Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль лактатдегидрогеназной системы в патогенезе алкогольного поражения сердца и атеросклероза человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль лактатдегидрогеназной системы в патогенезе алкогольного поражения сердца и атеросклероза человека"

3 ^ '

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КУПАЕВ Виталий Иванович

УДК 615.9:547.2:616.127-003:616.13-002.2:577.154

РОЛЬ ЛАКТАТДШГИДР0ГЕНАЗН0Й СИСТЕМЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ АЛКОГОЛЬНОГО ПОРАНЕНИЯ СЕРДЦА И АТЕРОСКЛЕРОЗА ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 1992

Работа выполнена в Самарском медицинском институте имени Д. И. Ульянова.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Ф.Н.ГИЛЬМИЯРОВА.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор П.Н.ШАРАЕВ;

доктор биологических наук В.И.МУРОНЕЦ.

Ведущая организация - Российский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится " "_1992 г.

в часов на заседании специализированного Совета К 084.35.0* при Башкирском государственном медицинском институте (450000, г.Уфа, ул.Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Б1Ж (450000, г.Уфа, ул.Ленина, 3).

Автореферат разослан " "___1992 г.

Ученый секретарь специа лизиро ванного Совета доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.ДШЕТ0В

ОНЦАП ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема алкогольной интоксикации •продолжает оставаться актуальной, несмотря на столетнюю историю изучения этого вопроса.

Установлено, что 74,3 % больных алкоголизмом умирают от соматических заболеваний, среди которых на первом месте по частоте находятся заболевания сердечно-сосудистой системы (30-50$), проявляющиеся в хронической недостаточности кровообращения и различными нарушениями ритма (Моисеев B.C., 1984; Вихерт A.M., Цыпленкова В.Г., 1985; Миндлин Я.С., Косаговская И.И., 1986;

Cserhalmi L. t J987).

Отсутствие единой картины патогенеза токсического действия алкоголя на сердце человека делает целесообразным изучение метаболических процессов в миокарде при данной патологии. В патологический процесс вовлекаются все еиды метаболизма. Мы остановили свое внимание на изучении углеводного обмена, особенно его анаэробного звена. Важность поставленной задачи объясняется, с одной стороны, большой ролью гликолиза в регуляции энергообмена миокарда и, в частности, его проводящей системы ( Jedekin А 1962; Chyumi М. , 1975; Lleijer А.Е.Е.Н. .Vriea do G .P. ,1978; Elias E .A.et al . , 1982). Именно сложные нарушения ритма, среди кототрых превалируют желудочковые экстрасистолии, являются основными проявлениями алкогольного поражения сердца и предвестниками внезапной смерти. С другой стороны, противоречивой оота-ется роль анаэробных процессов при употреблении этанола, особенно его ключевых звеньев, одним из которых является заключительная фаза гликолиза, катализируемая лактатдегидрогеназой. Это объясняется во многом односторонним подходом к рассмотрению этого вопроса, проведением исследований на лабораторных животных, что не может в полной мере быть экстраполировано на человека.

Другой важный аспект работы - это проблема атеросклероза. Наряду с существующими теориями его возникновения в последнее время получено немало доказательств взаимосвязи нарушений углеводного обмена с развитием атеросклеротического процесса, йлесте с тем весьма спорным остается вопрос антиатерогенного эффекта этилового спирта. Вменение этого механизма на уровне ферментативной регуляции в настоящий момент остается открытым.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выяснить роль заключительного звена анаэробного окисления углеводов в формировании патохимических изменений при алкогольной интоксикации в тканях сердечно-сосудистой системы человека. В связи с этим определены следующие ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) получить лактатдегидрогеназу из аутопсийного материала миокарда человека;

2) изучить каталитическую активность фермента в прямой и обратной реакциях превращения пировиноградной кислоты в молочную;

3) исследовать изоферментный спектр лактатдегидрогеньзы миокарда и аорты человека при алкогольной интоксикации., атеросклерозе и сочетании этих двух патологических процессов;

4) определить содержание молочной и пировиноградной кислот в крови, аорте и сердечной мышце человека во всех изучаемых группах;

5) исследовать влияние этанола на кинетические параметры лактатдегидроганезы человека в условиях in vitro ;

6) сравнить показатели константы Михаэлиса изучаемого фермента к субстратам и коферментам контрольной группы и при алкогольной интоксикации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Вгервые изучено заключительное звено анаэробного окисления углеводов в аутопсийном материале сердца и аорты человека при алкогольной интоксикации и сочетании ее с атеросклеротическим процессом. При этом рассмотрены в совокупности реакции восстановления пирувата и окисления молочной кислоты, изоферментный спектр, содержание метаболитов, что позволило выявить разнонаправленный характер изменений в лактатдегид-рогеназной системе при алкогольном и атеросклеротическом поражении миокарда и сосудистой отенки, а также продемонстрировать антиатерогенный эффект этанола на молекулярном уровне.

Впервые исследованы механизмы изменения свойств лактатде-гидрогеназы миокарда человека при алкогольной интоксикации путем определения константы Михаэлиса к субстратам и коферментам, регистрации константы скорости и полупериода реакции после воздействия на фермент различных концентраций этилового спирта в условиях in vitro . Все это позволило обнаружить значительное уменьшение сродства к коферменту НАД.Н и рефрактерноеть лактат-дегидрогеназного комплекса к прямому воздействию этанола. Данное обстоятельство явилось еще одним доказательством определяющей

роли коферментного регулирования катализа лактатдегидрогеназы при алкогольной интоксикации, где одним из основных патогенетических звеньев является избыток НАД.Н. Показана стабилизирующая роль лактатдегидрогеназной системы в поддержании гомеостаза в условиях угнетения аэробных процессов энергообеспечения.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Исследован заключительный этап анаэробного окисления углеводов в сердечно-сосудистой системе человека при атеросклерозе и алкогольной болезни. Полученные данные углубляют представление о патогенезе алкогольного поражения сердца и сосудов человека, выявляют изменения углеводного обмена при алкогольной интоксикации и атеросклерозе, имеющих во многом разнонаправленный характер.

Дано объяснение одному из механизмов антиатерогенного действия этилового спирта, выражающегося в активации процессов восстановления пирувата.

Анализ полученных результатов дает возможность для последующего поиска вариантов рациональной энзимотерапии, для коррекции кардиотоксического действия больших доз экзогенного этанола.

МАТЕРИАЛЫ РАБОТЫ ДОЛОЖЕНЫ на студенческих научных конференциях Самарского медицинского института в 1985-1987 годах, Самарского государственного университета - в 1985 и 1986 годах, Астраханского медицинского института - в 1986 году, Тбилисского государственного медицинского института - в 1988 году; на Всероссийских конференциях: "Физиология и патология сердечно-сосудистой системы" (Воронеж, 1987), "Современные проблемы медицинской химии и клинической лабораторной диагностики" (Хабаровск, 1989); на научно-практических конференциях врачей "Новое, прогрессивное - в практику здравоохранения" (Ульяновск, 1989), а также на Итоговой годичной конференции ЦНИЛ Самарского медицинского института в 1991 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ШНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

I. При алкогольной интоксикации'человека наблюдается активизация процессов восстановления пирувата до молочной кислоты в сердечной мышце наряду с изменением физико-химических параметров лактатдегидрогеназы, выражающихся в отклонении К^ для субстратов и коферментов, а таете смещением изоферментного спектра с преобладанием иэоформ ЛДГд и ЛДГд.

2. Сравнительное изучение состояния заключительного этапа гликолиза в миокарде, аорте, крови при атеросклерозе и алкогольной интоксикации выявило противоположный характер изучаемых показателей.

3. При сочетании атеросклероза и алкогольной интоксикации в миокарде, стенке аорты и крови происходит нивелирование изменений в лактатдегидрогеназной системе, характерное для атеросклероза.

4. Лактатдегидрогеназная система является мощным защитным механизмом, выполняющим гомеостатическую функцию в организме человека при алкогольной интоксикации и ее сочетании с атеросклерозом.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Текст диссертации изложен на 167 страницах машинописи, иллюстрирован 23 таблицами, 24 рисунками. Список литературы содержит 146 отечественных и 194 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил аутопсийный материал сердца и аорты скоропостижно умерших людей с признаками алкогольной интоксикации, атеросклероза, при сочетании этих патологических состояний и контрольной группы без морфологических признаков каких-либо заболеваний, с момента смерти которых прошло не более 24 часов. Отбор аутопсийного материала осуществлялся согласно принятым требованиям (Вихерт В.М., Жданов B.C., 1976), при этом исключались все виды интоксикаций, кроме алкогольной, выраженная соматическая патология. Уровень этанола в крови подтверждался данными судебно-химического анализа крови и мочи на содержание этанола. Степень атеросклеротического поражения производилась по классификации и схемам, предложенным Г.Г.Автавдиловым. Средний возраст в контрольной группе составил 30 ± 2,1 лет, в группе алкогольной интоксикации - 34 ± 2 года, с признаками атеросклероза - 51 ± 2 года, при сочетании указанных патологических состояний - 55 ± 2,2 года. Все исследованные лица были преимущественно мужского пола. Изучено 112 случаев.

Используя метод градуального осаждения сульфатом аммония

из фосфатного экстракта глыщ при температуре, равной 0°С, были получены ферментные препараты, обогащенные лактатдегидрогеназой, выделенной из миокарда человека. Лактатдегидрогеназная система аорты изучалась в гомогенате.

Активность лактатдегидрогеназн определялась спектрофото-метрически как в реакциях окисления молочной кислоты, так и при восстановлении пирувата в лактат. Уровень метаболитов в крови, миокарде, аорте регистрировался по модифицированной методике, разработанной на кафедре биохимии Самарского медицинского института (Гильмиярова Ф.Н. и др., 1986).

Исследование изоферментного спектра лактатдегидрогеназн проводилось с помощью вертикального гель-электрофореза с последующими специфической окраской по методике v/hitt (1970) и денситометрированием на анализаторе фореграмм АФ-1.

В работе анализировались некоторые кинетические параметры лактатдегидрогеназн; при этом регистрировалась константа Михаэлиса к коферментам и субстратам при алкогольной интоксикации, определялась константа скорости и полупериод реакции восстановления пирувата при воздействии in vitro различных концентраций этанола. Все результаты по ферментативной кинетике подвергались компьютерной обработке на СМ 1420. Статистическая обработка проводилась на МК-56 с использованием соответствующих программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Функциональное состояние лактатдегидрогеиазной системы в тканях человека при алкогольной интоксикации

Изучению свойств лактатдегидрогеназн, как фермента, регулирующего обменные процессы в миокарде, посвящено немало исследований. Но только в немногих этот участок метаболизма рассматривается в комплексе с учетом обратимости ферментативной реакции превращения молочной кислоты в пировинограднуи. В связи с этим наши исследования показали, что в сердечной мышце и аорте изменяется направленность реакции превращения пирувата в лактат. Но характер этих изменений при алкогольной интоксикации и атеросклерозе не идентичен. Активность лактатдегидро^-геназы миокарда человека в реакции восстановления пирувата

в лактат при алкогольной интоксикации равнялась 26,74 ^ 1,06 мкмоль НАД.Н/мг.мин, что на 58 % выше контроля. При атероскле-ротическом процессе и при сочетании с алкогольной интоксикацией достоверных изменений в суммарной активности фермента не обнаружено; она соответственно находилась на уровне 15,84 ± 0,68 и 16,50 + 0,56 мкмоль НАД.Н/мг.мин (рис.1).

ISO.

Реакция восстаномения

ПИРУВАТД

К AT К АИ К ДИ-ДТ к- коитюдк

ЛИ - АЛКОГОЛЬНАЯ ИМТОМИКАЦМЯ

Реакция окисления ЛАКТАТД

К AT К АН К ли»лт

AT - АТ1»«<вл1>«> АТ«4И - СМ1ШДННДЯ rtynn«

Рис.1. Соотношения суммарной активности лактатдегидро-геназы в миокарде человека (нх - Р<0,005)

Реакция окисления молочной кислоты в пировиноградную, как правило, превалирует в миокарде, что повышает ее значимость в изучении терминальной стадии гликолиза. Анализ суммарной активности лактатдегидрогеназы в этой реакции показывает, что в контроле она соответствует 0,384 ¿0,02 мкмоль НАД.Н/мг.мин, а при алкогольной интоксикации - 0,289^0,01 мкмоль НАД.Н/мг.мин, что достоверно на 24,7 % меньше, чем в первой группе. Подобное снижение на 25 % наблюдается и при атеросклерозе, где активность равнялась 0,288 ± 0,005 мкмоль НАД.Н/мг.мин. Однако в группе сочетания алкогольной интоксикации с атеросклеротическим поражением значимых отличий от показателей в контрольной группе не обнаружено (рис.1).

Изучение активности лактатдегидрогеназы в гомогенатах аорты показало, что реакция протекает преимущественно в сторону

восстановления пировиноградной кислоты в молочную. Эта закономерность проявляется во всех группах, в том числе и контроле. В реакции восстановления пирувата активность лактатдегидрогена-зы в контроле была 0,185 ± 0,005 мкмоль НАД.Н/мг.ыпн, при алкогольной интоксикации - 0,18 ± 0,016 мкмоль ПЛД.Н/мг.мин. В группе субъектов с атеросклерозом и его сочетаниях с алкогольной интоксикацией этот показатель соответствовал 0,31±0,022 мкмоль НАД.Н/мг.мин и 0,165 + 0,0096 мкмоль НАД.Н/мг.мин. Сравнивая эти данные с контролем, можно констатировать увеличите на 68 % активности лактатдегидрогеназы аорты только при атеросклерозе и отсутствие изменений в других группах (рис.2).

200.

КО. 100.

50.

к аи к ат к ат»аи к - КОЧТРвАЬ дт- ДГ1РОСКЛ1Р01

АИ - алкогольная интмсикдция АТ'АИ- смсманная г»упш|

Рис.2. Соотношение активности лактатдегидрогеназы аорты человека в реакции восстановления пирувата (к - Р<0,05)

Следовательно, при интоксикации этанолом в миокарде происходит увеличение активности фермента при восстановлении пирувата в лактат и снижение ее в реакции окисления молочной кислоты в пировиноградную, чего не происходит в аорте. При атеросклерозе наблюдается уменьшение процесса окисления лактата в сердечной мышце и усиление восстановления пирувата в аорте. Но при сочетании атеросклеротического и алкогольного поражения активность лактатдегидрогеназы не меняется.

Характер изменения каталистической активности лактатдегидрогеназы в миокарде подтверждается данными, полученными при

изучении ее изофсрментного спектра.

Сердечная мшца в нормальных условиях имеет свой специфический изоферментный спектр, в котором преобладают изоэнзимы ЛДГ1 и ЛДГ2' катализирующие в основном превращение лактата в пируват. Эту закономерность также подтвердили наши наблюдения в контрольной группе, где соотношение изоферментов ЛДГ1 : ЛДГ2 ЛДГ3 : ЛДГ4 можно представить как 6,5 : 4,5 : 1,0 : 0,11. Это соотношение при алкогольной интоксикации составило 3,0 : 2,1 : 1,0 : 0,4; при атеросклерозе - 3,4 : 3,7 : 1,0 : 0,3; при сочетании атеросклеротического поражения с алкогольным - 2,3 : 2,3 1,0 : 0,4. В отдельных случаях при атеросклерозе и сочетании с алкогольной интоксикацией регистрировалась изофорла ЛДГ5. Следовательно, при интоксикации этанолом и атеросклерозе в миокарде- человека наблюдаются существенные сдвиги изоферментного спектра в сторону увеличения М субъединиц лактатдегидрогеназы. Так, при алкогольной интоксикации достоверно увеличивается содержание ЛДГд и ЛДГ4 (рис.3).

«о

$9 40

90 90 10 0

ДДГ-4 ЛДГ-3 ЛАГ-2 АДГ-1

I I К0МТ»0«к

опит

Рис.3. Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы

миокарда в контроле и при алкогольной интоксикации (к - Р<0,05; «к - Р<0,005)

При атеросклерозе и его сочетании с алкогольным поражением наряду с повышением ЛДГ3 и ДЦГ4 достоверно уменьшается изо-энзим ЛДГТ (рис.4).

Рис.4. Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы

миокарда в контроле"и при сочетании атеросклероза и алкогольной интоксикации (эвг - Р< 0,005)

Характеристика ферментативной системы лактатдегидрогеназы была бы неполной без анализа ее метаболитов: лактата и пирувата, тем более, что лактат в миокарде не является тупиковым метаболитом, а выполняет роль энергоносителя.

Анализ содержания пировиноградной кислоты показал, что в крови ее уровень в контрольной группе составил 0,319 ± 0,014 мкмоль/мл, при алкогольной интоксикации - 0,267+0,0093 мкмоль/мл, при атеросклерозе этот показатель равнялся 0,186+0,007 мкмоль/мл, что на 16 и 42 % соответственно достоверно ниже данных контроля. При сочетании атеросклеротического и алкогольного поражений уровень пирувата соответствовал 0,27 ± 0,023 мкмоль/мл, что приближается к показателям контрольной группы.

Содержание пирувата в сердечной мышце во всех трех группах превышало уровень контроля, который составил 0,071 ± 0,0063 мкмоль/мл. При алкогольной интоксикации пировиноградная кислота обнаружена в количестве 0Д34 ± 0,017 мкмоль/мл, при атеросклерозе - 0,188 ± 0,028 мкмоль/мл, при совместном воздействии -

0,137 ± 0,0093 мкмоль/мл.

Те же исследования содержания данной кетокислоты в аорте показали, что уровень ее был повышенным только при интоксикации этанолом и соответствовал 0,108 + 0,013 мкмоль/мл (рис.5).

кровь сь»д(;е аорта

К »» И И<М К Ы IT «•«* К *« «Т 1М»

К - И«ГН<1 АТ - ATIMIMIM»

АН-дцмгнмда ттищи ДТ* ДИ - см|и»»м«м»«и

Рис.5. Содержание пирувата при алкогольной интоксикации и атеросклерозе (к - Р<0,05; «к - РС0.005)

Определение молочной кислоты выявило снижение ее уровня в крови при алкогольной интоксикации, атеросклерозе на 34,0 и 22,2 % соответственно. В миокарде подобная закономерность" была выявлена при потреблении этанола и в группе субъектов с признаками алкогольного поражения и сочетания с атеросклерозом. В то же время в аорте содержание лактата было повышенным, особеш при атеросклерозе (на 52 %) (рис.6).

Рассматривая соотношение лактата и пирувата в тканях при изучаемых нами патологических состояниях, следует отметить значительное его снижение при алкогольной интоксикации. Так, лактат-пируватный коэффициент в миокарде и аорте в норле был равен 717 и 343, при алкогольной интоксикации - 219 и 301. В крови наблвдалась аналогичная тенденция: этот показатель снизился с 223 до 175. Однако при атеросклерозе аорты была выявлена противоположная закономерность - соотношение лактата к пи-рувату было на 43 % выше контрольных цифр.

КРОВЬ

СЕРДЦЕ

АОРТА

К «и «г лт.ди К - контроль

аи - алкогольная ингнсиклцио

к ан ат лми к дн ат «т*дк

АТ - Атеросклероз АЬАИ - смсшаннля группа

Рис.6. Содержание лактата при алкогольной интоксикации и атеросклерозе (* - Р<0,05; ж - Р<0,005)

Таким образом, исследование тканей выявило значительное повышение уровня пирувата и уменьшение соотношения лактат/пиру-ват в сердечной мышце как при алкогольной интоксикации, так и при атеросклерозе. Это свидетельствует о накоплении пировиноградной кислоты в результате угнетения аэробных процессов окисления и невозможности ее превращения в ацетальдегид ввиду избытка последнего при интоксикации этанолом. В сосудистой стенке процессы, протекающие в заключительном звене гликолиза, более подвержены воздействию атеросклероза, чем алкогольной интоксикации, что подтверждается усилением процесса восстановления пирувата и, как следствие, накоплением молочной кислоты и увеличением соотношения лактата и пирувата.

Анализируя функциональное состояние лактатдегидрогеназной системы при сочетании атеросклеротического процесса и алкогольной интоксикации, следует заметить, что происходит нивелирование изменений, характерных для атеросклероза. Это проявляется стабилизацией активности лактатдегидрогеназы как в прямой, так и обратных реакциях, выравнивается соотношение лактата и пирувата в крови, аорте и миокарде.

2. Изучение кинетических свойств лактатдегидрогеназы миокарда человека при интоксикации этанолом

Лактатдегидрогеназа выделялась в трех фракциях: 0,45; 0,5; 0,55, соответствующих степени насыщения сульфатом аммония. Но, как показали наши дальнейшие исследования, в изучаемых группах распределение фермента было неоднородным и зависело от степени высаливания. Так, в контрольной группе максимальная активность фермента в реакции восстановления пировиноградной кислоты определялась во фракции 0,45 и соответствовала 10,68 ± 1,1 мкмоль НАД.Н/мг.мин, при алкогольной интоксикации максимальная активность наблюдалась в препаратах со степенью насыщения сульфатом аммония 0,5 и составляла 14,0 ± 0,016 мкмоль НАД.Н/мг.мин. Подобная закономерность прослеживалась и в реакции окисления лактата (рис.7).

Реакция постановлении

ПИРУМТА

Реакция окисления

лактата

1° .

5 .

А

W-

«.i.

i-1-1-1 ■ i

0,4! 0.5 0,55 фр

К- КОНТРОЛЬ

АИ-АЛКопм»цдя икгвкснмчия

\(\

/X Л «и

/

Л

0.<|Б 0,» 0,55

фР

Рис.7. Динамика активности лактатдегидрогеназы по фракциям (к - Р<0,05; «к - Р<0,005)

Повышение степени насыщейия сульфатом аммония, необходимого для высаливания фермента, свидетельствует об изменении его физико-химических свойств. Это может быть обусловлено либо изменением электростатической стабильности молекулы, либо увеличением ее гидрофильноети. При электрофорезе не выявили отклонений в подвижности изоферментов при алкогольной интоксикации

к

о

по сравнению с контролем. Возрастание гидрофильноети, возможно, является результатом воздействия алкоголя непосредственно на белковую молекулу. Чтобы ответить на этот вопрос, были поставлены опыты in vitro.

Ранее было установлено, что ацетальдегид, обладающий высокими окислительными свойствами, в условиях in vitro не влиял на каталитические свойства лактатдегидрогеназы, в отличие от других ферментов ( Dronou Л. et al. , 1985). Этанол - менее активный метаболит, но он присутствует в организме в более высоких концентрациях, чем ацетальдегид, и воздействие его становится более длительным на ту или иную ферментативную систему. Но, как показали наши исследования, воздействие этанола в условиях in vitro в достаточно высоких концентрациях: 1,7; 3,5; 5,2 М при экспозиции от минуты до часа - существенно не влияло на константу скорости реакции, катализируемой лактатдегидроге-назой. Только в контрольной группе при концентрации этанола 3,5 и 5,2 М после экспозиции в I час константа фермента снижалась на 28 и 27 % соответственно и равнялась (6,2+0,47)-Ю-3 и (6,33±0,68)'10"^ с"1, что проявляется более пологим характером графика реакции (рис.8).

Рис.8. Кривые реакции восстановления пирувата в лактат, катализвдгемой лактатдегвдрогеназой контрольной группы при внесении этанола

Аналогичные эксперименты, проведенные с лактатдегидрогена-зой, выделенной из сердечной мышцы лиц с алкогольной интоксикацией, не выявили достоверных изменений константы даже при высокой концентрации этанола, равной 5,2 М при экспозиции в I час. Малые концентрации этилового спирта способствовали возрастанию активности фермента. Бее это указывает на взаимодействие этанола с лактатдегидрогеназой, проявляющееся б положительном дозо-зависимом эффекте на каталитические свойства фермента. Подобное взаимодействие гидроксильных ионов можно расценивать как стабилизирующий фактор, направленный на поддержание баланса анаэробных гликолитических процессов в миокарде при алкогольной интоксикации.

Это утверждение тем более справедливо, если учесть, что алкогольное поражение организма нарушает баланс коферментов НАД.Н и НАД, приводит к дезинтеграции НАД-зависимых дегидроге-наз (Шишов В.И. и др., 1977; Дзяк В.П. и др., 1980; Гильмияро-ва Ф.Н. И др., 1983; Нее1у а. et а1. , 1973).

Совершенно бесспорным является то, что на лактатдегидро-геназу оказывают влияние коферменты НАД.Н и НАД, а также субстраты: лактат и пируват. Их соотношение определяет каталитические особенности этого ферментативного комплекса. Сравнивая данные, полученные при определении константы Михаэлиса (К^) к коферментам и субстратам лактатдегидрогеназы, нами были установлены отличия в показателях контрольной группы и алкогольной интоксикации. Так, по сравнению с контрольной константа Михаэлиса к пирувату и НАД снижалась соответственно на 28 и 30 % и составила 3,24-10~5 М и 6,48*Ю-4 М. Следовательно, можно говорить о некотором увеличении сродства лактатдегидрогеназы к этим двум веществам.

Нами не были установлены существенные изменения константы к молочной кислоте. Однако при анализе данных, полученных при определении К^ к НАД.Н, выявлено значительное уменьшение сродства к этому коферменту. В контроле Км к НАД.Н составила 0,88«10"^ М, а при алкогольной интоксикации это соотношение было равно 2,31«Ю-5 М, что на 164 % выше контрольных цифр (рис.9).

Как уже отмечено, при алкогольной интоксикации изменяется

Vcsi

(хЮ'м)

Рис.9. График определения К^ к НАД.Н при алкогольной интоксикации

соотношение НАД.Н к НАД в сторону увеличения. При этом наблюдается относительный дефицит кофермента НАД, активно используемого ферментами расщепления этанола, и увеличение содержания восстановленной формы НАД1". Именно избыток последнего кофермента воздействует на многие дегидрогеназы, осуществляя их кон-формационные перестройки, вызывая таким образом кардпотоксичес-кий эффект (Гильмиярова Г.М., 1988; Klein Н .Н. et al., 1981). Следовательно, снижение в 2,5 раза сродства к коферменту НАД.Н свидетельствует о перестройке лактатдегидрогеназного комплекса при интоксикации этанолом. Если учесть, что активность фермента увеличивается в реакции восстановлении пирувата в лактат всего в 1,5 раза на фоне избытка пировиноградной кислоты и НАД.Н, то подобную перестройку можно расценить как защитную реакцию, направленную на стабилизацию процесса в терминальной стадии гликолиза в миокарде человека при алкогольной интоксикации. А так как лактатдегидрогеназа является одним из регулирующих ферментов гликолиза, стабилизация или небольшое возрастание ее активности в реакции восстановления пирувата необходимы для поддержания на достаточном уровне активности глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы, пространственно и функционально связанной

с ней (Купаев В.И., Орловский А.Ю., 1991; Иеу^г V . et а1.р 1981;ЗикЬос1о:1^з 1,1 .V. et аХ. , 1989).

Поставляя в необходимом количестве кофермент НАД, на фоне его общего дефицита лактатдегидрогеназа способствует нормальному функционированию глицеральдегидфосфатдегмдрогеназы, которая, как известно, при алкогольной интоксикации повышает свою функциональную активность, расщепляя не только свои естественные метаболиты, но и этанол, ацетальдегид (Лапина Г.П..Радионова Г.II. 1980; Вострова Н.Г., 1988; Орловский А.Ю., 1988). Активизация этих двух дегидрогеназ происходит на фоне снижения функциональной способности альдолазы, замедления процессов расщепления гликогена (Гильмиярова Г.М., 1988; Сгагпеск! с.ш. et а1. ,1985). Поэтому утверждение об активизации анаэробных гликолитических процессов в миокарде при алкогольной интоксикации будет неверным. Повидимому, следует говорить о перестройке звеньев гликолиза, направленных на использование поступающих извне этанола и ацетальдегида как доступных источников энергии. Именно согласованная активизация комплекса глицеральдегидфосфатдегидрогена-за-лактатдегидрогеназа отличает процессы, происходящие в сердечной мышце при поступлении экзогенного этанола, от таковых при атеросклерозе, при котором наблюдается его угнетение.

Следовательно, активизация этого комплекса при экзогенном поступлении этанола в организм приводит к выравниванию, стабилизации гликолиза на фоне атеросклероза, что проявляется в отсутствии выраженных изменений функциональных свойств лактатде-гидрогеназы как в сердечной мышце, так и в стенке аорты при сочетании этих двух процессов. Возможно, компенсаторная активация заключительной фазы анаэробного окисления углеводов является одним из факторов антиатерогенного действия этилового спирта.

ВЫВОДЫ

1. При алкогольной интоксикации у человека отмечается увеличение активности лактатдегвдрогеназы в миокарде, характерно преобладание в функции фермента использование НАД.Н в восстановлении пирувата и снижение окисления лактата.

2. Закономерным для алкогольной интоксикации является возрастание'общей каталитической способности лактатдегидрогеназь

за счет перераспределения в изоферментном спектре в сторону процентного увеличения фракций ЛдГ3 и ДЦГ4.

3. Особенностью метаболизма стенки аорты в норме является отчетливое преобладание процесса восстановления пирувата над окислением лактата, эта специфика сохраняется и при алкогольной интоксикации.

4. Содержание пирувата в миокарде и стенке аорты резко возрастает при алкогольной интоксикации, что свидетельствует о затруднении использования важного интермедиата в процессе энергообеспечения. Лактат-пируватный коэффициент в миокарде и аорте равен в норме 717 и 343, при алкогольной интоксикации -219 и 301, в крови - 223 и 175 соответственно.

5. При атеросклерозе у человека в миокарде общая активность лактатдегидрогеназы снижается в реакции окисления молочной кислоты; в стенке аорты усиливаются процессы трансформации пирувата в лактат, сопровождающиеся накоплением молочной кислоты.

6. Атеросклеротическое поражение миокарда человека характеризуется увеличением процентного соотношения изоферментов лактатдегидрогеназы с преобладанием ЛДГд и ЛДГ4 и снижением уровня ЛДГ|.

7. При сочетании атеросклероза и алкогольной интоксикации отмечается нивелирование изменений в лактатдегидрогеназной системе, характерных для атеросклероза, в миокарде, стенке аорты и крови. В частности, стабилизируется активность лактатдегидрогеназы, выравнивается соотношение лактата и пирувата.

8. На заключительном этапе анаэробного распада углеводов при алкогольной интоксикации и атеросклерозе выявлен противоположный характер изменений в проявлении каталитических свойств, физико-химических параметров кинетических характеристик лактатдегидрогеназы, фонда ее окисленного и восстановленного субстрата. Высокая активность лактатдегидрогеназы в реакции окисления НАД.H является мощным защитным механизмом, выполняющим гомео-статическую функцию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активность некоторых ферментов углеводного обмена в миокарде человека при атеросклерозе и алкогольной интоксикации // Молодые ученые и специалисты - народному хозяйству: Тез. докл. обл.научно-техн.конф. - Куйбышев, 1986. - С.68 (в соавт. с О.Ю.Кузнецовой и Е.С.Арониной).

2. Особенности терминальной стадии гликолиза миокарда человека при алкогольной интоксикации // Материалы 51-й конф. Тбилисского мед.института (Тбилиси, 13-16 апреля 1988 г.). -Тбилиси, 1988. - С.120-121.

3. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ миокарда человека при алкогольной интоксикации // Новое, прогрессивное - в практику здравоохранения: Тез.докл. 24-й научно-практ.конф.врачей Ульяновской области. - Ульяновск, 1989. - С.284-285 (в соавт.

с И.Г.Кретовой и А.Ю.Орловским).

4. Характеристика терминальной стадии гликолиза в миокарде человека при алкогольной интоксикации // Современные проблемы медицинской химии и клинической лабораторной диагностики: Тез. докл. Всерос. студ.научн.конф. - Хабаровск, 1989. - С.37-38

(в соавт. с Ю.В.Романовой),

5. Изучение каталитических свойств лактатдегидрогеназы и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы человека при алкогольной интоксикации. - Самара: Самар.мед.ин-т, 1991. - 5 с. - Деп. в ВИНИТИ 16.07.91 г. - й 3032-В91 (в соавт. с А.Ю.Орловским).-