Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гидрофобных взаимодействий в модуляции NMDA рецептор-управляемых ионных каналов в нейтонах гипокампа крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль гидрофобных взаимодействий в модуляции NMDA рецептор-управляемых ионных каналов в нейтонах гипокампа крысы"

Національна Академія Наук України Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

рГ8 0/! 2 1 ФсВ 283!

Лішко Поліна Валеріївна

УДК 612.82:577.1

РОЛЬ ГІДРОФОБНИХ ВЗАЄМОДІЙ У МОДУЛЯЦІЇ ^БА РЕЦЕПТОР-КЕРОВАНИХ ІОННИХ КАНАЛІВ В НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПА ЩУРА

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

г п

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук КРИШТАЛЬ Олег Олександрович

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи ВЕСЕЛОВСЬКИЙ Микола Сергійович (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України)

Доктор біологічних наук, зав. відділом нейрохімії Інституту фізіології ім.

О. О. Богомольця НАН України МАЛИШЕВА Маргарита Константинівна (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України)

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться ”о?Л " ¿ьР/М 2000 р. о " /^ґ " годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий " /& " & 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нейромедіаторна система збуджуючих амінокислот (ЗАК) є основною системою передачі швидкого синаптичного збудження в центральній нервовій системі ссавців. Рецептори збуджуючих амінокислот відіграють ключову роль в чисельних нормальних і патологічних процесах та поділяються на дві великі групи- метаботропні і іонотропні, кожна з яких включає в себе різні типи {Krogsgaard-Larsen and Hansen, 1992}. До іонотропних відносяться: рецептори N-Meran-D-acnapariHOBO'í (NMDA), 2-аміно-3-(3-гідрокси-5-метил-4-ізоксазоліл) пропіонової (АМРА) і каінової кислот, що представлені, в свою чергу, кількома підтипами. Родина метаботропних рецепторів містить вісім підтипів і, на основі даних нейрохімії, фармакології і молекулярної біології, поділяється на три групи {Hollmann & Heinemann, 1994}.

Найбільш детально вивченими є рецептори NMDA- типу. Відомо, що NMDA- рецепторний комплекс відіграє суттєву роль у процесах навчання і пам’яті. NMDA- рецептори є мішенню для терапевтичних заходів при таких хронічних дегенеративних захворюваннях як хвороба Альцгеймера, хорея Гентінгтона, синдром Паркінсона і нейронні пошкодження при ВІЛ-2 {Foster & Fagg, 1987}, {Danysz, Parsons, et al., 1995}.

Блокатори NMDA- рецепторів можуть використовуватись в терапії для лікування від опіатної та морфінової залежності {Bespalov, Dumpis, et al., 1994}, {Wolf & Jeziorski, 1993}. На жаль, високоафінним блокаторам NMDA- рецепторів притаманна сильна нейротоксичність, тому їх використання в терапії є неможливим. Показано, що ефективні нейропротекторні агенти повинні мати низьку спорідненість до NMDA- рецептора і швидко звільняти іонний канал при фізіологічному миттєвому збільшенні концентрації глутамату в синаптичній щілині до мілімолярних концентрацій.

Деякі антагоністи глутаматних рецепторів знаходились на клінічних випробуваннях як протисудомні та протиішемічні засоби. Однак, хоча ці сполуки

і виявили чималі нейропротекторні властивості, значна кількість побічних ефектів ускладнює їх клінічне використання. В зв'язку із цим зросла зацікавленість до сполук, що діють на різні підтипи рецепторів збуджуючих амінокислот і проявляють властивості часткових агоністів {Kew, Trübe, et al.» 1998}, {Ebert, Madsen, et al., 1996}. Саме тому пошук нових лігандів NMDA-рецепторів є досить актуальною задачою.

Модельним об’єктом таких досліджень може служиш гіпокамп, оскільки він є місцем проекції великої кількості глутаматергічних нейронів, і, відповідно, концентрація NMDA- рецепторів в даній структурній одиниці головного мозку є досить високою.

Дослідження проводилися відповідно із планами наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіологи ім. О.О. Богомольця НАН України.

Мета і задачі дослідження: Метою роботи було з’ясування механізмів взаємодій похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки- ансекуліна (7-метокси-6-[3-[4-(2-метоксифешл)піперазин-1-іл]пропокси]-3,4-диметил-2Н-1-бензопіран-2 гідрохлорід (КА-672)), структурно подібної кумаринам рослинного походження із ИМОА- рецептор- керованим іонним каналом, а також дослідження ролі гідрофобних взаємодій в модуляції рецептора у пірамідних нейронах гіпокампу щура.

Для досягення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1) Використовуючи метод внутрішньоклітинної перфузії у конфігурації “ціла клітина” визначити електрофізіологічні характеристики похідних імідазол-4,5- и піразол-3,4-дикарбонових кислот.

2) Виділити серед ряду похідних речовини, що володіють найбільшою блокуючою здатністю і порівняти їх фармакологічні властивості із їх структурними особливостями.

3) Визначити механізм взаємодії ансекуліна (КА672) з ИМБА- рецепторним іонофорним комплексом.

4) Визначити роль гідрофобних взаємодій в модуляції №*ША- керованих іонних каналів.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вивчено вплив нових агоністів і антагоністів ИМЛА-рецептора, похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нового блокатора іонного каналу ИМОА- рецептора гідрохлорида ансекуліна (КА672.НС1). Виявлено основні характеристики взаємодії КА672 із рецепторами ИМБА- типа. На підставі даних електрофізіологічного скрінінгу піразольних і імідазольних похідних висловлено припущення про існування в глутамат-розпізнаючому центрі ИМОА- рецептора ліпофільної ділянки, з якою може взаємодіяти ліпофільний замісник молекули похідної. Наявність такої взаємодії веде до зміни і навіть інверсії агоністичних властивостей даної похідної.

Теоретичне та практичне значення роботи. Теоретичне значення результатів полягає в тому, що отримані принципово нові відомості стосовно структури і функції агоністів і антагоністів глутаматних рецепторів. Знайдені нові антагоністи можуть бути використані в ролі зондів при дослідженні вибірковості взаємодії лігандів із окремими підтипами КМОА- рецепторів. Практичне значення результатів роботи полягає в тому, що досліджені речовини, а саме гідрохлорид ансекуліна (КА672.НС1), можуть використовуватись в клінічній медицині і служити прототипом для створення більш ефективних бло каторів ИМОА-рецепторів. Зокрема, КА672 знаходиться на другій фазі клінічних досліджень серед хворих на синдром Альцгеймера.

Особистий внесок. Автором особисто були виконані всі електрофізіологічні експерименти. В розробці концепцій роботи приймали активну участь також інші спіавтори публікацій.

з

Особлива подяка док. біол. наук Л.Б. Піотровському за надані досліджувані речовини, результати експериментів in vivo і цінні наукові зауваження.

Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені і обговорені на V Всеросійському конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всеросійській науковій конференції "От materia medica к современным медицинским технологиям" (С.- Петербург, 1998), Міжнародному симпозіумі «Symposium of Pathology of Cerebral Neurotransmission» (Magdeburg, 1997), Всеросійській конференції “Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии” (С.-Петербург, 1999), Міжнародній науковій конференції “Joint Meeting of ISN and ESN” (Berlin, 1999), семінарі Інституту фізіології ім.

О.О.Богомольця (Київ, 1998).

Публікації Результати роботи опубліковані в трьох наукових статтях і тезах п’яти докладів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел зі 232 найменувань. Робота викладена на 133 сторінці, містить 5 таблиць та ілюстрована 23 рисунками.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкт досліджень. Дослідження проводилися на ферментативно ізольованих нейронах гіпокампа щура лінії Вістар віком 14-16 діб. Гостроізольйовані нейрони одержували за допомогою прийомів, подібних описаним раніше {Kiskin N.I., Tsyndrenko, et al., 1991}. Із зрізу гіпокампа виділяли stratum pyramidale. Ізольовані пірамідальні нейрони отримували при багаторазовому пропущенні stratum pyramidale через скляні піпетки (діаметром від 0.5 до 1 мм) у безмагнієвому розчині Рінгера (РР) (у мМ): 130 NaCI, 5 KCl, 2 СаСЬ, 20 N-2-гідроксиетилпіперазин-№-2-етансульфонової кислоти (HEPES), 10 глюкози; pH доводили 1 М розчином NaOH до 7.4.

Прикладання фармакологічно активних речовин. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії {Kostyuk, Veselovsky, et al., 1981} із використанням скляних мікропіпеток, яки мали опір 2-5 МОм {Hamill et al., 1981}. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (у мМ): 100 NMDG-фтор, 10 тетраетиламоній хлорид (ТЕА-С1), 20 Tris-HCl, pH 7.2, тонка частина кінчика заповнювалася розчином 130 мМ Tris-HCl. В експериментах по дослідженню властивостей КА-672 використовувався інший внутрішньоклітинний розчин (в мМ): 100 KF, 20 Tris-HCl, pH 7.2. Для отримання вольт-амперних характеристик внутрішньоклітинний розчин модифікували (у мМ): 104 NaF, 16 Tris-HCl та 8 ТЕА-С1, pH 7.2. Як позаклітинний розчин використовувався безмагнієвий розчин Рінгера (РР).

Піпетку з нейроном вміщували в отвір V-образно зігненої скляної трубки, що занурена у позаклітинний розчин. Програмно кероване відкривання клапана дозволяло швидко зміняти розчин в V-образному коліні трубки. Синхронно з відкриванням клапана проводився запис струму, що протікає через мембрану досліджуваного нейрона. Використання пристрою “плигаючий столик” (виробництво “Pharma Robot”, Київ) у наших експеріментах дозволяло провести швидку зміну позаклітинних розчинів за 15-20 мсек. При цьому тривалість аплікації речовин складала загалом 4-5 секунд і була лімітована часом, необхідним для перенесення системи піпетка-трубка в інше заглиблення для аплікації. На всіх приведених нижче кривих аплікації агоністів початок аплікації відповідає початку хемоактивованих іонних струмів. Для отримання NMDA-акгивованих відповідей використовувався розчин РР, який містив додатково L-аспарагінову кислоту і гліцин. У разі дослідження дії антагоністів HeNMDA- типа використовувався розчин РР, що містив 2 мМ MgCb і 300 мкМ АМРА. АМРА аплікували на фоні потрібної концентрації досліджуваної сполуки. Всі ефекти речовин в даній роботі були зворотними. Експерименти виконувалися при кімнатній температурі (19-24 °С). Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмою Sigma Chemical Co. (St. Louis, СІЛА). Вода для розведення розчинів була деіонізована на апараті Super-Q фірми Millipore і мала питомий опір 10-12 МОм* см. Похідні імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот були люб'язно надані доктором біол. наук JI. Б. Піотровським. КА-672 НС1 було люб'язно надане Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. (Німеччина).

Фармакологічні характеристики похідних імідазол-4,5- і піразол- 3,4-дикарбонових кислот. Раніше було показано, що l-метил-, 1-етил- і 1-бензилпохідні імідазол-4,5-дикарбонової кислоти (ІЕМ) при прямому введенні в мозок мишам виявляють властивості часткових агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот {Ryzov, Lapin, et al., 1988} Тому ми вивчили дію цих і деяких інших похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот (ІДК і ПДК) на струми, що активуються NMDA в ізольованих нейронах гіпокампа щура (рис 1. і табл.1).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

'соон

.СООН

Рис 1.Структура похідних імідазол-4,5- (ліворуч та середина) та піразол-3,4- дикарбонових кислот (праворуч).

ШМ-1573

R'=CH3

ŒM-1574

R2=CH3

R3=H

ШМ-1375

ШМ-1442

R^CjH;

ШМ-1808

ŒM-1575

R3=CH3;

ŒM-1791

R^CjH,

ŒM-1795

R2=CîII,

ŒM-1441

^=СН2СбН,

ШМ-1797

R2=Ph

При цьому найбільшу судомну активність, як видно з таблиці, виявили речовини ІЕМ-1574 та ІЕМ-1808. Інші похідні значно ослабляли власний судомний ефект NMDA, що свідчить про наявність у них активності NMDA- антагоніста.

Таблиця 1' Порівняння судомної активності імідазольних похідних при їх інтрацеребровентральному (іцв) введенні разом з 170 мг/кг NMDA мишам з їх дією на NMDA- активовані струми нейронів гіпокампа щура. Т і 4~ відповідно посилення і ослаблення судомного ефекту в порівнянні з власним судомним ефектом NMDA. Ант-антагоніст.

Похідна ІДК ІЕМ-1574 ЕЕМ- 1797 ІЕМ- 1808 ІЕМ- 1441 ІЕМ- 1795 ІЕМ- 1791 NMDA

Нейрони гіпокампа агоніст Ант Ант Ант Ант Ант агоніст

Іцв. досліди t п t і 4г і агоніст

В експериментах на ізольованих нейронах піразол-3,4-дикарбонова кислота (ІЕМ-1375) буда здатна активувати мембранну провідність, тобто виявила властивості агоніста №/ГОА- рецепторів, однак заміщення в положенні 1 циклу атома водня на метальну групу призвело до появи у такої сполуки (ІЕМ-1575) активності №ЛІ)А- антагоніста (рис. 2А).

Серед похідних імідазолу спостерігалася подібна картина. Так, дві 1-заміщені імідазольні похідні (ІЕМ-1573 і ІЕМ-1442) були неактивні, тоді як подовження вуглеводневого ланцюга замісника у першому положенні імідазольного кільця від пропіла до бензила (відповідно ІЕМ-1791 і ІЕМ-1441) виявило сполуки з властивостями антагоністів ММЕ)А- рецепторів (рис. 2Б і табл. 2).

1 вА І 2 о

50 мкМ L-аспартат»

L-вспаргаі» ІиМ ІЕМ-1575 тдмгака

7” F

50 мкМ 50 мкМ L-аспарпта L-мшртив 1 мМ ІЕМ-1791 вія**.*»

і**'**’

Рис. 2 Пригнічуюча дія ІмМ ІЕМ- 1575 (1-метилпохідної ПДК) (А) та ІЕМ-1791 (1-пропілпохідноТ ЩК) (Б) на активовану 50 мкМ Ь-аспартата №МП)А- відповідь. Тут і далі: підтримуваний мембранний потенціал -80 мВ. Вміст гліцина в розчинах 10 мкМ, Ь-аспартата-50 мкМ.

Як видно з таблиці 2 та рисунку 2Б ІЕМ-1791 у концентрації 1 мМ пригнічував активований іонний струм на 21.3±1%, а та ж сама концентрація ІЕМ-1441- на 16.5 ± 6%. На рисунку 6 наведена залежність дози- ефекта для пропільної похідної ІДК (ІЕМ-1441). Значення ІС50 для даної похідної вимірене на З клітинах при підтримуваному мембранному потенціал -70 мВ і конценгаціях

аспартату (50 мкМ) та гліцину (ЮмкМ) становило 2.67± 0.03 мМ, а коефіцієнт Хіллак= 1.5± 0.1.

Таблиця 2. Пригничення №УША- відповіді похідними 1ДК та ПДК (концентрації антагоністів 1 мМ). І - амплітуда пригніченої відповіді, Іо - амплітуда контролю.

ІЕМ Назва Міра пригнічення NMDA-відповіді, (1- ІЯо)*100%

1573 1-метил ІДК Не активна (< 0.1)

1442 1- етил ІДК Не активна (< 0.5)

1441 1- бензіл ІДК 16.5 ±6

1791 1- пропіл ІДК 21.3 ±1

1575 1- метил ПДК 45.1 ±5

1808 2-етил ІДК 63.1 + 10

1797 2- феніл ІДК 70.4 ± 18

1795 2- пропіл ЩК 77.3+4

Серед 2-заміщених ІДК тільки 2-метил-похідна (ІЕМ-1574) була №ЛЕ)А-агоністом, тобто була здатна сама активувати мембранну провідність за відсутністю аспартата.

50 мхМ 50«М Ыкяартата

І^асшрізта ІмМ ІЕМ-1808 відмквка

УМУ.ШШУ/УД'Л

ЗОмкМ 50 икМ L-аспартата

L-«cg»pr»ra і „м ШМ-1793 іішш

А

Y~~

Рис. З Пригнічення NMDA- відповіді (А) 1 мМ ІЕМ- 1808 (2-етил-похідна ІДК); (Б) ІмМ ІЕМ- 1795 (2-пропіл- похідна ІДК).

Як і раніше, подовження радікалу-замісника (в ряді 2-етил-, 2-пропіл та 2-феніл аналогів; ІЕМ-1808, ШМ-1795 та ШМ-1797, відповідно) призводило до появи у сполукі властивості NMDA- антагоніста. Так, 1 мМ ІЕМ-1808 пригнічував активовану відповідь в середньому на 63.1 ±10%, ІЕМ-1795 в тій самій концентрації на 77.3±4%, а 1 мМ ЕЕМ-1797 відповідно на 70.4±17.5% (див. табл. 2 та рис.З).

Рис. 4 Порівняння впливу ІЕМ-1441 (1-бензил- ІДК) та ШМ-1797 (2-феніл-ІДК) на NMDA- індуковані відповідь Розчин містив 50 мкМ L-аспартату і 10 мкМ гліцина. Підтримуваний потенціал -70 мВ. Дані отримані на 3 нейронах гіпокампа. І і Іо — максимальні амплітуди відповідей в присутності антагоніста (ШМ-1797 або ІЕМ-1441) і в контрольних розчинах відповідно, ІСи- концентрація блокатора, що пригнічує відповідь на 50%, к- коефіцієнт Хілла, що дорівнює 0.7± 0.1 для ІЕМ-1797.

Похідна ШМ-1797 (2-фенілзаміщений аналог) був антагоністом рецепторів як ИМОА-, так і неШЛОА- типа (із значенням ІС;о= 0.21± 0.03 мМ для КМОА-акгивованих відповідей; див. рис.4). У разі впливу на неШЛОА- рецептори, 1 мМ ШМ-1797 пригнічував АМРА- відповідь, що активується аплікуванням 300 мкМ АМРА при підтримуваному потенціалі -90 мВ до 76.4 ± 3.1 % (рис. 5).

300 КІМ 300 мгМ АМРА

Рис. S Пригничення HeNMDA- відповіді ІЕМ-1797 (2-феніл-похідною ЩК). Концентрації АМРА 300 мкМ, підтримуваний потенціалі -90 мВ.

Пригнічення ШМ-1797 NMDA- активованої відповіді в залежності від підтримуваного потенціалу показано на рис. 6.

Рис.6 ¡\MDA- активовані відповіді індивідуальної клітини в контрольному розчині (300 мкМ Ь-аспартата і ЮмкМ гліцииа) і в аналогічному розчині з блокатором (500мкМ ІЕМ-1797), виміряні прн підтримуваних потенціалах на мембрані нейрона від -120 до +40 мВ, а також вольт- амперні характеристики таких відповідей. Вісь абсцис- V,, (підгимуваний мембранний потенціал, у мВ); вісь ординат- пА (гакоамперна шкала сили струму).

Дія похідних ІДК, що виявляють властивості антагоністів, пояснюється конкурентним зв'язуванням похідних з глутамат- розпізнаючим центром рецептора. На рис.7 представлений характерний паралельний зсув залежностей дози- відповіді Ь-аспартата, виміряний в контрольному розчині (ЕС5о= 48.3 ± 5.4 мкМ) і в присутності 500 мкМ ШМ-1797 (ЕС5о= 62.6 ± 4.2 мкМ). Одержаний зсув значення ЕС50 після додання ШМ-1797 дає змогу вважати ШМ-1797 конкурентним антагоністом глутаматних рецепторів.

Рис.7 Залежності дози-відповіді L-аспаргата, виміряні в контрольному розчині і в присутності 500мкМ NMDA-антагоніста. Підтримуваний потенціал —90 мВ. І і Іо — максимальні амплітуди відповідей при тестових концентраціях L- аспартата і при його насичуючій концентрації ЮмМ відповідно; ECjo- концентрація агоніста, яка активує 50% максимальної відповіді; к-коефіцієнт Хилла (в обох випадках є близьким до 1). Дані 3 нейронів.

Таким чином, можна констатувати, що між даними, одержаними в експериментах in vivo та in vitro існують очевидні розходження. Логічно вважати, що це обумовлене специфікою експериментів in vivo, в яких досліджені сполуки взаємодіють не тільки із пірамідними нейронами гіпокампу, але й з елементами інших мозкових структур. Одержані на нейронах гіпокампа дані вказують на зміну типу активності тестованих речовин після введення ліпофільного замісника в частішу молекули, що позбавлена фармакофорних груп (тобто груп, що забезпечують її взаємодію із рецептором). Так, заміна агоністичної активності NMDA- типа (ШМ-1574) на антагоністичну (ШМ-1808) є наслідком подовження алкілового замісника в позиції 2 молекули ІДК від метилу (ІЕМ-1574), етилу (ШМ-1808), до пропілу та фенілу (ІЕМ-1795 і ІЕМ-1797). В даному випадку остання сполука набула властивостей NMDA- антагоніста та почала взаємодіяти із рецепторами HeNMDA типа.

Фармакологічний профіль хлорида і тартрата КА672.

1. Селективність КА672 по відношенню до рецепторів NMDA- типа. Другою частиною наших досліджень було визначення фармакологічних характеристик двох солей ансекуліна (рис. 8А): хлорида та тартрата. У дослідах по виявленню впливу КА672.НС1 на різні трансмембранні струми у нейронах гіпокампа, ансекулін продемонстрував значну селективність до рецепторів саме NMDA-типу. Так, при аплікації 10 мкМ КА672.НС1 разом із 0.5 мМ АМРА не було помітно будь-яких змін в жодному з трьох досліджених нейронів в АМРА-активованої провідності порівняно з контролем (відсутність пригнічення АМРА-індукованої провідності: ІЛо= 102 ± 12%, де І та Іо -максимальні амплітуди відповіді у розчині з блокатором і у контрольному розчині). Подібна сітуація склалася у випадку з ТТХ-чутливими Na+ струмами (І/Іо= 97.4 ± 2.5%). Але у випадку з рецепторами NMDA- типу ЮмкМ КА672.НС1 спричиняло значне зменшення провідності, активованої ІмМ L-аспартата і ЮмкМ гліцину (рис. 8Б).

Також була виявлена відсутність механізму “use-dependence” і відсутність зміни кінетики відповідей протягом тривалої аплікації блокатора. Так, після витримки клітини в розчині 10 мкМ КА672.НС1 протягом 5 хвилин, міра пригнічення контрольної відповіді залишилася такою ж, як і після 5 секунд інкубації в розчині блокатора (див. рис. 8В).

1.2 ^ 1,0

і 08

І0,6 8. 0,4

0,2

0,0'

• в присутності 500 мкМ ІЕМ-1797

L- аспартат ЕС^вЗіЗДмкМ

L-аспартат +■

500 мкМ ІЕМ-1797 ЕСМ* 62.б± 42 мкМ

■пц—

0,01

"Ч

0.1

10

концентрація L-аспартата, мМ

Рис.8 КА672.НСІ оборотно блокує відповіді в ізольованих нейронах гіпокампа. (А) Будова 7-метокси-6-[3-[4-(2-метоксифеніл) піперазин- 1-іл] пропокси] -3,4-диметил-2Н-1 -бензопіран-2 гідрохлоріду (КА-672), нової

синтезованої сполуки, що структурно подібна кумаринам рослинного походження (Б)

NMDA- відповідь, що активується 1 мМ L-аспартата на фоні 10 мкМ гліцина, оборотно блокуєгься 10 мкМ КА672.НС1. (В) Поєднання кривих з частини А: відсутність зміни амплітуди відповіді протягом 5 хвилин аплікації блокатора у порівнянні з амплітудою відповіді після 5 секунд аплікації

антагоніста (ліворуч). Праворуч:

нормування кривих свідчить про відсутність зміни кінетики

А, Б- загальне калібрування. Підтримуваний потенціал дорівнював -90 мВ.

Характеристики часових констант спаду відповіді (т) в обох випадках були Такі! Ткл-б72(5 сст/Теонтрсдь— 1.1 І 0.2 І ТкА-672(5 хви:ш!і/*^коптроль^^-9 ±0.1. Де ТкА-б72(5 се») І тка-672(5 мін) -характеристики констант часу спаду NMDA- відповідей в розчині 10 мкМ КА-672 НС1, виміряних відповідно після 5 секунд і 5 хвилин з початку інкубації нейрона у розчині блокатора. тсот(Гоі - часова константа спаду в контролі (З клітини). Відсутність розбіжностей між даними значеннями констант свідчить про взаємодію КА672.НС1 із закритим каналом NMDA- рецепторного комплекса, тобто механізм блоку КА672.НС1 являє собою блок закритого капала,

позбавлений механізму “use-dependence”.

Подібні характеристики має інша соль ансекуліна- КА672.тартрат. Але на відміну від гідрохлорида ансекуліна, більш розчинний у фізіологічних розчинах КА672.тартрат має незначну афіність до NMDA- рецептора. Так, ефективність пригнічення тартратом NMDA- відповідей є слабкішою в 50 разів у порівнянні з гідрохлоридом.

2. Залежність блокування NMD А- відповіді від концентрації KA672.HCL

NMDA- відповіді реєструвалися в присутності 10 мкМ гліцина і 1 мМ L-аспартата в контрольному і тестових розчинах (рис. 9). Значення ІС50 при підтримуваному потенціалі -90 мВ, близькому до потенціалу спокою, дорівнювало 20.1 ± 7.3 мкМ, а значення коефіцієнта Хілла, відповідно к= 0.3 ±0.1 (3 клітини). Ми, на жаль, не змогли виміряти міру блокування КА672.НС1 в концентраціях вищих за 50 мкМ через обмежену розчинність даного блокатора у фізіологічних водних розчинах.

ЮС

осн, н-а

о

ге

HjCO

10 мкМ KA672.HC1

контроль

1 мМ L-йс парта та 5 секунд 5 хвилин відмивка

Y Y

' 300 ПА I f

2 сен

1 5 секунд f

У\ 5 хвилин

f ВІДНОІ

в

контроль

5 хвилин віднормовані даш

ІД

ІСл-20Л*7^юМ к“0.3± 0.1

І нерозчинні І концентрації | блокатора 1

Рис.9 Залежність дози- ефекта пригнічення N1^11^- відповіді річними концентраціями КА672.НСІ. І і Іо — максимальні амплітуда відповідей у присутності антагоніста КА672.НС1 і в контрольному розчині відповідно, ІС50- концентрація блокатора, яка викликає 50% пригнічення відповіді. Концентрації Ь-аспартата- ІмМ, гліцина- 10 мкМ.

0.01

0.1 1 10 100 Концентрація блокатора, мкМ

-80 мВ

-20 мВ

,иВ

-80 -60 -ЗО,

(Іо-іуіс

І, нА

-КА672На - контроль

3. Потенціал- залежність блокування. В

експериментах з пірамідними нейронами КА672.НС1 виявив властивості слабкого потенціал-залежного блокатора. На рисунку 10А показана залежність ступеня пригнічення відповіді від підтримуваного мембранного потенціалу. У інтервалі підтримуваних потенціалів від -80 мВ до -20 мВ міра блоку змінювалася, зменшуючись з деполяризацією мембрани нейрона. Статистичну достовірність потенціал-залежності блокування підтверджує також результат те ста Стьюдента для 9 клітин при мембранних потенціалах (-80 і -20 мВ), де р > 0.005. Потенціал-

залежність іншої солі ансекуліна КА672 тартрата у порівнянні з гідро хлоридом була незначною (рис. 10Б).

Рис.10 Потенціал-залежність

блокування ЛШ>А- відповідей КА672.НСІ і КА672 тартратом. (А) Зверху ліворуч: зменшення міри блоку протягом деполяризації. Праворуч: вольт-амперна

характеристика відповіді індивідуальної клітини в контролі і в присутності 10 мкМ КА672. Знизу: потенціал- залежність

блокуючої дії КА672.НС1 за узагальненими даними 9 клітин. Вісь абсцис- підтримуваний потенціал у мВ; вісь ординат- віднормоване значення блоку (Іо - І)Ло, де Іо - амплітуда контролю, а І- амплітуда заблокованої відповіді. Концентрація Ь-аспартата 1 мМ, гліцина 10 мкМ. Концентрація Ь-аспартата 1 мМ, гліцина 10 мкМ, КА672.НС1 1 мМ. (Б) Пригнічення ИМОА- відповідей тартратом КА672 в залежності від мембранного потенціалу. Концентрація Ь-аспартата 1 мМ, гліцина 10 мкМ, КА672 тартрата 50 мкМ.

4. Залежність блока від концентрації агоніста або коагоніста. На блокуючу здатність КА672.НС1 (надалі просто КА672) не впливала ані зміна концентрації у позаклітинному розчині Ь-аспартата, ані гліцина. Інакше кажучи, даний агент не конкурував з агоністом та коагоністом КМЕ)А- рецептора за відповідні регуляторні центри. Так, значення ЕС50 у залежностях дози-відповіді для аспартата, що вимірені в контролі і в присутності ЮмкМ КА672 є майже Ідентичними: ЕС50(,:отр<ш,)= 38 ± 4 мкМ, ТОДІ як ЕС50(10 мкМКА-672) = 41 ± 2 мкМ. Дані,

т цн | -ЗО нВ

а-п/і,

-100 -Є0 -60 -40 -20

Уп мВ

що отримані на 3 клітинах свідчать про відсутність конкуренції між аспартатом і блокатором за глутамат- розпізнаючий центр NMDA- рецепторів. Таким чином, ми можемо вважати КА672 неконкурешним NMDA- антагоністом.

Схожі дані були отримані при дослідженні конкуренції між гліцином і даним блокатором за гліцин- зв'язуючий центр рецептора. В серії з 8 експериментів, де концентрацію гліцина в тестових розчинах змінювали від 0.01 до 100 мкМ, ми не помітили жодної значної зміни в пригніченні NMDA-відповідей: ЕС50(КА672) / ЕС5о(котроль) становить 93 ± 29%, де значення ЕС^юніріш.) = 2.9 ± 0.8 мкМ, а в присутності 10 мкМ блокатора ECso(ka672) = 2.7 ± 0.4 мкМ. Лише на одній клітині міра блоку збільшилася з підвищенням концентрації гліцина.

5. Дослідження конкуренції з фенциклідиновим центром NMDA-рсцептора. Можливість взаємодії КА672 з фенциклідиновим центром NMDA-рецептора (PCP- центром) була перевірена в серії експериментів, в яких порівнювалася міра блокування NMDA- активованих відповідей в розчині, що містив разом із аспартатом і гліцином ЮмкМ КА672 (контрольний розчин) і в розчині, що містив крім вищезгаданих компонентів ще 1 мкМ кетаміна, структурного гомолога фенциклідина, який також взаємодіє з PCP- центром рецептора. Спочатку визначали ступінь контрольного блоку ЮмкМ КА672: І клб72.нсі/ Ікоюрояю = 0.79± 0.03, а потім, після того як клітка була відмита від блокатора, прикладалася дана концентрація кетаміна і визначалася ступінь

пригнічення відповіді в кетамін-вмісному розчині (рис. 12).

Рис.12 Дослідження конкуренції між КА672 і фенциклідиновим центром NMDA- рецептора. Склад контрольного розчину: 300 мкМ L- аспартата, ЮмкМ гліцина, мембранний потенціал -90 мВ,. 5 клітин.

У даному випадку ступінь пригнічення кетаміном контрольної ВІДПОВІДІ СТаНОВИЛа ІкеталшУ Ікотролю

0.20 ±0.07. Потім клітину переносили в розчин, що містив 10 мкМ КА672 і 1 мкМ кетаміна і визначали наступну Інтенсивність блоку: 1<1М[Мкспшіт+ 10мжМКА672) / І(1жМ кспшіів)= 0.80± 0.07 (ВСЬОГО буЛО проведено п'ять таких експериментів.) Статистична обробка показала відсутність будь-якої конкуренції між кетаміном і КА672.НС1 за фенциклідиновий центр рецептора: відмінність між цими двома параметрами становить не більше за 1.3 %.

Відсутність конкуренції КА672 з аспартат-, гліцин- і фенциклідин-зв'язуючими центрами, а також слаба потенціал- залежність блокування свідчать про безпосередню взаємодію даного блокатора з іонним каналом ИМОА рецепторного комплекса. Це також підтверджується попередніми дослідженнями

10 икМ КА672 . 10 итМКАб72

Ьчспіртст Т777Л7777Л777Л І^гартат

контроль

Y

Ґ К Г

Г 500ПАI 4с f

300 шМ L^acnapran 1 шМкетжміка

зоошгмі^спчтт. ІОмкМ КАбТЇ

10ихМКАб72 , у ---

/_____ ыиК*

300 іаМ лРг L

jflpF L-acrupnn |f 1

Г

300 мкМ L-acraptm нкМкеташня

in vitro, в яких показана відсутність взаємодії між КА672 і безпосередньо активними цетрами даного рецептора (див. нижче).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Похідні імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот є новим класом агонісгів і антагоністів .NMDA- рецепторів. Досліджені сполуки є структурними аналогами відомого ендогеното агоніста NMDA- рецепторів, хінолінової кислоти, в яких шестичленне пірідинове кільце замінене на п’ятичленне. Молекулярне моделювання показує, що відстані між центральними атомами фармакофорних груп (атома азоту і атомів вуглецю карбоксильних груп) однакові у всіх молекулах. Геометричні параметри всіх цих молекул схожі з параметрами молекули NMDA в “стислій" конформації, де відстані (N- Ст)= 0.39 нм і (Са- Ст) = 0.3 нм. Тут Са і Сщ- атоми вуглецю відповідно а- карбоксильної і ю- карбоксильної груп {Петров В.И., Пиотровский Л.Б., 1997}. Як будо згадано раніше, можна передбачити, що в молекулах похідних імідазол- ІДК, як і в молекулі хінолінової кислоти, атом азоту пірідинового типу не здатний заряджатися позитивно в фізіологічних умовах (рис. 12). Тобто, приєднання атомів водню до азоту не відбувагшмось при фізіологічних значеннях pH. Досліди фармакологічної активності похідних ІДК (N- алкілпохідних) також підтвердили висновок про необов’язковість зв’язування атома азоту з активним центром

рецепторів збудливих амінокислот за допомогою з N^<,coo»--| іонного зв’язку {Петров В.И., Пиотровский Л.Б.,

,'мн'ічссхж Г 1997}.

і од і \ Рис. 12 Відстані (в нм) між центральними атомами

І* \ фармакофорних груп в молекулах хінолінової

"* " (ліворуч) і імідазол-4,5-ди карбонової кислот

(праворуч). У випадку з ІДК відстані між атомами азоту і карбоксильними групами Ni-COOH (С4) і Ni-COOH (Cj) рівні відповідно відстанням N3-COOH (С5) і N3-COOH (С4).

Дані, що одержані в електрофізіологічних експеріментах на нейронах гіпокампа, свідчать, що тип активності похідних ІДК і ПДК є залежним від мінімальних структурних змін молекули похідної. Причому, ці зміни торкаються тої її частини, яка не містить фармакофорних груп або атомів. Таким чином, хімічна модифікація не повинна торкатися карбоксильних груп у положенні 4 і 5. Прикладами такої зміни активності можуть бути:

а) інверсія NMDA- атомістичної активності похідної ПДК (ШМ-1375) в NMDA-антагоністичну (ІЕМ-1575) як наслідок заміни атома водню на метальну групу у атома N1 піразольного циклу;

б) схожа інверсія ефекіа внаслідок збільшення алкільного замісника у положенні

2 імідазольного циклу від метилу (ІЕМ-1574), етилу (ІЕМ-1808), до пропілу і фенілу (JEM-1795 і ІЕМ-1797). В останньому випадку сполука є не тільки NMDA-антагоністом, але набуває здатності взаємодіяти навіть з рецепторами HeNMDA-типа.

Введення метальної групи може глибоко змінити хімічну поведінку молекули ІДК завдяки зміні її розташування у просторі та набутим новим електронним

ефектам {Albert А., 1985}. Але у нашому випадку згідно з даними квантово-хімічних розрахунків (за методами АМ1 та РМЗ) {Burkert & Allinger, 1982} цього не спостерігається. Так, заміна атома водню у молекулі похідній піразол-3,4-дикарбонової кислоти на метальну групу теоретично може змінювати розподіл електронної щільності в молекулі. Однак це припущення не підтверджується даними квантово-хімічних розрахунків за вищезгаданими методами. Навіть у атома Ni гетероциклу електронна щільність змінюється досить незначно. Таким чином, у випадку сполук ІЕМ-1375 і ŒM-1575 зміна спрямованості дії може бути пов'язана або з втратою молекулою рухомого атома водню, або із підвищенням її ліпофільних властивостей.

Серед 2- заміщених похідних імідазол-4,5- дикарбонової кислоти збільшення алкільного радикалу також не приводить до істотних змін розподілу електронної щільності. Оскільки структурні зміни в цій серії не торкаються рухомого атома водню фармакофорної групи і не впливають на взаємодію молекули похідної з N-зв'язуючим центром NMDA- рецептора, залишається визнати, що антагоністична активність даних похідних гетероциклічних дикарбонових кислот пов'язана із збільшенням їх ліпофільности.

Для перевірки цього висновку ми розрахували площі ван-дер-ваальсовйх поверхонь досліджуваних молекул за методом Бонді {Bondi А., 1968} із застосуванням програми PCModel. Дані, наведені в таблиці 3, свідчать про залежність між спрямованістю біологічного ефекту і площею неполярної насиченої поверхні молекули тестованої речовини. Всі сполуки із площею поверхні меншою за 0.5 кв. нм, проявляють властивості агоністів, а її збільшення призводить до появи антагоністичних властивостей.

Таблиця 3 Площі ван-дер-ваальсових поверхонь молекул похідних ІДК і ПДК (кв. нм) і

кореляція з типом фармакологічної активності.

ІЕМ Площа неполярної насиченої поверхні Площа неполярної ненасиченої поверхні Площа полярної поверхні Загальна площа Тип фармакологічної активності

1375 0.112 0.198 1.194 1.504 агоніст

ХК 0.346 0.354 0.971 1.671 агоніст

1574 0.415 0.177 1.159 1.751 агоніст

1797 0.562 0.636 1.122 2.320 антагоніст

1808 0.674 0.165 1.156 1.995 антагоніст

1441 0.890 0.680 0.990 2.560 антагоніст

1795 0.901 0.163 1.154 2.218 антагоніст

1791 0.964 0.208 1.037 2.209 антагоніст

У ряді 2-алкілзаміщених похідних імідазолу і похідних піразолу (ІЕМ-1375, ІЕМ-1574, ІЕМ-1575, ІЕМ-1808 і ІЕМ-1795) спостерігається позитивна кореляція між ліпофільними властивостями молекул і їх дією на ЇЯМОА- рецептори. Виняток складає ІЕМ-1797, що містить ароматичний фенільний радикал.

В ряді похідних 1-заміщених похідних імідазола, в яких замісник розміщений поряд з однією із кислотних груп, картина менш чітка- два гомолога (ІЕМ-1573 і

ІЕМ-1442) взагалі не діють на NMDA- рецептори, а введення бензильного радикалу (ШМ-1441) призводить до ослаблення NMDA- антагоністичної активності у порівнянні із такою пропільного аналога (ІЕМ-1791, див. табл. 3).

Загальноприйнято, що для ослаблення агоністичних і посилення антагоністичних властивостей необхідне збільшення відстані між а-амінокислотною і са-кислотною групами. За опублікованими даними {Dorville, McCort-Tranchepain, et al., 1992}, для NMDA- антагоністів відстань між центральними атомами а- і со-кислотних функцій повинно бути близько 0.6- 0.7 нм. Однак в таких компактних молекулах, як похідні п’ятичленних гетероциклічних дикарбонових кислот, вкрай важко визначити відповідні відстані. Таким чином, ці сполуки можна розглядати як новий клас лігандів NMDA- рецепторів, антагоністичні властивості яких залежать не від відстані між термінальними кислотними групами, а від ліпофільності молекул. Тому можна припустити, що в глутамат-розпізнаючому центрі рецептора біля центра, що зв’язує аміногрупу, існує ліпофільна область (“кишеня”), з котрою може взаємодіяти ліпофільна група- замісник (біля атома азоту або сусіднього атома в молекулі похідної). Наявність такої взаємодії повинна призводити до послаблення агоністичних і появи антагоністичних властивостей { Лішко П.В., Піотровський Л.Б., 1999}.

У деяких випадках збільшення ліпофільності молекули може приводити до втрати селективності і появи у похідної здатності взаємодіяти з різними типами рецепторів збудливих амінокислот. Наприклад, ШМ-1797 (2-фенілімідазол-4,5-дикарбонова кислота) виявляє властивості антагоніста як NMDA-, так і iieNMDA-рецепторів. Перетворення NMDA- агоніста в NMDA- антагоніст без зміни фармакофорних відстаней показане раніше для двох інших похідних ізоксазолу. Так, (Д)-2-аміно-2-(3-гідрокси-5-метил -4-ізоксазоліл)оцтова кислота [(R)-AMAA] є сильним і селективним агоністом NMDA- рецепторів {Madsen, Frydenvang, 1996}, тоді як її ліпофільний аналог (R)-2- аміно-2-(5-трет-бутіл-3-гідрокси-4-ізоксазоліл)оцтова кислота [(R)-ATAA] є антагоністом одночасно NMDA- і АМРА-рецепторів {Johansen, Frydenvang, et al., 1997}.

Як зазначалося вище, основність пірідинового атома азоту хінолінової кислоти є низькою, тому в фізіологічних умовах ХК має лише негативно заряджені групи. Молекули похідних гетероциклічних дикарбонових кислот за своїми фізико-хімічними властивостями близькі до молекули хінолінової кислоти. Це відрізняє їх від молекул інших лігандів NMDA- рецепторів, в яких є дві негативно і одна позитивно заряджені групи. Отже, отримані нами дані свідчать, що ж для агоністів, так і для антагоністів NMDA- рецепторів не обов'язкова наявність в молекулі позитивно зарядженого атома азоту. Не можна виключити, що молекули з трьома зарядженими групами і молекули з двома зарядженими групами можуть виявляти різну вибірковість при взаємодії з окремими підтипами NMDA-рецепторів, тому знайдені нами нові антагоністи можуть бути використані в якості зондів в подібних дослідженнях.

Таким чином, наявність антагоністичної активності у молекулі кислої амінокислоти визначається не тільки відстанню між термінальними кислотними (карбоксильними) групами, але може бути пов'язана з ліпофільністю оточення

фармакофорного атома азоту. Причому в останньому разі відстані між фармакофорними групами в молекулі антагоніста можуть не відрізнятися від таких в молекулі агоніста.

Похідні гетероциклічних дикарбонових кислот являють собою новий клас лігандів рецепторів збуджуючих амінокислот, в яких ослаблення NMDA-агоністичної і посилення NMDA- антагоністичної активності пов'язане тільки із збільшенням ліпофільиості молекули похідної.

2. КА672.НС1 як неконкурентний потенціал- залежний антагоніст NMDA-рецепторного комплекса. Фармакологічний скрінінг похідних кумаріна, що є структурно гомологічними алкалоїду скопарону, привів до синтезу нової бензопіранової похідної- ансекулина (КА672). Було виявлено, що речовина володіє вираженими антидеменційними властивостями. У багатьох поведінкових тестах було показано, що у експериментальних тварин КА672 активно впливає на процеси запам'ятовування, а саме, полегшує і відновлює формування пам'яті {Noldner, Hauer, 1996}. Таким чином, визначення молекулярних механізмів впливу КА672 на центральну нервову систему ссавців являло собою надзвичайно актуальне питання.

У ході досліджень взаємодії КА672 з різними типами рецепторів ЦНС, виявився полімодальний вплив КА672 на центральну нервову систему {Hilgert, Noldner, 1999}{Skujins, Svirkis, 1997}. Як згадувалося раніше, ця сполука виявила модулюючи ефекти у деяких нейротрансмітерних системах які пошкоджуються при хворобі Альцгеймера, КА672 впливав також на функціонування 5-НТід, адрено- і дофамінових рецепторів {Winter, Helsley, 1998} {Noldner, Hauer, 1996}.

Безумовно, чималий інтерес викликає питання про вплив КА672 на глутамат- керовані процеси, оскільки глутаматні рецептори, а саме NMDA-підтип відіграють ведучу роль в формуванні первинної нейронної пам'яті і подальших процесів циклічної синаптичної активності. Більше того, було показано, що КА672 ефективно і специфічно інгібує NMDA- активовані судоми і загибель клітин, в той час, як ті ж ефекти, викликані електрошоком і традиційними хемоконвульсантами не змінювалися під впливом КА672. На моделях тварин було показано, що КА672 полегшує процес навчання, що проявляється швидким початком і тривалістю дії. Було висловлене припущення, що даний ефект зумовлений взаємодією КА672 з NMDA- рецептором або з одним

з його регуляторних центрів. Але досліди in vitro по виявленню афінності КА672 до цього рецептора не показали специфічності як до самого рецептору, так й до жодного з відомих регуляторних центрів {Noldner, Hauer, 1996}. Таким чином, метою даної роботи було визначити механізм впливу КА672 на іонні струми, що викликаються активацією NMDA - рецептора.

Внаслідок проведених досліджень було показано, що КА672 блокує NMDA-активовані відповіді із залежності від мембранного потенціалу. Речовина має низьку спорідненість до NMDA- рецептора і характеризується повного зворотністю дії. При цьому спостерігається відсутність механізму “use-dependence”.

В експериментах нами була виявлена відсутність конкуренції КА672 з Ь-аспартатом за глутамат- зв’язуючий центр, а також відсутність конкуренції з коагоністом ЫМОА- рецептора гліцином. Показано, що КА672 не взаємодіє також з фенциклідин- зв'язуючим центром рецептора. Ці спостереження корелюють з вищезазначеними даними активності КА672 у поведінкових тестах.

Механізм пригнічення активності рецепторів ИМБА- типа КА672.НС1 ймовірно пов'язаний з високою ліпофільністю даної речовини. Більш розчинний аналог КА672.тартрат виявився ще більш слабим блокатором.

Цікавою виглядає можливість взаємодії ліпофільного блокатора з іонним каналом, який є по суті гідрофільною мембранною порою. Зокрема, випливає, що всередині канапу знаходиться область підвищеної гідрофобності, з якою ефективно взаємодіють різні ліпофільні агенти. Таким чином, можна зробити висновок про бажану присутність ліпофільних властивостей у речовин, що претендують на роль блокаторів ИМПА- рецепторного каналу.

Відсутність побічних фармакодінамічних ефектів при застосуванні КА672 також є наслідком низької спорідненості даної речовини до ЫМОА- рецептора {Бош^еш, Ногг, 1997}. Важливо відмітити селективність дії КА672: даний агент не впливає на АМРА- активовані і потенціал- залежні натрієві і кальцієві іонні струми.

Оскільки КА672.НС1 є лише одним представником з серії бензопіранових похідних із схожими антагоністичними властивостями, ми чекаємо появи незабаром більш ефективних блокаторів ИМБА- рецепторів з вираженими нейропротекторними властивостями. Зараз КА672 знаходиться на П етапі кліничних досліджень як фармакологічний засіб проти хвороби Альцгеймера.

ВИСНОВКИ

1. Серед похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот знайдені нові агоністи і антагоністи рецепторів К-метил-Б-аспарагінової кислоти (ЫМБА). Виявлено, що збільшення лілофільності оточення атома азоту гетероцикла в даних похідних приводить до ослаблення ММБА-агоністичної і посилення NМО А-антагоністичної активності при незмінності відстані між карбоксильними групами.

2. Показано, що збільшення лілофільності оточення даного атома азоту може приводити також до втрати селективності взаємодії з рецептором КМБА-типу і появи у агента активності неЫМБА- антагоніста.

3. Виявлена можливість існування біля зв'язуючого аміногрупу місця в глутамат- розпізнаючому центрі ИМОА- рецептора ліпофільної області (кишені або порожнини), з якою може взаємодіяти ліпофільна група-замісник атома азоту або сусіднього атома. Така взаємодія веде до ослаблення агоністичної і появи антагоністичної активності.

4. Таким чином, наявність у молекулі кислої амінокислоти антагоністичної активності визначається не тільки відстанню між термінальними кислотними групами, але й може бути пов'язана з ліпофільністю оточення фармакофорного атома азоту, причому у останньому випадку відстані між

фармакофорними групами в молекулі антагоніста можуть бути такі ж, як і в молекулі агоніста.

5. Визначені електрофізіологічні характеристики ансекулина. Гідрохлорид ансекулина (КА672.НС1) є потенціал- залежним неконкурентним блокатором NMDA- рецепторного іонного каналу із значенням ICso= 20 ±7 мкМ при підтримуваному мембранному потенціалі —90 мВ. Відсутність конкуренції за будь-який регуляторний центр NMDA- рецептора разом із відсутністю механізма дії “use-dependence” свідчать про взаємодію ансекуліна безпосередньо з іонним каналом.

6. Виявлені раніше нейропротекторні та антидеменційні ефекти ансекуліна принаймні частково пояснюються специфічністю його взаємодії з NMDA-рецепторним комплексом.

Список опублікованих праць здобувана за темою дисертації

1. P.V. Lishko, О.Р. Maximyuk, S.S. Chattel]ее, M.Noldner and О.A Krishtal. The putative cognitive enhancer KA-672.HC1 is uncompetitive voltage-dependent NMDA receptor antagonist//. NeuroReport.- 1998,- 9- 18,- p. 4193-4197.

2. Л.Б. Пиотровский, П.В. Лишко, АП. Максимюк, И .Я. Александрова и О.А. Крышталь. Новый класс агонистов и антагонистов рецепторов N-Menm-D-аспарагиновой кислоты-производные имидазол-4,5- и пиразол-3,4-дикарбоновых кислот// Российский физиологический журнал им. ИМ.Сеченова,- 1999.- т.85,- № 4.-е. 523-530.

3. П.ВЛішко, Л.Б.ГПотровський, О.ПМаксимюк та О.О.Кришталь. Залежність фармакологічної активності нових NMDA агоністів та антагоністів від їх хімічної структури// Нейрофізіологія - 1999.- №2,- с. 170-174.

4. Krishtal О., Lishko P., Maximyuk О., Noldner М., Chatterjee S. Voltage-dependent inhibition of NMDA responses by KA-672.HCI// Symposium of Pathology of Cerebral Neurotransmission.-1997.- Magdeburg.- October 17-18,- p.49.

5. Пиотровский Л.Б., Думпис M.A., Александрова И .Я, Лишко П.В., Максимюк А.П.,

Крышталь О.А Новые агонисты и антагонисты рецепторов возбуждающих аминокислот// Материалы VВсероссийского конгресса "Человек и лекарство",- 1998,- Москва,- с.603. '

6. Пиотровский Л.Б., Думпис М.А., Лишко П.В., Максимюк АП., Крышталь О.А,

«Суперкислые» агонисты NMDA- рецепторов: связь структуры с биологической

активностью// Материалы Всероссийской научной конференции "От materia medica к современным медицинским технологиям".- 1998,- С.-Петербург.- с.52.

7. Пиотровский Л.Б., Александрова И.Я., Лишко П.В., Максимюк А.П., Крышталь О.А Взаимодействие производных имидазол-4,5- и пиразол-3,4-дикарбоновых кислот с NMDA рецепторами// Материалы Всероссийской научной конференции "От materia medica к современным MedwtfUHCKUM технологиям.- 1998.-С.-Петербург, с.132-133.

8. P. V. Lishko, О. P. Maximyuk, S. S. Chatterjee, М. Noldner and О. A Krishtal. A new cognitive enhancer KA-672.HC1 is uncompetitive voltage-dependent NMDA receptor antagonist// Journal of Neurochemistry. 17th ISN/ 13th ESNMeeting.- 1999,-v.73.-suppl.-S18C.

Лішко П.В. Роль гідрофобних взаємодій у модуляції NMDA рецептор-

керованих іонних каналів в нейронах гіпокампа щура.- Рукопис.

Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за

спеціальністю 03.00.02 - біофізика,- Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН

України, Київ, 1999.

Робота присвячена з’ясуванню механізмів взаємодії похідних імідазол-4,5-, та піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки, структурно подібної кумаринам рослинного походження - ансекуліна (КА-672) із ЫМОА-рецептор- керованим іонним каналом пірамідних нейронів щура. З використанням електрофізіологічних методів визначена дія таких сполук на провідність, керовану ШША- рецепторами. Досліджена роль гідрофобних взаємодій у їх модуляції. Виявлені основні характеристики взаємодії КА-672 із рецептором ШЛБА- типа. На підставі даних скрінінгу піразольних і імідазольних похідних висловлено припущення про існування в глутамат-розпізнаючому центрі М/ГОА- рецептора ліпофільної ділянки, з якою може взаємодіяти ліпофільний замісник молекули похідної. Наявність такої взаємодії веде до зміни і навіть інверсії агоністичних властивостей даної похідної.

Досліджені речовини можуть служити прототипами для створення більш ефективних блокаторів ИМЛА-рецепторів, придатних для використання в клінічній медицині. КА-672 знаходиться на другій фазі клінічних досліджень серед хворих на синдром Альцгеймера.

Ключові слова: гідрофобні взаємодії, антагоністи ММОА- рецепторів, КА-672.НС1, імідазол-4,5- дикарбонова кислота, синдром Альцгеймера, нейрони гіпокампа.

Лишко П.В. Роль гидрофобных взаимодействий в модуляции ІЧ\ША рецептор- управляемых ионных каналов в нейронах гиппокампа крысы.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика.- Институт физиологии им.

А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.

Работа посвящена выяснению механизмов взаимодействия производных имидазол-4,5- и пиразол-3,4- дикарбоновых кислот и нового бензопиранового соединения, структурно подобного кумаринам растительного происхождения-ансекулина (КА-672) с ЫМОА- рецептор управляемым ионным каналом пирамидных нейронов крысы. Используя элекгрофизиологические методы, определено действие этих соединений на проводимость, управляемую >1МОА-рецепторами. Исследована роль гидрофобных взаимодействий в их модуляции.

Определены основные характеристики взаимодействий КА-672 с рецептором №уГОА- типа. На основании данных скрининга имидазольных и пиразольных производных высказано предположение о существовании в глутамат- узнающем центре ІММОА- рецептора липофильной области, с которой может взаимодействовать липофильный заместитель молекулы производной. Наличие такого взаимодействия приводит к изменению и даже инверсии агонистических свойств данного производного.

Исследованные соединения могут служить прототипами для синтеза более эффективных блокаторов ММОА-рецепторов, пригодных для клинического использования. В частности, КА-672 находится сейчас на П фазе клинических испытаний среди больных синдромом Альцгеймера.

Ключевые слова: гидрофобные взаимодействия, антагонисты NMDA-рецепторов, КА- 672.НС1, имидазол-4,5- дикарбоновая кислота, синдром Альцгеймера, нейроны гиппокампа.

Lishko P. V. The role of hydrofobic interactions in the modulation of NMDA receptor-operated ionic channels in rat hippocampal neurons.- Manuscript

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02- biophysics.- Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation is devoted to the investigation of the effects of the derivatives of imidazole-4,5- and pyrazole-3,4- dicarboxylic acids and of a new benzopyranone compound anseculine (KA-672.HC1), which is structurally related to naturally occurring coumarins, on the NMDA receptor-operated ionic channels. In this study the action of compounds on the NMDA receptors was examined by applying patch clamp techniques to the enzymatically isolated rat hippocampal neurons.

It has been found that KA- 672.HC1 is a new NMDA receptor operated channelblocker with IC50 = 20 ± 7 jjM (when measured at holding potential of -90 mV). This action of KA-672 is independent on the concentration either of agonist or coagonist of NMDA receptor and does not interfere with phencyclidine- binding center. Evidently, КА- 672.HC1 is a weak NMDA receptor-operated channel blocker. Specific interaction with NMDA receptor/channel complex could be of relevance for the neuroprotective and antidementia effects of this drug which undergoes now phase П clinical trials for Altzheimer disease.

The screening of imidazole-4,5- and pyrazole-3,4- dicarboxylic acids derivatives allows to modernise the concept of structure/function relationship for the glutamate receptors antagonists. It has been proposed that in the glutamate-recognition site of NMDA receptor there is a lipophylic area near the binding point for amino group. Liphophylic substituent of imidazole- or pyrazole- derivatives can directly interact with it. This interaction leads to a decrease in the agonistic properties and to the appearance of the antagonistic ones. Our data show that NMDA antagonist activity is determined not only by the distance between the pharmacophore groups, but also by the lipophily of the surroundings of pharmacophore nitrogen atom in the investigated dicarboxylic acids compounds. It should be noted that the distances between the pharmacophore groups in the molecule of antagonist can be the same as in the agonist. The investigated derivatives are a new class of excitatory amino acids receptor ligands, in which the increase in lipophily can evoke a decrease of agonistic and increase of antagonistic NMDA activity.

Key words: hydrofobic interactions, NMDA receptor antagonist, KA-672 .HC1, imidazole-4,5-dicarboxylic acid, pyrazole-3,4- dicarboxylic acid, Alzheimer disease, hippocampal neurons.