Роль ионов Ca2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей

Осипенко, Марина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль ионов Ca2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов Ca2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей"

На правах рукописи

ОСИПЕНКО МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ИОНОВ Саг+ В ПРОЦЕССАХ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2008

003457945

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института биофизики клетки РАН

Научные руководители:

Член-коп"еспондент РАН доктор биологических наук, профессор Фесенко Евгений Евгеньевич

кандидат биологических наук Межевикина Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Гривенников Игорь Анатольевич

доктор биологических наук профессор Леднев Валерий Васильевич

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится « 25 » декабря 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино Автореферат разослан « 25 » ноября 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Значительная часть исследований на эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) посвящена выяснению механизмов дифференцировки и репрограммирования из дифференцированного состояния в плюрипотентное с целью создания фундаментальной базы для разработок новых биомедицинских технологий. Активно обсуждаются перспективы использования ЭСК для терапевтического клонирования и получения в условиях in vitro большого количества специализированных клеток для лечения наследственных и дегенеративных заболеваний, продления жизни человека (Colman, King, 2000; Wakayama et al., 2001; Caplice, Gersh, 2002; Chen et al., 2003; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006).

К настоящему времени сформировались четкие представления о молекулярно-генетических системах, экспрессия которых тесно связана с сохранением плюрипотентного потенциала ЭСК, а также факторах среды, регулирующих эти процессы. Несмотря на достижения в области молекулярной биологии, остаются не решенными две основных проблемы; 1) поддержание плюрипотентного потенциала ЭСК in vitro и 2) индукция дифференцировки в клетки определенного фенотипа.

Главная задача состоит в том, чтобы научиться получать in vitro популяции ЭСК, обогащенные определенными типами функционально активных клеток. Решение этой задачи связано с разработкой эффективных методов по отсортировыванию клеток нужного фенотипа от клеток с другим типом дифференцировки, а также недифференцированных предшественников, которые могут нести потенциальную угрозу образования опухолей в организме реципиента. Однако до сих пор не обнаружено соединений, оказывающих индуцирующее действие на все клетки одной популяции ЭСК и заставляющих их дифференцироваться в одном направлении.

Поиск специфических индукторов дифференцировки и активаторов роста ЭСК продолжается и в настоящее время. Как правило, для этой цели применяют различные приемы культивирования, а также индукторы химической природы, в том числе факторы роста и цитокины, блокаторы и активаторы сигнальных путей, факторов транскрипции (Wobus et al., 1997; Гривенников, Мануйлова, 2003; Мануйлова и др., 2003). Ионному составу сред не уделяется должного внимания, хотя в последние годы в этих исследования наметился прогресс, в связи с изучением роли ионов кальция и кальциевых каналов в процессах развития ЭСК (Quinlans et al., 2003; Асташкин и др., 2005; Lin et al., 2005; Loeb et al., 2005; Zahanich et al, 2005). Ионы Ca2+ как вторичные мессенджеры являются теми ионами, концентрация которых оказывается высокоэффективным сигналом для запуска дифференцировки, пролиферации и прохождения Gi стадии клеточного цикла (Rubin et. al., 1976; Kamine et. al., 1976; Осипенко и др., 2006, 2007).

Фактором неинвазивного влияния на процессы клеточной пролиферации и

дифференцировки являются слабые магнитные поля (МП), в частности, «нулевое» МП или же комбинированное МП со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер водорода. Действие таких МП детально исследовано в основном на моделях примитивно организованных беспозвоночных животных - планариях (Леднев и др., 1996; Новиков и др., 2007; Леднев и др., 2007; Novikov et al., 2008). Однако остается открытым вопрос о том, могут ли слабые МП влиять на ранний эмбриогенез, а также развитие ЭСК млекопитающих in vitro. Поэтому нам представлялось весьма интересным изучить возможность воздействия таких полей на процессы пролиферации и дифференцировки ЭСК и ранних зародышей.

Цель исследования

Основной целью настоящей работы было исследование роли ионов кальция в регуляции пролиферативной активности и дифференцировки плюрипотенгных клеток мыши и человека, а также эффектов слабых МП на процессы дифференцировки этих типов клеток в культуре in vitro.

Задачи исследования

• Оценка пролиферативной и метаболической активности ЭСК при изменении вне- и внутриклеточной концентрации ионов кальция.

• Исследование фосфоинозитольной сигнальной системы в регуляции процессов развития ЭСК в культуре.

• Выявление типа и направления дифференцировки ЭСК в зависимости от концентрации цитоплазматического кальция.

• Подбор и оптимизация условий для культивирования ЭСК и ранних зародышей в экспериментах с использованием слабых МП.

• Исследование морфофункциональных характеристик ЭСК и ранних зародышей при развитии в слабых МП. Оценка возможности использования таких МП для индукции процессов цитодифференцировки in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы

Установлено, что шнорипотентные линии ЭСК мыши и человека различаются по своей зависимости от содержания свободного кальция в среде культивирования. Однако эти виды объединяет одно общее свойство - способность к пролиферации при значительном снижении (10"5 М) концентрации кальция в среде культивирования и переход к суспензионному типу развития, что является характерным для иммортализованных линий соматических клеток.

Показано, что фосфоинозитольная сигнальная система является доминирующей для поддержания высокого уровня пролиферативной и метаболической активности ЭСК человека в

условиях in vitro. Спонтанная дифференцировка ЭСК человека при развитии в колониях повторяет события раннего эмбриогенеза, связанные с эпителиалыю-мезенхимальным переходом и последующей дифференцировкой в фибробласто-подобные нестин-позитивные клетки, являющиеся производными эмбриональной нейроэктодермы. Показано, что в колониях ЭСК человека все три типа эпителиальной, мезенхимальной и фибробластной морфологии различаются как по клеточным маркерам, так и исходной концентрации внутриклеточного кальция и активности Са2+-транспортирующих систем. Эти результаты могут представлять интерес для идентификации и отбора ЭСК с определенным типом дифференцировки для последующего использования в медицинских целях.

Установлено, что 250-ти кратное экранирование геомагнитного поля («нулевое» МП, 0.2 мкТл) является биологически активным фактором, негативно влияющим на эмбриональные клетки и, в целом, на процессы раннего эмбриогенеза. В «нулевом» МП нарушаются барьерные свойства плазматических мембран, происходит реорганизация цитоскелета, что приводит к гибели зародышей на ранних стадиях развития. Эти данные свидетельствуют о важной роли геомагнитного поля в обеспечении процессов регуляции эмбриогенеза млекопитающих.

Впервые установлено, что ЭСК человека могут размножаться колониями и дифференцироваться под влиянием комбинированного МП со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер атомов водорода. Выявлено индуцирующее действие такого магнитного поля на процессы нейроэктодермальной дифференцировки in vitro. Метод культивирования ЭСК человека в комбинированном магнитном поле со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер водорода может быть использован для получения нейроэктодермальных клеток для регенеративной медицины и трансплантологии.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены в виде устных и стендовых докладов на 10, 11 и 12 Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006-2008), на Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на 2-ом съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на Британско-Российском симпозиуме "Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union - Russian Federation Perspectives" (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них две статьи в реферируемых журналах, 7 тезисов докладов на международных и отечественных конференциях.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. В диссертации приведены 2 таблицы и 30 рисунков, список цитированных работ включает 194 источника.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы

Объекты исследования и их культивирование. Использовали мышиную линию стволовых клеток R1 (Nagy et al., 1993) и линию Hl клеток человека, предоставленную проф. В.В Галатом из Центра исследований стволовых клеток при университете Финберга (Чикаго, США). Клетки HI были переданы на втором пассаже после размораживания в виде колоний, растущих на матригеле в среде, разработанной для ЭСК человека (Schatten et al., 2005) с добавлением 4.0 нг/мл ростового фактора фибробластов (FGFß, PeproTech.inc.). Последующие пассирования HI проводили с использованием механического переноса небольших участков колонии (эксплантатов) на 0.1% желатину (Sigma) или митомициновый фидер первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши, приготовленный по стандартной методике (Robertson et al., 1987). Мышиные клетки R1 культивировали в среде ДМЕМ (ПанЭко) с 15% инактивированной фетальной сывороткой телят (HyClone), 2мМ L-глютамина (ПанЭко), 1% заменимых аминокислот (Gibco). В среду дополнительно вносили 10 нг/мл цитокина LIF (Sigma, PeproTech.inc.) и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. ЭСК мыши высевали из расчета 105 кл./мл на 4-луночные чашки Петри (Nunc) и/или 96-ти луночные планшеты (Nunc), предварительно обработанные 0.1% раствором желатины (Sigma).

Зародыши мыши на стадиях 2-х и 8-16-ти бластомеров выделяли из яйцеводов на второй и третий день беременности. Для выделения и культивирования зародышей использовали модифицированную среду Виттена с добавлением 20 мМ органического буфера HEPES (Березовская и др., 1986). Культивирование ЭСК и ранних зародышей проводили в естественном геомагнитном поле (ГМП) в СОг-инкубаторе (Sanyo) или малогабаритном автономном СО2-инкубаторе, приспособленном для работы с клеточными культурами в МП (рис. 1).

Оценка морфофунщионалъного состояния. ЭСК оценивали по морфологии колоний, пролиферативной и метаболической активности, способности дифференцироваться при изменении концентрации вне- и внутриклеточного кальция, а также в ходе культивирования в слабых МП. Для оценки жизнеспособности зародышей использовали красители 0.5% трипановый синий (Fluka) и 10"5 М этидиум бромид (Sigma). Результаты регистрировали с помощью цифровой

фотокамеры Cannon А-620. Эффективность развития зародышей оценивали по способности к делениям и формированию стадии бластоцисты. Динамику образования полости бластоцисты (бластоцеля) рассчитывали по формуле: V=P3/(6it2), где Р - периметр полости.

Илшуноцитохимические исследования. Иммуноцитохимические исследования проводили с использованием первичных антител против белков-маркеров: гомодимерного белка Nanog, основного фактора поддержания плюрипотентности ЭСК (моноклональные мышиные «Sigma», 1:500), тканеспецифичного белка Nestin (моноклональные крысиные, «Chemicon», 1:200). После фиксации охлажденным ацетоном препараты инкубировали в течение ночи при 4°С в растворах первичных антител, затем промывали в PBS и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в растворах вторичных козьих антител против Ig мыши («ИМТЭК», 1:300, коньюгированных флуоресцентным красителем FITC). Препараты заключали под покровное стекло в глицерин (Sigma) и анализировали под инвертированным микроскопом Axiovert 40CFL (Zeiss) при X 488 нм.

Оценка жизнеспособности и метаболической активности (МТТ-тест). Метод основан на способности дегидрогеназ живых клеток редуцировать жёлтую водорастворимую соль бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана (Tada et al., 1986). Раствор МТТ готовили из расчета 5.0 мг Thiazolyl blue (Sigma) на 1.0 мл PBS (рН 7.4). Для тестирования клетки выращивали на 96-луночных планшетах (Nunc) в течение 24-72 ч культивирования в средах с разным содержанием кальция, блокаторов и активаторов фосфоинозитольной сигнальной системы. По окончании культивирования в каждую лунку добавляли по 20.0 мкл раствора МТТ и выдерживали в течение 3 ч в СОг-инкубаторе, после чего удаляли супернатант, клетки растворяли в 150.0 мкл DMSO (ICN). Оптическую плотность раствора в лунках определяли при длине волны 600 нм (область поглощения формазана- соли МТТ) на мультисканере (Labsystems Multiskan Plus, тип 314). Достоверными считали различия по оптической плотности, составляющие более 20%.

Выявление эндогенной щелочной фосфатам (ЭЩФ). Колонии ЭСК фиксировали охлажденным ацетоном и инкубировали с а-иафтол-АБ-фосфатом (ICN) и красителем ВВ синим прочным (ICN) в течение 1 ч при 37° С по методу Лойда (Лойд, 1983). Цитохимические реагенты готовили непосредственно перед использованием (0.25 мл ДМСО, 5 мг а-нафтол-А5-фосфата, 25 мл Н20, 25 мл Трис-HCI (рН 8.5), 25 мг красителя синего прочного ВВ). Недифференцированные плюрипотентные колонии обнаруживают высокую активность ЭЩФ и окрашиваются в темно-синий цвет. Дифференцированные клетки и колонии остаются не окрашенными.

Исследование роли вне- и внутриклеточного кальция. В экспериментах по выявлению роли внеклеточного кальция использовали среду для культивирования ЭСК с добавлением EGTA (Sigma) для создания буферных растворов Са2+ в концентрациях 10"5 и 10"7 М. Буферные растворы

готовили по программе Sliders. Для исследования фосфоинозитольной (PI) сигнальной системы п ростовую среду добавляли блокаторы и активаторы фосфолипазы С (PLC) и протеинкиназы С (РКС). Для блокирования PLC использовали 0.5, 1.0, 5.0 и 10 мкМ U73122 (Biomol), для подавления активности РКС - 0.5, 5.0 и 10 мкМ бизиндолилмолиимид (BisII, Sigma). В качестве активатора РКС использовали форболовый эфир (Fluka) в концентрациях 1.0, 10 и 50 нМ.

Для измерения внутриклеточной концентрации кальция прикрепленные клетки (колонии ЭСК) нагружали 5 мкМ кальций-чувствительного флуоресцентного зонда Fura-2 (Molecular Probes) 40 мин, после чего отмывали 15 мин в растворе Хенкса, содержащим в мМ: NaCl - 140, КС1 - 5.4, MgS04 - 1.0, КН2Р04 - 1.0, NaH2P04 - 1.0, NaHC03 - 1.0, глюкозу - 6.0, Hepes - 20.0 (базовый раствор, рН 7.4). Готовые препараты исследовали под инвертированным флуоресцентным микроскопом ZEISS LSM 510. Максимум возбуждения флуоресценции Fura-2 340-380-нм, регистрация - 510 нм. Съемку проводили в режиме непрерывного сканирования. Добавку действующих веществ тапсигаргина (1.0 мкМ Tg, Sigma) и иономицина (1.0 мкМ Iono, Sigma) вносили во время непродолжительной паузы в процессе сканирования. Обработку изображений проводили с помощью программы LSM 5 Image Browser, графические построения -с помощью программы Origin 8.0.

Измерение внутриклеточной концентрации кальция в зародышах. Для измерения внутриклеточного кальция зародыши нагружали Fluo-ЗАМ (5.0 мкМ, Biotium) в среде Виттена без кальция и фенолового красного и оставляли на 60 мин в СОг-инкубаторе при 37°С. Далее зародыши отмывали и переносили поштучно в 10.0 мкл капли этой же среды на предметные стекла, покрытые минеральным маслом. Готовые препараты исследовали под инвертированным флуоресцентным микроскопом Axiovert 200 M (Zeiss). Для регистрации флуоресценции использовали фильтр 10 Alexa Fluor 488 (491нм/515нм). Максимум возбуждения флуоресценции Fluo-3 - 506 нм. Ионофор А23187 (1мкМ, Sigma) вносили во время непродолжительной паузы в процессе сканирования. Концентрацию кальция рассчитывали: [Са2+] = Kd (F-Fmin) / (Fmax-F), где Kd - константа диссоциации Fluo-3 (316 нМ), F- интенсивность флуоресценции, Fmin -флуоресценция темного фона, Fmax - максимальная флуоресценция А23187. Обработку кадров проводили с помощью программы ImageJ 1.36b, графические построения - по программе SigmaPlot.

Выявление F-актина в бластомерах зародыша. Фиксированные холодным ацетоном зародыши промывали PBS и инкубировали в растворе PBS (200 мкл) с 5мкл стокового раствора фаллоидин-FITC (Biotium) с добавлением 1% фетальной сыворотки (20 мин). Далее зародыши промывали в PBS, заключали в раствор глицерина и анализировали под инвертированным микроскопом Axiovert 200 M (Zeiss) при 496 нм.

СОг-инкубатор для работы в МП. Для проведения экспериментов на ЭСК и зародышах мыши в МП сконструирован малогабаритный автономный ССЬ-икубатор (6x9x13см), не содержащий ферромагнитных материалов (рис. 1,А). В такой инкубатор помещали от 1 до 3 стандартных 4-х луночных планшетов (Nunc) с клеточными культурами и культивировали их при постоянной температуре 37°С и 5 % ССЬ в атмосфере воздуха. Схема создания и подачи газовой смеси показана на рис. 1-Б. Перед работой инкубатор стерилизовали спиртом. Для исключения контаминации в индикатор подачи газовой смеси (рис. 15, 7) дополнительно вносили антибиотики-антимикотики. Точность работы малогабаритного автономного ССЬ-инкубатора соответствовала точности стационарного СОг-инкубатора (Sanyo).

СО!

I U

~~П~1—I—I

6а 66

Рис. 1. Малогабаритный автономный С02-инкубатор (А) и схема подачи газовой смеси для этого инкубатора (Б).

А: 1) - теплоизоляция, 2) - планшет для культивирования, 3) - пластмассовый контейнер, 4) - радиатор, 5) - место для контрольного термометра, 6) - терморегулятор с датчиком температуры (6 а) и нагревателем (6 б), 7) - вход для подачи газовой смеси.

Б: 1) - баллон с ССЬ, 2) - компрессор с ресивером и редуктором давления, 3) - входные редукторы для точного выравнивания давления СО2 и воздуха, 4) - электромагнитный клапан с генератором импульсов (4а), 5) - манометр для выравнивания давления газовой смеси, 6) -регулируемое пневмосопротивление, 7) - индикатор подачи газовой смеси.

Типы используемых МП. В экспериментах использовали «нулевое» МП с величиной магнитной индукции < 0.2 мкТл (поле 1) и комбинированное МП с крайне слабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер водорода (КМПспН+ или поле 2). В поле 2 величина магнитной индукции постоянной компоненты Ввс 42 мкТл, переменной компоненты ВАс 0.7 мкТл при частоте 32 Гц. При указанных параметрах переменной компоненты МП достигается максимальная величина воздействия на биосистемы (Леднев и др. 2003, 2007).

Для проведения исследований с полями 1 и 2 использовали экранирующую геомагнитное поле и техногенные поля камеру, изготовленную из пермаллоя с коэффициентом экранирования = 1200 по постоянному полю (рис. 2). Камера имеет прямоугольную форму (36x36x50 см) и состоит многослойного магнитного экрана, магнитных катушек и источника постоянного тока, обеспечивающего формирование заданной величины постоянной компоненты МП. Рабочий объем

камеры составляет 10x10x16 см. Внутри камеры остаточное значение МП составляет 0.2 мкТл, что соответствует 250 кратному ослаблению геомагнитного поля - «нулевое» МП (поле 1). Измерения проводили феррозондовым датчиком Mag- 03 MS 100, Bartington, UK.

Рис. 2. Камера экспериментальной установки для воздействия слабыми МП: А, Б - участки рабочей зоны с 9-

неоднородностью МП менее 0.5 и 4% соответственно (Новиков 6\

и др., 2007; Novikov et. al., 2008).

1 - корпус камеры - экран 1 (сталь); 2 - крышка экрана (пермаллой); 3 - крышка экрана (пермаллой); 4 - экран 2 (пермаллой); 5- катушка встроенной системы размагничивания; 6 - экран 3 (пермаллой); 7 - система индукторов МП; 8 -фиксатор.

Поле 2 создавали с помощью двух коаксиально расположенных магнитных катушек формирующих постоянное магнитное поле 42 мкТл и переменное МП 0.7 мкТл при частоте 32 Гц.

Для культивирования ЭСК и зародышей в слабых МП 1 и 2 типа использовали малогабаритный ССЬ-инкубатор (рис. 1), который устанавливали в зоне «А» экранирующей камеры (рис. 2). Культивирование проводили в течение 24-72 ч. В опытах с животными беременных мышей помещали в пластиковых клетках в зону Б экранирующей камеры (рис. 2) на 3, 5-6 и 12 суток, после чего их забивали, извлекали рога матки и в области мест имплантации вырезали небольшие кусочки ткани эндометрия для приготовления гистологических препаратов.

Гистологические исследования. Для приготовления парафиновых срезов кусочки ткани фиксировали в смеси растворов 4% параформальдегида и 0.25% глутарового альдегида (рН 7.2), обезвоживали в спиртах увеличивающейся концентрации: 70%, 80%, 96%, 100 % (30 мин, 37°С), затем переносили в смесь спирт-ксилол (1:1), в ксилол (2 раза), ксилол-парафин (30 мин, 37°С). Обезвоженные кусочки заливали в парафин. Блоки резали на микротоме (Termo electron), толщина срезов 5 мкм. Образцы монтировали на стекла с адгезивным покрытием (MARIENFELD Laboratory glassware). Депарафинирование проводили проводкой образцов через ксилол (100%) и этиловые спирты (100%, 96%, 70%). Срезы окрашивали раствором гематоксилина и эозина. После окрашивания и просветления в ксилоле срезы заключали в монтирующую среду (Histofluid) по общепринятой методике (Волкова и др., 1982; Саркисова и др., 1996).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью ¿-критерия Стьюдента в программе SigmaPlot и с помощью непараметрического теста Манна-Уитни. При уровне значимости < 0.05 принималась гипотеза о различии выборок.

Результаты и обсуждение

1. Эффективность развития ЭСК мыши и человека в зависимости от содержания вободного кальция в среде культивирования.

Два альтернативных процесса - дифференцировка и пролиферация в ЭСК животных и еловека регулируются разными сигнальными системами, между которыми возможны 1ерекрестные эффекты (Zamponi et al., 1997; Burdon et al., 1999, 2002). В частности, одни и те же егуляторные факторы, например LIF и FGF, действующие на специфические мембранные ецепторы ЭСК мыши и человека соответственно, могут активировать как процессы ролиферации, так и дифференцировки. Участие разных систем сигнальной трансдукции в егуляции ключевых процессов развития ЭСК значительно усложняет проблему управления тими клетками в системе in vitro.

Мы рассмотрели возможность влияния на развитие ЭСК мыши и человека разных онцентраций ионов кальция в среде культивирования для ответа на вопрос о том, оказывает ли неклеточный кальций влияние на плюрипотентные свойства ЭСК и способность этих клеток к осту в виде колоний. ЭСК культивировали на желатине с разными стимулирующими факторами: я ЭСК мыши использовали LIF, для ЭСК человека - FGFp. В наших исследованиях показано, то пролиферативная и метаболическая (дегидрогеназная) активность в ЭСК мыши и человека ависят от концентрации ионов кальция в среде (рис. 3 А, ЗБ).

ЭСК мьшш

ЭСК

человека S go

Рис. 3. Пролиферативная (А) и метаболическая активность (Б) эмбриональных стволовых еток мыши (линия К1) и человека (линия Н1) в зависимости от концентрации свободного альция в среде культивирования: 1) контроль; 2) 10"5М Са2+; 3) 10"7М Са2+; 4) ЭГТА (ЗмМ).

Снижение внеклеточного Са2+ до 10"5М приводит к подавлению пролиферативной активности ЭСК человека (но не мыши), однако к 72 ч культивирования количество ЭСК человека достигает уровня контроля (рис. 3, А). Полагаем, что ингибирование пролиферации ЭСК человека в среде с 10'5М кальция связано с переходом значительного числа клеток в суспензию (около 50%) и подавлением их метаболической активности, чего не происходит с клетками мыши при той же концентрации CaZT в среде культивирования (рис. 3, Б). Эти результаты свидетельствует о межвидовых различиях ЭСК по зависимости от содержания кальция в среде культивирования. Однако и для более «чувствительных» клеток человека снижение уровня внеклеточного кальция на два порядка (10"5М) по сравнению с оптимальным значением не является губительным. Со временем (48 ч культивирования) ЭСК человека приспосабливаются к неблагоприятным условиям среды возможно, за счет запасенного Са2+ в эндоплазматическом ретикулюме и митохондриях. Однако такие защитные механизмы не работают при более значительном снижении внеклеточного кальция до или же при его отсутствии (добавление в среду 10"3М EGTA).

Таким образом, концентрация внеклеточного кальция важна как для поддержания высокого уровня пролиферативной и метаболической активности ЭСК, так и клеточной адгезии и метаболической кооперации, что существенно для формирования колоний. При снижении концентрации кальция в среде до 10"7М клетки мыши и человека теряют свои адгезивные свойства, в результате чего нарушается рост и размножение колониями. В суспензионной культуре ЭСК не объединяются в клеточные конгломераты наподобие эмбриоидных тел, отсутствие которых свидетельствует о потери плюрипотентных свойств ЭСК.

Выявлена корреляция между уровнем свободного внеклеточного

Са2+ и дегидрогеназнои

активностью ЭСК человека (рис. 3, Б). При снижении концентрации Са2+ до 10"7М или же при его отсутствии в среде культивирования клетки человека не в состоянии обеспечивать энергией свои метаболические потребности и в итоге обречены на гибель. В меньшей степени это касается клеток мыши (линия R1), которые более адаптированы к условиям культивирования из-за гетерогенности своего состава (Глазко и др., 2005). Кроме того, мышиные клетки линии R1 обнаруживают in vitro независимость прохождения клеточных циклов от содержания свободного кальция в среде в пределах от 10"5М до 10"3М. Другой отличительной особенностью этой линии является отсутствие строгой корреляции между высокой пролиферативной активностью, особенно в первые сутки культивирования, и активностью митохондриальных дегидрогеназ (рис. 3, Б). В отличие от соматических клеток, для ЭСК концентрация ионов Са2+ в среде культивирования 10" 5М до 10"3М необходима не только для поддержания высо кого уровня пролиферативной и метаболической активности, но и плюрипотентного потенциала.

2. Роль фосфоинозитолъной (PI) сигнальной системы в регуляции процессов пролиферации ЭСК человека.

Процессы пролиферации стволовых клеток, зависящие от содержания ионов Са2+ в среде культивирования, активируются с помощью различных путей внутриклеточной сигнализации (Biesen et. al., 1996; Burdon et al., 2002; 2007) и у разного типа клеток механизмы запуска кальцием сигнальных реакций могут существенно различаться. Считается, что в соматических клетках взрослого организма одним из центральных путей передачи кальциевых сигналов является PI путь (Berridge, 1995). Это показано также на культурах ЭСК мыши (Quinalan et. al., 2003). Что же касается механизмов пролиферации ЭСК человека, данные литературы крайне противоречивы и не дают однозначного ответа на вопрос об участии PI сигнальной системы в регуляции высокой пролиферативной активности ЭСК человека в условиях in vitro. Для выяснения этого вопроса мы культивировали ЭСК человека в присутствии разных концентраций блокаторов и активаторов основных компонентов Pi-пути (рис. 4-6). Полученные данные свидетельствуют о том, что все использованные нами концентрации блокатора фосфолипазы С (PLC) существенно подавляют пролиферацию (рис. 4А). Кроме того, при действии на дегидрогеназные ферменты митохондрий также выявляются дозо-зависимые ингибирующие эффекты (рис. 4Б).

60 80 время, ч

контроль 0.5 мкМ 1 мкМ 5 мкМ

Рис. 4. Влияние блокатора РЬС - 1173122 на пролиферативную (А) и метаболическую активность (Б) эмбриональных стволовых клеток человека линии Н1 (п = 8, Р = 0,05). 1 - контроль; 2 - 0.5, 3 -1.0 и 4 - 5.0 мкМ И73122 в среде культивирования.

Аналогичные результаты получены при блокировании протеинкиназы С (РКС) с помощью 0.5, 5 и 10 мкМ неспецифического блокатора В^Н (рис. 5А, 5Б). В среде с В15П выявляется дозо-зависимое ингибирование пролиферативной активности ЭСК человека, что коррелирует со снижением в 2 раза активности митохондриальных дегидрогеназ в течение 24 ч культивирования (рис. 5Б). Через 72 ч ЭСК человека в среде с 5 и 10 мкМ ВЫ! теряют способность к размножению, переходят в суспензию и погибают, что свидетельствует о ключевой роли РКС в поддержании жизнеспособности и регуляции процессов роста.

контроль 0.5 мкМ SmkM ЮмкМ

Рис. S. Влияние блокатора РКС - Bis II на пролиферативную (А) и метаболическую (Б) активность клеток линии Н1(п = 8, Р = 0,05). 1 - контроль, 2 - 0.5, 3 - 5.0 и 4 -10.0 мкМ Bis II.

Однако активирование РКС форболовым эфиром при его использовании в концентрациях 1 и 10 нМ не дает заметных положительных результатов и не влияет на пролиферативную активность ЭСК человека (рис. 6А). Более того, в концентрации 50 нМ форболовый эфир вызывает остановку роста колоний и подавляет дегидрогеназную активность (рис. 6А, 6Б). При действии на ЭСК мыши в такой концентрации форболовый эфир, напротив, стимулирует клеточную пролиферацию in vitro (Quinlan et al., 2003).

время, ч

контроль 1 нМ 10 нМ 50 нМ

Рис. 6. Влияние активатора РКС - форболового эфира на пролиферативную (А) и метаболическую (Б) активность клеток линии Н1 (п = 8, Р = 0,05). 1 - контроль, 2 - 1.0, 3 - 10.0 и 4 - 50.0 нМ форболового эфира.

Такое неоднозначное действие форболового эфира на разные виды ЭСК может быть следствием того, что в среде для культивирования клеток человека присутствует ростовой фактор РОРЬ, который сам по себе может участвовать в активации Са2+-зависимых сигнальных путей и непосредственно влиять на РКС (Кип е1. а1., 2003). Это объясняет отсутствие положительных эффектов форболового эфира при действии на ЭСК человека.

Следует отметить, что отличительной особенностью плюрипотентных клеток эмбрионального происхождения является отсутствие GO и короткий Gl период клеточного цикла, поэтому биохимические механизмы поддержания жизнеспособности и пролиферативной активности в ЭСК не столь многочисленны, как в соматических стволовых клетках. Согласно нашим данным, PI-сигнализация занимает важное место в процессах регуляции ЭСК животных и человека и может через активацию РКС влиять на ERK-MAPK сигнальную систему (Biesen et. al., 1996), активность которой в ЭСК ассоциирована с процессами дифференцировки (Auerhammer, Melmed, 2001; Nicol, 2001; Burdon et al., 2002).

3. Спонтанная дифференцировка ЭСК человека in vitro (роль внутриклеточного кальция).

Поддерживать плюрипотентные линии ЭСК в недифференцированном состоянии, а тем более получать монодифференцировку в клетки определенного фенотипа довольно сложно (Schuldiner et al., 2000; Ullmann et al., 2007). Даже такие известные индукторы дифференцировки как ДМ СО или ретиноевая кислота не дают в культурах ЭСК высокий процент нейрональных и мышечных клеток (Schuldiner et al., 2000; Boheler et al., 2002; Marie et. al., 2003; Ventura et. al., 2004; Mao et al., 2005). Проблема заключается в том, что ЭСК несут в себе огромный потенциал, который реализуется in vitro в направлении всех трех зародышевых листков: экто-, мезо и эндодермы. Процессы эмбриональной дифференцировки происходят при смене сред или условий культивирования, например, при переводе ЭСК человека с фидера на специальные подложки (Rosler et al., 2004; Stojkovic et al., 2005; Ludwig et al., 2006; Ullmann et al., 2007). В целом, природа спонтанного превращения плюрипотентных клеток в клетки другого фенотипа мало исследована.

Наши исследования показывают, что ЭСК человека как более зависимые клетки от концентрации внеклеточного кальция по сравнению с клетками мыши, при переносе с подложки из фибробластов на матригель или желатину (рис. 7, а, б) спонтанно дифференцируются за достаточно короткий промежуток времени (48 ч). Видимые признаки морфологической дифференцировки при культивировании ЭСК человека без фидера выявляются на периферии колонии. Дифференцированные клетки, окружающие центр колонии, дают слабую реакцию на выявление маркеров плюрипотентности - ЭЩФ и Nanog (рис. 7, г, à), однако у них обнаруживается тканеспецифический белок нестин (рис. 7, е), характерный для нейроэктодермальных производных.

Следует отметить, что по мере увеличения продолжительности культивирования центральная часть колонии, представленная в основном плюрипотентными Nanog-позитивными клетками, увеличивается незначительно. Основной прирост размеров колонии ЭСК осуществляется за счет активной пролиферации Nestin-позитивных клеток фибробластоподобной

морфологии, расположенных по периферии. При увеличении времени культивирования до 5-7 суток такие клетки формируют сплошной монослой вокруг колонии. К этому же времени в среде культивирования начинают появляться сложные многоклеточные образования - эмбриоидные тела (рис. 7, в). Спонтанная дифференцировка ЭСК человека, связанная с переходом плюрипотентных клеток от эпителиальной к мезенхимально-подобной морфологии, описана в литературе (Rosier et al, 2004; Xu et al., 2005; Ullmann et al., 2007). Наши данные показывают, что такой переход осуществляется поэтапно путем превращения эпителия в мезенхиму, с последующим переходом мезенхимально-подобных клеток в нестин-позитивные клетки нейроэктодермы, что характерно для процессов эмбриогенеза.

? МАТРИГЕЛЬ Д\ ■ ГГРш , ЩЕТИНА Z, ' ■ 'Л. : ■ ',Д ■ у- ■о 1 эт

v Зщф / NANOG f?J 100 мкм NESTIN * ^ 100 мкм

Рис. 7. Морфология и плюрипотентность ЭСК человека на разных подложках, где: а, б -культивирование в течение 48 ч на матригеле и желатине; в - эмбриоидное тело; г - выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы; д - выявление фактора плюрипотентности - №по§; е - выявление фактора дифференцировки в нейроэктодерму - Мезйп.

Более дифференцированные клетки на периферии колонии и клетки, формирующие центр колонии, различаются между собой по уровню внутриклеточного Са2+ и активности Са2+-транспортирующих систем, что подтверждается их реакцией на действие тапсигаргина и иономицина (рис. 8). Через 48 ч культивирования на матригеле в колониях ЭСК человека выявляется 4 типа ответов в зависимости от места локализации клеток. Первый тип (рис. 8А, кривая 1) характерен для дифференцированных Кевйп-позитивных клеток, расположенных на периферии колонии (рис. 8Б, в колонии обведены зеленым цветом). У них обнаруживается более высокий начальный уровень Са2+, чем у всех остальных типов клеток. После добавления иономицина такие клетки не откачивают Са2+ за пределы клетки. Второй тип клеток (рис. 8А, кривая 2) локализован на границе между центром колонии и периферией (рис. 8Б, обведены синим

цветом) и имеет исходно самую низкую концентрацию Са"т, в том числе и в эндоплазматическом ретикулуме, о чем свидетельствует незначительное повышение его концентрации после обработки тапсигаргином. Такие клетки также как и дифференцированные клетки на периферии колонии не обладают способностью откачивать Са"+ из цитозоля после его увеличения с помощью иономицина.

^ время, сек ^

Рис. 8. Изменение концентрации кальция в цитозоле эмбриональных стволовых клетках человека в ответ на действие тапсигаргина (Tg, 1мкМ) и иономицина (1опо, 1мкМ). А - интенсивность флуоресценции; Б - расположение клеток в колонии с разным Са2+-ответом.

Третий тип клеток (рис. 8А, кривая 3) находился в центре колонии (рис. 8Б, обведены голубым цветом) и после обработки иономицином клетки этого типа обнаруживают функциональную активность и способность восстанавливать исходный уровень цитоплазматического Са2+, возможно, в силу большей активности АТФ-аз плазматической мембраны. Четвертый тип представлен единичными клетками, не имеющими строго определенной локализации в колонии. По исходному уровню Са2+ в цитоплазме они схожи с плюрипотентными клетками, формирующими центр колонии, однако имеют не такие активные Са2+-транспортирующие системы, что может свидетельствовать о переходном состоянии от плюрипотентности к дифференцировке (рис. 8А, 8Б). Различия между 4-мя типами клеток по их способности восстанавливать уровень внутриклеточного Са2+ после обработки иономицином, по всей видимости, обусловлены различиями в активности АТФ-аз плазматической мембраны или Ка+/Са++ обменников. Таким образом, направление спонтанной дифференцировки ЭСК человека зависит от места локализации в колонии и их переход из эпителиальной морфологии в мезенхимально- и фибробласто-подобные клетки сопровождается изменением концентрации внутриклеточного кальция и активности Са2+-транспортирующих систем. При переходе от состояния плюрипотентности к дифференцировке стволовые клетки теряют способность

г> 2+

восстанавливать исходный уровень Са , что может свидетельствовать о снижении жизнеспособности. В гетерогенных популяциях ЭСК человека различия в функционировании

Са2т-транспортирующих систем могут служить дополнительным тестом для идентификации разных типов клеток на самых начальных этапах дифференцировки.

4. Влияние слабых МП на рост колоний и дифференцировку ЭСК человека и ранних зародышей мыши.

Для медицинских целей «безопасными» считаются ЭСК, прошедшие in vitro начальные этапы дифференцировки. Поэтому задачей современных исследований является получение из ЭСК функционально активных первично дифференцированных клеток определенного фенотипа без использования химических индукторов дифференцировки и приемов генетической трансфекции. Одним из подходов для решения этой задачи может быть применение в качестве индуцирующего дифференцировку фактора слабых МП.

4.1. Влияние «нулевого» МП (поле 1).

Влияние гипомагнитных условий («нулевое» МП) четко прослеживается при исследовании морфогенетических процессов (деление и регенерация) у планарий (Леднев и др., 1996; Новиков и др., 2007; Novikov et. al., 2008). Согласно нашим данным действие «нулевого» МП с остаточной величиной постоянной магнитной компоненты 0.2 мкТл оказывает значительное воздействие на эмбриональные клетки и ранние зародыши мыши (рис. 9).

Рис. 9. Морфология двухклеточных зародышей мыши в «нулевом» МП. а - интактные зародыши; б, г зародыши после 24ч культивирования в контроле и поле 1; д - зародыши после 48ч культивирования в поле 1, окрашенные трипановым синим; в, е - распределение F-актина в контрольных и опытных зародышах

(люминесценция с

Fluorescein Phalloidin, X 496). Масштаб 100 мкм.

Гибель эмбриональных клеток происходит в результате увеличения проницаемости плазматических мембран (рис. 9 Ö), перераспределения цитоскелетного белка F-актина (рис. 9, в, е), снижения адгезивных свойств клеток. Ранние зародыши мыши в «нулевом» МП теряют способность к делениям дробления и через 48 ч погибают (рис. 9, г, д).

У беременных мышей, находящихся в «нулевом» МП, происходит прерывание беременности на самых ранних стадиях развития во время имплантации зародышей в матку. Причиной остановки развития зародышей в «нулевом» МП является недостаточная активность трофоэктодермальных клеток и отсутствие контактов с люминальным эпителием (рис. 10), что

- а

% Г Wm д

указывает на решающее значение МП как в обеспечении процессов клеточной пролиферации, так и раннего эмбриогенеза.

Рис. 10. Гистологический срез мест имплантации эмбриона мыши на 6 день беременности в контроле (а) и в «нулевом» магнитном поле (б). ЛЭ - люминальный эпителий; Э - эмбрион; ТБ - трофобласт; СТ - стромальные клетки.

4.2. Влияние комбинированного МП с крайне слабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер атомов водорода (поле 2).

Выбор МП с параметрами (Вое 42 мкТл, ВАС 0.7 мкТл при частоте 32 Гц) был основан на ранее полученных результатах (Леднев и др. 2003, 2007), свидетельствующих о том, что при использовании такой переменной компоненты МП достигается максимальная величина воздействия на биосистемы. Мы показали, что при экспонировании в поле 2 ЭСК человека сохраняют жизнеспособность и в течение 24 ч культивирования на подложке из желатины формируют колонии, морфология которых соответствует колониям плюрипотентных клеток (рис. 11,0, б).

ЫАЫОС

ЫЕБТШ

Рис. 11. Морфология колоний ЭСК человека в поле 2 через 24 ч культивирования (а) -проходящий свет; б) - фазовый контраст; внешний вид колонии через 48 ч (в - фазовый контраст); тест на выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы (г); тканеспецифического белка Ыевйп (д) и фактора транскрипции плюрипотентных клеток №по§ (е).

Однако при увеличении времени инкубации в поле 2 до 48 ч в центре таких колоний появляется клеточная гетерогенность (рис. 10, в), чего не наблюдается при развитии ЭСК в контроле. Спонтанная дифференцировка ЭСК в естественных условиях культивирования, как правило, идет по периферии колонии (рис. 7, а, б). В поле 2 через 48 ч культивирования центральная масса клеток, формирующая ядро колонии, дает слабое окрашивание на выявление маркеров плюрипотентности ЭСК (рис. 11, г, е), что свидетельствует о снижении плюрипотентного потенциала и переходе стволовых клеток в дифференцированное состояние. С помощью моноклональных антител против тканеспецифического белка нестина установлено, что дифференцировка в поле 2 идет в нейроэктодермальном направлении (рис. 11, д).

Сравнение процессов спонтанной дифференцировки ЭСК в естественном геомагнитном поле, которые сходны с процессами эпителиально-мезенхимальных органогенезов при развитии зародыша, и процессов, происходящих в условиях поля 2, показывает, что использованное нами поле направленно индуцирует нейроэктодермальный тип дифференцировки. Полагаем, что такое физическое воздействие активирует в ЭСК зависимые от кальция регуляторные системы, тем самым заставляя эти клетки дифференцироваться в нейроэктодерму. Как известно, нейроэктодерма является зачатком всей нервной системы взрослого организма, в функционировании которой огромную роль играет кальций-зависимая регуляция возбуждения и передачи нервных импульсов по нейрональным сетям.

Стимулирующее действие поля 2 на зависимые от кальция морфогенетические процессы такие, как кавитация и образование полости на стадии бластоцисты, подтверждено на более сложных объектах - ранних зародышах мыши. Показано, что при добавлении ионофора А23127 в среду культивирования в течение 10 мин экспозиции происходит компактизация бластомеров в результате резкого увеличения (в 3.5 раза) концентрации цитоплазматического кальция (рис. 12Б).

А Б

Рис. 12. Изменение концентрации внутриклеточного кальция в 8-16-клеточных зародышах мыши после обработки ионофором А23187 (1 мкМ). А - интенсивность флуоресценции Р1ио-ЗАМ; Б - уровень концентрации кальция в соответствии со шкалой, рассчитанной по интенсивности флуоресценции Р1ио-3АМ. Зародыш показан за 1 мин перед добавлением А23187 (0) и через 0.17, 0.3, 1.0, 4.0 и 5.0 мин после добавления в среду ионофора А23187.

. время, ч г время, ч

А Ь

Рис. 13. Скорость кавитации зародышей мыши после добавления 1 мкМ ионофора А23187 (А) и в поле 2 (Б), где: 1 - контроль; 2 - опыт.

Резкий выброс кальция под влиянием ионофора стимулирует процессы раннего морфогенеза. После переноса таких зародышей в нормальные условия культивирования усиливается скорость кавитации, быстрее формируется полость бластоцисты (рис. 13А), как и в случае развития зародышей в поле 2 (рис. 13Б), что важно для последующей дифференцировки тотипотентных клеток зародыша на клетки внутренней клеточной массы и клетки трофобласта. Таким образом, поле 2 способно влиять на Са2+-зависимые процессы кавитации и первичной дифференцировки, о чем свидетельствуют сходные результаты с действием ионофора, увеличивающего внутриклеточную концентрацию кальция.

Мы показали, что с помощью приемов культивирования ЭСК и ранних зародышей млекопитающих в поле 2 можно, с одной стороны, сдвигать направление развития в сторону преимущественной дифференцировки в нейроэктодерму, а с другой, - стимулировать процессы раннего морфогенеза. Такое поле может использоваться как существенный фактор физического воздействия на стволовые клетки эмбрионального происхождения в системе in vitro.

выводы

1. Показано, что при снижении свободного кальция в среде до 10'7М ЭСК мыши и человека теряют свои плюрипотентные свойства и переходят в суспензию. Ингибиторным анализом подтверждено значение фосфоинозитольной сигнальной системы для Са2+-зависимой регуляции роста ЭСК человека. Блокирование PLC и РКС в клетках человека приводит к одновременному резкому снижению пролиферативной и метаболической активности, в частности, митохондриальных дегидрогеназ.

2. Установлено, что спонтанная дифференцировка ЭСК человека при развитии в колонии повторяет эмбриогенез и идет от эпителиального фенотипа в сторону образования мезенхимальных и фибробласто-подобных клеток. Все три типа клеток в колонии различаются между собой по уровню цитоплазматического кальция и активности Са2+-транспортирующих систем, что может служить тестом для идентификации дифференцированных и шпорипотентных ЭСК.

3. Показано, что слабое МП («нулевое» МП, 0.2 мкТл) влияет на развитие эмбриональных клеток и целых зародышей мыши как в культуре in vitro, так и в организме матери. В «нулевом» МП происходит нарушение барьерных свойств плазматических мембран и реорганизация цитоскелета, что приводит к остановке развития и гибели зародышей. У беременных мышей в «нулевом» МП зародыши развиваются до стадии бластоцисты, после чего их развитие останавливается из-за нарушений взаимодействия трофоэктодермальных клеток с эндометрием во время имплантации.

4. Выявлено стимулирующее действие комбинированного магнитного поля с крайне слабой переменной компонентой, настроенной на резонансные условия для спинов ядер атомов водорода (поле 2) на развитие зародышей мыши со стадии 8-16 бластомеров. Экспонирование зародышей в таком поле усиливает Са2+-зависимые процессы кавитации на стадии бластоцисты, что способствует дифференцировке тотипотентных клеток на клетки внутренней клеточной массы и трофобласта.

5. Установлено, что поле 2 индуцирует дифференцировку и плюрилотентных ЭСК человека при их развитии in vitro. Показано, что через 48 ч культивирования в колониях ЭСК человека обнаруживаются Nestin-положительные клетки, свидетельствующие об избирательном влиянии этого поля на нейроэктодермальный тип дифференцировки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипенко М. А., Петрова Р. Р., Межевикина Л. М., Жерелова О. М. Влияние ионов свободного кальция на пролиферативиую активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток в культуре in vitro. Цитология, 2006, т. 48, № 9, с. 786-787.

2. Осипенко М. А., Межевикина Л. М., Крастс И. В., Яшин В. А., Новиков В. В., Фесенко Е. Е. Влияние «нулевого» магнитного поля на рост эмбриональных клеток и ранних зародышей мыши в культуре in vitro. Биофизика, 2008, т. 53, вып. 4, с. 705-712.

3. Осипенко М. А., Жерелова О. М., Петрова Р. Р., Межевикина Л. М., Фесенко Е. Е. Влияние ионов свободного кальция на пролиферативиую активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток мыши. ДАН, 2007, т. 412, № 1, с. 123-125.

4. Осипенко М. А., Межевикина Л. М. Пролиферация и жизнеспособность эмбриональных клеток и ранних зародышей мыши в условиях экранирования геомагнитного поля. Биология - наука XXI века, Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2007, с. 18.

5. Осипенко М. А., Межевикина Л. М., Фесенко Е. Е. Эффект «нулевого» магнитного поля в культуре эмбриональных клеток и обеспечении процессов раннего эмбриогенеза. Цитология, 2007, т. 49, № 9, с. 781.

6. Осипенко М. А., Жерелова О. М., Межевикина Л. М. Влияние внеклеточного кальция на пролиферативиую активность эмбриональных стволовых клеток мыши. Биология - наука XXI века, Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2006, стр. 116.

7. Osipenko М. A., Mezhevikina L. М., Petrova R. R. Role of calcium ions in regulation of growth of mouse embryonic stem cells in vitro. British-Russian Workshop in association with the Europian Commission. «Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union -Russian Federation perspectives», 2007, p. 2-3.

8. Осипенко M. А., Плахотин A. H., Таланов E. Ю., Межевикина Л. M. Выявление роли фосфоинозитольной сигнальной системы в эмбриональных стволовых клетках и ранних зародышах. Биология - наука XXI века, Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2008, с. 98.

9. Гольтяев М.В., Осипенко М.А., Межевикина Л.М., Яшин В.А., Фесенко Е.Е. Возможности флуоресцентной и конфокальной микроскопии в изучении особенностей раннего эмбриогенеза млекопитающих. 12-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века», 2008, с. 173.

Подписано в печать: 25.11.2008

Заказ № 1338 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Осипенко, Марина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль ионов Са в клеточных процессах и в раннем эмбриогенезе.

1.1.1. Гомеостаз ионов Са" в клетках.

1.1.2. Мишени и механизмы действия

1.1.3. Са" и клеточная пролиферация.

1.1.3.1 .Са" и пролиферация эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).

1.1.4. Са" и клеточная дифференцировка.

1.1.5. Са" и ранний эмбриогенез.

1.2. Магнитные поля как фактор воздействия на клеточные и эмбриональные процессы.

1.2.1. Влияние гипомагнитных условий на клеточные культуры.

1.2.2. Влияние комбинированных магнитных полей на клеточные культуры

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование ЭСК мыши и человека.

2.2. Выделение и культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши (ПЭФ).

2.3. Выделение и культивирование зародышей мыши.

2.4. Оценка морфофункционального состояния ЭСК и зародышей in vitro.

2.4.1. Иммуноцитохимические исследования.

2.4.2. Оценка жизнеспособности и метаболической активности (МТТ-тест).

2.4.3. Выявление активности эндогенной щелочной фосфотазы (ЭЩФ).

2.4.4. Исследование роли вне- и внутриклеточного кальция в ЭСК.

2.4.5. Исследование роли фосфоинозитольной сигнальной системы и внутриклеточного кальция в зародышах.

2.4.6. Выявление F-актина в эмбриональных клетках и бластомерах зародыша.

2.5. Гистологический анализ мест имплантации зародышей мыши в матку.

2.6. Малогабаритный ССЬ-инкубатор для работы с клетками в магнитных полях.

2.7. Создание «нулевого» магнитного поля для работы с клеточными культурами и зародышами.

2.8. Создание комбинированного магнитного поля с крайне слабой переменной компонентой настроенной на «резонансные» условия для спинов ядер атомов водорода (НС11-КМП) для работы с клеточными культурами и зародышами

2.9. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Определение роли вне- и внутриклеточного кальция в процессах пролиферации и жизнеспособности ЭСК мыши и человека.

3.2. Определение роли фосфоинозитольной сигнальной системы в регуляции процессов пролиферации ЭСК человека.

3.3. Спонтанная дифференцировка ЭСК человека in vitro (роль внутриклеточного кальция).

3.4. Выявление роли внутриклеточного Са~ и фосфоинозитольной сигнальной системы в процессах раннего эмбриогенеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль ионов Ca2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей"

Способность дифференцироваться во многие, если не в абсолютно все клетки взрослого организма, объясняет тот огромный интерес, который проявляется к культурам эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) животных и человека в настоящее время. Значительная часть исследований на ЭСК посвящена выяснению механизмов дифференцировки и репрограммирования из дифференцированного состояния в плюрипотентное с целью создания фундаментальной базы для разработок и внедрения новых биомедицинских технологий.

Несмотря на значительные достижения в области молекулярной биологии ЭСК, по-прежнему остаются не решенными две основные проблемы: 1) поддержание плюрипотентного потенциала этих клеточных культур in vitro и 2) индукция дифференцировки в клетки определенного фенотипа.

Поддерживать ЭСК животных и человека в плюрипотентном недифференцированном состоянии в течение длительного периода культивирования, а тем более получать монодифференцировку в клетки определенного фенотипа довольно сложно (Schuldiner et. al., 2000; Ullmann et al., 2007). Исключение составляют среды, содержащие ДМСО или ретиноевую кислоту, которые индуцируют развитие плюрипотентных клеток преимущественно в нейрональном и/или мышечном направлениях (Wobus et. al., 1997; Marie et. al., 2003; Ventura et. al., 2004). Однако и в этом случае в культуре получается гетерогенная популяция, в которой доля клеток определенного фенотипа небольшая, и составляет 3-5 % (Schuldiner et. al., 2000; Ventura et. al., 2004; Fiorio et. al., 2005).

Известны и другие химические индукторы, например, факторы роста и цитокины, активирующие дифференцировку ЭСК животных и человека в определенном направлении (Wobus et al., 1997; Гривенников, Мануйлова, 2003; Мануйлова и др., 2003). Ростовые факторы активин-А и тромбоцитарный ростовой фактор (TGFbl) вызывают дифференцировку ЭСК с образованием производных мезодермы. Морфогенетический регуляторный белок-4 (ВМР-4), а также эпидермальный ростовой фактор (EGF) и фактор роста фибробластов (bFGF) — в производные мезодермы и эктодермы, нейрональный ростовой фактор (NGF) и ростовой фактор гепатоцитов (HGF) — в производные всех трех зародышевых листков.

Поиск специфических индукторов дифференцировки и активаторов роста ЭСК продолжается и в настоящее время. Однако до сих пор не обнаружено соединений, обладающих специфичностью действия на ЭСК и заставляющих все клетки одной популяции дифференцироваться в строго заданном направлении. Несмотря на многочисленные попытки выявить такой индуктор, проблема получения монодифференцировки ЭСК остается нерешенной.

Главная задача современных исследований состоит в том, чтобы научиться получать in vitro популяции ЭСК, обогащенные определенными типами функционально активных клеток. Решение этой задачи тесно связано с разработкой эффективных методов по отсортировыванию клеток нужного фенотипа от клеток с другим типом дифференцировки, а также недифференцированных предшественников, которые могут нести потенциальную угрозу образования опухолей в организме реципиента.

Учитывая огромный интерес к ЭСК как источникам различных типов клеток для заместительной терапии, нельзя исключить возможность появления в самом недалеком будущем технологий создания на основе ЭСК «чистых» популяции одного типа клеток, которые после трансплантации смогут заместить собственные клетки пациента, подвергшиеся дегенерации или деструкции (Colman, King, 2000; Wakayama et. al., 2001; Calice, Gersh, 2002; Chen et. al., 2003; Hochelinger, Jaenisch, 2003).

Для ЭСК животных и человека, как и для других эмбриональных и соматических клеток, важное значение имеют не только ростовые факторы и цитокины, но и определенное соотношение концентраций щелочных и щелочно-земельных катионов (К+, Mg2^ и Са2+), представления о влиянии которых на функциональное состояние клеток имеет почти столетнюю историю.

Не умаляя значение других катионов, следует отметить, что именно ноны Са~ как вторичные мессенджеры являются наиболее эффективным сигналом для пролиферации и прохождения Gi стадии клеточного цикла (Rubin et. al., 1976; Kamine et. al., 1976; Осипенко и др., 2006, 2007). Ионы кальция включены во множество клеточных систем как регулирующие рост и макромолекулярный синтез элементы. Нарушение Са2+-баланса приводит к снижению жизнеспособности и гибели клеток.

Фактором неинвазивного влияния на процессы клеточной пролиферации и дифференцировки являются слабые магнитные поля (МП), в частности, «нулевое» МП или же комбинированное МП со сверхслабой переменной компонентой, настроенной на «резонансные» условия для спинов ядер водорода. Действие таких МП детально исследовано в основном на моделях примитивно организованных беспозвоночных животных — планариях (Леднев и др., 1996; Belova et. al., 2007; Novikov et al., 2008). Вопрос о том, могут ли, и каким образом, слабые МП влиять на ранний эмбриогенез, а также развитие ЭСК человека in vitro остается открытым. Поэтому нам представлялось весьма интересным изучить возможность воздействия таких полей на процессы пролиферации и дифференцировки ЭСК и ранних зародышей.

Основной целью настоящей работы было исследование роли ионов кальция в регуляции роста, пролиферативной активности и дифференцировки плюрипотентных клеток мыши и человека, а также эффектов слабых МП при действии на эти процессы в системе in vitro.

Решали следующие задачи:

• Оценка пролиферативной и метаболической активности ЭСК при изменении вне- и внутриклеточной концентрации ионов Са24.

• Исследование фосфоинозитольной сигнальной системы в регуляции процессов развития ЭСК и ранних зародышей в культуре.

• Выявление типа и направления цитодифференцировки ЭСК в зависимости от концентрации цитоплазматического кальция.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль ионов Са2+ в клеточных процессах и в раннем эмбриогенезе.

Интерес к сигнальным каскадам, которые активируются кратковременным повышением внутриклеточного кальция, возник около 120 лет назад, благодаря экспериментам, начатым в Лондоне в лаборатории Sidney Ringer (Ringer S. (1883) J. Physiol. 4, 29-43), где изучали динамику сокращений изолированных сердец крыс в различных солевых растворах, в том числе и с добавлением солей кальция с целью поддержания ритма сердечных сокращений. Сейчас этот химический элемент определяется как один из ключевых регуляторов клеточных циклов и метаболической активности разных типов соматических и эмбриональных клеток животных и человека (Carafoli, 2002).

Ионы кальция являются посредниками во многих сигнальных каскадах, которые обеспечивают нормальное функционирование клеток, их пролиферацию, дифференцировку, секрецию и апоптоз (Rasmussen et al., 1983; Marie et al., 2000, 2003). Трудно переоценить значение ионов Са2+ и в раннем эмбриогенезе. Начиная со стадии слияния гамет, когда сильное повышение цитоплазматического кальция запускает кортикальную реакцию, далее при созревании ооцита и делениях дробления и потом в ходе формирования осей зародыша ионы Са" играют важную роль в регуляции раннего развития (Cuthbertson et. al., 1981, 1985; Stachecki et. al., 1994).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Осипенко, Марина Александровна

4. ВЫВОДЫ:

1. Показано, что при снижении свободного кальция в среде до

10"М ЭСК мыши и человека теряют свои плюрипотентные свойства и переходят в суспензию. Ингибиторным анализом подтверждено значение I фосфоинозитольной сигнальной системы для Са" -зависимой регуляции роста ЭСК человека. Блокирование PLC и РКС в клетках человека приводит к одновременному резкому снижению пролиферативной и метаболической активности, в частности, митохондриальных дегидрогеназ.

4. Выявлено стимулирующее действие комбинированного магнитного поля с крайне слабой переменной компонентой, настроенной на «резонансные условия» для спинов ядер атомов водорода (поле 2) на развитие зародышей мыши со стадии 8-16 бластомеров. Экспонирование зародышей в таком поле усиливает Са2+-зависимые процессы кавитации на стадии бластоцисты, что способствует дифференцировке тотипотентных клеток на клетки внутренней клеточной массы и трофобласта.

5. Установлено, что поле 2 индуцирует дифференцировку и плюрипотентных ЭСК человека при их развитии in vitro. Показано, что через 48 ч культивирования в колониях ЭСК человека обнаруживаются Nestin-положительные клетки, свидетельствующие об избирательном влиянии этого поля на нейроэктодермальный тип дифференцировки.

3.7. Заключение.

Полученные нами данные по исследованию эффектов слабых МП на эмбриональных клетках и ранних зародышах свидетельствуют о том, что путем физического воздействия можно неинвазивно влиять на процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, а также в целом на морфогенез. Существенное значение имеет выбор МП, с помощью которых можно как подавлять основные клеточные процессы (поле 1 или «нулевое» МП), так и активировать их (поле 2 или Нсп-КМП).

Активирование процессов дифференцировки является наиболее важным моментом, особенно, когда дело касается получения направленной дифференцировки ЭСК без использования химических индукторов и приемов генетической трансфекции. В этом случае комбинированное МП с крайне слабой переменной компонентой, настроенной на «резонансные» условия для спинов ядер атомов водорода (поле 2), является фактором индуцирующего действия на процессы дифференцировки, что продемонстрировано на зародышах (активация морфогенеза) и ЭСК человека (активация нейроэктодермального типа дифференцировки).

Пролиферация и дифференцировка эмбриональных клеток in vitro регулируются при участии вне- и внутриклеточного кальция и способность Нсп-КМП влиять на эти процессы может свидетельствовать о комплексном воздействии этого поля на различные каскады Са2+-зависимых сигнальных реакций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Осипенко, Марина Александровна, Пущино

1. Александров Н. JL Полярные сияния. Процессы на поверхности Земли. М.: Наука, 2001.

2. Белова Н. А. Модуляция функционально-метаболических свойств биосистем с помощью слабых магнитных полей. Дис. Канд. Биол. Наук, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.-Пущино, 2001, с. 93.

3. Березовская О.П., Межевикина JI.M., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов- линейных мышей. Онтогенез, 1986, т. 17, № 5, стр.553-555.

4. Бинги В. Н., Савин А. В. Физические проблемы действия слабых магнитных полей на биологические системы. Успехи физических наук, 2003, т. 173, с. 265-300.

5. Владимиров Ю. А. Кальциевые насосы живой клетки. Соросовский образовательный журнал, 1998, вып. 3, с. 20-27.

6. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: «Медицина», 1982.

7. Гайдуков Ю. П. Физические основы и методы получения магнитного поля. Соросовский образовательный журнал, 1996, н. 4, с. 97-105.

8. Гусев Н. Б. Внутриклеточные Са связывающие белки. Часть 1 и 2. Соросовский образовательный журнал, 1998, вып. 5, с. 2-16.

9. Дубров А. П. Геомагнитное поле и жизнь. Л.: гидрометеоиздат, 1974, 175 с.

10. Жадин М. Н. Действие магнитных полей на движение иона в макромолекуле: теоретический анализ. Биофизика, 1996, т. 41, вып. 4, с. 832-850.

11. Зинченко В. П., Долгачева JI. П. Внутриклеточная сигнализация. ОНТИ ПНЦ РАН, Пущино, 2003.

12. Кириаков В. X., Любимов В. В. Новые приборы для исследования гипогеомагнитных полей и помещений. Мед. Физика, 2004, № 4, в. 24, с. 32-35

13. Красик В. Р. Физика и техника сильных магнитных полей. М.: Наука, 1964.

14. Леднев В. В. Биоэффекты слабых комбинированных, постоянных и переменных магнитных полей. Биофизика, 1996, т. 41, в. 1, с. 224-230.

15. Леднев В. В., Белова Н. А., Рождественская 3. Б., Тирас X. П. Биоэффкты слабых переменных магнитных полей и биологические предвестники землетрясений. Географические процессы и биосфера, 2003, т. 2, № 1, с. 3-9.

16. Лойд 3., Госсрау 3., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Москва, Мир, 1982, с. 64-67.

17. Межевикина JI.M., Колтун С.В., Горюшкин Г.Е., Тигранян Р.Э. Действие ЭМИ СВЧ на морфофункциональное состояние зародышей лабораторных мышей. Биофизика, 1990, т. 35, вып. 5, с. 813-816.

18. Межевикина JI.M., Лепихов К.А., Храмов Р.Н. Стимуляция развития двухклеточных зародышей мыши в поле электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. В сб.: Консервация генетических ресурсов. Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 1996, стр. 71-72.

19. Межевикина Л.М., Храмов Р.Н., Лепихов К.А. Имитация кооперативного эффекта развития в культуре ранних зародышей мыши после облучения электромагнитными волнами миллиметрового диапазона. Онтогенез, 2000, т. 31, № 1, стр. 27-31.

20. Миляев В. А., Бинги В. Н. О физической природе магнитобиологических эффектов. Квантовая электроника, 2006, т. 36, н. 8, с. 691-701.

21. Новиков В.В., Шейман И.М., Фесенко Е.Е. Влияние слабых и сверхслабых постоянных магнитных полей Планарии Биофизика, 2007, т. 52, вып. 5, с.

22. Осипенко М.А., Петрова P.P., Межевикина Л.М., Жерелова О.М. Влияние ионов свободного кальция на пролиферативную активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток в культуре in vitro. Цитология, 2006, т. 48, № 9, с. 786-787.

23. Осипенко М.А., Жерелова О.М., Петрова P.P., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Влияние ионов свободного кальция на пролиферативную активность и жизнеспособность эмбриональных стволовых клеток мыши. ДАН, 2007, т. 412, № 1, с. 123-125.

24. Осипенко М.А., Межевикина Л.М., Крастс И.В., Новиков В.В., Фесенко Е.Е. Влияние «нулевого» магнитного поля на рост эмбриональных клеток и ранних зародышей мыши в культуре in vitro. Биофизика, 2008, т. 53, вып. 4, с. 705-712.

25. Саркисова Д. С., Перова Ю. Л. Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов. М.: «Медицина», 1996.

26. Сивухин Д. В. Общий курс физики. М.: Наука, 1977.

27. Тирас X. П., Сребницкая JI. К., Ильясова Е. Н., Климов А. А., Леднев В. В. Влияние слабого комбинированного магнитного поля на скорость регенерации планарий Dugesia tigrina. Биофизика, 1996, т. 41, вып. 4, с. 826-831.

28. Ткачук В. А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. Соросовский образовательный журнал, 2001, т. 7, вып. 5, с. 10-15.

29. Aldinucci С., Garcia J. В. The effect of strong static magnetic field on lymphocytes. Bioelectromag., 2003, v. 24, p. 109-117.

30. Antoniotti S., Fiorio Pla A., Pregnolato S., Mottola A., Lovisolo D., Munaron L. J. Control of endothelial cell proliferation by calcium influx and arachidonic acid etabolism: a pharmacological approach. Cell Physiol., 2003, v. 197, №3, p. 370-378.

31. Aplin J.D., Kimber S.J. Trophoblast-uterine interactions at implantation. Rprod. Biol. Endocrinol., 2004, v. 2, p. 1-12.

32. Barbier E., Dyfy В., Veyret B. Stimulation of Ca2+ influx in rat pituitary cells under exposure to a 50Hz magnetic field. Bioelectromag., 1996, v. 17, p. 303-311.

33. Binhi V. N., Savin A. V. Molecular gyroscopes and biological effects of weak extremely low-frequency magnetic fields. Phys. Rev. E., 2002, v.65, p. 1-10.

34. Binhi V. N. Stochastic dynamics of magnetic nanoparticles and a mechanism of biological orientation in the geomagnetic field. Bioelectromagnetics, 2004, v. 27, № 1, p. 58-63.

35. Binhi V. N., Chernavskii D. S. Stochastic dynamics of magnetosomes in cytoskeleton. Europhysics Letters, 2005, v. 70, № 6, p. 850-856.

36. Boheler K. R., Czyz J., Tweedie D., Yang H. Т., Anisimov S. V., Wobus A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ. Res., 2002, v. 91, № 3, p. 189-201.

37. Boynton A. L., Whitfield J. F., Isaacs R. J., Tremblay R. J. The control of human WI-38 cell proliferation by extracellular calcium and its elimination by SV-40 virus-induced proliferative transformation. Cell Physiol., 1977, v. 92, №2, p. 241-247.

38. Burdon Т., Smith A., Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends in Cell Biology, 2002, v. 12, p. 432^38.

39. Caplice N.M., Gersh B.J. Stem cells to repair the heart a clinical perspective. Circ. Res., 2002, v. 91, p. 1092-1102.

40. Carson J. J., Prato F. S., Drost D. J., Diesbourg L. D., Dixon S. J. Time-varying magnetic fields increase cytosolic free Ca2+ in HL-60 cells. Am. J. Physiol., 1990, v. 259, p. 687-692.

41. Chiabrera A. Electromagnetics in Medicine and Biology. San Francisco: San Francisco Press, 1991.

42. Ciapa В., Pesando D., Wilding M., Whitaker M. Cell-cycle calcium transients driven by cyclic changes in inositol trisphosphate levels. Nature, 1994, v. 368, № 6474, p. 875-878.

43. Colman A., King A. Therapeutic cloning: concepts and practicalities. TIBTECH, 2000, v. 18, p. 192-196.

44. Colonna R., Tatone C., Francione A., Rosati F., Callaini G., Corda D., Di Francesco L. Protein kinase С is required for the disappearance of MPF upon artificial activation in mouse eggs. Mol. Reprod. Dev., 1997, v. 48, № 2, p. 292-299.

45. Cuthbertson K. S. R.,Cobbold P. H. Phorbol ester and sperm activate mouse1. I.oocytes by induction sustained oscillations in cell Ca~ . Nature, 1985, v. 316, p. 541-542.

46. Cuthbertson K. S. R., Whittingtham D. G., Cobbold P. H. Free Ca2+ increases in exponential phase during mouse oocyte activation. Nature, 1981, v. 294, p. 754-757.

47. Das S.K., Yano S., Wang J., Edwards D.R., Nagase H., Dey S.K. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in the mouse uterus during the periimplantation period. Dev. Genet., 1997, v. 21, p. 44-54.

48. D'Ascenzo M., Piacentini R., Casalbore P., Budoni M., Pallini R., Azzena G. В., Grassi C. Role of L-type Ca2+ channels in neural stem/progenitor cell differentiation. Eur. J. Neurosci., 2007, v. 23, № 4, p. 935-944.

49. Deibert M. C., McLeod B. R., Smith S. D., Liboff A. R. Ion resonance electromagnetic field stimulation of fracture healing in rabbits with a fibular ostectomy. J. Orthop. Res., 1994, v. 12, p. 878-885.

50. Dhanasekaran N., Tsim S-T., Dermott J. M., Onesime D. Regulation of cell proliferation by G proteins. Oncogene, 1998, v. 17, p. 1383-1394.

51. Dravid G., Hammond H., Cheng L. Culture of Human Embryonic Stem Cells on Human and Mouse Feeder Cells. Humana Press. Human Embryonic Stem Cell Protocols, 2006, v. 331, p. 91-104.

52. Duffy С., Kane M. T. Investigation of the role of inositol and the phosphatidylinositol signal transduction system in mouse embryonic stem cells. Journal of Reproduction and Fertility, 1996, v. 108, p. 87-93.

53. Duffy С., Kane M. T. Investigation of the role of inositol and the phosphatidylinositol signal transduction system in mouse embryonic stem cells. Journal of Reproduction and Fertility, 1996, v. 108, p. 87-93.

54. Eichwald C., Kaiser F. Model for external influences on cellular signal transduction pathways including cytosolic calcium oscillations. Bioelectromagnetics, 1995, v. 16, № 2, p. 75-85.

55. Ernesto Carafoli. Calcium signaling: A tale for all seasons. PNAS, 2002, v. 99, №3, p. 1115-1122.

56. Estacion M., Mordan L. Competence induction by PDGF requires sustained calcium influx by a mechanism distinct from storage-dependent calcium influx. Cell Calcium, 1993, v. 14, p. 439-454.

57. Fedrowitz M., Loscher W. Power frequency magnetic fields increase cell proliferation in the mammary gland of female fischer 344 rats but not various other rat strains or substrains. Oncology, 2005, v. 69, p. 486-498.

58. Fesenko E. E., Kolesnikov S. S., Lyubarsky A. L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment. Nature, 1985, v. 313, p. 310-313.

59. Fink С. С., Slepchenko В., Moraru I. I. An Image-Based Model of Calcium Waves in Differentiated Neuroblastoma Cells. Biophysical J., 2000, v. 79, p. 163-183.

60. Fiorio Pla A., Munaron L. Calcium influx, arachidonic acid, and control of endothelial cell proliferation. Cell Calcium, 2001, v. 30, p. 235-244.

61. Fitzsimmons R. J., Ryaby J. Т., Magee F. P., Baylink D. J. Combined magnetic fields increased net calcium influx in bone cells. Calcif. Tissue Int., 1994, v. 55, p. 376-380.

62. Fukuda M. N., Sato Т., Nakayama J., Klier G., Mikami M., Aoki D., Nozawa S. Trophinin and tastin, a novel cell adhesion molecule complex with potential involvement in embryo implantation. Genes Dev., 1995, v. 9, p. 1199-1210.

63. Furshpan E. J., Potter D. D. Low-resistance junctions between cells in embryos and tissue culture. Curr. Top. Dev. Boil., 1968, v. 3, p. 95-128.

64. Gallicano G. I., McGaughey R. W., Capco D. G. Activation of protein kinase С after fertilization is required for remodeling the mouse egg into the zygote. Molecular Reproduction and Development, 1997b, v. 46, p. 587601.

65. Gallicano G. I., Yousef M. C., Capco D. G. PKC a pivotal regulator of early development. Bioessays, 1997a, v. 19, p. 29-36.

66. Galvanovskis J., Sandblom J., Bergqvist В., Gait S., Hamnerius Y. The influence of 50-Hz magnetic fields on cytoplasmic Ca2+ oscillations in human leukemia T-cells. Sci. Total Environ., 1996, v. 180, № 1, p. 19-33.

67. Glossmann H., Striessnig J. Molecular properties of calcium channels. Rev. Physiol. Biochem. Phatmacol., 1990, v. 114, p. 1-105.

68. Gu Y., Jayatilak P.G., Parmer T.G., Gauldie J., Fey G.H., Gibori G. Alpha 2-mecroglobulin expression in the mesometrial decidua and its regulation by decidual luteotrophin and prolactin. Endocrinology, 1992, v. 131, p. 13211328.

69. Gumbiner В., Stevenson В., Grimaldi A. The role of the adhesion molecule uvomorulin in the formation and maitenance of epithelial junctional complex. J. Cell Biol., 1988, v. 107, p. 1575-1587.

70. Flazelton B. J., Tupper J. T. Intracellular ionic changes in normal and transformed human fibroblasts after extracellular Ca2+ deprivation. Biochem. J., 1981, v. 194, p. 707-711.

71. Hazelton В., Mitchell В., Tupper J. Calcium, magnesium, and growth control in the WI-38 human fibroblast cell. J. Cell Biology, 1979, v. 83, p. 487-498.

72. He Z., Li J. J., Zhen С. H., Feng L. Y., Ding X. Y. Effect of leukemia inhibitory factor on embryonic stem cell differentiation: implications for supporting neuronal differentiation. Acta. Pharmacol. Sin., 2006, v. 27, № 1, p. 80-90.

73. Hickie R. A., Wei J. W., Blyth L. M., Wong D. Y., Klaassen D. J. Cations and calmodulin in normal and neoplastic cell growth regulation. Can. J. Biochem. Cell Biol., 1983, v. 61, № 8, p. 934-941.

74. Hickie R. A., Wei J. W., Blyth L. M., Wong D. Y., Klaassen D. J. Cations and calmodulin in normal and neoplastic cell growth regulation. Can J. Biochem. Cell Biol., 1983, v. 61, № 8, p. 934-941.

75. Hill T. D., Kindmark H., Boynton A. L. Epidermal growth factor-stimulated DNA synthesis requires an influx of extracellular calcium. J Cell Biochem., 1988, v. 38, №2, p. 137-144.

76. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. The new England jour, of med., 2003, v. 349, №3, p. 275-286.

77. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature, 2006, v. 441, p. 1061-1067.

78. Hofmann J. The potential for isoenzyme-selective modulation of protein kinase C. FASEB Journal, 1997, v. 11, p. 649-669.

79. Jenrow K. A., Smith С. H., Liboff A. R. Weak extremely-low frequency magnetic fields and regeneration in the planarian Dugesia tigrina. Bioelectromagnetics, 1995, v. 16, p. 106-112.

80. Jiang Y., Jahagirdar B. N., Reinhardt R. L. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, 2002, v. 418, p. 41-49.

81. Jung Sun Heo, Yun Jung Lee, Ho Jae Han. EGF stimulates proliferation of mouse embryonic stem cells: involvement of С a" influx and p44/42 MAPKs. J. Physiol. Cell Physiol., 2005, v. 290, p. 123-133.

82. Kahl C. R., Means A. R. Regulation of cell cycle progression by calcium/calmodulin-dependent pathways. Endocr. Rev., 2003, v. 24, p. 719736.

83. Kamine J. and Rubin H. Magnesium required for serum-stimulation of growth in cultures of chick embryo fibroblast. Nature, 1976, v. 263, p. 134143.

84. Kanashiro C. A., Khalil R. A. Signal transduction by protein kinase С in mammalian cells. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 1998, v. 25, p. 974-985.

85. Kane M. Т., Bavister В. D. Vitamin requirements for development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts in vitro. Biology of Reproduction, 1988, v. 39, p. 1137-1143.

86. Kane M. Т., Carney E. W., Bavister B. D. Vitamins and amino acids stimulate hamster blastocysts to hatch in vitro. Journal of Experimental Zoology,-1986, v. 239, p. 429-432.

87. Kapur N., Mignery G. A., Banach K. Am J. Physiol. Cell cycle-dependent calcium oscillations in mouse embryonic stem cells. Cell Physiol., 2007, v. 292, p. 1510-1518.

88. Kirschvink J. L., Jones D. S., MacFadden B. J. Magnetite Biomineralization and Magnetoreception in Organisms: A New Biomagnetism. New York: Plenum Press, 1985.

89. Kojima I., Mogami H., Ogata E. Role of calcium entry and protein kinase С in the progression activity of insulinlike growth factor-I. J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 1003-1006.

90. Kolesnikov S. S., Zhainazarov А. В., Kosolapov A. V. Cyclic nucleotide-activated channels in the flog olfactory receptor plasma membrane. FEBS Lett., 1990, v. 266, p. 96-98.

91. Koltun S.V., Mezhevikina L.M. Effect of radio frequency electromagnetic radiation on the morphological state of mice embryos. In: Microwaves of Medicine. Roma, Italy, 1993, p. 297-300.

92. Kondrachuk A. V, Sirenko S. P. The theoretical consideration of microgravity effects on a cell. Adv. Space Res., 1996, v. 17, № 6-7, p. 165168.

93. Korzh-Sleptsova I. L., Lindstrom E., Mild К. H., Berglund A., Lundgren E. Low frequency MFs increased inositol 1,4,5-trisphosphate levels in the Jurkat cell line. FEBS Lett., 1995, v. 359, № 2-3, p. 151-154.

94. Kroupova J., Bartova E., Fojt L., Strasak L., Kozubek S., Vetterl V. Low-frequency magnetic field effect on cytoskeleton and chromatin. Bioelectrochemistry, 2007, v. 70, № 1, p. 96-100.

95. Munaron L., Antoniotti S., Fiorio Pla A., Lovisolo D. Blocking Ca2+ entry: a way to control cell proliferation. Curr Med Chem., 2004, v. 11, № 12, p. 1533-1543.

96. Munaron L., Antoniotti S., Lovisolo D. Intracellular calcium signals and control of cell proliferation: how many mechanisms? J. Cell. Mol. Med., 2004, v. 8, №2, p. 161-168.

97. Munaron L., Fiorio Pla A. Calcium influx induced by activation of tyrosine kinase receptors in cultured bovine aortic endothelial cells. J. Cell Physiol., 2000, v. 185, №3, p. 454-63.

98. Nagi A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 8424-8428/

99. Nieto M. A., Sargent M. G., Wilkinson D. G., Cooke J. Control of cell behavior during vertebrate development by Slug, a zinc fmger gene. Science, 1994, v. 264, p. 835-839.

100. Nikonov A.A., Zinchenko V.P., Mezhevikina L.M., Zherelova O.M., Mashkin P.V. Effect of electromagnetic radiation of mm-range on Ca distribution in culture cells of mice's embryos. Radiation Biophysics, 1990, p. 546.

101. Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992, v. 258, № 5082, p. 607-614.

102. Norimura T. Effects of strong magnetic fields on cell growth and radiation response of human T-lymphocytes in culture. Sangyo Ika Diagaku Zasshi, 1993, v. 15, p. 103-112.

103. Norimura Т., Imada H., Kunugita N., Yoshida N., Nikaido M. Effects of strong magnetic fields on cell growth and radiation response of human T-lymphocytes in culture. J UOEH, 1993, v. 15, № 2, p. 103-112.

104. Novikov V., Sheiman I., Fesenko E. Effect weak static and low-frequency alternating magnetic fields on the fission and regeneration of the planarian Dugesia (Gigardia) tigrina. Bioelectromagnetics, 2008, v. 29, p. 387-393.

105. Nowycky M. С., Fox А. P., Tsien R. W. The types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity. Nature, 1985, v. 316, p. 440-443.

106. Paria B.C., Zhao X., Das S.K., Dey S.K., Yoshinaga K. Zonula occludens-1 and E-cadherin are coordinately expressed in the mouse uterus with the initiation of implantation and decidualization. Devel. Biol., 1999, v. 208, № 2, p. 488-501

107. Peskin C. N., Odell G. M., Oster G. F. Cellular motions and thermal fluctuations: the Brownian ratcher. Biophys. J., 1993, v. 65, p. 316-324.

108. Pessina G. P., Aldinucci C., Palmi M., Sgaragli G., Benocci A., Meini A., Pessina F. Pulsed electromagnetic fields affect the intracellular calcium concentration in human astrocytoma cells. Bioelectrochemistry, 2001, v. 22, p. 503-510.

109. Petrov E., Martinac B. Modulation of channel activity and gadolinium block of MscL by static magnetic fields. European Biophysics Journal, 2006, v. 36, №2, p. 95-105.

110. Piacentini R., Ripoli C., Mezzogori D., Azzena G. В., Grassi C. Extremely low-frequency electromagnetic fields promote in vitro neurogenesis via upregulation of Ca (v)l-channel activity. J. Cell Physiol., 2008, v. 215, № 1, p. 129-139.

111. Popot J. L., Changeaux J. P. Nicotinic receptor of acetylcholine: structure of an oligomeric integral membrane protein. Physiol. Rev., 1984, v. 64, p. 1 162-1188.

112. Prato F. S., Carson J. J., Ossenkopp K. P., Kavaliers M. Possible mechanisms by which extremely low frequency magnetic fields affect opioid function. The FASEB Journal, 1995, v. 9, p. 807-814.

113. Puceat M., Jaconi M. Ca2+ signalling in cardiogenesis. Cell Calcium, 2005, v. 38, №3-4, p. 383-389.

114. Putney J.W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium, 1986, v. 7, p. 1-12.

115. Quinlan L. R., Faherty S., Kane M. T. Phospholipase С and protein kinase С involvement in mouse embryonic stem-cell proliferation and apoptosis. Reproduction, 2003, v. 126, p. 121-131.

116. Rasmussen H. and Goodman D. Relationships between calcium and cyclic nucleotides in cell activation. Physiol. Rev., 1977, v. 57, p. 421-509.

117. Rasmussen H. Cellular calcium metabolism. Ann Intern Med., 1983, v. 98, p.809-16.

118. Raylman R. R. Exposure to strong static magnetic field slows the growth of human cancer cells in vitro. Bioelectromag., 1996, v. 17, p. 358-363.

119. Raz R., Lee C.-K., Cannizzaro L.A., d'Eustachio P., Levy D.E. Essential role of STAT3 for embryonic stem cell pluripotency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, No 6, p. 2846-2851.

120. Reuter H. A variety of calcium channels. Nature, 1985, v. 316, p. 391.

121. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (ed. Robertson E.J.). Oxford, UK: IRL Press, 1987, p. 71-112.

122. Rogers N. Т., Hobson E., Pickering S. Phospholipase С causes Ca21 oscillations and parthenogenetic activation of human oocytes. Reproduction, 2004, v. 128, p. 697-702.

123. Rosier E. S., Fisk G. J., Ares X., Irving J., Miura Т., Rao M. S., Carpenter M. K. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev. Dyn., 2004, v. 229, p. 259-274.

124. Stachecki J. J., Armant D. R. Transient release of calcium from inositol 1,4,5-trisphosphate-specific stores regulates mouse preimplantation development. Development, 1996b, v. 122, p. 2485-2496.

125. Stachecki J. J., Yelian F. D., Schultz J. F., Leach R. E., Armant D. R. Blastocyst cavitation is accelerated by etanol- or ionofore-indused elevation of intracellular calcium. Biol, of Reprod., 1994, v. 50, p. 1-9.

126. Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Sience, 1991, v. 251, p. 1451-1455.

127. Takuwa N., Zhou W., Takuwa Y. Calcium, calmodulin and cell cycle progression. Cell Signal, 1995, v. 7, № 2, p. 93-104.

128. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M. A., Swiergiel J. J., Marshall V. S., Jones J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998, v. 282, p. 1145-1147.

129. Tonini R., Baroni M. D., Masala E. M. Calcium Protects Differentiating Neuroblastoma Cells during 50Hz Electromagnetic Radiation. Biophys. J., 2001, v. 81, № 5, p. 2580-2589.

130. Tsicn R. W. Calcium channels in excitable cell membrane. Annu. Rev. Physiol., 1983, v. 45, p. 341-358.

131. Van Biesen Т., Luttrell L. M., Hawes В. E., Lefkowitz R. J. Mitogenic signaling via G protcin-coupled receptors. Endocrine Reviews, 1996, v. 17, p. 698-714.

132. Ward K. W., Rogers E. H., Hunter E. S. Comparative pathogenesis of haloacetic acid and protein kinase inhibitor embryotoxicity in mouse whole embryo culture. Toxicological Sciences, 2000, v. 53, p. 118-126.

133. Weller S. G., Klein I. K., Penington R. C., Karnes W. E. Distinct protein kinase С isozymes signal mitogenesis and apoptosis in human colon cancer cells. Gastroenterology, 1999, v. 117, p. 848-857.

134. Ventura C., Maioli M., Asara Y. Bytyric and retinoic mixed ester of hyaluronan: a novel differentiating glycoconjugate affording a high throughout of cardigenesis in embryonic stem cells. J. Biol. Chem., 2004, v. 279, № 22, p. 23574-23579.

135. Ventura C., Maioli M., AsaraY., Santoni D., Mesirca P., Remondini D., Bersani F. Turning on stem cell cardiogenesis with extremely low frequency magnetic fields. The FASEB Journal, 2005, v. 19, p. 155-157.

136. Wakayama Т., Tabar V., Rodriguez I., Perry A.C., Studer I., Mombaets P. Differentation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science, 2001, v. 297, p. 740-743.

137. Whitaker M., Larman M. G. Calcium and mitosis. Semin Cell Dev Biol., 2001, v. 12, p. 53-58.

138. Whitfield J. F., MacManus J. P., Rixon R. H., Boynton A. L., Youdale Т., Swierenga S. H. H. The positive control of cell proliferation by the interplay of calcium ions and cyclic nucleotides. In Vitro (Rockville), 1976, v. 12, p. 1-18.

139. Wobus A. M., Kaomei G., Shan J. Retinoic acid accelerates embryonic stem cell-derived cardiac differentation and enhances development of ventricular cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol., 1997, v. 29, p. 1525-1539.

140. Xu С., Inokuma M. S., Denham J., Golds K., Kundu P., Gold J. D., Carpenter M. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embiyonic stem cells. Nat. Biotechnol., 2001, v. 19, p. 971-974.

141. Yanagida E., Shoji S., Hirayama Y., Yoshikawa F., Otsu K., Uematsu H., Hiraoka M., Furuichi Т., Kawano S. Functional expression of Ca2+ signaling pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Calcium, 2004, v. 36, №2, p. 135-146.

142. Yost M. G., Liburdy R. P. Time-varying and static magnetic fields act in combination to alter calcium signal transduction in the lymphocyte. FEBS Lett., 1992, v. 296, p. 117-122.

143. Zhao Y., Doroshenko P. A., Alper S. L., Baltz J. M. Routes of CI transport across the trophectoderm of the mouse blastocyst. Dev. Biol., 1997, v. 189, p. 148-160.

Информация о работе

Осипенко, Марина Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль ионов Ca2+ в процессах пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы