Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль гипоксии и ишемии мозга в метаболизме амилоидного пептида и патогенезе болезни Альцгеймера
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Роль гипоксии и ишемии мозга в метаболизме амилоидного пептида и патогенезе болезни Альцгеймера"
92-
На правах рукописи
Наливаева Наталия Николаевна
РОЛЬ ГИПОКСИИ И ИШЕМИИ МОЗГА В МЕТАБОЛИЗМЕ АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА И ПАТОГЕНЕЗЕ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2006 г.
Работа выполнена в лаборатории сравнительной нейрохимии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии Наук (зав. лабораторией д.б.н. Н.Ф. Аврова)
Научный консультант
доктор биологических наук, Аврова Н.Ф.
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Арутюнян А.В.
академик РАМН, профессор Ашмарин И.ГТ.
доктор биологических наук, профессор Перцева М.Н.
Ведущее учреждение
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Защита состоится 13 июня 2006 г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН в зале заседаний Ученого Совета по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Автореферат разослан_11_мая_2006 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Л // доктор биологических наук, профессор ^ [.Н. Маслова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний нервной системы, сопровождающимся тяжелыми нарушениями деятельности мозга и встречающимся, в основном, у людей пожилого возраста. В связи с увеличением средней продолжительности жизни число людей, страдающих старческой формой данного заболевания, возрастает каждый год. По данным Международной организации здравоохранения только в Европе к 2010 году затраты на лечение больных, страдающих этим заболеванием, будут составлять более 500 миллионов евро в год. Кроме того, существуют генетически обусловленные формы болезни Альцгеймера, встречающиеся в более молодом возрасте и требующие специальных подходов диагностики и лечения. Несмотря на то, что в мировой литературе накоплен значительный экспериментальный материал по изучению морфологических, физиологических и биохимических основ болезни Альцгеймера, в настоящее время все еще нет ясной концепции патогенеза этого заболевания и адекватных подходов к его лечению. Одним из факторов, приводящим к гибели нервных клеток и когнитивным нарушениям, сопровождающим болезнь Альцгеймера, является патологическое накопление в ткани мозга агрегатов 3-амилоидного пептида, являющегося основным компонентом так называемых сенильных бляшек. Последние являются одним из наиболее характерных морфологических проявлений болезни Альцгеймера. Амилоидный пептид (Ар) образуется в результате протеолиза молекул конститутивного трансмембранного белка, называемого предшественником амилоидного пептида или рАРР (P-amyloid precursor protein). Амилоидный пептид обладает высоко выраженными фибирилогенными свойствами и его олигомеры являются токсичными для нервных клеток, вызывая дегенерацию нейронов, и нарушение, в частности, холинэргической синаптической передачи.
До недавнего времени считалось, что накопление амилоидных фибрил в ткани мозга является необратимым, однако становится все более очевидным, что амилоидный метаболизм представляет собой динамический процесс, зависящий как от разнообразных внутренних факторов (генетических, клеточных, васкулярных), так и факторов окружающей среды (например, гипоксия и стресс). Перечисленные факторы могут влиять как на формирование и накопление амилоидного пептида, так и на процессы его деградации при участии различных амилоид-деградирующих ферментов (рис. 1), а также на его выведение из мозга по периваскулярным путям. Поскольку частота проявлений болезни Альцгеймера в пожилом возрасте существенно повышается в связи с нарушением снабжения мозга кислородом при ишемии и инсультах, представляет большой интерес систематическое . исследование влияния гипоксии и ишемии мозга на процессы образования Р-амилоидного пептида, а также на активность и экспрессию в ткани мозга как амилоид-образующих, так и амилоид-деградирующих ферментов. К числу последних в настоящее время относят все большее число хорошо известных ферментов, в частности, неприлизин и эндотелин-конвертирующий фермент. Такое исследование
представляет несомненную практическую ценность, поскольку позволяет не только подойти ближе к пониманию молекулярных и биохимических основ патогенеза болезни Альцгеймера, но также открывает новые стратегические пути лечения и профилактики данного заболевания.
Цели и задачи исследования. В ходе данного многолетнего исследования планировалось систематическое изучение влияния острой и хронической гипоксии (как нормо-, так и гипобарической), а также ишемии мозга на экспрессию ряда ферментов, принимающих участие в катаболизме предшественника амилоидного пептида ßAPP, в частности а- и ß-секретаз, а также ферментов, участвующих в расщеплении Aß, в частности неприлизина (НЕП) и эндотелин-конвертирующего фермента (ЕСЕ-1). Работа проводилась как на уровне целого организма с использованием зооморфных моделей (модель пре- и постнатальной гипоксии у крыс, модель глобальной ишемии и реперфузии мозга крыс), так и на клеточных культурах с использованием клеток нейробластомы человека, а также первичных нейрональных культур мозга крыс. В ходе данного исследования также проводилось изучение свойств перечисленных выше ферментов и регуляции их экспрессии и активности различными биологически активными веществами, с целью создания новых концепций лечения и профилактики болезни Альцгеймера. К числу таких соединений относились агонисты и антагонисты холинергической и опиоидной систем и нейропептиды. В результате проведения данного инновационного исследования планировалось создание новой концепции о влиянии гипоксии и ишемии на регуляцию амилоидного метаболизма и развитие болезни Альцгеймера, а также создание новых путей профилактики и коррекции нейродегенеративных нарушений в мозге.
Научная новизна. В результате проведенных биохимических исследований показано, что гипоксия и ишемия мозга приводят к существенным изменениям уровня экспрессии предшественника амилоидного пептида и активности ферментов, участвующих в формировании амилоидного пептида и его деградации. Это, в свою очередь, может приводить к сдвигу амилоидного метаболизма в сторону накопления патологически высоких концентраций амилоидного пептида, являющегося одним из факторов патогенеза болезни Альцгеймера. Полученные данные позволяют объяснить наблюдаемый клиницистами факт повышения риска развития болезни Альцгеймера у людей, страдающих ишемией мозга, а также перенесших инсульты.
В данном исследовании . впервые описана динамика экспрессии предшественника амилоидного пептида в сенсомоторной коре, стриатуме, гиппокампе и амигдале крыс в ходе постнаталыюго онтогенеза. Выявленное нами повышенное содержание растворимых форм АРР (sAPP) в этих структурах мозга в течение первого месяца после рождения, когда формируется большинство синаптических связей между нервными клеткам и происходит интенсивное созревание нервной системы, а также снижение их содержания в процессе старения подтверждает роль sAPP в синаптогенезе, экспериментально
эч
выявленную рядом авторов в условиях in vitro. Уровень содержания sAPP также может свидетельствовать о повышении активности а- и Р-секретаз в период интенсивного формирования нервной системы.
С использованием модели нормобарической гипоксии беременных крыс и тестирования потомства в постнатальном онтогенезе впервые показано, что пренатальная гипоксия приводит к существенным изменениям уровня экспрессии предшественника амилоидного пептида и дефициту активности а-секретазы, расщепляющей этот белок по неамилоидогенному пути с образованием его нейропротекторной формы, а также способствующей формированию растворимой формы фермента АХЭ, обладающей свойствами фактора роста нервов. Это приводит к отставанию развития поведенческих реакций и дефициту обучения и памяти у животных, перенесших пренатальную гипоксию и может быть причиной развития нейродегенеративных изменений мозга на более поздних этапах развития животных. Введение ингибитора а-секретазы батимастата в кору мозга крыс в период раннего постнатального онтогенеза также приводило к нарушению формирования краткосрочной памяти в период половозрелости животных, что свидетельствует о важной роли этого фермента в период интенсивного развития нейрональных сетей мозга. У взрослых животных введение батимастата также вызывало нарушение рабочей памяти, однако это явление носило краткосрочный характер.
В данной работе впервые исследовано содержание амилоид-деградирующего фермента неприлизина в коре, гиппокампе и стриатуме крыс в течение постнатального онтогенеза, а также в коре полушарий мозга мышей с ускоренной программой старения. Показано, что с возрастом содержание этой металлолептидазы в коре драматически снижается, что коррелирует с данными о накоплении амилоидного пептида преимущественно в этой структуре мозга у людей, страдающих болезнью Альцгеймера. Напротив в стриатуме, где формирование амилоидных депозитов при болезни Альцгеймера не наблюдается, содержание неприлизина в ходе взросления повышается и сохраняется на высоком уровне в течение всей продолжительности жизни животных. В результате пренатальной гипоксии содержание неприлизина и другого амилоид-деградирующего фермента, а именно его аналога - эндотелин-конвертирущего фермента, как в коре, так и стриатуме крыс существенно снижается, что может вести к еще большему дефициту данных амилоид-деградирующих ферментов в постнатальном онтогенезе. Однако, как также было показано нами впервые, прекондиционирование к гипоксии способно предотвращать снижение экспрессии этих ферментов, что может частично объяснить нейропротекторный эффект гипоксического прекондиционирования. Существенное снижение экспрессии неприлизина с возрастом было обнаружено нами и в коре больших полушарий мозга мышей, что свидетельствует об универсальном характере возрастного снижения содержания неприлизина в коре мозга млекопитающих.
С использованием ряда культур клеток нейробластомы человека, экспрессирующих НЕП и ЕСЕ-1, а также первичных нейрональных культур клеток мозга крыс (нейронов и астроцитов) впервые показано изменение экспрессии и локализации амилоид-деградирующих ферментов в условиях гипоксии, а также обнаружено, что нейропептиды соматостатин и синтетический агонист опиоидных рецепторов |ПО-Ала2-Ме-Фен4-Гли(ол)5]-энкефалин (ДАГО) способны в разных концентрациях повышать уровень экспрессии НЕП . и ЕСЕ-1. ^Уровень экспрессия НЕП повышался в клетках нейробластомы также при их культивировании с одним из антиоксидантов экстракта ..зеленого чая, а именно эпигаллокатехин-3 галлатом (ЭГКГ). Направленное увеличение экспрессии и повышение активности этих ферментов предлагается как один из возможных эффективных подходов к профилактике и лечению болезни Альцгеймера, а используемая автором модель клеток нейробластомы является удобным инструментом для скриннинга различных биологически активных веществ, обладающих способностью к регуляции амилоидного метаболизма.
Научно-практическая значимость работы. На основании обобщения данных литературы и результатов собственных исследований выдвинута рабочая гипотеза о роли гипоксии и ишемии в патогенезе болезни Альцгеймера. Дан критический анализ современных подходов к созданию лекарственных препаратов для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, имеющих в своей основе патологический амилоидогенез в ткани мозга. Исследованы и предложены пути коррекции активности амилоид-деградирующих ферментов с целью снижения накопления токсических концентраций амилоидного пептида. Разработаны методики анализа активности а-секретазы АРР с использованием культур клеток нейробластомы человека и анализа веществ, влияющих на активность неприлизина и эндотелин-конвертирующего фермента. Материалы диссертации используются в курсе лекций для студентов и аспирантов в ряде Университетов России, Словакии и Великобритании.
Положения, выносимые на защиту.
1. Метаболизм АРР в ткани мозга является динамическим процессом, зависящим от уровня его экспрессии и протеолитического расщепления, и изменяется в ходе онтогенетического развития животных и при воздействии патологических факторов. Содержание и продукция растворимых фрагментов АРР в различных структурах мозга крыс существенно возрастает в течение первого месяца после рождения, что связано с интенсивным развитием нейрональных сетей и синаптогенезом, . и постепенно снижается к старости. Ишемия и гипоксия мозга (как пре-, так и постнатальная) сдвигают процесс деградации предшественника амилоидного пептида в сторону его амилоидогенного превращения, что
создает условия, ведущие к накоплению АР в коре и других структурах мозга.
2. В коре мозга животных экспрессия и активность металлопептидазы неприлизина, принимающей участие в деградации амилоидного пептида Ар, существенно снижается в процессе старения,' что объясняет накопление АР преимущественно в этой структуре мозга, наблюдаемое при болезни Альцгеймера. Пре- и постнатальная гипоксия и ишемия мозга приводят к существенному снижению уровня экспрессии амилоид-де1радирующих ферментов неприлизина и эндотелин-конвертирующего фермента, как в коре, так и в гиппокампе, что может вести к ускоренному накоплению Ар и формированию предрасположенности к нейродегенеративным патологиям в старости.
3. Гипоксическое прекондиционирование оказывает положительный эффект на амилоидный метаболизм, поддерживая экспрессию предшественника амилоидного пептида и активность ферментов его протеолиза после эпизодов острой гипоксии на уровне, близком к контрольному, а также восстанавливая уровень эспрессии и активность амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1. Повышение экспрессии и активности амилоид-деградирующих ферментов с использованием различных нейропептидов и антиоксидантов предлагается как один из перспективных путей профилактики накопления АР в ткани мозга и развития болезни Альцгеймера у человека.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы докладывались на большом числе научных конференций, в том числе: на форумах Федерации Европейских обществ по нейронаукам (FENS; Амстердам, 1996; Париж, 2002; Лиссабон, 2004), XXXIII международном конгрессе по физиологии (IUPS; Санкт-Петербург, 1997), на съездах Европейского нейрохимического общества (ESN; Санкт-Петербург, 1998; Варшава, 2003), на специальных рабочих совещаниях ESN по нейродегенерации (Перуджа, Италия, 2001; Авиньон, Франция, 2004), на собраниях Американского нейрохимического общества (ASN; Новый Орлеан, 1999; Чикаго, 2000; Палм Бич, 2002), на съездах Международного нейрохимического общества (ISN; Берлин, 1999; Буэнос-Айрес, 2001; Иннсбрук, 2005), на собраниях Американского общества биохимиков и молекулярных биологов (ASBMB; Вашингтон, 1998; Сан-Франсиско, 1999; Орландо, 2001; Сан-Диего, 2003), на собраниях Чешского и Словацкого нейрохимического общества (Мартин, Словакия, 1999 и 2003) на 6-, 7- и 9-ом международных конференциях по эндотелинам (Монреаль, Канада, 1999; Эдинбург, Шотландия, 2001; Парк Сити, США, 2005), на 3-ем съезде Австралийской ассоциации по изучению пептидов (Лагуна Киз, Австралия, 1998), на 2-ом Международном симпозиуме по изучению клеточных пептидаз (Магдебург, Германия, 1999), на международном митинге «Нейропептидазы 2001» (Иерусалим, Израиль, 2001), на международной конференции «Нейронауки в 3-тьем тысячелетии» (Часта, Словакия, 2002), на 4-ом международном конгрессе патофизиологов (Будапешт, Венгрия, 2002), на 28-
ом съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Стамбул, Турция, 2002), на Международных Совещаниях по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика JI.A. Орбели (Санкт-Петербург, 2002 и 2006), на съезде Российского физиологического общества (Казань, 2003) и съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на международной конференции «Молекулярные аспекты клеточной адаптации» (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, в том числе 26 статей в рецензируемых отечественных и международных научных изданиях и 36 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 11 разделов главы результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 306 источников. Работа проиллюстрирована 35 рисунками и 1 таблицей.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Методы исследования
В данной работе использовался широкий спектр физиологических и биохимических методов, включавший:
- модель пренатальной нормобарической гипоксии;
- модели острой нормобарической и гипобарической гипоксии взрослых крыс;
- модель нормобарической гипоксии клеточных культур;
- модель глобальной ишемии мозга крыс (без и с реперфузией);
- выделение фракций растворимых и мембраносвязанных белков из больших полушарий или из сенсомоторной коры и других структур переднего мозга крыс и мышей методом дифференциального центрифугирования;
- электрофорез в ПААГ;
- иммуноблотинг с использованием поли- и моноклональных антител с последующей детекцией белков (АРР, неприлизина, эндотелин-конвертирующего фермента, транспортера глюкозы GLUTI, актина) с помощью метода хемолюминесценции, денситометрии и компьютерного
1 анализа их содержания;
- анализ уровня экспрессии белков (неприлизин и эндотелин-конвертирующий фермент) при помощи метода rt-PCR и q-PCR и набора специфических праймеров;
: - получение первичных нейрональных культур из мозга новорожденных крыс;
- культивирование клеток нейробластомы человека (SH-SY5Y, SK-N-SH и NB7) в стандартных условиях и с использованием различных химических агейтов для анализа регуляции уровня экспрессии АРР и амилоид-
деградирующих ферментов (неприлизина и эндотелин-конвертирующего фермента);
- анализ выживаемости клеток в культуре с помощью дифференциального окрашивания трипановым голубым;
- флюориметрический метод анализа активности неприлизина;
- определение общей активности холинестераз, а также АХЭ и БуХЭ методом Эллмана;
- метод иммуноцитохимии культивируемых клеток;
- методы световой и конфокальной микроскопии;
- определение содержания белков методами Лоури и ВСА;
- стандартный пакет статистических методов анализа экспериментальных данных (ANOVA и Excel).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Предшественник амилоидного пептида (АРР) представляет собой конститутивный трансмембранный белок, состоящий из 695-751 аминокислот, который экспрессируется в различных клетках и тканях животных разного уровня эволюционного развития (Johnstone et al, 1991; Maldonado et al, 2002; a также см. обзор: Selkoe, 1998). Большая часть молекулы АРР (N-концевой его фрагмент) находится во внеклеточном пространстве или повернут внутрь везикулярных клеточных органелл, в то время как короткая (С-концевая часть) молекулы находится в цитоплазме клеток (рис. 1).
Мембрана клетки
Сигнальный Внеклеточный Внутриклеточный
пептид домен а.-секретаза домен
N11,
IU1U4 "М 'ЯШ11 1 •«.' 1» л1 V1 LT UW44IJ
t-ar г^т'''^-"-^ -^^1
соон
кь.
ß-секретаза ..••*■"**
........... Aß пептиды
Н ...............И И Е Е Н,Е,И
< '•'.*ч у-секретаза
'••^PJ |Aß«
daJfrhdsg'
1
¡-YEVHHQiiwFAEDVGSNKGA f t f '
H HM
II
плазмин
HM 4M-
Д1 ™
GLMVGGVVIATV]
II И а-секретаза
И М
t
м
Рис.1. Схема строения молекулы АРР и расположения участков его протеолитического расщепления a-, ß- и у-секретазами. Участки расщепления Aß пептида известными амилоид-деградирующими ферментами указаны стрелками. Н - неприлизин, Е -эндотелин-конвертирующий фермент, И - инсулин-деградирующий фермент, М -матричная металлопептидаза ММР-9.
Согласно имеющимся литературным данным в ткани мозга АРР обладает нейротрофическими и нейропротекторными свойствами, модулирует рост нервных окончаний и синаптогенез, участвует в обеспечении возбудимости нервных клеток и синаптической пластичности, а также в процессах обучения и памяти (Kumar et al, 2000; а также см. обзор: Mattson, 1999). Несмотря на многочисленные исследования, поддерживающие амилоидную гипотезу патогенеза болезни Альцгеймера и рассматривающие только его нейротоксические свойства, существуют доказательства того, что Aß в нормальных физиологических концентрациях играет, важную роль в функционировании нервных клеток и их структурно-функциональной пластичности, обуславливающих обучение и память (Koudinov & Berezov, 2004; Kuperstein et al., 2004). В нормально функционирующем мозге Aß выводится из внеклеточной среды по периваскулярным путям, а также подвергается протеолитическому расщеплению под действием ряда металлопептидаз, что препятствует его накоплению в токсической для нервных клеток концентрации. Однако при болезни Альцгеймера и ряде других заболеваний имеет место патологическое изменение как процессов деградации АРР, так и образующегося из него Aß. Изучение динамики изменений метаболизма АРР и амилоид-деградирующих ферментов в мозге крыс и клетках нейробластомы человека при ишемии и гипоксии, а также регуляции этих процессов рядом фармакологических агентов являлось основной задачей данного исследования.
Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его растворимых фрагментов в норме и после пренатальной гипоксии
Для анализа возрастных изменений экспрессии мембраносвязанного АРР и эндогенной продукции его растворимых фрагментов (sAPP) использовали экстрагируемые слабым солевым раствором и Тритоном-ХЮО фракции коры, стриатума, гиппокампа и амигдалы мозга крыс разного возраста. Динамика изменений изучалась как в структурах мозга контрольных животных, так и у потомства крыс, подвергнутого пренатальной гипоксии на 13-ый день эмбриогенеза. Результаты содержания АРР в сенсомоторной коре представлены на рис. 2. Как видно из рис. 2А, в нормальных условиях уровень содержания мембраносвязанного АРР увеличивается с 1 по 5-й день развития и затем практически не изменяется до 30 дня'; однако снижается на более поздних сроках онтогенеза (к 180 дню), оставаясь приблизительно на таком же уровне до 600 дня жизни. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, уровень экспрессии АРР в сенсомоторной коре существенно отличается от контрольных величин. Так уже в первый день после рождения его содержание было на 40% выше, чем у контрольных животных, и повышенное содержание мембраносвязанного АРР наблюдалось в этой структуре мозга практически на всех исследованных этапах постнатального онтогенеза, включая 180 и 600 дни.
Рис.2. Динамика содержания мембраносвязанного АРР (А) и растворимого sAPP (Б), выявляемых с помощью моноклональных антител
22С11, в мембранной и растворимой фракциях
сенсомоторной коры крыс разного возраста в норме (К) и после пренатальной гипоксии на Е13 (Г). * - р < 0.05.
Возраст (дни)
В стриатуме контрольных животных наблюдается отличная от данных, полученных для коры мозга, картина возрастных изменений содержания мембраносвязанного АРР (рис. ЗА). К моменту рождения содержание АРР в стриатуме довольно высоко (на 40% выше, чем в коре), однако оно падает к 10 дню, а затем снова повышается к концу первого месяца и снижается к 600 дню. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, наблюдалось значительное снижение уровня содержания АРР в стриатуме к моменту рождения, в то время как в остальные изученные периоды наблюдаемое снижение не превышало 10% по сравнению с контролем.
Динамика изменения содержания растворимых форм АРР в разных структурах мозга крыс, которая определяется уровнем активности а- и ß-секретаз, имеет специфический для каждой структуры характер и существенным образом отличается от динамики экспрессии в них мембраносвязанного АРР. В нормальных условиях наибольшее содержание sAPP в коре, стриатуме и гиппокампе наблюдалось на 30 день после рождения, а в амигдале к концу 3-ей недели (рис. 2Б, ЗБ, 4). Как правило, уровень содержания растворимого АРР с возрастом снижается во всех структурах, причем в стриатуме и амигдале это снижение имеет особенно выраженный характер. У крыс, перенесших пренатальную гипоксию, также наблюдалось снижение продукции растворимого АРР. Наиболее существенные различия между гипоксическими животными и животными контрольной группы наблюдались в коре в период с 10 по 30 день развития, а в стриатуме в первый день после рождения и между
>а
«о « Я
и
3
120 100 80 60 ■ 40 20 ■ 0
1 5
10 19 30 1 80 600
10 19 30
Возраст (дни)
180 600
Рис. 3. Динамика содержания мембраносвязанного АРР (А) и растворимого вАРР (Б), выявляемых с помощью моноклональных антител 22С11, в мембранной и растворимой фракциях
стриатума крыс разного возраста в норме (К) и после пренатальной гипоксии (Г) на Е13. * - р < 0.05.
10 и 19 днями. Как в гиппокампе, так и в амигдале продукция растворимых форм АРР после пренатальной гипоксии изменялась в меньшей степени (рис. 4), а на 10 день в них наблюдалось даже незначительное повышение бАРР.
120 ■ | - | 100 ■
1180 | 2 60 I § 40
I I 20
£> о
ПО
■о.
3 юо 1 80
1 60 я
£ 40 20 О
* г>
гиппокамп
к г
---I I-1->--
5 10 19 30 180 600
амигдала
5 10 1» 30
Возраст (дни)
Рис.4. Динамика содержания растворимой формы бАРР, выявляемой с помощью моноклональных антител 22С11, в растворимой фракции гиппокампа и амигдалы крыс разного возраста в норме (К) и после пренатальной гипоксии (Г) наЕ13. * -р<0.05.
9В
Динамика содержания мембраносвязанного АРР и продукции его растворимых форм в ходе развития мозга описана нами впервые. Полученные данные свидетельствуют о том, что паттерн экспрессии АРР в различных структурах мозга является весьма специфичным и, по-видимому, отражает характер становления в этих структурах нейрональных сетей. В настоящее время еще нет однозначного мнения по поводу функций АРР в нервных клетках и в развитии мозга, хотя имеются данные о том, что уровень экспрессии этого конститутивного трансмембранного белка повышается в ответ на травматические повреждения мозга (Lambri et al., 2001), а также в ответ на неонатальную гипоксию (Baiden-Amissah et al., 1998). Полученные нами данные также свидетельствуют о том, что пренатальная гипоксия приводит к повышению экспрессии АРР в коре, наблюдаемому на всех этапах постнатального эмбриогенеза.
Описанное нами повышение уровня продукции растворимых форм АРР в течение первого месяца после рождения, когда формируется большинство синаптических связей между нервными клеткам и происходит интенсивное взросление нервной системы (Оленев, 1978), а также снижение их содержания в процессе старения, подтверждает роль sAPP в синаптогенезе, экспериментально показанную рядом авторов в условиях in vitro (см. обзор: Mattson, 1999). Уровень содержания sAPP также может свидетельствовать о повышении активности а- и Р-секретаз в период интенсивного формирования нервной системы. Поскольку в результате пренатальной гипоксии происходит снижение формирования sAPP в коре, стриатуме и гиппокампе, это позволяет объяснить обнаруженное нами в поведенческих экспериментах замедление формирования моторных реакций у новорожденных крысят, перенесших пренатальную гипоксию (Дубровкая и др., 2002). На более поздних этапах развития повышенная экспрессия АРР в коре, а также снижение активности а-секретазы может вести к дефициту неамилоидогенного пути метаболизма АРР и формированию более высоких концентраций токсичного амилоидного пептида.
Возрастная динамика изменений экспрессии амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 в норме и после пренатальной гипоксии
Поскольку НЕП и ЕСЕ-1 являются мембраносвязанными ферментами, в данной части исследования использовались растворимые в детергенте фракции коры и стриатума мозга крыс. Как было показано в ходе проведенных исследований, динамика экспрессии НЕП в коре и стриатуме имеет существенные отличия. Так в сенсомоторной коре наиболее высокий уровень содержания НЕП на уровне белка наблюдался в первые две недели после рождения, снижаясь к 20 дню более, чем на 60%, а к концу первого месяца почти в 5 раз (рис. 5, 1). У более старых крыс (10 месяцев) уровень экспрессии НЕП в коре не превышал 10% от наблюдаемого на 10-ый день развития. Напротив, в стриатуме уровень экспрессии НЕП постепенно повышался с 5 по 30 день после рождения и оставался на довольно высоком уровне вплоть до 300 дня (рис. 5,2).
Данный феномен,- по-видимому, имеет универсальный характер, поскольку наблюдается, не только у крыс, но и у мышей. Последнее было выявлено нами при анализе уровня экспрессии НЕП: в коре мышей линии НЕ112 с ускоренной программой старения (рис. 6). Как видно из этого рисунка, у таких мышей в возрасте 8 месяцев НЕП на уровне белка в коре полушарий практически не детектируется. Поскольку при болезни Альцгеймера формирование амилоидных депозитов в стриатуме не обнаруживается, а имеет' место в основном в коре и гиппокампе, допустимо предположить, что этому может способствовать дефицит активности НЕП, наблюдаемый в нашем исследовании у старых животных. -
1 - Кортекс
2 - Стриатум
11 20 30 300 НЕП дней
г *
5 11 20 30 300 НЕП дней
Б
|
■ 8 5
100
■ Р7!
- ■С -Я
\ \ г 1 <«'' 1 1
? ••• [ 1
г
5 11 20 30 300 дней
11 20 30 300 дней
Рис.5. Динамика экспрессии неприлизина, выявляемого с помощью поликлональных антител, в мембраносвязанной фракции коры (1) и стриатума (2) крыс разного возраста. А - данные иммуноблотинга. НЕП - позитивный контроль (НЕП из почек крыс); Б - данные денситометрии.,,, ...
Анализ влияния пренатальной гипоксии на уровень экспрессии НЕП в коре и стриатуме мозга крыс проводился с использованием мозга животных того возраста, для которого характерен наибольший уровень экспрессии данного фермента. Полученные данные показали, что как в коре на 11 день, так и в стриатуме на 30, день после рождения животных, перенесших пренатальную гипоксию, уровень содержания НЕПч снижался по сравнению с контролем в среднем на 30% } (рис. 7, столбики 1 и 2). Интересно отметить, что гипоксическое; прекондиционирование беременных, крыс (15% Ог, 2 часа) в
S9
У"и-»-«- 3
Jj • , - " - - •'t.t- Ct J
12 3 5
% от контроля 160 n (1 месЯЧ>
140 -
120 -
¡5 100 -
g. 80-
8 месяцев
¡S
60 -40 -20 0
1
H
Рис.6; Динамика экспрессии неприлизина, выявляемого с помощью моноклональных антител СБ 10, в мембраносвязанной фракции коры мышей линии НЕЯ2 с ускоренной программой старения. А -данные иммуноблотинга. НЕП -позитивный контроль (НЕП из почек крыс); Б - данные денситометрии.
Е*1
8 месяцев
течение трех дней перед эпизодом острой гипоксии предотвращало снижение экспрессии НЕП как в коре, так и стриатуме, наблюдаемое, соответственно, на 11-ый и 30-дни после рождения (рис. 7, столбики 1-3).
1 2 3 % от контроля
130
100
Рис.7. Уровень содержания неприлизина, выявляемого с помощью поликлональных
антител, в мембраносвязанной фракции сенсомоторного кортекса крыс на 11-ый (А) и стриатума на 30-ый (Б) день постнатального развития в норме (1), после пренатальной гипоксии на Е13 (2), а также после пренатальной гипоксии и прекондиционирования к мягкой гипоксии на ЕЮ, 11 и 12 (3). Представлены усредненные данные денситометрического анализа иммуноблотинга (п=3). * -р < 0.05 по сравнению с контролем, + - р < 0.05 по сравнению с гипоксией.
1 2 3
1 2 3
Анализ влияния пренатальной гипоксии на гомолог НЕП, ЕСЕ-1, также показал, что экспрессия этого амилоид-деградирующего фермента в коре и стриатуме животных, подвергавшихся гипоксии, существенно снижена. Так в коре у гипоксических животных экспрессия ЕСЕ-1 на 5-ый день после рождения была ниже почти в три раза по сравнению с контролем. В стриатуме таких животных также наблюдалось снижение экспрессии ЕСЕ-1 на 30 и 37% от контрольных величин, соответственно на день 5 и 11 после рождения (рис. 8). Как и в случае НЕП, уровень экспрессии ЕСЕ-1 у животных, проходивших гипоксическое прекондиционирование до эпизода острой гипоксии, практически не изменялся по сравнению с контрольными животными.
12 3
5 день
1 2 3 12 3
5 день 11 день
Условные единицы
120
12 3
11 день
Кора
Стриатум
Рис.8. Уровень экспрессии эндотелин-конвертирующего фермента (ЕСЕ-1), выявляемого с помощью моноклональных антител АЕС32-236 в мембраносвязанной фракции коры на 5-ый и в стриатума мозга крыс на 5-ый и 11-ый дни после рождения. А - данные иммуноблотинга. Б - денситометрический анализ изменения содержания ЕСЕ-1. Содержание ЕСЕ-1 в контроле принято за 100%. 1 - контроль (5-ый день после рождения), 2 - пренатальная гипоксия, 3 - острая гипоксия на Е13 с прекондиционированием на ЕЮ, 11 и 12; 4 - контроль (11-ый день после рождения); 5 - гипоксия; 6 - гипоксия с прекондиционированием. * - статистически достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0.05), + - статистически достоверные различия (р < 0.05) гипоксии по сравнению с прекондиционированием.
Полученные данные позволяют предположить, что пренатальная гипоксия, приводя к снижению экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 в постнатальном онтогенезе может приводить к постоянному дефициту амилоид-деградирующей активности и сдвигу метаболизма амилоидного пептида в сторону его накопления.
Влияние острой нормобарической гипоксии на экспрессию АРР и активность ферментов, участвующих в его метаболизме
Результаты исследования эффекта пренатальной гипоксии на содержание APP в коре крыс, позволили сформулировать задачу по изучению влияния острой гипоксии на уровень экспрессии мембраносвязанного APP и продукцию его растворимых фрагментов в коре взрослых животных, подвергнутых действию острой нормобарической гипоксии. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 9. Как видно из рисунка, острая гипоксия приводит к повышению содержания АРР в сенсомоторной коре крыс, наблюдаемому через 35 минут и 24 часа после воздействия (рис. 9, АРР, 2, 4). Увеличение экспрессии мембраносвязанного АРР составляло 74 и 59% соответственно через 35 минут и 24 часа после гипоксии. В то же время продукция растворимых форм sAPP после гипоксии в этой структуре мозга, выявляемых с помощью антител 22С11 к внеклеточной части молекулы, существенно (более, чем на 50%) снижается (рис. 9, sAPP, 2, 4). Прекондиционирование к гипоксии приводило к частичной нормализации уровня как мембраносвязанного, так и растворимого АРР, особенно ярко наблюдаемое через 35 минут после острой гипоксии (столбики 3 и 5).
Рис.9. Уровень содержания АРР, в мембраносвязанной и растворимой фракциях сенсомоторной коры мозга крыс после острой нормобарической гипоксии и прекондиционирования к мягкой гипоксии. А - данные иммуноблотинга. Б -
денситом етрический анализ
изменения содержания АРР и sAPP, выявляемых с помощью антител 22С11. Содержание АРР в контроле принято за 100%. 1 - контроль, 2 -35 минут после острой гипоксия, 3 -35 минут после острой гипоксии с прекондиционированием, 4-24 часа после острой гипоксии, 5 — 24 часа после острой гипоксии с прекондиционированием. * - р < 0.05 по сравнению с контролем, + - р <0.05 по сравнению с прекондиционированием.
sAPPa
АРР
Анализ растворимой фракции коры с помощью моноклональных антител в26 к эАРРр показал, что в результате гипоксии не происходит изменения его содержания через 35 минут после гипоксии, однако наблюдается существенное (на 80%) увеличение продукции этой формы АРР через 24 часа после экспозиции (рис. 10). Так как при этом уровень общего растворимого бАРР снижается, полученные данные свидетельствуют о резком снижении секреции неамилоидогенного бАРРсх через 24 часа после гипоксии.
"7Л? Л
sAPPß
1 2 3
%от контроля
250 t
Рис.10. Уровень содержания sAPPß, выявляемого с помощью антител G26, в растворимой фракции коры мозга крыс после нормобарической гипоксии.
А - данные иммуноблотинга. 1 -контроль; 2-35 минут; 3-24 часа после гипоксии.
Б - денситометрический анализ изменения содержания АРР. Содержание АРР в контроле принято за 100%.
* - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем.
2 3
В целом, полученные данные свидетельствуют о сдвиге метаболизма АРР после гипоксии в сторону его амилоидогенного процессинга. Полученные данные являются первым свидетельством влияния гипоксии на амилоидный метаболизм в коре взрослых животных, однако они согласуются с результатами исследований о влиянии гипоксии на процессинг АРР в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y (Webster et al., 2002; 2004).
Влияние острой гипобарической гипоксии на активность Н£П в коре и гиппокампе крыс
Как было показано в данной части работы, активность амилоид-деградирующего фермента НЕП в коре и гиппокампе, выявляемая с помощью энзиматического флуориметрического метода с использованием синтетического флуоригенного субстрата, сукцинат-аланин-аланин-фенилаланин-амидо-4-метилкумарин(АМС), снижается почти в 3 раза через 3 часа после острой гипобарической гипоксии и остается на таком уровне через 24 часа после воздействия (рис. 11). В гиппокампе также наблюдается
снижение активности НЕП, однако оно имеет иную динамику. Так, через 3 часа наблюдается небольшое снижение активности НЕП (порядка 10%) по сравнению с контролем, которое становится более выраженным (30%) через 24 часа после воздействия. Таким образом, острая гипобарическая гипоксия более существенным образом влияет на активность НЕП коры, вызывая ее более глубокое и пролонгированное снижение, по сравнению с гиппокампом. Полученные данные впервые свидетельствуют о воздействии острой гипобарической гипоксии на НЕП коры и гиппокампа. Хотя в литературе нет данных о влиянии гипоксии на НЕП в мозгу крыс кроме данных, полученных в наших исследованиях, однако активность НЕП изучалась в каротидных телах гипоксических животных. В этих исследованиях была показана важная роль НЕП в реакции каротидных тел на гипоксию, которую он выполняет посредством инактивации субстанции Р - основного нейротрансмиттера в этой ткани (Кишат е1 а1., 2000). У животных, лишенных гена НЕП наблюдался измененный респираторный ответ как при дыхании нормальным воздухом, так и в условиях гипоксии (вгазетапп е1 а!., 1999).
**
минуты
Рис. 11. Активность неприлизина, определяемая с помощью энзиматического флуоресцентного метода, в коре и гиппокампе крыс после гипобарической гипоксии. * - статистически достоверные различия (р < 0.05); ** - р<0.01по сравнению с контролем. Данные представлены в единицах флуоресценции. Содержание белка в каждой пробе было одинаковым.
— контроль
- 3 часа
— 24 часа
1—I—I—I—I—I-1-1—I—I I I-Г—I-1—I—I
1 3 3 7 9 11 13 15 17 19 минуты
Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию ферментов, участвующих в метаболизме амилоидного пептида
В результате проведенного нами исследования было обнаружено, что 15-минутная глобальная ишемия мозга приводит к повышению уровня мембраносвязанного АРР в коре и гиппокампе (в среднем на 80% и 25%,
соответственно), выявляемому с помощью моноклональных антител 22С11 к N-концевому участку молекулы (рис. 12, А, Б). После двухчасовой реперфузии, следующей за эпизодом ишемии, уровень содержания АРР в коре восстанавливался почти до контрольных величин, но существенно снижался (на 50% по сравнению с контролем) в гиппокампе. О реакции нейронов коры и гиппокампа на гипоксию судили по уровню экспрессии в них транспортера глюкозы GLUTI, который, как было показано нами, является хорошим маркером реакции клеток на гипоксию. Как видно из рис. 12 (В), в коре ишемия ведет к существенному повышению уровня GLUTI, которое не снижается после реперфузии.
Кора
Гиппокамп
-i АРР
1 2 3 4 5 6 7
Б Правое полушарие Левое полушарие & °,Ъ от контроля ^ 250 ■ й
8 200 • X
1 2 3
% от контроля ,150 Т
1 2 3
Н от контроля * *
Рис.12. Уровень содержания АРР, выявляемого с помощью моноклональных антител 22С11 в мембраносвязанной фракции сенсомоторного кортекса правого и левого полушарий мозга крыс и гиппокампа обоих полушарий, после ишемии и реперфузии. А - данные иммуноблотинга. 1, 4 - контроль; 2, 5 - ишемия; 3, 6 - реперфузия. Б -денситометрический анализ изменения содержания АРР в коре и гиппокампе. В - уровень экспрессии транспортера глюкозы GLUTI - маркера гипоксии. Содержание АРР в контроле принято за 100%. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем, + - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с ишемией.
Анализ уровня содержания растворимых форм АРР. (включая sAPPa и sAPPß), обнаруживаемых с помощью моноклональных антител 22С11 в растворимой фракции коры и гиппокампа, также показал существенное повышение их продукции после ишемии (в среднем, на 150%) и снижение до контрольного уровня после реперфузии (рис. 13, А, Б). При анализе содержания sAPPß в растворимой фракции обеих структур с помощью специфических антител G26
Аог
мы обнаружили, что увеличение содержания именно этой формы АРР является преимущественным после ишемии, составляя 234±52% от контрольной величины в гиппокампе (рис. 14, А, Б). В результате 2-часовой реперфузии содержание эАРРр в гиппокампе также снижалось, но оставалось достоверно выше контрольных величин на 32+12%. В коре уровень вАРРр повышался после ишемии в меньшей степени, однако продолжал повышаться до 160% от контроля после реперфузии. Принимая во внимание уровень количественных изменений общего содержания растворимых форм АРР в гиппокампе (в среднем на 152%) и одной эАРРР (в среднем на 234%) после ишемии по сравнению с контрольными величинами, можно сделать вывод о том, что ишемия приводит, в основном, только к повышению вАРРр, а продукция эАРРа, соответственно, должна быть существенно снижена. В случае реперфузии относительное содержание вАРРа в растворимой фракции и коры, и гиппокампа также должно быть ниже, чем в контроле, поскольку содержание в ней вАРРр остается достоверно выше (на 32% в гиппокампе и на 62% в коре) (рис. 14, А), а общее их содержание в сумме такое же, как в норме (рис. 13, Б, 3).
Кора
Гиппокамп
У
-".хш 1 6АРР
3 4 5 6 7
Правое Левое
£ полушарие
^ у « >4.,
теа 12 3
%
200 ч
Рис.13. Уровень содержания растворимых форм АРР, выявляемых с помощью моноклональных антител 22С11 в растворимой фракции сенсомоторного кортекса правого и левого полушарий и в гиппокампе обоих полушарий мозга крыс после ишемии и реперфузии. А - данные иммуноблотинга. 1 - контроль, 2 - ишемия, 3 - реперфузия. Равномерность загрузки образцов для электрофореза проверялась по содержанию в них актина. Б - денситометрический анализ изменения содержания АРР в гиппокампе. Содержание АРР в контроле принято за 100%. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем, + - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с ишемией.
Кора
Гиппокамп
12 3
12 3
Рис.14. Уровень содержания бАРР, выявляемого с . помощью антител в2б в растворимой (А) и ВАСЕ1, выявляемого с помощью моноклональных антител 9В21, в мембранной (Б) фракциях коры и гиппокампа мозга крыс после ишемии и реперфузии. Содержание эАРРр и ВАСЕ1 в контроле принято за 100%. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем, + - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с ишемией.
1 2
12 3
□ Контроль В Ишемия Н Репер фузия
При анализе уровня экспрессии Р-секретазы (ВАСЕ-1) в мембранной фракции коры и гиппокампа мы обнаружили существенное повышение уровня содержания этого фермента в коре (более чем на 50%) и лишь незначительное увеличение его содержания в гиппокампе (110±2% и 114±1% по сравнению с контролем после ишемии и реперфузии, соответственно) (рис. 14). Это свидетельствует о том, что наблюдаемое нами значительное увеличение продукции эАРРр в гиппокампе при данных экспериментальных условиях должно происходить в результате повышения Р-секретазной. активности, а не синтеза новых молекул этого фермента, что также имеет место и в коре после реперфузии. Тем не менее, наблюдаемое повышение содержания эАРРр в коре непосредственно после ишемии коррелирует с повышением уровня экспрессии в ней р-секретазы. Таким образом видно, что кора и гиппокамп по-разному изменяют активность ферментов амилоидного метаболизма после ишемии и реперфузии.
Как уже отмечалось в предыдущих главах, увеличение продукции и накопление токсических концентраций АР в ткани мозга является общепризнанным фактором патогенеза болезни Альцгеймера. В связи с этим, анализ изменения уровня экспрессии предшественника амилоидного пептида и его катаболизма при гипоксии и ишемии является важным для выяснения молекулярных механизмов, обуславливающих увеличение риска развития когнитивных расстройств и болезни Альцгеймера, наблюдаемое у больных с
ЮЗ
цереброваскулярными нарушениями. В проведенном нами исследовании убедительно показано, что 15-минутная глобальная ишемия мозга приводит к повышению уровня содержания АРР и его растворимых продуктов в коре и гиппокампе крыс. Полученные нами данные о повышении экспрессии АРР после гипоксии и ишемии как в коре, так и гиппокампе согласуются с результатами, полученными на других моделях и типах клеток (Wang et al., 2002). Несмотря на то, что повышение экспрессии АРР рассматривается как адаптивная реакция (Baiden-Amissah, 1998; Jin et al., 2001), увеличение содержания этого белка может вести к продукции АР в количествах, токсических для нервных клеток. В данном исследовании дифференциальный анализ соотношения изменений общего содержания растворимых форм sAPP и sAPPp свидетельствует только об увеличении продукции sAPPp, и предполагает, что продукция sAPPa как при ишемии, так и реперфузии должна быть существенно снижена. Снижение активности а-секретазы, предотвращающей образование АР, и повышение активности Р-секретазы, ведущей к его образованию, что наблюдалось нами в коре и частично в гиппокампе, является, несомненно, одним из факторов повышения риска развития болезни Альцгеймера. Повышение активности Р-секретазы может являться результатом структурных перестроек мембран клеток этих формаций мозга, которые необходимы для колокализации p-секретазы и его субстрата (АРР) и проявления его активности (Cordy et al., 2003). Одним из факторов, ведущим к повышению активности p-секретазы, может быть изменение липидного состава мембран нервных клеток, которое наблюдалось нами при гипоксии (Аврова и др., 1993; Наливаева и др., 1994).
Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию амилоид-деградирующих ферментов в коре
Помимо изменения уровня содержания АРР и активности а- и p-секретаз в коре, ишемия и реперфузия также приводили к существенному изменению в них уровня содержания амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 (рис. 15). Как видно из этого рисунка уровень ЕСЕ-1 при ишемии изменяется довольно существенно - более, чем в 3 раза (данные денситометрии не приведены), в то время как НЕП снижается на 25-45% в правом и левом полушарии, соответственно. Как видно из приведенных данных, уровень обоих ферментов частично восстанавливался после реперфузии. Полученные в данном исследовании результаты также свидетельствуют о снижении содержания ЕСЕ-1 в гиппокампе ишемических животных, однако отсутствие селективных антител к неприлизину крыс и чрезвычайно низкий уровень его экспрессии в этой структуре мозга заставляет нас искать новые экспериментальные подходы к анализу содержания этого фермента в гиппокампе при ишемии и реперфузии.
А
1 2 3 4 3 6
150 -,% от контроля
Правое Левое
полушарие
ЕСЕ-1
НЕП
Актин
Рис.15. Уровень экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 в мембраносвязанной фракции коры правого и левого полушарий мозга крыс, выявляемых с помощью поликлональных (НЕП) и моноклональных антител АЕС32-236 (ЕСЕ-1), после ишемии и реперфузии. А - данные иммуноблотинга. 1,4- контроль; 2, 5 - ишемия; 3,6- реперфузия. Равномерность загрузки образцов для электрофореза проверялась по содержанию в них актина. Б -денситометрический анализ изменения содержания НЕП. Содержание НЕП в контроле принято за 100%. * -
статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем.
Анализ изменения уровня экспрессии АРР и ферментов амилоидного метаболизма при ишемии индивидуально в коре правого и левого полушарий мозга крыс свидетельствует, что реакция нейронов в каждом из полушарий несколько различна. Это согласуется с полученными в наших исследованиях многочисленными данными о разной чувствительности нейронов правого и левого полушария на гипоксию и другие стимулы, что может являться молекулярной основой формирования правшества и левшества (Наливаева и др., 1993). Пренатальная гипоксия, как было показано в наших исследованиях, также является одним из факторов, приводящим к формированию левшества и амбидекстрии в постнатальном онтогенезе (Наливаева и др., 1996, 1998). Левшество и амбидекстрия у людей, как было показано (ЯаШа е1 а1, 1998), могут обуславливать риск развития болезни Альцгеймера, хотя для подтверждения данной гипотезы требуются более широкие клинические и социологические исследования.
Влияние специфического ингибитора а-секретазы на формирование памяти у крыс
В результате экспериментов, проведенных в данной части диссертационной работы, обнаружено, что внутрикортикальное введение ингибитора а-секретазы батимастата взрослым животным в концентрации 10"4 М приводило к нарушению памяти, что проявлялось в изменении числа правильных побежек в одноуровневом лабиринте. Через 60 мин после введения процент правильных посещений уменьшался (р<0,01) до 92,78+1,03 % по сравнению с фоновыми значениями, ежедневно регистрируемыми перед введениями и составляющими 98,11±1,63 % (рис. 16, А). При использовании 10"5 М батимастата наблюдалась такая же тенденция, но результаты были статистически недостоверны. На следующие сутки, как правило, происходило восстановление исходного уровня правильных побежек. В контрольной * серии экспериментов с введением физраствора каких-либо изменений в поведении животных не наблюдалось. После шестимесячного перерыва все крысы, которым делали инъекции батимастата, были вновь протестированы. В ходе повторного тестирования у этих животных существенных изменений количества правильных побежек в 8-лучевом лабиринте по сравнению с первоначальным уровнем (до операции) не обнаружено. '
Крысы, перенесшие билатеральные инъекции 10"4 М батимастата в кору больших полушарий на 5-й и 7-й дни постнатального онтогенеза, во взрослом возрасте хуже (р<0,001) обучались и делали больше ошибок в простом одноуровневом лабиринте, чем их сверстники, перенесшие введение физраствора, что выражалось, соответственно, в 90,92+2,21 % и 97,17±0,68 %
Рис.16. Влияние ингибитора а-секретазы на память у крыс. А -результаты тестирования крыс в одноуровневом восьмилучевом
лабиринте до и после i.e. введения физиологического раствора (I), 10"5 М (II) или 10"4 М (III) батимастата. 1 -до введения (фон), 2 - через 30 мин , 3 - через 60 мин после введения. По оси ординат указан процент правильных побежек в лабиринте. * - достоверное отличие от фона при р<0,01. Б -результаты тестирования крыс в одноуровневом восьмилучевом
лабиринте через 6 месяцев после двукратного (на Р5 и Р7) i.e. введения физраствора (1) или батимастата (2). По оси ординат указан процент правильных побежек в лабиринте. ,|"1'* достоверные различия между группами при р<0,001.
Таким образом, обнаружено, что инъекции ингибитора а-секретазы батимастата в сенсомоторную кору мозга крыс приводят к обратимому кратковременному нарушению памяти. В отличие от взрослых животных, последствия введения батимастата в мозг новорожденных имеют пролонгированный характер. Участие АРР в процессах обучения и памяти ранее изучалось только с использованием кортикальных инъекций sAPP (Bour et al, 2004) или его фрагментов (Roch et al, 1994), обладающих синаптогенной активностью, что приводило как к увеличению числа пресинаптических терминалий, так и к улучшению запоминания экспериментальной задачи на поведенческом уровне. В нашей работе впервые предпринята попытка оценить степень участия в процессах формирования памяти самой а-секретазы, благодаря действию которой образуется нейротрофический фрагмент sAPPa, а также растворимая форма АХЭ (Nalivaeva & Turner, 1999). Для этого мы использовали специфический ингибитор а-секретазы батимастат. Полученные нами данные о снижении правильного числа побежек в лабиринте уже через 60 минут после инъекций ингибитора свидетельствуют о том, что формирование sAPPa под действием a-секретазы необходимо для формирования памяти и его ингибирование нарушает нормальное протекание этого процесса. Восстановление же способности правильного выполнения поставленной задачи через сутки и более после инъекции взрослым крысам свидетельствует о том, что действие данного ингибитора является обратимым, и это согласуется с имеющимися данными о характере действия батимастата (Parvathy et al., 1999). В то же время, долговременное действие батимастата при введении его в кору новорожденных животных свидетельствует о том, что дефицит а-секретазы в этот период развития мозга может являться критическим для формирования необходимых нейрональных связей, которые в дальнейшие периоды жизни животных вовлекаются в процессы формирования памяти. Эти данные согласуются с результатами наших исследований о действии пренатальной гипоксии как на активность а-секретазы и содержание растворимой формы АХЭ, так и на способность к обучению у этих животных, которые были снижены в течение всего постнатального онтогенеза (Журавин и др., 2003; Журавин и др., 2004, Лавренова и др., 2003).
Анализ участия а-секретазы предшественника амилоидного пептида в секреции растворимой формы ацетилхолинэстеразы
Процесс протеолитического расщепления мембраносвязанных белков с высвобождением биологически активных растворимых молекул во внеклеточную среду является важным физиологическим феноменом. К числу таких соединений относятся цитокины, ростовые факторы и их рецепторы, молекулы клеточной адгезии и эктоэнзимы (см. обзор Huovila et al, 2005). Протеолитические ферменты, принимающие участие в этом процессе, называют секретазами или шеддазами (от английского термина "shedding"). Одним из мембраносвязанных белков, для которых показано существование секретируемой биологически активной формы, является АХЭ (Appleyard, 1992).
Растворимая форма АХЭ в ткани мозга обладает отличными от холинергической трансмиссии функциями, проявляя нейротропные и нейритогенные свойства. В комплексе с Ар растворимая форма АХЭ обнаружена в составе амилоидных депозитов при болезни Альцгеймера (ГпеБ^ова е1 а1,2004). В нашем исследовании с использованием культуры клеток нейробластомы человека 8Н-8У5У мы показали, что а-секретаза АРР является одним из ферментов, приводящих к шеддингу растворимой формы АХЭ с поверхности клеток.
Клетки нейробластомы человека 8Н-БУ5У происходят из предшественников симпатических нейронов и обладают многими свойствами, характерными для этого типа клеток (\Уас1е е1 а1, 1998). Они экспрессируют АХЭ, однако уровень ее активности ниже, чем в ткани мозга, но тем не менее достаточно высокий, что делает этот тип клеток удобной моделью для исследования механизмов влияния различных агентов на уровень экспрессии и активности АХЭ (ЕЬпсЪ е1 а1, 1997). Клетки нейробластомы БН-БУбУ также экспрессируют а-секретазу и часто используются для изучения ее свойств (Рагуа&у е1 а1., 1998).
150 т
| 100 I
§ 50
X'
/
-г=
•I
4
/
чь
16
20
24
40
Рис.17. Динамика секреции в культуральную среду растворимой формы АХЭ клетками
нейробластомы человека 5Н-8У5У и влияние на этот процесс специфического ингибитора а-секретазы батимастата и агониста мускариновых рецепторов
карбахола. 1 — контроль (п=8); 2 -20 мкМ карбахола (п=6), 3-20 мкМ батимастата (п=6). * -статистически достоверные
различия р < 0.05 и ** р < 0.01 по сравнению с контролем.
часы
В проведенных нами экспериментах было обнаружено, что активность АХЭ в клетках нейробластомы варьирует от 30 до 300 нмол АТХ/мг белка/мин в зависимости от номера пассажа и условий роста клеток. За 48 часов инкубации эти клетки выделяют во внеклеточную среду приблизительно около 15% их общей АХЭ активности. Динамика секреции АХЭ во внеклеточную среду показана на рис. 17. Добавление в культуральную среду 20 цМ агониста холинергических рецепторов карбахола или 20 р.М мускарина (рис. 18) приводило к существенному (более, чем трехкратному) увеличению секреции АХЭ. Напротив, в присутствии 20 цМ ингибитора а-секретазы батимастата наблюдалось почти полное подавление секреции АХЭ. В присутствии
батимастата стимулирующий эффект карбахола также подавлялся почти полностью (рис. 18, Б). После 48 часов инкубации клеток нейробластомы с 20 цМ карбахола и батимастата секреция АХЭ подавлялась почти на 37% по сравнению с контролем. При дальнейшем культивировании клеток (в течение 64 часов) наблюдалось дальнейшее снижение секреции по сравнению с контролем, однако менее эффективное по сравнению с 48 часами инкубации, что может объясняться гидролизом ингибитора и потерей его эффективности при длительных условиях культивирования клеток.
Рис.18. Влияние агонистов холинергических рецепторов и специфического ингибитора а-секретазы батимастата на секрецию в культур альную среду АХЭ клетками нейробластомы человека вН-ЗУбУ. А - 1 - контроль (п=8); 2 - 20 мкМ карбахола (п=6), 3-20 мкМ мускарина (п=б), 4-20 мкМ батимастата (п=6). Время инкубации клеток - 24 часа. * -статистически достоверные
различия р < 0.05 и ** р < 0.01 по сравнению с контролем. Активность АХЭ в среде с контрольными клетками принята за 100%. Б - 1 -контроль, 2-20 мкМ карбахола, 3 -20 мкМ карбахола + 20 мьсМ батимастата.
12 3
Обнаруженный в нашем исследовании феномен секреции АХЭ клетками нейробластомы очень схож с характером секреции бАРРсх, описанный (РагуаШу е1 а1., 1998) и наблюдаемый в наших исследованиях. Сравнение этих данных позволяет нам предположить, что а-секретаза может быть вовлечена в процесс секреции АХЭ в культуральную среду. Наличие растворимых форм АХЭ в ткани мозга было показано рядом автором, которые также указывали на ее нейритогенные свойства ^егпГеМ е1 а1., 1998; Арр1еуагс1, 1994). Как было показано в наших исследованиях, наиболее высокий уровень активности растворимой АХЭ в коре и стриатуме крыс наблюдается в первый месяц после рождения и понижен у животных, перенесших пренатальную гипоксию (Лавренова и др., 2003). Культивирование клеток нейробластомы в условиях гипоксии (2.5% О2, 24 часа) также приводило к существенному снижению (более чем на 90%) секреции растворимой формы АХЭ во внеклеточную среду. С другой стороны, рядом автором отмечена способность АХЭ образовывать комплексы с Ар, которые являются более нейротоксичными для нейронов, чем сами агрегаты АР, а также наличие АХЭ в составе сенильных бляшек (Мипог & 1пе5й"оза, 1999), что предполагает ее роль в патогенезе болезни Альцгеймера.
А
- /.Л,
Контроль
Л Ч\ >
V » ч -к * > [ '
/ ^
' * - ' .
Батимастат (20 |аМ)
В 50 х
!5
X
« и
о4
.<• У
' \ !* \ I Карбахол (20 )иМ)
40 30 -| 20 Ю -I о
** **
г*
Рис.19. Фазово-контрастная микроскопия клеток нейробластомы человека 5Н-БУ5У, культивируемых с различными агентами (А): контроль; 20 мкМ карбахола, 20 мкМ батимастата. Время инкубации клеток - 48 часов. Б - Влияние агонистов холинергических рецепторов и специфического ингибитора а-секретазы батимастата на формирование нейритов клетками нейробластомы человека 8Н-8У5У. 1 - контроль (п=6); 2-20 мкМ карбахола (п=6), 3-20 мкМ мускарина (п=6), 4-20 мкМ батимастата (п=6). Время инкубации клеток - 24 часа. ** - статистически достоверные различия р < 0.01 по сравнению с контролем.
В нашем исследовании также было обнаружено, что в присутствии холинергических агонистов карбахола и мускарина почти вдвое повышается способность клеток образовывать нейриты (рис. 19). Как видно из рисунка, в присутствии батимастата, напротив, число клеток с нейритами значительно снижено по сравнению с контролем и эти клетки имеют совсем другую морфологию. Кроме того, количество длинных нейритов (значительно превышающих размеры сомы клеток) в присутствии батимастата уменьшается с 1.51±0.09 в контрольной группе до 0.71±0.08 у клеток, обработанных ингибитором. Эти данные являются косвенным подтверждением того, что секретируемые а-секретазой фрагменты белков, включая растворимые бАРР и АХЭ, способствуют дифференцировке нервных клеток и нейритогенезу, и снижение их продукции является отрицательным для жизнедеятельности клеток. Таким образом, поддержание активности а-секретазы на физиологически высоком уровне является необходимым условием для нормального развития клеток. Однако чрезмерное увеличение активности а-
секретазы под действием агонистов холинергических рецепторов может вести к нежелательной продукции чрезмерных количеств растворимой формы АХЭ, которая, агрегируя с Aß, может способствовать формированию токсичных комплексов, губительных для нервных клеток (Reyes et al., 2004).
Влияние гипоксии и окислительного стресса на активность и экспрессию амилоид-деградирующих ферментов в клетках нейробластомы человека
В данной серии экспериментов проводился анализ влияния гипоксии и окислительного стресса на уровень экспрессии амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 клетками нейробластомы человека NB7, эндогенно экспрессирующими эти оба фермента, а также воздействия холинергического агониста карбахола и форболовых эфиров на уровень их экспрессии.
Результаты влияния гипоксии и окислительного стресса на уровень экспрессии и активность НЕП в клетках нейробластомы показаны на рис. 20. В качестве маркера гипоксии использовали уровень экспрессии GLUTI. Как видно из рис. 20, А (данные иммуноблотинга), гипоксия (1% 02, 24 часа) приводила к существенному повышению экспрессии этой формы транспортера глюкозы, в то время как при окислительном стрессе, вызываемом добавлением к клеткам 40 мкМ Н202, не наблюдалось существенных изменений уровния GLUTI. При данных условиях также не изменялась выживаемость клеток, оцениваемая по их окрашиванию трипановым голубым. Число гибнущих клеток при обоих воздействиях не отличалось более чем на 5% от контрольных величин.
Рис.20. Влияние гипоксии и окислительного стресса на уровень экспрессии и активности НЕП в клетках нейробластомы NB7. А, Б - содержание НЕП на уровне белка определялось с помощью иммуноблотинга с антителами CD 10. В - активность НЕП измерялась с помощью энзиматического флуорисцентного метода. Г - уровень мРНК НЕП определялся с помощью метода q-ПЦР (данные отнесены к уровню содержания мРНК GAPDH). 1 - контроль; 2 - 40 мкМ Н:02 (п=8), 3 - гипоксия (1% 02, 24 часа, (п=8), 4 -рекомбинантный НЕП. * -статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем.
кДа i 100-
НЕП
У.Е.
6.00Е-02 -i 4.00Е-02 -2.00Е-02 -0.ООЕ+ОО
2 3
Полученные нами данные свидетельствуют, что хроническая (24 часа) гипоксия и окислительный стресс приводят к снижению на 25-30% содержания НЕП в клетках >ГО7. Уровень экспрессии мРНК НЕП, оцениваемый с помощью метода количественной ПЦР, также достоверно снижался после гипоксии, а при окислительном стрессе наблюдалась тенденция к его снижению. Активность неприлизина также была достоверно (на 40-45%) ниже в гипоксических клетках по сравнению с контролем, в то время как при окислительном стрессе снижение было статистически недостоверным. Полученные данные свидетельствуют, что гипоксия влияет на транскрипцию гена НЕП, и, как следствие, на уровень содержания его мРНК, белкового продукта и активность. При этом окислительный стресс, вероятно, затрагивает указанные процессы в меньшей степени, влияя в основном на активность самого фермента. Анализ локализации БЕП в клетках N137 с помощью метода иммуноцитохимии показал, что помимо уменьшения яркости свечения клеток, окрашиваемых антителами к НЕП, что свидетельствует о снижении содержания НЕП при гипоксии, наблюдается также изменение его локализации. Так в гипоксических клетках НЕП наблюдается в основном в цитоплазме, в то время как в контроле достаточно сильное его свечение наблюдается в плазматических мембранах. Это свидетельствет о том, что гипоксия приводит или к нарушению транспорта НЕП, или к его интернализации.
Ша 105 -
ЕСЕ-1
12 3 4
Рис.21. Влияние гипоксии и окислительного стресса на уровень экспрессии ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы человека ЫВ7. Содержание ЕСЕ-1 на уровне белка определялось с помощью иммуноблотинга с моноклональными антителами АЕС32-236 (А, Б). Содержание ЕСЕ-1 мРНК определялось с помощью метода количественной ПЦР (В). Данные отнесены к содержанию мРНК САРБН. 1 - контроль; 2-40 мкМ Н202 (п=10), 3 -гипоксия (1% 02, 24 часа, п=12), 4 - ЕСЕ-1. * -статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем.
9 «И»
120 л
¥ 100 -
ои 60 -
$ 40 -
о. 20 -
0 4
В
I
в
0,05-1
0,04 ■ 0,03 0,02 Н
0,01 -0,00
У.Е.
При анализе экспрессии ЕСЕ-1, было обнаружено 30% снижение его содержания на уровне белка при гипоксии и на 20% при окислительном стрессе (рис. 21). Однако при обоих воздействиях не наблюдалось изменения уровня
экспрессии ЕСЕ-1 на уровне мРНК, что свидетельствует о влиянии гипоксии и окислительного стресса в основном на процессы трансляции молекул мРНК, а не на транскрипцию гена ЕСЕ-1.
Покольку клетки нейробластомы N137 не являются морфологически типичными нейрональными клетками, мы предприняли попытку инициировать их дифференциацию с помощью удаления факторов роста, содержащихся в эмбриональной сыворотке телят, добавляя к клеткам бессывороточную среду, а также при помощи холинергического агониста карбахола. Оба эти воздействия вызывали увеличение нейритогенеза в клетках нейробластомы БН-БУбУ, описанное нами в предыдущем разделе этой главы. В условиях данных экспериментов замена полной культуральной среды на бессывороточную и добавление 20 мкМ карбахола не приводило морфологически к существенному изменению внешнего вида клеток, однако они прекращали делиться и у части клеток появлялись короткие отростки. Как видно из рис. 22 (А, Б), уровень экспрессии ЕСЕ-1 в бессывороточной среде и при добавлении 20 мкМ карбахола снижался на 30-40% по сравнению с контролем. Снижение НЕП в то же время было менее выраженным (на 20% по сравнению с контролем) и наблюдалось только, когда клетки инкубировались с карбахолом (рис. 22, В).
А В
кДа
I ß-актин
%
8 ы
%
8 120 Й 100 1 80 I 60
в 40
I 20
I 0
Рис.22. Влияние бессывороточной среды и холинэргического агониста карбахола на уровень экспрессии ЕСЕ-1, НЕП и АРР в клетках нейробластомы человека NB7, выявляемых с помощью моноклональных антител АЕС32-236, CD10 и 22С11, соответственно. А - данные иммуноблотинга для ЕСЕ-1, Б - данные денситометрии для ЕСЕ-1. В — данные денситометрии для НЕП, Г - для APP. 1 - контроль; 2-20 мкМ харбахола (п=3), 3 - бессывороточная среда (п=4), 4 - бессывороточная среда с 20 мкМ карбахола (п=4). * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем.
В качестве контроля влияния карбахола и бессывороточной среды мы. использовали уровень экспрессии АРР клетками NB7 (рис. 22, Г). Как видно из рисунка, при данных условиях наблюдается существенное снижение уровня мембраносвязанного АРР, которое в случае действия карбахола может объясняться увеличением расщепления АРР а-секретазой и секрецией во внеклеточную среду, что было убедительно продемонстрировано в работе (Canet-Aviles et al., 2002).
Для оценки возможных сигнальных механизмов, принимающих участие в опосредовании действия карбахола, мы предприняли анализ влияния форболового эфира 12-миристат-13 ацетата (РМА) на уровень экспрессии и активности НЕП и ЕСЕ в клетках нейробластомы NB7, поскольку ранее было показано, что эти агенты активируют а-секретазу в клетках SH-SY5Y (Racchi et al., 1999). В результате проведенных нами экспериментов мы обнаружили, что добавление форболового эфира РМА к клеткам NB7 не вызывало при краткосрочной инкубации изменения уровня экспрессии ЕСЕ-1 и НЕП и активности НЕП, как в случае а-секретазы, однако при более пролонгированном воздействии приводило к дозо-зависимому подавлению экспрессии обоих ферментов (рис. 23, 24). Это было неожиданным, поскольку в литературе имеются данные об активации экспрессии ЕСЕ-1 форболовыми эфирами в эпителиальных клетках HUVEC (Orzechowski et al., 2001). Этот эффект в случае НЕП был более выраженным и наблюдался также на уровне активности фермента (рис. 24, Б).
А
ЕСЕ-1
Б
Рис.23. Влияние форболового эфира РМА па уровень экспрессии ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы человека №37, выявляемого с помощью моноклональных антител
антител
В
шянн
i 2 3 ЕСЕ
12 3 4
актин
Р-
ECE-lc ;
г
%
120 1 100 • 80 -
20 ■ о ■
1
г 3 4
1*1 , fi
2
Э
АЕС32-236. А, В - данные иммуноблотинга; Б, Г -денситометрии. А и Б: 1 -контроль; 2-10 мкМ РМА (24 часа, п=6), 3-50 мкМ РМА (24 часа, п=6), 4-100 мкМ РМА (24 часа, п=6). В и Г: 1 -контроль; 2 - 100 мкМ РМА (24 часа, п=3), 3-100 мкМ РМА + 10 мкМ ингибитора РКС BIS-1 (24 часа, п=3). * -статистически достоверные различия р < 0.05 и ** - р < 0.01 по сравнению с контролем.
Рис.24. Влияние форболового эфира РМА на уровень экспрессии НЕП в клетках нейробластомы человека NB7, выявляемое с помощью моноклональных антител CD 10. А - данные иммуноблотинга; Б -данные денситометрии; В -активность НЕП. 1 — контроль; 2 -10 мкМ РМА (24 часа, п=4), 3-50 мкМ РМА (24 часа, п=6), 4-100 мкМ РМА (24 часа, п=6). * -статистически достоверные различия р < 0.05 и ** - р < 0.01 по сравнению с контролем.
Анализируя этот феномен, мы обнаружили, что добавление ингибитора РКС Bis-I (GF 109203Х) не снимало ингибирующий эффект форболового эфира на экспрессию ЕСЕ-1 (рис. 23, Г). В случае НЕП Bis-I приводил лишь к частичному восстановлению уровня содержания НЕП, подавляемому в присутствии РМА, однако, анализируя активность НЕП при инкубации с Bis-I, мы не обнаружили существенных различий по сравнению с активностью НЕП в клетках, инкубируемых только с РМА. В ходе продолжения исследований, мы обнаружили, что РМА способен активировать появление активности НЕП в культуральной среде, а значит усиливать секрецию этого фермента - феномен, который до нас не описывался в литературе. Чтобы убедиться в достоверности полученных данных о «шеддировании» НЕП, в настоящее время проводится углубленный анализ этого явления.
Результаты, представленные в данной главе, свидетельствуют, что гипоксия и окислительный стресс снижают экспрессию НЕП и его гомолога ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы NB7. Такие данные, приводятся впервые, хотя недавно появилось сообщение (Oh-hashi et al., 2005), свидетельствующее о снижении активности НЕП в клетках нейробластомы SH-SY5Y, детектируемом с помощью метода HPLC. Поскольку, согласно нашим данным, уровень экспрессии НЕП в клетках SH-SY5Y является практически недетектируемым, данные этих авторов могут свидетельствовать о снижении при гипоксии активности другой пептидазы, недавно открытой секретируемой эндопептидазы
SEP, которая экспрессируется данным типом клеток и расщепляет использованный в работе этих авторов синтетический субстрат.
Поиск путей регуляции активности амилоид-деградирующих ферментов
Как уже отмечалось в обосновании целей и задач данного исследования, поиск агентов, способных повышать экспрессию и активность амилоид-деградирующих ферментов является одной из актуальных задач в области профилактики и лечения болезни Альцгеймера. Предложенный Саидо (Saito et al, 2003) подход к поиску агентов, способных регулировать активность НЕП, был применен нами при анализе влияния субстрата НЕП соматостатина на уровень его экспрессии и активности в клетках нейробластомы NB7. Данные этих экспрементов приведены на рис. 25 (А, Б). В отличие от первичных культур нейрональных клеток коры мозга крыс, использованных в работе Саидо и коллег (Saito et al., 2005), инкубация клеток нейробластомы NB7 не приводила к повышению активности НЕП а также увеличению уровня его активности, однако вызывала достоверно значительное повышение экспрессии ЕСЕ-1 (Рис. 25, А, Б), причем этот эффект был дозо-зависимым.
&
%
120 100 80
Я-«
20 О
У.Е.
а 250
1 200
§• 1»'
й 100
к J0
гЧ
П о
1
НЕП
2 3
ЕСЕ-1
I %
I 1501
I 1И'
I Я-
%
S* 150 -
НЕП
В
А
1 2 3 4 5 6 7
ЕСЕ-1
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 25. Влияние соматостатина на уровень экспрессии НЕП (А) и ЕСЕ-1 (Б) в клетках нейробластомы человека NB7, выявляемое с помощью моноклональных антител CD 10 и АЕС32-236. Время воздействия - 24 часа, n=6. 1 - контроль, 2-10 мкМ и 3 - 100 мкМ соматостатина. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем. В и Г - влияние синтетического агониста опиоидных рецепторов DAGO на уровень экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы человека NB7, выявляемое с помощью моноклональных антител CD10 и АЕС32-236. Время воздействия 24 часа, п=б. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем. 1 - контроль, 2 - 10, 3 - 100, 4- 1000 нМ DAGO, 5 часов; 5 - 10, 6 - 100, 7 - 1000 нМ DAGO, 24 часа.
Основываясь на данных литературы о том, что опиоидные пептиды могут активировать НЕП (Malfroy et al., 1978), другим агентом, использованным в нашей работе, был синтетический аналог энкефалина - [D-Ana2,N-Me-Фен4,Гли5-ол]-энкефалин (DAGO). Нами было обнаружено, что в концентрации (10 нМ) этот агент был способен незначительно повышать уровень экспрессии НЕП, а в концентрации 100 нмМ-10 мкМ он приводил к существенному увеличению содержания ЕСЕ-1 (рис. 25, В, Г). Полученные данные свидетельствуют, что хотя апробированные агенты не являются специфическими по отношению к НЕП, они в значительной мере повышают экспрессию ЕСЕ-1. Это дает основание надеяться, что дальнейший поиск в данном направлении может привести к созданию аналогов этих соединений, обладающих более высокой специфичностью и эффектом по отношению к обоим ферментам.
Другим классом соединений, которые недавно были предложены для повышения активности НЕП, являются антиоксиданты зеленого чая, положительный эффект которых был показан при разных нейродегенеративных заболеваниях (Weinreb et al., 2004). Экстракт зеленого чая EFLA85942, как было показано Melzig & Janka (2003), способен повышать активность НЕП в клетках нейробластомы SK-N-SH. Согласно полученным нами данным '(рис. 26), полифенол экстракта зеленого чая эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG) также способен при длительном воздействии повышать экспрессию НЕП в клетках
Рис.26. Влияние антиоксиданта экстракта зеленого чая (EGCG) на уровень экспрессии и активность НЕП в клетках нейробластомы человека NB7. А - НЕП иммунореактивность, выявляемая с помощью моноклональных антител CD 10, Б - активность НЕП, измеряемая с помощью флуоресцентного метода.
Время воздействия 72 часа, п=3. * - статистически достоверные различия (р < 0.05) по сравнению с контролем. 1,3- контроль, 2, 4
- 25 мкг/мл EGCG. 1, 2 -полная среда с сывороткой, 3, 4
- бессывороточная среда.
нейробластомы NB7.
%от контроля
600 -400 -200 -О
JZL
1 1600 -
i 1200 -
\о
и .Я 800 -
400 ■
С
0 -1
\ i ; . .8
Ь
*
-ь
Данные исследования в направлении поиска биологически активных природных и синтетических соединений, которые способны регулировать активность амилоид-деградирующих ферментов являются в настоящее время высоко приоритетными и продолжение их имеет важное научное значение.
Заключение
Проведенное исследование существенно дополняет и расширяет имеющиеся в литературе данные о метаболизме предшественника амилоидного пептида и свойствах ферментов, принимающих участие в секреции его растворимых фрагментов, а также в катаболизме амилоидного пептида Ар. Полученные новые данные об экспрессии АРР и содержании его растворимых форм в ходе онтогенетического развития мозга млекопитающих (крыс) в норме и при патологии (гипоксия и ишемия) свидетельствуют о их важной роли в формировании и функционировании нервной системы. Сопоставление данных, полученных на зооморфных моделях, с результатами исследований, проводимых с использованием культур нейрональных клеток человека при гипоксии и окислительном стрессе, позволяет глубже понять механизмы процессов, протекающих в нервной ткани и оценить уровень и характер изменения экспрессии и активности как ферментов, участвующих в катаболизме АРР, так и способных деградировать амилоидный пептид Ар. В результате проведенного исследования становится очевидным, что амилоидный метаболизм в нервных клетках является динамическим процессом и зависит от условий окружающей среды, в частности, от снабжения клеток кислородом. Это позволяет оценить молекулярные основы повреждающего действия гипоксии и ишемии и их роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и развития болезни Альцгеймера, а также предложить пути их коррекции путем повышения активности ферментов, как расщепляющих АРР по неамилоидогенному пути, так и деградирующих АР с помощью фармакологических агентов. Полученные данные свидетельствуют, что регуляция уровня экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 находится под строгим генетическим контролем, изменяющимся с возрастом, и для поиска путей повышения экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 необходимы дальнейшие исследования механизмов регуляции экспрессии генов этих ферментов. Как было показано совсем недавно, одними из факторов, контролирующими экспрессию НЕП являются компоненты ферментативного у-секретазного комплекса, приводящего к продукции АР, а именно пресенилины (Pardossi-Piquard ег а1., 2005). С этой точки зрения представляет интерес не только углубленное изучение данного феномена, но также анализ механизмов, приводящих к репрессии гена НЕП, наблюдаемое с возрастом. Развитие исследований именно в этом направлении открывает новый этап научных поисков автора.
ВЫВОДЫ
1. Содержание предшественника амилоидного пептида (АРР) в коре, стриатуме, гиппокампе и амигдале мозга крыс возрастает в течение первого месяца после рождения и снижается к старости. В первый месяц после рождения также наблюдается самый высокий уровень продукции растворимых форм АРР, образующихся при участии а-секретазы и обладающих нейритогенными и нейропротекторными свойствами.
2. Действие гипоксии в период эмбриогенеза приводит к изменению уровня экспрессии АРР в исследованных структурах мозга крыс и снижению секреции его растворимых фрагментов в коре и стриатуме в ходе первого месяца постнатального онтогенеза, что коррелирует с наблюдаемым в этот период жизни дефицитом развития сенсо-моторных реакций у гипоксических животных.
3. Наряду с протеолитическим расщеплением АРР, а-секретаза принимает участие в секреции растворимой формы АХЭ, обладающей нейритогенными свойствами. Секреция АХЭ снижается при действии гипоксии и в присутствии ингибитора а-секретазы батимастата. Наблюдаемые нами изменения в поведении крыс при внутрикортикальных инъекциях батимастата на разных этапах онтогенеза свидетельствует о важной роли а-секретазы в процессах формирования памяти.
4. Динамика экспрессии амилоид-деградирующего фермента неприлизина (НЕП) в коре и стриатуме головного мозга стареющих крыс и мышей свидетельствует о развитии эндогенного возрастного дефицита этой металлопептидазы в коре, что коррелирует с образованием депозитов амилоидного пептида при болезни Альцгеймера в этой структуре мозга. Пренатальная гипоксия приводит к существенному снижению уровня экспрессии НЕП и эндотелин-конвертирующего фермента (ЕСЕ-1) как в коре, так и в стриатуме мозга крыс в ходе постнатального онтогенеза, а гипоксическое прекондиционирование нормализует уровень их экспрессии.
5. Острая гипоксия и ишемия мозга взрослых крыс приводят к повышению уровня экспрессии АРР в коре и гиппокампе и его расщеплению с образованием высоких концентраций б АРР р. В этих условиях также наблюдается снижение экспрессии и активности амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1. Как гипоксия, так и ишемия мозга в целом приводят к изменению баланса ферментов амилоидного метаболизма в сторону накопления амилоидного пептида, что объясняет увеличение риска развития болезни Альцгеймера при ишемии и инсультах.
6. Нейропептиды соматостатин, агонист опиоидных рецепторов ДАГО и антиоксидант эпигаллокатехин-3-галлат способны повышать уровень экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы человека N137. Направленное увеличение экспрессии и повышение активности этих ферментов предлагается как один из перспективных подходов к профилактике и лечению болезни Альцгеймера.
7. Полученные данные позволяют сформулировать концепцию о динамичности метаболизма амилоидного пептида в ткани мозга в норме и при патологии, о его важной функциональной роли в развитии нервной системы и о возможности его регуляции с помощью различных физиологических и фармакологических агентов (гипоксическое прекондиционирование, биологически активные пептиды и антиоксиданты) с целью предотвращения накопления патологически высоких концентраций амилоидного пептида и нейродегенерации.
ПУБЛИКАЦИИ:
1. Аврова Н.Ф., Наливаева H.H., Тюрин В.А., Ветош А.Н., Тюрина Ю.Ю., Баев В.А., Васильева И.В. (1993) Способность ганглиозидов улучшать функциональное состояние организма и нормализовать биохимическую структуру клеточных мембран при гипоксии. Физиол. Человека, 19: 109120.
2. Наливаева H.H., Плеснева С.А., Ковешникова Т.Г., Васильева Ю.В., Варлинская Е.И., Клементьев Б.И. (1993) Сравнительно-биохимический анализ мозга крыс-правшей, левшей и амбидекстров. Докл. Акад. Наук, 328: 116-118.
3. Журавин И.А., Наливаева H.H., Дубровская Н.М. (1993) Влияние экзогенных ганглиозидов на формирование инструментальных движений с тактильным контролем у крыс. Журн. Высш. Нервн. Деят. им. И.П.Палова, 43:1129-1136.
4. Баев В.И., Васильева И.В., Наливаева H.H. (1994) Ганглиозиды мозга крыс при гипоксии. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 118: 19-21.
5. Баев В.И., Васильева И.В., Львов С.Н., Наливаева H.H. (1994) Ганглиозиды мозга крыс при сочетанном действии гиперкапнии, гипоксии и гипотермии. Укр. Биохим. Журн., 66: 89-94.
6. Матюшичев В.Б., Соколов И.Н., Наливаева H.H., Сафронова Т.И., Плеснева С. А., Жахов A.B. (1994) Модификация биохимических изменений в развивающихся культурах нервной ткани куриных эмбрионов. Биохимия, 59: 1490-1496.
7. Наливаева H.H., Плеснева С.А., Чекулаева У.Б., Ходов Д.А., Клементьев Б.И., Аврова Н.Ф. (1994) Влияние амтизола на биохимические параметры синаптосом коры мозга крыс при гипоксии. Физиол. Человека, 20: 112-117.
8. Журавин И.А., Наливаева H.H., Плеснева С.А., Дубровская Н.М., Чекулаева У.Б., Клементьев Б.И. (1994) Нейрохимические характеристики неостриатума и моторной коры крыс после выработки унилатерального манипуляторного рефлекса. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова, 80: 115-120.
9. Журавин И.А., Наливаева H.H., Плеснева С.А., Дубровская Н.М., Чекулаева У.Б., Клементьев Б.И. (1995) Активность аденилат-циклазы и 5'-нуклеотидазы в сенсомоторных и лимбических структурах мозга крыс после обучения манипуляторным навыкам. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова, 81: 40-47.
10. Nalivaeva, N., Plesneva, S., Chekulaeva, U., Zhuravin, I., Dubrobskaya, N., Klementjev, B. (1995) Hypoxic hypoxia induces different biochemical changes in the cortex of the right and left hemispheres of rat brain. Mol. Chem. NeuropathoL, 25: 255-263.
11. Наливаева H.H., Плеснева C.A., Чекулаева У.Б., Васильева Ю.В., Варлинская Е.И., Клементьев Б.И. (1996) Биохимические характеристики сенсомоторной коры крыс-правшей, левшей и амбидекстров. Журн. Эвол. Биохим. Физиол., 32: 75-81.
12. Chekulaeva, U., Nalivaeva, N. (1997) The effect of hypoxia on 5'-nucleotidase activity in synaptosomes of the right and left brain hemispheres. J\ Physiol. -London, 499:41-42.
13. Наливаева H.H., Клементьев Б.И., Плеснева C.A., Чекулаева У.Б., Журавин И.А. (1998) Эффект гипоксии на клеточные мембраны правого и левого полушарий эмбрионального мозга крыс. Ж Эвол. Биохим. Физиол., 34: 339343.
14. Plesneva S.A., Nalivaeva N.N., Zhuravin I.А. (1998) Adenylate cyclase system of the rat striatum: regulatory properties and the effect of gangliosides. Neurosci. Behav. Physiol, 28: 392-396.
15. Журавин И.А., Наливаева H.H., Плеснева, Дубровская Н.М. (1999) Эффект ганглиозидов на моторную активность, обучение и регуляцию трансдукции сигнала в мозгу крыс. Ж. Эвол. Биохим. Физиол., 35: 223-230.
16. Nalivaeva, N.N.' and Turner, A.J. (1999) Does acetylcholinesterase secretion involve an ADAMS-like metallosecretase? Lett. Peptide Sci., 6: 343-348.
17. Nalivaeva, N.N., Rybakina, E.G., Pivanovich, I.Yu., Kozinets, I.A., Shanin, S.N., and Bartfai, T.(2000) Activation of neutral sphingomyelinase by IL-ip requires the type I interleukine 1 receptor. Cytokine, 12: 229-232.
18. Nalivaeva N.N., Turner A.J. (2001) Post-translational modifications of proteins: Acetylcholinesterase as a model system. Proteomics, 1: 735-747.
19. Zhuravin, I.A., Tumanova, N.L., Nalivaeva, N.N., Plesneva, S.A., Dubrovskaya, N.M., Potapov, D.O., Turner, A.J. (2001) Effect of prenatal hypoxia on the developing brain: morphological, behavioural and biochemical study. Adv. Gerontol, 6 (S.104): 73-74.
20. Лавренова, C.M., Наливаева, H.H., Журавин, И.А. (2003) Активность ацетилхолинестеразы сенсомоторной коры в раннем онтогенезе крыс, перенесших пренатальную гипоксию. Ж. Эвол. Биохим. Физиол., 39: 154159.
21. Nalivaeva, N.N., Fisk, L,, Aviles, R.M.C., Plesneva, S.A., Zhuravin, I.A., Turner, A.J. (2003) Effects of prenatal hypoxia on expression of amyloid precursor protein and metallopeptidases in the rat brain. Letts. Peptide Sci., 10: 455-462.
22. Nalivaeva, N.N., Fisk, L. Kochkina, E.G., Plesneva, S.A., Zhuravin, I.A., Babusikova, E., Dobrota, D., Turner, A.J. (2004) Effect of hypoxia/ischemia and hypoxic preconditioning/reperfusion on expression of some amyloid-degrading enzymes. Ann. N-Y-. Acad. Sci., 1035: 21-33.
23. Turner, A.J., Fisk, L., Nalivaeva, N.N. (2004) Targeting amyloid-degrading enzymes as therapeutic strategies in neurodegeneration, Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1035, 1-20.
24. Дубровская H.M., Наливаева H.H., Журавин И.А., Тернер А. (2005) Влияние ингибитора а-секретазы, метаболизирующий предшественник амилоидного пептида, на формирование памяти у крыс. Ж. Высш. Нервы. Деят. им И.П.Павлова, 55: 725-728.
25. Наливаева Н.Н., Бабусикова Е., Доброта Д., Тернер А. (2005) Влияние ишемии и реперфузии на содержание предшественника амилоидного пептида и продуктов его протеолиза в гиппокампе крыс. Нейрохимия, 23£
26. Fisk, L., Nalivaeva, N.N., Turner, AJ. (2005) Regulation of endothelin-converting enzyme (ECE-1) expression in human neuroblastoma cells. Exp. Biol. Med., 231 (6): lG&g- J053.
Наливаева Наталия Николаевна «Роль гипоксии и ишемии мозга в метаболизме амилоидного пептида и патогенезе болезни Альцгеймера» Автореф. дисс, на соискание ученой степени доктора биологических наук
Подписано в печать 20.04.2006. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ №1/204. П. л. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0. Тираж 100 экз.
ЗАО «КопиСервис» Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Наливаева, Наталия Николаевна
Условные обозначения и сокращения.
Введение.
Цели и задачи исследования.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Общие представления о болезни Альцгеймера.
1.2. Предшественник амилоидного пептида, его свойства и. функции.
1.3. Протеолитический процессинг предшественника. амилоидного пептида.
1.4. Свойства амилоидного пептида.
1.5. Выведение А(3 из организма и мозга.
1.6. Амилоид-деградирующие ферменты.
1.6.1. Неприлизин.
1.6.2. Эндотелин-конвертирующий фермент.
1.6.3. Инсулин-деградирующий ф ермент.
1.6.4. Плазмин.
1.6.5. Другие агенты.
1.7. Динамичность уровня содержания А(3.
1.8. Факторы, влияющие на баланс А(3.
1.8.1. Возраст.
1.8.2. Гипоксия и ишемия мозга.
1.8.3. Пренатальная гипоксия.
1.9. Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера.
1.10. Обоснование целей и задач данного исследования.
Глава 2. Экспериментальные модели и методы исследования.
2.1. Материалы.
2.2. Модели гипоксии.
2.2.1. Модель пренатальной нормобарической гипоксии.
2.2.2. Модели острой гипоксии взрослых животных.
2.2.2.1. Модель нормобарической гипоксии.
2.2.2.2. Модель гипобарической гипоксии.
2.2.3. Модель гипоксии культивируемых нервных клеток.
2.3. Модель экспериментальной ишемии мозга крыс.
2.4. Метод культивирования нервных клеток.
2.4.1. Культивирование клеток нейробластомы человека.
2.4.2. Получение и культивирование первичных нейрональных. клеток из мозга новорожденных крыс.
2.4.3. Оценка выживаемости клеток в культуре с помощью. окрашивания трипановым голубым.
2.5. Выделение фракций растворимых и мембраносвязанных белков методом дифференциального центрифугирования.
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.
2.7. Исследование уровня экспрессии белков с помощью метода. иммуноблотинга.
2.8. Методы анализа экспрессии белков с использованием. иммуноцитохимии и флуоресцентной конфокальной микроскопии.
2.9. Исследование уровня экспрессии белков на уровне мРНК помощью методов полимеразной цепной реакции.
2.9.1. Выделение РНК и определение содержания нуклеиновых. кислот.
2.9.2. Электрофорез в агарозном геле.
2.9.3. Проведение одноэтапной полимеразной цепной реакции. с помощью обратной транскриптазы.
2.9.4. Количественная полимеразная цепная реакция.
2.10. Анализ активности а-секретазы с использованием. клеток нейробластомы человека.
2.11. Флуоресцентный метод определения активности неприлизина.
2.12. Метод определения активности ацетилхолинэстеразы.
2.13. Методы определения содержания белка.
2.14. Анализ влияния кортикальных инъекций ингибитора. а-секретазы батимастата на формирование памяти у крыс.
2.15. Статистические методы обработки полученных данных.
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
3.1. Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его. растворимых фрагментов в норме и после пренатальной гипоксии.
3.2. Возрастная динамика экспрессии амилоид-деградирующего. фермента НЕП и ЕСЕ-1 в норме и после пренатальной гипоксии.
3.3. Влияние острой нормобарической гипоксии у взрослых. животных на экспрессию АРР и активность ферментов,. участвующих в его метаболизме.
3.4. Влияние острой гипобарической гипоксии на активность.
НЕП в коре и гиппокампе крыс.
3.5. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию ферментов,. участвующих в метаболизме АРР.
3.6. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию амилоид-. деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 в коре мозга крыс.
3.7. Влияние специфического ингибитора а-секретазы на. формирование памяти у крыс.
3.8. Анализ участия а-секретазы предшественника амилоидного. пептида в секреции растворимой формы ацетилхолинэстеразы.
3.9. Влияние гипоксии и окислительного стресса на активность. и экспрессию амилоид-деградирующих ферментов в клетках. нейробластомы человека.
3.10. Влияние гипоксии на активность и экспрессию НЕП в. первичных культурах нейрональных клеток мозга крыс.
3.11. Поиск путей регуляции активности амилоид-деградирующих. ферментов.
Глава 4. Общая оценка результатов исследования.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гипоксии и ишемии мозга в метаболизме амилоидного пептида и патогенезе болезни Альцгеймера"
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний нервной системы, сопровождающимся тяжелыми нарушениями деятельности мозга и встречающимся, в основном, у людей пожилого возраста. В связи с увеличением средней продолжительности жизни число людей, страдающих старческой формой данного заболевания, возрастает каждый год. По данным Международной организации здравоохранения сейчас в мире насчитывается около 24 миллионов людей, страдающих этим заболеванием, а к 2020 году их число составит 42 миллиона. Только в Европе к 2010 году затраты на лечение больных, страдающих этим заболеванием, будут составлять более 500 миллионов евро в год. Кроме того, существуют генетически обусловленные формы болезни Альцгеймера, встречающиеся в более молодом возрасте, и требующие специальных подходов диагностики и лечения. Несмотря на то, что в мировой литературе накоплен значительный экспериментальный материал по изучению морфологических, физиологических и биохимических основ болезни Альцгеймера, в настоящее время все еще нет ясной концепции патогенеза этого заболевания и адекватных подходов к его лечению. Одним из факторов, приводящим к гибели нервных клеток и когнитивным нарушениям, сопровождающим болезнь Альцгеймера, является патологическое накопление в ткани мозга агрегатов [3-амилоидного пептида, являющегося основным компонентом так называемых сенильных бляшек. Последние являются одним из наиболее характерных морфологических проявлений болезни Альцгеймера. Амилоидный пептид (А(3) образуется в результате протеолиза более крупных молекул белка, называемого предшественником амилоидного пептида или (ЗАРР ([3-amyloid precursor protein) под действием ряда протеиназ. Амилоидный пептид обладает высоко выраженными фибрилогенными свойствами и его олигомеры являются токсичными для нервных клеток, вызывая дегенерацию и гибель нейронов, и нарушение, в частности, холинергической синаптической передачи.
До недавнего времени считалось, что накопление амилоидных фибрилл в ткани мозга является необратимым, однако становится все более очевидным, что амилоидный метаболизм является динамическим процессом, зависящим как от разнообразных внутренних факторов (генетических, клеточных, васкулярных), так и факторов окружающей среды (например, гипоксия и стресс). Перечисленные факторы могут влиять как на формирование и накопление амилоидного пептида, так и на его деградацию различными амилоид-деградирующими ферментами и выведение его из мозга по периваскулярным путям. Поскольку частота проявлений болезни Альцгеймера в пожилом возрасте существенно повышается в связи с нарушением снабжения мозга кислородом при ишемии и инсультах, представляет большой интерес систематическое исследование влияния гипоксии и ишемии мозга на процессы образования |3-амилоидного пептида, а также на активность и экспрессию в ткани мозга как амилоид-образующих, так и амилоид-деградирующих ферментов. На эту роль в последние годы претендует все большее число хорошо известных ферментов. Такое исследование представляет несомненную практическую ценность, поскольку позволяет не только ближе подойти к пониманию молекулярных основ патогенеза болезни Альцгеймера, но также открывает новые стратегические пути лечения и даже профилактики данного заболевания.
Цели и задачи исследования
В ходе данного многолетнего исследования планировалось систематическое изучение влияния острой и хронической гипоксии (как нормо-, так и гипобарической), а также ишемии мозга на экспрессию ряда ферментов, принимающих участие в катаболизме предшественника амилоидного пептида РАРР, в частности а- и (3-секретаз, а также ферментов, участвующих в расщеплении Ар, а именно неприлизина (НЕП) и эндотелин-конвертирующего фермента (ЕСЕ-1). Работа проводилась как на уровне целого организма с использованием зооморфных моделей (модель пре- и постнатальной гипоксии у крыс, модель глобальной ишемии и реперфузии мозга крыс), так и на клеточных культурах с использованием клеток нейробластомы человека, а также первичных нейрональных культур мозга крыс. В ходе данного исследования также проводилось изучение свойств перечисленных выше ферментов и регуляции их экспрессии и активности различными биологически активными веществами, с целью создания новых концепций лечения и профилактики болезни Альцгеймера. К числу таких соединений относились агонисты и антагонисты холинергической и опиоидной систем и нейропептиды. В результате проведения данного инновационного исследования планировалось создание новой концепции о влиянии гипоксии и ишемии на регуляцию амилоидного метаболизма и развитие болезни Альцгеймера, а также создание новых путей профилактики и коррекции нейродегенеративных нарушений в мозге.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Наливаева, Наталия Николаевна
ВЫВОДЫ
1. Содержание предшественника амилоидного пептида (АРР) в коре, стриатуме, гиппокампе и амигдале мозга крыс возрастает в течение первого месяца после рождения и снижается к старости. В первый месяц после рождения также наблюдается самый высокий уровень продукции растворимых форм АРР, образующихся при участии а-секретазы и обладающих нейритогенными и нейропротекторными свойствами.
2. Действие гипоксии в период эмбриогенеза приводит к изменению уровня экспрессии АРР в исследованных структурах мозга крыс и снижению секреции его растворимых фрагментов в коре и стриатуме в ходе первого месяца постнатального онтогенеза, что коррелирует с наблюдаемым в этот период жизни дефицитом развития сенсо-моторных реакций у гипоксических животных.
3. Наряду с протеолитическим расщеплением АРР, а-секретаза принимает участие в секреции растворимой формы АХЭ, обладающей нейритогенными свойствами. Секреция АХЭ снижается при действии гипоксии и в присутствии ингибитора а-секретазы батимастата. Наблюдаемые нами изменения в поведении крыс при внутрикортикальных инъекциях батимастата на разных этапах онтогенеза свидетельствует о важной роли а-секретазы в процессах формирования памяти.
4. Динамика экспрессии амилоид-деградирующего фермента неприлизина (НЕП) в коре и стриатуме головного мозга стареющих крыс и мышей свидетельствует о развитии эндогенного возрастного дефицита этой металлопептидазы в коре, что коррелирует с образованием депозитов амилоидного пептида при болезни Альцгеймера в этой структуре мозга. Пренатальная гипоксия приводит к существенному снижению уровня экспрессии НЕП и эндотелин-конвертирующего фермента (ЕСЕ-1) как в коре, так и в стриатуме мозга крыс в ходе постнатального онтогенеза, а гипоксическое прекондиционирование нормализует уровень их экспрессии.
5. Острая гипоксия и ишемия мозга взрослых крыс приводят к повышению уровня экспрессии АРР в коре и гиппокампе и его расщеплению с образованием высоких концентраций sAPP(3. В этих условиях также наблюдается снижение экспрессии и активности амилоид-деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1. Как гипоксия, так и ишемия мозга в целом приводят к изменению баланса ферментов амилоидного метаболизма в сторону накопления амилоидного пептида, что объясняет увеличение риска развития болезни Альцгеймера при ишемии и инсультах.
6. Нейропептид соматостатин, агонист опиоидных рецепторов ДАГО и антиоксидант эпигаллокатехин-3-галлат способны повышать уровень экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 в клетках нейробластомы человека NB7. Направленное увеличение экспрессии и повышение активности этих ферментов предлагается как один из перспективных подходов к профилактике и лечению болезни Альцгеймера.
7. Полученные данные позволяют сформулировать концепцию о динамичности метаболизма амилоидного пептида в ткани мозга в норме и при патологии, о его важной функциональной роли в развитии нервной системы и о возможности его регуляции с помощью различных физиологических и фармакологических агентов (гипоксическое прекондиционирование, биологически активные пептиды и антиоксиданты) с целью предотвращения накопления патологически высоких концентраций амилоидного пептида и нейродегенерации.
СЛОВА БЛАГОДАРНОСТИ
В первую очередь слова глубокой благодарности адресуются моим коллегам И.А. Журавину, С.А. Плесневой, Н.М. Дубровской, H.JI. Тумановой, Б.И. Клементьеву, Е.Г. Кочкиной, С.М. Лавреновой, Л. Фиск, Н. Маковой, Д. Доброте, Е. Бабусиковой, кто принимал участие в выполнении определенных этапов данной работы и критическом анализе полученных результатов, а также профессору Тони Тернеру за неоценимую всестороннюю поддержку и предоставленную возможность работы в его лаборатории.
Особая благодарность выражается моему научному консультанту и руководителю лаборатории д.б.н. Н.Ф. Авровой за знания и опыт, приобретенные за годы работы под ее руководством, а также всем сотрудникам лаборатории нейрохимии Института им. И.М. Сеченова за создание дружеской и творческой атмосферы. Также я не могу не вспомнить моих научных руководителей Ю.П. Глушанкова, Е.П. Харченко и, конечно же, Е.М.Крепса, оказавших на разных этапах большое влияние на мое научное формирование.
Данная работа была бы невыполнима без финансовой поддержки, которую я и коллеги получали за годы работы от различных фондов, включая Российский Фонд Фундаментальных Исследований, Королевское научное общество Великобритании (The Royal Society), ИНТАС и Фонд правительства Словацкой Республики.
И кончено же, самые искренние слова благодарности я адресую моим родителям - Николаю Павловичу и Вере Михайловне Лысенко, которые привили мне такие черты характера, как трудолюбие, терпение и уверенность в себе. Без их любви и веры данный труд и вся моя научная карьера были бы невозможны. Также огромное спасибо моей дочери, зятю и внучке - Екатерине, Владимиру и Марине Кочкиным, за любовь, моральную поддержку и чувство юмора.
Заключение
Проведенное исследование существенно дополняет и расширяет имеющиеся в литературе данные о метаболизме предшественника амилоидного пептида и свойствах ферментов, принимающих участие в секреции его растворимых фрагментов, а также в катаболизме амилоидного пептида Ар. Полученные новые данные об экспрессии АРР и содержании его растворимых форм в ходе онтогенетического развития мозга млекопитающих (крыс) в норме и при патологии (гипоксия и ишемия) свидетельствуют об их важной роли в формировании и функционировании нервной системы. Сопоставление данных, полученных на зооморфных моделях, с результатами исследований, проводимых с использованием культур нейрональных клеток человека при гипоксии и окислительном стрессе, позволяет глубже понять механизмы процессов, протекающих в нервной ткани и оценить уровень и характер изменения экспрессии и активности как ферментов, участвующих в катаболизме АРР, так и способных деградировать амилоидный пептид Ар. В результате проведенного исследования становится очевидным, что амилоидный метаболизм в нервных клетках является динамичным процессом и зависит от условий окружающей среды, в частности, от снабжения клеток кислородом. Это позволяет оценить молекулярные основы повреждающего действия гипоксии и ишемии и их роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и развития болезни Альцгеймера, а также предложить пути их коррекции путем повышения активности ферментов, как расщепляющих АРР по неамилоидогенному пути, так и деградирующих Ар, с помощью фармакологических агентов. Полученные данные свидетельствуют, что регуляция уровня экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 находится под строгим генетическим контролем, изменяющимся с возрастом, и для поиска путей повышения экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 необходимы дальнейшие исследования механизмов регуляции экспрессии генов этих ферментов. Как было показано совсем недавно, одними из факторов, контролирующими экспрессию НЕП могут быть компоненты ферментативного комплекса, приводящего к продукции А(3, а именно пресенилины (Pardossi-Piquard et al., 2005). С этой точки зрения представляет интерес не только углубленное изучение данного феномена, но также анализ механизмов, приводящих к репрессии гена НЕП, наблюдаемое с возрастом. Развитие исследований именно в этом направлении открывает новый этап научных поисков автора.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Наливаева, Наталия Николаевна, Санкт-Петербург
1. Буреш, Я, Бурешова, О, Хьюстон, Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991. 399 с.
2. Дубровкая, Н.М, Потапов, Д.О, Туманова, Н.Л. Влияние пренатальной гипоксии на развитие крыс в постнатальном онтогенезе // Вестн. Мол. Уч. Серия: Науки о жизни. 2002. Т. 4. С. 9-15.
3. Журавин, И.А, Дубровская, Н.М, Туманова, Н.Л. Постнатальное физиологическое развитие у крыс после острой пренатальной гипоксии // Росс. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2003. Т.89. С. 522-532.
4. Журавин, И.А, Толкунов, Б.Ф, Добрылко, А.К. Сравнительный анализ роли второй и первой соматосенсорных областей коры в формировании соматических реакций ретикулярной формации продолговатого мозга крыс /7 Нейрофизиология. 1983. Т. 15, С. 42-49.
5. Журавин, И.А, Дубровская, Н.М, Кочкина, Е.Г, Наливаева, Н.Н, Плеснева, С.А. Роль условий эмбрионального развития в формировании механизмов обучения в онтогенезе млекопитающих // Росс. Физиол. Журн. им. И.М.Сеченова. 2004. Т. 90. С. 173-174.
6. Журавин, И.А, Туманова, Н.Л, Потапов, Д.О. Структурные изменения в сенсомоторной коре мозга в раннем постнатальном онтогенезе крыс, перенесших пренатальную гипоксию // Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 2001. Т.37. С. 518-520.
7. Журавин, И.А., Туманова, Н.Л., Дубровская, Н.М., Федосеева, К.Н. Нарушение формирования старой и новой коры при изменении условий эмбрионального развития//Ж. Эвол. Биохим. Физиол. 2003. Т.39. С. 609-618.
8. Каданцева, А.Г., Журавин, И.А., Толкунов, Б.Ф. Перекрытие в стриатуме областей окончания кортикофугальных волокон из соматосенсорной и моторной зон коры мозга крысы. // Журн. Эвол. Биох. Физиол. 1992. Т.28. С. 2430.
9. Лавренова, С.М., Наливаева, Н.Н., Журавин, И.А. Активность ацетилхолинестеразы сенсомоторной коры в раннем онтогенезе крыс, перенесших пренатальную гипоксию // Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 2003. Т. 39. С. 154-159.
10. Наливаева, Н.Н., Клементьев, Б.И., Плеснева, С.А., Чекулаева, У.Б., Журавин, И.А. Влияние гипоксии на состояние клеточных мембран правого и левого полушария мозга эмбрионов крыс // Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 1998. Т. 34. С. 485-491.
11. Наливаева, Н.Н., Плеснева, С.А., Чекулаева, У.Б., Васильева, Ю.В., Варлинская, Е.И., Клементьев, Б.И. Биохимические характеристики сенсомоторной коры крыс-правшей, левшей и амбидекстров // Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 1996. Т. 32. С. 75-81.
12. Оленев, С.Н. Развивающийся мозг. Л.: Наука. 1978. 220 с.
13. Самойлов М.О. Реакция нейронов на гипоксию. Л.: Наука. 1985. 190 с.
14. Степаничев, М.Ю., Моисеева, Ю.В., Гуляева, Н.В. «Инъекционные» модели болезни Альцгеймера: окислительный стресс в механизме токсичности AF64A и (3-амилоидного пептида у грызунов // Нейрохимия. 2002. Т. 19. С. 165175.
15. Allinson, Т.М., Parkin, Е.Т., Turner, A.J., Hooper, N.M. ADAMs family members as amyloid precursor protein a-secretases // J. Neurosci. Res. 2003. Vol. 74. P. 342-352.
16. Alvarez, J., Moreno, R.D., Llanos, O., Inestrosa, N.C., Brandan, E., Colby, Т., Esch, F.S. Axonal sprouting induced in the sciatic nerve by the amyloid precursor protein (APP) and other antiproteases // Neurosci. Lett. 1992. Vol. 144. P. 130-134.
17. Alzheimer, A. Z. Uber eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde // Allgem. Z. Psych. 1907. Vol. 64. P. 146-148.
18. Alzheimer, A. Uber eigenartige Krankheitsfalle des spateren Alters // Z. Gesamte Neurol. Psych. 1911. Vol. 4. P. 356-385.
19. Appleyard, M.E. Non-cholinergic functions of acetylcholinesterase // Biochem.
20. Soc. T. 1994. Vol. 22. P. 749-755.
21. Appleyard, M.E. Secreted acetylcholinesterase: non-classical aspects of a classical enzyme // Trends Neurosci. 1992. Vol. 15. P. 485-490.
22. Arendt, Т., Bruckner, M.K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development a study of molecular forms // Neurochem. Int. 1992. Vol. 21. P. 381-396.
23. Backstrom, J.R., Lim, G.P., Cullen, M.J., Tokes, Z.A. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) is synthesized in neurons of the human hippocampus and is capable of degrading the amyloid-P peptide (1-40) // J. Neurosci. 1996. Vol. 16. P. 7910-7919.
24. Baiden-Amissah, K., Joashi, U., Blumberg, R., Mehmet, H., Edwards, A.D., Cox, P.M. Expression of amyloid precursor protein (|3-APP) in the neonatal brain following hypoxic ischaemic injury // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1998. Vol. 24. P. 346-352.
25. Barker, P.E., Shipp, M.A., D'Adamio, L., Masteller, E.L., Reinherz, E.L. The common acute lymphoblastic leukemia antigen gene maps to chromosomal region 3 (q21-q27) //J. Immunol. 1989. Vol. 142. P. 283-287.
26. Barnes, K., Turner, A.J. Endothelin converting enzyme is located on (3-actin filaments in smooth muscle cells // Cardiovasc. Res. 1999. Vol. 42. P. 814-822.
27. Barnes, К., Walkden, В.J., Wilkinson, T.C., Turner, A.J. Expression of endothelin-converting enzyme in both neuroblastoma and glial cell lines and its localization in rat hippocampus. J. Neurochem. 1997. Vol. 68. P. 570-577.
28. Bellingham, S. A., Lahiri, D. K., Maloney, В., La Fontaine, S., Multhaup, G., Camakaris, J. Copper depletion down-regulates expression of Alzheimer's disease Amyloid-p precursor protein gene // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 20378-20386.
29. Bennett, B.D., Babu-Khan, S., Loeloff, R., Louis, J.C., Curran, E., Citron, M., Vassar, R. Expression analysis of BACE2 in brain and peripheral tissues // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 20647-20651.
30. Bigl, M., Apelt, J., Eschrich, K., Schliebs, R. Cortical glucose metabolism is altered in aged transgenic Tg2576 mice that demonstrate Alzheimer plaque pathology III Neural. Transm. 2003. Vol. 110. P. 77-94.
31. Bour A., Little S., Dodart J.C., Kelche C., Mathis C. A secreted form of the p-amyloid precursor protein (sAPP695) improves spatial recognition memory in OF1 mice // Neurobiol. Learn. Mem. 2004. Vol. 81. P. 27-38.
32. Boussaha, M., Hannequin, D., Verpillat, P., Brice, A., Frebourg, Т., Campion, D. Polymorphisms of insulin degrading enzyme gene are not associated with Alzheimer's disease //Neurosci. Lett. 2002. Vol. 329. P. 121-123.
33. Bronfman, F.C., Fernandez, H.L., Inestrosa, N.C. Amyloid precursor protein fragment and acetylcholinesterase increase with cell confluence and differentiation in a neuronal cell line // Exp. Cell Res. 1996. Vol. 229. P. 93-99.
34. Bush, A.I. and Tanzi, RE. The galvanization of B-amyloid in Alzheimer's disease //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. Vol. 99. P. 7317-7319.
35. Butterfield, D.A., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid (3-peptide // Trends Mol. Med. 2002. Vol. 7. P. 548-554.
36. Caccamo, A., Oddo, S., Sugarman, M.C., Akbari, Y., LaFerla, F.M. Age- and region-dependent alterations in A(3-degrading enzymes: implications for Ap-induced disorders // Neurobiol. Aging. 2005. Vol. 26. P. 645-654.
37. Caille, I., Allinquant, В., Dupont, E., Bouillot, C., Langer, A., Muller, U., Prochiantz, A. Soluble form of amyloid precursor protein regulates proliferation of progenitors in the adult subventricular zone // Development. 2004. Vol. 131. P. 21732181.
38. Carlson, K. & Ehrich, M. Human neuroblastoma cell viability and growth are affected by altered culture conditions // In Vitr. Mol. Toxicol. 2000. Vol. 13. P. 249262.
39. Carson, J.A, Turner, A.J. (3-amyloid catabolism: role for neprilysin (NEP) and other metallopeptidases? // J. Neurochem. 2002. Vol. 81. P. 1-8.
40. Connelly, J.C, Skidgel, R.A, Schulz, W.W, Johnson, A.R, Erdos, E.G. Neutral endopeptidase 24.11 in human neutrophils: Cleavage of chemotactic peptide // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985. Vol. 82. P. 8737-8741.
41. Conti, L, Cattaneo, E. Controlling neural stem cell division within the adult subventricular zone: an APPealing job // Trends Neurosci. 2005. Vol. 28. P. 57-59.
42. Cuevas, P, Gutierrez Diaz, J.A, Dujovny, M, Diaz, F.G, Ausman, J.I. Freeze-fracture cytochemistry of cholesterol content in neuronal plasma membrane following cerebral ischaemia // Neurol. Res. 1988. Vol. 10. P. 2-6.
43. Cummings, J.L. & Back, C. The cholinergic hypothesis of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease // Am. J. Geriatr. Psychiatry. 1998. Vol. 6, Suppl. 1. P. 64-78.
44. De Strooper, В. Aph-1, Pen-2 and Nicastrin with Presenilin generate an active y-Secretase complex//Neuron. 2003. Vol. 38. P. 9-12.
45. Di Legge, S., Hachinski, V. Prospects for prevention and treatment of vascular cognitive impairment // Curr. Opin. Invest. Drugs. 2003. Vol. 4. P. 1082-1087.
46. Dolinak, D., Smith, C., Graham, D. I. Global hypoxia per se is an unusual cause of axonal injury // ActaNeuropathol. (Berl). 2000. Vol. 100. P. 553-560.
47. Dore, S., Kar, S., Rowe, W., Quirion, R. Distribution and levels of 125I.IGF-I, [125I]IGF-II and [125I]insulin receptor binding sites in the hippocampus of aged memory-unimpaired and-impaired rats//Neuroscience. 1997. Vol. 80. P. 1033-1040.
48. Duckworth, W.C., Bennett, R.G., Hamel, F.G. Insulin degradation: progress and potential//Endocr. Rev. 1998. Vol. 19. P. 608-624.
49. Eckman, E.A., Reed, D.K., Eckman, C.B. Degradation of the Alzheimer's amyloid p peptide by endothelin-converting enzyme // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 24540-24548.
50. Eckman, E.A., Watson, M., Marlow, L., Sambamurti, K., Eckman, C.B. Alzheimer's disease P-amyloid peptide is increased in mice deficient in endothelin-converting enzyme //J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 2081-2084.
51. Egashira, N., Iwasaki, K., Ishibashi, M., Hatip-Al-Khatib, I., Wolozin, В., Mishima, K., Irie, K., Fujiwara, M. Hypoxia enhances P-amyloid-induced apoptosis in rat cultured hippocampal neurons // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 321-327.
52. Ehehalt, R., Keller, P., Haass, C., Thiele, C., Simons, K. Amyloidogenic processing of the Alzheimer p-amyloid precursor protein depends on lipid rafts // J. Cell Biol. 2003. Vol. 160. P. 113-123.
53. Ehrich, M. and Veronesi, B. Esterase comparison in neuroblastoma cells ofhuman and rodent origin// Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1995. Vol. 22. P. 385-386.
54. Ehrich, M, Corell, L., Veronesi, B. Acetylcholinesterase and neuropathy targetesterase inhibitions in neuroblastoma cells to distinguish organophosphoruscompounds causing acute and delayed neurotoxicity // Fund. Appl. Toxicol. 1997.1. Vol. 38. P. 55-63.
55. El-Agnaf, O.M., Mahil, D.S., Patel, B.P., Austen, B.M. Oligomerization and toxicity of P-amyloid-42 implicated in Alzheimer's disease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 273. P. 1003-1007.
56. Ellman, G.L., Courtney, K.D., Andres, V., Jr., Featherstone, R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. Vol. 7. P. 88-95.
57. Emoto, N., Yanagisawa, M. Endothelin-converting enzyme-2 is a membrane-bound, phosphoramidon-sensitive mettaloprotease with acidic pH optimum // J. Biol.Chem. 1995. Vol. 270. P. 15262-15268.
58. Erdos, E.G., Skidgel, R.A. Neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and related regulators of peptide hormones // FASEB J. 1989. Vol. 3. P. 145-151.
59. Ertekin-Taner, N., Graff-Radford, N., Younkin, L.H., Eckman, C., Baker, M., Adamson, J., Ronald, J., Blangero, J., Hutton, M., Younkin, S.G. Linkage of plasma
60. A(342 to a quantitative locus on chromosome 10 in late-onset Alzheimer's disease pedigrees // Science. 2000. Vol. 290. P. 2303-2304.
61. Evangelopoulos, M.E., Weis, J., Kruttgen, A. Signalling pathways leading to neuroblastoma differentiation after serum withdrawal: HDL blocks neuroblastoma differentiation by inhibition of EGFR// Oncogene. 2005. Vol. 24. P. 3309-3318.
62. Facchinetti, P., Rose, C., Schwartz, J.C., Ouimet, T. Ontogeny, regional and cellular distribution of the novel metalloprotease neprilysin 2 in the rat: a comparison with neprilysin and endothelin-converting enzyme-1. Neuroscience. Vol. 118. P. 627639.
63. Fahlman, C.S., Bickler, P.E., Sullivan, В., Gregory, G.A. Activation of the neuroprotective ERK signaling pathway by fructose-1,6-bisphosphate during hypoxia involves intracellular Ca2+ and phospholipase С // Brain Res. 2002. Vol. 958. P. 4351.
64. Farooqui A.A., Ong W.Y., Horrocks L.A. Biochemical aspects of neurodegeneration in human brain: involvement of neural membrane phospholipids and phospholipases A2 //Neurochem. Res. 2004. Vol. 29. P. 1961-1977.
65. Fifkova E., Marsala J. Stereotaxic atlases for the cat, rabbit and rat // In: Elecrophysiological methods in biological research / Eds J. Bures, M. Petran, J. Zahar. Prague: Academia. 1967. P. 653-695.
66. Fisk, L., Nalivaeva, N.N., Turner, A.J. The metallopeptidase neprilysin is shed from human neuroblastoma cells //31st Lome Protein Conference. 2006. P. 88.
67. Fuentes, M.E., Inestrosa, N.C. Amphiphilic behavior of a brain tetrameric acetylcholinesterase form lacking the plasma membrane anchoring domain // Brain Res. 1992. Vol. 580. P. 1-5.
68. Fulcher, I.S., Matsas, R, Turner, A.J., Kenny, A.J. Kidney neutral endopeptidase and the hydrolysis of enkephalin by synaptic membranes show similar sensitivity to inhibitors // Biochem. J. 1982. Vol. 203. P. 519-522.
69. Gasparini, L., Xu, H. Potential roles of insulin and IGF-1 in Alzheimer's disease // Trends Neurosci. 2003. Vol. 26. P. 404-406.
70. Ge, Y.-W. & Lahiri, D. K. Regulation of promoter activity of the APP gene by cytokines and growth factors: implications in Alzheimer's disease // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. Vol. 973. P. 463-467.
71. Ghiso, J., Shayo, M., Calero, M., Ng, D., Tomidokoro, Y., Gandy, S, Rostagno, A., Frangione, B. Systemic catabolism of Alzheimer's A340 and A[342 // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 45897-45908.
72. Golomb, J., de Leon, M.J., Kluger, A., George, A.E., Tarshish, C., Ferris, S.H. Hippocampal atrophy in normal aging. An association with recent memory impairment // Arch. Neurol. 1993. Vol. 50. P. 967-973.
73. Grasemann, H., Lu, В., Jiao, A., Boudreau, J., Gerard, N.P., De Sanctis, G.T. Targeted deletion of the neutral endopeptidase gene alters ventilatory responses to acute hypoxia in mice//J. Appl. Physiol. 1999. Vol. 87. P. 1266-1271.
74. Gregory, G.C., & Halliday, G.M. What is the dominant A3 species in human brain tissue? A review // Neurotox. Res. 2005. Vol. 7. P. 29-41.
75. Grossman, H. Does diabetes protect or provoke Alzheimer's disease? Insights into the pathobiology and future treatment of Alzheimer's disease // CNS Spectr. 2003. Vol. 8. P. 815-823.
76. Gunyuzlu, P.L., White, W.H, Davis, G.L., Hollis, G.F, Toyn, J.H. A yeast genetic assay for caspase cleavage of the amyloid-P precursor protein // Mol. Biotechnol. 2000. Vol. 15. P. 29-37.
77. Haass, C, Schlossmacher, M.G, Hung, A.Y, Vigo-Pelfrey, C, Mellon, A, Ostaszewski, B.L, Lieberburg, I, Koo, E.H, Schenk, D, Teplow, D.B. Amyloid Ppeptide is produced by cultured cells during normal metabolism // Nature. 1992. Vol, 359. P. 322-325.
78. Hardy, J. Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease // Trends Neurosci. 1997. Vol. 20. P. 154-159.
79. Harrison, N.K, Dawes, K.E, Kwon, O.J, Barnes, P.J, Laurent, G.J, Chung, KF. Effects of neuropeptides on human lung fibroblast proliferation and chemotaxis // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. P. L278-L283.
80. Heldin, C.H, Ericsson, J. Signal transduction. RIPping tyrosine kinase receptors apart// Science. 2001. Vol. 294. P. 2111-2113.
81. Hoang, M.V, Turner, A.J. Novel activity for endothelin-converting enzyme: hydrolysis of bradykinin // Biochem. J. 1997. Vol. 327. P. 23-26.
82. Hong, C.S, Goins, W.F, Goss, J.R, Burton, E.A, Glorioso, J.C. Herpes simplex virus RNAi and neprilysin gene transfer vectors reduce accumulation of
83. Alzheimer's disease-related amyloid-(3 peptide in vivo // Gene Ther. 2006. Mar 16; Epub ahead of print.
84. Hong, L., Koelsch, G., Lin, X., Wu, S., Terzyan, S., Ghosh, A.K., Zhang, X.C. and Tang, J. Structure of the protease domain of memapsin 2 ((3-secretase) complexed with inhibitor// Science. 2000. Vol. 290. P. 150-153.
85. Hooper, N.M. Families of zinc metalloproteases // FEBS Lett. 1994. Vol. 354. P. 1-6.
86. Hooper, N.M. & Turner, A.J. The search for a-secretase and its potential as a therapeutic approach to Alzheimer s disease // Curr. Med. Chem. 2002. Vol. 9. P. 1107-1119.
87. Hooper, N.M., Karran, E.H., Turner, A.J. Membrane protein secretases // Biochem. J. 1997. Vol. 321. P. 265-279.
88. Hoshino, M., Dohmae, N., Takio, K., Kanazawa, I., Nukina, N. Identification of a novel amino-terminal fragment of amyloid precursor protein in mouse neuroblastoma Neuro2a cell//Neurosci. Lett. 2003. Vol. 353. P. 135-138.
89. Hoyer S. Glucose metabolism and insulin receptor signal transduction in Alzheimer disease // Eur. J. Pharmacol. 2004. Vol. 490. P. 115-125.
90. Hu, J., Igarashi, A., Kamata, M., Nakagawa, H. Angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid (3-peptide (A(3); retards A(3 aggregation, deposition, fibril formation; and inhibits cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 47863-47868.
91. Janicke, В., Coper, H. The effect of prenatal exposure to hypoxia on the bahaviour of rats during their life span // Pharmacol. Biochem. Behav. 1994. Vol. 48. P. 863-873.
92. Jin, К., Мао, X.O., Eshoo, M.W., Nagayama, Т., Minami, M., Simon, R.P., Greenberg, D.A. Microarray analysis of hippocampal gene expression in global cerebral ischemia // Ann. Neurol. 2001. Vol. 50. P. 93-103.
93. Johnson, G.D., Stevenson, Т., Ahn, K. Hydrolysis of peptide hormones by endothelin-converting enzyme-1. A comparison with neprilysin. J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 4053-4058.
94. Jolly-Tornetta, С. & Wolf, В.A. Protein kinase С regulation of intracellular and cell surface amyloid precursor protein (APP) cleavage in CH0695 cells // Biochemistry. 2000. Vol. 39. P. 15282-15290.
95. Kaether C. & Haass C. A lipid boundary separates APP and secretases and limits amyloid P-peptide generation // J. Cell. Biol. 2004. Vol. 167. P. 809-812.
96. Kanemitsu, H., Tomiyama, Т., Mori, H. Human neprilysin is capable of degrading amyloid (3 peptide not only in the monomeric form but also the pathological oligomeric form. Neurosci. Lett. 2003. Vol. 350. P. 113-116.
97. Kern, A., Roempp, В., Prager, K., Walter, J., Behl, C. Down-regulation of endogenous amyloid precursor protein processing due to cellular aging // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 281. P. 2405-2413
98. Killar, L., White, J., Black,, R., Peschon, J. Adamalysins. A family of metzincins including TNF-alpha converting enzyme (TACE) // Arm. N. Y. Acad. Sci. 1999. Vol. 878. P. 442-452.
99. Kimberly, W.T, Xia, W., Rahmati, Т., Wolfe, M.S., Selkoe, D.J. The transmembrane aspartates in presenilin 1 and 2 are obligatory for y-secretase activity and amyloid р-protein generation// J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 3173-3178.
100. Kingston, I. В., Castro, M.J.M., Anderson, S.A. In vitro stimulation of tissue-type plasminogen activator by Alzheimer amyloid р-peptide analogues // Nature Med. 1995. Vol. l.P. 138-142.
101. Khachaturian, Z.S. Diagnosis of Alzheimer's disease // Arch. Neurol. 1985. Vol. 42. P. 1097-1105.
102. Khaspekov, L.G., Lyzhin, A.A., Victorov, I.V., Dupin, A.M., Erin, A.N. Hypoxic and posthypoxic neuronal injury in hippocampal cell culture: attenuation by lipophylic antioxidant U-18 and superoxide dismutase // Int. J. Neurosci. 1995. Vol. 82. P. 33-45.
103. Koudinov, A.R. & Berezov, T.T. Alzheimer's amyloid-(3 (Af3) is an essential synaptic protein, not neurotoxic junk // Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 2004. Vol. 64. P. 71-79.
104. Kowalska, A. Amyloid precursor protein gene mutations responsible for early-onset autosomal dominant Alzheimer's disease // Folia Neuropathol. 2003. Vol. 41. P. 35-40.
105. Kristian, T. Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage // Cell Calcium. 2004. Vol. 36. P. 221-233.
106. Kumar, G.K., Yu, R.K., Overholt, J.L., Prabhakar, N.R. Role of substance P in neutral endopeptidase modulation of hypoxic response of the carotid body // Adv. Exp. Med. Biol. 2000a. Vol. 475. P. 705-713.
107. Kuperstein, F., Brand, A., Yavin, E. Amyloid Aj3M() preconditions non-apoptotic signals in vivo and protects fetal rat brain from intrauterine ischemic stress // J. Neurochem. 2004. Vol. 91. P. 965-974.
108. Kurochkin, I.V. & Goto, S. Alzheimer's p-amyloid peptide specifically interacts with and is degraded by insulin degrading enzyme// FEBS Lett. 1994. Vol 345. P. 33-37.
109. Madani, R., Nef, S., Vassalli, J.D. Emotions are building up in the field of extracellular proteolysis // Trends Mol. Med. 2003. Vol. 9. P. 183-185.
110. Maldonado, Т. A., Jones, R. E., Norris, D. O. Intraneuronal amyloid precursor protein (APP) and appearance of extracellular (3-amyloid peptide (A|3) in the brain of aging kokanee salmon // J. Neurobiol. 2002. Vol. 53. P. 11-20.
111. Malfroy, В., Swerts, J.P., Guyon, A., Roques, B.P., Schwartz, J.C. High-affinity enkephalin-degrading peptidase in brain is increased after morphine // Nature. 1978. Vol. 276. P. 523-526.
112. Maloney, В., Ge, Y.W., Greig, N., Lahiri, D.K. Presence of a "CAGA box" in the APP gene unique to amyloid plaque-forming species and absent in all APLP-1/2 genes: implications in Alzheimer's disease // FASEB J. 2004. Vol. 18. P. 1288-1290.
113. Mapp, P.I., Walsh, D.A., Kidd, B.L., Cruwys, S.C., Polak, J.M, Blake, D.R. Localization of the enzyme neutral endopeptidase to the human synovium // J. Reumatol. 1992. Vol. 19. P. 1838-1844.
114. Marr, R.A., Rockenstein, E., Mukherjee, A., Kindy, M.S., Hersh, L.B., Gage, F.H., Verma, I.M., Masliah, E. Neprilysin gene transfer reduces human amyloid pathology in transgenic mice // J. Neurosci. 2003. Vol. 23. P. 1992-1996.
115. Martin, В., de Maturana, R.L., Brenneman, R., Walent, Т., Mattson, M.P., Maudsley, S. Class II G protein-coupled receptors and their ligands in neuronal function and protection//Neuromolecular Med. 2005. Vol. 7. P. 3-36.
116. Martoglio, B. & Golde, Т.Е. Intramembrane-cleaving aspartic proteases and disease: presenilins, signal peptide peptidase and their homologs // Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 12. Suppl. 2. P. R201-R206.
117. Matsas, R., A.J. Kenny, Turner, A.J. An immunohistochemical study of endopeptidase-24.11 ("enkephalinase") in the pig nervous system // Neuroscience. 1986. Vol. 18. P. 991-1012.
118. Matsumura Y, Ikegawa R, Takaoka M, Morimoto S. Conversion of porcine big endothelin to endothelin by an extract from the porcine aortic endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. Vol. 167. P. 203-210.
119. Mattson, M.P. Cellular action of (3-amyloid precoursor protein and its soluble and fibrillogenic derivatives // Physiol. Rev. 1999. Vol. 77. P. 1081-1132.
120. Mattson, M.P., Guo, Q., Furukawa, K., Pedersen, W.A. Presenilins, the endoplasmic reticulum, and neuronal apoptosis in Alzheimer's disease // J. Neurochem. 1998. Vol. 70. P. 1-14.
121. Mattson, M.P., Duan, W., Pedersen, W.A., Culmsee, C. Neurodegenerative disorders and ischemic brain diseases // Apoptosis. 2001. Vol. 6. P. 69-81.
122. Mattson, M. Pathways towards and away from Alzheimer's disease // Nature. 2004. Vol. 430. P. 631-639.
123. McKee, A.C., Kowall, N.W., Schumacher, J.S., Beal, M.F. The neurotoxicity of amyloid (3 protein in aged primates // Amyloid. 1998. Vol. 5. P. 1-9.
124. Mehta, P.D., Pirttila, Т., Patrick, B.A., Barshatzky, M., Mehta, S.P. Amyloid (3 protein 1-40 and 1-42 levels in matched cerebrospinal fluid and plasma from patients with Alzheimer's disease //Neurosci. Letters. 2001. Vol. 304. P. 102-106.
125. Mehlhorn, G., Hollborn, M., Schliebs, R. Induction of cytokines in glial cells surrounding cortical (3-amyloid plaques in transgenic Tg2576 mice with Alzheimer's pathology // Int. J. Dev. Neurosci. 2000. Vol. 18. P. 423-431.
126. Melzig, M.F. & Janka, M. Enhancement of neutral endopeptidase activity in SK-N-SH cells by green tea extract // Phytomedicine. 2003. Vol. 10. P. 494-498.
127. Montine, T.J., Neely, M.D., Quinn, J.F., Beal, M.F., Markesbery, W.R., Roberts, L.J., Morrow, J.D. Lipid peroxidation in aging brain and Alzheimer's disease // Free Radic. Biol. Med. 2002. Vol. 33. P. 620-626.
128. Moran, M.A., Mufson, E.J., Gomezramos, P. Colocalization of cholinesterases with (3 amyloid protein in aged and Alzheimer's brains. // Acta Neuropathol. 1993. Vol. 85. P. 362 -369.
129. Mori, H., Takio, K., Ogawara, M., Selkoe, D.J. Mass spectrometry of purified amyloid (3 protein in Alzheimer's disease // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 1708217086.
130. Mrak, R.E. & Griffin, W.S. Glia and their cytokines in progression of neurodegeneration //Neurobiol. Aging. 2005. Vol. 26. P. 349-354.
131. Munoz, F.J. & Inestrosa, N.C. Neurotoxicity of acetylcholinesterase amyloid (3-peptide aggregates is dependent on the type of A(3 peptide and the AChE concentration present in the complexes // FEBS Lett. 1999. Vol. 450. P. 205-209.
132. Nakagami, Y., Abe, K., Nishiyama, N., Matsuki, N. Laminin degradation by plasmin regulates long-term potentiation// J. Neurosci. 2000. Vol. 20. P.2003-2010.
133. Nalivaeva N.N., Fisk L., Canet Aviles R.M., Plesneva S.A., Zhuravin I.A., Turner A.J. Effect of prenatal hypoxia on expression of amyloid precursor protein and metallopeptidases in the rat brain // Lett. Peptide Sci. 2003. Vol. 10. P. 455-462.
134. Nawrot, B. Targeting В ACE with small inhibitory nucleic acids a future for Alzheimer's disease therapy? //Acta Biochim. Pol. 2004. Vol. 51. P. 431-444.
135. Nocolls, M.R. The clinical and biological relationship between Type II diabetes mellitus and Alzheimer's disease // Curr. Alzheimer Res. 2004. Vol. 1. P. 47-54.
136. Nyakas, C., Buwalda, B. Luiten P. G. Hypoxia and brain development // Prog. Neurobiol. 1996. Vol. 49. P. 1-51.
137. Oddo, S, Caccamo, A, Kitazawa, M, Tseng, B.P, LaFerla, F.M. Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple transgenic model of Alzheimer's disease//Neurobiol. Aging. 2003. Vol. 24. P. 1063-1070.
138. Oddo, S. & LaFerla, F.M. The role of nicotinic acetylcholine receptors in Alzheimer's disease // J. Physiol. Paris. 2006. Vol. 99. P. 172-179.
139. Oh-hashi, K, Nagai, T, Tanaka, T, Yu, H, Hirata, Y, Kiuchi, K. Determination of hypoxic effect on neprilysin activity in human neuroblastoma SH-SY5Y cells using a novel HPLC method // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 334. P. 380-385.
140. Okamoto, T, Takeda, S, Murayama, Y, Ogata, E, Nishimoto, I. Ligand-dependent G protein coupling function of amyloid transmembrane precursor // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 4205-4208.
141. Ouimet, T, Facchinetti, P, Rose, C, Bonhomme, M.C, Gros, C. Schwartz, J.C. Neprilysin II: a putative novel metalloprotease and its isoforms in CNS and testis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 271. P. 565-570.
142. Pahlsson, P, Shakin-Eshleman, S.H, Spitalnik, S.L. N-linked glycosylation of |3-amyloid precursor protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. Vol. 189. P. 1667-1673.
143. Palmer, A.M., DeKosky, S.T. Monoamine neurons in aging and Alzheimer's disease // J. Neural. Transm. Gen. Sect. 1993. Vol. 91. P. 135-159.
144. Parvathy, S, Hussain, I, Karran, E.H, Turner, A.J, Hooper, N.M. Cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by a-secretase occurs at the surface of neuronal cells // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 9728-9734.
145. Perez, A, Morelli, L, Cresto, J.C, Castano, E.M. Degradation of soluble amyloid P-peptides 1-40, 1-42, and the Dutch variant 1-40Q by insulin degrading enzyme from Alzheimer disease and control brains // Neurochem. Res. 2000. Vol. 2. P. 247-255.
146. Perry, T.A, Greig, N.H. A new Alzheimer's disease interventive strategy: GLP-1. Curr. Drug. Targets. 2004. Vol. 5. P. 565-571.
147. Petty, M.A. & Wettstein, J.G. Elements of cerebral microvascular ischaemia // Brain Res. Brain Res. Rev. 2001. Vol. 36. P. 23-34.
148. Pfefferkorn, Т., Wiessner, C., Allegrini, P.R., Staufer, В., Vosko, M.R., Liebetrau, M., Bueltemeier, G., Kloss, C.U., Hamarm, G.F. Plasminogen activation in experimental permanent focal cerebral ischemia // Brain Res. 2000. Vol. 882. P. 1925.
149. Pierart, M.E., Najdovski, Т., Appelboom, Т.Е., Deschodt-Lanckman, M.M. Effect of human endopeptidase 24.11 ("enkephalinase") on IL-1-induced thymocyte proliferation activity//J. Immunol. 1988. Vol. 140. P. 3808-3811.
150. Pighetti, M., Tommaselli, G.A., D'Elia, A., Di Carlo, C., Mariano, A., Di Carlo, A., Nappi, C. Maternal serum and umbilical cord blood leptin concentrations with fetal growth restriction // Obstet. Gynecol. 2003. Vol. 102. P. 535-543.
151. Prince, J.A., Feuk, L., Gu, H.F., Johansson, В., Gatz, M., Blennow, K., Brookes, A.J. Genetic variation in a haplotype block spanning IDE influences Alzheimer disease // Hum. Mutat. 2003. Vol. 22. P. 363-371.
152. Pulsinelli, W.A., Levy, D.E., Duffy, Т.Е. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model // Stroke. 1983. Vol. 14. P. 832-834.
153. Qi, Y., Jamindar, T.M., Dawson, G. Hypoxia alters iron homeostasis and induces ferritin synthesis in oligodendrocytes // J. Neurochem. 1995. Vol. 64. P. 2458-2464.
154. Racchi, M. & Govoni, S. The pharmacology of amyloid precursor protein processing //Exp. Gerontol. 2003. Vol 38. P. 145-157.
155. Racchi, M., Solano, D.C., Sironi, M., Govoni, S. Activity of a-secretase as the common final effector of protein kinase C-dependent and -independent modulation of amyloid precursor protein metabolism// J. Neurochem. 1999. Vol. 72. P. 2464-2470.
156. Raiha, I., Kaprio, J., Koskenvuo, M., Rajala, Т., Sourander, L. Environmental differences in twin pairs discordant for Alzheimer's disease // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1998. Vol. 65. P. 785-787.
157. Rangan, S.K., Liu, R., Brune, D., Planque, S., Paul, S., Sierks, M.R. Degradation of p-amyloid by proteolytic antibody light chains // Biochemistry. 2003. Vol. 42. P. 14328-14334.
158. Robert, S., Maillet, M., Morel, E., Launay, J.M., Fischmeister, R, Mercken, L., Lezoualc'h, F. Regulation of the amyloid precursor protein ectodomain shedding by the 5-HT4 receptor and Epac // FEBS Lett. 2005. Vol. 579. P. 1136-1142.
159. Roques, B.P., Noble, F., Dauge, V., Fournie-Zaluski, M.C., Beaumont, A. Neutral endopeptidase 24.11: Structure, inhibition, and experimantal and clinical pharmacology// Pharmacol. Rev. 1993. Vol. 45. P. 87-146.
160. Ryder, J., Su, Y., Liu, F., Li, В., Zhou, Y., Ni, B. Divergent roles of GSK3 and CDK5 in APP processing // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 312. P. 922-999.
161. Saito, Т., Takaki, Y., Iwata, N., Trojanowski, J., Saido, T.C. Alzheimer's disease, neuropeptides, neuropeptidase, and amyloid-P peptide metabolism // Sci. Aging Knowledge Environ. 2003. Vol. 3. P. El.
162. Saito, Т., Iwata, N., Tsubuki, S., Takaki, Y., Takano, J., Huang, S.M., Suemoto, Т., Higuchi, M., Saido, T.C. Somatostatin regulates brain amyloid 3 peptide Af342 through modulation of proteolytic degradation // Nat. Med. 2005. Vol. 11. P. 434-439.
163. Sales, N, Dutriez, I, Maziere, B, Ottaviani, M, Roques, B.P. Neutral endopeptidase 24.11 in rat peripheral tissues: comparative localization by 'ex vivo' and 'in vitro' autoradiography // Regul. Pept. 1991. Vol. 33. P. 209-222.
164. Sayre, L.M, Zelasko, D.A, Harris, P.L, Perry, G, Salomon, R.G, Smith, M.A. 4-Hydroxynonenal-derived advanced lipid peroxidation end products are increased in Alzheimer's disease // J. Neurochem. 1997. Vol. 68. P. 2092-2097.
165. Sberna, G, Saez-Valero, J, Li, Q.-X, Czech, C, Beyreuther, K, Masters, C.L,
166. Mclean, C.A, Small, D.H. Acetylcholinesterase is increased in the brains oftransgenic mice expressing the C-terminal fragment (CT100) of the (3-amyloid proteinprecursor of Alzheimer's disease // J. Neurochem. 1998. Vol. 71. P. 723-731.
167. Schmitz, A, Schneider, A, Kummer, M.P, Herzog, V. Endoplasmic reticulum-localized amyloid (3-peptide is degraded in the cytosol by two distinct degradation pathways // Traffic. 2004. Vol. 5. P. 89-101.
168. Schweizer, A, Valdenaire, O, Nelbock, P, Deuschle, U, Dumas, M, Edwards, J.B, Stumpf, J.G, Loffler, B.M. Human endothelin converting enzyme (ECE-1): Three isoforms with distinct subcellular localizations // Biochem. J. 1997. Vol. 328. P. 871-877.
169. Selkoe, D.J. Altered structural proteins in plaques and tangles: what do they tell us about the biology of Alzheimer's disease? // Neurobiol. Aging. 1986. Vol. 7. P. 425-432.
170. Selkoe, D.J. The cell biology of p-amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer's Disease // Trends Cell Biol. 1998. Vol. 8. P. 447-453.
171. Seta, K.A. & Roth, R.A. Overexpression of insulin degrading enzyme: cellular localization and effects on insulin signalling // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 231. P. 167-171.
172. Shen, J, Bronson, R.T, Chen, D.F, Xia, W, Selkoe, D.J, Tonegawa, S. Skeletal and CNS defects in Presenilin-1-deficient mice // Cell. 1997. Vol. 89. P. 629639.
173. Shirotani, K, Edbauer, D, Prokop, S, Haass, C, Steiner, H. Identification of distinct y-secretase complexes with different APH-1 variants // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 41340-41345.
174. Shivers, B.D., Hilbich, С., Multhaup, G., Salbaum, M., Beyreuther, K., Seeburg, P. H. Alzheimer's disease amyloidogenic glycoprotein: expression pattern in rat brain suggests a role in cell contact // EMBO J. 1988. Vol. 7. P. 1365-1370.
175. Small, D. Acetylcholinesterase inhibitors for the treatment of dementia in Alzheimer's disease: do we need new inhibitors? // Expert Opin. Emerg. Drugs. 2005. Vol. 10. P. 817-825.
176. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid // Anal. Biochem. 1985. Vol. 150. P. 76-85.
177. Souren, L.E., Franssen, E.H., Reisberg, B. Neuromotor changes in Alzheimer's disease: implications for patient care // J. Geriatr. Psychiatry. Neurol. 1997. Vol. 10. P. 93-98.
178. Sprecher, C.A., Grant, F.J., Grimm, G., O'Hara, P.J., Norris, F., Norris, K.3 Foster, D.C. Molecular cloning of the cDNA for a human amyloid precursor protein homolog: evidence for a multigene family // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 44814486.
179. Takahashi, M., Matsushita, Y., Iijima, Y., Tanzawa, K. Purification and characterization of endothelin converting enzyme from rat lung // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 21394-21398.
180. Tarn, H., Yoshikawa, K., Suzuki, T. Suppression of the caspase cleavage of P-amyloid precursor protein by its cytoplasmic phosphorylation // FEBS Lett. 2004. Vol. 567. P. 248-252.
181. Toescu, E.C. & Verkhratsky, A. Ca2+ and mitochondria as substrates for deficits in synaptic plasticity in normal brain ageing // J. Cell. Mol. Med. 2004. Vol. 8. P. 181-190.
182. Tong, Y., Zhou, W., Fung, V., Christensen, M.A., Qing, H., Sun, X., Song, W. Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and A(3 generation // J. Neural. Transm. 2005. Vol. 112. P. 455-469.
183. Tran-Paterson, R., Willard, H.F., Letarte, M. The common acute lymphoblastic leukemia antigen (neutral endopeptidase-3.4.24.11) gene is located on human chromosome 3 // Cancer Genet. Cytogenet. 1989. Vol. 42. P. 129-134.
184. Tsirka, S.E., Rogove, A.D., Strickland, S. Neuronal cell death and tPA // Nature. 1996. Vol. 384. P. 123-124.
185. Tucker, H.M., Kihiko-Ehmann, M., Wright, S., Rydel, R.E., Estus, S. Tissue plasminogen activator requires plasminogen to modulate amyloid-(3 neurotoxicity and deposition // J. Neurochem. 2000b. Vol. 75. P. 2172-2177.
186. Tucker, H.M., Kihiko-Ehmann, M., Estus, S. Urokinase-type plasminogen activator inhibits amyloid-p neurotoxicity and fibrillogenesis via plasminogen // J. Neurosci. Res. 2002. Vol. 70. P. 249-255.
187. Turner, A.J. Neuropeptide signalling and cell-surface peptidases // Adv. Second. Messenger Phosphoprotein Res. 1990. Vol. 24. P. 467-471.
188. Turner, A.J., Tanzawa, K. Mammalian membrane metallopeptidases: NEP, ECE, KELL, and PEX // FASEB J. 1997. Vol. 11. P. 355-364.
189. Turner, A.J., Barnes, К., Schweizer, A., Valdenaire, 0. Isoforms of endothelinconverting enzyme: why and where? // Trends Pharmacol. Sci. 1998. Vol. 19. P. 483-486.
190. Turner, P.R., O'Connor, K., Tate, W.P., Abraham, W.C. Roles of amyloid precursor protein and its fragments in regulating neural activity, plasticity and memory // Prog. Neurobiol. 2003. Vol. 70. P. 1-32.
191. Valdenaire, O., Rohrbacher, E., Mattei M.G. Organization of the gene encoding the human endothelin-converting enzyme (ECE-1) // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 29794-29798.
192. Van Nostrand, W.E. & Porter, M. Plasmin cleavage of the amyloid p-protein: alteration of secondary structure and stimulation of tissue plasminogen activator activity//Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 11570-11576.
193. Vassar, R BACE1: the 3-secretase enzyme in Alzheimer's disease // J. Mol Neurosci. 2004. Vol. 23. P. 105-114.
194. Vassar, R. & Citron, M. AB-generating enzymes: recent advances in B- and y-secretases research //Neuron. 2000. Vol. 27. P. 419-422.
195. Vaughan, D.W. & Peters, A. The structure of neuritic plaque in the cerebral cortex of aged rats // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1981. Vol. 40. P. 472-487.
196. Vekrellis, K., Ye, Z, Qiu, W.Q., Walsh, D, Hartley, D., Chesneau, V., Rosner, M.R., Selkoe, D.J. Neurons regulate extracellular levels of amyloid (3-protein via proteolysis by insulin-degrading enzyme // J. Neurosci. 2000. Vol. 20. P. 1657-1665.
197. Wade, J.A., Vaughan, P.F.T., Peers, C. Hypoxia enhances 3H.noradrenaline release evoked by nicotinic receptor activation from the human neuroblastoma SH-SY5Y// J. Neurochem. 1998. Vol. 71. P. 1482-1489.
198. Walker, E.S., Martinez, M., Brunkan, A.L., Goate, A. Presenilin 2 familial Alzheimer's disease mutations result in partial loss of function and dramatic changes in Ap 42/40 ratios // J. Neurochem. 2005. Vol. 92. P. 294-301.
199. Walsh, D.M., Klyubin, I., Fadeeva, J.V., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. Amyloid-beta oligomers: their production, toxicity and therapeutic inhibition // Biochem. Soc. Trans. 2002. Vol. 30. P. 552-557.
200. Wang, D.S., Iwata, N., Hama, E., Saido, T.C., Dickson; D.W. Oxidized neprilysin in aging and Alzheimer's disease brains // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 310. P. 236-241.
201. Wang, Z., Wu, D., Vinters, H.V. Hypoxia and reoxygenation of brain microvascular smooth muscle cells in vitro: cellular responses and expression of cerebral amyloid angiopathy-associated proteins // APMIS. 2002. Vol. 110. P. 423434.
202. Webster, N.J, Green, K.N, Peers, C, Vaughan, P.F. Altered processing of amyloid precursor protein in the human neuroblastoma SH-SY5Y by chronic hypoxia // J. Neurochem. 2002. Vol. 83. P. 1262-1271.
203. Wei, W, Norton, D.D, Wang, X, Kusiak, J.W. Abeta 17-42 in Alzheimer's disease activates JNK and caspase-8 leading to neuronal apoptosis // Brain. 2002. Vol. 125. P. 2036-2043.
204. Weinreb, O, Mandel, S, Amit, T, Youdim, M.B. Neurological mechanisms of green tea polyphenols in Alzheimer's and Parkinson's diseases // J. Nutr. Biochem. 2004. Vol. 15. P. 506-516.
205. Wehner, S, Siemes, C, Kirfel, G, Herzog, V. Cytoprotective function of sAPPalpha in human keratinocytes // Eur. J. Cell Biol. 2004. Vol. 83(11-12)/ Р/ 701708.
206. Weller, R.O, Massey, A, Kuo, Y.M, Roher, A.E. Cerebral amyloid angiopathy: accumulation of A 3 in interstitial fluid drainage pathways in Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. Vol. 903. P. 110-117.
207. Weller, R.O, Yow, H.Y, Preston, S.D, Mazanti, I, Nicoll, J.A. Cerebrovascular disease is a major factor in the failure of elimination of A(3 from the aging human brain // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002. Vol. 977. P. 162-168.
208. Wen, Y, Onyewuchi, 0, Yang, S, Liu, R, Simpkins, J.W. Increased beta-secretase activity and expression in rats following transient cerebral ischemia // Brain Res. 2004. V. 1009. P. 1-8.
209. Werb, Z. ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology // Cell. 1997. Vol. 91. P. 439-442.
210. Wogulis, M, Wright, S, Cunningham, D, Chilcote, T, Powell, K, Rydel, R.E. Nucleation-dependent polymerization is an essential component of amyloid-mediated neuronal cell death // J. Neurosci. 2005. Vol. 25. P. 1071-1080.
211. Xie, L, Helmerhorst, E, Taddei, K, Plewright, B, Van Bronswijk, W, Martins, R. Alzheimer's (3-amyloid peptides compete for insulin binding to the insulin receptor // J. Neurosci. 2002. Vol. 22. P. RC221.
212. Xu, D, Emoto, N, Giaid, A, Slaughter, C, Kaw, S, deWit, D, Yanagisawa, M. ECE-1: a membrane-bound metalloprotease that catalyzes the proteolytic activation of big endothelin-1 // Cell. 1994. Vol. 78. P. 473-485.
213. Yasojima, K, Akiyama, H, McGeer, E.G., McGeer, P.L. Reduced neprilysin in high plaque areas of Alzheimer's brain: a possible relationship to deficient degradation of (3-amyloid peptide // Neurosci. Lett. 2001. Vol. 297. P. 97-100.
214. Yepes, M. & Lawrence, D.A. Tissue-Type Plasminogen Activator and Neuroserpin: A Well-Balanced Act in the Nervous System? // Trends Cardiovasc. Med. 2004. Vol. 14. P. 173-180.
215. Zhang, J.Z., Bebrooz, A., Ismail-Beigi, F. Regulation of glucose transport by hypoxia // Am. J. Kidney Dis. 1999. Vol. 34. P. 189-202.
216. Zhu, G., Wang, D., Lin, Y.H., McMahon, Т., Koo, E.H., Messing, R.O. Protein kinase С 8 suppresses A{3 production and promotes activation of a-secretase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 285. P. 997-1006.
-
Наливаева, Наталия Николаевна
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Механизмы токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты и клетки мозга
- Эффект производных гамма-карболина на прогрессию протеинопатии в трансгенных моделях болезни Альцгеймера
- Механизмы регуляции сократимости миокарда в модели болезни Альцгеймера
- Исследование нейропротекторных свойств фуллеренов С60 на модели болезни Альцгеймера у крыс
- Изучение свойств и регуляции металлопептидазы неприлизина в мозге и плазме крови млекопитающих
