, 2002, v. 70, p. 204-219.

483. White W.M., Willard H.F., Van Dyke D.L., Wolff D.J. The spreading of X inactivation into autosomal material of an X; autosome translocation: evidence for a difference between autosomal and X-chromosomal DNA. Am. J. Genet., 1998, v. 63, № 1, p. 20-28.

484. Wianny F., Real F.X., Mummery C.L. et al. G-l. phase regulators. Cyclin Dl, Cyclin D2, Cyclin D3: up-regulation at gastrulation and dynamic expression during neurolation. Dev. Dyn., 1998, v. 212, p. 49-62.

485. Wiles M.V., Keller G. Multiple hematopoietic lineages develop from embryonic stem (ES) cells in culture. Development, 1991, v. 111, p. 259-267.

486. Wiles M.V., Johansson B.M. Embryonic stem cell development in a chemically defined medium. Exp. Cell Res., 1999, v. 247, p. 241-248.

487. Williams R.L., Courtneidge S.A., Wagner E.F. Embryonic lethalities and endothelial tumours in chimaeric mice expressing polyoma virus middle T oncogene. Cell, 1988a, v. 52, p. 121-131.

488. Williams M.R., Arthur J.S.C., Balendran A., Kaay J., Poli V., Alessi D.R. The role of 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 in activating AGC kinases defined in embryonic stem cells. 2000, v. 10, № 8, p. 439-448.

489. Willson T.A., Metcalf D., Gough N.M. Cross-species comparison of the sequence of the leukaemia inhibitory factor gene and its protein. Eur. J. Biochem., 1992, v. 204, № 1, p. 21-30.

490. Winslow T. The embryonic stem cell. In: Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Direction, National Institute of Health, Depart. Health and Human Services, 2001, p. 5-10 (www.nih.gov/stemcell/scireport.htm).

491. Wobus A.M. Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization ofpluripotent stem cell line derived from mouse embryo. Exp. Cell. Res., 1984, v. 152, p. 212-219.

492. Wobus A.M., Guan K., Yang H.T., Boheler K. Embryonic stem cells as a model to study cardiac, skeletal muscle, and vascular smooth muscle cell differentiation. Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols, Methods in

493. Molecular Biology (ed. Turksen K.), N.-J.: Humana, 2002, v. 185, p. 127156.

494. Wobus A., Boheler K. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Phys. Rev., 2005, v. 85, p. 635-678.

495. Wood S.A., Allen N.D:, Rossant J., Auerbach A., Nagy A. Non-injection methods for the production of embryonic stem cell-embryo chimaeras. Nature, 1993, v. 365, p. 87-89.

496. Wulf E., Kramer R., Polejaeva I., Thoenen H., Brem G. Efficient generation'of chimaeric mice using embryonic stem cells after long term culture in the presence of ciliary neurotrophic factor. Transgen. Res., 1994, v.3, p. 152-158.

497. Xu C., Inokuma MiS., Denhham J., Golds K., Kundu P., Golds J., Carpenter M.K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Natl. Biotech., 2001, v. 19; № 10, p. 971-974.

498. Xu R.H., Peck R.M., Li D.S., Feng X., Ludwig T., Thomson J.A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat. Methods, 2005, v. 2, p. 185-190.

499. Yamada T., Yoshkawa M., Kanda S. et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. Stem cells, 2002, v. 20, p. 146-154.

500. Yamamori T., Fukada K., Aebersold R., Korsching S., Farm M.-J., Patterson P.H. The cholinergetic neuronal differentiation factor from heart cells is identical to leukemia inhibitory factor. Science, 1989, v. 246, p. 1412-1416.

501. Yamamoto-Yamaguchi Y., Tomida M., Hozumi M-. Prolongation by differentation-stimulating factor/leukemia inhibitory factor of the survival time of mice implanted with mouse myeloid leukemia cells. Leuk. Res., 1992, v. 16, p. 1025-1029.

502. Yamanaka Y., Ralston A., Stephenson R.O., Rossant J. Cell and molecular regulation of mouse blastocyst. Dev. Dyn., 2006, v. 235, № 9, p. 2301-2314.

503. Yanagida E., Shoji S., Hirayama Y:, Yoshikawa F., Otsu K., Uematsu H., Hiraoka M., Furuichi T., Kawano S. Functional expression of Ca2+ signalingpathways in mouse embryonic stem cells. Cell Calcium, 2004, v. 36, № 2, p. 135-146.

504. Yang Z.M., Chen D.B., Le S.P., Harper M.J. Differential hormonal regulation of leukemia inhibitory factor (LIF) in rabbit and mouse uterus. Mol. Reprod. Dev., 1996; v. 43, p. 470-476:

505. Ying Q.-L., Nichols J.,. Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustsins embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell, 2003, 115, № 3, p. 281-292.

506. Yoshida K., Chambers I., Nichols I., Smith A.G., Yasukawa K., Shoyab M., Taga T., Kishimoto T. Maintenance of the pluripotental phenotype of embryonic stem cells through direct activation of gp 130 signaling pathways. Mech. Dev. 1994, v. 45, 163-172.

507. Yu J., Hu K., Smuga-Otto K., Tian S., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. Human induced'pluripotent stem cells free of Vector and transgene sequences. Science, 2009, v. 324, p. 797-801.

508. Zamponi G.W., Bourinet E., Nelson D:, Nargeot J., Snutch T.P. Crosstalk between G proteins and protein kinase C mediated by' the calcium chanal alpha 1 subunit. Nature, 1997, v. 385, № 6615, p. 442-446.

509. Zhang X.F., Ge Z.L., Sun L.Y., Ding Q.M., Zhang Q.W., Cao H., Yuan L.Z. Cloning and expression' of the gene coding for the fusion protein rhGM-CSF/LIF. Sheng Wu (Shanghai), 1997a, v. 29, № 5, p. 425-431. 1

510. Zhang J.G., Owczarek C.M., Ward L.I., Howlett G.J., Fabri L.J., Roberts B.A., Nicola N.A. Evidence for the formation of a heterotrimeric complex of leukemia inhibitory factor with its receptor subunits in solution. Bioch. J., 1997b, v. 325, p. 693-700.

511. Zhang S.C., Wernig M., Duncan I.D., Briistle O., Thomson J.A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol., 2001, v.19^№ 12, p. H29-1133.

Информация о работе

Межевикина, Людмила Михайловна
доктора биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль лейкемия ингибирующего фактора в процессах роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и в раннем эмбриогенезе - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы